JP4966006B2 - カスタムメイドメガヌクレアーゼおよびその使用 - Google Patents
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Description
しかしながら、この実験は、新規な特異性を有する1つのエンドヌクレアーゼを導くが、いずれの所望のポリヌクレオチド配列を認識して切断するエンドヌクレアーゼを見出すのに適用できない。
a) 結合能力の選択工程、結合能力のスクリーニング工程、切断活性の選択工程および切断活性のスクリーニング工程;
b) 結合能力の選択工程, 結合能力のスクリーニング工程および切断活性のスクリーニング工程;
c) 結合能力の選択工程、切断活性の選択および切断活性のスクリーニング工程;または
d) 結合能力のスクリーニング工程および切断活性のスクリーニング工程
を含む。
より具体的には、本発明は、カスタムメイドメガヌクレアーゼの、該メガヌクレアーゼの認識・切断部位を含む対象の部位への二本鎖破壊を導入し、それによりDNA組換え事象、好ましくは相同的組換え事象、DNA欠失または細胞死を誘導するための使用に関する。
1) 本発明によるカスタムメイドメガヌクレアーゼの少なくとも1つの認識・切断部位を含むゲノム遺伝子座に二本鎖破壊を導入する工程;
2) 標的された遺伝子座と相同性を共有する(sharing)配列で挟まれる導入される配列を含むターゲティングDNA構築物を提供する工程
を含む。
1) 本発明によるカスタムメイドメガヌクレアーゼの少なくとも1つの認識・切断部位を含むゲノム遺伝子座に二本鎖破壊を導入する工程;
2) 切断部位の周囲の領域と相同性を共有する染色体DNAと、相同的組換えに適切な条件下で保持する工程
を含む。
本明細書において、「メガヌクレアーゼ」により、14〜40 bpのポリヌクレオチド認識部位を有する二本鎖エンドヌクレアーゼを意図する。該メガヌクレアーゼは、モノマー性またはダイマー性のいずれかである。よって、該メガヌクレアーゼは、レアカットエンドヌクレアーゼまたは高レアカットエンドヌクレアーゼ(very rare cutting endonuclease)とも呼ばれる。ホーミングエンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼの1種である。
本発明は、多様性の導入により当初のメガヌクレアーゼに由来する標的DNA配列に特異的なカスタムメイドメガヌクレアーゼを製造する方法に関する。任意に、該当初のメガヌクレアーゼは天然のメガヌクレアーゼである。この方法は、メガヌクレアーゼ変異型のライブラリを製造する工程と、選択および/またはスクリーニングにより標的DNA配列もしくはその一部分に結合できるかおよび/またはそれを切断できる変異型を単離する工程とを含む。
代わりに、各ライブラリからの最もよい要素を一緒にして、標的DNA部位に結合して切断できるメガヌクレアーゼを得る。
指向性の進化は、I-Cre I変異型のライブラリに基づく。これらのI-Cre I変異型は、ポリヌクレオチド標的と相互作用することが予想されるいくつかの位置でアミノ酸の多様性を示す。
メガヌクレアーゼの2つの特性、すなわち標的DNA配列に結合できる能力とそれを切断できる能力は、選択工程および/またはスクリーニング工程に用いることができる。
a) 結合能力の選択工程、結合能力のスクリーニング工程、切断活性の選択および切断活性のスクリーニング工程;
b) 結合能力の選択工程、結合能力のスクリーニング工程および切断活性のスクリーニング工程;
c) 結合能力の選択工程、切断活性の選択および切断活性のスクリーニング工程;
d) 結合能力のスクリーニング工程および切断活性のスクリーニング工程;
e) 切断活性の選択工程およびスクリーニング工程;または
f) 切断活性のスクリーニング工程
を含むかまたはこれらの工程からなる。
よって、二本鎖破壊が導入されなければならないDNA領域を分析して、当初のメガヌクレアーゼの元来の認識・切断部位と少なくとも25%の同一性、好ましくは50%の同一性、より好ましくは75%の同一性を有する少なくとも15ヌクレオチド長、好ましくは18〜40ヌクレオチド、より好ましくは18〜30ヌクレオチドの少なくとも1、2、3または5の配列を選択する。
選択工程および/またはスクリーニング工程により選択された陽性のメガヌクレアーゼ変異型は、インビトロおよび/またはエクスビボの切断アッセイにより確認される。
結合能力に基づくメガヌクレアーゼ変異型の選択およびスクリーニングは、切断活性に影響を及ぼさない条件を用いて行なわれなければならない。例えば、ほとんどのホーミングエンドヌクレアーゼは、それらの切断活性のためにマンガンまたはマグネシウムを必要とする。よって、このタイプのホーミングエンドヌクレアーゼ変異型についての結合アッセイは、マンガンまたはマグネシウムなしで、好ましくはカルシウムにより置換して行なわれる。
結合選択アッセイは、標的DNAポリヌクレオチドに結合できるメガヌクレアーゼの変異型の濃縮に基づく。よって、ライブラリによりエンコードされるメガヌクレアーゼ変異型は、固定化された標的DNAポリヌクレオチドと共に、固定化された標的DNAポリヌクレオチドに結合するメガヌクレアーゼ変異型がいずれの結合能力も示さないものから差異に基づいて分配され得るように、インキュベートされる。固定化された標的DNAポリヌクレオチドと結合するメガヌクレアーゼ変異型は、次いで親和性濃縮と増幅の後続の回のために回収されて増幅される。親和性の濃縮および増幅を数回行った後に、このようにして選択されるライブラリのメンバーを単離することができる。任意に、選択されるメガヌクレアーゼ変異型をエンコードするヌクレオチド配列が決定され、それにより標的DNA配列に結合できるメガヌクレアーゼ変異型を同定する。
スクリーニングアッセイを行うために、選択されたメガヌクレアーゼ変異型をクローニングする必要がある。選択をファージディスプレイシステムを用いて行った場合、各メガヌクレアーゼ変異型をエンコードするクローンを容易に単離することができる。選択をmRNA-タンパク質融合またはリボソームディスプレイにより行なった場合、選択されたメガヌクレアーゼ変異型は発現ベクターにサブクローニングされなければならない。
陽性にスクリーニングされたメガヌクレアーゼ変異型は、その切断能力について試験しなければならない。よって、該メガヌクレアーゼ変異型は、切断の選択および/またはスクリーニング実験、好ましくはインビボ切断スクリーニングアッセイに組み込まれる。任意に、該メガヌクレアーゼ変異型は、インビトロ切断アッセイにより試験できる。
切断能力に基づくメガヌクレアーゼ変異型の選択およびスクリーニングは、切断活性に影響を及ぼさない条件下で行なわれなければならない。切断能力に基づく選択および/またはスクリーニングにおいて用いられるメガヌクレアーゼ変異型は、メガヌクレアーゼ変異型の最初のライブラリまたは結合活性について選択および/またはスクリーニングされたメガヌクレアーゼ変異型のいずれかであり得る。
メガヌクレアーゼ変異型の切断能力に基づくメガヌクレアーゼ変異型のインビボ選択の一般的な原理は、二本鎖破壊が正の選択マーカーの活性化または負の選択マーカーの不活性化に導くことである。
このインビボ試験は、活性なメガヌクレアーゼ変異型により作製される二本鎖破壊により誘発される正の選択マーカーのSSAによる修復に基づく。標的は、標的DNA配列を含む介在配列により分離される内部重複を有する改変された正の選択遺伝子からなる。内部重複は、少なくとも50 bp、好ましくは少なくとも200 bpを含むべきである。SSA試験の効率は、内部重複のサイズにより増加する。介在配列は少なくとも標的DNA配列である。介在配列は、細胞が自発的組換え事象により正の選択マーカーを修復していないことを確かめることを許容する選択マーカーを任意に含み得る。正の選択マーカー遺伝子は、アッセイにおいて用いる細胞に関連する構成性プロモーターに動作可能に連結されるのが好ましい。該アッセイ方法によると、細胞は、活性なメガヌクレアーゼ変異型により導入された二本鎖破壊の後にSSA事象が起こる場合にのみ選択される。
任意に、陽性にスクリーニングされたメガヌクレアーゼ変異型をエンコードするヌクレオチド配列を決定し、それにより標的DNA配列を切断することができるメガヌクレアーゼ変異型を同定する。
スクリーニングアッセイを行うために、選択されたメガヌクレアーゼ変異型をクローニングする必要があり、切断アッセイは各クローンについて個別に行われる必要がある。
スクリーニングについてのインビボ切断アッセイは、選択工程で用いられるものと類似である。これは、負の選択マーカーまたはレポーター遺伝子のいずれかの不活性化あるいは正の選択マーカーまたはレポーター遺伝子のいずれかの活性化に基づくことができる。
レポーター遺伝子により、容易にアッセイされる物質、例えばβ-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、緑蛍光タンパク質、チロシナーゼ、DsRedタンパク質をエンコードするいずれの核酸を意図する。レポーター遺伝子は、アッセイにおいて用いられる細胞に関係する構成性プロモーター(例えばCMVプロモーター)に動作可能に連結されるのが好ましい。
メガヌクレアーゼ変異型による標的DNA配列またはその一部分の認識および切断は、当業者に公知のいずれの方法によりアッセイすることができる。
メガヌクレアーゼ変異型の活性を試験するある方法は、標的DNA配列またはその一部分を含むポリヌクレオチド基質に対するインビトロ切断アッセイを用いることである。該ポリヌクレオチド基質は、
−全体の標的DNA部位;
−半分の標的DNA部位と半分の元来の部位;または
−4分の1の標的DNA部位と4分の3の元来の部位
に対応する合成標的部位であり得る。
本発明は、本発明による方法により製造されるいずれのカスタムメイドメガヌクレアーゼおよびいずれのその使用に関する。任意に、該メガヌクレアーゼは、精製タグを含む。
本発明は、本発明による方法により製造されるカスタムメイドメガヌクレアーゼをエンコードする組換えポリヌクレオチドに関する。
