JP2018511333A - 導入遺伝子発現のための植物プロモータ - Google Patents

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Abstract

本開示は、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）のプロモータを用いて、植物体または植物細胞におけるヌクレオチド配列の転写を促進するための組成物及び方法に関する。いくつかの実施形態は、作用可能に連結したヌクレオチド配列の転写を促進させるために植物で作用するＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子(ｍｔｌ)のプロモータに関する。【選択図】 図３Ａ

Description

関連特許出願の相互参照
本出願は米国特許仮出願第６２／１４７，８４４号（２０１５年４月１５日出願）の優先権を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に援用される。参照によりその全体が本明細書に援用される。
電子ファイルで提出される資料の参照による援用
参照により全体が援用されるのは、これにより同時に提出され示されるコンピュータ可読ヌクレオチド/アミノ酸配列リストであり以下の通りに特定される。２６．２ ＫＢ ＡＣＩＩ （Ｔｅｘｔ）ファイル名「７７０３７−ＷＯ−ＰＣＴ−２０１６０３２２−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｌｉｓｔｉｎｇ−ＳＴ２５．ｔｘｔ」２０１６年３月２２日に作成。
本開示は、全般的に植物または植物細胞におけるヌクレオチド配列の構成及び転写を促進する方法に関する。いくつかの実施形態は、作用可能に連結されたヌクレオチド配列の転写を促進させるために植物で機能するＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）のプロモータに関する。特定の実施形態は、プロモータ（例えば、核酸分子を細胞に導入するため）と細胞、細胞培養株、組織、生物体及びプロモータを含む生物体の一部、ならびにそこから生成される生産物を含む方法に関する。
多くの植物種は、農学的に望ましい形質または特性を導入するために導入遺伝子で形質転換することができる。植物種は、特定の望ましい形質をもつように開発、及び／または改変される。一般に、望ましい形質としては、例えば栄養的価値品質を改良する、収量を増やす、害虫または病害耐性を付与する、乾燥及びストレス耐性を高める、園芸品質を改良する（例えば、色素形成及び成長）、除草剤耐性を与える 、産業的に有用な化合物の生産を可能にする、及び／または医薬の生産を可能にすることが挙げられる。
単一ゲノム遺伝子座にスタック化された複数の導入遺伝子を含むトランスジェニック植物種は植物形質転換技術を介して作製される。植物形質転換技術によって、植物細胞への導入遺伝子の導入、植物ゲノムに導入遺伝子が安定に取り込まれたコピーを含む稔性のトランスジェニック植物の再生が得られ、同時に、植物ゲノムの転写及び翻訳を介したその後の導入遺伝子発現は、望ましい形質及び表現型を有するトランスジェニック植物をもたらす。しかし、複数形質として設計された複数の導入遺伝子を高発現するトランスジェニック植物種の作製を可能にするメカニズムが望ましい。
同様に、植物の特定の組織または器官内で導入遺伝子の発現を可能にするメカニズムが望ましい。例えば、植物の土壌病原体による感染耐性の増大は、病原体耐性蛋白質が植物の根中で強靭に発現するように病原体耐性遺伝子を用いて植物ゲノムを形質転換することで達成する可能性がある。あるいは、例えば細胞***または伸長などの特定の成長または発育相にある植物組織に導入遺伝子を発現させることが望ましいかもしれない。更にまた、除草剤耐性または地上の昆虫及び害虫耐性を提供するために、植物の葉及び茎で導入遺伝子を発現させることが望ましいかもしれない。
従って、特定の植物組織で導入遺伝子の所望の発現レベルを促進できる新たな遺伝子調節エレメントの存在が必要である。
主題開示の実施形態において、開示は、ポリリンカー配列、非メタロチオネイン様遺伝子、またはポリリンカー配列及び非メタロチオネイン様遺伝子の組合せと作用可能に連結するプロモータであって、前記プロモータが配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性をもつポリヌクレオチド配列を含む核酸ベクターに関する。いくつかの実施形態において、プロモータは長さが１，８７５ｂｐである。追加的実施形態において、プロモータは配列番号1と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列からなる。他の実施形態において、プロモータは選択マーカーをコード化するポリヌクレオチドの発現を促進する。更なる実施形態において、プロモータは導入遺伝子と作用可能に連結される。本実施形態の態様において、導入遺伝子は、殺虫剤耐性、除草剤耐性、窒素利用効率、水利用効率または栄養価を付与する選択マーカーまたは遺伝子産物をコード化する。配列番号１のプロモータは、３′非翻訳ポリヌクレオチド配列（３′‐ＵＴＲ）と共に使用するために提供され、３′非翻訳ポリヌクレオチド配列は、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性をもつ配列、あるいは配列番号７と少なくとも９０％の配列同一性をもつ３′非翻訳ポリヌクレオチド配列を含み、３′非翻訳ポリヌクレオチド配列は前記ポリリンカーまたは前記導入遺伝子と作用可能に連結されている。他の実施形態において、配列番号１のプロモータは、５’非翻訳ポリヌクレオチド配列と共に使用するために提供され、５’非翻訳ポリヌクレオチド配列は、配列番号４と少なくとも９０％の配列同一性をもつ配列を含み、５’非翻訳ポリヌクレオチド配列は前記ポリリンカーまたは前記導入遺伝子と作用可能に連結されている。他の実施形態において、配列番号１のプロモータは更にイントロン配列を含む。更なる実施形態において、配列番号１のプロモータは地下組織特異的発現を促進する。
さらに別の実施形態において、主題開示は導入遺伝子に作用可能に連結された配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性をもつポリヌクレオチド配列を含む非キビ属（Ｐａｎｉｃｕｍ）植物に関して提供する。本実施形態に従って、植物はトウモロコシ、コムギ、イネ、モロコシ、オート麦、ライ麦、バナナ、サトウキビ、ダイズ、ワタ、シロイヌナズナ、タバコ、ヒマワリ及びアブラナからなる群から選択される。続いて、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性をもつポリヌクレオチド配列を含む非キビ属植物はいくつかの実施形態においてトウモロコシとすることができる。他の実施形態において、導入遺伝子は、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性をもつポリヌクレオチド配列に作用可能に連結され、植物ゲノムに挿入される。いくつかの実施形態において、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性をもつポリヌクレオチド配列はプロモータであり、前記プロモータは導入遺伝子と作用可能に連結される。他の実施形態において、非キビ属植物は、配列番号７を含む３′非翻訳配列、または配列番号７と少なくとも９０％の配列同一性をもつ３′非翻訳配列を含み、３′非翻訳配列は前記導入遺伝子と作用可能に連結される。更なる実施形態において、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性をもつポリヌクレオチド配列は、地下組織特異的発現で導入遺伝子の発現を促進する。更なる実施形態において、配列番号1と少なくとも９０％の配列同一性をもつポリヌクレオチド配列は長さが１，８７５のｂｐである。
１つの実施形態において、主題開示は、トランスジェニック植物細胞を製作する方法を提供し、方法は以下の工程、すなわち、対象の少なくとも１つのポリヌクレオチド配列に作用可能に連結されたＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータを含む遺伝子発現カセットで植物細胞を形質転換する;遺伝子形質発現カセットを含む形質転換植物細胞を単離する;及び対象の少なくとも１つのポリヌクレオチド配列に作用可能に連結されたＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータを含むトランスジェニック植物を作製することを含む。他の実施形態において、植物細胞を形質転換する工程は、植物形質転換法を用いて行う。植物形質転換法は、アグロバクテリウム媒介形質転換法、バイオリステック形質転換法、 炭化ケイ素形質転換法、プロトプラスト形質転換法及びリポソーム形質転換法からなる群から選択することができる。他の実施形態において、対象のポリヌクレオチド配列がトランスジェニック植物細胞全体で構造的に発現される。いくつかの実施形態において、対象のポリヌクレオチド配列がトランスジェニック植物細胞のゲノムに安定に組み込まれる。従って、トランスジェニック植物細胞を作出する方法は更に以下の工程、すなわち、トランスジェニック植物にトランスジェニック植物細胞を再生する;及びトランスジェニック植物が対象の少なくとも１つのポリヌクレオチド配列に作用可能に連結した請求項１記載のＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（［ｍｔｌ）プロモータを含む遺伝子形質発現カセットを含むトランスジェニック植物を得ることを含むことができる。１つの実施形態において、トランスジェニック植細胞は単子葉トランスジェニック植細胞または双子葉トランスジェニック植細胞である。例えば、双子葉トランスジェニック植物細胞はシロイヌナズナ植物細胞、タバコ植物細胞、ダイズ植物細胞、アブラナ植物細胞、及びワタ植物細胞からなる群から選択することができる。更に、単子葉トランスジェニック植細胞はトウモロコシ植物細胞、イネ細胞及びコムギ植物細胞からなる群から選択される。方法で使用されるＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータは配列番号１のポリヌクレオチドを含んでもよい。実施形態において、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータは配列番号１の３′末端に作用可能に連結された対象の第１のポリヌクレオチド配列を更に含んでもよい。
１つの実施形態において、主題開示は、植物細胞での対象のポリヌクレオチド配列を発現する方法、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータに作用可能に連結された対象のポリヌクレオチド配列を植物細胞に導入することを含む方法について提供する。いくつかの実施形態において、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータに作用可能に連結された対象のポリヌクレオチド配列が植物形質転換法によって植物細胞に導入される。このような植物形質転換法は、アグロバクテリウム媒介形質転換法、バイオリステック形質転換法、 炭化ケイ素形質転換法、プロトプラスト形質転換法、及びリポソーム形質転換法からなる群から選択することができる。実施形態において、対象のポリヌクレオチド配列が植物細胞全体で構造的に発現される。いくつかの実施形態において、対象のポリヌクレオチド配列が植物細胞に安定に組み込まれる。このようなトランスジェニック植物細胞は単子葉植物細胞または双子葉トランスジェニック植細胞である。例えば、双子葉植物細胞はシロイヌナズナ植物細胞、タバコ植物細胞、ダイズ植物細胞、アブラナ植物細胞、及びワタ植物細胞からなる群から選択することができる。更に、単子葉トランスジェニック植物細胞はトウモロコシ植物細胞、イネ細胞及びコムギ植物細胞からなる群から選択される。
１つの実施形態において、主題開示はＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータを含むトランスジェニック植物細胞のために提供する。いくつかの実施形態において、トランスジェニック植物細胞はトランスジェニック事象を含む。実施形態の１つの態様において、トランスジェニック事象は農業形質を含む。従って、農業形質は殺虫性耐性形質、除草剤耐性形質、窒素使用効率形質、水利用効率形質、栄養価形質、ＤＮＡ結合形質、選択マーカー形質、低分子ＲＮＡ形質またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。他の実施形態において、農業形質は除草剤耐性形質を含む。実施形態に１つの態様において、除草剤耐性形質はａａｄ-１コード配列を含む。いくつかの実施形態において、トランスジェニック植物細胞は商品生産物を産生する。商品生産物は、厳選された蛋白質濃縮物、蛋白質分離物、穀粒、ミール、小麦粉、オイル、または繊維である。実施形態において、トランスジェニック植物細胞は双子葉植物細胞または単子葉植物細胞からなる群から選択される。従って、単子葉植物細胞はトウモロコシ植物細胞である。他の実施形態において、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータは配列番号１のポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性をもつポリヌクレオチド含む。さらにもう１つの実施形態において、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータは長さが１，８７５ｂｐである。更なる実施形態において、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータは配列番号１からなる。追加的実施形態において、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータは配列番号１の３′末端に作用可能に連結された配列番号１からなる。他の実施形態において、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータは地下植物組織での農業形質の発現を促進する。
主題開示は、配列番号１のポリヌクレオチドと少なくとも９０％の配列同一性をもつ核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドに対して提供する。いくつかの実施形態において、単離ポリヌクレオチドは地上組織特異的発現を促進する。他の実施形態において、単離ポリヌクレオチドは植物細胞の中で発現活性をもつ。実施形態において、単離ポリヌクレオチドはポリペプチド及び終止配列をコードするオープンリーディングフレームポリヌクレオチドを含む。更なる実施形態としては、配列番号１のポリヌクレオチドと少なくとも９０％の配列同一性をもつ核酸配列を含み、配列番号１のポリヌクレオチドは長さが１，８７５ｂｐである単離ポリヌクレオチドが挙げられる。
前記及び他の特徴は、幾つかの実施形態の以下の詳述からより明らかになるし、添付図面を参照することで進展するであろう。
図１：この図は、配列番号１のＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータ及び配列番号４のＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）５′-ＵＴＲ（Ｐ．ｖｉｒｇａｔｕｍ ＭＴＬプロモータ及び５′ＵＴＲとして標識化）ならびに配列番号７のＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）３′-ＵＴＲ（Ｐ. ｖｉｒｇａｔｕｍ ＭＴＬ ３′ＵＴＲとして標識化）を含むｐＤＡＢ１０２４１７の概略図である。 図２Ａ：この図は、配列番号１のＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータならびに配列番号９及び配列番号１０の改変したＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータのポリヌクレオチドアラインメントを提供する。 図２Ｂ：この図は、配列番号１のＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータならびに配列番号９及び配列番号１０の改変したＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータのポリヌクレオチドアラインメントを提供する。 図２Ｃ：この図は、配列番号１のＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータならびに配列番号９及び配列番号１０の改変したＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータのポリヌクレオチドアラインメントを提供する。 図２Ｄ：この図は、配列番号１のＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータならびに配列番号９及び配列番号１０の改変したＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータのポリヌクレオチドアラインメントを提供する。 図３Ａ：この図は、配列番号７のＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）３′-ＵＴＲ及び配列番号１１の改変したＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）３′-ＵＴＲのポリヌクレオチドアラインメントを提供する。 図３Ｂ：この図は、配列番号７のＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）３′-ＵＴＲ及び配列番号１１の改変したＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）３′-ＵＴＲのポリヌクレオチドアラインメントを提供する。
発明の詳細な説明
I. 幾つかの実施形態の概要
トランスジェニック植物産物の開発がますます複雑になっている。商業的に実現可能なトランスジェニック植物は現在、単一遺伝子座に複数の導入遺伝子のスタッキングを必要とする。基礎研究または生物工学応用に使用される植物プロモータは一般に一方向であり、３′末端（下流）で融合される唯一の遺伝子を指向する。従って、各導入遺伝子は通常１つの発現用プロモータを必要とし、１つの遺伝子スタック内の複数の導入遺伝子を発現するのに複数のプロモータが必要である。遺伝子スタックの導入遺伝子数の増加とともに、通常同じプロモータを使用し、異なる導入遺伝子の同様な発現パターンレベルを得る。導入遺伝子発現の同様なレベルを得ることが、単一ポリジーン形質の産生に必要である。残念なことに、同じプロモータで促進される多重遺伝子構築物は圃場では効果の少ない遺伝子組換え作物をもたらす遺伝子サイレンシングの原因となる。プロモータエレメントの反復が相同性に基づく遺伝子サイレンシングをもたらすかもしれない。加えて、導入遺伝子内の繰返し配列がポリヌクレオチド再編成を生じる遺伝子座内で遺伝子相同組み換えをもたらすかもしれない。導入遺伝子のサイレンシング及び再編成は、導入遺伝子を発現するために作製されたトランスジェニック植物の能力におそらく好ましくない影響をもつであろう。更に、プロモータ反復に起因する過剰な転写因子（ＴＦ）結合部位が転写不活性をもたらす内因性ＴＦの減少を引き起こす場合がある。代謝工学及び形質スタッキングのために植物体に複数の遺伝子を導入する必要性を考慮すると、複数遺伝子の発現を促進する遺伝子組換え作物を開発するためにはさまざまなプロモータが必要である。
プロモータ同定における特定の問題は、他の植物組織で発現しないその植物における特異的細胞型、成長段階及び／または機能に関連した組織特異的プロモータを同定することの必要性である。組織特異的（すなわち、優先される組織）または器官特異的プロモータは、植物の穀粒、根、葉またはタペート組織等の特定組織での遺伝子発現を促進する。 組織及び発育段階特異的プロモータは、最初は、植物成長中の特定組織または特定期間に発現する遺伝子発現の観察から識別することができる。これらの組織特異的プロモータはトランスジェニック植物産業における特定の応用に必要であり、他の組織ではない種々の器官、組織及び／または時間で差別的に異種遺伝子の発現を示し、組織及び／または成長段階の選択的様式で異種遺伝子の特異的発現を可能にすることから望ましい。例えば、植物の土壌病原体による感染耐性の増大は、病原体耐性蛋白質が植物の根中で強靭に発現するように病原体耐性遺伝子を用いて植物ゲノムを形質転換することで達成する可能性がある。あるいは、例えば細胞***または伸長などの特定の成長または発育相にある植物組織に導入遺伝子を発現させることが望ましいかもしれない。もう１つの応用は、柔組織細胞の発達のように特定組織タイプでの農業形質コード化導入遺伝子発現に限定するための組織特異的プロモータを使用する望ましさである。そのように、プロモータ同定の特定の問題は、プロモータ同定の方法及び特異的組織発現用細胞の開発的特性と同定プロモータとの関連付けである。
プロモータの同定に関する別の問題は、クローン化ＤＮＡ断片が所望の特異的発現パターンで転写を促進するように全ての関連性のあるシス作用及びトランス活性化転写制御エレメントをクローン化する必要性である。そのような制御エレメントが翻訳開始部位または開始点から遠位に位置するならば、プロモータポリヌクレオチド配列の発現レベル及び発現パターンの提供には、プロモータを含むように選択されたポリヌクレオチドのサイズが重要である。プロモータの長さは機能的な情報を包含することが知られており、異なる遺伝子がゲノム内の他の遺伝子のプロモータより長いかまたは短いプロモータをもつことが示された。プロモータの転写開始点を明らかにすること、及びプロモータ領域内の機能的遺伝子エレメントを予測することは難しい。この課題に更に加わるのは調節モチーフならびにシス及びトランス調節要素の複雑性、多様性及び固有の退化本質である（Ｂｌａｎｃｈｅｔｔｅ， Ｍａｔｈｉｅｕ， ｅｔ ａｌ．”Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｄｕｌｅｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．” Ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ １６．５ （２００６）： ６５６−６６８）。 シス及びトランス調節エレメントは遺伝子の空間的時間的発現を調節するプロモータの遠位部に位置し、特定の時点に必要な部位だけで発生する（Ｐｏｒｔｏ， Ｍｉｌｅｎａ Ｓｉｌｖａ， ｅｔ ａｌ． “Ｐｌａｎｔ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ： ａｎ ａｐｐｒｏａｃｈ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５６．１ （２０１４)：３８−４９）。 既存のプロモータ解析ツールはゲノム配列でそのようなシス調節エレメントを確実に特定できない。従って、これらのツールは一般に配列内容物だけに焦点を置いているためあまりに多くの偽陽性を予測する結果となる（Ｆｉｃｋｅｔｔ ＪＷ， Ｈａｔｚｉｇｅｏｒｇｉｏｕ ＡＧ （１９９７） Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ． Ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ７： ８６１-８７８）。従って、プロモータ調節エレメントの同定は、所望の態様で作用可能に連結された導入遺伝子の発現誘導が得られるであろう特定サイズの適切な配列を得ることが要件となる。
植物で導入遺伝子を発現するＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータ調節エレメントの使用によってそのような問題を克服するための方法及び組成物が提供される。
II. 用語及び略語
出願全体で多くの用語が使用される。そのような用語が与えられる範囲を含め、明細書及び特許請求の範囲の主張の明確で一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。
本明細書で使用されるとき、用語「イントロン（intron）」は、転写されるが翻訳されない遺伝子に含まれる任意の核酸配列（または、対象の発現したポリヌクレオチド配列）を意味する。イントロンは、ＤＮＡの発現配列内の非翻訳核酸配列ならびにそれから転写されたＲＮＡ分子中の相当配列を含む。また、本明細書に記載した構築物はイントロンなどの転写及び／またはｍＲＮＡ安定性を高める配列も含む。そのようなイントロンの例は、シロイヌナズナまたは任意の他の一般に知られているイントロン配列のヒストンＨ３変異体の遺伝子ＩＩの第1イントロンである。イントロンをプロモータ配列と組み合わせて使用し、翻訳及び／またはｍＲＮＡ安定性を高めることができる。
本明細書で使用されるとき、用語「単離される（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」は、天然の環境から除去される、または化合物が最初に形成されるときに存在する他の化合物から除去されることを意味する。「単離される（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」という用語は、天然源から単離される材料ならびに、宿主細胞での組み換え発現による調製後に回収される材料（例えば、核酸及び蛋白質）、あるいは核酸分子、蛋白質及びペプチド等の化学的合成品を包含する。
本明細書で使用されるとき、用語「精製される（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」は、天然または自然環境において分子または化合物と通常に会合した不純物を実質的に含まない形態の分子または化合物、あるいは化合物が最初に形成されるときに存在する他の化合物と比較して濃度が実質的に高い分子または化合物の分離を言い、最初の組成物の他の成分から分離された結果として純度が増加することを意味する。用語「精製された核酸（ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」は、限定はされないが、ポリペプチド、脂質及び炭水化物を含む他の生物学的化合物から分離される、作製されるまたは精製される一方、成分の化学的または機能的変化（例えば、蛋白質不純物の除去及び染色体に残留するＤＮＡと核酸を結合する化学結合に破断によって染色体から精製されてもよい）に影響を及ぼす核酸配列を記載するために本明細書で使用される。
本明細書で使用されるとき、用語「合成物」は、インビトロ工程のときに化学合成を介して作製されるポリヌクレオチド（すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡ）分子を指す。例えば、合成ＤＮＡは、合成ＤＮＡがＤＮＡまたはＲＮＡの天然鎖から酵素的に生成されるようにエッペンドルフ（商標）チューブ内の反応中に作製されてもよい。他の実験室的方法を利用してポリヌクレオチド配列を合成することができる。オリゴヌクレオチドは、ホスホラミダイトを使用する固相合成を介してオリゴシンセサイザー上で化学的に合成することができる。合成オリゴヌクレオチドが複合体として相互にアニール化されることによって「合成」ポリヌクレオチドを産生する。ポリヌクレオチドを化学的に合成する他の方法は当技術分野においては公知であり、本開示での使用で容易に実施することができる。
本明細書で使用されるとき、用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、その値の多少または記載された値の１０パーセントの範囲を意味するが、単なる広義で任意の値または値の範囲を表わすことを意図しない。用語「約（ａｂｏｕｔ）」の後の値またはその値の範囲は、記載された絶対値または値の範囲の具体化を包含することも意図されている。
本開示の目的では、「遺伝子」は、遺伝子産物をコード化するＤＮＡ領域だけでなく、そのような調節配列がコーディング及び／または転写配列に隣接するかどうかにかかわらず遺伝子産物の生成を調節するＤＮＡ領域を含む。従って、遺伝子としては、プロモータ配列、ターミネーター、翻訳調節配列（例えばリボソーム結合部位及び配列内リボソーム進入部位）、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター 、バウンダリーエレメント、複製起点、基質付着部位及び遺伝子座領域が挙げられるが、これらに必ずしも限定されない。
本明細書で使用されるとき、「天然」または「自然」という用語は自然で発見される状態を定義する。「天然のＤＮＡ配列」は、遺伝子工学（例えば、分子生物学/形質転換技術を使用する）によって生成されるのではなく自然な方法または従来型繁殖方法によって生産される自然に存在するＤＮＡ配列である。
本明細書で使用されるとき、「導入遺伝子」は遺伝子産物をコード化する核酸配列と定義され、例えば、限定はされないがｍＲＮＡが挙げられる。１つの実施形態において、導入遺伝子は外因的な核酸であり、導入遺伝子は通常発見されない場合に遺伝子工学によって宿主細胞に導入される。１つの実施形態において、導入遺伝子は工業的または薬学的に有用な化合物をコード化する、あるいは好ましい農業形質をコード化する遺伝子（例えば、除草剤耐性遺伝子）である。さらに別の例では、導入遺伝子はアンチセンス核酸配列の発現が標的核酸配列の発現を阻害するアンチセンス核酸配列である。１つの実施形態において、導入遺伝子は、内因性核酸の追加的ゲノムコピーが望ましい内因性核酸、または宿主生物で標的核酸の配列に対してアンチセンス方向にある核酸である。
本明細書で使用されるとき、「非メタロチオネイン様導入遺伝子」または「非メタロチオネイン様遺伝子」という用語は、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子コーディング配列（配列番号８）と８０％未満の配列同一性をもつ任意の導入遺伝子である。
本明細書で定義される「遺伝子産物」は、遺伝子によって産生される任意の産物である。例えば、遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、干渉ＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡまたは任意の他のＲＮＡタイプ）またはｍＲＮＡの翻訳によって生成される蛋白質の場合がある。また、遺伝子産物としては、例えばキャッピング、ポリアデニル化、メチル化、及び編集によって修飾されるＲＮＡ、ならびに例えばメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン結合、ＡＤＰリボシル化、ミリストイル化、およびグリコシル化によって修飾される蛋白質を挙げることができる。遺伝子発現は、例えば細胞、組織または生物体の遺伝子発現を増減させる薬剤への曝露等、外部シグナルによって影響を受ける場合がある。また、遺伝子の発現は、ＤＮＡからＲＮＡ、蛋白質までの経路のどこででも調節することができる。遺伝子発現の調節は、例えば転写、翻訳、ＲＮＡの輸送及びプロセシング、ｍＲＮＡ等の中間分子の分解に作用する調節、あるいは製作された後の特異的蛋白質分子の活性化、不活性化、区画化、または分解またはそれらの組み合わせによって発生する。遺伝子発現は、これらに限定はされないが、ノーザンブロット、ＲＴ-ＰＣＲ、ウエスタンブロット、またはインビトロ、インシトゥー、あるいはインビボ蛋白質活性アッセイ(複数)を含む当該技術分野で公知の任意の方法によってＲＮＡレベルまたは蛋白質レベルで測定することができる。
