DE112010004584T5 - Chimäre Endonukleasen und Anwendungen davon - Google Patents

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Andrea Hlubek
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Dr. Höffken Hans Wolfgang
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Abstract

Die Erfindung betrifft chimäre Endonukleasen, die eine Endonuklease und eine heterologe DNA-Bindungsdomäne umfassen, sowie Verfahren zur gezielten Integration, gezielten Deletion oder gezielten Mutation von Polynukleotiden unter Verwendung chimärer Endonukleasen.

Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft chimäre Endonukleasen, die eine Endonuklease und eine heterologe DNA-Bindungsdomäne umfassen, sowie Verfahren zur gezielten Integration, gezielten Deletion oder gezielten Mutation von Polynukleotiden unter Verwendung chimärer Endonukleasen.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Genom-Engineering ist ein üblicher Begriff zur Zusammenfassung verschiedener Techniken zum Inserieren, Deletieren, Substituieren oder sonstigem Manipulieren spezifischer genetischer Sequenzen innerhalb eines Genoms und besitzt zahlreiche therapeutische und biotechnologische Anwendungen. Mehr oder weniger alle Techniken des Genom-Engineering verwenden Rekombinasen, Integrasen oder Endonukleasen zur Erzeugung von DNA-Doppelstrangbrüchen an vorbestimmten Stellen, um eine homologe Rekombination zu fördern.
  • Trotz der Tatsache, dass zahlreiche Verfahren angewandt worden sind, um DNA-Doppelstrangbrüche zu erzeugen, bleibt die Entwicklung von effektiven Wegen zur Erzeugung von DNA-Doppelstrangbrüchen an hochspezifischen Stellen in einem Genom ein Hauptziel in der Gentherapie, Agrotechnik und der synthetischen Biologie.
  • Eine Vorgehensweise, um dieses Ziel zu erreichen, besteht darin, Nukleasen mit Spezifität für eine Sequenz zu verwenden, die ausreichend groß ist, so dass sie nur an einer einzigen Stelle innerhalb eines Genoms vorkommt. Nukleasen, die solche großen DNA-Sequenzen von etwa 15 bis 30 Nukleotiden erkennen, werden deshalb als ”Meganukleasen” oder ”Suchkopf-” bzw. ”Homing”-Endonukleasen bezeichnet und sind häufig mit parasitären oder egoistischen bzw. ”selfish” DNA-Elementen, wie etwa Gruppe 1-selbstspleißenden Introns und Inteinen assoziiert, die häufig in den Genomen von Pflanzen und Pilzen gefunden werden. Meganukleasen werden üblicherweise in vier Familien eingeteilt: die LAGLIDADG-Familie, die GIY-YIG-Familie, die His-Cys-Box-Familie und die HNH-Familie. Diese Familien sind durch Strukturmotive, welche die katalytische Aktivität und die Sequenz ihrer DNA-Erkennungssequenzen beeinflussen, charakterisiert.
  • Natürliche Meganukleasen aus der LAGLIDADG-Familie wurden verwendet, um ortsspezifische Genom-Modifikationen in Insekten- und Säugetier-Zellkulturen sowie in vielen Organismen, wie Pflanzen, Hefe oder Mäusen, wirksam zu fördern, aber dieser Ansatz ist auf die Modifikation von entweder homologen Genen, bei denen die DNA-Erkennungssequenz konserviert ist, oder auf vormanipulierte Genome, in die man eine Erkennungssequenz einbrachte, beschränkt gewesen. Um diese Einschränkungen zu vermeiden und die systematische Umsetzung von DNA-Doppelstrangbruch-stimulierter Gen-Modifikation zu fördern, wurden neue Typen von Nukleasen erzeugt.
  • Ein Typ von neuen Nukleasen besteht aus künstlichen Kombinationen von unspezifischen Nukleasen mit einer hochspezifischen DNA-Bindungsdomäne. Die Wirksamkeit dieser Strategie wurde in einer Vielzahl von Organismen unter Verwendung von chimären Fusionen zwischen einer konstruierten Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne und der nicht-spezifischen Nuklease-Domäne des Restriktionsenzyms Fokl gezeigt (z. B. WO03/089452 ). Eine Variation dieser Vorgehensweise besteht darin, eine inaktive Variante einer Meganuklease als DNA-Bindungsdomäne, die an eine unspezifische Nuklease, wie Fokl, fusioniert ist, zu verwenden, wie es bei Lippow et al., "Creation of a type IIS restriction endonuclease with a long recognition sequence", Nucleic Acid Research (2009), Bd. 37, Nr. 9, Seiten 3061 bis 3073, offenbart ist. Ein alternativer Ansatz besteht darin, natürliche Meganukleasen gentechnisch zu verändern, damit ihre DNA-Bindungsregionen angepasst werden, um an existierende Stellen in einem Genom zu binden, wodurch konstruierte Meganukleasen mit neuen Spezifitäten erzeugt werden (z. B. WO07093918 , WO2008/093249 , WO09114321 ). Allerdings besitzen viele Meganukleasen, die in Bezug auf die DNA-Spaltungsspezifität gentechnisch manipuliert worden sind, eine verringerte Spaltungsaktivität im Vergleich zu den natürlich vorkommenden Meganukleasen, von denen sie abgeleitet sind ( US2010/0071083 ). Die meisten Meganukleasen wirken auch auf Sequenzen, welche ähnlich zu ihrer optimalen Bindungsstelle sind, was zu ungewollten oder sogar schädlichen Nicht-Ziel-Effekten führen kann. Mehrere Ansätze wurden bereits unternommen, um die Effizienz von Meganuklease-induzierter homologer Rekombination zu erhöhen, z. B. durch Fusionieren von Nukleasen an die Liganden-bindende Domäne des Ratten-Glucocorticoid-Rezeptors zur Förderung oder sogar Herbeiführung des Transports dieser modifizierten Nuklease in den Zellkern und damit zu seinen Zielstellen durch die Zugabe von Dexamethason oder ähnlichen Verbindungen ( WO2007/135022 ). Trotz dieser Tatsache gibt es immer noch einen Bedarf im Fachgebiet, Meganukleasen mit hohen Induktionsraten der homologen Rekombination und/oder einer hohen Spezifität für ihre Bindungsstelle zu entwickeln, wodurch die Gefahr von Nicht-Ziel-Effekten bzw. nicht beabsichtigten Effekten eingeschränkt wird.
  • KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung stellt chimäre Endonukleasen, welche mindestens eine Endonuklease mit DNA-Doppelstrangbruch-induzierender Aktivität und mindestens eine heterologe DNA-Bindungsdomäne umfassen, bereit. Vorzugsweise ist mindestens eine Endonuklease der chimären Endonuklease eine LAGLIDADG-Endonuklease. In einer Ausführungsform ist mindestens eine LAGLIDADG-Endonuklease I-SceI, I-CreI, I-CeuI, I-ChuI, I-DmoI, PI-SceI, I-MsoI, oder I-AniI, oder eine LAGLIDADG-Endonuklease mit wenigstens 45% Aminosäure-Sequenzidentität zu einem beliebigen von diesen. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung weist mindestens eine LAGLIDADG-Endonuklease mindestens 80% Aminosäure-Sequenzidentität zu einem Polypeptid auf, das durch SEQ ID NR: 1, 2, 3 oder 159 beschrieben ist. Bei der LAGLIDADG-Endonuklease kann es sich um Wildtyp-, konstruierte, optimierte oder optimierte konstruierte LAGLIDADG-Endonukleasen handeln.
  • Die heterologe DNA-Bindungsdomäne ist vorzugsweise ein Transkriptionsfaktor oder eine inaktive Nuklease, oder ein Fragment, das eine DNA-Bindungsdomäne eines Transkriptionsfaktors oder einer Nuklease umfasst.
  • In einer Ausführungsform ist die mindestens eine heterologe DNA-Bindungsdomäne eine inaktive I-SceI, I-CreI, I-CeuI, I-ChuI, I-DmoI, Pi-SceI, I-MsoI, oder I-AniI oder ein inaktives Homolog von diesen mit mindestens 45% Aminosäuresequenzidentität. In einer Ausführungsform ist die heterologe DNA-Bindungsdomäne eine inaktive Version einer LAGLIDADG-Endonukleasen) mit einer Aminosäuresequenz, wie beschrieben von mindestens einer der SEQ ID NR: 1, 2, 3, 5, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 142 oder 159, vorzugsweise mit einer Aminosäuresequenz, wie durch eine beliebige der SEQ ID NR: 1, 2, 3, 5 oder 159 beschrieben.
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist die heterologe DNA-Bindungsdomäne ein Transkriptionsfaktor oder eine DNA-Bindungsdomäne eines Transkriptionsfaktors. Vorzugsweise umfasst der Transkriptionsfaktor oder die DNA-Bindungsdomäne eines Transkriptionsfaktors eine HTH-Domäne. Noch weiter bevorzugt, umfasst der Transkriptionsfaktor oder die DNA-Bindungsdomäne eines Transkriptionsfaktors eine HTH-Domäne, umfassend eine Aminosäuresequenz von mindestens 80% Sequenzidentität zu mindestens einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NR: 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118 oder 119 beschrieben, vorzugsweise durch 91, 92, 93, 94, 95, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118 oder 119 beschrieben ist. In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst die heterologe DNA-Bindungsdomäne ein Polypeptid mit mindestens 80% Aminosäuresequenzidentität zu einem durch SEQ ID NR: 6, 7 oder 8 beschriebenen Polypeptid. Vorzugsweise umfasst die chimäre Endonuklease einen Linker (oder synonym, ein Linker-Polypeptid), um die mindestens eine Endonuklease mit mindestens einer heterologen DNA-Bindungsdomäne zu verknüpfen.
  • Die chimäre Endonuklease kann eine oder mehrere NLS-Sequenzen oder ein oder mehrere SecIII- oder SecIV-Sekretionssignale oder eine Kombination von einer oder mehreren NLS-Sequenzen und einem oder mehreren SecIII- oder SecIV-Sekretionssignalen oder eine Kombination von einem oder mehreren SecIII und SecIV-Sekretionssignalen mit einer oder mehreren NLS-Sequenzen umfassen. In einer Ausführungsform der Erfindung ist die DNA-bindende Aktivität der heterologen DNA-Bindungsdomäne induzierbar. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist die DNA-Doppelstrangbruch-induzierende Aktivität der Endonuklease durch Expression des zweiten Monomers von einer homo- oder heterodimeren Endonuklease, vorzugsweise einer homo- oder heterodimeren LAGLIDADG-Endonuklease induzierbar. Die chimären Endonukleasen können mindestens eine NLS-Sequenz oder mindestens ein SecIII- oder mindestens ein SecIV-Sekretionssignal oder eine Kombination von einer oder mehreren NLS-Sequenzen, einem oder mehreren SecIII-Sekretionssignalen oder einem oder mehreren SecIV-Sekretionssignalen umfassen.
  • Die Erfindung stellt ferner isolierte Polynukleotide bereit, welche eine chimäre Endonuklease codieren. Vorzugsweise ist das isolierte Polynukleotid, das eine chimäre Endonuklease codiert, Codon-optimiert, oder besitzt einen geringen Gehalt an RNA-Instabilitätsmotiven, oder besitzt einen niedrigen Gehalt an kryptischen Spleißstellen, oder besitzt einen geringen Gehalt an alternativen Start-Codons, oder besitzt einen geringen Gehalt an Restriktionsstellen, oder besitzt einen geringen Gehalt an RNA-Sekundärstrukturen, oder besitzt eine Kombination der oben beschriebenen Merkmale. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist eine Expressionskassette, die ein isoliertes Polynukleotid umfasst, das für eine chimäre Endonuklease in funktioneller Kombination mit einem Promotor und einer Terminatorsequenz codiert. Eine weitere Gruppe von isolierten Polynukleotiden, die von der Erfindung bereitgestellt wird, sind isolierte Polynukleotide, die eine chimäre Erkennungssequenz umfassen, welche eine Länge von etwa 15 bis etwa 300 Nukleotiden aufweist und eine Erkennungssequenz einer Endonuklease und eine Erkennungssequenz einer heterologen DNA-Bindungsdomäne umfasst. Vorzugsweise umfasst die chimäre Erkennungssequenz eine DNA-Erkennungssequenz einer LAGLIDADG-Endonuklease, noch bevorzugter eine DNA-Erkennungssequenz einer LAGLIDADG-Endonuklease mit einer Aminosäuresequenz, wie durch mindestens eine der SEQ ID NRn: 1, 2, 3, 5, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 142 oder 159 beschrieben, vorzugsweise mit einer Aminosäuresequenz, wie durch SEQ ID NR: 1, 2, 3, 5 oder 159 beschrieben. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst die chimäre Erkennungsstelle eine DNA-Erkennungssequenz von I-SceI, I-CreI, I-DmoI, I-MsoI, I-CeuI, I-ChuI, Pi-SceI oder I-AniI und eine Erkennungssequenz einer heterologen DNA-Bindungsdomäne mit mindestens 50% Sequenz-Aminosäuresequenzidentität zu scTet, scArc, LacR, MerR oder MarA oder zu einem DNA-Bindungsdomänen-Fragment von scTet, scArc, LacR, MerR oder MarA. Bevorzugte Polynukleotide, die von der Erfindung bereitgestellt werden, umfassen eine chimäre Erkennungssequenz, die eine DNA-Erkennungssequenz von I-SceI und eine Erkennungssequenz von scTet oder scArc umfasst, wobei die DNA-Erkennungssequenz von I-SceI und die Erkennungssequenz der scTet oder scArc direkt verbunden sind oder über eine Linker-Linkersequenz von 1 bis 10 Nukleotiden verbunden sind. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das isolierte Polynukleotid eine chimäre Erkennungssequenz, die eine Polynukleotidsequenz umfasst, wie durch eine beliebige der SEQ ID NRn: 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder 20 beschrieben.
  • Die Erfindung stellt ferner einen Vektor, eine Wirtszelle oder einen nicht-menschlichen Organismus bereit, welche(r) ein isoliertes Polynukleotid, das eine chimäre Endonuklease codiert, oder ein isoliertes Polynukleotid, wie oben beschrieben, oder eine Expressionskassette, oder ein isoliertes Polynukleotid, das eine chimäre Erkennungssequenz oder eine chimäre Endonuklease enthält, umfasst oder eine Kombination von einem oder mehreren von diesen umfasst. Vorzugsweise ist der nicht-menschliche Organismus eine Pflanze.
  • Die Erfindung stellt Verfahren zur Verwendung der hierin beschriebenen chimären Endonukleasen und chimären Erkennungssequenzen zum Induzieren oder zum Erleichtern von homologer Rekombination oder Endenverknüpfungs-Ereignissen, vorzugsweise Verfahren zur gezielten Integration oder Exzision von Sequenzen, bereit. Vorzugsweise sind die Sequenzen, die herausgeschnitten werden, Markergene.
  • Eine Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Bereitstellung einer chimären Endonuklease, das die folgenden Schritte umfasst: a) Bereitstellen mindestens einer Endonuklease codierenden Region, b) Bereitstellen mindestens einer eine heterologe DNA-Bindungsdomäne codierenden Region, c) Bereitstellen eines Polynukleotids mit einer potentiellen DNA-Erkennungssequenz oder potentiellen DNA-Erkennungssequenzen der Endonuklease oder Endonukleasen von Schritt a) und mit einer potentiellen Erkennungssequenz oder mit potentiellen Erkennungssequenzen der heterologen DNA-Bindungsdomäne oder heterologen DNA-Bindungsdomänen von Schritt b), d) Erzeugen einer translationalen Fusion der codierenden Regionen von allen Endonukleasen von Schritt b) und aller heterologen DNA-Bindungsdomänen von Schritt c), e) Exprimieren einer chimären Endonuklease aus der in Schritt d) erzeugten translationalen Fusion, f) Testen der in Schritt e) exprimierten chimären Endonuklease hinsichtlich der Spaltung des Polynukleotids von Schritt c).
  • Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren für die homologe Rekombination von Polynukleotiden bereit, das die folgenden Schritte umfasst: a) Bereitstellen einer Zelle, die für homologe Rekombination kompetent ist, b) Bereitstellen eines Polynukleotids, das eine chimäre Erkennungsstelle umfasst, die von einer Sequenz A und einer Sequenz B flankiert wird, c) Bereitstellen eines Polynukleotids, das Sequenzen A' und B' umfasst, welche ausreichend lang und homolog zu Sequenz A und Sequenz B sind, um die homologe Rekombination in der Zelle zu gestatten, und d) Bereitstellen einer chimären Endonuklease, wie hierin beschrieben, oder einer Expressionskassette, wie hierin beschrieben, e) Kombinieren von b), c) und d) in der Zelle, und f) Nachweisen von rekombinierten Polynukleotiden von b) und c), oder Selektieren bezüglich oder Wachsenlassen von Zellen, welche rekombinierte Polynukleotide von b) und c) umfassen. Vorzugsweise führt das Verfahren zur homologen Rekombination von Polynukleotiden zu einer homologen Rekombination, wobei eine in der kompetenten Zelle von Schritt a) enthaltene Polynukleotidsequenz aus dem Genom der wachsenden Zellen von Schritt f) deletiert wird. Ein weiteres Verfahren der Erfindung ist ein Verfahren zur gezielten Mutation, das die folgenden Schritte umfasst: a) Bereitstellen einer Zelle, die ein Polynukleotid umfasst, das eine chimäre Erkennungsstelle einer chimären Endonuklease umfasst, b) Bereitstellen einer chimären Endonuklease, die in der Lage ist, die chimäre Erkennungsstelle von Schritt a) zu spalten, c) Kombinieren von a) und b) in der Zelle, und d) Nachweisen mutierter Polynukleotide oder Selektieren bezüglich wachsender Zellen, welche mutierte Polynukleotide umfassen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfassen die oben beschriebenen Verfahren einen Schritt, wobei die chimäre Endonuklease und die chimäre Erkennungsstelle in mindestens einer Zelle mittels Kreuzen von Organismen, mittels Transformation oder mittels Transport, der durch ein an die optimierte Endonuklease fusioniertes SecIII- oder SecIV-Peptid vermittelt wird, kombiniert werden.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • Die 1 zeigt ein Sequenzalignment von verschiedenen I-SceI-Homologen, worin 1 für SEQ ID NR: 1 steht, 2 für SEQ ID NR: 56, 3 für SEQ ID NR: 57, 4 für SEQ ID NR: 58 und 5 für SEQ ID NR: 59 steht.
  • Die 2 zeigt ein Sequenzalignment von verschiedenen I-CreI-Homologen, worin 1 für SEQ ID NR: 60 steht, 2 für SEQ ID NR: 61, 3 für SEQ ID NR: 62, 4 für SEQ ID NR: 63 und 5 für SEQ ID NR: 64 steht.
  • Die 3a bis 3c zeigen ein Sequenzalignment von verschiedenen PI-SceI-Homologen, worin 1 für SEQ ID NR: 79 steht, 2 für SEQ ID NR: 80, 3 für SEQ ID NR: 81, 4 für SEQ ID NR: 82 und 5 für die SEQ ID NR: 83 steht.
  • Die 4 zeigt ein Sequenzalignment von verschiedenen I-CeuI-Homologen, worin 1 für SEQ ID NR: 65 steht, 2 für SEQ ID NR: 66, 3 für SEQ ID NR: 67, 4 für SEQ ID NR: 68, 5 für SEQ ID NR: 69 steht.
  • Die 5 zeigt ein Sequenzalignment von verschiedenen I-ChuI-Homologen, worin 1 für SEQ ID NR: 70 steht, 2 für SEQ ID NR: 71, 3 für SEQ ID NR: 72, 4 für SEQ ID NR: 73, 5 für SEQ ID NR: 74 steht.
  • Die 6 zeigt ein Sequenzalignment von verschiedenen I-DmoI-Homologen, worin 1 für SEQ ID NR: 75, 2 für SEQ ID NR: 76, 3 für SEQ ID NR: 77, und 4 für SEQ ID NR: 78 steht.
  • Die 7 zeigt ein Sequenzalignment von verschiedenen I-MsoI-Homologen, worin 1 für SEQ ID NR: 84 und 2 für SEQ ID NR: 85 steht.
  • Die 8 zeigt ein Sequenzalignment von verschiedenen TetR-Homologen, worin 1 für SEQ ID NR: 86, 2 für SEQ ID NR: 87, 3 für SEQ ID NR: 88, 4 für SEQ ID NR: 89, 5 für SEQ ID NR: 90 steht.
  • Die 9a zeigt ein Sequenzalignment von HTH-Domänen von verschiedenen TetR-Homologen, worin 1 für SEQ ID NR: 91, 2 für SEQ ID NR: 92, 3 für SEQ ID NR: 93, 4 für SEQ ID NR: 94, 5 für SEQ ID NR: 95 steht.
  • Die 9b zeigt ein Sequenzalignment von HTH-Domänen von verschiedenen ArcR-Homologen, worin 1 für SEQ ID NR: 96, 2 für SEQ ID NR: 97, 3 für SEQ ID NR: 98, 4 für SEQ ID NR: 99, 5 für SEQ ID NR: 100 steht.
  • Die 10a zeigt ein Sequenzalignment von HTH-Domänen von verschiedenen LacR-Homologen, worin 1 für SEQ ID NR: 101, 2 für SEQ ID NR: 102, 3 für SEQ ID NR: 103, 4 für SEQ ID NR: 104, 5 für SEQ ID NR: 105 steht.
  • Die 10b zeigt ein Sequenzalignment von HTH-Domänen von verschiedenen MerR-Homologen, worin 1 für SEQ ID NR: 106, 2 für SEQ ID NR: 107, 3 für SEQ ID NR: 108, 4 für SEQ ID NR: 109, 5 für SEQ ID NR: 110, 6 für SEQ ID NR: 111 steht.
  • Die 11 zeigt ein Sequenzalignment von HTH-Domänen von verschiedenen MarA-Homologen, worin 1 für SEQ ID NR: 112, 2 für SEQ ID NR: 113, 3 für SEQ ID NR: 114, 4 für SEQ ID NR: 115, 5 für SEQ ID NR: 1116, 6 für SEQ ID NR: 117, 7 für SEQ ID NR: 118, 8 für SEQ ID NR: 119 steht.
  • Die 12 zeigt ein Sequenzalignment von verschiedenen MarA-Homologen, worin 1 für SEQ ID NR: 120, 2 für SEQ ID NR: 121, 3 für SEQ ID NR: 122, 4 für SEQ ID NR: 123, 5 für SEQ ID NR: 124, 6 für SEQ ID NR: 125, 7 für SEQ ID NR: 126, 8 für SEQ ID NR: 127 steht.
  • BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung stellt chimäre Endonukleasen bereit, welche als alternative DNA-Doppelstrangbruch-induzierende Enzyme verwendet werden können. Die Erfindung schließt auch Verfahren zur Anwendung dieser chimären Endonukleasen ein.
  • Chimäre Endonukleasen der Erfindung
  • Die chimären Endonukleasen der Erfindung umfassen mindestens eine Endonuklease mit DNA-Doppelstrangbruch-induzierender Aktivität und mindestens eine heterologe DNA-Bindungsdomäne.
  • Die Endonuklease
  • Für die Erfindung geeignete Endonukleasen induzieren DNA-Doppelstrangbrüche in einer DNA-Erkennungssequenz von mindestens 4, mindestens 6, mindestens 8, mindestens 10, mindestens 14, mindestens 16, mindestens 18 oder mindestens 20 Basenpaaren.
  • Bevorzugte Endonukleasen induzieren Doppelstrangbrüche in einer DNA-Erkennungssequenz von mindestens 14 Basenpaaren, weiter bevorzugt von mindestens 16 Basenpaaren, noch weiter bevorzugt von mindestens 18 Basenpaaren.
  • Der Begriff ”DNA-Erkennungssequenz” bezieht sich allgemein auf solche Sequenzen, die unter den Bedingungen in einer Zelle, z. B. in einer Pflanzenzelle, eine Erkennung und Spaltung durch die Endonuklease ermöglichen. Beispiele für die DNA-Erkennungssequenzen sowie Endonukleasen, welche diese DNA-Erkennungssequenzen schneiden, können in der nachfolgenden Tabelle 8 gefunden werden.
  • Viele verschiedene Endonukleasen sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt. Beispiele sind Homing-Endonukleasen, wie etwa: F-SceI, F-SceII, F-SuvI, F-TevII, I-AmaI, I-AniI, I-CeuI, I-CeuAIIP, I-ChuI, I-CmoeI, I-CpaI, I-CpaII, I-CreI, I-CrepsbIP, I-CrepsbIIP, I-CrepsbIIIP, I-CrepsbIVP, I-CsmI, I-CvuI, I-CvuAIP, I-DdiI, I-DdiII, I-DirI, I-DmoI, I-HmuI, I-HspNIP, I-LlaI, I-MsoI, I-NaaI, I-NanI, I-NcIIP, I-NgrIP, I-NitI, I-NjaI, I-Nsp236IP, I-PakI, I-PboIP, I-PcuIP, I-PcuAI, I-PcuVI, I-PgrIP, I-PobIP, I-PorI, I-PorIIP, I-PpbIP, I-PpoI, I-SPBetaIP, I-ScaI, I-SceI, I-SceII, I-SceIII, I-SceIV, I-SceV, I-SceVI, I-SceVII, I-SexIP, I-SneIP, I-SpomCP, I-SpomIP, I-SpomIIP, I-SquIP, I-Ssp6803I, I-SthPhiJP, I-SthPhiST3P, I-SthPhiS3bP, I-TdeIP, I-TevI, I-TevII, I-TevIII, I-UarAP, I-UarHGPA1P, I-UarHGPA13P, I-VinIP, I-ZbiIP, PI-MtuI, PI-MtuHIP, PI-MtuHIIP, PI-PfuI, PI-PfuII, PI-PkoI, PI-PkoII, PI-PspI, PI-Rma43812IP, PI-SPBetaIP, PI-SceI, PI-TfuI, PI-TfuII, PI-ThyI, PI-TliI, PI-TliII, H-DreI, I-BasI, I-BmoI, I-PogI, I-TwoI, PI-MgaI, PI-PabI, PI-PabII.
  • Bevorzugte Homing-Endonukleasen sind GIY-YIG-, His-Cys-box-, HNH- oder LAGLIDADG-Endonukleasen. Die GIY-YIG-Endonukleasen weisen ein GIY-YIG-Modul von 70 bis 100 Aminosäuren Länge auf, das vier oder fünf konservierte Sequenzmotive mit vier invarianten Resten einschließt (Van Roey et al (2002), Nature Struct. Biol. 9: 806 bis 811). His-Cys-box-Endonukleasen umfassen eine hochkonservierte Sequenz von Histidinen und Cysteinen über einen Bereich von mehreren hundert Aminosäureresten. Die HNH-Endonukleasen sind durch Sequenzmotive definiert, die zwei Paare von konservierten Histidinen enthalten, die von Asparaginresten umgeben sind. Weitere Informationen über His-Cys-box- und HNH-Endonukleasen sind bei Chevalier et al. (2001), Nucleic Acids Res. 29(18): 3757 bis 3774 angegeben.
  • Vorzugsweise gehört die in den chimären Endonukleasen verwendete Homing-Endonuklease zur Gruppe der LAGLIDADG-Endonukleasen.
  • LAGLIDADG-Endonukleasen können in den Genomen von Algen, Pilzen, Hefen, Protozoen, Chloroplasten, Mitochondrien, Bakterien und Archaea gefunden werden. LAGLIDADG-Endonukleasen umfassen mindestens ein konserviertes LAGLIDADG-Motiv. Der Name des LAGLIDADG-Motivs beruht auf einer charakteristischen Aminosäuresequenz, die in allen LAGLIDADG-Endonukleasen vorkommt. Der Begriff LAGLIDADG ist ein Akronym dieser Aminosäuresequenz gemäß dem Ein-Buchstaben-Code, wie er beschrieben ist im STANDARD ST.25, d. h. dem Standard, der vom PCIPI Executive Coordination Committee für die Wiedergabe von Nukleotid- und Aminosäuresequenz-Auflistungen in Patentanmeldungen genehmigt ist.
  • Allerdings ist das LAGLIDADG-Motiv nicht in allen LAGLIDADG-Endonukleasen vollständig konserviert (siehe zum Beispiel Chevalier et al. (2001), Nucleic Acids Res. 29(18): 3757 bis 3774, oder Dalgaard et al. (1997), Nucleic Acids Res. 25(22): 4626 bis 4638), so dass manche LAGLIDADG-Endonukleasen einige Aminosäureänderungen in ihrem LAGLIDADG-Motiv umfassen. LAGLIDADG-Endonukleasen, die nur ein LAGLIDADG-Motiv umfassen, wirken in der Regel als Homo- oder Heterodimere. LAGLIDADG-Endonukleasen, die zwei LAGLIDADG-Motive umfassen, wirken als Monomere und umfassen üblicherweise eine pseudo-dimere Struktur.