a) 本発明によるカスタムメイドメガヌクレアーゼをエンコードするポリヌクレオチド配列を含むいずれのベクター;
b) 本発明によるカスタムメイドメガヌクレアーゼをエンコードするポリヌクレオチド配列またはa)によるベクターのいずれかを含むいずれの原核または真核細胞;および
c) 本発明によるカスタムメイドメガヌクレアーゼをエンコードするポリヌクレオチド配列またはa)によるベクターまたはb)による細胞を含むいずれのヒト以外の動物あるいは植物
に関する。
カスタムメイドメガヌクレアーゼをエンコードするポリヌクレオチド配列は、当業者に公知のいずれの方法により製造できる。
本発明によるカスタムメイドメガヌクレアーゼは、非常に有用である。もちろん、これらのカスタムメイドメガヌクレアーゼは、分子生物学および遺伝子工学、抗ウイルス療法、ゲノム療法および遺伝子治療、より具体的にはその開示が本明細書に参照として組み込まれるWO 96/14408号、米国特許第5,830,729号、WO 00/46385号、WO 00/46386号に記載された方法にしたがって、重要である。
本発明によるカスタムメイドメガヌクレアーゼは、ベクターの製造のための遺伝子工学において用いることができる。インビトロにおいて、該メガヌクレアーゼは、レアカットエンドヌクレアーゼがベクター構築において必要である場合に有用である。該カスタムメイドメガヌクレアーゼは、インビボベクター構築にも用いることができる。例えば、カスタムメイドメガヌクレアーゼについての認識・切断部位がベクター上に位置する場合、該メガヌクレアーゼは、切断部位の周囲の配列と相同性を示す他のベクターとの相同的組換えを誘導するのに用いることができる。該ベクターはプラスミドまたはウイルスベクターである。同様に、該カスタムメイドメガヌクレアーゼは、レトロウイルス、AAVまたはアデノウイルスの産生のためのトランスコンプレメント(transcomplementing)細胞株においてヘルパーベクター(通常、プラスミド)を欠失させるのに用いることができる。
ウイルスにより伝染される多くの疾患がヒトの苦痛および死亡の原因となっているが、現在、有効な抗ウイルス剤は非常に少ない。つまり、生命を脅かし致命的な疾患を含むこれらの疾患、例えばB型肝炎およびAIDSの治療に役に立つことができる安全で効果的な抗ウイルス剤に対する大きな必要性がある。ヒトの癌の15 %はウイルスを原因とする。この割合は、子宮癌および肝臓癌については80 %まで増加する。今日では、ウイルスはヒトにおける第三番目の発癌因子である。
Chandrasegaran (US第6,265,196号)は、ウイルス疾患の治療におけるハイブリッドエンドヌクレアーゼ(FoK IドメインとジンクフィンガーDNA結合ドメイン)の使用に関する見込みのある例を開示した。しかしながら、このようなハイブリッドエンドヌクレアーゼは、一般に、DNA標的部位内で単一の独特なホスホジエステル結合または塩基対として特異的に作用する能力を欠き(Smithら, 1999, 上記)、これらは高い配列特異性またはいずれの抗ウイルス性の証明も示していない。
−図10は、6つの標的を用いてLib2ライブラリをスクリーニングした後に得られる4つの結合パターンを示す。陽性のものは最初のスクリーニングで同定され、第二のスクリーニングにおいて確認されたが、その間にそれらは標的のそれぞれ(C1234、C1221、C4334、H1234、H1221およびH4334)について8回アッセイされた(8つの立方のバーに対応する)。ヒストグラムは各クラスからの1つのクローンについて示される。標的は図9に示す。
いくつかのLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼは、ホモダイマーとして活性である。各モノマーはそれらのドデカペプチドモチーフを介して主にダイマー化する。単鎖メガヌクレアーゼは、この酵素の2つのサブユニットの間に共有結合を導入するようにして改変された2つのモノマーを共有結合させることによりつくることができる。好ましくは、共有結合は2つのモノマーの間にペプチド結合を創ることにより導入される。しかしながら、他の簡便な共有結合も意図する。単鎖メガヌクレアーゼは、単鎖I-Cre Iおよび単鎖I-Ceu Iのような同じホーミングエンドヌクレアーゼからの2つのサブユニットを含むのが好ましい。単鎖メガヌクレアーゼは多数の利点を有する。例えば、単鎖メガヌクレアーゼはより操作(manipulate)しやすい。単鎖メガヌクレアーゼは、ダイマー構造に比べて例えば標的配列の認識のために熱力学的に好ましい。単鎖メガヌクレアーゼは、オリゴマー化の制御を許容する。
Chlamydomonas reinhardtiiからのI-CreIは、小さいLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼであり、これはより大きいモノマーLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼのものに類似の構造にダイマー化する。I-CreIの単鎖バージョン(scI-CreI)をつくるために、2つのI-CreIコピーを融合させた。このことは2つのドメインの間にリンカー領域を配置することを必要とし、I-CreIタンパク質のかなりの部分がリンカーに先行するドメインの末端で除去されなければならなかった。
タンパク質の発現および精製
Hisタグをつけたタンパク質を、pET-24d (+)ベクター(Novagen)を用いてE. coli BL21 (DE3)細胞で過剰発現させた。IPTG (1mM)を用いて25℃で誘導した。細胞をプロテアーゼ阻害剤(Complete EDTA-フリータブレット、Roche)および5% (v/v)グリセロールを含有する25mM HEPES (pH 8)溶液中で超音波破砕した。細胞溶解物を2回遠心分離した(15 000 g、30分間)。次いでHisタグをつけたタンパク質を、コバルトをのせた5mlのHi-Trapキレーティングカラム(Amersham)を用いて親和性精製した。イミダゾールの直線勾配(0.25Mイミダゾールまで、続いて0.5Mイミダゾールおよび0.5M NaClのプラトー)を用いる溶出の間にいくつかのフラクションを回収した。タンパク質に富むフラクション(SDS-PAGEにより測定)を、10kDaカットオフのセントリプレップAmiconシステムを用いて濃縮した。最後に得られたサンプルをSuperdex75 PG Hi-Load 26-60カラム(Amersham)での排除クロマトグラフィーにより精製した。回収したフラクションをSDS-PAGEに付した。選択したタンパク質フラクションを濃縮して25mM HEPES (pH 7.5)および20% (v/v)グリセロールの溶液に対して透析した。
単一のメガヌクレアーゼDNA標的切断部位を有するpGEMプラスミドを、まずXmnIを用いて直線化した。切断アッセイを37℃または65℃で12.5mM HEPES (pH 8)、2.5% (v/v)グリセロールおよび10mM MgCl2の中で行なった。反応を0.1容量の0.1 M Tris-HCl (pH 7.5)、0.25 M EDTA、5% (w/v) SDSおよび0.5 mg/mlのプロテイナーゼKの添加および37℃で20分間のインキュベーションにより停止した。反応産物を、1%アガロースゲルでの電気泳動による分離の後に調べた。
酵母の形質転換法を、以前のプロトコルから適合させた。染色には、伝統的な定性のX-Galアガロースオーバーレイアッセイ(Agarose Overlay Assay)を用いた。各プレートを、60℃で0.1 M燐酸ナトリウムバッファー、pH 7.0、0.2% SDS、12%ジメチルホルムアミド(DMF)、14 mM β-メルカプトエタノール、0.4% X-Gal中の1%アガロース2.5 mlで被覆した。プレートを37℃でインキュベーションした。
COS細胞を、Superfectトランスフェクション試薬を用いて、供給業者(Qiagen)のプロトコルに従ってトランスフェクションした。トランスフェクションの72時間後、細胞をPBS1Xで2回リンスし、溶解バッファー(Tris-HCl 10mM pH7.5、NaCl 150mM、トリトンX100 0.1 %、BSA 0.1 mg/ml、プロテアーゼ阻害剤)中でインキュベーションした。溶解物を遠心分離し、上清をタンパク質濃度測定およびβ-ガラクトシダーゼ液体アッセイに用いた。典型的に、抽出物30μlを3μlのMg 100Xバッファー(MgCl2 100mM、β-メルカプトエタノール 35%)、33μlのONPG 8 mg/mlおよび234μlのリン酸ナトリウム 0.1M pH7.5と合わせた。37℃でのインキュベーション後、反応を500μlの1M Na2CO3で停止してODを415nmで測定した。相対的なβ-ガラクトシダーゼ活性を、このODの関数として測定し、反応時間およびタンパク質の全量で標準化する。
新規な酵素に対応する合成遺伝子をつくり、scI-CreIタンパク質をE. coliで過剰発現させた。精製scI-CreIのインビトロでDNA基質を切断する能力を、I-CreIホーミング部位のコピーを有する直線化したプラスミドを用いて試験した。親のI-CreIと同様に、新規な酵素はI-CreI標的部位を37℃で切断する。
−I-Cre I変異型のファージディスプレイライブラリの構築
特異性が変化した新規なメガヌクレアーゼを作るために、DNA結合残基を置換するI-Cre Iホーミングエンドヌクレアーゼの突然変異誘発によりコンビナトリアルライブラリを構築した。次いで、選択およびスクリーニングの適用により、特定の選択されたDNA標的に結合し得る変異型を発見することができた。ファーディスプレイについて、I-Cre Iはホモダイマーであるので、2つの別個のI-Cre Iタンパク質をエンコードするファージミドベクターが必要であった。2つのI-Cre Iコピーのうちの1つ(ファージコートタンパク質p3に融合された)のみを突然変異させた。ファージディスプレイフォーマットで得られたタンパク質ライブラリは、I-Cre I野生型/変異体へテロダイマーを含んだ。DNA標的部位内の単一の半分の部位のほとんどの塩基との特異的相互作用可能な8残基(Q26、K28、N30、Y33、Q38、Q44、R68およびR70)を選択した。我々のコンビナトリアルライブラリは、8つの対応するコドンをユニーク縮重VVKコドンで置換することにより得た。結局、タンパク質ライブラリ中の変異体は、8つの残基の位置でVVKコドンによりエンコードされる12アミノ酸(ADEGHKNPQRST)のいずれの独立した組み合わせに対応した。ゆえに、タンパク質ライブラリの最大の(理論的)多様性は、128または4.29×108であった。