本明細書で使用されるとき、「遺伝子発現」は、核酸転写単位（例えば、ゲノムＤＮＡを含む）のコード化された情報は、しばしば蛋白質の合成を含む細胞の操作、非操作または構成部分に変換される。 遺伝子発現は、例えば細胞、組織、または生物体の遺伝子発現を増減させる薬剤への曝露等の外部シグナルによって影響を受ける場合がある。また、遺伝子の発現は、ＤＮＡからＲＮＡ、蛋白質までの経路のどこででも調節することができる。遺伝子発現の調節は、例えば転写、翻訳、ＲＮＡの輸送及びプロセシング、ｍＲＮＡ等の中間分子の分解に作用する調節、あるいは製作された後の特異的蛋白質分子の活性化、不活性化、区画化、または分解またはそれらの組み合わせによって発生する。遺伝子発現は、これらに限定はされないが、ノーザンブロット、ＲＴ-ＰＣＲ、ウエスタンブロット、またはインビトロ、インシトゥー、あるいはインビボ蛋白質活性アッセイ(複数)を含む当該技術分野で公知の任意の方法によってＲＮＡレベルまたは蛋白質レベルで測定することができる。
本明細書で使用されるとき、「相同性ベースの遺伝子サイレンシング（ＨＢＧＳ）」は転写性遺伝子サイレンシング及び転写後遺伝子サイレンシングの両方を含む総称である。非連結サイレンシング遺伝子座による標的遺伝子座のサイレンシングは、プロモータまたは転写配列に一致する2本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)の生成に起因して、転写阻害（転写性遺伝子サイレンシング;ＴＧＳ）またはｍＲＮＡ分解（転写後遺伝子サイレンシング;ＰＴＧＳ）から生じる場合がある。各工程における異なる細胞構成要素の関与は、ｄｓＲＮＡによって誘導されるＴＧＳ及びＰＴＧＳが、おそらく先祖の共通メカニズムの多様化から生じることを示唆する。しかし、ＴＧＳ及びＰＴＧＳの厳格な区画化は、それが別個のサイレンシング遺伝子座の分析に依存することから達成は困難であった。いくつかの例で、単一導入遺伝子の遺伝子座が、異なる標的遺伝子のプロモータ及び転写配列に相当するｄｓＲＮＡの生成によって、ＴＧＳ及びＰＴＧＳ両方を起動させることができる。Ｍｏｕｒｒａｉｎ ｅｔ ａｌ. （２００７） Ｐｌａｎｔａ ２２５：３６５−７９．ｓｉＲＮＡは相同配列にＴＧＳ及びＰＴＧＳを起動する実際の分子の可能性があり、本モデルではｓｉＲＮＡが、内因性プロモータへの導入遺伝子配列の拡張またはメチル化によってシス及びトランスで相同配列のサイレンシング及びメチル化を起動するだろう。
本明細書で使用されるとき、「核酸分子」（または「核酸」または「ポリヌクレオチド」）という用語はヌクレオチドの高分子形を指し、ＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡならびに上記の合成形態及び混合高分子を挙げることができる。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはヌクレオチドのいずれかのタイプの修飾形を指す。本明細書で使用されるとき、「核酸分子」は「核酸」及び「ポリヌクレオチド」と同義である。特に明記しない限り、核酸分子は通常長さが少なくとも１０塩基である。前記用語は不確定の長さのＲＮＡまたはＤＮＡの分子を指してもよい。前記用語はＤＮＡの１本鎖及び２本鎖の形を含む。核酸分子は、自然に発生するおよび／または非自然に発生するヌクレオチド結合によって共に連結された自然発生ヌクレオチド及び修飾ヌクレオチドのいずれかまたは両方を含んでもよい。
核酸分子は、当業者によって容易に特性化される化学的または生化学的に修飾されてもよく、あるいは非自然または誘導体化ヌクレオチド塩基を含んでもよい。そのような修飾としては、例えば、標識、メチル化、自然発生ヌクレオチドの類似体による１つ以上の置換、ヌクレオチド間修飾（例えば無電荷結合：例えばメチルホスホナート、リン酸トリエステル、ホスホラミダイト、カルバマート等；荷電結合：例えばホスホナート、ホスホロジチオアート等；側鎖部分：ペプチド；インターカレータ：例えば、アクリジン、ソラレン等；キレーター；アルキル化剤；及び修飾連結；例えばα‐アノマ核酸等）を挙げることができる。また、「核酸分子」という用語は、一本鎖、二本鎖、部分的に二重、三重、ヘアピン型、円形及び南京錠型立体配座を含む位相幾何学立体配座も含む。
転写はＤＮＡ鎖に沿って５′から３′に進行する。これは、ＲＮＡが成長鎖のリボヌクレオチド-５′‐三リン酸から３′末端の逐次付加（ピロリン酸の必要な脱離によって）によって作製されることを意味する。線形または環状核酸分子のいずれでも、分離したエレメント（例えば、特定のヌクレオチド配列）は更なるエレメントに対して「上流」または「５′」にあると称してもよいのは、それらがそのエレメントから５′方向に同じ核酸に結合する場合、または結合する可能性ある場合である。 同様に、分離したエレメントが更なるエレメントに対して「下流」または「３′」であるとしてよいのは、そのエレメントから３′方向に同じ核酸に結合する場合、または結合する可能性ある場合である。
本明細書で使用される塩基「位置」は指定した核酸内に与えられた塩基またはヌクレオチド残基の位置を指す。指定された核酸は、基準核酸による整列化（下記参照）によって定義することができる。
ハイブリッド化は水素結合を介した２つのポリヌクレオチド鎖の結合と関連する。オリゴヌクレオチド及びそれらの類似体は、相補的塩基の間でワトソン・クリック型、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型水素結合を含む水素結合によって対合する。一般に、核酸分子はピリミジン（シトシン(Ｃ)、ウラシル(Ｕ)、及びチミン(Ｔ)）またはプリン（アデニン(Ａ)及びグアニン(Ｇ)）のいずれかの窒素性塩基からなる。これらの窒素性塩基がピリミジン及びプリン間の水素結合を形成し、プリンへのピリミジンの結合が「塩基対」と称される。より詳しくは、ＡはＴまたはＵに水素結合し、ＧはＣに結合する。「相補性」は、２つの分離した核酸配列または同じ核酸配列の２つの別個の領域の間で発生する塩基の対合を意味する。
「本質的ハイブリッド化」及び「本質的相補性」は、例えば、オリゴヌクレオチドとＤＮＡまたはＲＮＡ標的の間に安定な特異的結合が生じる十分の相補性度を示す用語である。オリゴヌクレオチドは、本質的にハイブリッド化する標的配列と１００％相補的である必要はない。オリゴヌクレオチドは、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子へのオリゴヌクレオチドの結合が標的ＤＮＡまたはＲＮＡの正常機能と干渉するときに実質的にハイブリッド化する。また、特異的結合が望まれる場合の条件、例えばインビボアッセイまたはシステムのケースでは生理的条件下で非標的配列へのオリゴヌクレオチドの非特異的結合を回避するのに十分な相補性度がある。そのような結合は特異的ハイブリッド化と称される。
特定の厳密性度が得られるハイブリッド化条件は、選択されるハイブリッド化方法の本質ならびにハイブリッド化する核酸配列の成分及び長さに依存して変化するであろう。一般に、ハイブリッド化温度及びハイブリッド化緩衝剤のイオン強度（特にＮａ＋及び／またはＭｇ２＋濃度）がハイブリッドの厳密性に寄与するが、洗浄時間も厳密性に影響する。特定の厳密性度を達成するために必要なハイブリッド化条件に関する計算はＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．， ｖｕｌｏｌ． １−３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９， ｃｈｓ． ９ ａｎｄ １１．で考察されている。
本明細書で使用されるとき、「厳密な条件」は、ハイブリッド化分子とＤＮＡ標的の間に５０％未満で不一致がある場合にのみハイブリッド化が起きる条件を含む。「厳密な条件」は、厳密さのさらなる特有のレベルを含む。従って、本明細書で使用されるとき、「中程度の厳密さ」の条件は５０％以上の配列不一致をもつ分子はハイブリッド化しない条件下のものであり；「高い厳密さ」の条件は、２０％以上の不一致をもつ配列はハイブリッド化しない条件下のものであり;及び、「非常に高い厳密さ」の条件は１０％以上の不一致をもつ配列はハイブリッド化しない条件下のものである。
特定の実施形態において、厳密な条件は、６５℃でハイブリッド化し、続いて６５℃で４０分間、０．１ｘ ＳＳＣ/０．１％ＳＤＳで洗浄することを含みうる。
以下は、代表的な非限定的ハイブリッド化条件である：
非常に高い厳密さ：１６時間、６５℃で５ｘ ＳＳＣ緩衝剤中ハイブリッド化;１５分間、室温で２ｘ ＳＳＣ緩衝剤中 ２回洗浄;及び２０分間、６５℃で０．５ｘ ＳＳＣ緩衝剤中２回 洗浄。
高い厳密さ：１６〜２０時間、６５〜７０℃で５ｘ〜６ｘＳＳＣ緩衝剤中ハイブリッド化; ５〜２０分間、室温で２ｘ ＳＳＣ緩衝剤中２回洗浄；及び、３０分間、５５〜７０℃で１ｘ ＳＳＣ緩衝剤中 ２回洗浄。
中度の厳密さ：１６-２０時間、室温〜 ５５℃で６ｘ ＳＳＣ緩衝剤中ハイブリッド化;２０〜３０分間、室温〜 ５５℃で２ｘ〜３ｘ ＳＳＣ緩衝剤中少なくとも２回洗浄。
特定の実施形態において、本質的なハイブリッド化が可能な核酸分子は、非常に高い厳密なハイブリッド化条件下で拘束が維持される場合がある。これらの実施形態及びさらなる実施形態において、本質的なハイブリッド化が可能な核酸分子は、高い厳密なハイブリッド化条件下で拘束が維持される場合がある。これらの実施形態及びさらなる実施形態において、本質的なハイブリッド化が可能な核酸分子は、中度に厳密なハイブリッド化条件下で拘束が維持される場合がある。
オリゴヌクレオチド：オリゴヌクレオチドは短い核酸ポリマーである。オリゴヌクレオチドは、より長い核酸セグメントの切断、または個別のヌクレオチド前駆体を重合させることによって形成することができる。自動合成器によってオリゴヌクレオチドは最大数百の塩基対の長さまで合成が可能である。オリゴヌクレオチドは相補的ヌクレオチド配列に結合することができるため、ＤＮＡまたはＲＮＡを検出するためのプローブとして使用してもよい。ＤＮＡから構成されたオリゴヌクレオチド（オリゴデオキシリボ核酸）は、小型のＤＮＡ塩基配列の増幅技術のＰＣＲに使用することができる。ＰＣＲでは、オリゴヌクレオチドは一般的に、ＤＮＡポリメラーゼがオリゴヌクレオチドを延長して相補鎖を複製することを可能にする「プライマー」と称される。
本明細書で使用されるとき、２つの核酸またはポリペプチド配列の文脈の中で本明細書で使用される「配列同一性」または「同一性」は、特定のＣｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ｗｉｎｄｏｗ上で最大一致のために整列化させたときに同一である２つの配列中の残基と称すことができる。
本明細書で使用されるとき、「配列同一性の比率」という用語は、Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ｗｉｎｄｏｗ上で２つの最適に整列化させた配列（例えば、核酸配列及びアミノ酸配列）を比較することによって決定される値を指すことができ、Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ｗｉｎｄｏｗで配列の一部が２つの配列の最適アラインメントと基準配列（付加または欠失を含まない）を比較したときに付加または欠失（すなわち間隙）を含む場合がある。 前記比率は、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が両方の配列で発生する位置の数を測定することによって計算され、一致した位置の数を得て、Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ｗｉｎｄｏｗでの位置総数で一致した位置の数を割り、次いでその結果に１００を掛けて配列同一の比率を得る。
比較のための配列を整列化する方法は当該技術分野において周知である。例えば、種々のプログラム及びアラインメントアルゴリズムが、以下：Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ （１９８１） Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３；Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ （１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４；Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ（１９８８）Ｇｅｎｅ７３：２３７−４４；Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−３；Ｃｏｒｐｅｔｅｔ ａｌ. （１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：１０８８１−９０； Ｈｕａng et al. （１９９２）Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１５５−６５；Ｐｅａｒｓｏｎｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３１；Ｔａｔｉａｎａｅｔ ａｌ．（１９９９）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−５０に記載されている。配列アラインメント方法及びホモロジー計算の詳細な考察は、例えば．，Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔ ａｌ． （１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０に見出すことができる。
国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）基礎的局所アラインメントツール （ＢＬＡＳＴ（商標）;Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔ ａｌ．国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）基礎的局所アラインメントツール （ＢＬＡＳＴ（商標）;Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔ ａｌ．（１９９０））は、幾つかの配列分析プログラムを接続して使用するために、国立生物工学情報センター（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）及びインターネットを含む幾つかのソースから利用することができる。このプログラムを使用して配列同一性を決定する方法の記載は、ＢＬＡＳＴ（商標）の「ヘルプ」セクション下のインターネットで入手することができる。核酸配列の比較では、ＢＬＡＳＴ（商標）（Ｂｌａｓｔｎ）プログラムの機能「Ｂｌａｓｔ２配列」を、デフォルトパラメータを使用して利用してもよい。基準配列と一層大きく類似した核酸配列は、この方法で評価したときに比率の同一性が上昇することを示すであろう。
本明細書で使用されるとき、「作用可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」という用語は、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的な関係にあるときに、第１の核酸配列が第２の核酸配列と作用可能に連結されることを意味する。例えば、プロモータがコード化配列の転写または発現に影響を及ぼすときに、プロモータがコード化配列と作用可能に連結される。遺伝子組換的に作製されるとき、作用可能に連結された核酸配列は一般に隣接し、同じ読み枠の中で２つの蛋白質コード領域を結合する必要性がある。しかし、エレメントは作用可能に隣接する必要なない。
本明細書で使用されるとき、プロモータ（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」という用語は、一般に遺伝子の上流（遺伝子の５′領域の方）に位置し、遺伝子の転写を開始及び促進するために必要とされるＤＮＡの領域を指す。プロモータは調節する遺伝子の活性化または抑制を可能にすることができる。プロモータは、転写因子によって認識される特異的配列を含むことができる。これらの因子はプロモータＤＮＡ配列に結合することができ、その結果、遺伝子のコード領域からＲＮＡを合成する酵素ＲＮＡポリメラーゼの動員をもたらす。プロモータは、一般に、上流プロモータ、５′‐ＵＴＲ、イントロン及びリーダー配列を含む遺伝子の上流に位置する全遺伝子調節エレメントを指す。
本明細書で使用されるとき、「上流‐プロモータ（ｕｐｓｔｒｅａｍ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」という用語は、転写の開始を命令するのに十分な隣接ポリヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用されるとき、上流‐プロモータは、ＴＡＴＡボックス、イニシエーター配列、ＴＦＩＩＢ認識エレメント及び他のプロモータモチーフ（（Ｊｅｎｎｉｆｅｒ，Ｅ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，（２００２） Ｇｅｎｅｓ＆ｄｅｖ．，１６：２５８３−２５９２）を含む幾つかの配列モチーフをもつ転写の開始部位を包含する。上流プロモータは、ＴＦＩＩＡ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＨ等の基本的または一般的転写因子をもつマルチサブユニット酵素であるＲＮＡポリメラーゼＩＩに作用部位を提供する。 これらの因子は、ＤＮＡテンプレートからＲＮＡの合成を触媒する転写プレ開始複合体を組み立てる。
上流‐プロモータの活性化は、種々の蛋白質が結合し、次いで転写開始複合体と相互作用して遺伝子発現を活性化させる、調節性ＤＮＡ配列エレメントの追加的配列によって行われる。これらの遺伝子調節エレメント配列は、特異的ＤＮＡ結合因子と相互作用する。これらの配列モチーフは、時々シス‐エレメントと称され得る。組織特異的または成長特異的転写因子が個別にまたは組合せで結合するそのようなシス‐エレメントは、転写レベルでプロモータの空間時間的発現パターンを決定することができる。これらのシス‐エレメントは、作用可能に連結された遺伝子上で出す調節タイプで大きく変化する。いくつかのエレメントは、環境応答（例えば、温度、湿度及び損傷）に応じて作用可能に連結された遺伝子の転写を増加させるように作用する。 他のシス‐エレメントは、発達上の合図（例えば、発芽、種成熟及び開花）または、空間的情報（例えば、組織特異性）に反応するかもしれない。例えば、Ｌａｎｇｒｉｄｇｅｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：３２１９−２３.を参照されたい。これらのシス‐エレメントは転写開始点からさまざまな距離に位置し、いくつかのシスエレメント（近位エレメントと称す）はミニマルコアプロモータ領域に隣接する一方、他のエレメントはプロモータ（エンハンサー）の数キロベース上流または下流に位置する場合がある。
本明細書で使用されるとき、「５′非翻訳領域」または「５′−ＵＴＲ」という用語は、プレｍＲＮＡまたは成熟ｍＲＮＡの５′末端の非翻訳セグメントと定義される。例えば、成熟ｍＲＮＡでは５′-ＵＴＲが一般的にその５′末端７-メチルグアノシンキャップ上に宿り、スプライシング、ポリアデニル化、細胞原形質へのｍＲＮＡ輸出、翻訳機構によるｍＲＮＡの５′末端の識別、及びｍＲＮＡの分解保護等の多くの工程に関与する。
本明細書で使用されるとき、「転写ターミネーター」という用語は、プレｍＲＮＡまたは成熟ｍＲＮＡの３′末端の転写セグメントと定義される。例えば、「ポリアデニル化シグナル」部位を超えたＤＮＡのより長いひと配列がプレｍＲＮＡとして転写される。このＤＮＡ配列は、通常成熟ｍＲＮＡへの適切なプレｍＲＮＡプロセシングのための転写終結シグナルを含む。
本明細書で使用されるとき、「３′‐非翻訳領域」または「３′-ＵＴＲ」という用語は、プレｍＲＮＡまたは成熟ｍＲＮＡの３′末端の非翻訳セグメントと定義される。例えば、成熟ｍＲＮＡでは、この領域はポリＡ鎖を担持し、ｍＲＮＡ安定性、翻訳開始及びｍＲＮＡ輸出で多くの役割をもつことが知られている。加えて、３′-ＵＴＲはポリアデニル化シグナル及び転写ターミネータを含むと考えられている。
本明細書で使用されるとき、「ポリアデニル化シグナル」という用語は、ポリ-(Ａ)ポリメラーゼの存在で、転写産物が、例えばポリ-(Ａ)シグナルの１０〜３０下流に位置するポリアデニル化部位上でポリアデニル化されるのを可能にする、ｍＲＮＡ転写産物に存在する核酸配列を意味する。多くのポリアデニル化シグナルは当技術分野において公知であり、本発明に有用である。例示的な配列としては、Ｌｏｋｅ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．， （２００５）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ１３８（３）；１４５７−１４６８に記載されているようにＡＡＵＡＡＡ及びその変異体を挙げることができる。
「ＤＮＡ結合導入遺伝子」は、ＤＮＡ結合蛋白質をコード化するポリヌクレオチドコード化配列である。ＤＮＡ結合蛋白質はその後別の分子に結合できる。結合蛋白質は、例えばＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合蛋白質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合蛋白質）、及び／または蛋白質分子（蛋白質結合蛋白質）に結合できる。蛋白質結合蛋白質の場合、それ自身に結合（ホモダイマー、ホモトリマーなどを形成する） 及び／または異なる蛋白質または蛋白質類の１つ以上の分子と結合できる。結合蛋白質は、１つ以上の結合活性タイプをもつ場合がある。例えば、亜鉛フィンガータンパク質はＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合、及び蛋白質結合活性を有する。
ＤＮＡ結合蛋白質の例としては、予定されたヌクレオチド配列に結合するように「設計」が可能な、メガヌクレアーゼ、Ｚｎフィンガー、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインを挙げることができる。一般的に、設計されたＤＮＡ結合蛋白質（例えば、Ｚｎフィンガー、ＣＲＩＳＰＲ、またはＴＡＬＥ）は天然由来の非自然発生的な蛋白質である。. ＤＮＡ結合蛋白質の工学方法の非限定例は設計及び選別である。設計されたＤＮＡ結合蛋白質は、その設計／組成物結果が主に合理的な基準から得られる本質で発生しない蛋白質である。設計の合理的な基準は、既存のＺＦＰ、ＣＲＩＳＰＲ、及び／またはＴＡＬＥ設計及び結合データのデータベース格納情報におけるプロセシング情報の置換規則及び計算機化アルゴリズムの利用を含む。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号、 6,453,242号及び６，５３４，２６１号を参照されたい。また、ＷＯ９８／５３０５８;ＷＯ９８／５３０５９;ＷＯ９８／５３０６０;ＷＯ０２／０１６５３６、及びＷＯ０３／０１６４９６ならびに米国公報第２０１１０３０１０７３号、２０１１０２３９３１５号及び２０１１９１４５９４０号を参照されたい。
「ＺｎフィンガーＤＮＡ蛋白質」（または結合ドメイン）は、１つ以上のＺｎフィンガーによって配列特異的態様でＤＮＡに結合し、その構造が亜鉛イオンの配位によって安定化される結合ドメイン内のアミノ酸領域である、蛋白質または大きな蛋白質内のドメインである。用語ＺｎフィンガーＤＮＡ結合蛋白質は、しばしばＺｎフィンガータンパク質またはＺＦＰと略される。Ｚｎフィンガー結合ドメインは、予定されたヌクレオチド配列に結合するように「設計」することができる。Ｚｎフィンガータンパク質を工学方法の非限定例は設計と選別である。設計されたＺｎフィンガータンパク質は、その設計／組成物が合理的な基準から得られる本質で発生しない蛋白質である。設計の合理的な基準は、既存のＺＦＰ設計及び結合データのデータベース格納情報におけるプロセシング情報の置換規則及び計算機化アルゴリズムの利用を含む。例えば、米国特許 第６,１４０,０８１号、６，４５３，２４２号、６，５３４，２６１号および６，７９４，１３６号を参照されたい。また、ＷＯ９８／５３０５８、ＷＯ９８／５３０５９、ＷＯ９８／５３０６０、ＷＯ０２／０１６５３６及びＷＯ０３／０１６４９６を参照されたい。
他の例では、１つ以上のヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインが自然発生的または設計された（非自然発生的）ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、参照によりその全体が本明細書に援用される［3］米国特許公報第２０１１０３０１０７３号を参照されたい。属キサントモナスの植物病原菌は重要な作物で多くの病害を引き起こすことが知られている。キサントモナス属の病原性は、植物細胞により大きい異なるエフェクター蛋白質を注入する保存ＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）システムに依存する。これらの注入された蛋白質の中には植物転写活性化因子を模倣し、植物トランスクリプトームを操作する転写活性化因子（ＴＡＬＥＮ）エフェクターがある(Ｋａｙｅｔ ａｌ．， （２００７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：６４８−６５１)を参照）。これらの蛋白質はＤＮＡ結合ドメイン及び転写活性化ドメインを含む。最もよく特徴づけられたＴＡＬエフェクターの１つはＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｇｒｉｓｐｖ．Ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ由来のＡｖｒＢｓ３である。Vesicatoria （Ｂｏｎａｓｅｔ ａｌ．， （１９８９）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ２１８：１２７−１３６及びＷＯ２０１００７９４３０を参照)。 ＴＡＬエフェクターはタンデムリピートの集中化ドメインを含み、各反複が蛋白質のＤＮＡ結合特異性に重要な約３４個のアミノ酸を含む。加えて、それらは核局在化配列及び酸性転写性活性化ドメインを含む（レビューに関しては、Ｓｃｈｏｒｎａｃｋ Ｓ、et al., （２００６） Ｊ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １６３（３）： ２５６−２７２を参照)。 加えて、植物病原性細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍでは、２つの遺伝子、いわゆるbrg11 及びｈｐｘ１７は、キサントモナス属のＡｖｒＢｓ３ファミリーに相同であることがわかった。キサントモナス属は以下、Ｒ. ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ生物型株ＧＭＩ１０００及び生物型４株ＲＳ１０００に属する（Ｈｅｕｅｒｅｔ ａｌ．，（２００７）Ａｐｐｌ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏ ｍｉｃｒｏ７３（１３）：４３７９−４３８４を参照)。 これらの遺伝子は、互いにヌクレオチド配列で９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７の繰り返しドメインで１，５７５ｂｐの欠失によって異なる。しかし、両方の遺伝子産物は、キサントモナス属のＡｖｒＢｓ３ファミリー蛋白質と４０％未満の配列同一性をもつ。例えば、参照によりその全体が援用される米国特許公報第２０１１０３０１０７３号を参照されたい。
これらのＴＡＬエフェクターの特異性は、タンデムリピートで発見された配列に依存する。反復配列は、およそ１０２ｂｐを含み、繰り返しは一般的に相互に９１〜１００％相同である（Ｂｏｎａｓ ｅｔ ａｌ．，ｉｂｉｄ）. 反復多型は、通常位置１２及び１３に位置する。ＴＡＬエフェクターの標的配列で隣接するヌクレオチドの同一性に関して、位置１２と位置１３との高頻度可変性両残基の同一性は１対１対応に見える（Ｍｏｓｃｏｕ ａｎｄ Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ，（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ３２６：１５０１ ａｎｄ Ｂｏｃｈet al., （２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ３２６：１５０９−１５１２参照)。これらのＴＡＬエフェクターのＤＮＡ認識の自然コードは、位置１２及び１３のＨＤ配列がシトシン(Ｃ)に結合、ＮＧがＴに結合、ＮＩがＡ、Ｃ、ＧまたはＴに結合、ＮＮがＡまたはＧに結合、及びＩＮＧがＴに結合するように測定する。これらのＤＮＡ結合反復は、新組合せ及び反復の数をもった蛋白質に組み立てられ、新たな配列と相互作用し、また植物細胞の非内因性リポーター遺伝子の発現を活性化することができる人工の転写因子を作製する（Ｂｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，ｉｂｉｄ）。設計されたＴＡＬ蛋白質は、ＦｏｋＩ切断半ドメインに連結し、酵母リポーターアッセイ（プラスミドベース標的）で活性を示すＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ融合（ＴＡＬＥＮ）が得られる。