  • LAGLIDADG-Endonukleasen können aus Polynukleotiden von Organismen, die in beispielartiger Weise in Tabelle 1, 2, 3, 4, 5 und 6 erwähnt sind, isoliert oder durch im Fachgebiet bekannte Techniken de novo synthetisiert werden, z. B. unter Verwendung von Sequenzinformationen, welche in dem Fachmann auf dem Gebiet bekannten öffentlichen Datenbanken, zum Beispiel Genbank, Benson (2010), Nucleic Acids Res 38: D46–51, oder Swissprot, Boeckmann (2003), Nucleic Acids Res 31: 365–70, verfügbar sind.
  • Eine Sammlung von LAGLIDADG-Endonukleasen kann in der PFAM-Datenbank für Proteinfamilien gefunden werden. Die PFAM-Datenbank-Zugangsnummer PF00961 beschreibt die LAGLIDADG 1-Proteinfamilie, welche etwa 800 Proteinsequenzen umfasst. Die PFAM-Datenbank-Zugangsnummer PF03161 beschreibt Mitglieder der LAGLIDADG 2-Proteinfamilie, welche etwa 150 Proteinsequenzen umfasst. Eine alternative Sammlung von LAGLIDADG-Endonukleasen kann in der InterPro-Datenbank, z. B. InterPro-Zugangsnummer IPR004860, gefunden werden.
  • Der Begriff LAGLIDADG Endonukleasen soll auch künstliche homo- und heterodimere LAGLIDADG-Endonukleasen abdecken, die z. B. durch Modifizieren der Protein-Protein-Wechselwirkungs-Regionen der Monomere erzeugt werden können, um die Homo- oder Heterodimer-Bildung zu fördern. Beispiele für eine künstliche heterodimere LAGLIDADG-Endonuklease, umfassend die LAGLIDADG-Endonuklease I-Dmo I als eine Domäne, können in WO2009/074842 und WO2009/074873 gefunden werden.
  • Darüber hinaus soll der Begriff LAGLIDADG-Endonukleasen auch künstliche einzelkettige Endonukleasen einschließen, welche durch Herstellen translationaler Fusionen von Monomeren von homo- oder heterodimeren LAGLIDADG-Endonukleasen erzeugt werden können.
  • Demzufolge umfassen, in einer Ausführungsform der Erfindung, die chimären Endonukleasen der Erfindung mindestens eine LAGLIDADG-Endonuklease. In weiteren Ausführungsformen kann die LAGLIDADG-Endonuklease, die in der chimären Endonuklease enthalten ist, eine monomere, homodimere, künstliche homo- oder heterodimere oder künstliche einzelkettige LAGLIDADG-Endonuklease sein.
  • In einer Ausführungsform ist die LAGLIDAG-Endonuklease eine monomere, homodimere, heterodimere oder künstliche einzelkettige LAGLIDADG-Endonuklease. Vorzugsweise ist die Endonuklease eine monomere oder künstliche einzelkettige LAGLIDADG-Endonuklease.
  • Bevorzugte LAGLIDADG-Endonukleasen sind: I-AniI, I-Sce I, I-Chu I, I-Dmo I, I-Cre I, I-Csm I, PI-Sce I, PI-Tli I, PI-Mtu I, I-Ceu I, I-Sce II, I-Sce III, HO, PI-Civ I, PI Ctr I, PI-Aae I, PI-Bsu I, PI-Dha I, PI-Dra I, PI-Mav I, PI-Mch I, PI-Mfu I, PI-Mfl I, PI-Mga I, PI-Mgo I, PI-Min I, PI-Mka I, PI-Mle I, PI-Mma I, PI-Msh I, PI-Msm I, I-Mso I, PI-Mth I, PI-Mtu I, PI-Mxe I, PI-Npu I, PI-Pfu I, PI-Rma I, PI-Spb I, PI-Ssp I, PI-Fac I, PI-Mja I, PI-Pho I, PI-Tag I, PI-Thy I, PI-Tko I und PI-Tsp I und Homologe von einer beliebigen von diesen, die mindestens 49%, 51%, 58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität auf Aminosäureebene aufweisen; weiter bevorzugt sind: I-Sce I, I-Chu I, I-Dmo I, I-Cre I, I-Csm I, PI-Pfu I, PI-Sce I, PI-Tli I, I-Mso I, PI-Mtu I, I-Ceu I, I-Sce II, I-Sce III und HO und Homologe von einer beliebigen von diesen, die mindestens 49%, 51%, 58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität auf Aminosäureebene aufweisen; noch weiter bevorzugt sind I-Sce I, I-Chu I, I-Dmo I, I-Cre I, I-Csm I, PI-Sce I, PI-Pfu I, PI-Tli I, I-Mso I, PI-Mtu I und I-Ceu I und Homologe von einer beliebigen von diesen, die mindestens 49%, 51%, 58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität auf Aminosäureebene aufweisen;
    Noch mehr bevorzugt sind I-Dmo I, I-Cre I, I-Sce I, I-Mso I und I-Chu I und Homologe von einer beliebigen von diesen, die mindestens 49%, 51%, 58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität auf Aminosäureebene aufweisen, am meisten bevorzugt ist I-Sce I und Homologe von I-Sce I, die mindestens 49%, 51%, 58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität auf Aminosäureebene aufweisen.
  • Bevorzugte monomere LAGLIDADG-Endonukleasen sind: I-AniI, I-Sce I, I-Chu I, I-Dmo I, I-Csm I, PI-Sce I, PI-Tli I, PI-Mtu I, I-Sce II, I-Sce III, HO, PI-Civ I, PI Ctr I, PI-Aae I, PI-Bsu I, PI-Dha I, PI-Dra I, PI-Mav I, PI-Mch I, PI-Mfu I, PI-Mfl I, PI-Mga I, PI-Mgo I, PI-Min I, PI-Mka I, PI-Mle I, PI-Mma I, PI-Msh I, PI-Msm I, PI-Mth I, PI-Mtu I, PI-Mxe I, PI-Npu I, PI-Pfu I, PI-Rma I, PI-Spb I, PI-Ssp I, PI-Fac I, PI-Mja I, PI-Pho I, PI-Tag I, PI-Thy I, PI-Tko I und PI-Tsp I; und Homologe von einer beliebigen von diesen mit mindestens 49%, 51%, 58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität auf Aminosäureebene.
  • Stärker bevorzugte monomere LAGLIDADG-Endonukleasen sind: I-Sce I, I-Chu I, I-Dmo I, I-Csm I, PI-Pfu I, PI-Sce I, PI-Tli I, PI-Mtu I, I-Sce II, I-Sce III, und HO und Homologe von einer beliebigen von diesen mit mindestens 49%, 51%, 58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität auf Aminosäureebene.
  • Noch stärker bevorzugte monomere LAGLIDADG-Endonukleasen sind: I-Sce I, I-Chu I, I-Dmo I, I-Csm I, PI-Sce I, PI-Tli I, und PI-Mtu I; Homologe von einer beliebigen von diesen mit mindestens 49%, 51%, 58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität auf Aminosäureebene.
  • Noch bevorzugtere monomere LAGLIDADG-Endonukleasen sind: I-Dmo I, I-Sce I, und I-Chu I; Homologe von einer beliebigen von diesen mit mindestens 49%, 51%, 58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität auf Aminosäureebene.
  • Ein Typ von Homolog-LAGLIDADG-Endonukleasen sind künstliche Einzelketten-LAGLIDADG-Endonukleasen, welche zwei Untereinheiten der gleichen LAGLIDADG-Endonuklease umfassen können, wie einzelkettiges I-Cre, einzelkettiges I-Ceu I oder einzelkettiges I-Ceu II, wie in WO03078619 offenbart, oder welche zwei Untereinheiten von verschiedenen LAGLIDADG-Endonukleasen umfassen können. Künstliche Einzelketten-LAGLIDADG Endonukleasen, welche zwei Untereinheiten von verschiedenen LAGLIDADG-Endonukleasen umfassen, werden Hybrid-Meganukleasen genannt.
  • Bevorzugte künstliche Einzelketten-LAGLIDADG-Endonukleasen sind einzelkettiges I-CreI, einzelkettiges I-CeuI oder einzelkettiges I-CeuII und Hybrid-Meganukleasen, wie: I-Sce/I-Chu I, I-Sce/PI-Pfu I, I-Chu/I-Sce I, I-Chu/PI-Pfu I, I-Sce/I-Dmo I, I Dmo I/I-See I, I-Dmo I/PI-Pfu I, I-Dmo I/I-Cre I, I-Cre I/I-Dmo I, I-Cre I/PI-Pfu I, I-Sce I/I-Csm I, I-Sce I/I-Cre I, I-Sce I/PI-Sce I, I-Sce I/PI-Tli I, I-Sce I/PI-Mtu I, I-Sce I/I-Ceu I, I-Cre I/I-Ceu I, I-Chu I/I-Cre I, I-Chu I/1-Dmo I, I-Chu I/I-Csm I, I-Chu I/PI-Sce I, I-Chu I/PI-Tli I, I-Chu I/PI-Mtu I, I-Cre I/I-Chu I, I-Cre I/I-Csm I, I-Cre I/PI-Sce 1,1 Cre I/PI-Tli I, I-Cre I/PI-Mtu I, I-Cre I/I-Sce I, I-Dmo I/I-Chu I, I-Dmo I/I-Csm I, I Dmo I/PI-Sce I, I-Dmo I/PI-Tli I, I-Dmo I/PI-Mtu I, I-Csm I/I-Chu I, I-Csm I/PI-Pfu I, I-Csm I/I-Cre I, I-Csm I/I-Dmo I, I-Csm I/PI-Sce I, I-Csm I/PI-Tli I, I-Csm I/PI-Mtu I, I-Csm I/I-Sce I, PI-Sce I/I-Chu I, PI-Sce I/I-Pfu I, PI-Sce I/I-Cre I, PI-Sce I/I Dmo I, PI-Sce I/I-Csm I, PI-Sce I/PI-Tli I, PI-Sce I/PI-Mtu I, PI-Sce I/I-Sce I, PI-Tli I/I Chu I, PI-Tli I/PI-Pfu I, PI-Tli I/I-Cre I, PI-Tli I/I-Dmo I, PI-Tli I/I-Csm I, PI-Tli I/PI Sce I, PI-Tli I/PI-Mtu I, PI-Tli I/I-Sce I, PI-Mtu I/I-Chu I, PI-Mtu I/PI-Pfu I, PI-Mtu I/I-Cre I, PI-Mtu I/I-Dmo I, PI-Mtu I/I-Csm I, PI-Mtu I/I-Sce I, PI-Mtu I/PI-Tli I, und PI-Mtu I/I-SceI, die in WO03078619 , in WO09/074842 , WO2009/059195 und in WO09/074873 offenbart sind, sowie LIG3-4SC, das in WO09/006297 offenbart ist, oder einzelkettiges I-Cre I V2 V3, das in Sylvestre Grizot et al., "Efficient targeting of a SCID gene by an engineered single-chain homing endonuclease", Nucleic Acids Research, 2009, Band 37, Nr. 16, Seiten 5405 bis 5419, offenbart ist.
  • Eine besonders bevorzugte einzelkettige LAGLIDADG-Endonuklease ist einzelkettige I-Cre I.
  • Bevorzugte dimere LAGLIDADG-Endonukleasen sind: I-Cre I, I-Ceu I, I-Sce II, I-Mso I und I-Csm I und Homologe von einer beliebigen von diesen mit mindestens 49%, 51%, 58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität auf Aminosäureebene.
  • Bevorzugte heterodimere LAGLIDADG-Endonukleasen sind in WO 07/034262 , WO 07/047859 und WO08093249 offenbart.
  • Homologe von LAGLIDADG-Endonukleasen können zum Beispiel aus anderen Organismen kloniert werden oder können durch Mutieren von LAGLIDADG-Endonukleasen erzeugt werden, z. B. durch Ersetzen, Addieren oder Deletieren von Aminosäuren der Aminosäuresequenz einer gegebenen LAGLIDADG-Endonuklease, was vorzugsweise keine Auswirkung auf ihre DNA-Bindungsaffinität, ihre Dimer-Bildungsaffinität hat oder ihre DNA-Erkennungssequenz verändern wird.
  • Wie hierein verwendet, bedeutet der Begriff ”DNA-Bindungsaffinität” die Tendenz einer Meganuklease oder LAGLIDADG-Endonuklease, nicht-kovalent mit einem Referenz-DNA-Molekül (z. B. einer DNA-Erkennungssequenz oder einer willkürlichen Sequenz) zu assoziieren. Bindungsaffinität wird durch eine Dissoziationskonstante KD gemessen (z. B. beträgt die KD von I-CreI für die WT-DNA-Erkennungssequenz ungefähr 0,1 nM). Wie hierein verwendet, weist eine Meganuklease eine ”veränderte” Bindungsaffinität auf, wenn die KD der rekombinanten Meganuklease für eine Referenz-DNA-Erkennungssequenz um ein statistisch signifikantes (p < 0,05) Ausmaß im Verhältnis zu einer Referenz-Meganuklease oder -LAGLIDADG-Endonuklease erhöht oder verringert wird.
  • Wie hierin in Bezug auf Meganuklease-Monomere oder LAGLIDADG-Endonuklease-Monomere verwendet, bedeutet der Begriff ”Affinität für Dimerbildung” die Tendenz eines Monomeren, mit einem Referenz-Meganuklease-Monomer oder -LAGLIDADG-Endonuklease-Monomer nicht-kovalent zu assoziieren. Die Affinität für Dimerbildung kann mit dem gleichen Monomer (d. h. Homodimerbildung) oder mit einem unterschiedlichen Monomer (d. h. Heterodimer-Bildung) gemessen werden, wie etwa einer Referenz-Wildtyp-Meganuklease oder einer Referenz-LAGLIDADG-Endonuklease. Die Bindungsaffinität wird durch eine Dissoziationskonstante, Kp, gemessen. Wie hierin verwendet, besitzt eine Meganuklease ”veränderte” Affinität für Dimerbildung, wenn die KD des rekombinanten Meganukleasemonomers oder des rekombinanten LAGLIDADG-Endonuklease-Monomers für ein Referenz-Meganuklease-Monomer oder für eine Referenz-LAGLIDADG-Endonuklease um ein statistisch signifikantes (p < 0,05) Ausmaß im Verhältnis zu einem Referenz-Meganuklease-Monomer oder dem Referenz-LAGLIDADG-Endonuklease-Monomer erhöht oder verringert wird.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff ”enzymatische Aktivität” auf die Geschwindigkeit, bei der eine Meganuklease, z. B. eine LAGLIDADG-Endonuklease, eine bestimmte DNA-Erkennungssequenz spaltet. Eine solche Aktivität ist eine messbare enzymatische Reaktion, welche die Hydrolyse von Phosphodiesterbindungen von doppelsträngiger DNA beinhaltet. Die Aktivität einer Meganuklease, welche auf ein bestimmtes DNA-Substrat einwirkt, wird durch die Affinität oder Avidität der Meganuklease für dieses bestimmte DNA-Substrat beeinflußt, welche ihrerseits sowohl durch sequenzspezifische als auch nicht-sequenzspezifische Wechselwirkungen mit der DNA beeinflußt wird.
  • Zum Beispiel ist es möglich, nukleäre bzw. Zellkern-Lokalisationssignale an die Aminosäuresequenz einer LAGLIDADG-Endonuklease anzufügen und/oder eine oder mehrere Aminosäuren auszutauschen und/oder Teile ihrer Sequenz, z. B. Teile des N-Terminus oder Teile ihres C-Terminus, zu deletieren.
  • Zum Beispiel ist es möglich, eine Homolog-LAGLIDADG-Endonuklease von I-SceI durch Mutieren von Aminosäuren ihrer Aminosäuresequenz zu erzeugen. Mutationen, welche einen geringen Effekt auf die DNA-Bindungsaffinität von I-SceI haben, oder dessen DNA-Erkennungssequenz verändern werden, sind: A36G, L40M, L40V, I41S, I41N, L43A, H91A und I123L.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung werden die Homologe von LAGLIDADG-Endonukleasen aus den Gruppen von künstlichen Einzelketten-LAGLIDADG-Endonukleasen, einschließlich oder nicht einschließlich Hybrid-Meganukleasen, Homologen, die aus anderen Organismen kloniert werden können, konstruierten Endonukleasen oder optimierten Nukleasen ausgewählt.
  • In einer Ausführungsform wird die LAGLIDADG-Endonuklease aus der Gruppe gewählt, die folgendes umfasst: I-Sce I, I-Cre I, I-Mso I, I-Ceu I, I-Dmo I, I-Ani I, PI-Sce I, I-Pfu I oder Homologe von einem beliebigen von diesen mit mindestens 49%, 51%, 58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität auf Aminosäure-Ebene.
  • In einer anderen Ausführungsform wird die LAGLIDADG-Endonuklease aus der Gruppe gewählt, die folgendes umfasst: I-Sce I, I-Chu I, I-Cre I, I-Dmo I, I-Csm I, PI-Sce I, PI-Pfu I, PI-Tli I, PI-Mtu I und I-Ceu I und Homologe von einem beliebigen von diesen mit mindestens 49%, 51%, 58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität auf Aminosäure-Ebene. Tabelle 1: Exemplarische Homologe von I-SceI, die aus anderen Organismen kloniert werden können.
    Uni-Prot Eintrag-Nr. Organismus SEQ ID NR: Aminosäuresequenzidentität zu I-SceI
    A7LCP1 S. cerevisiae 1 100
    Q36760 S. cerevisiae 56 98
    063264 Z. bisporus 57 72
    Q34839 K. thermotolerans 58 71
    Q34807 P. canadensis 59 58
    Tabelle 2: Exemplarische Homologe von I-CreI, die aus anderen Organismen kloniert werden können.
    Uni-Prot Eintrag-Nr. Organismus SEQ ID NR: Aminosäuresequenzidentität zu I-CreI
    P05725 C. reinhardtii 60 100
    Q85MM1 C. lunzensis 61 56
    Q8SML7 C. olivieri 62 58
    Q1KVQB S. obliquus 63 49
    Tabelle 3: Exemplarische Homologe von PI-SceI, die aus anderen Organismen kloniert werden können.
    Uni-Prot Eintrag-Nr. Organismus SEQ ID NR: Aminosäuresequenzidentität zu PI-SceI
    P17255 S. cerevisiae 79 100
    Q874G9 S. cerevisiae 80 99
    Q874F9 S. pastorianus 81 97
    Q8J0H1 S. cariocanus 82 87
    Q8J0G4 Z. bailii 83 61
    Q8J0G5 T. pretoriensis 84 55
    Tabelle 4: Exemplarische Homologe von I-CeuI, die aus anderen Organismen kloniert werden können.
    Uni-Prot Eintrag-Nr. Organismus SEQ ID NR: Aminosäuresequenzidentität zu I-CeuI
    P32761 C. moewusii 65 100%
    Q8WKZ1 C. echinozygotum 66 63%
    Q8WL12 C. elongatum 67 58%
    Q8WL11 A. stipitatus 68 55%
    Q8WKX7 C. monadina 69 51%
    Tabelle 5: Exemplarische Homologe von I-ChuI, die aus anderen Organismen kloniert werden können.
    Uni-Prot Eintrag-Nr. Organismus SEQ ID NR: Aminosäuresequenzidentität zu I-CeuI
    Q53X18 C. humicola 70 100%
    Q8WL03 C. zebra 71 67%
    Q8WKX6 C. monadina 72 62%
    Q8WL10 A. stipitatus 73 58%
    Q8SMI6 N. aquatica 74 54%
    Tabelle 6: Exemplarische Homologe von I-DmoI, die aus anderen Organismen kloniert werden können.
    Uni-Prot Eintrag-Nr. Organismus SEQ ID NR: Aminosäuresequenzidentität zu I-CeuI
    P21505 D. mobilis 75 100%
    Q6L6Z4 Thermoproteus sp. 76 51%
    Q6L6Z5 Thermoproteus sp. 77 50%
    A3MXB6 P. calidifontis 78 49%
  • Homologe von Endonukleasen, die aus anderen Organismen kloniert werden, könnten eine andere enzymatische Aktivität, DNA-Bindungsaffinität, Dimerbildungs-Affinität oder Änderungen in ihrer DNA-Erkenungssequenz, im Vergleich zu den Referenz-Endonukleasen, wie I-SceI für in Tabelle 1 beschriebene Homologe, I-CreI für in Tabelle 2 beschriebene Homologe, oder PI-SceI für in Tabelle 3 beschriebene Homologe, oder I-CeuI für in Tabelle 4 beschriebene Homologe, oder I-ChuI für in Tabelle 5 beschriebene Homologe, oder I-DmoI für in Tabelle 6 beschriebene Homologe, aufweisen.
  • Bevorzugt sind LAGLIDADG-Endonukleasen, für welche genaue Proteinkristallstrukturen bestimmt worden sind, wie I-Dmo I, H-Dre I, I-Sce I, I-Cre I, Homologe von einer beliebigen von diesen, die mindestens 49%, 51%, 58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität auf Aminosäure-Ebene aufweisen und die leicht auf Kristallstrukturen von I-Dmo I, H-Dre I, I-Sce I, I-Cre I modelliert werden können. Ein Beispiel einer Endonuklease, die auf der Kristallstruktur von I-Cre I modelliert werden kann, ist I-Mso I (SEQ ID NR: 84), (Chevalier et al., Flexible DNA Target Site Recognition by Divergent Homing Endonuclease Isoschizomers I-CreI and I-MsoI, J. Mol. Biol. (2003) 329, Seiten 253–269).
  • Ein anderer Weg zum Erzeugen von Homologen von LAGLIDADG-Endonukleasen besteht darin, die Aminosäuresequenz einer LAGLIDADG-Endonuklease zu mutieren, um ihre DNA-Bindungsaffinität, ihre Dimerbildungsaffinität zu modifizieren oder ihre DNA-Erkennungssequenz zu verändern. Die Bestimmung der Proteinstruktur sowie Sequenzalignments von Homologen von LAGLIDADG-Endonukleasen ermöglichen rationelle Wahloptionen bezüglich der Aminosäuren, welche verändert werden können, um ihre enzymatische Aktivität, ihre DNA-Bindungsaffinität, ihre Dimerbildungsaffinität zu beeinflußen oder ihre DNA-Erkennungssequenz zu verändern.
  • Homologe von LAGLIDADG-Endonukleasen, die mutiert worden sind, um ihre DNA-Bindungsaffinität, ihre Dimerbildungsaffinität zu modifizieren oder ihre DNA-Erkennungsstelle zu verändern, werden als gentechnisch veränderte bzw. konstruierte Endonukleasen bezeichnet. Eine Vorgehensweise zur Erzeugung von konstuierten Endonukleasen besteht darin, molekulare Evolution anzuwenden. Polynukleotide, welche ein Kandidaten-Endonuklease-Enzym codieren, können zum Beispiel mit DNA-Shuffling-Protokollen moduliert werden. DNA-Shuffling ist ein Verfahren der rekursiven Rekombination und Mutation, durchgeführt durch zufallsmäßige Fragmentierung eines Pools von verwandten Genen, gefolgt von Reassemblierung der Fragmente durch ein Polymerasekettenreaktion-ähnliches Verfahren; siehe z. B. Stemmer (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91: 10747–10751; Stemmer (1994) Nature 370: 389–391; und US 5 605 793 , US 5 837 458 , US 5 830 721 und US 5 811 238 . Konstruierte Endonukleasen können auch unter Anwendung von ”Rational Design” erzeugt werden, basierend auf einer weiteren Kenntnis der Kristallstruktur einer gegebenen Endonuklease, siehe zum Beispiel Fajardo-Sanchez et al., "Computer design of obligate heterodimer meganucleases allows efficient cutting of custom DNA sequences", Nucleic Acids Research, 2008, Band 36, Nr. 7, 2163–2173.
  • Zahlreiche Beispiele von gentechnisch veränderten Endonukleasen, sowie ihre jeweiligen DNA-Erkennungsstellen, sind im Fachgebiet bekannt und werden zum Beispiel offenbart in: WO 2005/105989 , WO 2007/034262 , WO 2007/047859 , WO 2007/093918 , WO 2008/093249 , WO 2008/102198 , WO 2008/152524 , WO 2009/001159 , WO 2009/059195 , WO 2009/076292 , WO 2009/114321 oder WO 2009/134714 , WO 10/001189 , welche alle hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind.
  • Gentechnisch veränderte Versionen von I-SceI, I-CreI, I-MsoI und I-CeuI mit einer erhöhten oder verminderten DNA-Bindungsaffinität sind zum Beispiel in WO07/047859 und WO09/076292 offenbart.
  • Falls nicht explizit anderslautend erwähnt, werden alle Mutanten gemäß den Aminosäure-Nummern der Wildtyp-Aminosäuresequenzen der betreffenden Endonuklease benannt, z. B. besitzt die Mutante L19 von I-SceI einen Aminosäureaustausch von Leucin an Position 19 der I-SceI-Wildtyp-Aminosäuresequenz, wie durch SEQ ID NR: 1 beschrieben. Die L19H-Mutante von I-SceI weist eine Ersetzung der Aminosäure Leucin an der Position 19 der Wildtyp-I-SceI-Aminosäuresequenz mit Histidin auf.
  • Zum Beispiel kann die DNA-Bindungsaffinität von I-SceI durch mindestens eine Modifikation erhöht werden, die einer Substitution entspricht, welche aus der Gruppe gewählt ist, die aus folgendem besteht:
    • (a) Substitution von D201, L19, L80, I92, Y151, Y188, I191, Y199 oder Y222 mit H, N, Q, S, T, K oder R; oder
    • (b) Substitution von N15, N17, S81, H84, N94, N120, T156, N157, S159, N163, Q165, S166, N194 oder S202 mit K oder R.
  • Die DNA-Bindungsaffinität von I-SceI kann durch mindestens eine Mutation gesenkt werden, die einer Substitution entspricht, welche aus der Gruppe gewählt ist, die aus folgendem besteht:
    • (a) Substitution von K20, K23, K63, K122, K148, K153, K190, K193, K195 oder K223 mit H, N, Q, S, T, D oder E; oder
    • (b) Substitution von L19, L80, L92, Y151, Y188, I191, Y199, Y222, N15, N17, S81, H84, N94, N120, T156, N157, S159, N163, Q165, Q166, N194 oder S202 mit D oder E.
  • Gentechnisch veränderte Versionen von I-SceI, I-CreI, I-MsoI und I-CeuI mit einer veränderten DNA-Erkennungssequenz sind in der WO07/047859 und WO09/076292 offenbart.
  • Zum Beispiel hat eine wichtige DNA-Erkennungsstelle von I-SceI die folgende Sequenz:
    Figure 00160001
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI verändern die Präferenz für C an der Position 4 zu A: K50
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI behalten die Präferenz für C an der Position 4: K50, CE57
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI verändern die Präferenz für C an der Position 4 zu G: E50, R57, K57.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI verändern die Präferenz für C an der Position 4 zu T: K57, M57, Q50.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI verändern die Präferenz für C an der Position 5 zu A: K48, Q102.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI behalten die Präferenz für C an der Position 5: R48, K48, E102, E59
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI verändern die Präferenz für C an der Position 5 zu G: E48, K102, R102.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI verändern die Präferenz für C an der Position 5 zu T: Q48, C102, L102, V102.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI verändern die Präferenz für C an der Position 6 zu A: K59.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI behalten die Präferenz für C an der Position 6: R59, K59.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI verändern die Präferenz für C an der Position 6 zu G: K84, E59.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI verändern die Präferenz für C an der Position 6 zu T: Q59, Y46.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI verändern die Präferenz für T an der Position 7 zu A: 046, L46, V46.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI verändern die Präferenz für T an der Position 7 zu C: R46, K46, E86.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI verändern die Präferenz für T an der Position 7 zu G: K86, R86, E46.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI behalten die Präferenz für T an der Position 7: K68, C86, L86, Q46*.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI verändern die Präferenz für G an der Position 8 zu A: K61, S61, V61, A61, L61.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI verändern die Präferenz für G an der Position 8: E88, R61, H61.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI behalten die Präferenz für G an der Position 8: E61, R88, K88.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI verändern die Präferenz für G an der Position 8 zu T: K88, Q61, H61.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI verändern die Präferenz für T an der Position 9 zu A: T98, C98, V98, L9B.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI verändern die Präferenz für T an der Position 9 zu C: R98, K98.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI verändern die Präferenz für T an der Position 9 zu G: E98, D98.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI behalten die Präferenz für T an der Position 9: Q98.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI verändern die Präferenz für T an der Position 10 zu A: V96, C96, A96.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI verändern die Präferenz für T an der Position 10 zu C: K96, R96.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI verändern die Präferenz für T an der Position 10 zu G: D96, E96.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI behalten die Präferenz für T an der Position 10: Q96.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI behalten die Präferenz für A an der Position 11: C90, 190.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI verändern die Präferenz für A an der Position 11 zu C: K90, R90.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI verändern die Präferenz für A an der Position 11 zu G: E90.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI verändern die Präferenz für A an der Position 11 zu T: Q90.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI verändern die Präferenz für T an der Position 12 zu A: Q193.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI verändern die Präferenz für T an der Position 12 zu C: E165, E193, D193.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI verändern die Präferenz für T an der Position 12 zu G: K165, R165.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI behalten die Präferenz für T an der Position 12: C165, L165, C193, V193, A193, T193, S193.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI verändern die Präferenz für C an der Position 13 zu A: C193, L193.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI behalten die Präferenz für C an der Position 13: K193, R193, D192.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI verändern die Präferenz für C an der Position 13 zu G: E193, D193, K163, R192.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI verändern die Präferenz für C an der Position 13 zu T: Q193, C163, L163.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI verändern die Präferenz für C an der Position 14 zu A: L192, C192.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI behalten die Präferenz für C an der Position 14: E161, R192, K192.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI verändern die Präferenz für C an der Position 14 zu G: K147, K161, R161, R197, D192, E192.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI verändern die Präferenz für C an der Position 14 zu T: K161, Q192.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI verändern die Präferenz für C an der Position 15 zu A: keine identifiziert.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI behalten die Präferenz für C an der Position 15: E151.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI verändern die Präferenz für C an der Position 15 zu G: K151.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI verändern die Präferenz für C an der Position 15 zu T: C151, L151, K151.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI behalten die Präferenz für A an der Position 17: N152, S152, C150, L150, V150, T150.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI verändern die Präferenz für A an der Position 17 zu C: K152, K150.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI verändern die Präferenz für A an der Position 17 zu G: N152, S152, D152, D150, E150.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI verändern die Präferenz für A an der Position 17 zu T: Q152, Q150.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI verändern die Präferenz für G an der Position 18 zu A: K155, C155.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI verändern die Präferenz für G an der Position 18: R155, K155.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI behalten die Präferenz für G an der Position 18: E155.