まず、R68およびR70により溶媒から遮蔽されている残基D75をN (Asn)に変異させた。これは、ライブラリにおけるこれらの2つの塩基性残基の置換によりもたらされるエネルギーのひずみ(energetic strain)のようなものを除くためである。変異型D75Nのホモダイマー(pET発現ベクターを用いてこれを過剰発現させたE. coli細胞から精製した)は、I-CreIホーミング部位を切断することが示された。次いで、野生型I-CreI (図2Aおよび2B:「天然」または「非相同」)をエンコードするファージミドベクターをつくり、ファージコードタンパク質p3に融合されたD75N変異体(図2C:「鋳型」)およびファージディスプレイ野生型/D75Nヘテロダイマーは、その標的DNAに結合することが示された。
タンパク質の発現および精製
Hisタグをつけたタンパク質を、pET 24d (+)ベクター(Novagen)を用いてE. coli BL21 (DE3)細胞において過剰発現させた。IPTG (l mM)を用いる誘導を15℃で5晩にわたって行なった。細胞を、プロテアーゼ阻害剤(Complete EDTA-フリータブレット、Roche)およびDNase I (80ユニット) / ヌクレアーゼ(それぞれ80および60ユニット、Roche)を含むB-Per溶液(Bacterial Protein Extraction Reagent、Pierce、200mlの培養細胞に5ml)中に1時間、4℃で破砕した。あるいは、細胞を、プロテアーゼ阻害剤(Complete EDTA-フリータブレット、Roche)および5% (v/v)グリセロールを含む25 mM HEPES (pH 8)の溶液中で超音波破砕した。
回収したフラクションをSDS-PAGEに付した。選択したタンパク質フラクションを濃縮して25mM HEPES (pH 7.5)および20% (v/v)グリセロールの溶液に対して透析した。
単一のメガヌクレアーゼDNA標的切断部位を有するpGEMプラスミドを、まずXmnIを用いて直線化した。切断アッセイを37℃で12.5mM HEPES (pH 8)、2.5% (v/v)グリセロールおよび10mM MgCl2の中で行なった。反応を0.1容量の0.1 M Tris-HCl (pH 7.5)、0.25 M EDTA、5% (w/v) SDSおよび0.5 mg/mlのプロテイナーゼKの添加および37℃で20分間のインキュベーションにより停止した。反応産物を、1%アガロースゲルでの電気泳動による分離の後に調べた。
I-Cre I/D75Nヘテロダイマーのファージディスプレイを、プロモーターpLacの調節下で、バイシストロン(bicistron)として2つの異なるORFを有するファージミドを用いることにより得た。最初の1つは、N-末端シグナル配列に融合された可溶性タンパク質を産生し、これが生成物をE. coliのペリプラズム空間に指向させる。遺伝子1-Cre I WTを制限酵素ApaLIおよびAscIを用いてこのORFにクローニングした。D75NドメインをNco IおよびEag I制限酵素を用いて第二のORFにクローニングして、6Hisタグ、C-Mycタグおよびアンバー停止コドンを介するファージコートタンパク質p3との融合体に導く。この最終のファージミドはpCes1CreTとよばれる。TG1またはXL1blueのような抑制株において、およびヘルパーファージ(例えばM13K07)による感染の後に、D75N-p3融合体はファージコートタンパク質に組み込まれ、同じ区画で生成される可溶性I-CreIモノマーは、ダイマー化するかまたはディスプレイされたD75Nドメインと相互作用するかのいずれかにより、I-CreI WT/D75Nヘテロダイマーをディスプレイする粒子を産生する。
100μg/mlのアンピシリンおよび2%グルコースを含む2xTYの5 mLの培養液に、ファージミドpCes1CreTを含む細菌の一晩培養物の1/100希釈物を植菌し、37℃で攪拌した。OD600が0.5のとき、ファージヘルパーM13K07 (Pharmacia)を、20:1のファージ:細菌比で加えた。攪拌せずに37℃で30分経過後、培養物を4000 rpmで10分間遠心分離し、ペレットを100μg/mLのアンピシリンおよび25μg/mLのカナマイシンを含む2xTY 25 mlに再懸濁し、30℃で一晩攪拌した。培養物を遠心分離し、上清をそのままファージELISAに用いた。
マイクロタイタープレートを、PBS中の2μg/mLのビオチン化BSA 100μl/ウェルを用いて37℃で1時間コートした。0.1% Tween20 (PBST)を含むPBS中での数回の洗浄の後、ウェルをPBS中の10μg/mLのストレプトアビジン100μl/ウェルを用いてインキュベートし、RTで1時間インキュベートした。プレートをさらに洗浄して、PBS中に250 pMの標的部位を有するビオチン化PCR断片とインキュベートした。RTで1時間のインキュベーションの後、プレートを、3%粉ミルクおよび25 mM CaCl2を含むPBS (PMC) 200μl/ウェルと飽和させた。PMCを捨て、プレートをPMC 80μlおよびファージ粒子を含む培養上清20μl/ウェルで満たした。RTで1時間のインキュベーションの後、プレートをPBSTで広範に洗浄し、PMC中に1/5000に希釈した抗25 M13-HRPコンジュゲート抗体(Pharmacia) 100μl/ウェルとインキュベートした。プレートをRTで1時間インキュベートし、洗浄し、TMB溶液(Sigma)とインキュベートした。反応を50μl/ウェルの1M H2SO4でブロックした。プレートを450 nmで読み取った。バックグラウンド(無関係な標的)の3倍より高いシグナルを陽性とみなすことができる。
遺伝子I-CreI D75Nを含むプラスミドpET24-T45を、PCRの鋳型として用いるために、1 ng/μlで希釈した。所望のランダム化(randomization)をエンコードする縮重オリゴヌクレオチドを用いて、挿入断片当たり4×50μlのPCR反応においてPCR断片Lib1およびLib2を増幅した。PCR産物をプールし、EtOH沈殿させ、50μlの10 mM Tris中に再懸濁した。
全ての酵素および対応するバッファーはNEBiolabsからであった。10μgまでのDNAの消化を、100 Uまでの第一の制限酵素を用いて、37℃で150〜500μlの最終反応容積で行った。2〜6時間後に、消化したDNAをフェノール抽出してEtOH沈殿させた。消化基質および産物を、アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、所望の産物をゲルから抽出して精製した(Nucleospin Extract、Macherey-Nagel)。PCR挿入断片については、消化産物をNucleospinカラムで直接精製した。次いで、第二の消化を同じ条件で行なった。この第二の消化反応の最後に、0.1容量の1OX CAPバッファーおよび0.5μlのCAPを消化したベクターに加え、サンプルをさらに30分間、37℃でインキュベートした(アルカリホスファターゼを、EDTAの添加後にサンプルを70℃で10分間インキュベートすることにより不活性化した)。最後に、消化して脱リン酸化したDNAをフェノール抽出し、EtOH沈殿させて10 mM Tris pH8 30μl中に再懸濁した。最終のDNA濃度を、電気泳動の後のアガロースゲルでのバンドの強度の比較により見積もった。
大規模ライゲーションを16℃で、200μl反応容積中で、消化したベクター1400 ngおよび5:1モル超過の消化したものならびに4000 UのT4 DNAリガーゼ(NEBiolabs)を用いて行なった。ライゲーションの後、反応サンプルを65℃で20分間インキュベートしてリガーゼを不活性化した。ベクターDNAは、最後にEtOH沈殿させ、25 ng/μlの10 mM Tris pH8中に再懸濁した。
自家製のエレクトロコンポーネント細胞TG1 40μlを、2 mmのキュベット中にライゲーションしたDNA (1μl) 25 ngと混合した。氷上で1分経過後、細胞をパルス(2.5 Kv、25μF、200オーム)し、2xTY + 2% グルコース1 mlに直ちに再懸濁した。細胞を37℃で1時間、攪拌下におき、次いでアンピシリン(ファージミドベクター)またはカナマイシン(pETベクター)および2%グルコースを含む2xTYの大きいプレートにおいて、30℃で一晩インキュベートした。一定量を2xTY中に希釈し、2xTYアンピシリングルコースの小さいプレートにおいて、単離されたコロニーを得たが、このコロニーはライブラリの多様性の算出および制限分析によるいくつかのクローンの特徴づけを可能にする。
このプロジェクトの目的は、HIV2のゲノムで見出された配列(GGAAGAAGCCTTAAGACATTTTGA)を切断可能なメガヌクレアーゼを得ることであった。ホーミングエンドヌクレアーゼI-Cre Iを骨格(scaffold)として用いて、1つのI-Cre IモノマーのDNA結合界面に位置する8残基のランダム化による108の変異型のライブラリを構築した(前の節を参照)。このライブラリを、HIV2に由来する標的(H1V6335)を有するビオチン化DNA断片を用いる数回の選択/増幅により結合物について濃縮した。続いて、選択された標的をファージELISAを用いて結合についてスクリーニングした。
ファージミドフォーマット