ＣＲＩＳＰＲ（クリスパー）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連遺伝子群）ヌクレアーゼシステムは、ゲノム工学に利用可能な細菌株に基づいて最近設計されたヌクレアーゼシステムである。これは多くの細菌及び古細菌の適応性免疫応答の一部に基づく。ウイルスまたはプラスミドが細菌に侵入するときに侵入者のＤＮＡセグメントが「免疫」反応によってＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）に変換される。次いで、このｃｒＲＮＡは部分的相補性の領域を介して別のタイプのＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡと称される）と会合し、「ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ」と呼ばれる標的ＤＮＡ中のｃｒＲＮＡと相同な領域にＣａｓ９ヌクレアーゼを誘導する。Ｃａｓ９は、ｃｒＲＮＡ転写産物内に含まれる２０‐ヌクレオチドガイド配列によって特定化される部位での二重鎖切断（ＤＳＢ）でＤＮＡを裂き平滑末端を生じる。Ｃａｓ９は、部位特異的ＤＮＡ認識及び切断にはｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの両方を必要とする。このシステムは、現在ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡが１分子（「単一ガイドＲＮＡ」）に結合するように設計されており、単一ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ等価部分がＣａｓ９ヌクレアーゼを誘導し、任意の望ましい配列を標的化する設計が可能である（Ｊｉｎｅｋｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ３３７，ｐｐ．８１６−８２１，Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，（２０１３），ｅＬｉｆｅ ２：ｅ００４７１，ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｓｅｇａｌ, (2013) eLife 2:e00563を参照)。従って、ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓシステムを設計し、ゲノムの望ましい標的でＤＳＢを作製することが可能であり、ＤＳＢの修復は修復阻害剤の使用に影響を受け、誤りがちな修復（ｅｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ ｒｅｐａｉｒ）の増加を引き起こす場合がある。
他の例では、ＤＮＡ結合導入遺伝子は、設計された（非自然発生的）メガヌクレアーゼを含む部位特異的ヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼとも記載）である。ホーミングエンドヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼの認識配列、例えばI−ＳｃｅＩ、Ｉ−CeuＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Sce、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−Csm}Ｉ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ及びＩ−ＴｅｖＩＩＩが知られている。以下も参照されたい、米国特許第５,４２０,０３２号;米国特許第６,８３３,２５２；Ｂｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９-３０３３８８；Ｄｕｊｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８９） Ｇｅｎｅ ８２：１１５-１１８；Ｐｅｒｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，１１１２７；Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４-２２８；Ｇｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）J．ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２６３：１６３-１８０； Ａｒｇａｓｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）J．Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ．２８０：３４５-３５３ ａｎｄ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ｃａｔａｌｏｇｕｅ．加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性を非自然発生的に結合するように設計することができる。以下を参照されたい、、例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ １０：８９５−９０５；Ｅｐｉｎａｔ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．５ ３１：２９５２−２９６２；Ａｓｈｗｏｒｔｈｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：６５６−６５９；Ｐａｑｕｅｓ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ７：４９−６６；Ｕ．ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．２００７０１１７１２８．ホーミングエンドヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、全体としてヌクレアーゼの文脈で変化させる（すなわち、例えばヌクレアーゼが同族の切断ドメインを含む）、あるいは異種の切断ドメインへ融合させることができる。
本明細書で使用されるとき、「形質転換」という用語は、核酸分子を細胞等に導入することができる全技術を包含する。例としては、ウイルスベクターによるトランスフェクション；プラスミドベクトルによる形質転換；エレクトロポレーション；リポフェクション；マイクロインジェクション（Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ.,（１９７８） Ｃｅｌｌ １５：５７９−８５）；アグロバクテリウム媒介移入；直接ＤＮＡ取込み;ウイスカー（商標）媒介形質転換；及び微粒子銃を挙げることができるが、これらに限定されない。これらの技術は、植物細胞の安定した形質転換及び過渡的形質転換の両方で使用することができる。「安定な形質転換」は、遺伝的に安定した継承を生じる宿主生物体のゲノムへの核酸断片の導入を意味する。一旦安定に形質転換すると、核酸断片が宿主生物体及び任意の次世代のゲノムに安定に取り込まれる。形質転換した核酸断片を含む宿主生物体は「トランスジェニック」生物体と呼ばれる。「過渡的形質転換」は、遺伝的に安定した継承がない遺伝子発現を生じる宿主生物体の核またはＤＮＡ含有オルガネラへの核酸断片の導入を意味する。
外因的な核酸配列。１つの例では、導入遺伝子は、遺伝子配列（例えば、除草剤耐性遺伝子）、産業的または薬学的に有用な化合物をコード化する遺伝子、または望ましい農業形質をコード化する遺伝子である。さらに別の例では、導入遺伝子は、アンチセンス核酸配列の発現が標的核酸配列の発現を阻害するアンチセンス核酸配列である。導入遺伝子は、導入遺伝子に作用可能に連結された調節配列を含むことができる（例えば、プロモータ）。いくつかの実施形態において、対象のポリヌクレオチド配列は導入遺伝子である。しかし、他の実施形態において、対象のポリヌクレオチド配列は、内因性核酸配列の追加的ゲノムコピーが望ましい内因性核酸配列であり、または、宿主生物体で標的核酸分子の配列に対してアンチセンス方向にある核酸配列である。
本明細書で使用されるとき、用語のトランスジェニック「事象」は異種ＤＮＡによる植物細胞の形質転換によって作製され、すなわち対象の導入遺伝子を含む核酸構築物、植物ゲノムへの導入遺伝子の挿入で生じる植物群の再生、及び特定のゲノム位置への挿入によって特徴付けられる特定の植物の選別である。用語「事象」は、異種のＤＮＡを含む原始形質転換体及び形質転換体の子孫を指す。また、用語「事象」は、形質転換体とゲノム/導入遺伝子ＤＮＡを含む別の品種との有性他殖によって産生される子孫も指す。反復親への繰り返し戻し交雑の後でも、形質変換された親からの挿入導入遺伝子ＤＮＡ及び近傍のゲノムＤＮＡ（ゲノム/導入遺伝子ＤＮＡ）が交雑種の子孫の同じ染色***置に存在する。また、用語「事象」は、挿入ＤＮＡを含む一つの親系列（例えば原始形質転換体と自殖で生じた子供）及び挿入ＤＮＡを含まない親系列の雄***雑の結果としての対象の導入遺伝子を含め、挿入ＤＮＡを受ける子孫へ伝達されることが期待されている挿入ＤＮＡ及び挿入ＤＮＡの直近に位置する近傍ゲノム配列を含む原始形質転換体及びその子孫からのＤＮＡも指す。
本明細書で使用されるとき、「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」という用語は、微量の核酸、ＲＮＡ及び／またはＤＮＡが１９８７年７月２８出願の米国特許第４，６８３，１９５号に記載のように増幅される手順または技術を定義する。 一般に、例えばオリゴヌクレオチドプライマが設計できるように、関心領域またはそれを超えた配列情報を入手する必要があり、すなわちこれらのプライマーは増幅される鋳型の反対鎖の配列に同一または類似であろう。２つのプライマーの５′末端ヌクレオチドは増幅される材料の末端と一致してもよい。ＰＣＲを使用して、特異的ＲＮＡ配列、総ゲノムＤＮＡからの特異的ＤＮＡ配列、及び全細胞内ＲＮＡから転写されるｃＤＮＡ、バクテリオファージまたはプラスミド配列等を増幅することができる。一般に、Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５１：２６３（１９８７）；Ｅｒｌｉｃｈ， ｅｄ．，ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９）を参照されたい。
本明細書で使用されるとき、用語「プライマー」は、条件がプライマー伸長産物の合成に好適なときに、相補鎖に沿って合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを指す。合成条件は、４つの異なるデオキシリボヌクレオチド三燐酸及び、例えば逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼ等の少なくとも１つの重合誘導剤の存在を含む。これらは、補助因子の成分を含む緩衝剤または種々の好適な温度でのｐＨ等の条件に影響を及ぼす適切な緩衝剤中に存在する。プライマーは、好ましくは増幅効率は最適化されるような１本鎖であるが、２本鎖配列も利用できる。
本明細書で使用されるとき、用語「プローブ」は標的配列にハイブリッド化するオリゴヌクレオチドを指す。ＴａｑＭａｎ（登録商標）またはＴａｑＭａｎ（登録商標）-スタイル 検査手技では、プローブは、２つのプライマーのアニーリング部位の間に位置する標的の一部にハイブリッド化する。プローブは、約８個のヌクレオチド、約１０個のヌクレオチド、約１５個のヌクレオチド、約２０個のヌクレオチド、約３０個のヌクレオチド、約４０個のヌクレオチド、または約５０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、プローブは約８個のヌクレオチド〜約１５個のヌクレオチドを含む。更に、プローブは、検出可能な標識、例えば発蛍光団（Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ（登録商標）、フルオレッセインイソチオシアネートなど）を含む。検出可能な標識は、例えばプローブの５′末端またはプローブの３′末端に位置するプローブオリゴヌクレオチドに直接共有結合することができる。また、蛍光団を含むプローブは、例えばＢｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（商標）等のクエンチャを備えてもよい。
本明細書で使用されるとき、「制限酵素」及び「制限エンドヌクレアーゼ」という用語は細菌酵素を指し、個々の酵素が特定のヌクレオチド配列または近傍で二本鎖ＤＮＡを切断する。２型制限酵素は同部位でＤＮＡを認識し切断し、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ、Ｓａｌｉ、ＫｐｎＩ、ＡｖａＩ、ＰｓｔＩ及びＳｍａＩが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、用語「ベクター」は、用語「構築物」、「クローニングベクター 」及び「発現ベクター」と交互に用いられ、宿主を形質転換する、あるいは導入された配列の発現（例えば、転写及び翻訳）を促進するために、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）が宿主細胞に導入される場合の媒体を意味する。「非ウイルスベクター」は、ウイルスまたはレトロウィルスを含まないあらゆるベクターを意味することが意図される。いくつかの実施形態において、「ベクター」は、ＤＮＡ複製の少なくとも１つの起源及び少なくとも１つの選択マーカー遺伝子を含む一連のＤＮＡである。例としては、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体（ＢＡＣ）または細胞に外因的ＤＮＡを運ぶウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。また、ベクターは、１つ以上の遺伝子、アンチセンス分子、及び／または選択マーカー遺伝子ならびに当技術分野においては公知の他の遺伝エレメントを含むことができる。ベクターが形質導入、形質転換または細胞する細胞に感染し、それによって、細胞が核酸分子及び／またはベクターによってコード化された蛋白質を発現することができる。用語「プラスミド」は、原核生物または真核生物のいずれかの宿主細胞で常染色体複製が可能な核酸の環状鎖と定義する この用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡのどちらでもよい、また１本鎖または２本鎖でもよい核酸を含む。また、定義のプラスミドは細菌性複製開始点と一致する配列も含むことができる。
本明細書で使用されるとき、本明細書で使用される用語「選択マーカー遺伝子」は、選択マーカー遺伝子が挿入される細胞の認識を容易にする蛋白質をコード化する遺伝子または他の発現カセットと定義する。例えば、「選択マーカー遺伝子」はリポーター遺伝子ならびに例えば、選択剤から植物細胞を保護する、または選択剤に耐性／抵抗性を提供するために植物形質転換で使用される遺伝子を含む。１つの実施形態において、機能的な選択マーカーを受けるこれらの細胞または植物だけが選択剤を持つ条件下で隔離または増殖することができる。選択剤の例としては、例えばスペクチノマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、パロモマイシン、ゲンタマイシン及びハイグロマイシンを含む抗生物質を挙げることができる。これらの選択マーカーは、抗生物質カナマイシン耐性を付与する酵素を発現するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔ ＩＩ）、関連抗生物質ネオマイシン、パロモマイシン、ゲンタマイシン及びＧ４１８の遺伝子、あるいはハイグロマイシン耐性を付与する酵素を発現するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）の遺伝子を含む。他の選択マーカー遺伝子としては、barまたはpat（グルフォシネートアンモニウムまたはフォスフィノスリシン耐性）、アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ、例えばスルホニル尿素（ＳＵ）、イミダゾリノン（ＩＭＩ）、トリアゾロピリミジン（ＴＰ）、ピリミジニルオキシベンゾエート（ＰＯＢ）及び分岐鎖アミノ酸合成の第1工程を回避するスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン）、グリフォセート、２,４-Ｄ及び金属抵抗性または感受性を含む除草剤耐性コード化遺伝子を挙げることができる。選択マーカー遺伝子として使用できる「リポーター遺伝子」の例は、発現したリポーター遺伝子蛋白質（例えば、β-グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、をコード化している蛋白質、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アルカリ性ホスファターゼ等）の目視観測を含む。句「マーカー陽性」は、選択マーカー遺伝子を含むように形質転換された植物を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「検出可能なマーカー」は、例えばラジオアイソトープ、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレーターまたは酵素等の検出可能な標識を指す。検出可能なマーカーの例としては、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン光体）、酵素標識（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ）、化学発光、ビオチニル群、第二リポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）が挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、検出可能なマーカーは、強力な立体障害を減少させるさまざまな長さのスペーサーアームを結合させることができる。
本明細書で使用されるとき、「カセット」、「発現カセット」及び「遺伝子発現カセット」という用語は、特異的制限部位の核酸またはポリヌクレオチドへ挿入される、または相同組み換えによって挿入されるＤＮＡセグメントを指す。本明細書で使用されるとき、ＤＮＡのセグメントは対象のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含み、カセット及び制限部位は、転写及び翻訳のための適当な読み枠にカセットの挿入を確実にするように設計される。１つの実施形態において、発現カセットは、対象のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含み、また特定の宿主細胞の形質転換を容易化するポリヌクレオチドに加えてエレメントをもつことができる。１つの実施形態において、遺伝子発現カセットは宿主細胞における対象のポリヌクレオチドをコード化するポリヌクレオチドの発現を高めることを可能にするエレメントを含んでもよい。これらのエレメントは、プロモータ、最小プロモータ、エンハンサー、応答エレメント、終了配列、ポリアデニル化配列等が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「リンカー」または「スペーサ」は、２つの別々の個体を互いに結び付ける結合、分子または分子群である。リンカー及びスペーサは、２つの実体の最適間隔を供給する、あるいはさらに２つの実体を互いから分離することを可能にする不安定な結合を提供することができる。 不安定な結合としては、光分解性基、酸に不安定な部分、塩基に不安定な部分及び酵素切断可能基を挙げることができる。本明細書で使用される「ポリリンカー」または「多重クローニング部位」という用語は、核酸配列上で互いの１０個のヌクレオチド内に位置する３つまたはそれ以上の２型制限酵素部位のクラスターと定義する。ポリリンカーを含む構築物は、遺伝子のコード領域のような核酸配列の挿入及び／または切除に利用される。他の例では、本明細書で使用される用語「ポリリンカー」は、任意の既知シームレスクローニング法（すなわち、 Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）、ＢｉｏＢｒｉｃｋ（登録商標）Ａｓｓｅｍｂｌｙ等）を介して２つの配列を結合するために標的化されるヌクレオチド区間を指す。ポリリンカーを含む構築物は、遺伝子のコード領域のような核酸配列の挿入及び／または切除に利用される。
本明細書で使用されるとき、用語「対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）」は比較する目的で解析手順に使用される試料を指す。対照は「陽性」または「陰性」の場合がある。例えば、解析手順の目的が細胞または組織で差別的に発現した転写産物を検出することである場合、一般に、陽性対照（例えば、所望の発現を示す既知植物からの試料）及び陰性対照（例えば、所望の発現を欠く既知植物からの試料）を含むことが好ましい。
本明細書で使用されるとき、用語「植物」は、植物及びあらゆる子孫の全体、細胞、組織または植物の一部を含む。本発明で使用される植物クラスは、一般に、被子植物（単子葉及び双子葉類植物）、裸子植物、シダ類及び多細胞藻類を含む変異誘発に従順な広範囲の高等及び下等植物クラスである。従って、「植物」は双子葉植物及び単子葉植物を含む。用語「植物部位」は、例えば、種子（成熟種子及び未熟種子を含む）、裁断植物、植物細胞、植物細胞培養、植物器官（例えば、花粉、胚、花、果物、撮影、葉、根、茎及び外植体）が挙げられるが、これらに限定されない。植物組織または植物器官は、種子、プロトプラスト、カルス、または構造または機能的単位に組織化される植物細胞の任意の他の基でもよい。植物細胞または組織培養は、細胞または組織が得られる植物の生理的及び形態的特性をもつ植物を再生する、あるいはその植物と実質的に同じ遺伝子型を有する植物を再生することができるかもしれない。対照的に、いくつかの植物細胞は再生して植物を作製することができない。植物細胞または組織培養での再生可能な細胞は、胚、プロトプラスト、***組織細胞、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、絹糸、花、穀粒、穂先、穂軸、外皮または茎とすることができる。
植物部位は、収穫可能な部分及び子孫植物の増殖に役立つ部位を含む。増殖に有用な植物部位としては、例えば、種子、果実、さし木、苗、塊茎、及び台木が挙げられるが、これらに限定されない。植物の収穫可能な部位は、植物の任意の有用な部分であってもよく、例えば花、花粉、苗、塊茎、葉、茎、果実、種子及び根が挙げられるが、これらに限定されない。
植物細胞はプロトプラスト及び細胞壁を含む植物の構造的及び生理的単位である。植物細胞は単離した単一細胞または細胞の集合体（例えば、脆いカルス及び培養細胞）の形でもよく、高度に組織化した単位（例えば、植物組織、植物器官及び植物体）の部分でもよい。従って、植物細胞は、プロトプラスト、細胞を産生する配偶子、または植物全体へ再生できる細胞または細胞集合でもよい。そのように、種子（複数の植物細胞を含み植物全体に再生が可能）は本明細書の実施形態では「植物細胞」とみなされる。
本明細書で使用されるとき、用語「低分子ＲＮＡ」は幾つかのクラスのノンコーディングリボ核酸（ｎｃＲＮＡ）を指す。用語低分子ＲＮＡは、細菌細胞、動物、植物及び真菌で産生される短鎖のｎｃＲＮＡを記述する。これらの短鎖のｎｃＲＮＡは、細胞内で自然に作製されてもよく、または短鎖またはｎｃＲＮＡを発現する外因的配列の導入によって作製されてもよい。低分子ＲＮＡ配列は直接蛋白質をコードしない。また、低分子ＲＮＡ配列が転写のみで翻訳されない点で他のＲＮＡと機能的に異なる。低分子ＲＮＡ配列は、遺伝子発現及び修飾を含め他の細胞機能に関与する。低分子ＲＮＡ分子は、通常約２０〜３０ヌクレオチドで構成される。低分子ＲＮＡ配列は、より長い前駆体から誘導される場合がある。前駆体は、自己相補的な領域で互いの上に後ろに折りたためる構造を形成し、次いで動物ではヌクレアーゼＤｉｃｅｒまたは植物ではＤＣＬ１によって処理される。
多種類の低分子ＲＮＡが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及び核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）を含め自然的または人工的に存在する。ある種の低分子ＲＮＡ（例えばマイクロＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ）は遺伝子サイレンシング及びＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に重要である。遺伝子サイレンシングは、通常は発現されであろう遺伝子が細胞内エレメント、この場合低分子ＲＮＡによって止められる遺伝学的調節の過程である。通常はこの遺伝情報によって形成されるであろう蛋白質が干渉により形成されず、また遺伝子にコード化される情報が発現から遮断される。
本明細書で使用されるとき、用語「低分子ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ＲＮＡ）」は、”ｔｉｎｙ ＲＮＡ”（Ｓｔｏｒｚ，（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：１２６０−３；Ｉｌｌａｎｇａｓｅｋａｒe ｅｔ ａｌ．，（１９９９）ＲＮＡ５：１４８２−１４８９）；ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ”低分子ＲＮＡ”（ｓＲＮＡ）（Ｗａｓｓａｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７：３７−４５）；ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ “ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ （ｎｃＲＮＡ）”；”ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）”；”ｓｍａｌｌ ｎｏｎ−ｍＲＮＡ（ｓｎｍＲＮＡ）”；”ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＲＮＡ （ｆＲＮＡ）”；”ｔｒａｎｓｆｅｒ ＲＮＡ （ｔＲＮＡ）”；”ｃａｔａｌｙｔｉｃ ＲＮＡ” ［ｅ．ｇ．， ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｓｅｌｆ−ａｃｙｌａｔｉｎｇ ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ（Ｉｌｌａｎｇａｓｋａｒｅｅｔ ａｌ．，（１９９９） ＲＮＡ ５：１４８２−１４８９）； ”ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅｏｌａｒ ＲＮＡｓ（ｓｎｏＲＮＡｓ），” ”ｔｍＲＮＡ”（ａ．ｋ．ａ．”１０ｓ ＲＮＡ，” Ｍｕｔｏｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ．２３：２５−２９； ａｎｄ Ｇｉｌｌｅｔｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：８７９−８８５）；ＲＮＡｉ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｗｉｔｈｏｕｔ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ”ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ），”“ｅｎｄｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ−ｐｒｅｐａｒｅｄ ｓｉＲＮＡ（ｅ−ｓｉＲＮＡ），”“ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ），”ａｎｄ”ｓｍａｌｌ ｔｅｍｐｏｒａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ），”“ｄｉｃｅｄ ｓｉＲＮＡ （ｄ−ｓｉＲＮＡ），”“ｅｎｄｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ−ｐｒｅｐａｒｅｄ ｓｉＲＮＡ （ｅ−ｓｉＲＮＡ），” ”ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ），”ａｎｄ”ｓｍａｌｌ ｔｅｍｐｏｒａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ＲＮＡ （ｓｔＲＮＡ），” ”ｄｉｃｅｄ ｓｉＲＮＡ（ｄ−ｓｉＲＮＡ）”等の文献に記載されたＲＮＡ分子ならびにアプタマー、オリゴヌクレオチド及び少なくとも１つのウラシル塩基を含む他の合成核酸を包含する。
他に断りがない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本開示が属する当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。分子生物学の一般用語の定義は、例えば、Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｖ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９４ （ＩＳＢＮ ０−１９−８５４２８７−９）；Ｋｅｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）， Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．， １９９４ （ＩＳＢＮ ０−６３２−０２１８２−９）； ａｎｄ Ｍｅｙｅｒｓ （ｅｄ．）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ， ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．， １９９５ （ＩＳＢＮ １−５６０８１−５６９−８）に見出すことができる。
本明細書で使用されるとき、冠詞「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は文脈に別段の表示が明瞭かつ明確にある場合を除き複数の言及を含む。
III. Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータ及びそれを含む核酸
植物で非メタロチオネイン様導入遺伝子を発現するためにＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータを使用するための方法と組成物を提供する。１つの実施形態において、プロモータは配列番号１のＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ））プロモータとすることができる。