  • Die folgenden Mutationen von I-SceI verändern die Präferenz für G an der Position 18 zu T: H155, Y155.
  • Kombinationen von mehreren Mutationen können den Effekt verstärken. Ein Beispiel ist die Dreifachmutante W149G, D150C und N152K, welche die Präferenz von I-SceI für A an der Position 17 zu G verändert.
  • Zur Beibehaltung der enzymatischen Aktivität der LAGLIDADG-Endonukleasen sollten die folgenden Mutationen vermieden werden:
  • Für I-Sce I: I38S, I38N, G39D, G39R, L40Q, L42R, D44E, D44G, D44H, D44S, A45E, A45D, Y46D, I47R, I47N, D144E, D145E, D145N und G146E.
    für I-CreI: Q47E,
    für I-CeuI E66Q,
    für I-MsoI D22N,
    für PI-SceI Mutationen in D218, D229, D326 oder T341.
  • Gentechnisch veränderte Endonukleasevarianten von I-AniI mit hoher enzymatischer Aktivität können in Takeuchi et al., Nucleic Acid Res. (2009), 73(3): 877 bis 890, gefunden werden. Bevorzugte gentechnisch veränderte Endonukleasevarianten von I-Ani I, wie durch SEQ ID NR: 142 beschrieben, umfassen die folgenden Mutationen: F13Y und S111Y, oder F13Y, S111Y und K222R, oder F13Y, I55V, F91I, S92T und S111Y.
  • Mutationen, welche die DNA-Bindungsaffinität, die Dimerbildungsaffinität ändern oder die DNA-Erkennungssequenz einer gegebenen Endonuklease, z. B. einer LAGLIDADG-Endonuklease, verändern, können kombiniert werden, um eine gentechnisch veränderte Endonuklease zu erzeugen, z. B. eine gentechnisch veränderte Endonuklease, die auf I-SceI basiert und eine geänderte DNA-Bindungsaffinität und/oder eine veränderte DNA-Erkennungssequenz im Vergleich zu I-SceI, wie durch SEQ ID NR: 1 beschrieben, aufweist.
  • Optimierte Nukleasen:
  • Nukleasen können zum Beispiel durch Inserieren von Mutationen, um ihre DNA-Bindungsspezifität zu verändern, z. B um ihre DNA-Erkennungsstelle mehr oder weniger spezifisch zu machen, oder durch Anpassen der für die Nuklease codierenden Polynukleotidsequenz an die Codon-Benutzung des Organismus, in dem die Endonuklease exprimiert werden soll, oder durch Deletieren von alternativen Startcodons oder durch Deletieren von kryptischen Polyadenylierungssignalen aus der für die Endonuklease codierenden Polynukleotidsequenz optimiert werden.
  • Mutationen und Veränderungen zur Erzeugung optimierter Nukleasen können mit den Mutationen, die zum Erzeugen gentechnisch veränderter Endonukleasen verwendet werden, kombiniert werden, zum Beispiel kann ein Homolog von I-SceI eine optimierte Nuklease sein, wie hierin beschrieben, aber kann auch Mutationen umfassen, die verendet werden, um ihre DNA-Bindungsaffinität zu ändern und/oder ihre DNA-Erkennungssequenz zu verändern.
  • Die weitere Optimierung von Nukleasen kann die Proteinstabilität steigern. Demzufolge umfassen optimierte Nukleasen keine, oder besitzen eine im Vergleich zur Aminosäuresequenz der nicht-optimierten Nuklease verminderte Zahl an:
    • a) PEST-Sequenzen,
    • b) KEN-Boxen
    • c) A-Boxen,
    • d) D-Boxen, oder
    • e) umfassen ein hinsichtlich Stabilität gemäß der N-Enden-Regel optimiertes N-terminales Ende,
    • f) umfassen ein Glycin als die zweite N-terminale Aminosäure, oder
    • g) jedwede Kombination von a), b), c) d), e) und f).
  • PEST-Sequenzen müssen mindestens ein Prolin (P), ein Aspartat (D) oder Glutamat (E) und mindestens ein Serin (S) oder Threonin (T) enthalten. Negativ geladene Aminosäuren sind innerhalb dieser Motive geclustert, während positiv geladene Aminosäuren, Arginin (R), Histidin (H) und Lysin (K), generell verboten sind. PEST-Sequenzen sind zum Beispiel in Rechsteiner M, Rogers SW. "PEST sequences and regulation by proteolysis." Trends Biochem. Sci. 1996; 21(7), Seiten 267 bis 271, beschrieben.
  • Die Aminosäure-Consensus-Sequenz einer KEN-Box ist: KENXXX(N/D)
  • Die Aminosäure-Consensus-Sequenz einer A-Box ist: AQRXLXXSXXXQRVL
  • Die Aminosäure-Consensus-Sequenz einer D-Box ist: RXXL
  • Ein weiterer Weg zum Stabilisieren von Nukleasen gegen Abbau besteht darin, die Aminosäuresequenz des N-Terminus der betreffenden Endonuklease gemäß der N-Enden-Regel zu optimieren. Nukleasen, welche für die Expression in Eukaryoten optimiert sind, umfassen entweder Methionin, Valin, Glycin, Threonin, Serin, Alanin oder Cystein nach dem Start-Methionin ihrer Aminosäuresequenz. Nukleasen, welche für die Expression in Prokaryoten optimiert sind, umfassen entweder Methionin, Valin, Glycin, Threonin, Serin, Alanin, Cystein, Glutaminsäure, Glutamin, Asparaginsäure, Asparagin, Isoleucin oder Histidin nach dem Start-Methionin ihrer Aminosäuresequenz.
  • Nukleasen können ferner durch Deletieren von 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 oder 1 Aminosäuren von deren Aminosäuresequenz, ohne deren Endonuklease-Aktivität zu zerstören, optimiert werden. Zum Beispiel ist es in dem Fall, dass Teile der Aminosäuresequenz einer LAGLIDADG-Endonuklease deletiert werden, wichtig, das oben beschriebene LAGLIDADG-Endonuklease-Motiv beizubehalten.
  • Es wird bevorzugt, PEST-Sequenzen oder andere destabilisierende Motive, wie KEN-Box, D-Box und A-Box, zu deletieren. Diese Motive können auch durch Einbringen von Einzel-Aminosäureaustauschen, z. B Einbringung einer positiv geladenen Aminosäure (Arginin, Histidin und Lysin) in die PEST-Sequenz zerstört werden.
  • Ein anderer Weg zum Optimieren von Nukleasen besteht darin, nukleare bzw. Zellkern-Lokalisationssignale an die Aminosäuresequenz der Nuklease anzufügen, zum Beispiel ein Zellkern-Lokalisationssignal, wie es bei SEQ ID NR: 4 beschrieben ist.
  • Optimierte Nukleasen können eine Kombination der oben beschriebenen Verfahren und Merkmale umfassen, z. B. können sie ein Zellkern-Lokalisationssignal umfassen, ein Glycin als die zweite N-terminale Aminosäure oder eine Deletion am C-Terminus oder eine Kombination dieser Merkmale umfassen. Beispiele von optimierten Nukleasen, die eine Kombination der oben beschriebenen Verfahren und Merkmale aufweisen, sind zum Beispiel durch die SEQ ID NRn: 2, 3 und 5 beschrieben.
  • In einer Ausführungsform ist die optimierte Nuklease ein optimiertes I-Sce-I, welches keine Aminosäuresequenz umfasst, die durch die folgende Sequenz beschrieben ist: HVCLLYDQWVLSPPH, LAYWFMDDGGK, KTIPNNLVENYLTPMSLAYWFMDDGGK, KPIIYIDSMSYLIFYNLIK, KLPNTISSETFLK oder TISSETFLK,
    oder welches keine Aminosäuresequenz umfasst, die durch die folgende Sequenz beschrieben ist: HVCLLYDQWVLSPPH, LAYWFMDDGGK, KPIIYIDSMSYLIFYNLIK, KLPNTISSETFLK oder TISSETFLK,
    oder welches keine Aminosäuresequenz umfasst, die durch die folgende Sequenz beschrieben ist: HVCLLYDQWVLSPPH, LAYWFMDDGGK, KLPNTISSETFLK oder TISSETFLK,
    oder welches keine Aminosäuresequenz umfasst, die durch die folgende Sequenz beschrieben ist: LAYWFMDDGGK, KLPNTISSETFLK oder TISSETFLK,
    oder welches keine Aminosäuresequenz umfasst, die durch die folgende Sequenz beschrieben ist: KLPNTISSETFLK oder TISSETFLK.
  • In einer Ausführungsform handelt es sich bei der optimierten Nuklease um I-SceI, oder dessen Homologe mit mindestens 49%, 51%, 58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität auf Aminosäureebene, wobei die Aminosäuresequenz TISSETFLK am C-Terminus von Wildtyp-I-SceI oder dessen Homologen, die mindestens 49%, 51%, 58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität auf Aminosäureebene aufweisen und eine Aminosäuresequenz TISSETFLK am C-Terminus besitzen, deletiert oder mutiert ist.
  • Die Aminosäuresequenz TISSETFLK kann durch Deletieren oder Mutieren von mindestens 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 oder 9 Aminosäuren des C-Terminus von Wildtyp-I-SceI oder dessen Homologen, die mindestens 49%, 51%, 58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität auf Aminosäureebene aufweisen und eine Aminosäuresequenz TISSETFLK am C-Terminus besitzen, deletiert oder mutiert werden. Tabelle 7: Verschiedene Beispiele für Deletionen der TISSETFLK-Aminosäuresequenz in Wildtyp-I-SceI
    Wildtyp und optimierte I-SceI Aminosäuresequenz am C-Terminus
    I-SceI Wildtyp TISSETFLK
    I-SceI -1 TISSETFL
    I-SceI -2 TISSETF
    I-SceI -3 TISSET
    I-SceI -4 TISSE
    I-SceI -5 TISS
    I-SceI -6 TIS
    I-SceI -7 TI
    I-SceI -8 T
    I-SceI -9 alle 9 Aminosäuren am C-Terminus von wt I-SceI deletiert
  • Alternativ dazu kann die Aminosäuresequenz TISSETFLK mutiert werden, z. B. zu der Aminosäuresequenz: TIKSETFLK (SEQ ID NR: 149), oder AIANQAFLK (SEQ ID NR: 150).
  • Gleichermaßen bevorzugt ist es, das Serin an Position 229 der Aminosäuresequenz von Wild-typ-I-SceI, wie offenbart in SEQ ID Nr. 1 (ist die Aminosäure 230 bei Bezugnahme auf SEQ ID Nr. 2) zu Lys, Ala, Pro, Gly, Glu, Gln, Asp, Asn, Cys, Tyr oder Thr zu mutieren. Hierdurch werden die I-SceI-Mutanten S229K, S229A, S229P, S229G, S229E, S229Q, S229D, S229N, S229C, S229P oder S229T erzeugt (Aminosäuren sind gemäß SEQ ID Nr. 1 nummeriert).
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird die Aminosäure Methionin an der Position 203 der Aminosäuresequenz von Wildtyp-I-SceI, wie in SEQ ID Nr. 1 offenbart (welche die Aminosäure 204 bei Bezugnahme auf SEQ ID Nr. 2 ist), zu Lys, His oder Arg mutiert, wodurch die I-SceI-Mutante M203K, M203H und M203R erzeugt wird.
  • Bevorzugte optimierte Versionen von I-SceI sind die Deletionen I-SceI -1, I-SceI -2, I-SceI -3, I-SceI -4, I-SceI -5, I-SceI -6, I-SceI -7, I-SceI -8, I-SceI -9 und die Mutanten S229K und S229N, S229R, noch bevorzugter sind die Deletionen I-SceI -1, I-SceI -2, I-SceI -3, I-SceI -4, I-SceI -5, I-SceI -6 und die Mutante S229K.
  • Es ist auch möglich, die oben beschriebenen Deletionen und Mutationen zu kombinieren, z. B. durch Kombinieren der Deletion I-SceI -1 mit der Mutante S229K, wodurch die Aminosäuresequenz TIKSETFL am C-Terminus erzeugt wird.
  • Es ist auch möglich, die oben beschriebenen Deletionen und Mutationen zu kombinieren, z. B.
  • durch Kombinieren der Deletion I-SceI -1 mit der Mutante S229A, wodurch die Aminosäuresequenz TIASETFL am C-Terminus erzeugt wird.
  • Weiter bevorzugte optimierte Versionen von I-SceI sind die Deletionen I-SceI -1, I-SceI -2, I-SceI -3, I-SceI -4, I-SceI -5, I-SceI -6, I-SceI -7, I-SceI -8, I-SceI -9 oder die Mutanten S229K und S229H, S229R, in Kombination mit der Mutation M203K, M203H, M203R. Noch stärker bevorzugt sind die Deletionen I-SceI -1, I-SceI -2, I-SceI -3, I-SceI -4, I-SceI -5, I-SceI -6 oder die Mutante S229K in Kombination mit der Mutation M203K.
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden die Aminosäuren Glutamin an der Position 75, Glutaminsäure an der Position 130 oder Tyrosin an der Position 199 der Aminosäuresequenz von Wildtyp-I-SceI, wie in SEQ ID Nr. 1 offenbart (welche die Aminosäuren 76, 131 und 120 bei Bezugnahme auf SEQ ID Nr. 2 sind), zu Lys, His oder Arg mutiert, wodurch man die I-SceI-Mutanten Q75K, Q75H, Q75R, E130K, E130H, E130R, Y199K, Y199H und Y199R erzeugt.
  • Die oben beschriebenen Deletionen und Mutationen sind auch anwendbar auf ihre Homologen von I-SceI, welche mindestens 49%, 51%, 58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität auf Aminosäureebene aufweisen und eine Aminosäuresequenz TISSETFLK am C-Terminus besitzen.
  • Demzufolge ist, in einer Ausführungsform der Erfindung, die optimierte Endonuklease eine optimierte Version von I-SceI oder einem ihrer Homologe mit mindestens 49%, 51%, 58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität auf Aminosäureebene, und mit einer oder mehreren der Mutationen oder Deletionen, die aus der Gruppe von: I-SceI -1, I-SceI -2, I-SceI -3, I-SceI -4, I-SceI -5, I-SceI -6, I-SceI -7, I-SceI -8, I-SceI -9, S229K, S229A, S229P, S229G, S229E, S229Q, S229D, S229N, S229C, S229Y, S229T, M203K, M203H, M203R, Q77K, Q77H, Q77R, E130K, E130H, E130R, Y199K, Y199H und Y199R gewählt sind, wobei die Aminosäurenummern in Bezug auf die Aminosäuresequenz, wie durch SEQ ID NR: 1 beschrieben, referenziert sind.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die optimierte Endonuklease eine optimierte Version von I-SceI oder einem ihrer Homologe mit mindestens 49%, 51%, 58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität auf Aminosäureebene und mit einer oder mehreren von den Mutationen oder Deletionen, die aus der Gruppe von: I-SceI -1, I-SceI -2, I-SceI -3, I-SceI -4, I-SceI -5, I-SceI -6, S229K und M203K gewählt sind, wobei die Aminosäurenummern in Bezug auf die Aminosäuresequenz, wie durch SEQ ID NR: 1 beschrieben, referenziert sind.
  • Eine besonders bevorzugte optimierte Endonuklease ist eine Wildtyp- oder gentechnisch veränderte Version von I-SceI, wie durch SEQ ID NR: 1 beschrieben, oder eines von ihren Homologen mit mindestens 49%, 51%, 58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität auf Aminosäureebene, und aufweisend eine oder mehrere Mutationen, die aus den folgenden Gruppen gewählt sind:
    • a) I-SceI -1, I-SceI -2, I-SceI -3, I-SceI -4, I-SceI -5, I-SceI -6, I-SceI -7, I-SceI -8 und I-SceI -9;
    • b) S229K, S229A, S229P, S229G, S229E, S229Q, S229D, S229N, S229C, S229Y, S229T, M203K, M203H, M203R, Q77K, Q77H, Q77R, E130K, E130H, E130R, Y199K, Y199H und Y199R;
    • c) ein Methionin, Valin, Glycin, Threonin, Serin, Alanin, Cystein, Glutaminsäure, Glutamin, Asparaginsäure, Asparagin, Isoleucin oder Histidin nach dem Start-Methionin ihrer Aminosäuresequenz; oder
    • d) eine Kombination von einer oder mehreren Mutationen, die aus obigen a) und b), a) und c), b) und c) oder a) b) und c) gewählt wird.
  • Heterologe DNA-Bindungsdomänen:
  • Die chimäre Endonuklease der Erfindung umfasst mindestens eine heterologe DNA-Bindungsdomäne.
  • Heterologe DNA-Bindungsdomänen sind Polypeptide, die an Polynukleotide mit einer spezifischen Polynukleotidsequenz (Erkennungssequenz oder Operatorsequenz) binden. Beispiele für heterologe DNA-Bindungsdomänen sind eukaryotische, prokaryotische oder virale Transkriptionsfaktoren. In einer Ausführungsform der Erfindung wird nur die DNA-Bindungsdomäne des eukaryotischen, prokaryotischen oder viralen Transkriptionsfaktors als heterologe DNA-Bindungsdomäne verwendet.
  • Vorzugsweise werden heterologe DNA-Bindungsdomänen ausgewählt aus eukaryotischen, prokaryotischen und viralen Transkriptionsfaktoren oder ihren jeweiligen DNA-Bindungsdomänen, die DNA als Monomere oder Einzelketten-Varianten binden, die ihre DNA-Erkennungssequenz mit hoher Affinität und Spezifität binden, und die einen N- oder C-Terminus auf der Oberfläche des Proteins aufweisen.
  • Besonders bevorzugt sind eukaryotische, prokaryotische und virale Transkriptionsfaktoren oder ihre jeweiligen DNA-Bindungsdomänen, von denen die dreidimensionale Struktur von mindestens einem Homolog der jeweiligen eukaryotischen, prokaryotischen und viralen Transkriptionsfaktoren oder ihrer jeweiligen DNA-Bindungsdomäne bestimmt worden ist.
  • Der Begriff heterologe DNA-Bindungsdomäne soll nicht mehr als zwei Repetitionen von modularen C2H2-Zinkfingerdomänen umfassen, wie zum Beispiel in WO07/014275 , WO08/076290 , WO08/076290 oder WO03/062455 offenbart. C2H2-Zinkfingerdomänen besitzen konservierte Cystein- und Histidinreste, welche das einzelne Zinkatom in jeder Fingerdomäne tetraedrisch koordinieren, und sind durch Fingerkomponenten mit der allgemeinen Sequenz: -Cys-(X)2-4-Cys-(X)12-His-(X)3-5-His- gekennzeichnet, worin X für eine beliebige Aminosäure steht (die C2H2-ZFPs).
  • Zahlreiche eukaryotische, prokaryotische und virale Transkriptionsfaktoren, sowie ihre jeweiligen Erkennungssequenzen oder Operatorsequenzen sind im Stand der Technik beschrieben worden. Informationen zu eukaryotischen, prokaryotischen und viralen Transkriptionsfaktoren sowie ihre jeweiligen Erkennungssequenzen sowie zahlreiche dreidimensionale Strukturen können in öffentlich verfügbaren Datenbanken und bioinformatischen Analyse-Werkzeugen gefunden werden, beispielsweise in:
    JASPAR 2010 (Partales-Casamar et al. (2009), Nucl. Acids Res., 1 bis 6),
    UniPROBE (Newburger, D. E. und Bulyk, M. L. (2008), Nucl. Acids Res., 37, Datenbank-Ausgabe, D77 bis D82),
    PLACE (Higo et al. (1999), Nucl. Acids Res., 27 (1), 297 bis 300).
    RegTransBase (Kazakov, A. E., et al. (2007) Nucleic acids research 35, D407 bis 412)
    RegulonDB (Gama-Castro, S., et al. (2008) Nucleic acids research 36, D120 bis 124)
    DqP Interact (Robison, K., et al. (1998) J Mol Biol 284, 241 bis 254)
    FlyReg (Bergman, C. M., et al. (2005) Bioinformatics 21, 1747 bis 1749)
    Zhu, C., et al. (2009), Genome Res 19, 556 bis 566
    Harbison, C. T., et al. (2004), Nature 431, 99 bis 104
    Maclsaac, K. D., et al. (2006) BMC Bioinformatics 7, 113
  • Die ”DNA binding domain database” (DBD) (http://transcriptionfactor.org) enthält Vorhersagen von Sequenz-spezifischen Transkriptionsfaktoren aus über 700 Spezies (Teichmann (2007) Nucleic Acids Research 36: D88–D92).
  • Bevorzugte heterologe DNA-Bindungsdomänen sind Proteine mit bekannten Bindungseigenschaften und Erkennungssequenzen; weiter bevorzugt Proteine, die mit ihrem spezifischen DNA-Ziel co-kristallisiert wurden.
  • Eukaryotische, prokaryotische und virale Transkriptionsfaktoren sind in mehrere Proteinfamilien gruppiert worden, die eine individuelle PF-Nummer als Kennung besitzen.
  • Heterologe DNA-Bindungsdomänen können zum Beispiel in den folgenden Proteinfamilien gefunden werden:
    PF00126 Bakterielles regulatorisches Helix-turn-helix-Protein, lysR-Familie
    PF00486 Transkriptionales regulatorisches Protein, C-terminal
    PF04383 KilA-N-Domäne
    PF01381 Helix-turn-helix
    PF02954 Bakterielles regulatorisches Protein, Fis-Familie
    PF00313 Kälteschock DNA-Bindungsdomäne
    PF00325 Bakterielle regulatorische Proteine, crp-Familie
    PF01047 MarR-Familie
    PF04299 Putative FMN-Bindungsdomäne
    PF00392 Bakterielle regulatorische Proteine, gntR-Familie
    PF00165 Bakterielle regulatorische Helix-turn-helix-Proteine, AraC-Familie
    PF05225 Helix-turn-helix, Psq-Domäne
    PF00847 AP2-Domäne
    PF04967 HTH-DNA-Bindungsdomäne
    PF08279 HTH-Domäne
    PF01022 Bakterielles regulatorisches Protein, arsR-Familie
    PF00196 Bakterielle regulatorische Proteine, luxR-Familie
    PF00010 Helix-loop-helix-DNA-Bindungsdomäne
    PF00356 Bakterielle regulatorische Proteine, lacI-Familie
    PF02082 Transkriptioneller Regulator
    PF00292 ”Paired box”-Domäne
    PF04397 LytTr-DNA-Bindungsdomäne
    PF03749 Zuckerfermentations-Stimulationsprotein
    PF04353 Regulator der RNA-Polymerase Sigma70-Untereinheit, Rsd/AlgQ
  • Vorzugsweise werden heterologe DNA-Bindungsdomänen aus Mitgliedern der folgenden Proteinfamilien ausgewählt:
    PF00126 Bakterielles regulatorisches Helix-turn-helix-Protein, lysR-Familie
    PF00165 Bakterielle regulatorische Helix-turn-helix-Proteine, AraC-Familie
    PF01022 Bakterielles regulatorisches Protein, arsR-Familie
    PF00196 Bakterielle regulatorische Proteine, luxR-Familie
    PF00010 Helix-loop-helix-DNA-Bindungsdomäne
    PF00356 Bakterielle regulatorische Proteine, lacI-Familie
  • Noch stärker bevorzugt sind Mitglieder der folgenden Proteinfamilien:
    PF00126 Bakterielles regulatorisches Helix-turn-helix-Protein, lysR-Familie
    PF00165 Bakterielle regulatorische Helix-turn-helix-Proteine, AraC-Familie
    PF00196 Bakterielle regulatorische Proteine, luxR-Familie
    PF00356 Bakterielle regulatorische Proteine, lacI-Familie
  • Eine besonders bevorzugte Gruppe von heterologen DNA-Bindungsdomänen sind Proteine, die eine Helix-turn-Helix-DNA-Bindungsdomäne (HTH-Domäne) umfassen. Solche Proteine sind zum Beispiel scTetR, ArcR und Proteine der LadI-, AraC- und MerR-Proteinfamilien.
  • Informationen über die TetR (scTetR)-Proteinfamilie kann man finden in: Ramos J. L. et al. "The RetR Family of Transcriptional Repressors", Microbiology and Molecular Biology Reviews (2005), Seiten 326 bis 356, und Ralph Bertram et al., "The application of Tet repressor in prokaryotic gene regulation and expression.", (2008) Microbial Biotechnology, 1(1), Seiten 2–16, und Marcus Krueger et al., "Engineered Tet repressors with recognition specificity for the tetO-4C5G Operator variant", (2007), Gene, 404, Seiten 93–100, und Xue Zhou et al., "Improved single-chain transactivators of the Tet-On gene expression system", (2007), BMC Biotechnology, 7: 6.
  • Beispiele und gemeinsame Merkmale von Proteinen, die der TetR-Proteinfamilie angehören, sind durch SEQ ID NR: 86, 87, 88, 89 und 90 und das in 8 gezeigte Alignment angegeben, Beispiele und gemeinsame Merkmale der jeweiligen HTH-Domänen sind durch SEQ ID NR: 91, 92, 93, 94 und 95 sowie das in 9a gezeigte Alignment angegeben.
  • Informationen über die LacI (Lac-Repressor oder Lac-Inhibitor)-Proteinfamilie können gefunden werden in: Weickert J. M. und Adhya S., "A Family of Bacterial Regulators Homologous to Gal and Lac Repressors", The Journal of Biological Chemistry, Bd. 267, Seiten 15869 bis 15874, und Liskin Swint-Kruse et al., "Allostery in the LacI/GalR family: variations an a theme", (2009), Current Opinion in Microbiology, 12: 129–137, und Catherine M. Falcon et al., "Operator DNA Sequence Variation Enhances High Affinity Binding by Hinge Helix Mutants of Lactose Repressor Protein", (2000), Biochemistry, 39, 11074–11083, und Christof Francke et al., "A generic approach to identify Transcription Factor-specific operator motifs; Inferences for Lacl-family mediated regulation in Lactobacillus plantarum WCFS1", (2008), BMC Genomics, 9: 145. Beispiele und gemeinsame Merkmale der HTH-Domänen von Proteinen, die der Lac-Repressor-Proteinfamilie angehören, sind durch SEQ ID NR: 101, 102, 103, 104 und 105 sowie das in 10a gezeigte Alignment angegeben.
  • Mitglieder der AraC-Proteinfamilie und Informationen über gemeinsame Merkmale dieser Proteine sind zum Beispiel beschrieben in: Martin, R. Rosner, "The AraC transcriptional activators", Current Opinion in Microbiology (2001), Band 4, Seiten 132 bis 137. Mitglieder der AraC-Proteinfamilie, die zwei HTH-Domänen aufweisen, sind zum Beispiel Homologe des MarA-Proteins. Informationen über MarA und verwandte Proteine können gefunden werden in: Sangkee Rhee et al., "A novel DNA-binding motif in MarA: The first structure of an AraC family transcriptional activator", PNAS (1998), Band 95, Seiten 10413 bis 10418, und in Gillette W. K. et al., "Probing the Escherichia coli Transcriptional Activator MarA using Alanine-scanning Mutagenesis: Residues Important for DNA Binding and Activation", JMB (2000), Band 299, Seiten 1245 bis 1255.