pCeslベースのファージミド(pCLS346)を選択した。このプラスミドは、プロモーターpLacの調節下で、バイシストロンとして2つの異なるORFを有した。最初の1つは、N-末端シグナル配列に融合された可溶性タンパク質を産生し、これが生成物をE. coliのペリプラズム空間に指向させる。我々の場合、この第一の産物がI-CreIの野生型モノマーであった。第二のORFは、6Hisタグ、C-Mycタグおよびアンバー停止コドンを介してファージコートタンパク質p3と融合したI-CreIモノマーをエンコードした。TG1またはXL1blueのような抑制株において、およびヘルパーファージ(例えばM13K07)による感染の後に、このファージミドを有する細菌はファージ粒子を産生し、それらの約1〜10%はそれらの表面上で組換えタンパク質をディスプレイする。
所望の配列をエンコードするが3'に余分のアデノシンを有する2つの相補的プライマーをアニールして、pGEM-t Easy (Promega)にライゲーションした。配列決定の後、正しいクローンを、ビオチン化200 pb断片をキットKOD (Novagen)ならびにプライマーSP6 (TTTAGGTGACACTATAGAATAC)およびbiotT7 (biot-TAATACGACTCACTATAGG)を用いてPCR増幅するための鋳型として選択した。PCR産物の濃度をゲル上で見積もり、断片をそのままELISAまたは選択手順において用いた。
ライブラリの標本の一定量(ライブラリのサイズより少なくとも10倍より多い細菌)を用いて、100μg/mlのアンピシリンおよび2%グルコースを含む2xTY (2TYAG) 50 mlに植菌し、培養物を37℃で攪拌した。0.5のOD600で、この培養物5 mlにヘルパーファージK07を20:1のファージ:細菌の比で感染させ、攪拌せずに37℃で30分間インキュベートした。室温(RT)にて4000 rpmで10分間遠心分離した後、ペレットを100μg/mlのアンピシリンおよび25μg/mlのカナマイシンを含む2xTY (2TYAK) 25 mlに再懸濁して、30℃で一晩攪拌した。培養物を4℃にて4000 rpmで20分間遠心分離し、ファージ粒子を、0.2容量の20% PEG6000 /2.5M NaClを氷上で1時間添加することにより沈殿させた。
ファージ粒子を、3%乾燥ミルクおよび25 mM CaClを含むPBS (PMC) 1 ml中に希釈し、RTで1時間インキュベートした。100 pIストレプトアビジンビーズ(Dynal、第1回目について200μl)をPMC中に3回洗浄し、同じバッファー中に1時間ブロックした。ビオチン化された標的を、示された濃度でファージに添加し、混合物をRTで1時間攪拌した。ビーズを混合物に添加し、RTで15分間インキュベートした。ビーズをバイアルの壁上で磁石を用いて回収し、0.1%Tweenを含むPMC中で10回洗浄した。PBS中での最後の洗浄の後、ビーズを100 mMのトリエタノールアミン pH 12 0.5 ml中に再懸濁し、ちょうど10分間インキュベートした。上清を回収し、1 M Tris pH8 0.5 mlで直ちに中和した。この溶出物の一定量を、タイトレーションのために2xTY 4 mlで段階的に希釈した。指数関数的に増殖するTG1細胞5 mlを加え、混合物を攪拌せずに37℃で30分間インキュベーションした。細胞を2TYAGの大きいプレート上におき、30℃で一晩インキュベーションした。コロニーを2TYAG中に再懸濁し、OD600を100に調整し、15 %グリセロールの添加後に−80℃で保存した。
選択アウトプットからの単離されたコロニーを楊枝でついて96ウェルプレート中の2TYAG 100μlに入れ、37℃で一晩攪拌した。次の日、2TYAG 100μlを含む新しいプレートをトランスファー装置を用いて分離した。滅菌60%グリセロール50μlを一晩インキュベートしたプレートに加え、このマスタープレートを−80℃で保存した。新しいプレートを37℃で2.5時間攪拌し、2×109 pfuのヘルパーファージM13K07を含む2TYAGの添加によりレスキューし、30℃で30分間インキュベーションし、1700 rpmで15分間スピンした。細胞のペレットを2TYAK 150μl中に再懸濁し、30℃で一晩攪拌した。遠心分離後、上清20μlを前の節で記載したようにして用いた。
選択
I-Cre I変異型をディスプレイするファージ粒子を、ファージミドライブラリを有する細菌をヘルパーファージM13KO7で感染させることにより産生した。ファージ粒子をPEG沈殿により精製し、HIV6335標的を有するビオチン化PCR断片とインキュベーションした。室温で1時間のインキュベーションの後、ストレプトアビジンでコートした磁気ビーズを溶液に添加して、ビオチン化DNAおよび結合したファージを回収した。ビーズを充分に洗浄し、結合したファージをpHショックにより溶出させた。細菌を溶出させたファージで感染させ、アンピシリンおよび2%グルコースを含む2xTYの大きいプレート上においた。溶出させたファージの一定量の段階希釈を用いて細菌に感染させ、ファージ粒子の数を算出して単離されたコロニーを得た。
選択の強度(stringency)は、各回の後に増加させた。第一の選択を、ビオチン化標的10 nMを用いて行なった。第二を400 pMを用いて行ない、洗浄工程を延長した。第三回目は250 pMを用い、洗浄をより延長した。
各アウトプットから無作為に採取した80のクローン(および選択されなかったクローン)を用いて、モノクローナルの様式でI-CreI変異型をディスプレイするファージ粒子を生成した。ファージ粒子を含む上清を、ストレプトアビジンを介してプラスチック上に固定化されたビオチン化PCR断片上でインキュベートした。結合したファージを、HRP標識抗p8 (主要なコートタンパク質)モノクローナル抗体(Pharmacia)を用いて染色した。表2に示すように、選択されなかったクローンの中からまたは選択の第1回目のアウトプットから結合物は検出されなかった。しかしながら、第2回目の後に採取されたクローンの60%は、H6335に対して陽性であるが、無関係な標的(P1234、ホーミングエンドヌクレアーゼPI-Scelの標的)に対しては陰性である。この結果は、アウトプット力価とよく一致している。実際に、この選択は温和な濃縮をもたらすだけであり、このことはクローンの多数がまだバックグラウンドから生じることを示唆する。予期されたように、選択の第3回目は強い結合物の99%を導き、このことはこの第3の選択の後のアウトプットファージが多数であることを説明する。
材料および方法
細菌株および酵母株
全てのサブクローニングおよびプラスミド調製は、Stratageneにより提供されるXLI-blue :E.coliで標準の手順に従って行う。S. cerevisiaeでの実験は、次の株を用いて行う:
- FYC2-6A:アルファ, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ 200
- FYBL2-7B:a, ura3Δ 851, trp1Δ63, leu2Δ1, lys2Δ202
- YASP3 (FYC2-6A由来):アルファ, ura3::SSA-ura3-HIV2-KanR, ade2::SSA-ade2-HIV2-TRP1, trp1Δ63, leu2Δ, his3Δ 200
- pCLS0279:ADH1プロモーター、TRP1選択マーカーおよびARS-CEN複製起点、β-ガラクトシダーゼSSA標的、HIV2 6335切断部位。
- pCLS0569:カナマイシン耐性カセット、HIV2 6335、URA3遺伝子の内部断片。
- pCLS0570:カナマイシン耐性カセット、HIV2 6335、LYS2遺伝子の内部断片。
- pCLS0576:TRP1選択マーカー、HIV2 6335、ADE2遺伝子の内部断片。
- pCLS0047:ガラクトース誘導プロモーター、LEU2選択マーカーおよび2ミクロン複製起点。
特定の標的に対する検出可能な活性を有する突然変異誘発したI-CreIタンパク質変異型のスクリーニングを許容する、酵母でのインビボアッセイを行った。
変異I-CreIメガヌクレアーゼのライブラリを、まずファージディスプレイ法により選択し、HIV2 6335標的に結合し得る対象の変異型について濃縮されたサブライブラリを得る。この濃縮されたサブライブラリからの挿入断片を、酵母でのさらなる選択のためにガラクトース誘導プロモーターの調節の下のpCLS0047にサブクローニングする。しかしながら、我々は適切な酵母発現ベクターにおいて直接ライブラリを製造し、ファージディスプレイの工程を除くことができる。
すなわち、URA3 SSA標的およびADE2 SSA標的を導入した。URA3 SSA標的は、4.3 kbにより分けられた600塩基対の2つの直列反復を有する改変されたura3遺伝子(カナマイシン耐性カセットおよびHIV2 6335切断部位を含む)であった。この株は、ウラシルを欠く最少培地では増殖できないが、G418耐性であった。この標的が適切に切断されて組み換えられたとき、酵母はウラシルを含まない培地で増殖でき、G418感受性であった。
−実験手順
細胞
American Type Culture Collection (ATCC)からのCOS-7細胞株を、10%ウシ胎児血清を含むDMEMで培養した。ATCCからのPC-12細胞は、10%熱失活ウマ血清および5%熱失活ウシ胎児血清を補ったRPMI1640で増殖した。PC-12細胞を、以前に記載された(Suら, 1999, Journal of Virology, 4171〜4180)ようにして分化させた。簡単に、細胞を6ウェルプレートにウェル当たり5 104細胞で播種した。次の日、細胞を100 ng/ml の2,5S NGF (Invitrogen)を含むPC-12培地でインキュベートした。培地は3日毎に変えた。インキュベーションの7日後、未分化細胞を2μMのフルオロデオキシウリジン(FdUrd)の添加により除去した。
