JP6775584B2 - 設計されたメガヌクレアーゼを使用した網膜色素変性症の治療 - Google Patents
設計されたメガヌクレアーゼを使用した網膜色素変性症の治療 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6775584B2 JP6775584B2 JP2018531315A JP2018531315A JP6775584B2 JP 6775584 B2 JP6775584 B2 JP 6775584B2 JP 2018531315 A JP2018531315 A JP 2018531315A JP 2018531315 A JP2018531315 A JP 2018531315A JP 6775584 B2 JP6775584 B2 JP 6775584B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- meganuclease
- rho1
- residues
- rho
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
- A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/861—Adenoviral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
- C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本出願は、35U.S.C.§119(e)に基づいて、2015年9月8日に出願された同時係属中の米国仮出願第62/215,460号(この内容は、その全体が参照により組み込まれる)の優先権の利益を主張する。
本発明は、分子生物学及び組換え核酸技術の分野に関する。特に、本発明は、ヒトロドプシン遺伝子対立遺伝子に見られる認識配列を認識及び切断するように設計された組換えメガヌクレアーゼに関する。本発明は更に、網膜色素変性症を治療するための方法におけるこのような組換えメガヌクレアーゼの使用に関する。
網膜色素変性症(RP)は、網膜における視細胞の進行性変性による重度の視力障害を引き起こす遺伝性変性眼疾患である。RPは、最初に桿体視細胞が減少し、その結果、周辺視力及び暗所視力が損なわれることを特徴とする。進行性桿体変性の後、網膜色素上皮の異常及び錐体視細胞の劣化が起こる。疾患が進行するにつれて、患者は、夜盲症、進行性視野狭窄、及び最終的には失明を経験する。RPは3000人に約1人が罹患しており、単独で又は他の全身性障害と一緒に起こり得る。現在の所、RPには有効な治療がない。
配列番号1は、1つのP23H認識配列(RHO−1/2)のヌクレオチド配列を示す。
1.1 参考文献及び定義
本明細書で言及される特許及び科学文献は、当業者が利用可能な知識を確立する。本明細書で引用される発行米国特許、許可出願、公開外国出願、及び参考文献(GenBankデータベース配列を含む)は、それぞれが参照により組み込まれると具体的且つ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、病原性P23Hロドプシンタンパク質をコードする突然変異RHO P23H対立遺伝子を標的化、切断、及び不活性化することによって、常染色体優性RPを修正又は予防し得るという仮説に部分的に基づくものである。驚くべきことに、組換えメガヌクレアーゼは、突然変異RHO P23H対立遺伝子に存在するP23H認識配列(例えば、配列番号1〜4の1つ)を認識及び切断するように操作され得る。このような組換えメガヌクレアーゼは、対応する野生型対立遺伝子(配列番号96)と比べて、突然変異RHO P23H対立遺伝子を優先的に標的化及び切断し得る。切断部位におけるNHEJは、突然変異RHO P23H対立遺伝子の突然変異誘発及び破壊をもたらすが、機能的野生型RHO対立遺伝子は依然として、網膜の桿体視細胞において野生型ロドプシンを発現するほどにインタクトである。突然変異RHO P23H対立遺伝子の優先的不活性化及びP23Hロドプシン発現の破壊は、患者におけるRPの進行を予防し、遅延させ又は逆転させると予想される。