１つの実施形態において、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、または１００％同一であるプロモータを含むポリヌクレオチドが提供される。１つの実施形態において、プロモータは配列番号１のポリヌクレオチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、または１００％同一のポリヌクレオチドを含むＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ メタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータである。１つの実施形態において、配列番号１のポリヌクレオチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、または１００％同一性を含む単離ポリヌクレオチドが提供される。１つの実施形態において、配列番号１のＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータを含む核酸ベクターが提供される。１つの実施形態において、ポリリンカーに作用可能に連結されるＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータを含むポリヌクレオチドが提供される。１つの実施形態において、非メタロチオネイン様導入遺伝子に作用可能に連結されるＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータを含む遺伝子発現カセットが提供される。１つの実施形態において、非メタロチオネイン様導入遺伝子に作用可能に連結されるＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータを含む核酸ベクターが提供される。１つの実施形態において、プロモータは配列番号１からなる。具体的な実施形態において、核酸ベクターは導入遺伝子に作用可能に連結されるＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータを含み、導入遺伝子は殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、低分子ＲＮＡ導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子、またはそれらの組み合わせとすることができる。
導入遺伝子発現は、遺伝子コード配列の下流に位置する３′‐非翻訳遺伝子領域（すなわち、３′-ＵＴＲ）によって調節されてもよい。プロモータ及び３′-ＵＴＲの両方が導入遺伝子発現を調節できる。プロモータは転写の促進に必要である一方、３′-ＵＴＲ遺伝子領域は転写を終結させ、翻訳及び蛋白質合成のために結果物ｍＲＮＡのポリアデニル化を開始することができる。３′-ＵＴＲ遺伝子領域は導入遺伝子の安定な発現を助ける。
１つの実施形態において、本明細書に記載したＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータ及び３′-ＵＴＲを含む核酸ベクターを提供する。１つの実施形態において、核酸ベクターはＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）３′-ＵＴＲを含む。１つの実施形態において、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）３′-ＵＴＲは配列番号７である。１つの実施形態において、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）３′-ＵＴＲは配列番号７である。
１つの実施形態において、本明細書に記載されたＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータ及び配列番号７のポリヌクレオチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、または１００％同一である３′-ＵＴＲを含む核酸ベクターが提供される。１つの実施形態において、本明細書に記載されたＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイ様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータならびにＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータ及び３′-ＵＴＲの両方がポリリンカーの反対端に作用可能に連結される３′-ＵＴＲを含む核酸ベクターが提供される。１つの実施形態において、本明細書に記載されたＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイ様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータ及び３′-ＵＴＲを含み、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータ及び３′-ＵＴＲの両方が非メタロチオネイン様導入遺伝子の反対端に作用可能に連結される遺伝子カセットが提供される。１つの実施形態において、３′-ＵＴＲは配列番号７からなる。１つの実施形態において、本明細書に記載されたＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータ及び３′-ＵＴＲを含み、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータが配列番号１を含み、３′-ＵＴＲが配列番号３を含み、プロモータと３′-ＵＴＲが非メタロチオネイン様導入遺伝子の反対端に作用可能に連結される遺伝子発現カセットが提供される。 本実施形態の１つの態様において、３′-ＵＴＲは配列番号７からなる。本実施形態の別の態様において、プロモータは配列番号１からなる。具体的な実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作用可能に連結されるＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ メタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）３′-ＵＴＲを含み、導入遺伝子は殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、低分子ＲＮＡ導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子、またはそれらの組み合わせとすることができる。更なる実施形態において、導入遺伝子は、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータ及び同じメタロチオネイン様遺伝子の３′-ＵＴＲに作用可能に連結される。
また、導入遺伝子発現はプロモータ配列の下流に位置するイントロン領域によっても調節される場合がある。プロモータ及びイントロンの両方が導入遺伝子発現を調節できる。プロモータは転写の促進に必要である一方、イントロンの存在は翻訳及び蛋白質合成用のｍＲＮＡ転写産物をもたらす発現レベルを上昇させることができる。イントロン遺伝子領域は導入遺伝子の安定な発現を助ける。更なる実施形態において、イントロンはＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータに作用可能に連結される。
また、導入遺伝子発現はプロモータ配列の下流に位置する５′‐ＵＴＲ領域によっても調節される場合がある。プロモータ及び５′‐ＵＴＲの両方が導入遺伝子発現を調節できる。プロモータは転写の促進に必要である一方、５′‐ＵＴＲの存在は翻訳及び蛋白質合成用のｍＲＮＡ転写産物をもたらす発現レベルを上昇させることができる。５′‐ＵＴＲ遺伝子領域は導入遺伝子の安定な発現を助ける。更なる実施形態において、５′‐ＵＴＲはＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータに作用可能に連結される。
１つの実施形態において、本明細書に記載されたＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ メタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータ及び５′‐ＵＴＲを含む核酸構築物が提供される。１つの実施形態において、５′-ＵＴＲがプロモータの３′末端に作用可能に連結される。１つの実施形態において、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍから単離したメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータの３′末端に作用可能に連結されるＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）５′-ＵＴＲを含む核酸構築物が提供される。更なる実施形態において、５′-ＵＴＲの３′末端はイントロンの５′末端に作用可能に連結される。１つの実施形態において、５′‐ＵＴＲは配列番号４のＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）５′‐ＵＴＲとすることができる。
１つの実施形態において、本明細書に記載されたＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータ及び配列番号4のポリヌクレオチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、または１００％同一である５′‐ＵＴＲを含む核酸構築物が提供される。１つの実施形態において、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータを含む核酸構築物が提供され、プロモータは配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、または１００％同一であり、かつ配列番号４のＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）５′‐ＵＴＲがポリリンカーに作用可能に連結している。１つの実施形態において、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ メタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータを含む遺伝子発現カセットが提供され、プロモータは配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一であり、かつ配列番号４のＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）５′-ＵＴＲ配列が非メタロチオネイン様導入遺伝子に作用可能に連結している。任意選択で、構築物は、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン遺伝子（ｍｔｌ）５′-ＵＴＲおよび非メタロチオネイン様導入遺伝子の５′末端に作用可能に連結される本明細書で開示されたイントロンを更に含み、また、任意選択で、非メタロチオネイン様導入遺伝子の３′末端に作用可能に連結される３′-ＵＴＲを更に含むことができる。１つの実施形態において、プロモータ及び３′-ＵＴＲ配列は本明細書に記載された配列から選択され、５′-ＵＴＲ配列は配列番号４からなる。１つの実施形態において、３′-ＵＴＲは配列番号７からなる。
１つの実施形態において、遺伝子発現カセットは、プロモータに作用可能に連結されるＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）５′-ＵＴＲを含み、プロモータはＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータ、または植物起源のプロモータ（例えば、トウモロコシユビキチン１プロモータ）、ウイルス（例えば、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモータ）または、細菌（例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓデルタｍａｓ）である。具体的な実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作用可能に連結される配列番号４のＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ メタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）５′‐ＵＴＲを含み、導入遺伝子は殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子、またはそれらの組み合わせとすることができる。
１つの実施形態において、本明細書に記載されたＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータ、５′‐ＵＴＲ及び ３′‐ＵＴＲを含む核酸ベクターが提供され、５′‐ＵＴＲは配列番号４のポリヌクレオチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である。１つの実施形態において、本明細書に記載されたＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイ様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータ及び５′‐ＵＴＲを含む核酸ベクターが提供され、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータ及び５′‐ＵＴＲの両方がポリリンカーの反対端に作用可能に連結される。１つの実施形態において、本明細書に記載されたＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイ様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータ及び５′‐ＵＴＲを含む核酸ベクターが提供され、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータ及び５′‐ＵＴＲの両方がポリリンカーの反対端に作用可能に連結される。１つの実施形態において、本明細書に記載されたＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイ様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータ、５′‐ＵＴＲ及び３′-ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットが提供され、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータ及び５′UTRは非メタロチオネイン様導入遺伝子の５′末端に作用可能に連結され、３′‐ＵＴＲは非メタロチオネイン様導入遺伝子の３′末端に作用可能に連結される。１つの実施形態において、５′‐ＵＴＲは配列番号4からなる。１つの実施形態において、本明細書に記載されたＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータ及び５′‐ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットが提供され、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータは配列番号 １を含み、５′‐ＵＴＲは配列番号 ４を含み、プロモータ及び５′‐ＵＴＲは非メタロチオネイン様導入遺伝子の５′末端に作用可能に連結される。本実施形態の１つの態様において、５′‐ＵＴＲは配列番号４からなる。本実施形態の別の態様において、プロモータは配列番号１からなる。具体的な実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作用可能に連結されるＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ メタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）５′‐ＵＴＲを含み、導入遺伝子は殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、低分子ＲＮＡ導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子、またはそれらの組み合わせとすることができる。更なる実施形態において、導入遺伝子は、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータ及び同じメタロチオネイン様遺伝子の５′‐ＵＴＲに作用可能に連結される。
また、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子 （ｍｔｌ）プロモータは １つ以上の追加的配列エレメントも含むことができる。いくつかの実施形態において、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータはエクソン（例えば、葉緑体トランジットペプチドまたは小胞体保留シグナル等のリーダーまたはシグナルペプチド）を含むことができる。例えば、限定はされないが、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータは、更なる実施形態として、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータに取り込まれるエクソンをコード化することができる。
１つの実施形態において、核酸ベクターは本明細書で開示された遺伝子発現カセットを含む。 １つの実施形態において、ベクターはプラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、バクテリオファージ、ウイルス、または例えばドナーＤＮＡ等のダイレクトトランスフォーメーションまたは遺伝子ターゲッティングで使用する切除ポリヌクレオチド断片とすることができる。
１つの実施形態に従って、組み換え型遺伝子発現カセットを含む核酸ベクターが提供され、組み換え型遺伝子形質発現カセットは、ポリリンカー配列、非メタロチオネイン様導入遺伝子またはその組合せに作用可能に連結されるＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータを含む。１つの実施形態において、組み換え型遺伝子発現カセットは、非メタロチオネイン様導入遺伝子に作用可能に連結されるＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータを含む。１つの実施形態において、本明細書で開示されたＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータがポリリンカー配列に作用可能に連結された組み換え型遺伝子発現カセットが含まれる。ポリリンカーは、ポリリンカーの制限部位の１つへのコード配列の挿入が、ベクターが宿主細胞にトランスフェクされるときにコード配列の発現を可能にするコード配列に作用可能に連結するような態様で、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータに作用可能に連結される。
１つの実施形態に従って、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータは 配列番号１または配列番号１と８０、８５、９０、９５または９９％の配列同一性をもつ配列を含む。１つの実施形態に従って、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータは配列番号 １または配列番号１と少なくとも８０、８５、９０、９５または９９％の配列同一性をもつ配列を含む。１つの実施形態に従って、プロモータ配列は、わずか１．５、２、２．５、３または４ｋｂの全長しか持たない。１つの実施形態に従って、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータは配列番号 １または配列番号１と８０、８５、９０、９５または９９％の配列同一性をもつ１，８７５ｂｐの配列からなる。１つの実施形態に従って、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータは配列番号 １または配列番号１と少なくとも８０、８５、９０、９５または９９％の配列同一性をもつ１，８７５ｂｐの配列からなる。
さらに提供される実施形態において、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータは配列番号９及び配列番号１０である。これらの改変したＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータ配列を本明細書で使用して導入遺伝子の発現を促進し、また、本明細書での主題開示によって提供された配列番号１の代わりに使用してもよい代替のプロモータ配列を提供することができる。配列番号１及び配列番号９のプロモータポリヌクレオチド配列は９８．８％の配列同一性を共有する。加えて、配列番号１及び配列番号１０のプロモータポリヌクレオチド配列は９７．３％の配列同一性を共有する。最後に、配列番号９及び配列番号１０のプロモータポリヌクレオチド配列は９７．３％の配列同一性を共有する。配列番号９のプロモータは、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータの追加的実施形態として提供される。 更に、配列番号１０のプロモータは、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータの追加的実施形態として提供される。
１つの実施形態に従って、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータ、非メタロチオネイン様導入遺伝子及びＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）の配列番号３の３′-ＵＴＲからなる遺伝子カセットを含む核酸ベクターが提供される。１つの実施形態において、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）の配列番号３の３′-ＵＴＲが非メタロチオネイン様導入遺伝子の３′末端に作用可能に連結される。更なる実施形態において、３′非翻訳配列は、配列番号３または配列番号３と少なくとも８０、８５、９０、９５、９９または１００％の配列同一性をもつ配列を含む。１つの実施形態において、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）の配列番号３の３′-ＵＴＲが非メタロチオネイン様導入遺伝子の３′末端に作用可能に連結される。 更なる実施形態において、３′非翻訳配列は、配列番号３または配列番号３と少なくとも８０、８５、９０、９５、９９または１００％の配列同一性をもつ配列を含む。１つの実施形態に従って、配列番号１、または配列番号１と８０、８５、９０、９５または９９％の配列同一性をもつ１，８７５ｂｐ配列、非メタロチオネイン様導入遺伝子及び３′-ＵＴＲからなる遺伝子カセットを含む核酸ベクターが提供され、配列番号１は非メタロチオネイン様導入遺伝子の５′末端に作用可能に連結され、かつ配列番号７の３′-ＵＴＲが非メタロチオネイン様導入遺伝子の３′末端に作用可能に連結される。 １つの実施形態に従って、配列番号１、または配列番号１と８０、８５、９０、９５または９９％の配列同一性をもつ１，８７５ｂｐ配列、非メタロチオネイン様導入遺伝子及び３′-ＵＴＲからなる遺伝子カセットを含む核酸ベクターが提供され、配列番号１は非メタロチオネイン様導入遺伝子の５′末端に作用可能に連結され、かつ配列番号７の３′-ＵＴＲが非メタロチオネイン様導入遺伝子の３′末端に作用可能に連結される。 更なる実施形態において、３′非翻訳配列は、配列番号３または配列番号３と少なくとも８０、８５、９０、９５、９９または１００％の配列同一性をもつ配列を含む。更なる実施形態において、３′非翻訳配列は、配列番号３または配列番号３と少なくとも８０、８５、９０、９５、または９９％の配列同一性をもつ１，０００ｂｐ配列を含む。更なる実施形態において、３′非翻訳配列は、配列番号３または配列番号３と少なくとも８０、８５、９０、９５、９９または１００％の配列同一性をもつ配列を含む。更なる実施形態において、３′非翻訳配列は、配列番号３または配列番号３と少なくとも８０、８５、９０、９５、または９９％の配列同一性をもつ１，０００ｂｐ配列を含む。
さらに提供される実施形態において、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）３′-ＵＴＲは配列番号11である。この改変したＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）３′-ＵＴＲ配列を本明細書で使用して導入遺伝子の発現を停止し、また、本明細書での主題開示によって提供された配列番号７の代わりに使用してもよい代替の３′-ＵＴＲ配列を提供することができる。配列番号１１及び配列番号７のプロモータポリヌクレオチド配列は９７．４%の配列同一性を共有する。配列番号１１の３′-ＵＴＲは、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）３′-ＵＴＲの追加的実施形態として提供される。
１つの実施形態に従って、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータ、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）の配列番号４の５′-ＵＴＲ、 非メタロチオネイン様導入遺伝子及びＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）の配列番号３の３′-ＵＴＲからなる遺伝子カセットを含む核酸ベクターが提供される。１つの実施形態において、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）の配列番号 ４の５′−ＵＴＲが、非メタロチオネイン様導入遺伝子の５′末端及びＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）の配列番号１のプロモータの３′末端に作用可能に連結される。更なる実施形態において、５′非翻訳配列は、配列番号４または配列番号４と少なくとも８０、８５、９０、９５、９９または１００％の配列同一性をもつ配列を含む。 １つの実施形態に従って、配列番号４、または配列番号４と８０、８５、９０、９５または９９％の配列同一性をもつ９７ｂｐ配列、プロモータ、非メタロチオネイン様導入遺伝子及び３′-ＵＴＲからなる遺伝子カセットを含む核酸ベクターが提供され、配列番号１が５′非翻訳領域の５′末端に作用可能に連結され、５′非翻訳領域が非メタロチオネイン様導入遺伝子の３′末端に作用可能に連結され、配列番号７の３′-ＵＴＲが非メタロチオネイン様導入遺伝子の３′末端に作用可能に連結される。１つの実施形態に従って、配列番号４、または配列番号４と少なくとも８０、８５、９０、９５または９９％の配列同一性をもつ９７ｂｐ配列、プロモータ、非メタロチオネイン様導入遺伝子及び３′-ＵＴＲからなる遺伝子カセットを含む核酸ベクターが提供され、配列番号１が５′非翻訳領域の５′末端に作用可能に連結され、５′非翻訳領域が非メタロチオネイン様導入遺伝子の３′末端に作用可能に連結され、配列番号７の３′-ＵＴＲが非メタロチオネイン様導入遺伝子の３′末端に作用可能に連結される。更なる実施形態において、５′非翻訳配列は、配列番号４または配列番号４と少なくとも８０、８５、９０、９５、９９または１００％の配列同一性をもつ配列を含む。 更なる実施形態において、５′非翻訳配列は、配列番号４または配列番号４と少なくとも８０、８５、９０、９５、９９または１００％の配列同一性をもつ配列を含む。 更なる実施形態において、５′非翻訳配列は、配列番号４または配列番号４と８０、８５、９０、９５または９９％の配列同一性をもつ９７ｂｐの配列からなる。更なる実施形態において、５′非翻訳配列は、配列番号４または配列番号４と８０、８５、９０、９５または９９％の配列同一性をもつ９７ｂｐの配列からなる。
１つの実施形態において、プロモータ、非メタロチオネイン様導入遺伝子及び任意選択で下記の１つ以上のエレメント：
ａ）５′非翻訳領域；
ｂ）イントロン；及び
ｃ）３′非翻訳領域を含む核酸構築物が提供され、
これにおいて、
プロモータは配列番号１または配列番号１と９８％の配列同一性をもつ配列；
５′非翻訳領域は配列番号４または配列番号４と９８％の配列同一性をもつ配列からなり；
３′非翻訳領域は配列番号７または配列番号７と９８％の配列同一性をもつ配列からなり；更に、前記プロモータは前記ポリリンカーに作用可能に連結され、各任意のエレメント（存在する場合）はプロモータとポリリンカーの両方に作用可能に連結される。更なる実施形態において、直上で開示された核酸構築物を含むトランスジェニック細胞が提供される。１つの実施形態において、トランスジェニック細胞は植物細胞であり、更なる実施形態において、前記トランスジェニック細胞を含む植物が提供される。
１つの実施形態において、プロモータ、非メタロチオネイン様導入遺伝子及び任意選択で下記の１つ以上のエレメント：
ａ）５′非翻訳領域;
ｂ）３′非翻訳領域からなる核酸構築物が供給され、
これにおいて、
プロモータは配列番号１または配列番号１と９８％の配列同一性をもつ配列；
５′非翻訳領域は配列番号４または配列番号４と９８％の配列同一性をもつ配列からなり；
３′非翻訳領域は配列番号７または配列番号７と９８％の配列同一性をもつ配列からなり；更に、前記プロモータは前記ポリリンカーに作用可能に連結され、各任意のエレメント（存在する場合）はプロモータとポリリンカーの両方に作用可能に連結される。更なる実施形態において、直上で開示された核酸構築物を含むトランスジェニック細胞が提供される。１つの実施形態において、トランスジェニック細胞は植物細胞であり、更なる実施形態において、前記トランスジェニック細胞を含む植物が提供される。
１つの実施形態において、プロモータ及びポリリンカー、及び任意選択で１つ以上の以下のエレメント；
ａ）５′非翻訳領域；
ｂ）イントロン；及び
ｃ）３′非翻訳領域を含む核酸構築物が提供され、
これにおいて、
プロモータは配列番号１または配列番号１と９８％の配列同一性をもつ配列；
５′非翻訳領域は配列番号４または配列番号４と９８％の配列同一性をもつ配列からなり；
３′非翻訳領域は配列番号７または配列番号７と９８％の配列同一性をもつ配列からなり；更に、前記プロモータは前記ポリリンカーに作用可能に連結され、各任意のエレメント（存在する場合）はプロモータとポリリンカーの両方に作用可能に連結される。