HSV-1はATCCから購入した。ウイルスを低MOI (0.01PFU/細胞)でCOS-7細胞で増殖させた。組換えウイルス(rHSV-1)を、以前に記載された(Lachmann, R.H., Efstathiou, S., 1997, Journal of Virology, 3197〜3207)ようにして得た。4.6 KbのpstI-bamHIウイルスゲノムDNA断片をpUC 19にクローニングした。データベースからのHSV-1配列(ID:NC 001806)に基づくと、この領域はヌクレオチド118867〜123460を表す。Lac遺伝子の発現を駆動するCMVプロモーターからなるカセットを168 bpのHpaI欠失に導入した。この領域は、HSV-1の主要LAT遺伝子座の中に位置する。I-Sce I切断部位を、最終的に、CMVプロモーターのすぐ後にクローニングした。この構築物を組換えウイルスを作製するのに用いた。プラスミドはXmnI消化により直線化し、このプラスミドDNA 2μgを、COS-7感染細胞からCaCl2法により調製したHSV-1ゲノムDNA 15μgと共トランスフェクションさせた。3または4日後、感染した細胞を回収して超音波破砕した。溶解した細胞の一定量を用いてCOS単層を感染させた。ウイルス組換え体を、COS単層に300μg/mlのX-Gal (5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド)を含む培地中の1%アガロースをオーバーレイすることにより選択した。青いクローンを採取し、3回のプラーク精製にさらに付した。I-Sce I部位の存在をPCRおよびインビトロI Sce-I酵素消化により確認した。
6ウェルプレートにウェル当たり2.104細胞を播種した。次の日、COS-7細胞をISce-Iを発現するかまたはISce-I ORFを逆方向に含むプラスミド0.5μgを用いて製造業者のプロトコルに従うEFFECTENE法によりトランスフェクションした。この方法を用いて、我々の実験室では、通常、60〜70%の効率を達成した。48時間後、亜集密な(subconfluent)トランスフェクションされた細胞をrHSV-1を用いて感染させた。感染には、rHSV-1を1%ウシ胎児血清を含むPBSで希釈し、5% CO2の湿性インキュベーター中に37℃で20〜40分間細胞に吸着させた。それぞれウイルス阻害実験または細胞生存実験のために、6ウェルのプレートにウェル当たり30〜300 PFUで感染させた。細胞を第1、2および3日に回収し、β-ガラクトシダーゼ活性を分析してDNAを抽出した。
細胞単層を、1mM MgCl2を含む100mM PBS中の0.5%グルタルアルデヒド中に4℃で10分間固定した。洗剤溶液(100mM PBS、1mM MgCl2、0,02% Nonidet p-40)で1回洗浄後、細胞を37℃でX-Gal染色溶液(10 mM PBS、1mM MgCl2、150 mM NaCl、33 mM K4Fe(CN)6.3H2O、33 mM K3Fe(CN)6、0.1% X-Gal)中で発色するまでインキュベートした。β-ガラクトシダーゼ活性を細胞抽出液についても基質としてo-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド(ONPG)を用いて測定した。細胞単層をPBSで1回洗浄した。次いで、細胞を10 mM Tris pH 7.5、150 mM NaCl、1% Triton X-100、プロテアーゼ阻害剤を用いて溶解した。氷上で30分間のインキュベーションの後、細胞溶解物を遠心分離してβ-ガラクトシダーゼをアッセイした。典型的には、上清30μlを800μg /ml ONPG含有反応バッファー(10 mM PBS;pH 7.5、1 mM MgCl2、0.3% β-メルカプトエタノール) 270μlと合わせた。反応を37℃で行い、1M NaCO3 0.5 mlで停止した。吸光度を415 nmで測定した。β-ガラクトシダーゼ活性は、タンパク質濃度およびインキュベーション時間について標準化した相対単位として算出する。
rHSV-1のウイルス複製を測定するために、オリゴヌクレオチドを設計してLac遺伝子から217 bpの断片を増幅した。このアッセイにおいて用いた標準DNAは、この断片をBluescriptプラスミドにクローニングし、5'オリゴヌクレオチドの下流に50 bpの断片を挿入することにより作製した。標準物(the standard)のPCRにより267 bpのアンプリコンを産生した。一連のPCR (示さず)を行なって標準およびDNAサンプルの量ならびにサイクル数を固定して増幅の直線的な応答を達成した。基本的な半定量的PCRを、全容量30μl中に、各プライマー20 pmolおよびDNA 180 pgとともにREADYMIX(商標) TAQ (Sigma)を用いて行なった。チューブを94℃で4分間加熱し、22サイクル:94℃で1分、62℃で50秒、72℃で2分および72℃で7分に付した。
ある一連の実験において、培養液を第1、2、3および4日の毎日回収し、新しい培地を加えた。別の実験において、実験の間に培地を交換せず、一定量を毎日回収した。HSV-1の子孫の放出を監視するために、培地の一定量を標準プラークアッセイによりCOS-7細胞に対して力価測定した。
ウイルス複製に対するI-Sce Iの影響を、I-Sce I制限部位を有する組換え単純ヘルペスウイルス(rHSV-1)を用いて調べた。簡単に、rHSV-1を、Lac遺伝子を駆動するCMVプロモーターを含むカセットを用いて構築した。I-Sce I部位をCMVプロモーターとLac遺伝子との接合部に挿入した。発現カセットを、主要LAT遺伝子座における相同的組換えによりクローニングしたが、該遺伝子座はCOS-7細胞単層における溶菌感染の間にβ-ガラクトシダーゼ (β-gal)の発現を許容した。ウイルス感染前のI-Sce I発現ベクターのストリンキング(strinkingly)トランスフェクションは、X-Galの呈色により示されるようにCOS細胞でのHSV-1プラーク形成を実質的に完全に阻害した(図5)。これに対して、いずれの機能的転写も許容しない、I-Sce Iオープンリーディングフレームを逆方向に含む発現ベクターを用いたコントロールトランスフェクションは、ウイルス複製に影響しなかった。さらに、感染の48時間後、細胞をI-Sce I発現について調べた。I-Sce I発現ベクターでトランスフェクションされた細胞単層において形成された全ての溶菌プラークは、I-Sce Iを発現しなかった細胞を表した (一過性のトランスフェクションは約70%の効率である)。しかしながら、溶菌プラークの周囲のI-Sce Iを発現する細胞は、ウイルスの増殖を阻害した。I-Sce Iの影響は、細胞溶解物中のβ-ガラクトシダーゼ活性を測定することにより確認された。ウェル当たり30 Pfuを用いるI-Sce Iを一過的に発現するCOS-7細胞単層の感染の後、細胞単層を感染後第1、2および3日に回収してβ-galをアッセイした。図6Aは、rHSV-1複製の阻害を反映して、β-ガラクトシダーゼ活性の大きな低下を示す。rHSV-1感染の時間経過の間にわたるI-Sce Iの防御効果を、次に評価した。感染の3日後、I-Sce I発現ベクターでトランスフェクションされた細胞は細胞変性効果の徴候を示さなかったが、コントロールの培養物は、図6Bに示すように完全に溶解した。I-Sce IによるウイルスDNA複製の阻害の程度を定量するために、半定量的PCRを設定した。ゲノムDNAを、感染後第1、2および3日に細胞から抽出した。PCRを、Lac遺伝子で217 bpのアンプリコンを発生するプライマーaおよびbを用いて行なった(図7A)。内部標準をPCRの前にサンプルに添加してDNAを定量した。Lac遺伝子は、感染の3日後のI-Sce Iを発現する細胞において、実質的に検出できなかった(図7A)。これに対して、I-Sce I発現ベクターを受容していない細胞は、高いレベルのウイルスDNAを示した。この結果は、ウイルスの内因性遺伝子内のプライマーを用いるPCRにより確認された(図7B)。チミジンキナーゼ(TK)遺伝子の増幅は、I-Sce Iがウイルスの複製を阻害したことを示した。最後に、活性I-Sce Iまたは逆方向にI-Sce I ORFを発現するCOS-7細胞にrHSV-1を感染させ、異なる時間点で培地中に放出されたウイルスの濃度を、プラークアッセイにより測定した(図8)。ウイルスをI-Sce Iが産生された第1日に大ざっぱな配列(rough array)で定量した。ウイルス産生は、I-Sce Iを発現しなかった細胞と比較したときに、感染の2日後でさえかなり減少しており、このことはI-Sce Iがウイルス複製をかなり効率的に阻害したことを示した。この影響は、より少ない程度ではあるが、第3日にも確認された。おそらくウイルス複製の間に高い割合で起こる突然変異が、I-Sce I活性から逃れることができる変異HSV-1の出現を許容した。
この実験の目的は、I-CreIの天然の標的部位の近くの標的部位に結合する新規なメガヌクレアーゼを得ることであった。野生型で天然のI-CreI標的(C1234と呼ぶ)、実施例2で記載したHIV2標的(ここではH1234と呼ぶ)およびさらなる4つの標的を含む一連の6つの標的を用いた(図9)。これらのさらなる4つの標的は、12 bpの半分のI-CreIまたはHIV2標的部位の逆方向反復に対応する24 bpのパリンドロームである。C1221およびC4334は、それぞれC1234標的の第一の半分および第二の半分の逆方向反復である。H1221およびH4334は、それぞれH1234標的の第一の半分および第二の半分の逆方向反復である。
I-CreI変異型のファージディスプレイされたライブラリの構築
まず、R68およびR70により溶媒から遮蔽される残基D75を、ライブラリ中のこれらの2つの塩基性残基の置換によりもたらされるエネルギーのひずみのようなものを除くために、N (Asn)に変異させた。突然変異型D75Nのホモダイマー (pET発現ベクターを用いてそれを過剰発現させたE. coli細胞から精製)は、I-CreIホーミング部位を切断することが示された。次いで、ファージコートタンパク質p3に融合したD75N突然変異型(図2C:「鋳型」)をエンコードするファージミドベクターを作製し、ファージディスプレイされたD75Nモノマーは、I-CreI天然DNA標的に結合することを示した(図9のC1234)。
スクリーニングは、実施例2に記載のようにしてファージELISAにより行なった。
−結果