  • Beispiele und gemeinsame Merkmale von Proteinen, die der AraC-Proteinfamilie angehören, insbesondere von Homologen von MarA, sind durch SEQ ID NR: 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126 und 127 sowie das in 12 gezeigte Alignment angegeben. Beispiele und gemeinsame Merkmale der HTH-Domänen von Proteinen, die der AraC-Protein-Proteinfamilie angehören, insbesondere Homologen von MarA, sind durch SEQ ID NR: 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118 und 119 sowie das in 11 gezeigte Alignment angegeben.
  • Informationen über die MerR-Proteinfamilie und gemeinsame Merkmale ihrer HTH-Domäne kann man finden in: Brown N. L. et al. "The MerR family of transcriptional regulators" FEMS Microbiology Reviews (2003), Band 27, Seiten 145 bis 163. Beispiele und gemeinsame Merkmale der HTH-Domänen von Proteinen, die der MerR-Protein-Proteinfamilie angehören, sind durch SEQ ID NR: 106, 107, 108, 109, 110 und 111 sowie das in 10b gezeigte Alignment angegeben.
  • Zum scArcR-Protein, wie durch SEQ ID NR: 7 beschrieben, ähnliche Proteine umfassen eine HTH-Domäne für DNA-Bindung, wobei verschiedene Beispiele und gemeinsame Merkmale dieser HTH-Domänen durch SEQ ID NR: 96, 97, 98, 99 und 100 sowie das in 9b gezeigte Alignment angegeben sind.
  • Vertreter der WRKY-Proteinfamilie und Informationen über gemeinsame Merkmale dieser Proteine sind zum Beispiel in: Eulgem, T. et al. "The WRKY superfamily of plant transcription factors." (2000) Trends Plant Sci., 5, Seiten 199 bis 206, und Ming-Rui Duan et al. "DNA binding mechanism revealed by high resolution crystal structure of Arabidopsis thaliana WRKY1 protein" (2007), Nucleic Acids Research, Band 35, Nr. 4, 1145–1154, beschrieben, welche hierin zur Bezugnahme in ihrer Gesamtheit einbezogen sind.
  • Andere geeignete heterologe DNA-Bindungsdomänen sind inaktive Endonukleasen. Solche Endonukleasen können in dem Zielorganismus inaktiv sein, weil sie nur unter bestimmten, üblicherweise extremeren Bedingungen (zum Beispiel hohe Temperatur) wirken. Alternativ dazu, kann man eine mutierte Endonuklease verwenden, wobei die Mutation die Endonuklease inaktiv macht. Inaktive Endonukleasen sind zum Beispiel, ohne jedoch andere auszuschließen: I-DmoI oder andere termophylische Endonukleasen, die bei Temperaturen unter 40°C, stärker bevorzugt unter 30°C, noch bevorzugter unter 25°C verwendet werden, sowie Endonukleasen mit Aminosäuresubstitutionen in ihren aktiven Zentr(en), zum Beispiel I-CreI mit der Mutation von Q47 zu E, I-Sce I mit der Mutation von D44 oder D145 zu N, I-CeuI mit der Mutation E66 zu Q, oder I-MsoI mit der Mutation D22 zu N. Eine bevorzugte inaktive Endonuklease ist I-Sce I mit der Mutation von D44 zu S (I-SceID44S). So zum Beispiel die folgenden Aminosäurereste von PI-SceI: D218, D229, D326 und T341; Pingoud (2000) Biochemistry 39: 15895-15900.
  • In einer Ausführungsform ist mindestens eine heterologe DNA-Bindungsdomäne eine inaktive I-SceI, I-CreI, I-CeuI, I-ChuI, I-DmoI, Pi-SceI, I-MsoI, oder I-AniI oder ein inaktives Homolog von diesen mit mindestens 45%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% Aminosäuresequenzidentität. In einer Ausführungsform ist die heterologe DNA-Bindungsdomäne eine inaktive Version von einer LAGLIDADG-Endonukleasen mit einer Aminosäuresequenz, wie beschrieben durch mindestens eine von SEQ ID NR: 1, 2, 3, 5, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 142 oder 159, vorzugsweise mit einer Aminosäuresequenz, wie durch eine beliebige von SEQ ID NR: 1, 2, 3, 5 oder 159 beschrieben.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die chimäre Endonuklease I-SceI oder eine optimierte Version von I-SceI und eine heterologe DNA-Bindungsdomäne, die eine inaktive I-SceI oder eine inaktive Version einer optimierten Version von I-SceI umfasst.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst der Begriff heterologe DNA-Bindungsdomäne nicht inaktive Endonukleasen.
  • Die heterologe DNA-Bindungsdomäne kann das Voll-Protein eines gegebenen Transkriptionsfaktors oder ein großes Fragment davon umfassen oder könnte nur ein Fragment umfassen, das mehr oder weniger auf die DNA-Bindungsdomäne eines Transkriptionsfaktors begrenzt ist.
  • Beispiele für geeignete Transkriptionsfaktoren sind zum Beispiel, ohne jedoch andere auszuschließen: scTet, scArcR, LacR, TraR, Gal, LambaR, LuxR, WRKY und Homologe von einem beliebigen von diesen mit mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität auf Aminosäure-Ebene.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die DNA-Bindungsaktivität der heterologen DNA-Bindungsdomäne durch Binden eines Induktors an mindestens eine der DNA-Bindungsdomänen induzierbar oder reprimierbar. Der Induktor kann ein Polypeptid oder eine kleine organische Substanz sein.
  • Beispiele für induzierbare oder reprimierbare oder induzierbare und reprimierbare heterologe DNA-Bindungsdomänen und ihre Induktoren oder Repressoren sind folgende:
    • scTet
    Tetracylin und Anhydrotetracyclin und andere Derivate
    LacR,
    Lactose und IPTG
    TraR,
    3OC8HL (N-(3-Oxo)-octanoyl-L-homoserinlacton)
    LuxR-Familie
    acetyliertes Homoserinlacton (AHL)
    LuxR
    3OC6HL (N-(3-Oxo)-hexa-L-homoserinlacton)
    LasR
    3OC12HL (N-(3-Oxo)-duodeca-L-homoserinlacton)
    AraC
    Arabinose
    RhaR
    Rhamnose
    MerR
    Quecksilberionen
  • Vorzugsweise besitzt die heterologe DNA-Bindungsdomäne eine Erkennungssequenz von mindestens 4, mindestens 6, mindestens 8, mindestens 10 oder mindestens 12 Basenpaaren.
  • Beispiele für Erkennungssequenzen von heterologen DNA-Bindungsdomänen sind folgende:
    Figure 00290001
    worin A für Adenin, G für Guanin, C für Cytosin, T für Thymin, R für Guanin oder Adenin, Y für Thymin oder Cytosin, K für Guanin oder Thymin, W für Adenin oder Thymin und n für Adenin oder Guanin oder Cytosin oder Thymin steht.
  • Der Fachmann auf dem Gebiet wird erkennen, dass die meisten DNA-Bindungsdomänen nicht eingeschränkt sind, um nur an die exakte Erkennungssequenz zu binden, sondern beispielsweise ebenfalls an ähnliche Erkennungssequenzen.
  • Beispiele für alternative Erkennungssequenzen von LacR-Dimeren sind
    Figure 00300001
  • Bevorzugte heterologe DNA-Bindungsdomänen sind monomere DNA-Bindungsdomänen, z. B. HTH-Domänen von Transkriptionsfaktoren oder monomere Transkriptionsfaktoren.
  • Ähnlich bevorzugt sind DNA-Bindungsdomänen mit einer hohen Spezifität für eine oder eine kleine Gruppe von Erkennungssequenzen.
  • Ebenso bevorzugt sind DNA-Bindungsdomänen mit einer hohen Affinität für eine oder eine kleine Gruppe von Erkennungssequenzen.
  • In einer Ausführungsform umfasst die heterologe DNA-Bindungsdomäne mindestens eine HTH-Domäne von scTet, scArcR, TraR, LacR, LuxR, MarA, oder MerR und Homologen von einem beliebigen von diesen mit mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, bei 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität auf Aminosäureebene.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst der Transkriptionsfaktor oder die DNA-Bindungsdomäne eines Transkriptionsfaktors eine HTH-Domäne, die eine Aminosäuresequenz von mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% Sequenzidentität zu mindestens einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NR: 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118 oder 119 beschrieben wird, vorzugsweise zu mindestens einer Aminosäuresequenz, die durch 91, 92, 93, 94, 95, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118 oder 119 beschrieben ist, umfasst.
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung umfasst die heterologe DNA-Bindungsdomäne eine HTH-Domäne mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, bei 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität auf Aminosäure-Ebene zu einer beliebigen von SEQ ID NR: 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118 oder 119.
  • In einer Ausführungsform ist die heterologe DNA-Bindungsdomäne aus der Gruppe gewählt, die aus folgendem besteht: scTet, scArcR, TraR, LacR, LuxR, MarA oder MerR und Homologe von einem beliebigen von diesen mit mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, bei 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität auf Aminosäureebene, oder das DNA-Bindungsdomänenfragment von scTet, scArcR, TraR, LacR, LuxR, Gal4 und Homologen von einem beliebigen von diesen mit mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, bei 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität auf Aminosäureebene.
  • In einer Ausführungsform ist die heterologe DNA-Bindungsdomäne aus der Gruppe gewählt, die aus folgendem besteht: scTet, scArcR, TraR, LacR, LuxR und Homologen von einem beliebigen dieser mit mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, bei 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität auf Aminosäureebene, oder das DNA-Bindungsdomänenfragment von scTet, scArcR, TraR, LacR, LuxR, Gal4 und Homologen von einem beliebigen dieser mit mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, bei 93%, 94%, 95%; 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität auf Aminosäureebene.
  • In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der heterologen DNA-Bindungsdomäne um scTet oder scArcR und Homologe von einem beliebigen von diesen mit mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, bei 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität auf Aminosäureebene, oder das DNA-Bindungsdomänenfragment von scTet oder scArcR und Homologen von einem beliebigen von diesen mit mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, bei 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität auf Aminosäure-Ebene.
  • In einer anderen Ausführungsform ist die heterologe DNA-Bindungsdomäne scTet und Homologe von scTet mit mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, bei 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität auf Aminosäureebene, oder die HTH-Domäne von scTet und Homologen von scTet mit mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, bei 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität auf Aminosäureebene.
  • In einer anderen Ausführungsform ist die heterologe DNA-Bindungsdomäne MarA und Homologe von MarA mit mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, bei 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität auf Aminosäureebene, oder die HTH-Domäne von MarA und Homologen davon mit mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, bei 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität auf Aminosäureebene.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die heterologe DNA-Bindungsdomäne ein TAL-Effektorprotein oder der DNA bindende Teil eines TAL-Effektors. Man kann native TAL-Effektoren verwenden. Alternativ können TAL-Effektoren entworfen werden, um an bestimmte Erkennungssequenzen zu binden (Moscou & Bogdanove, 2009, Science DOI: 10.1126/Science.1178817; Boch et al. 2009, Science DOI: 10.1126/Science.1178811) und WO2010/079430 und EP2206723 .
  • WO2010/079430 und EP2206723 sind hierin durch den Bezug darauf einbezogen.
  • Beispiele für TAL-Effektorproteine sind AvBs3 (SEQ ID NR: 160), Hax2 (SEQ ID NR: 161), Hax3 (SEQ ID NR: 162) und Hax4 (SEQ ID NR: 163).
  • Die jeweilige DNA-Bindungsstelle oder die Erkennungssequenz von
    Figure 00320001
  • Folglich ist, in einer anderen Ausführungsform, mindestens eine heterologe DNA-Bindungsdomäne der chimären Endonuklease ein TAL-Effektorprotein mit einer Aminosäure-Sequenzidentität von mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% zu einer durch SEQ ID NR: 160, 161, 162 oder 164 beschriebenen Aminosäuresequenz, oder ein Fragment der DNA-Bindungsdomäne eines TAL-Effektorproteins mit einer Aminosäuresequenzidentität von mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% zu einer durch SEQ ID NR: 160, 161, 162 oder 164 beschriebenen Aminosäuresequenz, umfassend mindestens 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder 20 Repeat-Einheiten, die aus einem ”Transkriptionsaktivator-like” (TAL)-Effektor abgeleitet sind, oder einen ”Transkriptionsaktivator-like” (TAL)-Effektor.
  • In einer anderen Ausführungsform ist mindestens eine heterologe DNA-Bindungsdomäne der chimären Endonuklease mindestens eine Repeat-Einheit, die aus einem Transkriptionsaktivator-like(TAL)-Effektor abgeleitet ist, oder ein Transkriptionsaktivator-like(TAL)-Effektor. Der Begriff ”Wiederholungseinheit” bzw. ”Repeat-Einheit” wird verwendet, um den modularen Abschnitt einer Repeat-Domäne von einem TAL-Effektor oder eine künstliche Version davon zu beschreiben, die eine oder zwei Aminosäuren in den Positionen 12 und 13 der Aminosäuresequenz einer Repeat-Einheit enthält, welche die Erkennung eines Basenpaars in einer Ziel-DNA-Sequenz bestimmen, wobei diese Aminosäuren eine Erkennung wie folgt vermitteln: HD für die Erkennung von C/G; NI für die Erkennung von A/T; NG für die Erkennung von T/A; NS für die Erkennung von C/G oder A/T oder T/A oder G/C; NN für die Erkennung von G/C oder A/T; IG für die Erkennung von T/A; N für die Erkennung von C/G; HG für die Erkennung von C/G oder T/A; H für die Erkennung von T/A; und NK für die Erkennung von G/C. (Die Aminosäuren H, D, I, G, S, K sind im Ein-Buchstaben-Code beschrieben, wobei A, T, C, G sich auf die von den Aminosäuren erkannten DNA-Basenpaare beziehen).
  • Die Anzahl der Wiederholungseinheiten, die in einer Repeat-Domäne verwendet werden soll, kann von einem Fachmann auf dem Gebiet durch Routineexperimente ermittelt werden. Im Allgemeinen werden mindestens 1,5 Wiederholungseinheiten als ein Minimum betrachtet, obwohl typischerweise mindestens etwa 8 Wiederholungseinheiten verwendet werden. Die Wiederholungseinheiten müssen keine vollständigen Wiederholungseinheiten sein, da Wiederholungseinheiten von halber Größe verwendet werden können. Eine heterologe DNA-Bindungsdomäne der Erfindung kann zum Beispiel 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 20,5, 21, 21,5, 22, 22,5, 23, 23,5, 24, 24,5, 25, 25,5, 26, 26,5, 27, 27,5, 28, 28,5, 29, 29,5, 30, 30,5, 31, 31,5, 32, 32,5, 33, 33,5, 34, 34,5, 35, 35,5, 36, 36,5, 37, 37,5, 38, 38,5, 39, 39,5, 40, 40,5, 41, 41,5, 42, 42,5, 43, 43,5, 44, 44,5, 46, 46,5, 47, 47,5, 48, 48,5, 49, 49,5, 50, 50,5 oder mehr Wiederholungseinheiten umfassen.
  • Eine typische Consensus-Sequenz eines Repeats mit 34 Aminosäuren (im Ein-Buchstaben-Code) ist nachstehend gezeigt:
    Figure 00330001
  • Eine weitere Consensus-Sequenz für eine Wiederholungseinheit mit 35 Aminosäuren (im Ein-Buchstaben-Code) ist wie folgt:
    Figure 00330002
  • Die Repeat-Einheiten, welche in einer Ausführungsform der Erfindung verwendet werden können, haben eine Identität mit den oben beschriebenen Consensus-Sequenzen von mindestens 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% oder 95%.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung ist die heterologe DNA-Bindungsdomäne ein Transkriptionsaktivator-like(TAL)-Effektor der Gruppe von Transkriptionsaktivator-like (TAL)-Effektoren, die beschrieben wird durch: AvrBs3, AvrBs3~repI6, AvrBs3~repI09, AvrHahI, AvrXa27, PthXo1, PthXo6, PthXo7, oder die Mitglieder der Hax-Subfamilie Hax2, Hax3, Hax4 und BrgII, oder Homologe von diesen mit mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, bei 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität auf Aminosäureebene.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung ist die heterologe DNA-Bindungsdomäne nicht ein TAL-Effektorprotein oder eine TAL-Effektor-Wiederholungseinheit.
  • Herstellung von chimären Endonukleasen:
  • Endonukleasen und die heterologen DNA-Bindungsdomänen können auf vielen alternativen Wegen kombiniert werden.
  • Zum Beispiel ist es möglich, mehr als eine Endonuklease mit einer oder mehreren heterologen DNA-Bindungsdomäne(n) zu kombinieren oder mehr als eine heterologe DNA-Bindungsdomäne mit einer Endonuklease zu kombinieren. Es ist auch möglich, mehr als eine Endonuklease mit mehr als einer heterologen DNA-Bindungsdomänen zu kombinieren.
  • Die heterologe DNA-Bindungsdomäne oder die heterologen DNA-Bindungsdomänen können am N-terminalen oder am C-terminalen Ende der Endonuklease fusioniert werden. Es ist auch möglich, eine oder mehrere heterologe DNA-Bindungsdomänen am N-terminalen Ende, und eine oder mehrere heterologe DNA-Bindungsdomänen am C-terminalen Ende der Endonuklease zu fusionieren. Es ist auch möglich, alternative bzw. abwechselnde Kombinationen von Endonukleasen und heterologen DNA-Bindungsdomänen herzustellen.
  • Im Fall, dass die chimäre Endonuklease mehr als eine Endonuklease oder mehr als eine heterologe DNA-Bindungsdomäne oder mehr als eine Endonuklease und mehr als eine heterologe DNA-Bindungsdomäne umfasst, ist es möglich, mehrere Kopien der gleichen heterologen DNA-Bindungsdomäne oder Endonuklease zu verwenden, oder unterschiedliche heterologe DNA-Bindungsdomänen oder Endonukleasen zu verwenden.
  • Es ist auch möglich, die oben für optimierte Nukleasen beschriebenen Verfahren und Merkmale auf die volle Sequenz von chimären Endonukleasen anzuwenden, z. B. durch Hinzufügen eines Zellkern-Lokalisationssignals an eine chimäre Endonuklease oder durch Verringern der Anzahl von:
    • a) PEST-Sequenzen,
    • b) KEN-Boxen
    • c) A-Boxen,
    • d) D-Boxen, oder
    • e) Umfassen eines hinsichtlich Stabilität gemäß der N-Enden-Regel optimierten N-terminalen Endes,
    • f) Umfassen eines Glycins als die zweite N-terminale Aminosäure, oder
    • g) jedwede Kombination von a), b), c) d), e) und f) von der gesamten Aminosäuresequenz der chimären Endonuklease.
  • Chimäre Endonukleasen mit einem Zellkernlokalisierungssignal sind beispielsweise durch die Aminosäuresequenz beschrieben, die durch SEQ ID NR: 11 beschrieben ist, oder die Polynukleotidsequenz, die durch SEQ ID NR: 24, 25 oder 26 beschrieben ist.
  • In einer Ausführungsform sind die chimären Endonukleasen Kombinationen von folgendem: I-SceI und scTet, oder I-SceI und scArc, oder I-CreI und scTet, oder I-CreI und scArcR orI-MsoI und scTet, oder I-MsoI und scArcR, wobei scTet oder scArcR N- oder C-terminal an I-SceI, I-CreI oder I-MsoI fusioniert sind, und wobei I-SceI, I-CreI, I-MsoI, scTet, scArcR ihre Homologe mit mindestens 50%, 49%, 51%, 58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, bei 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität auf Aminosäureebene einschließen.
  • In einer anderen Ausführungsform weisen die chimären Endonukleasen die folgende Struktur auf:

    N-Terminus-I-SceI-scTet-C-Terminus, oder
    N-Terminus-I-SceI-scArcR-C-Terminus, oder

    N-Terminus-I-CreI-scTet-C-Terminus, oder
    N-Terminus-I-CreI-scArcR-C-Terminus, oder

    N-Terminus-I-MsoI-scTet-C-Terminus, oder
    N-Terminus-I-MsoI-scArcR-C-terminus,

    N-Terminus-scTet-I-SceI-C-Terminus, oder
    N-Terminus-scArcR-I-SceI-C-Terminus, oder

    N-Terminus-scTet-I-CreI-C-Terminus, oder
    N-Terminus-scArcR-I-CreI-C-Terminus, oder

    N-Terminus-scTet-I-MsoI-C-Terminus, oder
    N-Terminus-scArcR-I-MsoI-C-Terminus.
  • Die chimäre Endonuklease wird vorzugsweise als ein Fusionsprotein mit einer Zellkern-Lokalisationssequenz (NLS) exprimiert. Diese NLS-Sequenz ermöglicht erleichterten Transport in den Zellkern und erhöht die Wirksamkeit des Rekombinationssystems. Eine Vielzahl von NLS-Sequenzen sind dem Fachmann bekannt und sind, unter anderem, bei Jicks GR und Raikhel NV (1995) Annu. Rev. Cell Biol. 11: 155–188, beschrieben. Für pflanzliche Organismen bevorzugt ist zum Beispiel die NLS-Sequenz von dem SV40-large-Antigen. Beispiele sind in der WO 03/060133 angegeben, die hierin zur Bezugnahme einbezogen ist. Die NLS kann heterolog bezüglich der Endonuklease und/oder der DNA-Bindungsdomäne sein, oder kann von Natur aus innerhalb der Endonuklease und/oder DNA-Bindungsdomäne enthalten sein.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Sequenzen, welche die chimären Endonukleasen codieren, durch Insertion einer Intronsequenz modifiziert. Dies verhindert die Expression eines funktionellen Enzym in prokaryotischen Wirtsorganismen und erleichtert dadurch die Klonierungs- und Transformationsprozeduren (z. B. basierend auf E. coli oder Agrobacterium). In eukaryotischen Organismen, zum Beispiel pflanzlichen Organismen, wird die Expression eines funktionstüchtigen Enzyms vollführt, da Pflanzen in der Lage sind, Introns zu erkennen und heraus zu ”spleißen”. Vorzugsweise werden Introns in den oben als bevorzugt erwähnten Homing-Endonukleasen (z. B. in I-SceI oder I-CreI) inseriert.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können die Aminosäuresequenzen der Endonuklease oder die chimäre Endonuklease durch Hinzufügen eines SecIV-Sekretionssignals an den N- oder C-Terminus der Endonuklease oder chimären Endonuklease modifiziert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das SecIV-Sekretionssignal ein SecIV-Sekretionssignal, das in Vir-Proteinen von Agrobacterium enthalten ist. Beispiele solcher SecIV-Sekretionssignale sowie Verfahren, wie diese anzuwenden sind, werden in WO 01/89283 , in Vergunst et al, "Positive charge is an important feature of the C-terminal transport signal of the VirB/D4-translocated Proteins of Agrobacterium", PNAS 2005, 102, 03, Seiten 832 bis 837, offenbart, was hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist.
  • Ein SecIV-Sekretionssignal könnte auch hinzugefügt werden durch Addieren von Fragmenten eines Vir-Proteins oder sogar eines ganzen Vir-Proteins, zum Beispiel eines vollständigen VirE2-Proteins, an eine Endonuklease oder chimäre Endonuklease, in einer ähnlichen Weise, wie beschrieben in der Beschreibung von WO01/38504 , die hierin zur Bezugnahme eingeschlossen ist, welche ein RecA/VirE2-Fusionsprotein beschreibt.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können die Aminosäuresequenzen der Endonuklease oder der chimären Endonuklease durch Hinzufügen eines SecIII-Sekretionssignals an den N- oder C-Terminus der Endonuklease oder chimären Endonuklease modifiziert werden. Geeignete SecIII-Sekretionssignale sind beispielsweise in WO 00/02996 offenbart, die hierin zur Bezugnahme eingeschlossen ist.
  • In dem Fall, dass ein SecIII-Sekretionssignal hinzugefügt wird, kann es von Vorteil sein, diese Endonuklease oder chimäre Endonuklease in einer Zelle zu exprimieren, die ebenfalls ein rekombinantes Konstrukt umfasst, das Teile eines oder ein komplettes funktionsfähiges Typ-III Sekretionssystem codiert, um Teile oder das komplette funktionsfähige Typ-III-Sekretionssystem in einer derartigen Zelle zu überexprimieren oder zu komplementieren.
  • Rekombinante Konstrukte, welche Teile oder ein komplettes funktionsfähiges Typ-III-Sekretionssystem codieren, sind zum Beispiel in WO 00/02996 und WO05/085417 offenbart, was hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist.
  • Wenn der chimären Endonuklease ein SecIV-Sekretionssignal hinzugefügt wird, und die chimäre Endonuklease zum Beispiel in Agrobacterium rhizogenes oder in Agrobacterium tumefaciens exprimiert werden soll, ist es von Vorteil, die für die chimäre Endonuklease codierende DNA-Sequenz an die Codon-Nutzung des exprimierenden Organismus anzupassen. Vorzugsweise hat die Endonuklease oder chimäre Nuklease keine, oder hat nur wenige, DNA-Erkennungssequenzen im Genom des exprimierenden Organismus. Es ist von noch größerem Vorteil, wenn die ausgewählte chimäre Endonuklease keine DNA-Erkennungssequenz oder eine weniger bevorzugte DNA-Erkennungssequenz im Agrobacterium-Genom aufweist. In dem Fall, dass die Nuklease oder die chimäre Endonuklease in einem prokaryotischen Organismus exprimiert werden soll, darf die für die Nuklease oder chimäre Nuklease codierende Sequenz kein Intron aufweisen.
  • In einer Ausführungsform sind die Endonuklease und die heterologe DNA-Bindungsdomäne über ein Linkerpolypeptid verbunden.
  • Vorzugsweise besteht das Linkerpolypeptid aus 1 bis 30 Aminosäuren, weiter bevorzugt 1 bis 20 und noch weiter bevorzugt aus 1 bis 10 Aminosäuren.
  • Zum Beispiel kann das Linkerpolypeptid aus einer Vielzahl von Resten aufgebaut sein, die aus der Gruppe gewählt sind, die aus Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Asparagin, Glutamin und Prolin besteht. Vorzugsweise ist das Linkerpolypeptid so entworfen, dass Sekundärstrukturen unter physiologischen Bedingungen fehlen, und ist vorzugsweise hydrophil. Geladene oder nicht-polare Reste können enthalten sein, aber sie können unter Bildung von Sekundärstrukturen interagieren oder können die Löslichkeit zu reduzieren und sind deshalb weniger bevorzugt. In einigen Ausführungsformen besteht das Linkerpolypeptid im Wesentlichen aus einer Vielzahl von Resten, die aus Glycin und Serin gewählt sind. Beispiele solcher Linker besitzen die Aminosäuresequenz (in Einbuchstabencode): GS oder GGS oder GSGS oder GSGSGS oder GGSGG oder GGSGGSGG oder GSGSGGSG.
  • Falls der Linker aus mindestens 3 Aminosäuren besteht, ist es bevorzugt, dass die Aminosäuresequenz des Linkerpolypeptids mindestens zu einem Drittel Glycine oder Alanine oder Glycine und Alanine umfasst.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Linker-Sequenz die Aminosäuresequenz GSGS oder GSGSGS auf.
  • Vorzugsweise wird der Polypeptid-Linker mit Hilfe von ”Rational Design” unter Verwendung von Bioinformatik-Werkzeugen entworfen, die zum Modellieren von beidem, der DNA-Bindungsstelle und der betreffenden Endonuklease, sowie der Erkennungsstelle und der heterologen DNA-Bindungsdomäne, in der Lage sind. Geeignete bioinformatische Werkzeuge sind zum Beispiel in Desjarlais & Berg, (1994), PNAS, 90, 2256 bis 2260, und in Desjarlais & Berg (1994), PNAS, 91, 11099 bis 11103, beschrieben.
  • DNA-Erkennungssequenzen von chimären Endonukleasen (chimäre Erkennungssequenzen):
  • Die chimären Endonukleasen binden an DNA-Sequenzen, welche Kombinationen der DNA-Erkennungssequenz der Endonuklease und der Erkennungssequenz der heterologen DNA-Bindungsdomäne sind. Falls die chimäre Endonuklease mehr als eine Endonuklease oder mehr als eine heterologe DNA-Bindungsdomäne umfasst, bindet die DNA die chimäre Endonuklease an DNA-Sequenzen, welche eine Kombination der DNA-Erkennungssequenz der verwendeten Endonukleasen und der Operatorsequenzen der verwendeten heterologen DNA-Bindungsdomänen sind. Es ist klar, dass die Sequenz der DNA, welche von der chimären Endonuklease gebunden wird, die Reihenfolge, in der die Endonuklease und die heterologen DNA-Bindungsdomänen kombiniert sind, reflektieren wird.