メガヌクレアーゼは、生細胞のゲノムにおいて部位特異的DNA切断を起こし得、このようなDNA切断は、突然変異誘発NHEJ修復を介して、又はトランスジェニックDNA配列との相同組換えを介して、ゲノムの永続的な改変をもたらし得る。NHEJは切断部位において突然変異誘発を生じさせ、対立遺伝子の不活性化をもたらし得る。NHEJ関連突然変異誘発は、早期停止コドンの生成、異常な非機能的タンパク質を生じさせるフレームシフト突然変異を介して対立遺伝子を不活性化し得るか、又はナンセンス介在性mRNA分解等の機構をトリガーし得る。NHEJを介して突然変異誘発を誘導するためのメガヌクレアーゼの使用は、特定の突然変異又は野生型対立遺伝子に存在する配列をターゲティングするために使用され得る。
本発明を使用したRPの治療は、適切な組織の細胞において組換えメガヌクレアーゼを発現させ得ることを必要とする。本発明の組換えメガヌクレアーゼの送達のための標的組織は、眼の細胞、好ましくは眼の後部の細胞、更により好ましくは網膜の細胞(桿体視細胞を含む)である。組換えメガヌクレアーゼは、精製タンパク質として、又はメガヌクレアーゼをコードするRNA若しくはDNAとして送達され得る。一実施形態では、組換えメガヌクレアーゼタンパク質又は組換えメガヌクレアーゼをコードするmRNA若しくはベクターは、標的組織への直接的な注射を介して、標的細胞(例えば、網膜の細胞)に供給される。例えば、網膜下注射又は硝子体内注射を介した眼へのRNA、DNA、又は組換えAAVベクターの送達は、当技術分野で記載されている(例えば、Martin et al.(2002)Methods.28:267−275;Hauswirth et al.(2008)Human Gene Therapy.19(10):979−990;Johnson et al.(2008)Molecular Vision.14:2211−2226を参照のこと)。あるいは、メガヌクレアーゼタンパク質、mRNA、又はDNAは、循環系を介して全身送達され得る。
本発明の実施形態は、本明細書に記載される組換えメガヌクレアーゼ及びその変異体を包含する。本発明の更なる実施形態は、本明細書に記載される組換えメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド及びこのようなポリヌクレオチドの変異体を包含する。
P23H認識配列を認識及び切断するメガヌクレアーゼの評価
突然変異RHO P23H対立遺伝子に存在するP23H認識配列の1つ(即ち、配列番号1)を認識及び切断するように、組換えメガヌクレアーゼ(配列番号6〜93)(本明細書では、「RHO1−2メガヌクレアーゼ」と総称される)を操作した(図1Aを参照のこと)。各RHO1−2組換えメガヌクレアーゼは、SV40由来のN末端ヌクレアーゼ局在化シグナルと、第1のメガヌクレアーゼサブユニットと、リンカー配列と、第2のメガヌクレアーゼサブユニットとを含む。各RHO1−2メガヌクレアーゼ中の第1のサブユニットは配列番号1のRHO1認識ハーフサイトに結合し、第2のサブユニットはRHO2認識ハーフサイトに結合する(図1Bを参照のこと)。
RHO1−2メガヌクレアーゼが配列番号1のP23H認識配列を認識及び切断し得るかを決定するために、以前に記載されているCHO細胞レポーターアッセイを使用して、各RHO1−2メガヌクレアーゼを評価した(国際公開第2012/167192号の図4を参照のこと)。アッセイを実施するために、細胞のゲノムに組み込まれた非機能的緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子発現カセットを有する一組のCHO細胞レポーター株を生産した。メガヌクレアーゼによるいずれかの認識配列の細胞内切断が相同的組換え事象を刺激して、機能的GFP遺伝子が生じるように、一組の認識配列によって各細胞株のGFP遺伝子を中断した。両方の細胞株において、認識配列の一方はRHO遺伝子に由来しており(配列番号1又は配列番号5のいずれか)、第2の認識配列は、「CHO−23/24」と称される対照メガヌクレアーゼによって特異的に認識された。配列番号1のP23H認識配列及びCHO−23/24認識配列を含むCHOレポーター細胞は、本明細書では「RHO1−2細胞」と称される。RHO1−2メガヌクレアーゼ(配列番号6〜93)の1つをコードするか、又はCHO−23/34メガヌクレアーゼをコードするプラスミドDNAをRHO1−2細胞にトランスフェクトした。