4560クローン(理論上の変異体ライブラリ多様性の2.5倍を越える)を個別に採取し、6つの異なる標的を用いてファージELISAによりスクリーニングした。28の陽性(6つの標的のうち1つに結合するクローン)を同定した。確認のために、これらの28のクローンを6つの異なる標的を用いて8回並行してファージELISAにより再アッセイした。これにより、20のクローンが真の陽性であると確認された。最後に、28全てのクローンを配列決定した。
ここでの目的は、酵母でのスクリーニング法と選択法の比較である。スクリーニングはその所望の特性(我々にとっては切断特性)についての個体群の各個別のクローンの広範囲の検査であるが、選択は、濃縮工程である。当初のライブラリを選択プロセスに付し、所望の特性を有するクローンについて濃縮されたサブライブラリをもたらす。
−材料および方法
細菌株および酵母株
全てのサブクローニングおよびプラスミド調製は、Stratageneにより提供されるXLI-blue :E.coliで標準の手順に従って行う。
S. cerevisiaeでの実験は、次の株を用いて行う(ここで、cutI-CreIはI-CreIについての切断部位を表す):
- FYC2-6A:アルファ, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200
- FYBL2-7B:a, ura3Δ851, trp1Δ63, leu2Δ1, lys2Δ202
- YAP4およびYDD6 (FYC2-6A由来):アルファ, lys2::SSA-ura3-cutI-CreI-KanR, ade2::SSA-ade2-cutI-CreI-TRP1, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200
- pCLS050:ADH1プロモーター、TRP1選択マーカーおよびARS-CEN複製起点、β-ガラクトシダーゼ SSA標的、I-CreI切断部位。
- pCLS0047:ガラクトース誘導プロモーター、LEU2選択マーカーおよび2ミクロン複製起点。
変異I-CreIメガヌクレアーゼのライブラリ、すなわちLib2 (実施例4を参照)を酵母ベクター(pCLS0047)中に導入した。
染色体に組み込まれた2つのレポーター系を有する2つの特異的酵母株(YAP4およびYDD6)を調製した。これらの2つのレポーター系は、単鎖アニーリング(SSA)による組換えに基づく。SSAは、I-CreI部位の特異的切断により誘導される。
すなわち、LYS2 SSA標的およびADE2 SSA標的を導入した。LYS2 SSA標的は、4.3kbにより分けられた3240 bp塩基対の2つの直列反復を有する改変されたlys2遺伝子(カナマイシン耐性カセットおよびI-CreI切断部位を含む)であった。この株は、リジンを欠く最少培地上では増殖できなかったが、G418耐性であった。この標的がI-CreIの過剰発現の際に切断されて適切に組み換えられたとき、酵母はリジンを欠く培地上で増殖できず、G418感受性であった。
ライブラリを用いた株の形質転換は、106を超える独立した酵母形質転換体を、ロイシンを含まず(メガヌクレアーゼ発現ベクターの選択)かつ炭素源としてグルコースを含み少量のアデニンを含む選択培地上で与える。このようなクローンは、SSA β-ガラクトシダーゼ標的を含む酵母菌株(pCLS050で形質転換したFYBL2-7B)と掛け合わせた後にスクリーニングすることができる。2倍体を選択し、誘導されたβ-ガラクトシダーゼ活性についてアッセイした。2400の独立したクローンのスクリーニングは、15の陽性の同定をもたらした。これらのクローンからDNAを回収し、メガヌクレアーゼ発現プラスミドの回収のためにE. coliにエレクトロポレーションした。これらの15の陽性のそれぞれについて、2つのE. coliクローンを増幅して配列決定した。同じ陽性の酵母クローンから得られた2つのE. coliクローンの間に配列の違いは見られなかった。次いで、プラスミドを酵母YAP4またはYDD6株に再形質転換し、再びスクリーニングを行なった。このことにより、15の異なる酵母クローンについての一次スクリーニングの結果を確認した。
この実験の目的は、活性および不活性なメガヌクレアーゼが、インビトロおよび哺乳動物細胞での単純なスクリーニングアッセイにおいて区別され得ることを証明することである。インビトロアッセイは制限アッセイに類似であり、哺乳動物細胞でのアッセイは切断誘導組換えに基づく。哺乳動物細胞における切断は、酵母におけるアッセイに類似である(実施例2)。切断誘導組換え(およびより精密には単鎖アニーリング)は、機能的LacZレポーター遺伝子をもたらし、これは標準的な方法によりモニターすることができる。しかしながら、安定な複製プラスミドに依拠する酵母アッセイに比較して、細胞ベースのアッセイは一過性のマトリックスと働く。
2000のクローンを別個に採取し、2つのスクリーニング法を用いて試験してこれらの方法の比較を確立した。次いで陽性を配列決定して分析した。
インビトロ発現のためのI-CreIのライブラリの構築
まず、R68およびR70により溶媒から遮蔽されている残基D75をN (Asn)に変異させた。これは、ライブラリにおけるこれらの2つの塩基性残基の置換によりもたらされるエネルギーのひずみのようなものを除くためである。変異体D75Nのホモダイマーは、I-CreIホーミング部位を切断することが示された。ライブラリは、pTriexベクター(Novagen)中で構築した。
2μl中の50 ngのDNAプラスミド溶液を4μlのRTS溶液(Rapid Translation System RTS 100, E. coli HYキット、Roche)と混合した。タンパク質の産生をインビトロで30℃において少なくとも4時間行なった。タンパク質の産生の後、メガヌクレアーゼ活性を試験する前に新鮮な調製物を蒸留水で希釈した。
単一のメガヌクレアーゼDNA標的切断部位を有するpGEMTプラスミドを、まずXmnIで直線化した。切断アッセイを37℃で12.5 mM HEPES (pH 8)、2.5% (v/v)グリセロールおよび10 mM MgCl2中に行なった。反応を、1時間後に0.1容量の0.1 M Tris-HCl (pH 7.5)、0.25 M EDTA、5% (w/v) SDSおよび0.5 mg/ml プロテイナーゼKの添加および37℃で20分間のインキュベーションにより停止した。反応産物を1%アガロースゲルでの電気泳動による分離に続いて調べた。
CHO細胞を、pTriExプラスミドとレポータープラスミドとを発現するメガヌクレアーゼで共トランスフェクションした。レポータープラスミドは、適切なプロモーターの調節下に不活性なLacZ遺伝子を含む。LacZが不活性なのは、これが220 bpの内部重複および2つの220 bpの反復の間に位置する標的部位の挿入断片(24〜80 pb)を有するからである。トランスフェクションのために、Polyfectトランスフェクション試薬を供給業者(Qiagen)のプロトコルに従って用いた。トランスフェクションの72時間後、組織培養培地を除き、細胞を溶解バッファー(Tris-HCl 10 mM pH7.5、NaCl 150 mM、Triton X100 0.1%、BSA 0.1 mg/ml、プロテアーゼ阻害剤)中にインキュベートした。全溶解物を、0.1容量のMg 100Xバッファー(MgCl2 100 mM、β-メルカプトエタノール 35%)、1.1容量のONPG 8 mg/mlおよび7.8容量のリン酸ナトリウム0.1 M pH7.5と合わせた。37℃でのインキュベーションの後、反応を0.5容量の1 M Na2CO3 を用いて停止し、ODを415nmで測定した。相対的β-ガラクトシダーゼ活性を、このODの関数として測定した。陽性のクローンを、細胞に空の発現ベクターを感染させたネガティブコントロールとの比較により選択した。それらのβ-ガラクトシダーゼ活性は、(M + 2 E)より高い (ここで、Mはネガティブコントロールのβ-ガラクトシダーゼ活性の平均であり、Eはこれらの同じ測定の間の標準偏差である)。
2000のクローン(理論的変異型ライブラリ多様性よりも多い)を別個に採取し、96ディープウェルプレートで培養した。プラスミドDNAをBioRobot8000プラットフォーム(Qiagen)をQiaprep 96 Turbo BioRobotキット(Qiagen)とともに用いて抽出した。pTriExプラスミドは細菌および哺乳動物細胞内でのタンパク質の発現を駆動するように設計されているので、プラスミドDNAは、次に、インビトロアッセイと細胞内でのアッセイの両方に用いられた。いずれかの方法で得られた全ての陽性をインビトロおよび細胞内での切断について再び確認した。
哺乳動物細胞内でのアッセイを用いるスクリーニングについて、プラスミドを標的部位を含むレポータープラスミドを用いてCHO細胞に共トランスフェクションし、そして切断誘導組換えを72時間後にβ-ガラクトシダーゼ活性の関数としてモニターした。
121の異なる変異型タンパク質を、陽性クローンの配列決定の後に同定した。これらの121の変異型の情報および切断特性を以下の表に示す。54の変異型が両方のアッセイにおいて検出可能な切断活性を示し、66はインビトロでの切断にのみ陽性である。単一の変異型が細胞ベースのアッセイで陽性でかつインビトロで陽性でなかった。
A-レポーター系の最適化
−実験手順
ベクター構築
標的ベクターは、ヒトEF1-アルファ遺伝子のプロモーターにより駆動されるLagoZ発現ベクターに基づく。このプロモーターは、以前に、インビボでの発現スペクトルが広いことが示されている(Kim, D.W., Uetsuki, T., Kaziro, Y., Yamaguchi, N., Sugano, S, 1990, Gene, 91, 217〜223)。プロモーター領域は、スプライス供与体および受容体部位をh-EF1-アルファ遺伝子の5'非翻訳領域に含む。LagoZは、トランスジェニックマウスでサイレントになる遺伝子を破壊するように設計された、LacZ 遺伝子を欠くCpG島(island)である(Henry I, Forlani S, Vaillant S, Muschler J, Choulika A, Nicolas JF, 1999, C R Acad Sci III. 322, 1061〜70)。異なる長さの相同性を有する標的ベクターを構築するために、LagoZ遺伝子の3'断片(約2000 bp)をまず欠失させ、I-Sce I切断部位により置換した。異なる長さの3'断片を親のプラスミドの消化により作製した。これらの断片は、LagoZ遺伝子の5'断片との相同性を種々の量で有した。最後にこれらのDNA断片をI-SceI切断部位に近接して(adjacent to)それぞれクローニングして、それぞれ0、70、220、570および1200 bpの相同性を有する種々の標的ベクターを創った。