１つの実施形態に従って、核酸ベクターは、選択マーカーをコード化する配列を更に含む。１つの実施形態に従って、組換遺伝子カセットは、アグロバクテリウムＴ-ＤＮＡボーダーに作用可能に連結される。１つの実施形態に従って、組換遺伝子カセットは更に第１及び第２Ｔ-ＤＮＡボーダーを含み、第１Ｔ-ＤＮＡボーダーは遺伝子構築物の1末端に作用可能に連結され、第２Ｔ-ＤＮＡボーダーは遺伝子構築物の他の末端に作用可能に連結される。第１及び第２アグロバクテリウムＴ-ＤＮＡボーダーは、ノパリン合成アグロバクテリウムＴ-ＤＮＡボーダー、オクトピン合成アグロバクテリウムＴ-ＤＮＡボーダー、マンノピン合成アグロバクテリウムＴ-ＤＮＡボーダー、スクシナモピン合成アグロバクテリウムＴ-ＤＮＡボーダーまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される細菌株起源のＴ-ＤＮＡボーダーから独立して選択されることができる。１つの実施形態において、ノパリン合成株、マンノピン合成株、スクシナモピン合成株またはオクトピン合成株からなる群から選択されるアグロバクテリウム株が提供され、前記株がプラスミドを含み、前記プラスミドが配列番号１から選択される配列または配列番号１と８０、８５、９０、９５または９９％の配列同一性をもつ配列と作用可能に連結される。
本出願で開示された構築物で使用するのに好適な対象の導入遺伝子としては、これらに限定はされないが、（１）害虫または病害耐性、２）除草剤耐性、（３）付加価値農業形質、例えば収量改善、窒素利用効率、水利用効率及び栄養価、（４）部位特異的にＤＮＡへの蛋白質の結合、（５）低分子ＲＮＡの発現、及び（６）選択マーカーを付与するコード配列を挙げることができる。１つの実施形態に従って、導入遺伝子は、殺虫剤耐性、除草剤耐性、低分子ＲＮＡ発現、窒素利用効率、水利用効率または栄養価を付与する選択マーカーまたは遺伝子産物をコード化する。
1. 耐虫性
さまざまな耐虫性コード配列が、配列番号１または配列番号１と８０、８５、９０、９５または９９％の配列同一性をもつ配列を含むＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータと作用可能に連結することができる。さまざまな耐虫性コード配列が、配列番号１または配列番号１と８０、８５、９０、９５または９９％の配列同一性をもつ配列を含むＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ））プロモータと作用可能に連結することができる。いくつかの実施形態において、配列が、配列番号１を含むＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ） プロモータ ならびに配列番号４または配列番号４に作用可能に連結される配列番号１と少なくとも８０、８５、９０、９５または９９％の配列同一性をもつ配列を含むＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子 （ｍｔｌ）５′‐ＵＴＲ と作用可能に連結される。 いくつかの実施形態において、配列が、配列番号１を含むＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ） プロモータ ならびに配列番号４または配列番号４に作用可能に連結される配列番号１と少なくとも８０、８５、９０、９５または９９％の配列同一性をもつ配列を含むＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子 （ｍｔｌ）５′‐ＵＴＲ と作用可能に連結される。 次いで、作用可能に連結される配列は、形質転換された植物（「形質転換体」）の認識及び選別を可能にする選択ベクターに取り込むことができる。例示的な耐虫性コード配列は当技術分野においては公知である。主題開示の調節エレメントに作用可能に連結が可能な耐虫性コード配列の実施形態として、以下の形質が提供される。cry1A.105例示的な鱗翅類耐虫性を提供するコード配列としては、以下を挙げることができる：ｃｒｙ１ａ; ｃｒｙ１ａ．１０５; ｃｒｙ１Ａｂ; ｃｒｙ１Ａｂ( 短縮); ｃｒｙ１Ａｂ−Ａｃ (融合蛋白質); ｃｒｙ１Ａｃ （Ｗｉｄｅｓｔｒｉｋｅ（登録商標）として市販）; ｃｒｙ１ｃ; ｃｒｙ１ｆ （Ｗｉｄｅｓｔｒｉｋｅ（登録商標）として市販）; ｃｒｙ１Ｆａ２; ｃｒｙ２Ａｂ２; ｃｒｙ２Ａｅ; ｃｒｙ９ｃ; ｍｏｃｒｙ１ｆ; ｐｉｎＩＩ（プロテアーゼ阻害剤蛋白質）; ｖｉｐ３ａ（ａ）; 及び ｖｉｐ３Ａａ２０。例示的な甲虫耐虫性を提供するコード配列は下記を挙げることができる： ｃｒｙ３４Ａｂ１ （Ｈｅｒｃｕｌｅｘ（登録商標）として市販）; ｃｒｙ３５Ａｂ１ （Ｈｅｒｃｕｌｅｘ（登録商標）として市販）; ｃｒｙ３ａ; ｃｒｙ３Ｂｂ1; ｄｖｓｎｆ７; 及び ｍｃｒｙ３Ａ。例示的なマルチ耐虫性を提供するコード配列は、ｅｃｒｙ３１.Ａｂを含む。耐虫性遺伝子の上記リストは制限することを意味していない。あらゆる耐虫性遺伝子は本開示に含まれる。
２．除草剤耐性
さまざまな除草剤耐性コード配列が、配列番号１または配列番号１と８０、８５、９０、９５または９９％の配列同一性をもつ配列を含むＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータと作用可能に連結される。さまざまな除草剤耐性コード配列が、配列番号１または配列番号１と少なくとも８０、８５、９０、９５または９９％の配列同一性をもつ配列を含むＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータと作用可能に連結される。いくつかの実施形態において、配列が、配列番号１を含むＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ） プロモータ ならびに配列番号４または配列番号４に作用可能に連結される配列番号１と少なくとも８０、８５、９０、９５または９９％の配列同一性をもつ配列を含むＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子 （ｍｔｌ）５′‐ＵＴＲ と作用可能に連結される。 いくつかの実施形態において、配列が、配列番号１を含むＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ） プロモータ ならびに配列番号４または配列番号４に作用可能に連結される配列番号１と少なくとも８０、８５、９０、９５または９９％の配列同一性をもつ配列を含むＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子 （ｍｔｌ）５′‐ＵＴＲ と作用可能に連結される。 次いで、作用可能に連結される配列は、形質転換された植物（「形質転換体」）の認識及び選別を可能にする選択ベクターに取り込むことができる。例示的な除草剤耐性コード配列は当技術分野においては公知である。主題開示の調節エレメントに作用可能に連結が可能な除草剤耐性コード配列の実施形態として、以下の形質が提供される。グリフォセート除草剤はＥＰＳＰＳ酵素（５-エノイルピルビニルシキミ酸-３-リン酸合成酵素）を阻害することによる作用様式を含む。この酵素は植物の成長及び生育に重要な芳香族アミノ酸の生合成に関与する。酵素を阻害するために利用することできるさまざまな酵素メカニズムが当分野では公知である。そのような酵素をコード化する遺伝子は、主題開示の遺伝子調節エレメントに作用可能に連結することができる。１つの実施形態において、グリフォセート耐性遺伝子をコード化する遺伝子に限定されない選択マーカー遺伝子としては、突然変異体ＥＰＳＰＳ遺伝子（例えば２ｍＥＰＳＰＳ遺伝子、ｃｐ４ ＥＰＳＰＳ遺伝子、ｍＥＰＳＰＳ遺伝子、ｄｇｔ-２８遺伝子）;ａｒｏＡ遺伝子;及び、グリフォセート分解遺伝子（例えばグリフォセートアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇａｔ）およびグリフォセートオキシダーゼ遺伝子（ｇｏｘ）を挙げることができる。これらの形質は、現在Ｇｌｙ−Ｔｏｌ（商標）, Ｏｐｔｉｍｕｍ（登録商標）、ＧＡＴ（登録商標）、 Ａｇｒｉｓｕｒｅ（登録商標）ＧＴ及びＲｏｕｎｄｕｐ Ｒｅａｄｙ（登録商標）として市販されている。グルフォシネート及び／またはビアラホス化合物に耐性な遺伝子としては、ｄｓｍ−２、ｂａｒ及びｐａｔ遺伝子を挙げることができる。このｂａｒ及びｐａｔ形質は現在ＬｉｂｅｒｔｙＬｉｎｋ（登録商標）として市販されている。また、２,４-Ｄに抵抗性を提供する耐性遺伝子としては、例えばａａｄ-１遺伝子（ａａｄ-１遺伝子がアリールオキシフェノキシプロピオナート（Ａｒｌｏｘｙｐｈｅｎｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）除草剤上に更なる活性を持つ点に留意する必要がある）及びａａｄ-１２遺伝子（ａａｄ-１２遺伝子がｐｙｉｄｙｌｏｘｙａｃｅｔａｔｅ合成オーキシン上に更なる活性を持つ点に留意する必要がある）を挙げることができる。これらの形質はＥｎｌｉｓｔ（登録商標）作物保護技術として市販されている。ＡＬＳ阻害剤（スルホニル尿素、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジン、ピリミジニル(チオ)ベンゾエート及びスルホニルアミノ‐カルボニル-トリアゾリノン）の耐性遺伝子は当技術分野において公知である。これらの耐性遺伝子は最も一般にはＡＬＳコード化遺伝子配列に対する点突然変異から生じる。他のＡＬＳ阻害剤耐性遺伝子としては、ｈｒａ遺伝子、ｃｓｒ１-２遺伝子、Ｓｒ-ＨｒＡ遺伝子及びｓｕｒＢ遺伝子を挙げることができる。いくつかの形質は商品名Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ（登録商標）の下で市販されている。ＨＰＰＤを阻害する除草剤としては、ピラゾロン（例えばピラゾキシフェン、ベンゾフェナップ及びｂｅｎｚｏｆｅｎａｐ及びトプラメゾン）；トリケトン（例えばメソトリオン、スルコトリオン、テンボトリオン、ベンゾビシクロン）;及び、ジケトニトリル（ｔｏｎｉｔｒｉｌｅｓ（例えばイソキサフルトール ）を挙げることができる。これらの例示的なＨＰＰＤ除草剤は、既知の形質 ＨＰＰＤ阻害剤の例は、ｈｐｐｄＰＦ_Ｗ３３６遺伝子（イソキサフルトール耐性）及びａｖｈｐｐｄ-０３遺伝子（メソトリオン耐性）を挙げることができる。オキシニル除草剤耐性形質の例は、除草剤/抗生物質ブロモキシニルに耐性を付与することが示されたｂｘｎ遺伝子が挙げられる。ジカンバ耐性遺伝子としては、国際ＰＣＴ公開ＷＯ２００８／１０５８９０に開示されているジカンバモノオキシゲナーゼ遺伝子（ｄｍｏ）を挙げることができる。ＰＰＯまたはＰＲＯＴＯＸ阻害剤型除草剤（例えば、アシフルオルフェン、ブタフェナシル、フルポロパジル（ｆｌｕｐｒｏｐａｚｉｌ）、ペントキサゾン、カルフェントラゾン、フルアゾレート、ピラフルフェン、アクロニフェン、アザフェニジン、ルミオキサジン、フルミクロラック、ビフェノックス、オキシフルオルフェン、ラクトフェン、ホメサフェン、フルオログリコフェン及びスルフェントラゾン）の耐性遺伝子は当技術分野において公知である。例示的遺伝子（ＰＰＯに耐性を付与する）野生型Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ ＰＰＯ酵素（Ｌｅｒｍｏｎｔｏｖａ Ｉ ａｎｄ Ｇｒｉｍｍ ｂ， （２０００）色素体プロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼの過剰発現がジフェニルエーテル除草剤アシフルオルフェン耐性をもたらす Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ１２２：７５-８３．）， ｔｈｅ Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＰＰＯ ｇｅｎｅ （Ｌｉ， ｘ． ａｎｄ Ｎｉｃｈｏｌｌ ｄ． ２００５．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＰＰＯ阻害剤耐性培養及び作物の開発 Ｐｅｓｔ Ｍａｎａｇ．Ｓｃｉ．６１：２７７−２８５ ａｎｄ Ｃｈｏｉ ＫＷ， Ｈａｎ Ｏ， Ｌｅｅ ＨＪ， Ｙｕｎ ＹＣ， Ｍｏｏｎ ＹＨ， Ｋｉｍ ＭＫ， Ｋｕｋ ＹＩ， Ｈａｎ ＳＵ ａｎｄ Ｇｕｈ ＪＯ， （１９９８）ジフェニルエーテル除草剤、オキシフルオルフェン耐性の生成、 via発現枯草菌トランスジェニックタバコ植物イリノーゲンオキシダーゼ遺伝子 Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６２：５５８-５６０．」 ピリジンオキシまたはフェノキシプロピオン酸及びシクロヘキソン（ｃｙｃｌｏｈｅｘｏｎｅｓ）の耐性遺伝子としては、ＡＣＣアーゼ阻害剤コード化遺伝子（例えば、Ａｃｃ１-Ｓ１、Ａｃｃ１-Ｓ２及びＡｃｃ１-Ｓ３）を挙げることができる。シクロヘキサンジオン誘導体及び／またはアリールオキシフェノキシプロパン酸に耐性を付与する例示的遺伝子としては、ハロキシホップ、ジクロホップ、フェノキサプロップ、フルアジホップ及びキザロホップを挙げることができる。最後に、トリアジンまたはベンゾニトリルを含む除草剤は光合成を阻害することができ、ｐｓｂＡ遺伝子（トリアジン耐性）、１ｓ+遺伝子（トリアジ耐性）及びニトリラーゼ遺伝子（ベンゾニトリル耐性）によって耐性が提供される。除草剤耐性遺伝子の上記リストは制限することを意味していない。あらゆる除草剤耐性遺伝子は本開示に含まれる。
3. 農業形質
さまざまな農業形質コード配列が、配列番号１または配列番号１と８０、８５、９０、９５または９９％の配列同一性をもつ配列を含むＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータと作用可能に連結することができる。さまざまな農業形質コード配列が、配列番号１または配列番号１と少なくとも８０、８５、９０、９５または９９％の配列同一性をもつ配列を含むＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子 （ｍｔｌ） プロモータと作用可能に連結することができる。いくつかの実施形態において、配列が、配列番号１を含むＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ） プロモータ ならびに配列番号４または配列番号４に作用可能に連結される配列番号１と少なくとも８０、８５、９０、９５または９９％の配列同一性をもつ配列を含むＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子 （ｍｔｌ）５′‐ＵＴＲ と作用可能に連結される。 いくつかの実施形態において、配列が、配列番号１を含むＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ） プロモータ ならびに配列番号４または配列番号４に作用可能に連結される配列番号１と少なくとも８０、８５、９０、９５または９９％の配列同一性をもつ配列を含むＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子 （ｍｔｌ）５′‐ＵＴＲ と作用可能に連結される。 次いで、作用可能に連結される配列は、形質転換された植物（「形質転換体」）の認識及び選別を可能にする選択ベクターに取り込むことができる。例示的な農業形質コード配列は当技術分野においては公知である。主題開示の調節エレメントに作用可能に連結が可能な農業形質コード配列の実施形態として、以下の形質が提供される。細胞壁のペクチン分子の破壊に関与するポリガラクツロナーゼ酵素の産生を阻害し、果実の軟化抑制を起こし果実の軟化抑制が発生する果実の軟化抑制がｐｇ遺伝子によって提供される。さらに、ａｃｃ 遺伝子の果実の熟成/老化抑制が生来のａｃｃ合成酵素遺伝子の通常の発現を抑制するように作用し、その結果エチレン産生の減少及び果実成熟抑制をもたらす。他方では、ａｃｃｄ遺伝子は果実成熟ホルモンエチレンの前駆体を代謝し、その結果、果実成熟抑制をもたらす。代わりに、ｓａｍ−ｋ 遺伝子は、エチレン生成基質のＳ‐アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）を減少させることによって成熟を遅らす。乾燥ストレス耐性表現型は、ｃｓｐＢ 遺伝子によって提供され、ＲＮＡ安定性及び翻訳を維持することによって水ストレス条件の下で正常細胞機能を維持する。別の例としては、水ストレス耐性を付与する浸透圧調節物質の化合物グリシンベタインの生成を触媒するＥｃＢｅｔＡ 遺伝子を挙げることができる。加えて、ＲｍＢｅｔＡ遺伝子が水ストレス耐性を付与する浸透圧調節物質の化合物グリシンベタインの生成を触媒する。植物の昼/夜生理的過程を調節する１つ以上の内因性転写因子と相互作用する蛋白質を発現するｂｂｘ３２ 遺伝子によって光合成及び収量増大が提供される。エタノール生産は、澱粉分解に使われるアミラーゼの耐熱性強化によるバイオエタノール産生を高める耐熱性アルファアミラーゼ酵素コードａｍｙ７９７Ｅ 遺伝子の発現によって増加させることができる。最後に、修飾アミノ酸組成は、アミノ酸リジンの生産を増やすジヒドロジピコリン酸合成酵素コード化ｃｏｒｄａｐＡ遺伝子の発現によって生じる。農業形質コード配列の上記リストは制限することを意味していない。あらゆる農業形質コード配列は本開示によって包含される。
4. ＤＮＡ結合蛋白質
さまざまなＤＮＡ結合蛋白質コード配列が、配列番号１または配列番号１と８０、８５、９０、９５または９９％の配列同一性をもつ配列を含むＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子 （ｍｔｌ） プロモータと作用可能に連結することができる。さまざまなＤＮＡ結合蛋白質コード配列が、配列番号１または配列番号１と少なくとも８０、８５、９０、９５または９９％の配列同一性をもつ配列を含むＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータと作用可能に連結することができる。いくつかの実施形態において、配列が、配列番号１を含むＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ） プロモータ ならびに配列番号４または配列番号４に作用可能に連結される配列番号１と少なくとも８０、８５、９０、９５または９９％の配列同一性をもつ配列を含むＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子 （ｍｔｌ）５′‐ＵＴＲ と作用可能に連結される。 いくつかの実施形態において、配列が、配列番号１を含むＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ） プロモータ ならびに配列番号４または配列番号４に作用可能に連結される配列番号１と少なくとも８０、８５、９０、９５または９９％の配列同一性をもつ配列を含むＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子 （ｍｔｌ）５′‐ＵＴＲ と作用可能に連結される。 次いで、作用可能に連結される配列は、形質転換された植物（「形質転換体」）の認識及び選別を可能にする選択ベクターに取り込むことができる。例示的なＤＮＡ結合蛋白質コード配列は当技術分野においては公知である。主題開示の調節エレメントに作用可能に連結が可能なＤＮＡ結合蛋白質コード配列の実施形態として、以下の種類のＤＮＡ結合蛋白質、すなわちＺｎフィンガー、Ｔａｌｅｎ、ＣＲＩＳＰＲＳ及びメガヌクレアーゼを含むことができる。ＤＮＡ結合蛋白質コード配列の上記リストは制限することを意味していない。あらゆるＤＮＡ結合蛋白質コード配列は本開示によって包含される。
5. 低分子ＲＮＡ
さまざまな低分子ＲＮＡが、配列番号１または配列番号１と８０、８５、９０、９５または９９％の配列同一性をもつ配列を含むＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ） プロモータと作用可能に連結することができる。さまざまな低分子ＲＮＡが合蛋白質コード配列が、配列番号１または配列番号１と少なくとも８０、８５、９０、９５または９９％の配列同一性をもつ配列を含むＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータと作用可能に連結することができる。いくつかの実施形態において、配列が、配列番号１を含むＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ） プロモータ ならびに配列番号４または配列番号４に作用可能に連結される配列番号１と少なくとも８０、８５、９０、９５または９９％の配列同一性をもつ配列を含むＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子 （ｍｔｌ）５′‐ＵＴＲ と作用可能に連結される。 いくつかの実施形態において、配列が、配列番号１を含むＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｅｎｅ （ｍｔｌ）プロモータ ならびに配列番号４または配列番号４に作用可能に連結される配列番号１と少なくとも８０、８５、９０、９５または９９％の配列同一性をもつ配列を含むＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子 （ｍｔｌ）５′‐ＵＴＲ と作用可能に連結される。 次いで、作用可能に連結される配列は、形質転換された植物（「形質転換体」）の認識及び選別を可能にする選択ベクターに取り込むことができる。例示的な低分子ＲＮＡ形質は当技術分野においては公知である。主題開示の調節エレメントに作用可能に連結が可能な低分子ＲＮＡコード配列の実施形態として、以下の形質が提供される。例えば、抗-ｅｆｅ 低分子ＲＮＡの果実の熟成/老化抑制はエチレン形成酵素をコード化するＡＣＯ遺伝子のサイレンシング介してエチレン産生を抑制することによって熟成を遅らせる。低分子ＲＮＡｃｃｏｍｔ のリグニン生産変化が、内因性Ｓ‐アデノシル-Ｌ-メチオニン：トランスカフェオイルＣｏＡ ３-Ｏ-メチルトランスフェラーゼ（ＣＣＯＭＴ遺伝子）の阻害によるｇｕａｎａｃｙｌ(Ｇ)リグニン含量を低下させる。さらに、Ｓｏｌａｎｕｍ ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍのＢｌａｃｋ Ｓｐｏｔ Ｂｒｕｉｓｅ ＴｏｌｅｒａｎｃｅがＰｐｏ５低分子ＲＮＡに起因し、Ｐｐｏ５転写産物の分解によるｂｌａｃｋ ｓｐｏｔ ｂｒｕｉｓｅ損傷発達を引き起こす場合がある。また、低分子ＲＮＡｄｖｓｎｆ7としては、西洋ハムシモドキの幼虫Ｓｎｆ７遺伝子の２４０ｂｐ断片を含むｄｓＲＮＡによって西洋ハムシモドキの幼虫を阻害することも挙げられる。化工デンプン/炭水化物は、低分子ＲＮＡ、例えば、ｐＰｈＬ低分子ＲＮＡ（澱粉分解によって還元糖形成を制限するPhL転写産物を低下させる）及びｐＲ１低分子ＲＮＡ（澱粉分解によって還元糖形成を制限するＲ１転写産物を低下させる）から得ることができる。低分子ＲＮＡａｓｎ１ がＡｓｎ１の分解を誘導し、アスパラギン形成を弱め、ポリアクリルアミドを低下させる結果、アクリルアミドが減少する追加的な利益がある。最後に、低分子ＲＮＡｐｇａｓ ｐｐｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎの非褐変表現型によって、ＰＰＯを抑制し、非褐変表現型のリンゴが得られる。低分子ＲＮＡの上記リストは制限することを意味していない。あらゆる低分子ＲＮＡコード配列は本開示によって包含される。
6. 選択マーカー
レポーター遺伝子としても記載されているさまざまな選択マーカーが、配列番号１または配列番号１と８０、８５、９０、９５または９９％の配列同一性をもつ配列を含むＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータと作用可能に連結することができる。レポーター遺伝子としても記載されているさまざまな選択マーカーが、配列番号１または配列番号１と少なくとも８０、８５、９０、９５または９９％の配列同一性をもつ配列を含むＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータと作用可能に連結することができる。いくつかの実施形態において、配列が、配列番号１を含むＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ） プロモータ ならびに配列番号４または配列番号４に作用可能に連結される配列番号１と少なくとも８０、８５、９０、９５または９９％の配列同一性をもつ配列を含むＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子 （ｍｔｌ）５′‐ＵＴＲ と作用可能に連結される。 いくつかの実施形態において、配列が、配列番号１を含むＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ） プロモータ ならびに配列番号４または配列番号４に作用可能に連結される配列番号１と少なくとも８０、８５、９０、９５または９９％の配列同一性をもつ配列を含むＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子 （ｍｔｌ）５′‐ＵＴＲ と作用可能に連結される。 次いで、作用可能に連結される配列は、形質転換された植物（「形質転換体」）の認識及び選別を可能にする選択ベクターに取り込むことができる。形質転換された植物での選択マーカーの発現を確認するために多くの方法が利用されており、例えば、ベクターから発現した蛋白質の検出に関してはＤＮＡシークエンシング及びＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、サザンブロッティング、ＲＮＡブロッティング、免疫学的方法が挙げられる。しかし、通常、レポーター遺伝子は、発現したときに着色産物を生成する蛋白質の目視によって観測される。 例示的リポーター遺伝子は当技術分野において公知であり、β-グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ、φ-ＹＦＰ）、赤色蛍光蛋白質（ＤｓＲＦＰ、ＲＦＰ、その他）、β-ガラクトシダーゼ等をコード化する (参照によりその全体が本明細書に援用されるＳａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．， ２００１を参照 )。
選択マーカー遺伝子は形質転換された細胞または組織の選別に利用される。選択マーカー遺伝子は、抗生物質抵抗性をコード化する遺伝子、例えばネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）、スペクチノマイシン／ストレプトマイシン抵抗性（ＡＡＤ）、及びハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ(ＨＰＴまたはＨＧＲ)ならびに除草化合物耐性を付与する遺伝子を挙げることができる。除草剤耐性遺伝子は、一般に除草剤に反応いない改変標的蛋白質、あるいは作用する前に除草剤を分解または解毒する酵素をコードする。例えば、グリホサート耐性は突然変異体標的酵素、５-エノイルピルビニルシキミ酸-３-リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）をコードする遺伝子の使用によって得られる。EPSPSの遺伝子及び突然変異体は周知であり、以下に詳述する。グルフォシネートアンモニウム、ブロモキシニル及び２，４-ジクロロフェノキシアセテート（２,４-Ｄ）耐性は、ＰＡＴまたはＤＳＭ-２、ニトリラーゼ、ＡＡＤ-１またはＡＡＤ-１２コード化細菌性遺伝子（それぞれが除草剤を解毒する蛋白質の例）を用いて得られた。
１つの実施形態において、除草剤は、イミダゾリノンまたはスルホニル尿素を含めて成長点または***組織を阻害することができ、これらの除草剤のアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）及びアセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）の耐性／抵抗性遺伝子は公知である。グリフォセート耐性遺伝子としては、突然変異体５-エノイルピルビニルシキミ酸-３-リン酸合成酵素（ＥＰＳＰ）及びｄｇｔ-２８遺伝子（組み換え型核酸の導入及び／または生来ＥＰＳＰ遺伝子の種々の形態のインビボ突然変異生成の導入による）、ａｒｏＡ遺伝子及びグリフォセートアセチルトランスフェラーゼ（ＧＡＴ）遺伝子）をそれぞれ挙げることができる。他のホスホノ化合物の耐性遺伝子としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｉｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓを含むストレプトマイセス種由来のｂａｒ及びｐａｔ遺伝子、ならびにフェノキシプロピオン酸及びｃｙｃｌｏｈｅｘｏｎｅｓ（ＡＣＣアーゼ阻害剤コード化遺伝子）を挙げることができる。シクロヘキサンジオン及び／またはアリールオキシフェノキシプロパン酸（ハロキシホップ、ジクロホップ、フェノキサプロップ、フルアジホップ、キザロホップを含む）に耐性を付与する例示的遺伝子としては、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）の遺伝子、すなわちＡｃｃ１-Ｓ１、Ａｃｃ１-Ｓ２及びＡｃｃ１-Ｓ３を挙げることができる。１つの実施形態において、除草剤はトリアジン（ｐｓｂＡ及び１ｓ+遺伝子）またはベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）を含め、光合成を阻害することができる。更に、このような選択マーカーとして、ホスホマンノースイソラーゼ（ＰＭＩ）酵素のようなポジティブセレクションマーカーが挙げられる。
１つの実施形態において、選択マーカー遺伝子としては、２,４-Ｄ;ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ;シアナミドヒドラターゼ;アスパラギン酸キナーゼ;ジヒドロジピコリン酸合成酵素;トリプトファンデカルボキシラーゼ;ジヒドロジピコリン酸合成酵素および脱感作アスパラギン酸キナーゼ;ｂａｒ遺伝子;トリプトファンデカルボキシラーゼ;ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＥＯ）;ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴまたはＨＹＧ）;ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）;フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ; ２，２-ジクロロプロピオン酸デハロゲナーゼ;アセトヒドロキシ酸シンターゼ;５-エノイルピルビニル‐シキミ酸‐リン酸塩シンターゼ（ａｒｏＡ）;ハロアリルニトリラーゼ;アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ;ジヒドロプテロイン酸シンターゼ（ｓｕｌ Ｉ）;そして、３２ ｋｄの光化学系ＩＩポリペプチド（ｐｓｂＡ）を挙げることができるが、これらに限定はされない。また、１つの実施形態は、クロラムフェニコール;メトトレキサート;ハイグロマイシン;スペクチノマイシン;ブロモキシニル;グリフォセート;及びフォスフィノスリシン耐性をコード化する選択マーカー遺伝子も含む。選択マーカー遺伝子の上記リストは制限することを意味していない。あらゆる選択マーカー遺伝子は本開示に含まれる。