製造業者の説明書に従ってLipofectamine 2000(ThermoFisher)を使用して、96ウェルプレート中で、50ngのプラスミドDNAを約4×105個のCHO細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、フローサイトメトリーによって細胞を評価して、非トランスフェクト陰性対照(RHO1−2bs)と比較したGFP陽性細胞の割合を決定した。RHO1−2メガヌクレアーゼは全て、P23H認識配列を含む細胞株では、陰性対照を有意に超える頻度で、及びCHO−23/24陽性対照と同程度か又はそれを超える頻度で、GFP陽性細胞を生じさせることが見出されたが、これは、各RHO1−2メガヌクレアーゼが、細胞中の目的のP23H認識配列を効率的に認識及び切断することができたことを示している(図5を参照のこと)。
これらの研究では、本発明によって包含されるRHO1−2メガヌクレアーゼ(配列番号6〜93)は、細胞中の配列番号1のP23H認識配列をターゲティング及び切断し得ることが実証された。
P23H認識配列に対するメガヌクレアーゼの特異性
配列番号1のP23H認識配列に対するRHO1−2メガヌクレアーゼ(配列番号6〜93)の特異性を決定するために、対応する野生型RHO認識配列(配列番号5)(本明細書では、「RHO3−4認識配列」と称される)及びCHO−23/24認識配列を含むCHOレポーター細胞株を前述のように作製した。得られた細胞は、本明細書では「RHO3−4細胞」と称される。
RHO1−2メガヌクレアーゼをRHO1−2細胞又はRHO3−4細胞に導入して、組換えメガヌクレアーゼが、配列番号1のP23H認識配列と、対応する野生型認識配列(配列番号5)とを識別し得るかを決定した。前述のようにmRNAのエレクトロポレーションによって、RHO1−2メガヌクレアーゼmRNAをRHO1−2細胞又はRHO3−4細胞に導入し、3〜5日後にGFP陽性細胞のパーセントを決定した。図7に示されているように、RHO3−4細胞よりもGFP陽性RHO1−2細胞の割合が高いことから明らかなように、試験したRHO1−2メガヌクレアーゼはそれぞれ、RHO3−4認識配列と比べてP23H認識配列を優先的に切断した(図7A〜7Eを参照のこと)。その後の実験では、野生型RHO3−4認識配列(配列番号5)を優先的に標的化及び切断する組換えメガヌクレアーゼを開発することができたことが示された。上記CHO細胞レポーターアッセイを使用して評価した場合、このセットのメガヌクレアーゼは、RHO1−2細胞よりも高い割合のGFP陽性RHO3−4細胞をもたらすことが見出された(図7Fを参照のこと)。
本発明者らは、本発明によって包含されるRHO1−2メガヌクレアーゼが、対応する野生型RHO3−4認識配列(配列番号5)と比べて、配列番号1のP23H認識配列を優先的に切断することを実証した。
組換えメガヌクレアーゼを発現させるための組換えAAVベクターの作製及び発現
CHOレポーター細胞においてRHO1−2メガヌクレアーゼを発現するように、組換えAAVベクターを設計した。図8Aに示されているように、組換えAAVベクターは、5’から3’に、第1の逆方向末端反復(ITR)と、メガヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたCMVプロモーターと、第2の逆方向末端反復とを含む。この研究では、RHO−1/2−L2−49メガヌクレアーゼのコード配列を組換えAAVベクターに組み込んだ。
RHO1−2細胞におけるRHO−1/2−L2−49メガヌクレアーゼの発現のために、HEK−293細胞において標準的なトリプルトランスフェクションプロトコールを使用して、組換えAAVベクター(rAAV−RHO−1/2)を調製した(Drittanti et al.(2001),J Gene Med.3:59−71)。3つのウイルス濃度のrAAV−RHO−1/2ベクターをRHO1−2CHOレポーター細胞に形質導入した。形質導入の24時間後、細胞を溶解し、ポリクローナルメガヌクレアーゼ特異的抗体又はβ−アクチン特異的対照抗体を使用してウエスタンブロットによって分析した。図8Bに示されているように、3つのウイルス濃度全てにおいて、RHO−1/2−L2−49の発現が観察された。