American Type Culture Collection (ATCC)からのCOS-7およびCHO-K1細胞株をそれぞれ10% ウシ胎児血清を加えたDMEMまたはHam's F12K培地で培養した。I-Sce I誘導単鎖アニーリング(SSA)アッセイのために、細胞をトランスフェクションの1日前に12ウェルプレートにウェル当たり15.103細胞で播種した。一過性のトランスフェクションを、次の日に、500 ngのDNAを用いて、EFFECTENEトランスフェクションキット(Qiagen)を用いて行なった。等モル量の標的プラスミドとI-SceI発現ベクターとを用いた。次の日に、培地を置換して細胞をさらに72時間インキュベートした。
細胞単層を、1mM MgCl2を含む100mM PBS中の0.5%グルタルアルデヒド中で4℃で10分間固定した。洗浄溶液(100mM PBS、1mM MgCl2、0.02% Nonidet p-40)を用いて1回洗浄した後、細胞を37℃でX-Gal染色溶液(10 mM PBS、1 mM MgCl2、150 mM NaCl、33 mM K4Fe(CN)6.3H2O、33 mM K3Fe(CN)6、0.1% X-Gal)中に発色するまでインキュベートした。β-ガラクトシダーゼ活性を細胞抽出物中でもo-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド(ONPG)を基質として用いて測定した。細胞単層をPBSで1回洗浄した。次いで、細胞を10 mM Tris pH 7.5、150 mM NaCl、1% Triton X-100、プロテアーゼ阻害剤を用いて溶解した。氷上で30分間インキュベーションした後、細胞溶解物を遠心分離してβ-ガラクトシダーゼを測定した。典型的には、上清30μlを、800μg /ml ONPGを含む反応バッファー(10 mM PBS、pH 7.5、1 mM MgCl2、0.3% β-メルカプトエタノール) 270μlと合わせた。反応を37℃で行い、1M NaCO3 0.5 mlで停止した。吸光度を415 nmで測定した。β-ガラクトシダーゼ活性を、タンパク質濃度およびインキュベーション時間について標準化した相対単位として算出した。
DNA二本鎖破壊(DSB)が2つの反復配列の間に導入されるとき、これは相同的組換えを誘導して全ての介在配列とともに反復の欠失をもたらす。組換え経路は、しばしば、単鎖アニーリング(SSA)経路とよばれる。レポーター系は、メガヌクレアーゼ誘導SSAをイントト動物モデルにおいてモニターするように設計された。レポーター系を最適化するために、メガヌクレアーゼ誘導SSAの効率と反復の長さとの間の相関関係をまず調べた。種々のサイズの重複を含むLagoZ遺伝子を有する種々の標的ベクターを構築した(図11)。重複の存在およびI-SceI切断部位の存在が、遺伝子を不活性化する。SSAによるLagoZ遺伝子の修復は、1つの反復の損失および切断部位の損失をもたらしかつ機能的LagoZ遺伝子の回復をもたらす。LagoZは、比色分析により検出できるβ-ガラクトシダーゼ酵素をコードする。等モル量の標的ベクターとI-SceI発現ベクターまたはメガヌクレアーゼを発現しない発現ベクターを用いる一過性トランスフェクションを、CHOまたはCOS-7細胞で行なった。種々の構築物で得られた結果を図12に示す。I-SceI誘導DSBは、明らかにSSA修復機構を刺激する。さらに、70 bpの相同性は、誘導されたSSAの最大限に近い効率を達成するのに充分であったが、自発的組換えのレベル(I-SceI誘導DSBなし)は最小であった。220 bpの重複を用いると最大限の効率が達成されたが、より長い重複を用いてもSSA効率におけるさらなる向上は観察されなかった。同様の結果がCOS-7細胞で得られた(データは示さず)。70および220 bpの相同性は、活性 対 バックグラウンドの最良の比を与えた。β-ガラクトシダーゼを細胞溶解物中でアッセイしかつ1つの単一細胞が標的プラスミドのいくつかのコピーを有し得るので、この方法により絶対的なSSA効率を評価することは不可能である。よって、細胞単層の直接の着色を、トランスフェクションの72時間後に行なった(図13)。メガヌクレアーゼの不在下では、青い細胞は実質的に検出されなかった(図13A)。これに比べて、I-SceIが標的ベクターを用いて共トランスフェクションされるときに多数のβ-ガラクトシダーゼ-陽性細胞が存在し、このことはメガヌクレアーゼ誘導DSBによる相同的組換えの刺激を証明する。I-SceI誘導SSAの効率は、青い細胞(組換えが起こった細胞)を計数することおよびそれをトランスフェクションされた細胞(効率的にDNAを受容した細胞)の数と比較することにより算出した。図13Bは、I-SceIが70または220 bpの重複を有する標的ベクターとともに存在する場合に、細胞の50〜60%が相同的組換えをおこすが、自発的組換えは事象の0.1%未満を表すことを示す。つまり、導入遺伝子とともに70 bpおよび220 bpの相同性を有する構築物を動物での研究に選択した。
−実験手順
インビボでの流体力学ベースのトランスフェクション
マウス肝臓細胞の形質導入を、流体力学的尾部静脈注射により以前に記載されたようにして行った(Zhang, G., Budker, V., Wolff, A., 1999, Human Gene Therapy, 10, 1735〜1737; Liu, F.,Song, Y.K., Liu, D., 1999, Gene Therapy, 6, 1258〜1266)。この方法は、動物における効率的な形質導入および外因性遺伝子の発現を、尾部静脈注射によるプラスミドDNAの投与により許容する。簡単に、DNAを1.5〜2 mlのPBSに混合し、これは動物の体重の10%である。続いて、尾部静脈注射を26-ゲージ針を用い、5〜10秒にわたって、滅菌の材料および作業状況を用いて行う。このようなプロトコルを用いて、ほぼ肝臓細胞のみに形質導入し、それによりLagoZ遺伝子の修正に導くI-SceI-媒介SSA事象を肝臓において研究した。用いたI-SceI発現ベクターはpCLS 197であり、これはpUC主軸内のCMVプロモーターの制御下でのI-SceIコーディング配列(米国特許第5,474,896号)に相当しかつ5737bpの長さである。
注射の3日後、マウスを頸部脱臼により安楽死させ、マウスの肝臓のX-Gal染色を行なった。肝臓を動物から冷 1×PBS中に解剖し、組織にX-Galがより接近することを許容するために、肝葉(lobes)を約1/4 cmの破片に切断した。次いで、肝臓の破片を、氷上に保持した12ウェル細胞培養プレート内の新鮮な冷PBS 1×中に入れ、4%パラホルムアルデヒド中に1時間、攪拌下に4℃で固定した。サンプルを3回、室温で30分間、洗浄バッファー(100mM リン酸ナトリウム pH=7.3、2mM MgCl2、0.01容量% デオキシコレートナトリウム 0.02容量% NP-40)で洗浄した。イントトX-Gal染色を一晩、37℃で染色溶液(洗浄バッファー中に5mM フェリシアン化カリウム、5mM フェロシアン化カリウム、1mg/ml X-gal、20mM Tris pH=7.3)中に行なった。最後に、サンプルを広範にPBSで洗浄し、顕微鏡で調べた。写真をNikon CoolpixカメラでNikon SMZ 1500 双眼顕微鏡の下で撮影した。
細胞の研究は、70 bpの相同性がDSB誘導SSAのほぼ最大限の効率を達成するのに充分であるが、一方、自発的組換え(I-SceI誘導DSBなし)は最小であることを示す。よって、インビボで組換えを刺激する最初の試みにおいて、一過性の実験を行った。標的ベクター(30μg)とI-SceI発現プラスミドまたはコントロールプラスミド(10μg)のいずれかとの混合物を、流体力学的尾部静脈注入法により肝臓に導入した。図14は、注射の3日後に回収し、染色した肝臓の拡大図を示す。青色の点は、70 bpの重複に接するI-SceI部位を有する不完全なLagoZ遺伝子が修復された細胞を表す。メガヌクレアーゼ誘導DSBの後、SSA経路は1つの反復の欠失および機能的遺伝子の再構築をもたらす。LagoZ遺伝子によりエンコードされる活性なβ-ガラクトシダーゼは、次いで、X-Gal染色により検出され得る。さらに、メガヌクレアーゼ発現ベクターの不在下では遺伝子修正が検出されなかった。これらのデータは、メガヌクレアーゼ誘導組換えが肝臓において刺激され、染色体外標的のイントト修復が達成できることの最初の証拠である。
種々のマウス組織におけるイントト染色体外レポーターのメガヌクレアーゼ誘導ゲノム外科治療(surgery)を証明するために、イントトlagoZ遺伝子の修復を、いくつかの器官の形質導入化細胞により、I-SceI-発現アデノウイルスである 「Ad.I-SceI」を用いて試験した。コントロールのトランスジェニック同腹子に、I-SceI-非発現アデノウイルスである「Ad.control」を感染させた。トランスジェニックマウスでのアデノウイルス感染は、静脈内(IV)注射により行なった。イントトlagoZ遺伝子のいくつかの組織における修復を、イントトβ-ガラクトシダーゼ活性を検出する2つの方法、X-gal染色およびFDGアッセイにより試験した。
トランスジェニックマウス