  • Im Stand der Technik bekannte Endonukleasen schneiden eine immense Vielzahl an unterschiedlichen Polynukleotidsequenzen. Die Begriffe DNA-Erkennungssequenz und DNA-Erkennungsstelle werden synonym verwendet und beziehen sich auf ein Polynukleotid einer bestimmten Sequenz, welche von einer bestimmten Endonuklease gebunden und geschnitten werden kann. Ein Polynukleotid einer gegebenen Sequenz kann daher eine DNA-Erkennungssequenz oder DNA-Erkennungsstelle für eine Endonuklease sein, aber kann oder kann nicht eine DNA-Erkennungssequenz oder DNA-Erkennungsstelle für eine andere Endonuklease sein.
  • Beispiele von Polynukleotidsequenzen, die durch Endonukleasen gebunden und geschnitten werden können, d. h. welche eine DNA-Erkennungssequenz oder DNA-Erkennungsstelle für diese Endonuklease darstellen, sind in der Tabelle 8 beschrieben: der Buchstabe N steht für ein beliebiges Nukleotid, und kann durch A, T, G oder C ersetzt werden).
  • Tabelle 8
    Figure 00380001
  • Endonukleasen weisen keine streng definierten DNA-Erkennungssequenzen auf, so dass einzelne Basenänderungen die Spaltung nicht vereiteln, sondern deren Effizienz zu variablen Ausmaßen verringern können. Eine hierin für eine gegebene Endonuklease aufgeführte DNA-Erkennungssequenz repräsentiert nur eine Stelle, von der bekannt ist, dass sie erkannt und gespalten wird.
  • Beispiele für Abweichungen von einer DNA-Erkennungsstelle sind beispielsweise in Chevelier et al. (2003), J. Mol. Biol. 329, 253 bis 269, in Marcaida et al. (2008), PNAS, 105 (44), 16888 bis 16893, und in der "Unterstützenden Information" zu Marcaida et al. 10.1073/pnas.0804795105, in Doyon et al. (2006), J. AM. CHEM. SOC. 128, 2477 bis 2484, in Argast et al, (1998), J. Mol. Biol. 280, 345 bis 353, in Spiegel et al. (2006), Structure, 14, 869 bis 880, in Posey et al. (2004), Nucl. Acids Res. 32 (13), 3947 bis 3956, oder in Chen et al. (2009), Protein Engineering, Design & Selection, 22 (4), 249 bis 256, offenbart.
  • Es ist daher möglich, eine natürlich vorkommende Endonuklease, die eine vorbestimmte Polynukleotidsequenz als eine DNA-Erkennungssequenz aufweist, zu identifizieren.
  • sVerfahren zum Identifizieren von natürlich vorkommenden Endonukleasen, ihren Genen und ihren DNA-Erkennungssequenzen sind zum Beispiel in WO 2009/101625 offenbart.
  • Die Spaltungsspezifität bzw. deren Degeneration von ihrer DNA-Erkennungssequenz können durch Überprüfen ihrer Aktivität auf verschiedenen Substraten getestet werden. Geeignete In-vivo-Techniken sind zum Beispiel in WO09074873 offenbart.
  • Alternativ dazu können In-vitro-Tests eingesetzt werden, zum Beispiel durch Anwenden markierter Polynukleotide, die punktförmig auf Arrays aufgetropft werden, wobei unterschiedliche Punkte im Wesentlichen nur Polynukleotide einer gewissen Sequenz umfassen, was sich von den Polynukleotiden anderer Punkte unterscheidet, und bei denen es sich um DNA-Erkennungssequenzen der bezüglich ihrer Aktivität zu testenden Endonuklease handeln kann, oder nicht. Eine ähnliche Technik wird beispielsweise in US 2009/0197775 offenbart.
  • Es ist jedoch möglich, die Aminosäuresequenz einer bestimmten Endonuklease, vorzugsweise einer LAGLIDADG Endonuklease, zu mutieren, so dass sie neue Polynukleotide bindet und schneidet, d. h. eine konstruierte Endonuklease mit einer veränderten DNA-Erkennungsstelle zu erzeugen.
  • Zahlreiche Beispiele für DNA-Erkennungsstellen von gentechnisch konstruierten Endonukleasen sind im Fachgebiet bekannt, und sind zum Beispiel in WO 2005/105989 , WO 2007/034262 , WO 2007/047859 , WO 2007/093918 , WO 2008/093249 , WO 2008/102198 , WO 2008/152524 , WO 2009/001159 , WO 2009/059195 , WO 2009/076292 , WO 2009/114321 oder WO 2009/134714 , WO 10/001189 und WO 10/009147 offenbart.
  • Daher ist es auch möglich, eine konstruierte Endonuklease zu erzeugen, die eine zu einer bestimmten vorgegebenen Polynukleotidsequenz identische DNA-Erkennungssequenz aufweisen wird.
  • Vorzugsweise sind die DNA-Erkennungssequenz der Endonuklease und die Operatorsequenz durch 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr Basenpaare getrennt. Vorzugsweise sind sie durch 1 bis 10, 1 bis 8, 1 bis 6, 1 bis 4, 1 bis 3, oder 2 Basenpaare getrennt.
  • Die Menge der zum Trennen der DNA-Erkennungssequenz der Nuklease und der Erkennungssequenz der heterologen DNA-Bindungsdomäne verwendeten Basenpaare hängt von dem Abstand der DNA-Bindungsregionen der Nuklease und der DNA-Bindungsregion der heterologen DNA-Bindungsdomäne in der chimären Endonuklease ab. Ein größerer Abstand zwischen den DNA-Bindungsregionen der Nuklease und der DNA-Bindungsregion der heterologen DNA-Bindungsdomäne wird durch eine höhere Menge an Basenpaaren widergespiegelt, welche die DNA-Erkennungssequenz der Nuklease und die Erkennungssequenz der heterologen DNA-Bindungsdomäne trennen. Die optimale Menge an trennenden Basenpaaren kann unter Verwendung von Computermodellen oder durch Testen der Bindungs- und Schneide-Effizienz einer betreffenden chimären Endonuklease auf mehreren Polynukleotiden, welche eine variierende Menge an Basenpaaren zwischen der DNA-Erkennungssequenz der Nuklease und der Erkennungssequenz der heterologen DNA-Bindungsdomäne umfassen, bestimmt werden.
  • Demzufolge umfasst die chimäre Erkennungsstelle, in einer Ausführungsform der Erfindung, eine DNA-Erkennungssequenz einer LAGLIDADG-Endonuklease, noch bevorzugter eine DNA-Erkennungssequenz einer LAGLIDADG-Endonuklease mit einer Aminosäuresequenz, wie durch mindestens eine der SEQ ID NRn: 1, 2, 3, 5, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 142 oder 159 beschrieben, vorzugsweise mit einer Aminosäuresequenz, wie durch SEQ ID NR: 1, 2, 3, 5 oder 159 beschrieben.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst die chimäre Erkennungsstelle eine DNA-Erkennungssequenz von I-SceI, I-CreI, I-DmoI, I-MsoI, I-CeuI, I-ChuI, Pi-SceI oder I-AniI oder ein Homolog von diesen mit mindestens 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% zu I-SceI, I-CreI, I-DmoI, I-MsoI, I-CeuI, I-ChuI, Pi-SceI oder I-AniI, und eine Erkennungssequenz einer heterologen DNA-Bindungsdomäne mit mindestens 50% Sequenz-Aminosäuresequenzidentität zu scTet, scArc, LacR, MerR oder MarA oder zu einem DNA-Bindungsdomänenfragment von scTet, scArc, LacR, MerR oder MarA.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst die chimäre Erkennungsstelle eine zwei DNA-Erkennungssequenzen von I-SceI, I-CreI, I-DmoI, I-MsoI, I-CeuI, I-ChuI, Pi-SceI oder I-AniI oder ein Homolog von diesen mit mindestens 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% zu I-SceI, I-CreI, I-DmoI, I-MsoI, I-CeuI, I-ChuI, Pi-SceI oder I-AniI.
  • Solche chimären Erkennungsstellen können mit chimären Endonukleasen verwendet werden, die eine aktive Endonuklease und eine inaktive Endonuklease als heterologe DNA-Bindungsdomäne umfassen.
  • Ein Beispiel für solche Typen von Kombinationen besteht in einer chimären Erkennungsstelle, die zwei DNA-Erkennungssequenzen von I-SceI umfasst, welche in Kombination mit einer chimären Endonuklease, welche eine aktive Version von I-SceI und eine inaktive Version von I-SceI als heterologe DNA-Bindungsdomäne umfasst, verwendet werden kann.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst die chimäre Erkennungsstelle eine zwei DNA-Erkennungssequenzen von I-SceI, I-CreI, I-DmoI, I-MsoI, I-CeuI, I-ChuI, Pi-SceI oder I-AniI oder ein Homolog von diesen mit mindestens 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% zu I-SceI, I-CreI, I-DmoI, I-MsoI, I-CeuI, I-ChuI, Pi-SceI oder I-AniI und eine DNA-Bindungsstelle eines TAL-Effektorproteins, vorzugsweise umfassend eine Polynukleotidsequenz, wie bei SEQ ID NR: 164, 165, 166 oder 167 beschrieben.
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung umfasst die chimäre Erkennungsstelle eine zwei DNA-Erkennungssequenzen von I-SceI, vorzugsweise beschrieben bei SEQ ID NR: 13, und eine DNA-Bindungsstelle eines TAL-Effektorproteins, vorzugsweise umfassend eine Polynukleotidsequenz, wie bei SEQ ID NR: 164, 165, 166 oder 167 beschrieben.
  • Beispiele für DNA-Erkennungssequenzen von chimären Endonukleasen (chimäre Erkennungsstelle oder Zielstelle der jeweiligen chimären Endonuklease) sind folgende:
    Eine chimäre Endonuklease mit der Struktur: I-SceI-scTet, vorzugsweise mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NR: 8 oder 9 beschrieben ist
    Figure 00400001
  • Eine chimäre Endonuklease mit der Struktur: I-SceI-scArcR, vorzugsweise mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NR: 10 oder 11 beschrieben ist
    Figure 00410001
  • Polynukleotide:
  • Die Erfindung umfasst auch isolierte Polynukleotide, welche die oben beschriebenen chimären Endonukleasen codieren.
  • Beispiele solcher isolierten Polynukleotide sind isolierte Polynukleotide, die für bei SEQ ID NR: 23, 24, 25 und 26 beschriebene Aminosäuresequenzen oder Aminosäuresequenzen mit mindestens 70%, 80%, 90% 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Aminosäuresequenzähnlichkeit, vorzugsweise mit mindestens 70%, 80%, 90% 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Aminosäuresequenzidentität zu einer beliebigen der durch SEQ ID NR: 23, 24, 25 und 26 beschriebenen Aminosäuresequenzen, codieren.
  • Vorzugsweise weist das isolierte Polynukleotid eine optimierte Codon-Verwendung für die Expression in einem bestimmten Wirtsorganismus auf, oder hat einen niedrigen Gehalt an RNA-Instabilitätsmotiven, oder hat einen niedrigen Gehalt an Codon-Repeats bzw. -Wiederholungen oder hat einen niedrigen Gehalt an kryptischen Spleißstellen, oder hat einen niedrigen Gehalt an alternativen Startcodons, oder hat einen geringen Gehalt an Restriktionsstellen oder hat einen niedrigen Gehalt an RNA-Sekundärstrukturen oder weist eine beliebige Kombination von diesen Merkmalen auf.
  • Die Codon-Verwendung des isolierten Polypeptids kann z. B. für die Expression in Pflanzen optimiert werden, vorzugsweise in einer Pflanze, die aus der Gruppe gewählt ist, die folgendes umfasst: Reis, Mais, Weizen, Raps, Zuckerrohr, Sonnenblume, Zuckerrübe, Tabak.
  • Vorzugsweise wird das isolierte Polynukleotid mit einer Promotorsequenz und einer Terminatorsequenz kombiniert, die geeignet sind, um eine eine funktionelle Expressionskassette für die Expression der chimären Endonuklease in einem bestimmten Wirtsorganismus zu bilden.
  • Geeignete Promotoren sind zum Beispiel konstitutive, Wärme- oder Pathogen-induzierbare oder Samen-, Pollen-, Blüten- oder Frucht-spezifische Promotoren.
  • Der Fachmann auf dem Gebiet kennt zahlreiche Promotoren, welche diese Merkmale aufweisen.
  • Zum Beispiel sind mehrere konstitutive Promotoren in Pflanzen bekannt. Die meisten von ihnen sind aus viralen oder bakteriellen Quellen abgeleitet, wie der Nopalinsynthase(nos)-Promotor (Shaw et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12 (20): 7831–7846), der Mannopinsynthase(mas)-Promotor (Co-mai et al. (1990) Plant Mol Biol 15(3): 373–381), oder der Octopinsynthase(ocs)-Promotor (Leisner und Gelvin (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85 (5): 2553–2557) aus Agrobacterium tumefaciens oder der CaMV35S-Promotor aus dem Blumenkohlmosaikvirus ( US 5 352 605 ). Der Letztere wurde am häufigsten in der konstitutiven Expression von Transgenen in Pflanzen verwendet (Odell et al. (1985) Nature 313: 810–812; Battraw und Hall (1990) Plant Mol Biol 15: 527–538; Benfey et al. (1990) EMBO J 9(69): 1677–1684; US 5,612,472 ). Allerdings zeigt der CaMV-355-Promotor Variabilität, nicht nur in verschiedenen Pflanzenarten, sondern auch in verschiedenen Pflanzengeweben (Atanassova et al. (1998) Plant Mol Biol 37: 275–85; Battraw und Hall (1990) Plant Mol Biol 15: 527–538; Holtorf et al. (1995) Plant Mol Biol 29: 637–646; Jefferson et al. (1987) EMBO J 6: 3901–3907). Ein weiterer Nachteil ist eine Störung der Transkriptions-regulierenden Aktivität des 35S-Promotors durch Wildtyp-CaMV-Virus (Al-Kaff et al. (2000) Nature Biotechnology 18: 995–99). Ein anderer viraler Promotor für konstitutive Expression ist der Zuckerrohr-bacilliformes-Badnavirus(ScBV)-Promotor (Schenk et al. (1999) Plant Mol Biol 39 (6): 1221–1230).
  • Mehrere pflanzliche konstitutive Promotoren sind beschrieben, wie etwa der Ubiquitinpromotor aus Arabidopsis thaliana (Callis et al. (1990) J Biol Chem 265: 12486–12493; Holtorf S et al. (1995) Plant Mol Biol 29: 637–747), von dem – jedoch – berichtet wird, dass er nicht in der Lage ist, die Expression von Selektionsmarkern zu regulieren ( WO03102198 ), oder zwei Mais-Ubiquitinpromotoren (Ubi-1 und Ubi-2; US 5 510 474 ; US 6 020 190 ; US 6 054 574 ), welche neben einem konstitutiven Expressionsprofil eine Hitzeschock-Induktion zeigen (Christensen et al. (1992) Plant. Mol. Biol. 18(4): 675–689). Ein Vergleich der Spezifität und Expressionshöhe von dem CaMV 35S-, dem Gerste-Thionin-Promotor, und dem Arabidopsis-Ubiquitin-Promotor, basierend auf stabil transformierten Arabidopsis-Pflanzen, zeigt eine hohe Expressionsrate für den CaMV-35S-Promotor, während der Thioninpromotor in den meisten Linien inaktiv war, und der ubi1-Promotor aus Arabidopsis nur zu einer mäßigen Expressionsaktivität führte (Holtorf et al. (1995) Plant Mol Biol 29 (4): 637–6469).
  • Chimäre Erkennungssequenzen:
  • Die Erfindung umfasst auch isolierte Polynukleotide, die eine chimäre Erkennungssequenz mit einer Länge von etwa 15 bis etwa 300, oder von etwa 20 bis etwa 200 oder von etwa 25 bis etwa 100 Nukleotiden umfassen, welche eine DNA-Erkennungssequenz einer Endonuklease und eine Erkennungssequenz einer heterologen DNA-Bindungsdomäne (auch als Bindungsstelle oder Operator bezeichnet) umfasst.
  • Vorzugsweise umfassen isolierte Polynukleotide eine DNA-Erkennungssequenz einer Homing-Endonuklease, vorzugsweise einer LAGLIDADG-Endonuklease.
  • In einer Ausführungsform umfasst das isolierte Polynukleotid eine DNA-Erkennungssequenz von I-SceI.
  • Vorzugsweise ist die Erkennungssequenz einer heterologen DNA-Bindungsdomäne, die in dem isolierten Polynukleotid enthalten ist, eine Erkennungssequenz eines Transkriptionsfaktors.
  • Stärker bevorzugt ist die Erkennungssequenz die Erkennungssequenz der Transkriptionsfaktoren scTet oder scArc.
  • In einer Ausführungsform umfasst das isolierte Polynukleotid eine DNA-Erkennungssequenz von I-SceI und eine Linker-Sequenz von 0 bis 10 Polynukleotiden und eine Erkennungssequenz von scTet oder scArc.
  • Bevorzugte Chimäre Erkennungssequenzen umfassen eine Kombination von einer DNA-Erkennungssequenz von I-SceI, I-CreI, I-DmoI, oder I-Ceu, I-MsoI, Pi-SceI oder I-AniI in Kombination mit einer Erkennungsstelle von scTet, TetR, scArcR, TraR, WRKY, LacR, MarA oder MerR, wobei die DNA-Erkennungssequenz von I-SceI, I-CreI, I-DmoI, I-MsoI oder I-Ceu in einem Abstand von 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 oder 12 Nukleotiden stromauf- oder abwärts einer Erkennungsstelle von scTet, TetR, scArcR, TraR, WRKY, LacR, MarA oder MerR fusioniert sein kann.
  • Bevorzugte chimäre Erkennungssequenzen umfassen eine Kombination von einer DNA-Erkennungssequenz von I-SceI, I-CreI, I-DmoI oder I-MsoI in Kombination mit einer Erkennungsstelle von scTet, TetR, scArcR, TraR, MarA oder MerR, wobei die DNA-Erkennungssequenz von I-SceI, I-CreI, I-DmoI oder I-Ceu in einem Abstand von 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 oder 12 Nukleotiden stromauf- oder abwärts einer Erkennungsstelle von scTet, TetR, scArcR, TraR, MarA oder MerR fusioniert sein kann.
  • Bevorzugte chimäre Erkennungssequenzen umfassen eine Kombination von einer DNA-Erkennungssequenz von I-SceI, I-CreI, I-DmoI oder I-MsoI in Kombination mit einer Erkennungsstelle von scTet, TetR, scArcR, TraR, MarA oder MerR, wobei die DNA-Erkennungssequenz von I-SceI, I-CreI, I-DmoI, oder I-Ceu in einem Abstand von 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 oder 12 Nukleotiden stromauf- oder abwärts einer Erkennungsstelle von scTet, TetR, scArcR, TraR, MarA oder MerR fusioniert sein kann.
  • In einer Ausführungsform umfasst die chimäre Erkennungssequenz eine Kombination von einer DNA-Erkennungssequenz von I-SceI in Kombination mit einer Erkennungsstelle von scTet, TetR, scArcR, TraR, MarA oder MerR, wobei die DNA-Erkennungssequenz von I-SceI in einem Abstand von 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 oder 12 Nukleotiden stromauf- oder abwärts einer Erkennungsstelle von scTet, TetR, scArcR, TraR, MarA oder MerR fusioniert sein kann.
  • In einer Ausführungsform umfasst die chimäre Erkennungssequenz eine Kombination von einer DNA-Erkennungssequenz von I-SceI in Kombination mit einer Erkennungsstelle von MarA, wobei die DNA-Erkennungssequenz von I-SceI in einem Abstand von 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 oder 12 Nukleotiden stromauf- oder abwärts einer Erkennungsstelle von MarA fusioniert sein kann. Vorzugsweise wird die DNA-Erkennungssequenz von I-SceI stromaufwärts von einer Erkennungsstelle von MarA fusioniert.
  • In einer Ausführungsform umfasst das isolierte Polynukleotid eine Sequenz einer chimären Erkennungsstelle, die aus der Gruppe gewählt ist, die folgendes umfasst: SEQ ID NR: 30, 31, 32, 34, 35, 36 oder 37.
  • Die isolierten Polynukleotide können eine Kombination von einer chimären Erkennungsstelle und einer Polynukleotidesequenz, die eine chimäre Nuklease codiert, umfassen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine chimäre Endonuklease mit einer Aminosäuresequenz, wie durch SEQ ID NR: 8 oder 9 beschrieben, in Kombination mit einer chimären Erkennungssequenz verwendet, die eine Polynukleotidsequenz aufweist, die aus der Gruppe von Sequenzen gewählt ist, die durch SEQ ID NR: 14, 15 oder 16 beschrieben werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine chimäre Endonuklease mit einer Aminosäuresequenz, wie durch SEQ ID NR: 10 oder 11 beschrieben, in Kombination mit einer chimären Erkennungssequenz verwendet, die eine Polynukleotidsequenz aufweist, die aus der Gruppe von Sequenzen gewählt ist, die durch SEQ ID NR: 17, 18, 19 oder 20 beschrieben werden.
  • Vektoren:
  • Die oben beschriebenen Polynukleotide können in einem zur Transformation, Transfektion, Klonierung oder Überexpression geeigneten DNA-Vektor enthalten sein.
  • In einem Beispiel sind die oben beschriebenen Polynukleotide in einem Vektor für Transformation von nicht-humanen Organismen oder Zellen enthalten, wobei die nicht-humanen Organismen vorzugsweise Pflanzen oder Pflanzenzellen sind.
  • Die Vektoren der Erfindung umfassen üblicherweise weitere funktionelle Elemente, die, ohne jedoch darauf eingeschränkt sein zu sollen, folgende einschließen können:
    • i) Replikationsursprünge, welche die Replikation der Expressionskassetten oder Vektoren gemäß der Erfindung in, zum Beispiel, E. coli, gewährleisten. Beispiele, welche erwähnt werden können, sind ORI (”Origin” bzw. Ursprung der DNA-Replikation), der pBR322-ori oder der P15A-ori (Sambrook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
    • ii) Mehrfach-Klonierungsstellen (MCS) zum Ermöglichen und Erleichtern der Insertion einer oder mehrerer Nukleinsäuresequenzen.
    • iii) Sequenzen, die eine homologe Rekombination oder Insertion in das Genom eines Wirtsorganismus möglich machen.
    • iv) Elemente, zum Beispiel Border-Sequenzen, die den Agrobacterium-vermittelten Transfer in Pflanzenzellen für die Übertragung und Integration in das pflanzliche Genom möglich machen, wie, zum Beispiel, die rechte oder linke Border der T-DNA oder die vir-Region.
  • Die Marker-Sequenz
  • Der Begriff ”Marker-Sequenz” ist im weitesten Sinne zu so verstehen, dass er alle Nukleotidsequenzen (und/oder davon translatierte Polypeptidsequenzen) einschließt, welche Nachweis, Identifikation oder Selektion von transformierten Zellen, Geweben oder Organismen) (z. B. Pflanzen) erleichtern. Die Begriffe ”Sequenz, welche die Selektion eines transformierten Pflanzenmaterials gestattet”, ”Selektionsmarker” oder ”Selektionsmarkergen” oder ”Selektionsmarkerprotein” oder ”Marker” besitzen im Wesentlichen die gleiche Bedeutung.
  • Marker können (ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein) selektierbare Marker und screenbare Marker einschließen. Ein selektierbarer Marker verleiht der Zelle oder dem Organismus einen Phänotyp, der zu einem Wachstums- oder Lebensfähigkeits-Unterschied führt. Der selektierbare Marker kann mit einem Selektionsmittel (wie einem Herbizid oder Antibiotikum oder Pro-Arzneistoff) wechselwirken, um diesen Phänotyp hervorzubringen. Ein screenbarer Marker verleiht der Zelle oder dem Organismus einen leicht nachweisbaren Phänotyp, vorzugsweise einen visuell nachweisbaren Phänotyp, wie etwa eine Farbe oder Färbung. Der screenbare Marker kann mit einem Screeningmittel (wie einem Farbstoff) wechselwirken, um diesen Phänotyp hervorzubringen.
  • Selektierbare Marker (oder selektierbare Markersequenzen) umfassen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein
    • a) negative Selektionsmarker, welche Resistenz gegenüber einem oder mehreren toxischen (im Fall von Pflanzen phytotoxischen) Mitteln, wie einem Antibiotika, Herbizide oder andere Biozide, vermitteln,
    • b) Gegen-Selektionsmarker, welche eine Empfindlichkeit gegenüber bestimmten chemischen Verbindungen (z. B. durch Umwandeln einer nicht-toxischen Verbindung in eine toxische Verbindung) vermitteln, und
    • c) positive Selektionsmarker, welche einen Wachstumsvorteil vermitteln (z. B. durch Expression von Schlüsselelementen der Cytokinin- oder Hormon-Biosynthese, was zur Produktion eines Pflanzenhormons, z. B. Auxinen, Gibberllinen, Cytokininen, Abscisinsäure und Ethylen, führt; Ebinuma H et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 94: 2117–2121).
  • Bei Verwendung negativer Selektionsmarker werden nur Zellen oder Pflanzen selektiert, welche den negativen Selektionsmarker umfassen. Bei Verwendung eines Gegenselektionsmarkers werden nur Zellen oder Pflanzen selektiert, welchen der Gegen-Selektionsmarker fehlt. Gegen-Selektionsmarker können verwendet werden, um die erfolgreiche Exzision einer Sequenz (umfassend den Gegen-Selektionsmarker) aus einem Genom zu bestätigen. Screenbare Markersequenzen schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Reportergene (z. B. Luziferase, Glucuronidase, Chloramphenicolacetyltransferase (CAT), etc.) ein. Bevorzugte Markersequenzen schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt sein zu sollen, folgende ein:
  • i) Negative Selektionsmarker
  • In der Regel sind negative Selektionsmarker nützlich für das Selektieren von Zellen, welche erfolgreich einer Transformation unterzogen worden sind. Der Negativ-Selektionsmarker, welcher mit dem DNA-Konstrukt der Erfindung eingeführt worden ist, kann Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem phytotoxischen Agens (zum Beispiel einem Herbizid, wie Phosphinothricin, Glyphosat oder Bromoxynil), einem Stoffwechselinhibitor, wie 2-Desoxyglucose-6-phosphat ( WO 98/45456 ) oder einem Antibiotikum, wie zum Beispiel Tetracyclin, Ampicillin, Kanamycin, G 418, Neomycin, Bleomycin oder Hygromycin, an die Zellen vermitteln, welche erfolgreich eine Transformation durchlaufen haben. Der Negativ-Selektionsmarker erlaubt die Selektion der transformierten Zellen von untransformierten Zellen (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81–84). Negative Selektionsmarker in einem Vektor der Erfindung können verwendet werden, um Resistenz in mehr als einem Organismus zu vermitteln. Zum Beispiel kann ein Vektor der Erfindung einen Selektionsmarker für die Amplifikation in Bakterien (wie E. coli oder Agrobacterium) und Pflanzen umfassen. Beispiele von selektierbaren Markern für E. coli schließen folgende ein: Gene, welche Resistenz gegenüber Antibiotika, d. h. Ampicillin, Tetracyclin, Kanamycin, Erythromycin, spezifizieren oder Gene, welche andere Typen von selektierbaren enzymatischen Aktivitäten vermitteln, wie Galactosidase oder das Lactose-Operon. Geeignete selektierbare Marker zur Verwendung in Säugerzellen schließen zum Beispiel das Dihydrofolatreduktase-Gen (DHFR), das Thymidinkinase-Gen (TK) oder prokaryotische Gene, welche Arzneistoffresistenz vermitteln, gpt (Xanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase), für das mit Mycophenolsäure selektiert werden kann; neo (Neomycin-Phosphotransferase), für das mit G418, Hygromycin oder Puromycin selektiert werden kann; und DHFR (Dihydrofolatreduktase), wofür mit Methotrexat selektiert werden kann (Mulligan & Berg (1981) Proc Natl Acad Sci USA 78: 2072; Southern & Berg (1982) J Mol Appl Genet 1: 327), ein. Selektionsmarker für Pflanzenzellen verleihen oft Resistenz gegen ein Biozid oder ein Antibiotikum, wie zum Beispiel Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Chloramphenicol, oder Herbizidresistenz, wie Resistenz gegenüber Chlorsulfuron oder Basta.