いくつかの実施形態において、コード配列は植物での最適発現のために合成される。例えば、１つの実施形態において、遺伝子のコード配列は植物での発現を高めるために、コドン最適化によって修飾される。殺虫性耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、または選択マーカー導入遺伝子は、特定の植物種での発現用に最適化する、あるいは双子葉または単子葉植物での最適発現用に修飾することができる。植物の優先コドンは、興味の特定植物において最大量で発現した蛋白質の最多頻度のコドンから決定してもよい。１つの実施形態において、コード配列、遺伝子または導入遺伝子はより高い形質転換効率をもたらすより高レベルで植物に発現させるように設計される。遺伝子の植物最適化の方法は公知である。合成ＤＮＡ配列の最適化及び生成に関するガイダンスは、例えば、参照により本明細書で援用されるＷＯ２０１３０１６５４６、ＷＯ２０１１１４６５２４、ＷＯ１９９７０１３４０２、米国特許第６１６６３０２号、及び米国特許第５３８０８３１号で見出すことができる。
形質転換
植物の最適な形質転換方法としては、ＤＮＡを細胞に導入できるあらゆる方法、例えば、エレクトロポレーション（例えば米国特許第５，３８４，２５３号を参照）;微粒子銃（例えば、米国特許第５，０１５，５８０号、５，５５０，３１８号、５，５３８，８８０号、６，１６０，２０８号、６，３９９，８６１号及び６，４０３，８６５号を参照）;アグロバクテリウム-媒介形質転換（例えば、米国特許第５，６３５，０５５号、５，８２４，８７７号、５，５９１，６１６号、５，９８１，８４０号及び６，３８４，３０１号を参照）;及びプロトプラスト形質転換（例えば、米国特許第５，５０８，１８４号を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。
ＤＮＡ構築物は、例えば炭化けい素繊維（米国特許第５，３０２，５２３号及び５，４６４，７６５号を参照）等の技術を用いて植物細胞のゲノムＤＮＡへ直接導入してもよく、またはＤＮＡ構築物は、例えばＤＮＡ粒子衝撃等の微粒子銃法(例えば、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｎａｔｕｒｅ ３２７：７０−７３を参照)を用いて植物組織に直接導入することができる 。 あるいは、ＤＮＡ構築物は、ナノ粒子形質転換を介して植物細胞へ導入することができる（例えば、参照により本明細書で援用される米国特許公報第２００９０１０４７００号を参照）。
加えて、遺伝子導入は、非アグロバクテリウム 細菌またはウイルス、例えばリゾビウム属種、ＮＧＲ２３４、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｏｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ、ジャガイモウイルスＸ、カリフラワーモザイクウイルス及びキャッサバ葉脈モザイクウイルス及び／またはタバコモザイクウィルスを用いて達成してもよく、例えば、Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ． １１（１）：１−４を参照されたい。
形質転換技術の応用によって、事実上あらゆる植物種の細胞が安全に形質添加することができ、これらの細胞は公知技術によってトランスジェニック植物へ成長させることができる。例えば、ワタの形質転換の文脈において特に有用としてもよい技術は特に綿の転換の前後関係に役立つ場合がある技術は米国特許第５，８４６，７９７号、５，１５９，１３５号、５，００４，８６３号及び６，６２４，３４４号に記載されており;アブラナ属植物の形質転換技術は、例えば米国特許第５，７５０，８７１号に記載されており;大豆の形質転換技術は、例えば技術は、例えば米国特許第６，３８４，３０１号に記載されており;及びトウモロコシの形質転換技術は、例えば米国特許第７，０６０，８７６号及び５，５９１，６１６号、ならびに国際ＰＣＴ公開ＷＯ９５／０６７２２号に記載されている。
レシピエント細胞への外因的核酸の輸送を果たした後、一般に更なる培養及び植物再生のために形質転換細胞を同定する。形質転換体を同定する能力を改善するため、形質転換ベクターを使用して形質転換体を作製するのと併せて、選択マーカー遺伝子を用いることが望ましい。例示的な実施形態においては、細胞を選択剤または薬剤に曝露させることによって形質転換細胞集団を分析し、あるいは、望ましいマーカー遺伝子形質に関して細胞をスクリーニングすることができる。
選択剤への曝露に生き残る細胞、またはスクリーニング検定で陽性スコアの細胞は、植物の再生を支持する培地で培養することができる。１つの実施形態において、任意の好適な植物組織培養培地を、成長調整剤等の更なる物質を含むことによって修飾させてもよい。組織は、植物再生の取り組みを開始するのに十分な組織が利用できるまで成長調整剤を含む基礎培地で維持してもよく、または手動の選択の繰り返し期間の後、組織の形態が再生に最適となるまで（例えば、少なくとも2週間）維持し、その後シュート形成を誘導する培地に移してもよい。培養株はシュート形成が起きるまで定期的に移される。一旦シュートが形成されたら、根の形成を誘導する培地に移す。一旦シュートが形成されたら、根の形成を誘導する培地に移す。
分子確認
形質転換した植物細胞、カルス、組織または植物体は、形質転換するＤＮＡ上にあるマーカー遺伝子によって同定及び単離をすることができる。例えば、選別は、形質転換遺伝子構築物が耐性を付与する抑制的な量の抗生物質または除草剤を含む培地上に組み換え型植物材料を増殖することによって達成することができる。更に、形質転換した植物体及び植物細胞は、組換え型核酸構築物上に存在してもよい任意の可視的マーカー遺伝子（例えば、β‐グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼまたはｇｆｐ遺伝子）の活性をスクリーニングすることによって同定することもできる。そのような選択及びスクリーニング方法論は当業者には公知である。トランスジェニック植物を同定するために使用することができる分子確認方法は当業者には公知である。幾つかの例示的方法を更に以下に記載する。
分子ビーコンが配列検出に使用するために記載されている。簡潔にはＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブを隣接ゲノム及び挿入ＤＮＡ接合体に重なるように設計される。ＦＲＥＴプローブの唯一の構造が近接近で蛍光及び消光部分を保持する二次構造を含むことから得られる。ＦＲＥＴプローブ及びＰＣＲプライマー（挿入ＤＮＡ配列中に１つのプライマー及び隣接ゲノム配列中に１つのプライマー）が熱安定性ポリメラーゼ及びｄＮＴＰの存在下で循環される。効率的なＰＣＲ増幅の後、ＦＲＥＴプローブ(複数)の標的配列へのハイブリッド化によって、プローブの二次構造の除去及び蛍光と消光部分の空間的分離が生じる。蛍光発光は、成功裏の増幅及びハイブリッド化によって隣接ゲノム／導入遺伝子挿入配列の存在を示す。そのような増幅反応の検出用分子ビーコンアッセイが主題開示の１つの実施形態である。
別途ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， Ｃａｌｉｆ．）として知られている加水分解プローブアッセイはＤＮＡ配列の存在を検出及び定量化する方法である。簡潔には、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブは導入遺伝子内の１つのオリゴで設計され、事象特異的検出のために隣接ゲノム配列内にある。ＦＲＥＴプローブ及びＰＣＲプライマー（挿入ＤＮＡ配列中に１つのプライマー及び隣接ゲノム配列中に１つのプライマー）が熱安定性ポリメラーゼ及びｄＮＴＰの存在下で循環される。ＦＲＥＴプローブのハイブリッド化はＦＲＥＴピローブ上で消光部分から離れた蛍光部分の切断と放出を生じる。蛍光発光は、成功裏の増幅及びハイブリッド化によって隣接／導入遺伝子挿入配列の存在を示す。そのような増幅反応の検出用の加水分解アッセイが主題開示の１つの実施形態である。
Ｋａｓｐａｒ（登録商標）は、ＤＮＡ配列の存在を検出し定量化する方法である。簡潔には、組み入れた遺伝子発現カセットポリヌクレオチドを含むゲノムＤＮＡ試料は、ＫＡＳＰａｒ（登録商標）アッセイシステムとして知られるアッセイに基づくポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてスクリーニングされる。主題開示の実施で使用するＫＡＳＰａｒ（登録商標）アッセイは複数のプライマーを含むKASPar（登録商標）ＰＣＲアッセイ混合物を利用することができる。ＰＣＲアッセイ混合物で使用するプライマーは、少なくとも１つのフォワードプライマーと少なくとも１つのリバースプライマーを含むことができる。フォワードプライマーはＤＮＡポリヌクレオチドの特異的領域に対応する配列を含み、リバースプライマーはゲノム配列の特異的領域に対応する配列を含む。加えて、ＰＣＲアッセイ混合物で使用されるプライマーは少なくとも１つのフォワードプライマーと１つのリバースプライマーを含むことができる。例えば、ＫＡＳＰａｒ（登録商標）ＰＣＲアッセイ混合物は、２つの異なる対立遺伝子に対応する２つのフォワードプライマーと１つのリバースプライマーを含むことができる。１つのフォワードプライマーは内在性ゲノム配列の特定領域に対応する配列を含む。第2のフォワードプライマーはＤＮＡポリヌクレオチドの特異的領域に対応する配列を含む。リバースプライマーはゲノム配列の特異的領域に対応する配列を含む。そのような増幅反応検出用のＫＡＳＰａｒ（登録商標）アッセイは主題開示の１つの実施形態である。
いくつかの実施形態において、蛍光発光または蛍光色素は、HEX蛍光色素、ＦＡＭ蛍光色素、ＪＯＥ蛍光色素、ＴＥＴ蛍光色素、Ｃｙ３蛍光色素、Ｃｙ３．５蛍光色素、Ｃｙ５蛍光色素、Ｃｙ５．５蛍光色素、Ｃｙ７蛍光色素及びＲＯＸ蛍光色素からなる群から選択される。
他の実施形態において、増幅反応は、フローサイトメトリーで検出可能な濃縮範囲で細胞ＤＮＡを着色することが可能であり、リアルタイムサーマルサイクラーによって検出可能な蛍光発光スペクトルを持つ最適な第２蛍光ＤＮＡ色素を使用して行う。他の核酸色素は公知であり、絶えず同定されていることが当業者によって理解されるだろう。適切な励起及び発光スペクトルを有した任意の好適な核酸色素は、例えばＹＯ−ＰＲＯ−１（登録商標）、ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（登録商標）、ＳＹＴＯ１１（登録商標）、ＳＹＴＯ１２（登録商標）、ＳＹＴＯ１３（登録商標）、ＢＯＢＯ（登録商標）、ＹＯＹＯ（登録商標）、及びＴＯＴＯ（登録商標）が用いられる。１つの実施形態において、第２蛍光ＤＮＡ色素は、１０μＭ未満、４μＭ未満または２．７μＭ未満で使用されるＳＹＴＯ１３（登録商標）である。
更なる実施形態において、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）は検出に使用することができる。Ｂｒａｕｔｉｇｍａｅｔ ａｌ．， ２０１０によって記載されるように、ＤＮＡ配列分析を用いて単離及び増幅した断片のヌクレオチド配列を決定することができる。増幅断片を単離し、ベクターにサブクローン化し、チェインターミネーター法（サンガーシークエンシングとも称される）またはダイターミネーター法を用いて配列決定を行うことができる。加えて、アンプリコンは、次世代シークエンシングで配列決定することができる。ＮＧＳ技術はサブクローニング工程を必要としない。また複数シークエンシングリードを単一反応で完成することができる。３つのＮＧＳプラットホーム、４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｒｏｃｈｅ製のＧｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ＦＬＸ（商標）、Ｓｏｌｅｘａ製のＩｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｅｒ（商標）、 Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製のＳＯＬｉＤ（商標）（「Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｏｌｉｇｏ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」頭文字）が市販されている。 加えて、現在開発中の２つの単一分子塩基配列解読法がある。これらはＨｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）の単一分子シークエンシング（ｔＳＭＳ）及びＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）の単一分子リアルタイムシークエンシング（ＳＭＲＴ）が含まれる。
４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｒｏｃｈｅ によって市販されているＧｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ ＦＬＸは、配列の読取値を発生させるエマルジョンＰＣＲ及びピロシーケンスを使用するロングリードＮＧＳである。３００〜８００ｂｐのＤＮＡ断片または３〜２０ｋｂの断片を含むライブラリを使用することができる。反応は、２５０〜４００メガ塩基の全収量に対して1ランあたり約２５０〜４００塩基の百万以上のリードを産出することができる。この技術は最長リードを産出するが、１ランあたり全配列出力がＮＧＳ技術と比較して低い。
Ｓｏｌｅｘａによって販売されるＩｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｅｒは、蛍光染料標識可逆化ターミネーターヌクレオチドでの合成手法によるシークエンシングを使った短リードＮＧＳであり、固相ブリッジＰＣＲに基づいている。最高１０ｋｂのＤＮＡ断片を含むｐａｉｒｅｄ ｅｎｄシークエンシングライブラリの構築が使用できる。反応は、長さが３５〜７６塩基である１億超の短い配列を産出する。このデータは１ランあたり３〜６ギガ塩基を産出することができる。
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）から販売されているＯｌｉｇｏ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＳＯＬｉＤ）によるシークエンシングは短リード技術である。このＮＧＳ技術は、長さが最大１０ｋｂの断片化した２本鎖ＤＮＡを使う。このシステムは、色素標識オリゴヌクレオチドプライマとエマルションＰＣＲによるシークエンシングを用いて１ランあたり最大３０ギガ塩基の全配列出力を生じる１０億の短鎖読み取りを産出する。
Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）のｔＳＭＳ及びＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）のＳＭＲＴは配列反応で単一ＤＮＡ分子を使用する異なる手法を適用する。ｔＳＭＳ Ｈｅｌｉｃｏｓ（商標）システムは１ランあたり２１ギガ塩基を生じる最大８００百万の短鎖読み取りを産出する。これらの反応は、「合成手法による配列決定」として記載される蛍光色素標識バーチャルターミネーターヌクレオチドを用いて完了させる。
Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）から販売されているＳＭＲＴ Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇシステムは合成によるリアルタイム配列決定を使用する。この技術は、可逆的ターミネーターによって制限されない結果として長さで最高１，０００ｂｐのリードを産出することができる。二倍性ヒトゲノムの×１カバレージに相当するRawリードスループットが本技術を使って１日あたりに産生することができる。
他の実施形態では、検出はウエスタンブロット、ノーザンブロット及びサザンブロットを含むブロッティングアッセイを使って達成することができる。そのようなブロッティングアッセイは、生体試料の識別及び定量化の生物調査で一般的に用いられる技術である。これらのアッセイは、まず電気泳動法でゲル中の試料成分を分離した後、ゲルから電気泳動的に分離した成分を、ニトロセルロース、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）またはナイロン等の材料から作られた転写膜へ移動することを含む。検体をこれらの支持体に直接スポットしてもよく、または事前分離なしに真空、毛管作用または圧力を適用して支持体上で特定領域に誘導することもできる。次いで転写膜は、一般に移動後処理にかけて、可視的または自動読み取り器によって検体の他から識別、検出される能力を高める。
更なる実施形態において、固相酵素免疫測定法を用いて物質、液体試料または湿潤試料中の通常抗原の存在を検出するＥＬＩＳＡアッセイによって検出を完了することができる。試料の抗原はプレート表面に付着する。次に、抗原に結合できるようにさらに特異抗体を表面上に塗布する この抗体を酵素に結合させて、最終工程で酵素の基質を含む物質を加える。後続反応が検出可能な信号（最も一般的には基質中の色の変化）を産み出す。
トランスジェニック植物
１つの実施形態において、植物体、植物組織または植物細胞は、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイ様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータを含む。１つの実施形態において、植物組織または植物細胞は、配列番号１または配列番号１から選択した配列と８０％、８５％、９０％、９５％または９９．５％の配列同一性をもつ配列のＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイ様遺伝子 （ｍｔｌ）プロモータを含む。１つの実施形態において、植物組織または植物細胞は、配列番号１または配列番号１から選択した配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９．５％の配列同一性をもつ配列のＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイ様遺伝子 （ｍｔｌ）プロモータを含む。別の実施形態において、植物体、植物組織または植物細胞は、配列番号７または配列番号７から選択した配列と８０％、８５％、９０％、９５％または９９．５％の配列同一性をもつ配列を含むＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイ様遺伝子（ｍｔｌ）３′-ＵＴＲを含む。別の実施形態において、植物体、植物組織または植物細胞は、配列番号７または配列番号７から選択した配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９．５％の配列同一性をもつ配列を含むＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイ様遺伝子（ｍｔｌ）３′-ＵＴＲを含む。別の実施形態において、植物体、植物組織または植物細胞は、配列番号１のＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイ様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータを含み、プロモータはＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイ様遺伝子（ｍｔｌ） ５′-ＵＴＲと作用可能に連結され、５′-ＵＴＲは配列番号４または配列番号４から選択した配列と８０％、８５％、９０％、９５％または９９．５％の配列同一性をもつ配列を含む。別の実施形態において、植物体、植物組織または植物細胞は、配列番号1のＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイ様遺伝子 （ｍｔｌ）プロモータを含み、プロモータはＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイ様遺伝子（ｍｔｌ）５′-ＵＴＲと作用可能に連結され、５′-ＵＴＲは配列番号４または配列番号４から選択した配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９．５％の配列同一性をもつ配列を含む。１つの実施形態において、植物体、植物組織または植物細胞は、非Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様導入遺伝子と作用可能に連結される配列番号１から選択した配列、または配列番号１から選択した配列と８０％、８５％、９０％、９５％または９９．５％の配列同一性をもつ配列を含む遺伝子発現カセットを含む。１つの実施形態において、植物体、植物組織または植物細胞は、非Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様導入遺伝子と作用可能に連結される配列番号１から選択した配列、または配列番号１から選択した配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９．５％の配列同一性をもつ配列を含む遺伝子発現カセットを含む。例示的な実施形態において、植物体、植物組織または植物細胞は、導入遺伝子に作用可能に連結されるＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様プロモータを含む遺伝子発現カセットを含み、導入遺伝子は殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択可能マーカー導入遺伝子またはそれらの組合せとすることができる。
１つの実施形態に従って、導入遺伝子と作用可能に連結される非内在性Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）誘導性プロモータ配列を含む植物、植物組織または植物細胞が提供され、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）［9］プロモータ誘導性プロモータ配列が配列番号１または配列番号１と８０％、８５％、９０％、９５％または９９．５％の配列同一性をもつ配列を含む。１つの実施形態において、植物体、植物組織または植物細胞が配列番号 １または 非Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様導入遺伝子に作用可能に連結される配列番号１と８０％、８５％、９０％、９５％または９９．５％の配列同一性をもつ配列を含む植物体、植物組織または植物細胞が提供される。１つの実施形態において、植物体、植物組織または植物細胞が配列番号 １または 非Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様導入遺伝子に作用可能に連結される配列番号１と８０％、８５％、９０％、９５％または９９．５％の配列同一性をもつ配列を含む植物体、植物組織または植物細胞が提供される。１つの実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、双子葉または単子葉植物、または双子葉または単子葉植物から誘導される細胞または組織である。１つの実施形態において、植物はトウモロコシ、コムギ、イネ、モロコシ、オート麦、ライ麦、バナナ、サトウキビ、ダイズ、ワタ、ヒマワリ及びアブラナからなる群から選択される。１つの実施形態において、植物はトウモロコシである。１つの実施形態に従って、植物体、植物組織または植物細胞は、配列番号 １または非 Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様導入遺伝子に作用可能に連結される配列番号１と８０％、８５％、９０％、９５％または９９．５％の配列同一性をもつ配列を含む。１つの実施形態において、植物はトウモロコシである。１つの実施形態に従って、植物体、植物組織または植物細胞は、配列番号 １または非Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様導入遺伝子に作用可能に連結される配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９．５％の配列同一性をもつ配列を含む。１つの実施形態において、植物体、植物組織または植物細胞は、導入遺伝子に作用可能に連結されるプロモータを含み、プロモータは配列番号 １または配列番号１と８０％、８５％、９０％、９５％または９９．５％の配列同一性をもつ配列からなる。１つの実施形態において、植物体、植物組織または植物細胞は、導入遺伝子に作用可能に連結されるプロモータを含み、プロモータは配列番号 １または配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９．５％の配列同一性をもつ配列からなる。１つの実施形態に従って、導入遺伝子に作用可能に連結されるＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様誘導プロモータ配列を含む遺伝子構築物は植物、植物組織または植物細胞のゲノムに取り込まれる。
１つの実施形態に従って、配列番号１または導入遺伝子に作用可能に連結される配列番号 １と８０％、８５％、９０％、９５％または９９．５％の配列同一性を有する配列を含む非キビ属植物、植物組織または植物細胞が提供される。１つの実施形態に従って、配列番号１または導入遺伝子に作用可能に連結される配列番号 １と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９．５％の配列同一性を有する配列を含む非キビ属植物、植物組織または植物細胞が提供される。１つの実施形態に従って、植物、植物組織または植物細胞は、双子葉または単子葉植物、または双子葉または単子葉植物から誘導される細胞または組織である。１つの実施形態において、植物はトウモロコシ、コムギ、イネ、モロコシ、オート麦、ライ麦、バナナ、サトウキビ、ダイズ、ワタ、ヒマワリ及びアブラナからなる群から選択される。１つの実施形態において、植物はトウモロコシである。１つの実施形態に従って、導入遺伝子に作用可能に連結されるプロモータは植物、植物組織または植物細胞のゲノムに取り込まれる。
１つの実施形態において、配列番号１、または配列番号１と８０％、８５％、９０％、９５％または９９．５％の配列同一性をもつ配列を含む非キビ属植物、植物組織または植物細胞が提供され、配列番号１は、導入遺伝子の５′末端ならびに配列番号７または配列番号７と８０％、８５％、９０％、９５％または９９．５％の配列同一性をもつ配列を含む３′非翻訳配列に作用可能に連結され、３′非翻訳配列は前記導入遺伝子に作用可能に連結される。 １つの実施形態において、配列番号１、または配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９．５％の配列同一性をもつ配列を含む非キビ属植物、植物組織または植物細胞が提供され、配列番号１は、導入遺伝子の５′末端ならびに配列番号７または配列番号７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９．５％の配列同一性をもつ配列を含む３′非翻訳配列に作用可能に連結され、３′非翻訳配列は前記導入遺伝子に作用可能に連結される。 別の実施形態において、配列番号１、または配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９．５％の配列同一性をもつ配列を含む非キビ属植物、植物組織または植物細胞が提供され、配列番号１は、配列番号４を含む５′非翻訳配列の３′末端、あるいは配列番号４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９．５％の配列同一性をもつ配列と作用可能に連結され、５′非翻訳配列が前記導入遺伝子に作用可能に連結される。 別の実施形態において、配列番号１、または配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９．５％の配列同一性をもつ配列を含む非キビ属植物、植物組織または植物細胞が提供され、配列番号１は、配列番号４を含む５′非翻訳配列の３′末端、あるいは配列番号４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９．５％の配列同一性をもつ配列と作用可能に連結され、５′非翻訳配列が前記導入遺伝子に作用可能に連結される。 １つの実施形態に従って、植物体、植物組織または植物細胞は、双子葉または単子葉植物であり、または双子葉または単子葉植物から誘導される植物組織または細胞である。１つの実施形態において、植物はトウモロコシ、コムギ、イネ、モロコシ、オート麦、ライ麦、バナナ、サトウキビ、ダイズ、ワタ、ヒマワリ及びアブラナからなる群から選択される。１つの実施形態において、植物はトウモロコシである。１つの実施形態に従って、導入遺伝子に作用可能に連結されるプロモータは植物、植物組織または植物細胞のゲノムに取り込まれる。
１つの実施形態において、本明細書に開示された方法に従った植物体、植物組織または植物細胞は単子葉植物とすることができる。単子葉植物、植物組織または植物細胞としては、限定はされないが、トウモロコシ、イネ、コムギ、サトウキビ 、大麦、ライ麦、モロコシ、ラン、竹、バナナ、ガマ、ユリ、オート麦、タマネギ、キビ、スイッチグラス、芝草及びライコムギの場合がある。
１つの実施形態において、本明細書に開示された方法に従った植物体、植物組織、または植物細胞は双子葉植物することができる。双子葉植物、植物組織または植物細胞は、限定はされないが、アルファルファ、ナタネ、アブラナ 、カラシナ、エチオピアマスタード、ダイズ、ヒマワリ、ワタ、マメ、ブロッコリー、キャベツ、カリフラワー、セロリ、キュウリ、ナス、レタス、メロン、エンドウ、コショウ、南京豆、ジャガイモ、カボチャ、ラディッシュ、ホウレンソウ、テンサイ、ヒマワリ、タバコ、トマト及びスイカの場合がある。
当業者であれば、外因的配列がトランスジェニック植物に安定に取り込まれ、作用可能であることを確認した後、有***雑によって他の植物に導入することができることはわかるであろう。多数の育種技術を任意で、交雑される種に依存して使用することができる。
本開示は、上述のトランスジェニック植物の種子も含み、種子は導入遺伝子または主題開示の遺伝子調節エレメントを含む遺伝子構築物をもつ。本開示は、上記の子孫、クローン、細胞株または細胞を更に包含し、前記子孫、クローン、細胞株または細胞は導入遺伝子または主題開示の遺伝子調節エレメントを含む遺伝子構築物をもつ。
また、本開示は、上述のトランスジェニック植物の栽培を包含し、トランスジェニック植物は導入遺伝子または主題開示の遺伝子調節エレメントを含む遺伝子構築物をもつ。従って、そのようなトランスジェニック植物は、本発明に従った核酸分子で形質転換されることによって、とりわけ、１つ以上の所望形質または主題開示の遺伝子調節エレメントを含むトランスジェニック事象をもつように設計されてもよく、また当業者に公知な任意の方法によって作付けし、または栽培してもよい。
導入遺伝子を発現する方法