トランスジェニック創始者の発生のために用いられた導入遺伝子は、ヒト伸長因子1アルファプロモーター(human elongation factor 1 alpha promoter)の制御下にあり、70 bpまたは220bpのLagoZ重複およびI-SceI切断部位により不活性化された不完全なLagoZ遺伝子を有する5919bpのBglII/NotI断片であった(図11参照)。
220bpまたは70bpのいずれかの長さのlagoZ遺伝子反復配列を有する2つの独立した株を用いた。これらのトランスジェニック株は、それぞれ株「361」および「58A」という。
CMVプロモーターの制御下にI-SceIメガヌクレアーゼコーディング領域を有する組換えV型アデノウイルス「Ad.I-SceI」は、Q BIOジーンカンパニーから、TCID50法により評点された1.58 1011感染性単位濃度で提供された。ネガティブアデノウイルスコントロール「Ad.control」もQ BIOジーンカンパニーから、3.76 1011感染性単位濃度で提供された。組換えV型アデノウイルス感染は、トランスジェニックマウスの尾部静脈での静脈内(IV)注射により行なった。トランスジェニックマウスを秤量し、キシラシン(100 mg/kg)とケタミン(10 mg/kg)の混合物の腹腔内注射により感染の前に麻酔をかけた。IV感染を、400μlの容量中の1010感染性単位/動物で行なった。感染は、4〜7週齢のトランスジェニックマウスに行なった。アデノウイルスに感染したマウスと未感染のコントロール同腹子とをアイソレーター中に、β-ガラクトシダーゼアッセイのために犠牲にするまで飼育した。
アデノウイルスに感染したマウスを、感染後5〜14日(days-post-infention;dpi)でCO2吸入により犠牲にし、その器官をβ-ガラクトシダーゼアッセイのために加工した。肝臓の約10% (8 mm3)をタンパク質抽出のために用い、残りの90%を、β-ガラクトシダーゼのイントトX-galアッセイ(プロトコルは以前に記載)のために用いた。
2匹の「58A」トランスジェニックマウスを、70bpの重複lagoZ配列の間のDSBを標的し、レポーター遺伝子の修復を誘導するために、1010感染性単位の「Ad.I-SceI」アデノウイルスでIV-注入した。注入後の種々の時間においてマウスを犠牲にし、いくつかの器官を解剖してイントトX-galアッセイにより分析した。青色の染色が、5dpiで安楽死させた感染したマウスの肝臓全体にわたって分散した細胞として検出された(図15A)。試験したほかの器官、すなわち腎臓、脾臓、心臓および肺において染色は検出できなかった。2匹の「58A」トランスジェニックマウス同腹子をコントロールとして用い、1匹は1010感染性単位のコントロールアデノウイルス「Ad.control」をIV-注入し、もう一方は感染させなかった。いずれのコントロールの肝臓でもβ-ガラクトシダーゼ活性は検出できなかった(データ示さず)。同様の結果が、Ad.I-SceIアデノウイルスの109および1010感染性単位で感染させた2匹の「361」トランスジェニックマウスで得られた(それぞれ図15Bと15C)。これらの結果は、肝臓抽出物でのβ-ガラクトシダーゼ活性の測定により確認された(図16)。I-SceIを発現するアデノウイルス(Ad.1Sce-I)を注入したマウスの肝臓において、高い活性が検出された。これに比べて、注入しなかったマウス(NI)は、コントロールアデノウイルス(Ad.control)を注入したマウスで検出される活性と類似の残存バックグラウンド活性だけを示した。
Claims (22)
- I-Cre I変異型がLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼI-Cre Iの認識・切断部位とは異なるDNA標的配列を切断することができ、次の工程:
a)認識・切断部位の異なる塩基と接触するかまたは直接もしくは間接に相互作用するI-Cre Iの複数のアミノ酸位置であって、I-Cre IのQ26、K28、N30、S32、Y33、Q38、Q44、R68、R70およびT140からなる群より選択されるアミノ酸位置にアミノ酸変異を導入することによりI-Cre Iの変異型の少なくとも1つのコンビナトリアルライブラリを作製する工程;および
b)前記変異型により作製されたDNA標的配列中の二本鎖破壊が正の選択マーカーまたはレポーター遺伝子の活性化、あるいは負の選択マーカーまたはレポーター遺伝子の不活性化を前記DNA二本鎖破壊の組換え媒介遺伝子修復によって導く条件下で、酵母細胞または哺乳動物細胞において、前記DNA標的配列を切断できる変異型を選択及び/又はスクリーニングする工程
を含むことを特徴とするLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼI-Cre Iの変異型を製造する方法。 - 前記工程b)が、前記DNA標的配列と、活性型の負の選択マーカー、不活性型の正の選択マーカーまたは活性型もしくは不活性型のレポーター遺伝子のコーディング配列とを含む発現ベクターにより少なくとも改変された細胞の使用を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が、標的DNA配列を含む介在配列により分離される内部重複を有する改変された正の選択マーカーまたはレポーター遺伝子を含む発現ベクターにより改変されていることを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 前記細胞が、欠失または変異と欠失の位置または変異の近傍に前記標的DNAの挿入とを含む第一の改変された正の選択マーカーまたはレポーター遺伝子を含む発現ベクターにより改変され、前記細胞が、欠失/挿入の境をなす正の選択マーカーまたはレポーター遺伝子の配列により両側で挟まれる欠失または変異された正の選択マーカーまたはレポーター遺伝子のセグメントによりさらに改変されていることを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 前記DNA標的配列中の二本鎖破壊が、2つの直列反復間の相同的組換えにより修復されることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1つに記載の方法。
- 前記DNA標的配列中の二本鎖破壊が、遺伝子変換により修復されることを特徴とする請求項1、2および4のいずれか1つに記載の方法。
- 前記コーディング配列と前記DNA標的配列とがプラスミド上にあることを特徴とする請求項2〜6のいずれか1つに記載の方法。
- 前記コーディング配列と前記DNA標的配列とが、前記細胞の染色体に組み込まれていることを特徴とする請求項2〜6のいずれか1つに記載の方法。
- 前記正の選択マーカーが、抗生物質耐性または栄養要求性マーカーであることを特徴とする請求項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
- 前記細胞が酵母細胞である請求項2〜9のいずれか1つに記載の方法。
- 前記細胞が哺乳動物細胞である請求項2〜9のいずれか1つに記載の方法。
- 工程b)が前記変異型を切断活性について選択する工程であることを特徴とする請求項1〜11のいずれか1つに記載の方法。
- 工程b)が前記変異型を切断活性についてスクリーニングする工程であることを特徴とする請求項1〜11のいずれか1つに記載の方法。
- 工程b)が前記変異型を切断活性について選択する工程および前記変異型を切断活性についてスクリーニングする工程の組み合わせであることを特徴とする請求項1〜11のいずれか1つに記載の方法。
- 工程b)が、
− 前記変異型を結合能力について選択する工程、前記変異型を結合能力についてスクリーニングする工程、前記変異型を切断活性について選択する工程および前記変異型を切断活性についてスクリーニングする工程;
− 前記変異型を結合能力について選択する工程、前記変異型を結合能力についてスクリーニングする工程および前記変異型を切断活性についてスクリーニング工程;
− 前記変異型を結合能力について選択する工程、前記変異型を切断活性について選択する工程および前記変異型を切断活性についてスクリーニング工程;または
− 前記変異型を結合能力についてスクリーニングする工程および前記変異型を切断活性についてスクリーニング工程
からなる群から選択される選択工程およびスクリーニング工程の組み合わせであることを特徴とする請求項1〜11のいずれか1つに記載の方法。 - 前記結合能力についての選択工程およびスクリーニング工程が、ファージディスプレイを用いることを特徴とする請求項15に記載の方法。
- 前記切断活性についての選択工程が、切断が正の選択マーカーの活性化に導く試験を用いることを特徴とする請求項12、14および15のいずれか1つに記載の方法。
- 前記切断活性についてのスクリーニング工程が、切断がレポーター遺伝子の活性化に導く試験を用いることを特徴とする請求項13、14および15のいずれか1つに記載の方法。
- 前記I-Cre I変異型が、a) Q26、K28、N30、Y33、Q38、Q44、R68、R70、T140;b) Q26、K28、N30、Y33、Q38、Q44、R68、R70;c) Q26、K28、N30、Y33、Q44、R68、R70;d) Q26、K28、Y33、Q38、Q44、R68、R70;e) Q26、K28、N30、Y33、Q38;またはf) Q44、R68、R70の位置においてアミノ酸変異を導入することにより作製されることを特徴とする請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記I-Cre I変異型が、Q26、K28、N30、Y33、Q38、Q44、R68およびR70の位置においてアミノ酸変異を導入することにより作製されることを特徴とする請求項19に記載の方法。
- 前記I-Cre I変異型が、I-Cre Iの位置75のアスパラギン酸の非荷電アミノ酸への変異をさらに含むことを特徴とする請求項1〜20のいずれか1つに記載の方法。
- 前記非荷電アミノ酸がアスパラギン残基であることを特徴とする請求項21に記載の方法。
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