  • Speziell bevorzugte negative Selektionsmarker sind diejenigen, welche Resistenz gegenüber Herbiziden verleihen. Beispiele von Negativselektionsmarkern sind folgende:
    • – DNA-Sequenzen, welche eine Phosphinothricinacetyltransferase (PAT) codieren, welche die freie Aminogruppe des Glutaminsynthase-Inhibitors Phosphinothricin (PPT) acetyliert und somit die Detoxifikation von PPT bewirkt (de Block et al. (1987) EMBO J 6: 2513–2518) (ebenfalls bezeichnet als Bialophos-Resistenzgen bar; EP 242236 ),
    • – 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase-Gene (EPSP-Synthase-Gene), welche Resistenz gegenüber Glyphosat (N-(Phosphonomethyl)glycin) vermitteln,
    • – das gox-Gen, welches das Glyphosat-abbauende Enzym Glyphosat-Oxidoreduktase codiert,
    • – das deh-Gen (codierend eine Dehalogenase, welche Dalapon-inaktiviert),
    • – Acetolactatsynthasen, welche Resistenz gegenüber Sulfonylharnstoff und Imidazolinon vermitteln,
    • – bxn-Gene, welche Bromoxynil-abbauende Nitrilase-Enzyme codieren,
    • – das Kanamycin- oder G418-Resistenzgen (NPTII). Das NPTII-Gen codiert eine Neomycin-Phosphotransferase, welche den inhibitorischen Effekt von Kanamycin, Neomycin, G418 und Paromomycin vermittels einer Phosphorylierungsreaktion verringert (Beck et al. (1982) Gene 19: 327),
    • – das DOGR1-Gen. Das DOGR1-Gen ist aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae isoliert worden ( EP 0 807 836 ). Es codiert eine 2-Desoxyglucose-6-phosphat-Phosphatase, welche Resistenz gegenüber 2-DOG vermittelt (Randez-Gil et al. (1995) Yeast 11: 1233–1240).
    • – das hyg-Gen, welches für das Enzym Hygromycin-Phosphotransferase codiert und Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Hygromycin vermittelt (Gritz und Davies (1983) Gene 25: 179);
    • – speziell bevorzugt sind Negativselektionsmarker, welche Resistenz gegen die toxischen Effekte, die durch D-Aminosäuren, wie z. B. D-Alanin und D-Serin, herbeigeführt werden, vermitteln ( WO 03/060133 ; Erikson 2004). Besonders bevorzugt als Negativselektionsmarker in diesem Kontext sind das daol-Gen (EC: 1.4. 3.3: GenBank Zugangs-Nr.: U60066) aus der Hefe Rhodotorula gracilis (Rhodosporidium toruloides) und das E. coli-Gen dsdA (D-Serin-Dehydratase (D-Serin-Desaminase) (EC: 4.3. 1.18; GenBank Zugangs-Nr.: J01603)).
  • ii) Positiv-Selektionsmarker
  • Positivselektionsmarker umfassen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Wachstumsstimulierende Selektionsmarkergene, wie Isopentenyltransferase aus Agrobacterium tumefaciens (Stamm: PO22; Genbank Zugangs-Nr.: AB025109) und können – als ein Schlüsselenzym der Cytokinin-Biosynthese – die Regeneration transformierter Pflanzen erleichtern (z. B. durch Selektion auf Cytokinin-freiem Medium). Entsprechende Selektionsverfahren sind beschrieben (Ebinuma H et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 94: 2117–2121; Ebinuma H et al. (2000) Selection of Marker-free transgenic plants using the oncogenes (ipt, rol A, B, C) of Agrobacterium as selectable markers, in: Molecular Biology of Woody Plants. Kluwer Academic Publishers). Zusätzliche positive Selektionsmarker, welche einer transformierten Pflanze einen Wachstumsvorteil im Vergleich zu einer nicht-transformierten Pflanze vermitteln, sind z. B. in der EP-A 0 601 092 beschrieben. Wachstumsstimulations-Selektionsmarker können (ohne dass eine Einschränkung darauf beabsichtigt ist) beta-Glucuronidase (in Kombination mit z. B. einem Cytokininglucuronid), Mannose-6-phosphat-Isomerase (in Kombination mit Mannose), UDP-Galactose-4-Epimerase (in Kombination mit z. B. Galactose) einschließen, wobei Mannose-6-phosphat-Isomerase in Kombination mit Mannose besonders bevorzugt wird.
  • iii) Gegen-Selektionsmarker
  • Gegen-Selektionsmarker erlauben die Selektion von Organismen mit erfolgreich deletierten Sequenzen (Koprek T et al. (1999) Plant J 19(6): 719–726). TK-Thymidinkinase (TK) und Diphtherie-Toxin A-Fragment (DT-A), das codA-Gen, das eine Cytosindeaminase codiert (Gleve AP et al. (1999) Plant Mol Biol 40(2): 223–35; Pereat RI et al. (1993) Plant Mol Biol 23(4): 793–799; Stougaard J (1993) Plant J 3: 755–761), das Cytochrom-P450-Gen (Koprek et al. (1999) Plant J 16: 719–726), Gene, die eine Halogenalkan-Dehalogenase codieren (Naested H (1999) Plant J 18: 571–576), das iaaH-Gen (Sundaresan V et al. (1995) Genes & Development 9: 1797–1810), das tms2-Gen (Fedoroff NV & Smith DL (1993) Plant J 3: 273–289) und D-Aminosäureoxidasen, welche toxische Effekte durch Umwandlung von D-Aminosäuren verursachen ( WO 03/060133 ). In einer bevorzugten Ausführungsform schließt die Exzisionskassette mindestens einen der Gegen-Selektionsmarker ein, um Pflanzenzellen oder Pflanzen mit erfolgreich herausgeschnittenen Sequenzen von Pflanzen, welche diese noch enthalten, zu unterscheiden. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform umfasst die Exzisionskassette der Erfindung einen Zwei-Funktions-Marker, d. h. einen Marker, der sowohl als ein Negativ- wie auch als ein Gegenselektionsmarker verwendet werden kann, abhängig von dem im Selektionsschema verwendeten Substrat. Ein Beispiel für einen Zwei-Funktions-Marker ist das daol-Gen (EC: 1.4. 3.3: Gen-Bank Zugangs-Nr.: U60066) aus der Hefe Rhodotorula gracilis, welches als Negativ-Selektionsmarker mit D-Aminosäuren, wie D-Alanin und D-Serin, und als Gegen-Selektionsmarker mit D-Aminosäuren, wie D-Isoleucin und D-Valin, verwendet werden kann (siehe europäische Patentanmeldung Nr.: 04006358.8 ).
  • iv) Screenbarer Marker (Reportergene)
  • Screenbare Marker (wie Reportergene) codieren leicht quantifizierbare oder nachweisbare Proteine, und welche, durch intrinsische Farb- oder Enzymaktivität, die Beurteilung der Transformationseffizienz oder der Lokalisierung oder Zeitgebung der Expression gewähren. Besonders bevorzugt werden Gene, welche Reporterproteine codieren (siehe auch Schenborn E, Groskreutz D. (1999) Mol Biotechnol 13(1): 29–44), wie etwa
    • – ”Grün-Fluoreszenz-Protein” (GFP) (Chui WL et al. (1996) Curr Biol 6: 325–330; Lef-fel SM et al. (1997) Biotechniques 23(5): 912–8; Sheen et al. (1995) Plant J 8(5): 777–784; Haseloff et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94(6): 2122–2127; Reichel et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93(12): 5888–5893; Tian et al. (1997) Plant Cell Rep 16: 267–271; WO 97/41228 ).
    • – Chloramphenicol-Transferase,
    • – Luciferase (Millar et al. (1992) Plant Mol Biol Rep 10: 324–414; Ow et al. (1986) Science 234: 856–859) gestattet Selektion durch Nachweisen von Biolumineszenz,
    • – beta-Galactosidase, codiert ein Enzym, für das eine Vielzahl an chromogenen Substraten zur Verfügung steht,
    • – beta-Glucuronidase (GUS) (Jefferson et al. (1987) EMBO J 6: 3901–3907) oder das uidA-Gen, welches ein Enzym für eine Vielzahl an chromogenen Substraten codiert,
    • – R-Locus-Genprodukt: Protein, welches die Produktion von Anthocyanin-Pigmenten (rote Färbung) in Pflanzengewebe reguliert und somit die direkte Analyse der Promotoraktivität ohne die Zugabe von zusätzlichen Hilfsstoffen oder chromogenen Substraten möglich macht (Dellaporta et al. (1988) In: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium, 11: 263–282),
    • – beta-Lactamase (Sutcliffe (1978) Proc Natl Acad Sci USA 75: 3737–3741), Enzym für eine Vielzahl an chromogenen Substraten (zum Beispiel PADAC, ein chromogenes Cephalosporin),
    • – xylE-Genprodukt (Zukowsky et al. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80: 1101–1105), Catecholdioxygenase, die zum Umsetzen von chromogenen Catecholen in der Lage ist,
    • – alpha-Amylase (Ikuta et al. (1990) Bio/technol. 8: 241–242),
    • – Tyrosinase (Katz et al. (1983) J Gene Microbiol 129: 2703–2714), Enzym, welches Tyrosin unter Erhalt von DOPA und Dopachinon oxidiert, welche anschließend Melanin bilden, das leicht nachweisbar ist,
    • – Aequorin (Prasher et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126(3): 1259–1268), kann in der Calcium-empfindlichen Biolumineszenz-Detektion verwendet werden.
  • Zielorganismen
  • Jedweder Organismus, der für Transformation oder Zuführung einer chimären Endonuklease geeignet ist, kann als Zielorganismus verwendet werden. Dies schließt Prokaryoten, Eukaryoten und Archaea, insbesondere nicht-humane Organismen, Pflanzen, Pilze oder Hefen, aber auch humane oder tierische Zellen, ein.
  • In einer Ausführungsform ist der Zielorganismus eine Pflanze.
  • Der Begriff ”Pflanze” schließt ganze Pflanzen, vegetative Sprossorgane/strukturen (z. B. Blätter, Stengel und Knollen), Wurzeln, Blüten und Blütenorgane/strukturen (z. B. Deckblätter, Kelchblätter, Blütenblätter, Staubblätter, Fruchtblätter, Antheren und Samenanlagen), Samen (einschließlich Embryo, Endosperm und Samenhülle) und Früchte (den reifen Fruchtknoten), Pflanzengewebe (z. B. Gefäßgewebe, zermahlenes Gewebe, und dergleichen) und Zellen (z. B. Schließzellen, Eizellen, Trichome und dergleichen) und Abkömmlinge derselben ein. Die Klasse von Pflanzen, welche im Verfahren der Erfindung verwendet werden kann, ist im Allgemeinen so breitgefasst wie die Klasse von höheren und niederen Pflanzen, welche Transformationstechniken zuführbar sind, einschließlich Angiospermen (monokotyle und dikotyle Pflanzen), Gymnospermen, Farnen und mehrzelligen Algen. Sie schließt Pflanzen einer Vielzahl von Ploidie-Niveaus, einschließlich aneuploid, polyploid, diploid, haploid und hemizygot, ein.
  • Innerhalb des Umfangs der Erfindung sind alle Gattungen und Spezies von höheren und niederen Pflanzen des Pflanzenreichs eingeschlossen. Ferner sind die reifen Pflanzen, Samen, Schößlinge und Sämlinge sowie Teile, Fortpflanzungsmaterial (zum Beispiel Samen und Frucht) und Kulturen, zum Beispiel Zellkulturen, welche davon abgeleitet sind, eingeschlossen.
  • Bevorzugt sind Pflanzen und Pflanzenmaterialien der folgenden Pflanzenfamilien: Amaranthaceae, Brassicaceae, Carophyllaceae, Chenopodiaceae, Compositae, Cucurbitaceae, Labiatae, Leguminosae, Papilionoideae, Liliaceae, Linaceae, Malvaceae, Rosaceae, Saxifragaceae, Scrophulariaceae, Solanaceae, Tetragoniaceae.
  • Einjährige, mehrjährige, monokotyle und dikotyle Pflanzen sind bevorzugte Wirtsorganismen für die Erzeugung von transgenen Pflanzen. Die Verwendung des Rekombinationssystems oder Verfahrens gemäß der Erfindung ist außerdem vorteilhaft bei allen Zierpflanzen, Nutz- oder Zierbäumen, Blumen, Schnittblumen, Stauden oder Rasen. Die Pflanze kann – ohne jedoch darauf eingeschränkt sein zu sollen – Bryophyten, wie zum Beispiel Hepaticae (Lebermoose) und Musci (Moose); Pteridophyten, wie Farne, Schachtelhalm und Bärlapp; Gymnospermen, wie Koniferen, Palmfarne, Ginkgo und Gnetaeae; Algen, wie Chlorophyceae, Phaeophpyceae, Rhodophyceae, Myxophyceae, Xanthophyceae, Bacillariophyceae (Diatomeen) und Euglenophyceae, einschließen.
  • Pflanzen für die Zwecke der Erfindung können die Familien der Rosaceae, wie Rose, Ericaceae, wie Rhododendren und Azaleen, Euphorbiaceae, wie Poinsettien und Croton, Caryophyllaceae, wie Nelken, Solanaceae, wie Petunien, Gesneriaceae, wie Usambaraveilchen, Balsaminaceae, wie Rührmichnichtan, Orchidaceae, wie Orchideen, Iridaceae, wie Gladiolen, Iris, Freesia und Krokus, Compositae, wie Studentenblume, Geraniaceae, wie Geranien, Liliaceae, wie Drachaena, Moraceae, wie Ficus, Araceae, wie Philodendron, und viele andere umfassen.
  • Die transgenen Pflanzen gemäß der Erfindung werden ferner insbesondere aus dikotylen Nutzpflanzen, wie zum Beispiel aus den Familien der Leguminosae, wie Erbse, Alfalfa und Soja; Solanaceae, wie Tabak und viele andere; der Familie der Umbelliferae, insbesondere die Gattung Daucus (ganz besonders die Spezies carota (Karotte)) und Apium (ganz besonders die Spezies graveolens dulce (Selerie)) und viele andere; der Familie der Solanaceae, insbesondere die Gattung Lycopersicon, ganz besonders die Spezies esculentum (Tomate), und die Gattung Solanum, ganz besonders die Spezies tuberosum (Kartoffel) und melongena (Aubergine) und viele andere; und die Gattung Capsicum, ganz besonders die Spezies annum (Paprika) und viele andere; der Familie der Leguminosae, insbesondere die Gattung Glycine, ganz besonders die Spezies max (Soja) und viele andere; und der Familie der Cruciferae, insbesondere die Gattung Brassica, ganz besonders die Spezies napus (Ölsamenraps), campestris (Rübe), oleracea cv Tastie (Kohl), oleracea cv Snowball Y (Blumenkohl) und oleracea cv Emperor (Broccoli); und die Gattung Arabidopsis, ganz besonders die Spezies thaliana und viele andere; der Familie der Compositae, insbesondere die Gattung Lactuca, ganz besonders die Spezies sativa (Gartensalat) und viele andere, ausgewählt.
  • Die transgenen Pflanzen gemäß der Erfindung werden insbesondere aus monokotylen Nutzpflanzen, wie zum Beispiel Getreiden, wie Weizen, Gerste, Sorghum und Hirse, Roggen, Triticale, Mais, Reis oder Hafer, und Zuckerrohr, ausgewählt.
  • Speziell bevorzugt werden Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum, Ölsamenraps, Sojabohne, Mais, Weizen, Leinsamen, Kartoffel und Tagetes.
  • Pflanzliche Organismen sind, für die Zwecke der Erfindung, ferner sonstige Organismen, welche zu photosynthetischer Aktivität in der Lage sind, wie zum Beispiel, Algen oder Cyanobakterien, und auch Moose. Bevorzugte Algen sind Grünalgen, wie zum Beispiel Algen der Gattung Haematococcus, Phaedactylum tricornatum, Volvox oder Dunaliella.
  • Genetisch modifizierte Pflanzen gemäß der Erfindung, welche von Menschen oder Tieren verzehrt werden können, können auch als Lebensmittel oder Futtermittel, zum Beispiel direkt oder im Anschluss an eine im Fachgebiet bekannte Verarbeitung, verwendet werden.
  • Konstruktion von Polynukleotidkonstrukten
  • Typischerweise werden Polynukleotidkonstrukte (z. B. für eine Expressionskassette), die in nicht-menschliche Organismen oder Zellen, z. B. Pflanzen oder Pflanzenzellen, eingebracht werden sollen, unter Anwendung von Transgen-Expressionstechniken hergestellt. Rekombinante Expressionstechniken beinhalten die Konstruktion von rekombinanten Nukleinsäuren und die Expression von Genen in transfizierten Zellen. Molekulare Klonierungstechniken zum Erreichen dieser Ziele sind im Fachgebiet bekannt. Eine weite Vielfalt von für die Konstruktion von rekombinanten Nukleinsäuren geeigneten Klonierungs- und In-vitro-Amplifikations-Verfahren sind dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt. Beispiele dieser Techniken und Anweisungen, die ausreichend sind, um den Fachmann auf dem Gebiet durch viele Klonierungsarbeiten zu leiten, werden in Berger und Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Bd. 152, Academic Press, hic., San Diego, CA (Berger); Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., Hrsg., Current Protocols, einem Joint Venture zwischen Greene Publishing Associates, Inc., und John Wiley & Sons, Inc. (1998 Ergänzungsband), T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989), in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984), gefunden. Vorzugsweise werden die in der Erfindung verwendeten DNA-Konstrukte durch Zusammenknüpfen der oben erwähnten wesentlichen Bestandteile des DNA-Konstrukts in der oben erwähnten Sequenz bzw. Abfolge unter Anwendung der Rekombinations- und Klonierungstechniken, mit denen der Fachmann vertraut ist, erzeugt.
  • Die Konstruktion von Polynukleotidkonstrukten erfordert im Allgemeinen die Verwendung von Vektoren, die in der Lage sind, in Bakterien zu replizieren. Eine Fülle an Kits ist für die Reinigung von Plasmiden aus Bakterien im Handel erhältlich. Die isolierten und gereinigten Plasmide können dann weiter manipuliert werden, um andere Plasmide herzustellen, die zum Transfizieren von Zellen verwendet oder in Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes zum Infizieren und Transformieren von Pflanzen eingebracht werden. Wo Agrobacterium das Mittel zur Transformation ist, werden Shuttle-Vektoren konstruiert.
  • Verfahren zum Einbringen von Konstrukten in Zielzellen
  • Ein in der Erfindung verwendetes DNA-Konstrukt kann in vorteilhafter Weise unter Verwendung von Vektoren, in die das DNA-Konstrukt inseriert ist, in Zellen eingebracht werden. Beispiele von Vektoren können Plasmide, Cosmide, Phagen, Viren, Retroviren oder Agrobakterien sein. In einer vorteilhaften Ausführungsform wird die Expressionskassette mittels Plasmidvektoren eingeführt. Bevorzugte Vektoren sind diejenigen, welche die stabile Integration der Expressionskassette in das Wirtsgenom ermöglichen.
  • Ein DNA-Konstrukt kann in die Ziel-Pflanzenzellen und/oder -Organismen durch beliebige der mehreren dem Fachmann bekannten Methoden eingebracht werden, einer Prozedur, welche als Transformation bezeichnet wird (siehe auch Keown et al. (1990) Meth Enzymol 185: 527–537). Zum Beispiel können die DNA-Konstrukte in Zellen, entweder in Kultur oder in den Organen einer Pflanze, durch eine Vielzahl von herkömmlichen Techniken eingebracht werden. Zum Beispiel können die DNA-Konstrukte unter Anwendung von Ballistik-Verfahren, wie DNA-Partikelbeschuss, direkt in Pflanzenzellen eingebracht werden, oder das DNA-Konstrukt kann unter Anwenden von Techniken, wie Elektroporation und Mikroinjektion von Zellen, eingebracht werden. Partikel-vermittelte Transformationstechniken (ebenfalls bekannt als ”Bilistik”) sind z. B. in Klein et al. (1987) Nature 327: 70–73; Vasil V et al. (1993) BiolTechnol 11: 1553–1558; und Becker D et al. (1994) Plant J 5: 299–307 beschrieben. Diese Verfahren beinhalten die Penetration von Zellen mittels kleinen Partikeln, bei denen die Nukleinsäure entweder innerhalb der Matrix von kleinen Kügelchen oder Teilchen, oder auf der Oberfläche vorliegt. Die Biolistik-”PDS-1000 Gene Gun” (Biorad, Hercules, CA) verwendet Heliumdruck zum Beschleunigen von DNA-beschichteten Gold- oder Wolfram-Mikroträgern in Richtung auf die Zielzellen. Das Verfahren ist auf eine breite Auswahl an Geweben und Zellen aus Organismen, einschließlich Pflanzen, anwendbar. Andere Transformationsmethoden sind dem Fachmann auf dem Gebiet ebenfalls bekannt.
  • Mikroinjektionstechniken sind im Fachgebiet bekannt und sind in der Wissenscharts- und Patentliteratur allgemein beschrieben. Außerdem kann die Zelle, zum Beispiel unter Verwendung von Polyethylenglycol, chemisch permeabilisiert werden, so dass die DNA durch Diffusion in die Zelle eintreten kann. Die DNA kann auch durch Protoplastenfusion mit anderen DNA-enthaltenden Einheiten, wie Minizellen, Zellen, Lysosomen oder Liposomen, eingebracht werden. Die Einbringung von DNA-Konstrukten unter Verwendung von Polyethylenglycol(PEG)-Präzipitation ist in Paszkowski et al. (1984) EMBO J 3: 2717 beschrieben. Liposom-basierte Genzuführung ist z. B. in WO 93/24640 ; Mannino und Gould-Fogerite (1988) BioTechniques 6(7): 682–691; US 5 279 833 ; WO 91/06309 ; und Feigner et al. (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84: 7413–7414) beschrieben.
  • Ein anderes geeignetes Verfahren zur Einbringung von DNA ist Elektroporation, wobei die Zellen durch einen elektrischen Puls reversibel permeabilisiert werden. Elektroporationstechniken sind in Fromm et al. (1985) Proc Nati Acad Sci USA 82: 5824 beschrieben. PEG-vermittelte Transformation und Elektroporation von pflanzlichen Protoplasten sind ebenfalls in Lazzeri P (1995) Methods Mol Biol 49: 95–106 erörtert. Bevorzugte allgemeine Verfahren, welche erwähnt werden können, sind die Calciumphosphat-vermittelte Transfektion, die DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, die kationische Lipid-vermittelte Transfektion, Elektroporation, Transduktion und Infektion. Solche Verfahren sind dem Fachmann bekannt und, zum Beispiel, in Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986) beschrieben. Für eine Übersicht von Gentransfer-Verfahren für Pflanzen- und Zellkulturen siehe Fisk et al. (1993) Scientia Horticulturae 55: 5–36, und Potrykus (1990) CIBA Found Symp 154: 198.
  • Verfahren zur Einbringung und Expression von heterologen Genen sowohl in monokotylen als auch dikotylen Pflanzen sind bekannt. Siehe z. B. US 5 633 446 , US 5 317 096 , US 5 689 052 , US 5 159 135 und US 5 679 558 ; Weising et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22: 421–477. Insbesondere die Transformation von Monokotylen kann verschiedene Techniken anwenden, einschließlich Elektroporation (z. B. Shimamoto et al. (1992) Nature 338: 274–276); Biolistik (z. B. EP-A 1 270 356 ); und Agrobacterium (z. B. Bytebier et al. (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84: 5345–5349).
  • Bei Pflanzen werden Verfahren für das Transformieren und Regenerieren von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen, mit denen der Fachmann vertraut ist, für transiente oder stabile Transformation genutzt. Geeignete Verfahren sind insbesondere Protoplastentransformation mittels Polyethylenglycol-induzierter DNA-Aufnahme, Biolistik-Verfahren, wie das Gen-Kanone(”Partikelbeschuss”)-Verfahren, Elektroporation, die Inkubation von trockenen Embryonen in DNA-haltiger Lösung, Schallbehandlung und Mikroinjektion, und die Transformation von intakten Zellen oder Geweben durch Mikro- oder Makroinjektion in Gewebe oder Embryonen, Gewebeelektroporation, oder Vakuuminfiltration von Samen. Im Fall der Injektion oder Elektroporation von DNA in pflanzliche Zellen, muss das verwendete Plasmid nicht irgendeine besondere Anforderung erfüllen. Einfache Plasmide, wie jene der pUC-Serie, können verwendet werden. Wenn intakte Pflanzen aus den transformierten Zellen regeneriert werden sollen, ist das Vorhandensein eines zusätzlichen selektierbaren Markergens auf dem Plasmid nützlich.
  • Zusätzlich zu diesen ”direkten” Transformationstechniken kann die Transformation auch durch bakterielle Infektion mittels Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes durchgeführt werden. Diese Stämme enthalten ein Plasmid (Ti- oder Ri-Plasmid). Ein Teil von diesem Plasmid, genannt T-DNA (transferierte DNA), wird im Anschluß an Agrobacterium-Infektion in die Pflanze überführt und in das Genom der Pflanzenzelle integriert.
  • Für Agrobacterium-vermittelte Transformation von Pflanzen kann ein DNA-Konstrukt der Erfindung mit geeigneten T-DNA flankierenden Regionen kombiniert und in einen herkömmlichen Agrobacterium tumefaciens-Wirtsvektor eingebracht werden. Die Virulenzfunktionen des A. tumefaciens-Wirts lenken die Insertion eines Transgens und angrenzender Markergen(e) (falls vorhanden) in die Pflanzenzell-DNA, wenn die Zelle durch die Bakterien infiziert wird. Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Transformationstechniken sind in der wissenschaftlichen Literatur hinreichend beschrieben. Siehe zum Beispiel Horsch et al. (1984) Science 233: 496–498, Fraley et al. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80: 4803–4807, Hooykaas (1989) Plant Mol Biol 13: 327–336, Horsch RB (1986) Proc Natl Acad Sci USA 83(8): 2571–2575), Bevans et al. (1983) Nature 304: 184–187, Bechtold et al. (1993) Comptes Rendus De L'Academie Des Sciences Serie III-Sciences De La Vie-Life Sciences 316: 1194–1199, Valvekens et al. (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85: 5536–5540.
  • Ein DNA-Konstrukt der Erfindung wird vorzugsweise in spezifische Plasmide, entweder in einen Shuttle- oder Zwischenstufen-Vektor oder in einen binären Vektor integriert. Wenn zum Beispiel ein Ti- oder Ri-Plasmid für die Transformation verwendet werden soll, ist zumindest die rechte Border, aber in den meisten Fällen die rechte und die linke Border, der Ti- oder Ri-Plasmid-T-DNA mit der einzubringenden Expressionskassette als eine flankierende Region verknüpft. Binäre Vektoren werden vorzugsweise verwendet. Binäre Vektoren sind zur Replikation sowohl in E. coli als auch in Agrobacterium in der Lage. In der Regel enthalten sie ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker, flankiert von der rechten oder linken T-DNA-flankierenden Sequenz. Sie können direkt in Agrobacterium transformiert werden (Holsters et al. (1978) Mol Gen Genet 163: 181–187). Das Selektionsmarkergen erlaubt die Selektion von transformierten Agrobakterien und ist, zum Beispiel, das nptII-Gen, welches Resistenz gegenüber Kanamycin verleiht. Das Agrobakterium, das in diesem Fall als Wirtsorganismus wirkt, sollte bereits ein Plasmid mit der vir-Region enthalten. Letztere wird zum Übertragen der T-DNA in die Pflanzenzelle benötigt. Ein so transformiertes Agrobakterium kann zum Transformieren von Pflanzenzellen verwendet werden.
  • Viele Stämme von Agrobacterium tumefaciens sind zum Überführen von genetischem Material – zum Beispiel von einem DNA-Konstrukt gemäß der Erfindung – in der Lage, wie zum Beispiel die Stämme EHA101(pEHA101) (Hood EE et al. (1996) J Bacteriol 168(3): 1291–1301), EHA105(pEHA105) (Hood et al. 1993, Transgenic Research 2, 208–218), LBA4404(pAL4404) (Hoekema et al. (1983) Nature 303: 179–181), C58C1(pMP90) (Koncz und Schell (1986) Mol Gen Genet 204, 383–396) und C58C1(pGV2260) (De-blaere et al. (1985) Nucl Acids Res. 13, 4777–4788).
  • Der für die Transformation verwendete agrobakterielle Stamm umfasst, zusätzlich zu seinem entschärften Ti-Plasmid, ein binäres Plasmid mit der zu übertragenden T-DNA, welches, in der Regel, ein Gen für die Selektion der transformierten Zellen und das zu übertragende Gen umfasst. Beide Gene müssen mit transkriptionalen und translationalen Initiations- und Terminationssignalen ausgestattet sein. Das binäre Plasmid kann zum Beispiel durch Elektroporations- oder andere Transformationsmethoden in den agrobakteriellen Stamm übertragen werden (Mozo & Hooykaas (1991) Plant Mol Biol 16: 917–918). Das Cokultivieren der Pflanzenexplantate mit dem agrobakteriellen Stamm wird üblicherweise zwei bis drei Tage lang durchgeführt.
  • Eine Vielzahl von Vektoren konnte, oder kann, verwendet werden. Im Prinzip unterscheidet man zwischen denjenigen Vektoren, welche für die Agrobacterium-vermittelte Transformation oder Agroinfektion verwendet werden können, d. h. welche ein DNA-Konstrukt der Erfindung innerhalb einer T-DNA umfassen, welches in der Tat die stabile Integration der T-DNA in das Pflanzengenom erlaubt. Daneben können Bordersequenz-freie Vektoren verwendet werden, welche, zum Beispiel durch Partikelbeschuss, in die Pflanzenzellen transformiert werden können, wo sie sowohl zu transienter als auch stabiler Expression führen können.
  • Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und beschrieben worden ( EP-A1 120 516 ; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System, Offset-drukkerij Kanters B. V., Alblasserdam, Kapitel V; Fraley et al. (1985) Crit Rev Plant Sci 4: 1–45, und An et al. (1985) EMBO J 4: 277–287). Verschiedene binäre Vektoren sind bekannt, von denen manche kommerziell erhältlich sind, wie zum Beispiel pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. USA).
  • Um die DNA in die Pflanzenzelle zu übertragen, werden Pflanzenexplantate mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes cokultiviert. Ausgehend von infiziertem Pflanzenmaterial (zum Beispiel Blatt-, Wurzel- oder Stengelschnitten, aber auch Protoplasten oder Suspensionen von Pflanzenzellen) können intakte Pflanzen unter Verwendung eines geeigneten Mediums regeneriert werden, welches zum Beispiel Antibiotika oder Biozide zum Selektieren von transformierten Zellen enthalten kann. Die erhaltenen Pflanzen können dann hinsichtlich der Gegenwart der eingeführten DNA, in diesem Fall eines DNA-Konstrukts gemäß der Erfindung, gescreent werden. Sobald die DNA in das Wirtsgenom integriert worden ist, ist der betreffende Genotyp in der Regel stabil, und die betreffende Insertion wird auch in den nachfolgenden Generationen gefunden. In der Regel enthält die integrierte Expressionskassette einen Selektionsmarker, welcher der transformierten Pflanze eine Resistenz gegenüber einem Biozid (zum Beispiel einem Herbizid) oder einem Antibiotikum, wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinotricin, und dergleichen verleiht. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion von transformierten Zellen (McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81–84). Die erhaltenen Pflanzen können in der üblichen Weise kultiviert und hybridisiert werden. Zwei oder mehr Generationen sollten wachsen gelassen werden, um sicherzustellen, dass die genomische Integration stabil und erblich ist.
  • Die oben erwähnten Verfahren sind, zum Beispiel, in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von SD Kung und R Wu, Academic Press (1993), 128–143, und in Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42: 205–225) beschrieben. Das zu exprimierende Konstrukt wird vorzugsweise in einen Vektor kloniert, der für die Transformation von Agrobacterium tumefaciens geeignet ist, zum Beispiel pBin19 (Bevan et al. (1984) Nucl Acids Res 12: 8711).
  • Das DNA-Konstrukt der Erfindung kann verwendet werden, um gewünschte Merkmale an im Wesentlichen jedwede Pflanze zu vermitteln. Der Fachmann wird erkennen, dass nachdem das DNA-Konstrukt stabil in transgene Pflanzen eingebracht und bestätigtermaßen funktionsfähig ist, es durch sexuelle Kreuzung in andere Pflanzen eingeführt werden kann. Jedwede von einer Anzahl standardmäßiger Züchtungstechniken kann, abhängig von den zu kreuzenden Spezies, angewandt werden.
  • Die Nukleasen oder chimäre Endonuklease können alternativ dazu in transienter Weise exprimiert werden. Die chimäre Endonuklease kann transient als eine DNA oder RNA exprimiert werden, die in die Zielzelle zugeführt wird, und/oder kann als ein Protein zugeführt werden. Die Zuführung als ein Protein kann mit Hilfe von Zell-penetrierenden Peptiden oder durch Fusion mit, an die Nukleasen oder chimären Endonukleasen fusionierten, SEciV-Signalpeptiden bewirkt werden, welche die Sekretion aus einem Abgabeorganismus in eine Zelle eines Zielorganismus hinein, z. B. aus Agrobacterium rhizogenes oder Agrobacterium tumefaciens in eine Pflanzenzelle, vermitteln.
  • Regeneration von transgenen Pflanzen
  • Transformierte Zellen, d. h. diejenigen, welche die in die DNA der Wirtszelle integrierte DNA umfassen, können von untransformierten Zellen fort selektiert werden, wenn ein selektierbarer Marker Teil der eingebrachten DNA ist. Ein Marker kann zum Beispiel jedwedes Gen sein, das zum Herbeiführen einer Resistenz gegenüber Antibiotika oder Herbiziden in der Lage ist (für Beispiele siehe oben). Transformierte Zellen, welche ein derartiges Markergen exprimieren, sind zum Überleben in Gegenwart von Konzentrationen eines geeigneten Antibiotikums oder Herbizids in der Lage, welche einen nicht-transformierten Wildtyp töten. Sobald eine transformierte Pflanzenzelle erzeugt worden ist, kann eine intakte Pflanze unter Anwendung von, dem Fachmann bekannten, Verfahren erhalten werden. Zum Beispiel werden Kalluskulturen als Ausgangsmaterial verwendet. Die Bildung von Spross und Wurzel kann auf die bekannte Weise in dieser bis dahin noch undifferenzierten Zellbiomasse induziert werden. Die erhaltenen Sprosse können eingepflanzt und kultiviert werden.
  • Transformierte Pflanzenzellen, die durch beliebige der obigen Transformationstechniken abgeleitet wurden, können kultiviert werden, um eine ganze Pflanze zu regenerieren, welche den transformierten Genotyp und somit den gewünschten Phänotyp besitzt. Derartige Regenerationstechniken basieren auf der Manipulation bestimmter Phytohormone in einem Gewebekultur-Wachstumsmedium, wobei sie typischerweise auf einen Biozid- und/oder Herbizid-Marker zurückgreifen, der zusammen mit den gewünschten Nukleotidsequenzen eingebracht worden ist. Die Pflanzenregeneration aus kultivierten Protoplasten ist in Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, S. 124176, Macmillian Publishing Company, New York (1983); und in Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, S. 21–73, CRC Press, Boca Raton, (1985), beschrieben. Die Regeneration kann ebenfalls aus Pflanzenkallus, Explantaten, somatischen Embryonen (Dandekar et al. (1989) J Tissue Cult Meth 12: 145; McGranahan et al. (1990) Plant Cell Rep 8: 512), Organen oder Teilen davon erhalten werden. Derartige Regenerationstechniken sind allgemein in Klee et al. (1987) Ann Rev Plant Physiol 38: 467–486, beschrieben.
  • Kombination mit anderen Rekombinations-verstärkenden Techniken
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Effektivität des Rekombinationssystems durch Kombination mit Systemen, welche die homologe Rekombination fördern, erhöht. Derartige Systeme sind beschrieben und beinhalten zum Beispiel die Expression von Proteinen, wie RecA, oder die Behandlung mit PARP-Inhibitoren. Es ist gezeigt worden, dass die intrachromosomale homologe Rekombination in Tabakpflanzen durch Verwenden von PARP-Inhibitoren erhöht werden kann (Puchta H et al. (1995) Plant J. 7: 203–210). Unter Verwendung dieser Inhibitoren kann die homologe Rekombinationsrate in der Rekombinationskassette nach Induktion des sequenzspezifischen DNA-Doppelstrangbruchs, und somit die Effektivität der Deletion der Transgen-Sequenzen, weiter erhöht werden. Verschiedene PARP-Inhibitoren können für diesen Zweck verwendet werden. Vorzugsweise sind Inhibitoren eingeschlossen, wie 3-Aminobenzamid, 8-Hydroxy-2-methylchinazolin-4-on (NU1025), 1,11b-Dihydro-(2H)benzopyrano(4,3,2-de)isochinolin-3-on (GPI 6150), 5-Aminoisochinolinon, 3,4-Dihydro-5-(4-(1-piperidinyl)butoxy)-1(2H)-isochinolinon, oder die Verbindungen, welche in WO 00/26192 , WO 00/29384 , WO 00/32579 , WO 00/64878 , WO 00/68206 , WO 00/67734 , WO 01/23386 und WO 01/23390 beschrieben sind.
  • Darüber hinaus war es möglich, die Frequenz von verschiedenen homologen Rekombinationsreaktionen in Pflanzen durch Exprimieren des E. coli-RecA-Gens zu erhöhen (Reiss B et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93(7): 3094–3098). Des Weiteren verschiebt die Gegenwart des Proteins das Verhältnis zwischen homologer und illegitimer Doppelstrangbruch- bzw. DSB-Reparatur zu Gunsten der homologen Reparatur (Reiss B et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97(7): 3358–3363). Man kann auch auf die in WO 97/08331 beschriebenen Verfahren zur Erhöhung der homologen Rekombination in Pflanzen Bezug nehmen. Eine weitere Erhöhung der Effektivität des Rekombinationssystems könnte durch die simultane Expression des RecA-Gens oder anderer Gene, welche die homologe Rekombinationseffektivität erhöhen, erzielt werden (Shalev G et al. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96(13): 7398–402). Die oben angegebenen Systeme zur Förderung homologer Rekombination können auch in vorteilhafter Weise in Fällen angewandt werden, bei denen das Rekombinationskonstrukt mittels homologer Rekombination in einer ortsgerichteten Weise in das Genom eines eukaryotischen Organismus eingebracht werden soll.
  • Verfahren zum Bereitstellen chimärer Endonukleasen:
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Bereitstellen einer chimären Endonuklease, wie oben beschrieben, bereit.
  • Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte:
    • a. Bereitstellen mindestens einer Endonuklease-codierenden Region
    • b. Bereitstellen mindestens einer für eine heterologe DNA-Bindungsdomäne codierenden Region;
    • c. Bereitstellen eines Polynukleotids mit einer potentiellen DNA-Erkennungssequenz oder potentiellen DNA-Erkennungssequenzen der Endonuklease oder Endonukleasen von Schritt a) und mit einer potentiellen Erkennungssequenz oder mit potentiellen Erkennungssequenzen der heterologen DNA-Bindungsdomäne oder heterologen DNA-Bindungsdomänen von Schritt b),
    • d. Erzeugen einer translationalen Fusion von allen Endonuklease-codierenden Regionen von Schritt b) und allen heterologen DNA-Bindungsdomänen von Schritt c),
    • e. Exprimieren einer chimären Endonuklease aus der in Schritt d) erzeugten translationalen Fusion,
    • f. Testen der in Schritt e) exprimierten chimären Endonuklease hinsichtlich der Spaltung des Polynukleotids von Schritt c).
  • Abhängig von dem beabsichtigten Zweck können die Verfahrensschritte a), b), c) und d) in variierender Reihenfolge verwendet werden. Zum Beispiel kann das Verfahren angewandt werden, um eine bestimmte Kombination von mindestens einer Endonuklease und mindestens einer heterologen DNA-Bindungsdomäne bereitzustellen, und wobei danach ein Polynukleotid bereitgestellt wird, das potentielle DNA-Erkennungsstellen und potentielle Erkennungsstellen umfasst, welche die Abfolge, in der die mindestens eine Nuklease sowie die mindestens eine heterologe DNA-Bindungsstelle in der translationalen Fusion angeordnet wurden, reflektieren, und die chimäre Endonuklease bezüglich der Spaltungsaktivität auf einem Polynukleotid mit potentiellen DNA-Erkennungsstellen und potentiellen Erkennungsstellen für die Nukleasen und heterologen DNA-Bindungsdomänen, die von der chimären Endonuklease enthalten sind, getestet wird, und mindestens ein Polynukleotid selektiert wird, das durch die chimäre Endonuklease geschnitten wird.
  • Das Verfahren kann auch angewandt werden, um eine chimäre Endonuklease bezüglich der Spaltungsaktivität auf einem vorausgewählten Polynukleotid zu entwerfen, indem zuerst ein Polynukleotid mit einer spezifischen Sequenz bereitgestellt wird, wonach mindestens eine Endonuklease und mindestens eine heterologe DNA-Bindungsdomäne mit nicht-überlappenden potentiellen DNA-Erkennungsstellen und potentiellen Erkennungsstellen in der Nukleotidsequenz des Polynukleotids ausgewählt werden, eine translationale Fusion der mindestens einen Endonuklease und der mindestens einen heterologen DNA-Bindungsdomäne erzeugt wird, die von der translationalen Fusion codierte chimäre Endonuklease exprimiert wird, und die chimäre Endonuklease bezüglich der Spaltungsaktivität auf der vorausgewählten Polynukleotidsequenz getestet wird, und eine chimäre Endonuklease mit einer derartigen Spaltungsaktivität selektiert wird.
  • Dieses Verfahren kann angewandt werden, um eine chimäre Endonuklease mit einer gesteigerten Spaltungsaktivität auf einem spezifischen Polynukleotid zu entwerfen. Zum Beispiel ist es, wenn ein Polynukleotid eine DNA-Erkennungsstelle einer Nuklease umfasst, möglich, eine potentielle Erkennungsstelle einer heterologen DNA-Bindungsdomäne zu identifizieren, welche verwendet werden kann, um eine chimäre Endonuklease zu erzeugen, welche die Nuklease und die heterologe DNA-Bindungsdomäne umfasst.
  • Alternativ dazu kann dieses Verfahren auch angewandt werden, um eine chimäre Endonuklease mit Spaltungsaktivität auf einem spezifischen Polynukleotid, das eine Erkennungsstelle einer heterologen DNA-Bindungsdomäne umfasst, zu erzeugen. Falls zum Beispiel das spezifische Polynukleotid bekanntermaßen von einer heterologen DNA-Bindungsdomäne gebunden wird, z. B. einem bestimmten Transkriptionsfaktor oder einem Virulenzfaktor eines Pathogens mit einer spezifischen DNA-Bindungsaktivität, wie Tal-Typ-Effektorproteinen oder die Repeat-Einheiten in bestimmten Tal-Typ III-Effektorproteinen von Xanthomonas-Spezies, ist es möglich, eine Endonuklease zu identifizieren, welche eine potentielle DNA-Erkennungsstelle aufweist, die in der Nähe, aber nicht überlappend mit, der Erkennungsstelle der identifizierten heterologen DNA-Bindungsdomäne vorliegt. Durch Erzeugen einer translationalen Fusion und Exprimieren der die identifizierte Endonuklease und die heterologe DNA-Bindungsdomäne umfassenden chimären Endonuklease wird es möglich sein, die chimäre Endonuklease bezüglich der Spaltungsaktivität auf dem vorausgewählten Polynukleotid zu testen.
  • Geeignete Endonukleasen und heterologe DNA-Bindungsdomänen können mittels Durchsuchen von Datenbanken identifiziert werden, welche DNA-Erkennungsstellen von Endonukleasen und Erkennungsstellen von DNA-Bindungsproteinen, wie Transkriptionsfaktoren oder Virulenzfaktoren, umfassen.
  • Ferner, ist es möglich, die Aminosäuresequenz von Endonukleasen, wie I-SceI, I-CreI, I-DmoI oder I-MsoI zu mutieren, um neue Bindungs- und DNA-Spaltungsaktivität zu erzeugen. Ähnliche Techniken sind verfügbar, um neue Bindungaktivitäten von Zinkfinger-umfassenden Proteinen oder Virulenzfaktoren der Tal-Typ III-Effektorproteine von Xanthomonas-Spezies zu erzeugen, welche als heterologe DNA-Bindungsdomänen verwendet werden können. Durch Erzeugen von chimären Endonukleasen, welche Endonukleasen, wie I-SceI, I-CreI, I-DmoI oder I-MsoI, und heterologe DNA-Bindungsdomänen, die aus Zinkfingerproteinen oder Tal-Typ-III-Effektorproteinen von Xanthomonas-Spezies abgeleitet sind oder diese enthalten, umfassen, in Kombination mit Mutationstechniken zur Anpassung ihrer DNA-Bindungsaktivität an die Sequenz von vorausgewählten Polypeptiden, ist es möglich, chimäre Endonukleasen zu erzeugen, welche solche vorausgewählten Polypeptide binden und spalten.
  • Demzufolge umfasst eine Ausführungsform der Erfindung chimäre Endonukleasen, die folgendes umfassen
    • a) mindestens eine Endonuklease, die aus der Gruppe von I-SceI, I-CreI, I-DmoI oder I-MsoI oder Homologen von I-SceI, I-CreI, I-DmoI oder I-MsoI mit mindestens 80%, 85%, 90% 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität gewählt ist, und
    • b) eine heterologe DNA-Bindungsdomäne, die entweder mindestens ein Zinkfingerprotein umfasst oder mindestens ein Tal-Typ III-Effektorprotein von Xanthomonas-Spezies umfasst oder mindestens ein Zinkfingerprotein umfasst und mindestens ein Tal-Typ III-Effektorprotein von Xanthomonas-Spezies umfasst oder mindestens ein Homolog von Zinkfingerproteinen oder Tal-Typ III-Effektorproteinen von Xanthomonas-Spezies mit mindestens 80%, 85%, 90% 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität umfasst.
  • Die Spaltungsaktivität von Endonukleasen und chimären Endonukleasen sowie die DNA-Bindungsaktivität von Endonukleasen, heterologen DNA-Bindungsdomänen und chimären Endonukleasen können durch im Fachgebiet bekannte In-vitro- und In-vivo-Techniken getestet werden, beispielsweise durch Techniken, wie sie in den Beispielen hierin offenbart sind.
  • Verfahren zur homologen Rekombination und gezielten Mutation unter Verwendung von chimären Endonukleasen.
  • Die vorliegende Erfindung sieht ein Verfahren zur homologen Rekombination von Polynukleotiden vor, das Folgendes umfasst:
    • a. Bereitstellen einer Zelle, die für homologe Rekombination kompetent ist,
    • b. Bereitstellen eines Polynukleotids, das ein rekombinantes Polynukleotid, flankiert von einer Sequenz A und einer Sequenz B, umfasst,
    • c. Bereitstellen eines Polynukleotids, das Sequenzen A' und B' umfasst, die ausreichend lang und homolog zur Sequenz A und Sequenz B sind, damit homologe Rekombination in der Zelle ermöglicht wird, und
    • d. Bereitstellen einer chimären Endonuklease oder einer Expressionskassette, die für eine chimäre Endonuklease codiert,
    • e. Kombinieren von b), c) und d) in der Zelle, und
    • f. Nachweisen von rekombinierten Polynukleotiden von b) und c), oder Selektieren für oder Wachsenlassen von Zellen, die rekombinierte Polynukleotide von b) und c) umfassen.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst das in Schritt b) bereitgestellte Polynukleotid mindestens eine chimäre Erkennungsstelle, vorzugsweise eine chimäre Erkennungsstelle, die aus der Gruppe von Sequenzen gewählt ist, die durch SEQ ID NR: 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder 20 beschrieben ist.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst das in Schritt c) bereitgestellte Polynukleotid mindestens eine chimäre Erkennungsstelle, die vorzugsweise aus der Gruppe von Sequenzen gewählt ist, die durch SEQ ID NR: SEQ ID NR: 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder 20 beschrieben ist.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung umfassen das in Schritt b) bereitgestellte Polynukleotid und das in Schritt c) bereitgestellte Polynukleotid mindestens eine chimäre Erkennungsstelle, die vorzugsweise aus der Gruppe von Sequenzen gewählt ist, die durch SEQ ID NR: 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder 20 beschrieben ist.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung führt Schritt e) zur Deletion eines Polynukleotids, das in dem in Schritt c) bereitgestellten Polynukleotid enthalten ist.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung codiert das deletierte Polynukleotid, das in dem in Schritt c) bereitgestellten Polynukleotid enthalten ist, ein Markergen oder Teile von einem Markergen.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst das in Schritt b) bereitgestellte Polynukleotid mindestens eine Expressionskassette.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst das in Schritt b) bereitgestellte Polynukleotid mindestens eine Expressionskassette, welche zur Expression eines Selektionsmarkergens oder eines Reportergens führt.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst das in Schritt b) bereitgestellte Polynukleotid mindestens eine Expressionskassette, welche zur Expression eines Selektionsmarkergens oder eines Reportergens führt, und umfasst mindestens eine DNA-Erkennungsstelle oder mindestens eine chimäre Erkennungsstelle.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung sieht ein Verfahren zur gezielten Mutation von Polynukleotiden vor, das Folgendes umfasst:
    • a. Bereitstellen einer Zelle, die ein Polynukleotid umfasst, das eine chimäre Erkennungsstelle umfasst,
    • b. Bereitstellen einer chimären Endonuklease, z. B. einer chimären Endonuklease, die eine Endonuklease mit einer Sequenz umfasst, die aus der durch SEQ ID NR: 2, 3 oder 5 beschriebenen Gruppe von Sequenzen gewählt ist, und in der Lage ist, die chimäre Erkennungsstelle von Schritt a) zu spalten,
    • c. Kombinieren von a) und b) in der Zelle, und
    • d. Nachweisen von mutierten Polynukleotiden oder Selektieren für wachsende Zellen, die mutierte Polynukleotide umfassen.
  • Die Erfindung sieht in einer anderen Ausführungsform ein Verfahren zur homologen Rekombination, wie oben beschrieben, oder ein Verfahren zur gezielten Mutation von Polynukleotiden, wie oben beschrieben, vor, das Folgendes umfasst:
    Kombinieren der chimären Endonuklease und der chimären Erkennungsstelle durch Kreuzung von Organismen, durch Transformation von Zellen oder durch ein an die chimäre Endonuklease fusioniertes SecIV-Peptid und Inkontaktbringen der Zelle, welche die chimäre Erkennungsstelle umfasst, mit einem Organismus, der die chimäre Endonuklease exprimiert und einen SecIV-Transportkomplex exprimiert, welcher in der Lage ist, das an die chimäre Endonuklease fusionierte SecIV-Peptid zu erkennen.
  • Beispiele
  • Generelle Verfahren:
  • Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann zum Beispiel in der bekannten Weise unter Anwendung des Phosphoamidit-Verfahrens bewirkt werden (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seiten 896–897). Die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungs-Schritte, wie zum Beispiel Restriktionsspaltungen, Agarosegelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, der Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose- und Nylonmembranen, das Verknüpfen von DNA-Fragmenten, die Transformation von E. coli-Zellen, bakterielle Kulturen, die Fortpflanzung bzw. Vermehrung von Phagen und die Sequenzanalyse von rekombinanter DNA werden wie bei Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6, beschrieben durchgeführt. Rekombinante DNA-Moleküle wurden unter Verwendung eines ALF-Express-Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierers (Pharmacia, Upsala [sic], Schweden) unter Befolgung des Verfahrens von Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463–5467) sequenziert.
  • Beispiel 1: Konstrukte, welche sequenzspezifische DNA-Endonuklease-Expressionskassetten für die Expression in E. coli enthalten
  • Beispiel 1a: Basales Konstrukt
  • In diesem Beispiel präsentieren wir die allgemeine Skizze eines als ”Konstrukt I” bezeichneten Vektors, der für die Transformation in E. coli geeignet ist. Diese allgemeine Skizze des Vektors umfasst ein Ampicillin-Resistenzgen für die Selektion, einen Replikationsursprung für E. coli und das Gen araC, das einen Arabinose-induzierbaren Transkriptionsregulator codiert. Unterschiedliche Gene, die verschiedene Versionen der sequenzspezifischen DNA-Endonuklease codieren, können von dem Arabinose-induzierbaren pBAD-Promotor (Guzman et al., J Bacteriol 177: 4121–4130 (1995)) aus exprimiert werden. Die Sequenzen der Gene, welche die verschiedenen Nukleaseversionen codieren, sind in den folgenden Beispielen angegeben.
  • Das Kontrollkonstrukt, in welchem die Sequenz von I-SceI (SEQ ID NR: 22) codiert ist, wurde als VC-SAH40-4 bezeichnet.
  • Beispiel 1b: scTet-I-SceI-Fusionskonstrukte
  • In JOURNAL OF BACTERIOLOGY 150(2), 633–642 (1982) beschrieben Beck et al. das TetR-Protein. TetR wirkt als ein Dimer, aber Einzelkettenvarianten (scTetR) sind in NUCLEIC ACIDS RESEARCH 31(12), 3050–3056 (2003) von Krueger et al. allgemein beschrieben. Die scTetR codierende Sequenz wurde an I-SceI, mit einem einzelnen Lysin als einem kurzen Linker, fusioniert. Der Linker war auf eine solche Weise entworfen, dass das resultierende Fusionsprotein eine zugehörige Bindungsstelle erkennt, die eine Kombination der Bindungsstellen von I-SceI und TetR darstellt. TetR ist ein transkriptioneller Repressor, der in Abwesenheit des Induktors an die DNA bindet. Er wird in Gegenwart von Tetracyclin von der Erkennungssequenz abgelöst bzw. disloziert. Dies könnte das Potential zum Regulieren der Aktivität oder DNA-Bindungs-Affinität des Fusionsproteins auf die gleiche Weise bieten. Das resultierende Plasmid wurde VC-SAH54-4 genannt. Die Sequenz des Konstrukts ist identisch zur Sequenz von Konstrukt I, während das Nuklease codierende Gen durch die bei SEQ ID NR: 23 beschriebene Sequenz ersetzt wurde.
  • Ein ähnliches Konstrukt wurde erzeugt, welches zusätzlich zum Letzteren eine NLS-Sequenz enthält. Das resultierende Plasmid wurde VC-SAH53-10 genannt. Die Sequenz des Konstrukts ist identisch zu der Sequenz von Konstrukt I, während das Nuklease codierende Gen durch die bei SEQ ID NR: 24 beschriebene Sequenz ersetzt wurde.
  • Beispiel 1c: scArc-I-SceI-Fusionskonstrukte
  • In J Mol Biol 185 (2), 445–6 (1985) beschrieben Jordan et al. die Kristallisation des Arc-Repressors von Salmonella-Phage P22 Arc. Es ist als ein Dimer aktiv, aber Einzelkettenvarianten (scArc) sind in Biochemistry 35 (1), 109–16 (1996) von Robinsons et al. beschrieben. Die codierende Sequenz für diese Einzelkettenvariante wurde an I-SceI fusioniert, und zwar mit einem Linker, der eine NLS umfasst. Der Linker mit der Aminosäuresequenz: RSGGGSGGGTGGGSGGGAPKKKRKVLE (SEQ ID NR: 151) war auf eine Weise entworfen, dass das resultierende Fusionsprotein eine zugehörige Bindungsstelle erkennt, welche eine Kombination der Bindungsstellen von I-SceI und Arc darstellt. Das resultierende Plasmid wurde VC-SAH28-5 genannt. Die Sequenz des Konstrukts ist identisch zur Sequenz von Konstrukt I, während das codierte Gen durch SEQ ID NR: 25 beschrieben ist. Es wurde auch eine Fusion mit einem kürzeren Linker erzeugt, wobei der Linker die Aminosäuresequenz: RSAPKKKRKVLE (SEQ ID NR: 152) zwischen scArc und I-SceI aufweist, was immer noch eine NLS beinhaltet. Das resultierende Plasmid wurde VC-SAH46-4 genannt. Die Sequenz des Konstrukts ist identisch zur Sequenz von Konstrukt I, während das codierte Gen durch SEQ ID NR: 26 beschrieben ist.
  • Beispiel 2: Konstrukte, welche Nuklease-Erkennungssequenzen/Zielstellen umfassen, um -SceI-Aktivität in E. coli zu überwachen
  • Beispiel 2a: Basales Konstrukt
  • In diesem Beispiel präsentieren wir die allgemeine Skizze eines als ”Konstrukt II” bezeichneten Vektors, der für die Transformation in E. coli geeignet ist. Diese allgemeine Skizze des Vektors umfasst ein Kanamycin-Resistenzgen für die Selektion, einen Replikationsursprung für E. coli, der mit dem ori von Konstrukt I kompatibel ist. Die SEQ ID NR: 27 zeigt eine Sequenzstrecke von ”NNNNNNNNNN”. Diese soll einen Platzhalter für verschiedene Erkennungs/Zielstellen für die diversen Versionen und Proteinfusionen der sequenzspezifischen DNA-Endonukleasen bedeuten. Das Kontrollkonstrukt, in welchem der Platzhalter durch eine Sequenzstrecke, welche die native Zielsequenz von I-SceI (SEQ ID NR: 28) umfasst, ersetzt ist, wurde VC-SAH6-1 genannt. Ein Kontrollplasmid ohne eine Zielstelle wurde VC-SAH7-1 (SEQ ID NR 29) genannt. Die verschiedenen kombinierten Zielstellen sind in den folgenden Beispielen angegeben.
  • Beispiel 2b: Zielstellen, kombiniert aus I-SceI-Erkennungssequenz und scTet-Bindungssequenz
  • Kombinierte Zielstellen wurden erzeugt, welche aus der Zielstelle von der Nuklease I-SceI und TetR bestehen. Verschiedene kombinierte Zielstellen mit variierenden Abständen der einzelnen Stellen wurden erzeugt. Die Absicht war es, diejenige zu identifizieren, welche am besten von dem zugeordneten I-SceI-Fusionsprotein erkannt wird. Die resultierenden Plasmide wurden VC-SAH60-5, VC-SAH61-1, VC-SAH62-1 genannt. Die Sequenz der Konstrukte ist identisch zu der Sequenz von Konstrukt II, während die Sequenz ”NNNNNNNNNN” durch die bei SEQ ID NR: 30, NR: 31, NR: 32 jeweils beschriebenen Sequenzen ersetzt wurde.