１つの実施形態において、植物で少なくとも１つの導入遺伝子を発現する方法は、少なくとも１つの導入遺伝子またはポリリンカー配列に作用可能に連結されるＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータを含む植物を栽培することを含む。１つの実施形態において、植物で少なくとも１つの導入遺伝子を発現する方法は、少なくとも１つの導入遺伝子またはポリリンカー配列に作用可能に連結されるＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）５′‐ＵＴＲ を含む植物を栽培することを含む。１つの実施形態において、植物で少なくとも１つの導入遺伝子を発現する方法は、少なくとも１つの導入遺伝子またはポリリンカー配列に作用可能に連結されるＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）３′‐ＵＴＲを含む植物を栽培することを含む。１つの実施形態において、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータは、配列番号1から選択した配列または配列番号1から選択した配列と８０％、８５％、９０％、９５％または９９．５％の配列同一性をもつ配列からなる。１つの実施形態において、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータは、配列番号1から選択した配列または配列番号1から選択した配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９．５％の配列同一性をもつ配列からなる。別の実施形態において、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）５′-ＵＴＲは、配列番号４から選択した配列または配列番号４から選択した配列と８０％、８５％、９０％、９５％または９９．５％の配列同一性をもつ配列からなる。別の実施形態において、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）５′-ＵＴＲは、配列番号４から選択した配列または配列番号４から選択した配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９．５％の配列同一性をもつ配列からなる。別の実施形態において、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）３′-ＵＴＲは、配列番号７から選択した配列または配列番号７から選択した配列と８０％、８５％、９０％、９５％または９９．５％の配列同一性をもつ配列からなる。別の実施形態において、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）３′-ＵＴＲは、配列番号７から選択した配列または配列番号７から選択した配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９．５％の配列同一性をもつ配列からなる。１つの実施形態において、植物で少なくとも１つの導入遺伝子を発現する方法は、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータ及び少なくとも１つの導入遺伝子に作用可能に連結されるＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）３′‐ＵＴＲを含む植物を栽培することを含む。１つの実施形態において、植物で少なくとも１つの導入遺伝子を発現する方法は、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータ及び少なくとも１つの導入遺伝子に作用可能に連結されるＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）５′‐ＵＴＲを含む植物を栽培することを含む。１つの実施形態において、植物で少なくとも１つの導入遺伝子を発現する方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作用可能に連結されるＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータを含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。１つの実施形態において、植物で少なくとも１つの導入遺伝子を発現する方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作用可能に連結されるＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータ及び３′‐ＵＴＲを含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。１つの実施形態において、植物で少なくとも１つの導入遺伝子を発現する方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作用可能に連結されるＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータ及び５′‐ＵＴＲ を含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。１つの実施形態において、植物で少なくとも１つの導入遺伝子を発現する方法は、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータ及び少なくとも１つの導入遺伝子に作用可能に連結されるＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子 （ｍｔｌ） ３′‐ＵＴＲを含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。１つの実施形態において、植物で少なくとも１つの導入遺伝子を発現する方法は、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータ及び少なくとも１つの導入遺伝子に作用可能に連結されるＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）５′‐ＵＴＲを含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。
１つの実施形態において、植物で少なくとも１つの導入遺伝子を発現する方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作用可能に連結されるＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータを含む遺伝子発現カセットを含む。１つの実施形態において、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータは、配列番号1から選択した配列または配列番号1から選択した配列と８０％、８５％、９０％、９５％または９９．５％の配列同一性をもつ配列からなる。１つの実施形態において、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータは、配列番号1から選択した配列または配列番号1から選択した配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９．５％の配列同一性をもつ配列からなる。別の実施形態において、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）３′-ＵＴＲは、配列番号７から選択した配列または配列番号７から選択した配列と８０％、８５％、９０％、９５％または９９．５％の配列同一性をもつ配列からなる。別の実施形態において、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）３′-ＵＴＲは、配列番号７から選択した配列または配列番号７から選択した配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９．５％の配列同一性をもつ配列からなる。別の実施形態において、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）５′-ＵＴＲは、配列番号４から選択した配列または配列番号４から選択した配列と８０％、８５％、９０％、９５％または９９．５％の配列同一性をもつ配列からなる。別の実施形態において、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）５′-ＵＴＲは、配列番号４から選択した配列または配列番号４から選択した配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９．５％の配列同一性をもつ配列からなる。１つの実施形態において、植物で少なくとも１つの導入遺伝子を発現する方法は、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータならびに少なくとも１つの導入遺伝子に作用可能に連結されるＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）３′‐ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む植物を栽培することを含む。１つの実施形態において、植物で少なくとも１つの導入遺伝子を発現する方法は、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータならびに少なくとも１つの導入遺伝子に作用可能に連結されるＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）５′‐ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む植物を栽培することを含む。１つの実施形態において、植物で少なくとも１つの導入遺伝子を発現する方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作用可能に連結されるＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）３′‐ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む植物を栽培することを含む。１つの実施形態において、植物で少なくとも１つの導入遺伝子を発現する方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作用可能に連結されるＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）５′‐ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む植物を栽培することを含む。１つの実施形態において、植物組織または植物細胞で少なくとも１つの導入遺伝子を発現する方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作用可能に連結されるＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータを含む遺伝子発現カセットを含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。１つの実施形態において、植物組織または植物細胞で少なくとも１つの導入遺伝子を発現する方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作用可能に連結されるＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）３′‐ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。１つの実施形態において、植物組織または植物細胞で少なくとも１つの導入遺伝子を発現する方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作用可能に連結されるＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）５′‐ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。１つの実施形態において、植物組織または植物細胞で少なくとも１つの導入遺伝子を発現する方法は、遺伝子発現カセット、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータ及び少なくとも１つの導入遺伝子に作用可能に連結されるＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子 （ｍｔｌ）３′‐ＵＴＲを含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。１つの実施形態において、植物組織または植物細胞で少なくとも１つの導入遺伝子を発現する方法は、遺伝子発現カセット、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータ及び少なくとも１つの導入遺伝子に作用可能に連結されるＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）５′‐ＵＴＲを含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。
以下の実施例は、ある特定の特徴及び／ま実施形態を例示するために提供される。実施例は、例示した特定の特徴または実施形態に開示を制限するものと解釈されるべきではない。
実施例１．Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）のプロモータ
Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）（配列番号１）のプロモータは、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）配列から同定された１，８７５ｂｐポリヌクレオチド配列である。プロモータ配列は、ＢＬＡＳＴｉｎｇ Ｐｈｙｔｏｚｏｍｅデータベース（Ｇｏｏｄｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１２）によって、トウモロコシメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）に関して同定された。得られたヒットを解析し、単一コード配列を更なる解析用に選択した。何百万塩基対にわたった隣接する染色体配列の評価から、異種のコード配列の発現用に１，８７５ｂｐのポリヌクレオチド配列を同定し、単離した。この新規ポリヌクレオチド配列を、遺伝子発現を促進させる調節配列とし使用するために解析した。下記の配列（配列番号２）で示したように、配列番号１の１，８７５ｂｐＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ） プロモータは、塩基対１〜１，８７５として提供される。配列番号４の９７ｂｐＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ） ５′-ＵＴＲは、塩基対１，８７６〜１，９７２として提供される。配列番号８の生来のｍｔｌ遺伝子コード配列は塩基対１，９７３〜２，３２８として提供される。配列番号３の３７１ｂｐＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子 （ｍｔｌ） ３′-ＵＴＲは、塩基対２，３２９〜２，６９９として提供される。配列番号７の１，０００ｂｐＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）３′-ＵＴＲは、塩基対２，３２９〜３，３２８として提供される。従って、配列番号２は以下のように提供される：
gtatctgtttttgctcccactgttcacatctgattcatttgcacaacttattacactggtatatcatatcatatttgacgcctctagagtttcctcggtaattactatttgctaatgcattaaatttgctctttttccatcaatttcaattgctaaatcattatcttaattcgccatgctactactaagatgtttttaaaaacctcttttttctgtctatataataaaggtaaagtataataaatcttgagtatgtgtctagcttggttcctagaataggttaggaatcttgagtagctactcggcccggctatcaatcatgtactacatacatctttttcccggtaacatgcacttgatgatgcagtagtggagtttttttttctcaccattgtcaaaagcaagtctaatgttcactaacaataggcttttcgtatgcttaatttttttttctttccaaagtttacgacgacaaacgtatcgcctttgaaaagcatcaaatttcggccctaccttttattcttctcccagaggcagttactgcagaagcacgccgggttgaggtcgttgtggacaaaccaatcctccaaaccggctgggagtattttcgtaacttttgtggaaccaattgttttaggttccttgaacaacgaagtaacaaggatgatgtgacagatggagcctttgttaactcgaagcgataaaattgtttctgctagccccttcccaatcaaagcagaaatatccatctagtaaattactgatgtgctggatgtgatgatgttttattgttgtctcagtcaaaacaaatgatccagacaggttggcaaacgaaggttacatacagtgtatatattaataaggaaatagaaaaagaatcatgcatgtatttagttgctctcgaccgtatactaaagaacagatatctgtagacattagtaggtactacgtacgtattgcagaaacttgttttagcaagtgttcgagaagaaggaataattattgaattgaatgcatatatatctgaaagcaacctgtgatagaagaaaaattatattcacaaggaagaaagaaggcacatttcttgccggcaaggaatagctagcgtcgtaaaatagtggcctcttattcggtcttgcatcattgtgaatctagctagaaacgtggtcctggtgcgtgtctgaatgatatccatgagatggagcaagggaagcagagaagtcaagcacgccttgttcattagcttattgtgtgactctgcagaaaagaaagcaaccaggagcattttttttccaatataatgcggttgctttcgatttggaggacagagacgtcgtatacacaaggcaatactttatggtattcgtcaagcggcattaattgtaaatatatcaaagaaaatactgtagatgagagaaattaagttttacatgtatttttttattgaacacgcaggagagttgtgtatcattgtattttttattattgttattaattaggcttcaattgtcgttagaaacataatggtagatgcagaggaagttttgactgaattggtaaccttatcttctacctatcatttttgttgtgcatgcagtaacattattatttattggttttgtttggagagatgccaaaaatcaacttgcgggaatcctttttttgaaacgaattttcttttgtgaaaacgaaagtgtcttgggaataatcttgcttgaatactagttacctagcaattctttcactgtcaaagggtcgggcccacagctcaccaagacaagtgggcattggatggggcgacgactctcctacccaagcaattaaggacacgaaaccacgtctgtatacgtctctgtataaaagccggggtgctggGGTTGAGGCTCTTCATTCAGCTGAGTGTGCTCGATCATCAAGCAATCAACAAAGCCTCCCAATTATCCTTTCATCCGATCATCTTCCTTCTTCCAAGatgtcttgcagctgcggatcaagctgcaactgcggctccaactgcaagtgcgggtatgttacttattactaaagcgagtaacatttccacctcaaattttggtttggtcggtcttatgtagtctctttaatttgctgctagctgttacaacaaatataatcttgccttgactttgttgcagcaagatgtaccctgaccttgaggagaagagcagcggcggcgctcaggccaccgtcgtcctcggcgtggccccggagaagaaggccggccagttcgaggcggcggcggagtccggcgagaccgcccacgcctgcaagtgcggtaacagctgcagctgcgacccctgcaactgctgatttcgatggggaacgtcagaacacacctgcatgcatgctagctactacctactactctgcttgtgtgtgacttgatgattgaacaagaataaggatgagcctgagccatcatgtctcatgtatcggtttggctccggcctcatcaagcatgcatgcgtcgtctgcccctctgtgtgctttgcgtccgtcctgtgtctgtatgtgttgatcattgcaaagaaaccatgcaggcatacatctctgcatgtgtctctgtaatgatcggtccagagtgatgaatatataaaactggtttgctttatctgcctaatgcgtatttatcgtcttaatttggatcgtctttgcaaaatggaaaaaaacaggttccagcctctgcaccgggttttggatggataccgtaccaaattgttggtttctttcttcaggtcttcagtgcttcaagtttggaattggataccacaacaaatagggatcacctctactttagaatatacaagaaatcatgtcgccgaaaattagcactggcaacagagcaatataatagagacctttagttttctactgctaaaaaagattcagactatgttacaactaaaaccaaccctcgcacgggcaggcaaaataataaaactatggactgcctacagttctcaactgctaagaaccatccctatgctatttcagcaacatcatatcatccgaagcgatggcatatatactaccatcatcctatgactgaaaaaattttccaacaaagaaagtacaattcccagcaataatcagagcactgaggaggctttgcttggtcacacacaattcatccatgagagaaacaaaccaccatgttctccgcagctgtgcactatattgaagcttctaaccattgacactgtagtggcaaaacatatttatgtcagggttacaagatcagctcaatatggctttttaccgagatcaacaggaaatactcaaagtaaactgattaaggaccaaggcatca
実施例２：ベクター構築物
以下のベクターは、導入遺伝子のＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）上流のプロモータに取り込むために構築した。ベクター構築物ｐＤＡＢ１２０４１７は遺伝子発現カセットを含み、遺伝子発現カセットでは、ｐｈｉ−ｙｆｐ導入遺伝子（Ｐｈｉ−ｙｅｌｌｏｗ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ； Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ）が、プロモータ（配列番号１のＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）のプロモータ）によって促進され、配列番号４のＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子 （ｍｔｌ）の５′‐ＵＴＲを取り込み、配列番号７のＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）３′‐ＵＴＲによって隣接された。この遺伝子発現カセットの図は、図１に示されて、配列番号５として提供される。また、ベクターは、ａａｄ-１導入遺伝子（米国特許 第７,８３８,７３３号）を含む選択マーカー遺伝子発現カセットを含み、導入遺伝子はトウモロコシユビキチン１プロモータ（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎｅｔ ａｌ., （１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １８； ６７５ 689) によって促進され、トウモロコシリパーゼ3’ -UTR (米国特許第７，１７９，９０２号）によって停止される。 この遺伝子発現カセットの図は、図１ に示され、配列番号６として提供される。この構築物は、外部のプロバイダー（Ｇｅｎｅａｒｔ ｖｉａ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）によって与えられたＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子の新たに設計したプロモータを合成し、プロモータを、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）シームレスクローニングおよびアセンブリキット（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び制限酵素を使用してＧａｔｅｗａｙ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ドナーベクターにクローニングすることによって構築した。得られたドナーベクターをＧａｔｅｗａｙ（商標）クローニングシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、最終的なバイナリーデスティネーションベクターに組み入れた。ｐＤＡＢ１２０４１７のクローンを得て、制限酵素消化及びシークエンシングを介して確認した。得られた構築物は、プロモータの３′末端に作用可能に連結された導入遺伝子の発現を強く促進する可能性があるプロモータを含んだ。
実施例３：触媒Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）調節エレメント
この配列番号１の１，８７５ｂｐＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ） プロモータは、プロモータ配列を変更することによって修飾した。２つの変異体を配列番号９と配列番号１０として設計した。修飾Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ メタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ） の配列番号１のプロモータと修飾Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子 （ｍｔｌ） の配列番号９と配列番号１０のプロモータを比較したアライメントが図２に提供されている。図２に示されるように、配列番号１及び配列番号９のプロモータポリヌクレオチド配列は９８．８％の配列同一性を共有する。加えて、図２は、配列番号１及び配列番号１０のプロモータポリヌクレオチド配列は９７．３％の配列同一性を共有することを示す。最後に、図２に示されるように、配列番号９及び配列番号１０のプロモータポリヌクレオチド配列は９７．３％の配列同一性を共有する。本明細書では、配列番号１のＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ） プロモータを起源とする新規なプロモータ配列が提供される。１つの実施形態において、配列番号９の新規なプロモータポリヌクレオチド配列は、遺伝子発現カセットに使用して導入遺伝子の発現を促進することができる。本実施形態の別の態様において、配列番号９の新規なプロモータポリヌクレオチド配列は、５′-ＵＴＲ（例えば、配列番号４の５′-ＵＴＲ）に作用可能に連結することができ、また、遺伝子発現カセットに使用して導入遺伝子の発現を促進することができる。１つの実施形態において、配列番号１０の新規なプロモータポリヌクレオチド配列は、遺伝子発現カセットに使用して導入遺伝子の発現を促進することができる。この実施形態の他の態様において、配列番号１０の新規なプロモータポリヌクレオチド配列は、５′-ＵＴＲ（例えば、配列番号４の５′-ＵＴＲ）に作用可能に連結することができ、また、遺伝子発現カセットに使用して導入遺伝子の発現を促進することができる。
配列番号７の１，０００ｂｐＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ） ３′-ＵＴＲは、３′-ＵＴＲ配列を変化させることによって修飾した。新たな変異体が設計され、配列番号１１として提供される。新規Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ） の配列番号7の３′‐ＵＴＲ 及び修飾Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ） の配列番号１１の３′‐ＵＴＲを比較したアライメントが図3に提供されている。図３に示されるように、配列番号７及び配列番号１１の３′‐ＵＴＲポリヌクレオチド配列は９７．４％の配列同一性を共有する。本明細書では、配列番号７のＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ） ３′‐ＵＴＲを起源とする新規な３′‐ＵＴＲ配列が提供される。１つの実施形態において、配列番号１１の新規な３′‐ＵＴＲポリヌクレオチド配列は、遺伝子発現カセットに使用して導入遺伝子の発現を促進することができる。本実施形態の別の態様において、配列番号１１の新規３′‐ＵＴＲ ポリヌクレオチド配列は、プロモータ（例えば、配列番号1のプロモータ）に作用可能に連結することができ、また、遺伝子発現カセットに使用して導入遺伝子の発現を促進することができる。
実施例４：トウモロコシ形質転換転換
アグロバクテリウムチュメファシエンスの形質転換：
二元（バイナリー）発現ベクターを、アグロバクテリウムチュメファシエンス株ＤＡｔ１３１９２（ＲｅｃＡ欠失ターナリー株）（国際特許公開ＷＯ２０１２０１６２２２）に形質転換した。 細菌コロニーを選別し、バイナリープラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素消化を介して確認した。
アグロバクテリウム培養開始：
アグロバクテリウム 培養菌をグリセロールストックからＡＢ最少培地（Ｇｅｌｖｉｎ， ｓ．， ２００６，Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ Ｇｅｎｅ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ， ｉｎ Ｗａｎｇ， ｋ．，ｅｄ．， Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｖｏｌ．１， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， ｐ．７９；ショ糖不含の５ｇ/Ｌグルコース及び１５ｇ/ＬＢａｃｔｏ（商標）寒天で製作）上に画線培養し、３日間日中２０℃で温置した。アグロバクテリウム培養菌を、ＹＥＰ培地（Ｇｅｌｖｉｎ， ｓ．， ２００６， Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ Ｇｅｎｅ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ， ｉｎ Ｗａｎｇ， ｋ．， ｅｄ．， Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｖｏｌ． １， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， ｐ． ７９）のプレート上に画線培養し、１日間日中２０℃で温置した。
実験の日に、接種培地（２．２ｇ/ＬのＭＳ塩、６８．４ｇ/Ｌのショ糖、３６ｇ/Ｌのグルコース、１１５ｍｇ/ＬのＬ-プロリン、２ｍｇ/Ｌのグリシン、１００ｍｇ/Ｌのミオイノシトール、０．０５ｍｇ/Ｌのニコチン酸、０．５ｍｇ/ＬのピリドキシンＨＣｌ、０．５ｍｇ/ＬのチアミンＨＣｌ）及びアセトシリンゴンの混合物を実験のサイズに適した体積で調製した。１００％ジメチルスルホキシドのアセトシリンゴンの１Ｍ原液を接種培地に加えて２００μＭのアセトシリンゴン最終濃度を調製した。
各構築物について、ＹＥＰプレートからの１〜２白金耳のアグロバクテリウム を、無菌、使い捨ての５０ｍｌ遠心管内の１５ｍｌ接種培地／アセトシリンゴン混合物に懸濁し、６００ｎｍ（Ｏ.Ｄ.６００）の光学濃度を分光光度計で測定した。次いで、懸濁液を追加の接種培地/アセトシリンゴン混合液を使用して０．２５-０．３５Ｏ.Ｄ.６００に希釈した。次いで、アグロバクテリウム懸濁液チューブを使用前の１〜４時間、室温で約７５ｒｐｍでプラットフォームシェーカーセット上で水平に配置した。
トウモロコシ形質転換：
実験構築物をアグロバクテリウム介在性形質転換を介してトウモロコシに形質転換（トウモロコシは 近交系、Ｚｅａ ｍａｙｓ ｃ．ｖ． Ｂ１０４から単離した未熟胚であった。使用した方法は、Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４：７４５−７５０ ａｎｄ Ｆｒａｍｅ ｅｔ ａｌ．， （２００６） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２５： １０２４−１０３４によって出版された方法と類似するが、幾つかの改変及び改良を加えて、高スループット形質転換に従順な方法を作った。 トウモロコシで多くのトランスジェニック事象を産生するのに使用した方法の１例が、胚培養及び共培養段階で始まる米国特許出願公開第２０１３／０１５７３６９Ａ１号に与えられている。
推定上Ｔ０トランスジェニック小植物を、培養培地（Ｐｒｅｍｉｘ ＢＸ； Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｔｅｃｈ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ）で満たした小型３．５インチのプラスチックポット（Ｔ．Ｏ．Ｐｌａｓｔｉｃｓ；Ｃｌｅａｒｗａｔｅｒ， ＭＮ）にＰｈｙｔａｔｒａｙｓ（商標）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ； Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）から移植し、ｈｕｍｉｄｏｍｅｓ（Ａｒｃｏ Ｐｌａｓｔｉｃｓ Ｌｔｄ．）で被覆した後、育成室（２８℃昼間/２４℃夜間、１６時間光周性、５０-７０％湿度、２００μＥｍ‐２秒‐1、光強度）でハードニングオフを行った。植物がＶ３-Ｖ４成長段階（３〜４カラーリーフが見える）に達したとき、Ｓｕｎｓｈｉｎｅ Ｃｕｓｔｏｍ Ｂｌｅｎｄ １６０混合土壌に移植し、温室（光曝露型：光または同化;光輝度制限：１２００ＰＡＲ；１６時間の日長;２７℃昼間/２４℃夜間）で開花まで栽培した。 植物を導入遺伝子の相対コピー数を検出するために設計したプライマーを使用してｑＰＣＲアッセイによって導入遺伝子コピー数を解析し、促進用に選択した推定単一コピーイベントを５ガロンポットに移植した。
実施例５：コピー数の分子確認
ｐｈｉ−ｙｆｐの安定な組込みがトランスジェニックＺ. ｍａｙｓ植物のゲノム内にあることが加水分解プローブアッセイを介して確認された。カルスから成長した安定形質転換トランスジェニックＺ． ｍａｙｓ小植物が得られ、完全長Ｔ鎖挿入物の小コピー数（１〜２コピー）を含む事象が確認された。確認された小植物を温室に進めで栽培した。
Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ４８０（商標）システムを使用して導入遺伝子コピー数を測定した。方法は、ｐｈｉ−ｙｆｐ遺伝子及び内在性Ｚ. ｍａｙｓ参照遺伝子に特異的オリゴヌクレオチド、インベルターゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｕ１６１２３．１）、単一アッセイを用いるｂｉｐｌｅｘ ＴａｑＭａｎ（登録商標）反応を利用した。 コピー数及び接合生殖性は、既知コピー数標準と比較するときにインベルターゼ特異的蛍光に対するｐｈｉ−ｙｆｐ特異的蛍光の強度を測定することによって決定した。
ｐｈｉ−ｙｆｐ 遺伝子-特異的ＤＮＡ断片は、ＦＡＭ（商標）蛍光色素で標識化したＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマー／プローブセットで増幅し、インベルターゼは、ＨＥＸ（商標）蛍光で標識化したＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマー／プローブセットで増幅した。試料のコピー数及び接合生殖性は、リポーター遺伝子、既知コピー数標準と比較するとき、参照遺伝子、インベルターゼに特異的な蛍光に対する、ｐｈｉ−ｙｆｐに特異的な蛍光相対強度を測定することによって決定した。
実施例６：蛋白質発現の分子確認
蛋白質抽出
Ｎｕｎｃ（登録商標）９６ウェルマキシソーププレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）をＥＬＩＳＡで使用した。プレートは、マウスモノクローナル抗Phi-YFPキャプチャー抗体（ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）で被覆した。抗体をＰＢＳ（１μｇ/ｍｌ）で希釈し、１５０μＬの希釈ＰＢＳをウエルに加えた。プレートを４℃で一晩中温置した。プレートは、２０〜３０分間保持した後、３５０μＬの洗浄緩衝剤［０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）‐２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を補充した１ｘ ＰＢＳ］で４ｘ洗浄した。次に、プレートをブロッキングバッファー［０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）‐２０を補充した１ｘ ＰＢＳプラス０．５％ＢＳＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｒｏｂｕｍｉｎ（登録商標）)]のウエルあたり２００μＬで+３７℃で最低１時間、ブロック化し、その後、３５０μＬの洗浄緩衝剤(Ｔｏｍｔｅｃ ＱｕａｄｒａＷａｓｈ（商標）、２， Ｔｏｍｔｅｃ， Ｉｎｃ．， Ｈａｍｄｅｎ， ＣＴ)で４ｘ洗浄した。
Ｐｈｉ−ＹＦＰ ＥＬＩＳＡに関して、Ｅｖｒｏｇｅｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈｉ−ＹＦＰ １ｍｇ／ｍＬ （Ａｘｘｏｒａ ＬＬＣ， Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ， ＮＹ）を標準に使用した。５‐パラメータフィット標準曲線（１ｎｇ／ｍｌ〜０．１２５ｎｇ／ｍｌ標準）を使用して曲線の線形部分に全データが位置するのを確保した。次に、１００μＬの標準または試料をウエルに添加した。アッセイ緩衝剤で最小１:４に希釈した試料を使用した。プレートは、プレート振盪機（２５０ｒｐｍ;タイタープレート振盪機）上で１時間室温で温置し、その後、３５０μＬの洗浄緩衝剤（Ｔｏｍｔｅｃ ＱｕａｄｒａＷａｓｈ（商標）２）で４ｘ洗浄した。約１００μＬの１μｇ/ｍＬ Ｅｖｒｏｇｅｎウサギポリクローナル抗Ｐｈｉ−ＹＦＰ一次抗体（Ａｘｘｏｒａ）を各細胞ウエルに加えた。プレートは、２５０ｒｐｍでプレート振盪機上、室温で１時間温置し、次いで、３５０μＬの洗浄緩衝剤（Ｔｏｍｔｅｃ ＱｕａｄｒａＷａｓｈ（商標）２）で４ｘ洗浄した。次に、１００μＬの抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰ二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をブロッキング/アッセイ緩衝剤で１:５０００に希釈し、各ウエルに加えた。プレートは、２５０ｒｐｍのプレート振盪機上、室温で１時間温置し、その後、３５０μＬの洗浄緩衝剤（Ｔｏｍｔｅｃ ＱｕａｄｒａＷａｓｈ（ｓｈｏｕｈｙｏｕ）２）で４ｘ洗浄した。次いで、１００μＬのＰｉｅｒｃｅ １ Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）基質を各ウエルに加えて、１０分間緩く振蕩させた。反応は、５０μＬの０．４Ｎ Ｈ２ＳＯ４を加えて停止させた。吸光度は、６５０ｎｍの参照フィルタを用いて４５０ｎｍで読んだ。
Ｐｈｉ−ＹＦＰ発現レベルは、Ａｃａｄｉａ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ （Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＭＥ）製キットを用いたＥＬＩＳＡによって決定した。ＥＬＩＳＡは、抽出物の複数の希釈液、試薬、供給元により提供された指示書を使って行った。蛋白質レベルは、総可溶性蛋白質アッセイを用いてノーマライズし、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃにより供給された６６０ｎｍ蛋白質アッセイ試薬を用いて及びその供給者の説明に従って実施した。
実施例７：Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）のプロモータに作用可能に連結される遺伝子の発現
トウモロコシ植物を、上述のＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）のプロモータを含む遺伝子発現構築物で形質転換した。ＥＬＩＳＡ分析で、新規プロモータが導入遺伝子の発現を強力に促進することを確認した。新規プロモータ構築物を含むトランスジェニック植物から得られたＰｈｉ−ＹＦＰ蛋白質の定量的測定は表１に示される。データは、新規Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）プロモータ（すなわち、ｐＤＡＢ１２０４１７）を含む植物におけるＰｈｉ−ＹＦＰ蛋白質を示す。
安定に組み込まれた１２０４１７トランスジェニック事象を含むＴ０単一の導入遺伝子コピー植物を、野生型Ｂ１０４トウモロコシ植物に戻し交配し、成熟植物まで栽培されたＴ１種子を得た。これらの成熟植物体から、半接合Ｔ1植物を分析に使用して、ＡＡＤ１及びＰｈｉ−ＹＦＰ蛋白質の発現を測定した。構築物あたり５つの事象及び１事象あたり１０の植物を蛋白質発現解析に使用した。１構築物あたり３つの事象及び１事象あたり３〜５の植物を他の組織タイプ発現に使用した。接合生殖性分析はＰｈｉ−ＹＦＰ／ＡＡＤ１に対して行った。新規プロモータ構築物を含むＴ１トランスジェニック植物の葉、穂軸、外皮、花粉、根、絹糸及び茎組織を含む異なる組織タイプから得られたＰｈｉ−ＹＦＰ及びＡＡＤ１蛋白質の定量ＥＬＩＳＡを表２に示す。データは根組織でのT０発現を確認し、更に、Ｐｈｉ−ＹＦＰ蛋白質の一貫した発現が新規プロモータ（ｐＤＡＢ１２０４１７）を含む植物の穂軸、外皮、絹糸及び茎組織で得られたことを示した。更にまた、データは、Ｐｈｉ−ＹＦＰ蛋白質の発現は、新規プロモータ（ｐＤＡＢ１２０４１７）を含む植物の花粉組織では得られなかったことを更に示した。これらのデータは、ここで例示される新規プロモータがトランスジェニック植物内の花粉組織より他の組織で導入遺伝子の構成的発現を促進し、この発現プロフィールは第１世代から第２世代へ継承されることを示す。従って、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）のプロモータが生物工学応用に有用である。

表２ トランスジェニックトウモロコシ植物の異なる組織タイプでの蛋白質発現

Ｐｈｉ−ＹＦＰ ＥＬＩＳＡ結果は、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ） プロモータ調節エレメント（配列番号１）及び３′-ＵＴＲ（配列番号７）は、構築物、ｐＤＡＢ１２０４１７で形質転換されたトランスジェニック事象でＰｈｉ−ＹＦＰの地下での優先的発現、根組織では選択的は発現を促進したことを示した。Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ） プロモータ調節エレメントによるＰｈｉ−ＹＦＰの中程度発現が、穂軸、外皮、葉、絹糸、及び茎組織で観察された（表１及び表２）。また、形質転換から得られた事象は葉及び根の両方でＡＡＤ１蛋白質を発現した。これらの事象内のＡＡＤ１の発現は、異なる組織でのＰｈｉ−ＹＦＰの発現レベルを比較するために、対照として役に立った。要約すると、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ） プロモータは、地下組織内の導入遺伝子の強靭な発現ならびにトウモロコシのような植物種の穂軸、外皮、葉、絹糸及び茎組織内での導入遺伝子の中度の発現のために開発された。
実施例８：Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）のプロモータに作用可能に連結される遺伝子の作物形質転換
ダイズは、出願公開ＷＯ２００７／０５３４８２の実施例#11または実施例＃１３に以前記載した同じ技術を利用してＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ） のプロモータに作用可能に連結される遺伝子で形質転換することができる。
ワタは、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ メタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）のプロモータと作用可能に連結される遺伝子で形質転換することができ、米国特許第７,８３８,７３３号の実施例#１４または出願公開ＷＯ２００７／０５３４８２（Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．)の実施例＃１２に以前記載と同じ技術を利用している。
アブラナは、米国特許第７,８３８,７３３号の実施例#26または出願公開ＷＯ２００７／０５３４８２（Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．）の実施例＃２２で以前記載と同じ技術を利用してＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）のプロモータと作用可能に連結される遺伝子で形質転換することができる。
コムギは、出願公開ＷＯ２０１３/１１６７００Ａ１（Ｌｉｒａ ｅｔ ａｌ．）の実施例＃２３に以前記載と同じ技術を利用して、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ メタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）のプロモータと作用可能に連結される遺伝子で形質転換することができる。
ダイズは、特許公開ＷＯ２０１３/１１６７００Ａ１（Ｌｉｒａ ｅｔ ａｌ．）の実施例＃１９に以前記載した同じ技術を利用してＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子 （ｍｔｌ）のプロモータに作用可能に連結される遺伝子で形質転換することができる。
実施例９：アグロバクテリウム介在性形質転換で、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）のプロモータに作用可能に連結される遺伝子を使用。
主題開示を考慮して、追加的作物は、当技術分野において公知である技術を使用して主題開示の実施形態に従って形質転換することができる。ライ麦のアグロバクテリウム介在性形質転換に関しては、例えば、Ｐｏｐｅｌｋａ ＪＣ， Ｘｕ Ｊ， Ａｌｔｐｅｔｅｒ ｆ．， “Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｙｅ ｗｉｔｈ ｌｏｗ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ａｆｔｅｒ ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ （Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ ｌ．） ｐｌａｎｔｓ ｉｎｓｔａｎｔｌｙ ｍａｒｋｅｒ−ｆｒｅｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｙｅ，” Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ ２００３ Ｏｃｔ；１２（５）：５８７−９６）を参照されたい。モロコシのアグロバクテリウム介在性形質転換に関しては、例えば、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ.,"Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｏｒｇｈｕｍ ｔｏｒａｎｓｕｆｗｏ−ｍｅ−ｓｈｏｎ，“ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０００ Ｄｅｃ；４４（６）：７８９−９８を参照されたい。オオムギのアグロバクテリウム介在性形質転換に関しては、例えば、Ｔｉｎｇａｙ ｅｔ ａｌ．， “Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂａｒｌｅｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，” Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ， （１９９７） １１：１３６９−１３７６を参照されたい。コムギのアグロバクテリウム介在性形質転換に関しては、例えば、Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， “Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｗｈｅａｔ Ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ，” Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １９９７ Ｎｏｖ；１１５（３）：９７１−９８０を参照されたい。 イネのアグロバクテリウム介在性形質転換に関しては、例えば、Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ．， “Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｃｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ，” Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９９７ Ｓｅｐ；３５（１−２）：２０５−１８を参照されたい。
これら及び他の植物のラテン名は以下に与えられる。他の（非アグロバクテリウム）形質転換技術を使用して、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）のプロモータに作用可能に連結される遺伝子を形質転換することができることは明らかであろう。実施例はとしては、これらに限定されるものではないが、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｓｐｐ.）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓｐｐ及びＺｉｚａｎｉａ ｓｐｐ.）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｓｐｐ.）、ワタ（Ａｂｒｏｍａ ａｕｇｕｓｔａ及び Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｓｐｐ.）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、砂糖及びテーブルビート（Beta ｓｐｐ.）、サトウキビ（Ａｒｅｎｇａ ｐｉｎｎａｔａ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ及び他の属種、ホオズキ、ナス及び他の属種、タマリロ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔａｓ）、ライ麦（Ｓｅｃａｌｅ ｓｐｐ.）、トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ、ラッキョウ、シソ）、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ、キク（ｐｅｒｅｎｎｉｓ）、クリ（ｐｕｌｃｈｅｌｌａ））、キャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐｐ.）、セロリ（Ａｐｉｕｍ ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ）、ナス（Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）、南京豆（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇｅａ）、ソルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｓｐｐ.）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、マメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｓｐｐ.)、オート麦（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ)、エンバク（ｓｔｒｉｇｏｓａ）、エンドウ（Ｐｉｓｕｍ， Ｖｉｇｎａ、シカクマメ（Ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ）ｓｐｐ.）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、スクワッシュ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｓｐｐ.）、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖａ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｐｐ.）、アラビドプシス（シロイヌナズナ）、芝草（ライグラス、ヌカボ、イチゴツナギ属、ギョウギシバ及び他属）、クローバー（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ）、ソラマメ類（Ｖｉｃｉａ）を挙げることができる。Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）のプロモータと作用可能に連結される遺伝子によるそのような植物の形質転換は、例えば、主題開示の実施形態において考慮される。
作用可能に連結される遺伝子を促進するためのＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）のプロモータの使用は、多くの落葉性及び常緑樹木種で展開することができる。また、そのような応用は本開示の実施形態の範囲内でもある。これらの種としては、これらに限定されないが、ハンノキ（Ａｌｎｕｓ ｓｐｐ.）、アッシュ（Ｆｒａｘｉｎｕｓ ｓｐｐ.）、ハコヤナギ及びポプラ種（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｓｐｐ.）、ブナノキ（Ｆａｇｕｓ ｓｐｐ.）、樺（Ｂｅｔｕｌａ ｓｐｐ.）、サクランボ（Ｐｒｕｎｕｓ ｓｐｐ.）、ユーカリノキ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｓｐｐ.）、ヒッコリー（Ｃａｒｙａ ｓｐｐ.）、カエデ（Ａｃｅｒ ｓｐｐ.）、オーク（Ｑｕｅｒｃｕｓ ｓｐｐ.）及びマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｐｐ.）を挙げることができる。
作用可能に連結される遺伝子を促進するためのＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍメタロチオネイン様遺伝子（ｍｔｌ）のプロモータの使用は観賞植物及び結実種で展開することができる。また、そのような応用は本開示の実施形態の範囲内でもある。実施例としては、これらに限定はされないが、バラ（Ｒｏｓａ ｓｐｐ.）、ホウキグ（Ｅｕｏｎｙｍｕｓ ｓｐｐ.）、ツクバネアサガオ（Ｐｅｔｕｎｉａ ｓｐｐ.）、ベゴニア（Ｂｅｇｏｎｉａ ｓｐｐ.）、ツツジ（Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ ｓｐｐ.）、野生リンゴまたはリンゴ（Ｍａｌｕｓ ｓｐｐ.）、西洋ナシ（Ｐｙｒｕｓ ｓｐｐ.）、桃（Ｐｒｕｎｕｓ ｓｐｐ.）及びマリゴールド（Ｔａｇｅｔｅｓ ｓｐｐ.）を挙げることができる。
多くの例示的態様及び実施形態が上記で考察されているが、当業者は、特定の改変、置換、追加及びそれらのサブコンビネーションを気づくであろう。従って、下記に添付の特許請求の範囲、以下に導入した特許請求の範囲は、真の趣旨および範囲内にあるそのような全ての改変、置換、追加及びサブコンビネーションを含むと解釈されることが意図されている。

Claims (18)

  1. 核酸ベクターであって、
    ａ）ポリリンカー配列;
    ｂ）非メタロチオネイン様遺伝子;または
    ｃ）ａ）及びｂ）の組合せに作用可能に連結されるプロモータを含み、前記プロモータが配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性をもつポリヌクレオチド配列を含む、前記ベクター。
  2. 前記プロモータは、長さが１，８７５ｂｐである、請求項１に記載の核酸ベクター。
  3. 前記プロモータは、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性をもつポリヌクレオチド配列からなる、請求項１に記載の核酸ベクター。
  4. 選択マーカーをコード化する配列を更に含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸ベクター。
  5. 前記プロモータは、導入遺伝子に作用可能に連結される、請求項１に記載の核酸ベクター。
  6. 前記導入遺伝子は、殺虫剤耐性、低分子ＲＮＡ発現、部位特異的ヌクレアーゼ、除草剤耐性、窒素利用効率、水利用効率、栄養価またはＤＮＡ結合蛋白質を付与する選択マーカーまたは遺伝子産物をコード化する、請求項５に記載の核酸ベクター。
  7. 配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性をもつ３′非翻訳ポリヌクレオチド配列または配列番号７と少なくとも９０％配列同一性をもつ３′非翻訳ポリヌクレオチド配列を更に含み、前記３′非翻訳配列が前記ポリリンカーまたは前記導入遺伝子と作用可能に連結される、請求項１〜３または５のいずれか１項に記載の核酸ベクター。
  8. 配列番号４と少なくとも９０％配列同一性をもつ５′非翻訳ポリヌクレオチド配列を更に含み、前記５′非翻訳ポリヌクレオチド配列が前記ポリリンカーまたは前記導入遺伝子と作用可能に連結される、請求項１〜３または５のいずれか１項に記載の核酸ベクター。
  9. イントロン配列を更に含む、請求項１〜３または５のいずれか１項に記載の核酸ベクター。
  10. 前記プロモータは、地下組織発現を有する、請求項１に記載の核酸ベクター。
  11. 導入遺伝子に作用可能に連結される配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性をもつポリヌクレオチド配列を含む非キビ属植物。
  12. 前記植物は、トウモロコシ、コムギ、イネ、モロコシ、オート麦、ライ麦、バナナ、サトウキビ、ダイズ、ワタ、シロイヌナズナ、タバコ、ヒマワリ及びアブラナからなる群から選択される、請求項１１に記載の植物。
  13. 前記植物は、トウモロコシである、請求項１２に記載の植物。
  14. 前記導入遺伝子が前記植物のゲノムに挿入される、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の植物。
  15. プロモータは、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性をもつポリヌクレオチド配列を含み、かつ前記プロモータは導入遺伝子と作用可能に連結される、請求項１１に記載の植物。
  16. 配列番号７を含む３′非翻訳配列または配列番号７と少なくとも９０％の配列同一性をもつ３′非翻訳配列を更に含み、前記３′非翻訳配列は前記導入遺伝子と作用可能に連結される、請求項１５に記載の植物。
  17. 前記導入遺伝子は地下組織発現を有する、請求項１５に記載の植物。
  18. 前記プロモータは長さが１，８７５ｂｐである、請求項１５に記載の植物。
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