  • Beispiel 2c: Zielstellen, kombiniert aus I-SceI-Erkennungssequenz und scArc-Bindungssequenz
  • In PNAS 96, 811–817(1999) beschrieben Schildbach et al. das Arc-Protein im Kontakt mit dessen zugehöriger Erkennungssequenz. Kombinierte Zielstellen wurden erzeugt, welche aus der Zielstelle von der Nuklease I-SceI und von Arc, mit variierenden Abständen, bestehen. Die Absicht ist es, diejenige zu identifizieren, welche am besten von dem zugeordneten I-SceI-Fusionsprotein erkannt wird. Die resultierenden Plasmide werden VC-SAH132-1, VC-SAH133-8, VC-SAH134-1 und VC-SAH135-1 genannt. Die Sequenzen dieser Plasmide ist identisch zu der Sequenz von Konstrukt III (SEQ ID NR: 33), wobei die Sequenz ”NNNNNNNNNN” durch die Sequenzen ersetzt ist, welche aus verschiedenen Versionen der kombinierten Zielstellen bestehen, die jeweils durch SEQ ID NR: 34, NR: 35, NR: 36, NR: 37 beschrieben sind.
  • Beispiel 3: Cotransformation von DNA-Endonuklease codierenden Konstrukten und Konstrukten, welche Nuklease-Erkennungssequenzen enthalten
  • Zwei Plasmide mit unterschiedlichen Selektionsmarkern und identischen Konzentrationen wurden gemäß der Bescheibung des Herstellers in Chemikalien-kompetente E. coli-Top10-Zellen eintransformiert. Die Zellen wurden auf LB mit den jeweiligen Antibiotika für die Selektion ausplattiert und über Nacht bei 37°C wachsen gelassen.
  • Mit diesem Verfahren wurden Konstrukte, die Expressionskassetten der sequenzspezifischen DNA-Endonuklease enthielten, und zugehörige Konstrukte, welche Nuklease-Erkennungssequenzen/Zielstellen enthielten, in derselben Transformante kombiniert, um ein Überwachen der Nuklease-Aktivität zu erlauben.
  • Beispiel 4: Aufzeigen der Endonuklease-Aktivität in E. coli
  • Cotransformanten, welche die Kombination von zwei Plasmiden tragen, eines, das eine Nuklease oder eine Nuklease-Fusion codiert (Konstrukt I), und das andere, das eine kompatible Zielstelle beherbergt (Konstrukt II), wurden über Nacht in LB mit Ampicillin und Kanamycin wachsen gelassen. Die Kulturen wurden 1:100 verdünnt und wachsen gelassen, bis sie eine OD600 = 0,5 erreichten. Die Expression des Fusionsproteins aus Konstrukt I wurde durch Zusetzen von Arabinose während 3 bis 4 Stunden induziert. Der pBAD-Promotor wird als dosisabhängig beschrieben (Guzman 1995), weshalb die Kultur in verschiedene Aliquots aufgeteilt wurde und die Proteinexpression mit von 0,2% bis 0,0002% variierenden Arabinose-Konzentrationen induziert wurde. 5 μl von jedem Aliquot wurden auf festen LB-Medien, die mit Ampicillin und Kanamycin ergänzt waren, ausplattiert. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert, und das Zellwachstum wurde semiquantitativ analysiert. Aktive Nukleasefusionen schnitten die Konstrukte, welche die Zielstelle beinhalten. Dies führte zum Verlust von Konstrukt II oder Konstrukt III, welche Kanamycin-Resistenz vermitteln. Deshalb beobachtete man die Aktivität des Fusionsproteins vermittels der verlorengegangenen Fähigkeit der Cotransformanten, auf Kanamycinhaltigem Medium zu wachsen.
  • ERGEBNISSE:
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 vereinfacht und zusammengefasst. ++ und + repräsentieren sehr starkes und starkes Wachstum, was keine oder geringe Aktivität der exprimierten Nuklease gegenüber der jeweiligen Zielstelle anzeigt. - und -- repräsentieren vermindertes oder gar kein Wachstum, was eine hohe oder sehr hohe Aktivität der Nuklease gegenüber der jeweiligen Zielstelle anzeigt. Tabelle 9: I-SceI-scTet-Fusionen: E. coli-Wachstumsassay zeigt Endonukleaseaktivität (enzymatische Aktivität) gegenüber den jeweiligen Zielstellen an.
    VC-SAH40-4 VC-SAH54-4 VC-SAH53-10
    VC-SAH7-1 ++ ++ ++
    VC-SAH6-1 -- -- --
    VC-SAH60-5 -- --
    VC-SAH61-1 -- --
    VC-SAH62-1 -- --
  • Beispiel 5: Transformation von Arabidopsis thaliana
  • A. thaliana-Pflanzen wurden in Erde wachsen gelassen, bis sie erblühten. Agrobacterium tumefaciens (Stamm C58C1 [pMP90]), der mit dem interessierenden Konstrukt transformiert war, wurde in 500 ml in flüssigem YEB-Medium (5 g/l Rinder-Extrakt, 1 g/l Hefe-Extrakt (Duchefa), 5 g/l Pepton (Duchefa), 5 g/l Saccharose (Duchefa), 0,49 g/l MgSO4 (Merck)) wachsen gelassen, bis die Kultur eine OD600 0,8–1,0 erreichte. Die Bakterienzellen wurden durch Zentrifugation (15 Minuten, 5000 U/min) geerntet und in 500 ml Infiltrations-Lösung (5% Saccharose, 0,05% SILWET L-77 [vertrieben von ”Lehle Seeds”, Kat.-Nr. VIS-02]) resuspendiert. Blühende Pflanzen wurden 10–20 Sekunden lang in die Agrobacterium-Lösung eingetaucht. Danach wurden die Pflanzen einen Tag lang im Dunklen und dann im Gewächshaus gehalten, bis Samen geerntet werden konnten. Man selektierte transgene Samen durch Ausplattieren von Oberflächensterilisierten Samen auf Wachstumsmedium A (4,4 g/l MS-Salze [Sigma-Aldrich], 0,5 g/l MES [Duchefa]; 8 g/l Pflanzen-Agar [Duchefa]), das mit 50 mg/l Kanamycin, für Pflanzen, die das nptII-Resistenzmarkergen tragen, bzw. mit 10 mg/l Phosphinotricin, für Pflanzen, die das pat-Gen tragen, ergänzt war. Überlebende Pflanzen wurden in Erde überführt und im Gewächshaus wachsen gelassen.
  • Beispiel 6: Konstrukte, welche Sequenzspezifische-DNA-Endonuklease-Expressionskassetten für A. thaliana enthalten
  • Beispiel 6a: Basales Konstrukt
  • In diesem Beispiel präsentieren wir die allgemeine Skizze eines, ”Konstrukt IV” genannten, binären Vektors, der für Pflanzentransformation geeignet ist. Diese allgemeine Skizze des binären Vektors umfasst eine T-DNA mit einer p-Masldel100::cBAR:: t-Ocs1-Kassette, welche die Selektion auf Phosphinotricin ermöglicht, wenn sie in das Pflanzengenom integriert ist. Die SEQ ID NR: 38 zeigt eine Sequenzstrecke von ”NNNNNNNNNN”. Diese soll einen Platzhalter für Gene bedeuten, die verschiedene Versionen der sequenzspezifischen DNA-Endonuklease codieren. Die Sequenz der Letzteren ist in den folgenden Beispielen angegeben.
  • Beispiel 6b: scTet-I-SceI-Fusionskonstrukte
  • Die Sequenzstrecke ”NNNNNNNNNN” von Konstrukt IV wird separat durch Gene ersetzt, welche die verschiedenen Versionen von I-SceI-scTet-Fusionen codieren. Die scTetR codierende Sequenz wurde an I-SceI, mit einem kurzen Linker, wie in Beispiel 1c) beschrieben, fusioniert. Das resultierende Plasmid wird VC-SAH140 genannt. Die Sequenz des Konstrukts ist identisch zu der Sequenz von Konstrukt IV, während die Sequenz ”NNNNNNNNNN” durch die in Beispiel 1 beschriebene Sequenz ersetzt ist.
  • Ein ähnliches Konstrukt wird erzeugt, welches zusätzlich zur Letzteren eine NLS-Sequenz enthält. Das resultierende Plasmid wird VC-SAH139-20 genannt. Die Sequenz des Konstrukts ist identisch zur Sequenz von Konstrukt I, während die Sequenz ”NNNNNNNNNN” durch die in Beispiel 1 beschriebene Sequenz ersetzt ist.
  • Beispiel 6c: scArc-I-SceI-Fusionskonstrukte
  • Die Sequenzstrecke ”NNNNNNNNNN” von Konstrukt IV wurde separat durch Gene ersetzt, welche die verschiedenen Versionen von I-SceI-scArc-Fusionen codieren. Die scArc codierende Sequenz wurde an I-SceI, wie in Beispiel 1d) beschrieben, fusioniert. Das resultierende Plasmid wurde VC-SAH89-10 genannt. Die Sequenz des Konstrukts ist identisch zu der Sequenz von Konstrukt IV, wenngleich die Sequenz ”NNNNNNNNNN” durch die in Beispiel 1d) beschriebene Sequenz ersetzt war. Eine andere Fusion mit einem kürzeren Linker zwischen scArc und I-SceI wird erzeugt, welche immer noch eine NLS beinhaltet. Das resultierende Plasmid wird VC-SAH90 genannt. Die Sequenz des Konstrukts ist identisch zu der Sequenz von Konstrukt IV, während die Sequenz ”NNNNNNNNNN” durch die bei SEQ ID NR: 26 beschriebene Sequenz ersetzt ist.
  • Beispiel 7: Konstrukte, welche Nuklease-Erkennungssequenzen/Zielstellen umfassen, um Nuklease-Aktivität in A. thaliana zu überwachen
  • Beispiel 7a: Basales Konstrukt
  • In diesem Beispiel präsentieren wir die allgemeine Skizze eines binären Vektors, genannt ”Konstrukt V”, der für die Transformation in A. thaliana geeignet ist. Diese allgemeine Skizze des Vektors umfasst eine T-DNA mit einer nos-Promotor::nptII::nos-Terminator-Kassette, welche Kanamycin-Resistenz verleiht, wenn sie in das Pflanzengenom integriert ist.
  • Die T-DNA umfasst auch ein partielles uidA (GUS)-Gen (genannt ”GU”) und ein anderes partielles uidA-Gen (genannt ”US”). Zwischen GU und US ist eine Strecke ”NNNNNNNNNN” in der SEQ ID NR: 39 gezeigt. Diese soll einen Platzhalter für verschiedene Erkennungs/Zielstellen für die diversen Versionen und Proteinfusionen der sequenzspezifischen DNA-Endonukleasen bedeuten. Die Sequenzen der verschiedenen Zielstellen sind in den folgenden Beispielen angegeben.
  • Wenn die Erkennungssequenz durch die betreffende Nuklease geschnitten wird, werden die partiell überlappenden und nicht-funktionstüchtigen Hälften des GUS-Gens (GU und US) als ein Ergebnis von intrachromosomaler homologer Rekombination (ICHR) wiederhergestellt. Dies kann man durch histochemische GUS-Färbung verfolgen (Jefferson 1985).
  • Beispiel 7b: Zielstellen, die aus einer Nuklease-Erkennungssequenz und einer scTet-Bindungssequenz kombiniert sind
  • Kombinierte Zielstellen werden erzeugt, welche aus der Zielstelle von der Nuklease I-SceI und von TetR bestehen. Verschiedene kombinierte Zielstellen mit variierenden Abständen der einzelnen Stellen werden erzeugt. Die Absicht ist es, diejenige zu identifizieren, welche am besten von dem zugeordneten I-SceI-Fusionsprotein erkannt wird. Die resultierenden Plasmide werden VC-SAH113, VC-SAH114, VC-SAH115 genannt. Die Sequenz der Konstrukte ist identisch zu der Sequenz von Konstrukt II, während die Sequenz ”NNNNNNNNNN” durch die bei SEQ ID NR: 40, NR: 41, NR: 42 jeweils beschriebenen Sequenzen ersetzt ist.
  • Beispiel 7c: Zielstellen, die aus einer Nuklease-Erkennungssequenz und einer scArc-Bindungssequenz kombiniert sind
  • Es wurden kombinierte Zielstellen erzeugt, welche aus der Zielstelle von der Nuklease I-SceI und von Arc bestehen. Verschiedene kombinierte Zielstellen mit variierenden Abständen der einzelnen Stellen wurden erzeugt. Die Absicht war es, diejenige zu identifizieren, welche am besten von dem zugeordneten I-SceI-Fusionsprotein erkannt wird. Die resultierenden Plasmide wurden VC-SAH16-4, VC-SAH17-8, VC-SAH18-7, VC-SAH19-15 genannt. Die Sequenz der Konstrukte ist identisch zu der Sequenz von Konstrukt V, während die Sequenz ”NNNNNNNNNN” durch die bei SEQ ID NR: 43, NR: 44, NR: 45, NR: 46 jeweils beschriebenen Sequenzen ersetzt wurde.
  • Beispiel 8: Transformation von sequenzspezifische DNA-Endonuklease codierenden Konstrukten in A. thaliana
  • Die Plasmide VC-SAH87-4, VC-SAH140, VC-SAH139-20, VC-SAH89-10, VC-SAH90 wurden/werden gemäß dem in Beispiel 5 beschriebenen Protokoll in A. thaliana transformiert. Selektierte transgene Linien (T1-Generation) werden im Gewächshaus wachsen gelassen, und einige Blüten werden für Kreuzungen verwendet (siehe unten).
  • Beispiel 9: Transformation von Konstrukten, welche kombinierte Zielstellen enthalten, um Rekombination in A. thaliana zu überwachen
  • Die Plasmide VC-SAH111, VC-SAH112, VC-SAH113, VC-SAH114, VC-SAH115, VC-SAH16-4, VC-SAH17-8, VC-SAH18-7 und VC-SAH19-15 wurden/werden gemäß dem in Beispiel 5 beschriebenen Protokoll in A. thaliana transformiert. Selektierte transgene Linien (T1-Generation) werden im Gewächshaus wachsen gelassen, und einige Blüten werden für Kreuzungen verwendet (siehe Beispiel 10).
  • Beispiel 10: Überwachen der Aktivität der Nuklease-Fusionen in A. thaliana
  • Transgene Linien von Arabidopsis, die eine für eine sequenzspezifische DNA-Endonuklease codierende T-DNA beherbergen, werden mit Linien von Arabidopsis gekreuzt, welche die T-DNA, die ein GU-US-Reporterkonstrukt mit einer entsprechenden kombinierten Zielstelle trägt, beherbergen. Als ein Ergebnis der I-SceI-Aktivität auf die Zielstelle wird ein funktionstüchtiges GUS-Gen durch homologe intrachromosomale Rekombination (ICHR) wiederhergestellt. Dieses kann durch histochemische GUS-Färbung (Jefferson et al. (1987) EMBO J 6: 3901–3907) verfolgt werden.
  • Zur Sichtbarmachung der I-SceI-Aktivität der scTet-Fusionen werden transgene Linien von Arabidopsis, welche die T-DNA der Nuklease-codierenden Konstrukte VC-SAH139-20 und VC-SAH140 enthalten, mit Linien von Arabidopsis gekreuzt, welche die T-DNA der Konstrukte VC-SAH113, VC-SAH114, VC-SAH115 beherbergen, die die Zielstellen enthalten.
  • Zur Sichtbarmachung der I-SceI-Aktivität der scArc-Fusionen werden transgene Linien von Arabidopsis, welche die T-DNA der Nuklease-codierenden Konstrukte VC-SAH89-10, VC-SAH90 beherbergen, mit Linien von A. thaliana gekreuzt, welche die T-DNA der Konstrukte VC-SAH16-4, VC-SAH17-8, VC-SAH18-7, VC-SAH19-15 beherbergen, die die Zielstellen enthalten.
  • F1-Samen der Kreuzungen werden geerntet. Die Samen werden oberflächensterilisiert und auf Medium A, das mit den jeweiligen Antibiotika und/oder Herbiziden ergänzt ist, wachsen gelassen. Blätter werden geerntet und für die histochemische GUS-Färbung verwendet. Der Prozentsatz an Pflanzen, welche eine blaue Färbung zeigen, ist ein Indikator für die Häufigkeit von ICHR und daher für die I-SceI-Aktivität.
  • Die Aktivität der verschiedenen Fusionsproteine wird durch Vergleich der Anzahl von ICHR-Ereignissen dieser Kreuzungen bestimmt. Eine Erhöhung der Spezifität der I-SceI-Fusionen in Bezug auf die native Nuklease wird durch Vergleichen dieser Ergebnisse mit Kontrollkreuzungen festgestellt. Hierfür werden alle transgenen Linien von Arabidopsis, welche die T-DNA von Konstrukten beherbergen, welche die verschiedenen Fusionen von I-SceI codieren, mit Linien von Arabidopsis gekreuzt, welche die T-DNA des Konstrukts beherbergen, das die native I-SceI Zielstelle trägt (VC-SAH743-4).
  • Die nächste Generation dieser Pflanzen wird hinsichtlich vollständig blauer Sämlinge analysiert.
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims (28)

  1. Chimäre Endonuklease, die mindestens eine Endonuklease mit DNA-Doppelstrangbruch induzierender Aktivität und mindestens eine heterologe DNA-Bindungsdomäne umfasst.
  2. Chimäre Endonuklease, wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei mindestens I-SceI, I-CreI, I-CeuI, I-ChuI, I-DmoI, Pi-SceI, I-MsoI oder I-AniI oder eine LAGLIDADG-Endonuklease, die mindestens 45% Aminosäuresequenzidentität zu einem beliebigen von diesen aufweist, vorliegt.
  3. Chimäre Endonuklease, wie in Anspruch 1 oder 2 beansprucht, wobei die LAGLIDADG-Endonuklease mindestens 80% Aminosäuresequenzidentität zu einem Polypeptid aufweist, welches durch SEQ ID NR: 1, 2, 3 oder 159 beschrieben ist.
  4. Chimäre Endonuklease, wie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht, welche eine heterologe DNA-Bindungsdomäne, die aus einem Transkriptionsfaktor oder einer inaktiven Nuklease abgeleitet ist, oder ein eine DNA-Bindungsdomäne eines Transkriptionsfaktors oder einer Nuklease umfassendes Fragment umfasst.
  5. Chimäre Endonuklease, wie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4 beansprucht, wobei mindestens eine heterologe DNA-Bindungsdomäne ein inaktives I-SceI, I-CreI, I-CeuI, I-ChuI, I-DmoI, PI-SceI, I-MsoI oder I-AniI oder ein inaktives Homolog von diesen mit mindestens 45% Aminosäuresequenzidentität zu I-SceI, I-CreI, I-CeuI, I-ChuI, I-DmoI, PI-SceI, I-MsoI oder I-AniI ist.
  6. Chimäre Endonuklease, wie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 5 beansprucht, wobei die chimäre Endonuklease eine gentechnisch konstruierte Endonuklease oder eine optimierte Endonuklease oder eine konstruierte optimierte Endonuklease umfasst.
  7. Chimäre Endonuklease, wie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6 beansprucht, wobei mindestens eine heterologe DNA-Bindungsdomäne ein Transkriptionsfaktor oder eine DNA-Bindungsdomäne eines Transkriptionsfaktors ist, welche(r) eine HTH-Domäne umfasst.
  8. Chimäre Endonuklease, wie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6 beansprucht, wobei mindestens ein Transkriptionsfaktor oder die DNA-Bindungsdomäne eines Transkriptionsfaktors eine HTH-Domäne umfasst, die eine Aminosäuresequenz von mindestens 80% Sequenzidentität zu mindestens einer Aminosäuresequenz umfasst, welche durch SEQ ID N R: 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118 oder 119 beschrieben ist, vorzugsweise durch 91, 92, 93, 94, 95, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118 oder 119 beschrieben ist.
  9. Chimäre Endonuklease, wie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 7 beansprucht, wobei die heterologe DNA-Bindungsdomäne ein Polypeptid umfasst, das mindestens 80% Aminosäuresequenzidentität zu einem durch SEQ ID NR: 6 oder 7 beschriebenen Polypeptid aufweist.
  10. Chimäre Endonuklease, wie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 8 beansprucht, wobei die Endonuklease mit DNA-Doppelstrangbruch induzierender Aktivität und die heterologe DNA-Bindungsdomäne über ein Linkerpolypeptid verbunden sind.
  11. Chimäre Endonuklease, wie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 9 beansprucht, wobei die DNA-Bindungsaktivität der heterologen DNA-Bindungsdomäne induzierbar ist.
  12. Chimäre Endonuklease, wie in beliebigen der Ansprüche 1 bis 19 beansprucht, wobei die DNA-Bindungsaktivität der heterologen DNA-Bindungsdomäne durch mindestens einen Mechanismus induzierbar ist, der gewählt ist aus der Gruppe von a. Bindung eines Induktormoleküls, b. Bindung des zweiten Monomers der DNA-Bindungsdomäne, c. Phosphorylierung oder Dephosphorylierung, d. Erhöhen der Temperatur oder Senken der Temperatur.
  13. Chimäre Endonuklease, wie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 11 beansprucht, wobei die DNA-Doppelstrangbruch induzierende Aktivität der Endonuklease durch Expression des zweiten Monomers einer homo- oder heterodimeren Endonuklease induzierbar ist.
  14. Chimäre Endonuklease, wie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 12 beansprucht, die mindestens eine NLS-Sequenz oder ein oder mehrere SecIII- oder SecIV-Sekretionssignale oder eine Kombination von einer oder mehreren NLS-Sequenzen und einem oder mehreren SecIII- oder SecIV-Sekretionssignalen oder eine Kombination von einem oder mehreren SecIII- und SecIV-Sekretionssignalen mit einer oder mehreren NLS-Sequenzen umfasst.
  15. Isoliertes Polynukleotid, das eine Nukleotidsequenz umfasst, welche für eine chimäre Endonuklease codiert, wie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 13 beansprucht.
  16. Isoliertes Polynukleotid, das eine Nukleotidsequenz, wie in Anspruch 14 beansprucht, umfasst, wobei die Sequenz des isolierten Polynukleotids a. Codon-optimiert ist, b. einen geringen Gehalt an RNA-Instabilitätsmotiven aufweist c. einen geringen Gehalt an Codonrepeats aufweist, d. einen geringen Gehalt an kryptischen Spleißstellen aufweist, e. einen geringen Gehalt an alternativen Startcodons aufweist, f. einen geringen Gehalt an Restriktionsstellen aufweist, g. einen geringen Gehalt an RNA-Sekundärstrukturen aufweist, h. eine beliebige Kombination von a), b), c), d), e), f) oder g) aufweist.
  17. Expressionskassette, die ein isoliertes Polynukleotid, wie in Anspruch 14 oder 15 beansprucht, in funktionaler Kombination mit einem Promotor und einer Terminatorsequenz umfasst.
  18. Isoliertes Polynukleotid, das eine chimäre Erkennungssequenz umfasst, die eine Länge von etwa 15 bis etwa 300 Nukleotiden aufweist und Folgendes umfasst: a. eine Erkennungssequenz einer Endonuklease und b. Erkennungssequenz einer heterologen DNA-Bindungsdomäne.
  19. Isoliertes Polynukleotid, das eine chimäre Erkennungssequenz, wie in Anspruch 17 beansprucht, umfasst, wobei die Erkennungssequenz der Endonuklease eine Erkennungssequenz einer LAGLIDADG-Endonuklease ist.
  20. Isoliertes Polynukleotid, das eine chimäre Erkennungssequenz, wie in einem beliebigen der Ansprüche 18 oder 19 beansprucht, umfasst, welche Folgendes umfasst: a. eine DNA-Erkennungssequenz von I-SceI, b. eine Erkennungssequenz von scTet oder scArc und c. eine Linkersequenz von 0 bis 10 Nukleotiden, welche die DNA-Erkennungssequenz von I-SceI und die Erkennungssequenz von scTet oder scArc verbindet.
  21. Isoliertes Polynukleotid, das eine chimäre Erkennungssequenz, wie in einem beliebigen der Ansprüche 18 bis 20 beansprucht, umfasst, die eine Polynukleotidsequenz, wie durch eine beliebige von SEQ ID NR: 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder 20 beschrieben, umfasst.
  22. Vektor, Wirtszelle oder nicht-menschlicher Organismus, welche(r) Folgendes umfasst: a. ein Polynukleotid, das für eine chimäre Endonuklease, wie in beliebigen der Ansprüche 1 bis 14 beansprucht, codiert, oder b. eine Expressionskassette, wie in Anspruch 16 beansprucht, oder c. eine Expressionskassette, wie in Anspruch 17 beansprucht, oder d. ein isoliertes Polynukleotid, das eine chimäre Erkennungssequenz umfasst, wie in einem beliebigen der Ansprüche 18 bis 21 beansprucht, oder e. eine beliebige Kombination von a), b), c) und d).
  23. Nicht-menschlicher Organismus, wie in Anspruch 21 beansprucht, wobei der nicht-menschliche Organismus eine Pflanze ist.
  24. Verfahren zur Bereitstellung einer chimären Endonuklease, das die folgenden Schritte umfasst: a. Bereitstellen mindestens einer Endonuklease codierenden Region b. Bereitstellen mindestens einer für eine heterologe DNA-Bindungsdomäne codierenden Region, c. Bereitstellen eines Polynukleotids mit einer potentiellen DNA-Erkennungssequenz oder potentiellen DNA-Erkennungssequenzen der Endonuklease oder Endonukleasen von Schritt a) und mit einer potentiellen Erkennungssequenz oder mit potentiellen Erkennungssequenzen der heterologen DNA-Bindungsdomäne oder heterologen DNA-Bindungsdomänen von Schritt b), d. Erzeugen einer translationalen Fusion der codierenden Regionen von allen Endonukleasen von Schritt b) und aller heterologen DNA-Bindungsdomänen von Schritt c), e. Exprimieren einer chimären Endonuklease aus der in Schritt d) erzeugten translationalen Fusion, f. Testen der in Schritt e) exprimierten chimären Endonuklease hinsichtlich der Spaltung des Polynukleotids von Schritt c).
  25. Verfahren für die homologe Rekombination von Polynukleotiden, das Folgendes umfasst: a. Bereitstellen einer Zelle, die für homologe Rekombination kompetent ist, b. Bereitstellen eines Polynukleotids, das ein isoliertes Polynukleotid umfasst, wie in einem beliebigen der Ansprüche 18 bis 21 beansprucht, das von einer Sequenz A und einer Sequenz B flankiert wird, c. Bereitstellen eines Polynukleotids, das Sequenzen A' und B' umfasst, welche ausreichend lang und homolog zu Sequenz A und Sequenz B sind, um die homologe Rekombination in der Zelle zu gestatten, und d. Bereitstellen einer chimären Endonuklease, wie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 14 beansprucht, oder einer Expressionskassette, wie in Anspruch 17 beansprucht, e. Kombinieren der Polynukleotide von b), c) und der chimären Endonuklease von d) in der Zelle, und f. Nachweisen von rekombinierten Polynukleotiden von b) und c), oder Selektieren bezüglich und/oder Wachsenlassen von Zellen, welche rekombinierte Polynukleotide von b) und c) umfassen.
  26. Verfahren für die homologe Rekombination von Polynukleotiden, wie in Anspruch 25 beansprucht, wobei nach homologer Rekombination eine, in der kompetenten Zelle von Schritt a) enthaltene Polynukleotidsequenz aus dem Genom der wachsenden Zellen von Schritt f) deletiert ist.
  27. Verfahren für die gezielte Mutation von Polynukleotiden, das Folgendes umfasst: a. Bereitstellen einer Zelle, die ein Polynukleotid umfasst, das eine chimäre Erkennungsstelle oder eine DNA-Erkennungsstelle umfasst, b. Bereitstellen einer chimären Endonuklease, wie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 14 beansprucht, oder einer Expressionskassette, wie in Anspruch 17 beansprucht, und die in der Lage ist, die chimäre Erkennungsstelle oder die DNA-Erkennungsstelle von Schritt a) zu spalten, c. Kombinieren des Polynukleotids von a) und der chimären Endonuklease von b) in der Zelle, und d. Nachweisen mutierter Polynukleotide oder Selektieren bezüglich oder Wachsenlassen von Zellen, welche mutierte Polynukleotide umfassen.
  28. Verfahren zur homologen Rekombination oder gezielten Mutation, wie in einem beliebigen der Ansprüche 25 bis 27 beansprucht, wobei die chimäre Endonuklease und die chimäre Erkennungsstelle in mindestens einer Zelle mittels Kreuzen von Organismen, mittels Transformation oder mittels Transport, der durch ein an die chimäre Endonuklease fusioniertes SecIII- oder SecIV-Peptid vermittelt wird, kombiniert werden.
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