rAAV−RHO−1/2ベクターをRHO1−2細胞又はRHO3−4細胞に形質導入して、対応する野生型RHO3−4認識配列(配列番号5)と比べた、配列番号1のP23H認識配列の認識及び切断に関するAAV送達RHO−1/2−L2−49メガヌクレアーゼの特異性を実証した。図9に示されているように、形質導入の3日後、AAV送達RHO−1/2−L2−49メガヌクレアーゼは、使用したウイルス濃度全てにおいて、RHO3−4細胞よりも高い割合のGFP陽性RHO1−2細胞を誘導したが、これは、メガヌクレアーゼが突然変異配列を優先的に認識及び切断することを示している。
RHO−1/2−L2−49メガヌクレアーゼ又はGFPをコードする組換えAAVベクターを形質導入したRHO1−2細胞をシクロヘキシミドで処理してタンパク質翻訳を停止させ、細胞において発現されたタンパク質の安定性を決定した。シクロヘキシミド処理後の様々な時点(0時間、1.5時間、6時間、及び22時間)において細胞を溶解し、ウエスタンブロット分析によって、RHO−1/2−L2−49、GFP、及びβ−アクチンのタンパク質レベルを決定した。図10に示されているように、RHO−1/2−L2−49タンパク質はGFPよりも有意に長く存続し、22時間後において、メガヌクレアーゼタンパク質の減少は見られなかった。
この研究は、組換えAAVベクターを使用して、本発明によって包含されるRHO1−2メガヌクレアーゼを細胞において発現させ得ること、及びこのようなメガヌクレアーゼが、対応する野生型RHO3−4配列(配列番号5)と比べて、配列番号1のP23H認識配列を優先的に認識及び切断することを示している。更に、この研究は、組換えAAVベクターを使用して発現させた場合、RHO1−2メガヌクレアーゼタンパク質が細胞において安定であることを実証している。
AAVによって送達したRHO1−2メガヌクレアーゼによる、レポーター細胞におけるRHO1−2認識配列の切断
この研究の目的は、ウイルス形質導入によってRHO1−2メガヌクレアーゼを哺乳動物細胞において発現させ得ることを実証することであり、RHO1−2認識配列を切断するそれらの能力を更に実証することであった。
これらのAAV粒子が、RHO3−4認識配列(配列番号5)ではなくRHO1−2認識配列(配列番号1)を認識して特異的に切断することができる機能的RHO1−2メガヌクレアーゼを送達し得るかを決定するために、以前に記載されているCHOレポーター株(国際公開第2012/167192号を参照のこと)においてそれらを試験した。アッセイを実施するために、細胞のゲノムに組み込まれた非機能的緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子発現カセットを有する一組のCHO細胞レポーター株を生産した。メガヌクレアーゼによる認識配列の細胞内切断が相同的組換え事象を刺激して、機能的GFP遺伝子が生じるように、RHO1−2認識配列又はRHO3−4認識配列のいずれかによって各細胞株のGFP遺伝子を中断した。RHO1−2認識配列を含むCHOレポーター細胞は、この実験では「P23H RHO細胞」と称される。RHO3−4認識配列を含むCHOレポーター細胞は、この実験では「WT RHO細胞」と称される。GFPレポーターカセットを有しない野生型対照細胞は、この実験では「CHO K細胞」と称される。
まとめると、これらのデータは、本発明のRHO1−2メガヌクレアーゼのための発現カセットを有する組換えscAAVがCHOレポーター株に感染して、RHO1−2メガヌクレアーゼの発現をもたらすことができ、次いでこれが、WT RHO3−4認識ではなくP23H RHO1−2認識配列(配列番号1)を特異的に切断することができることを実証している。
RPのマウスモデルにおけるP23H対立遺伝子のインビボ切断
この研究の目的は、本発明のRHO1−2メガヌクレアーゼが、マウス網膜の視細胞内においてインビボでRHO1−2認識配列を標的化及び切断し得るかを決定することであった。
PCRバンドのディープシーケンシングにより、1サンプル当たり5×105個の配列が得られた。GFPをコードするscAAVを注射した網膜は、RHO1−2認識配列においてインデル(挿入又は欠失)を有する約4×103個の配列を示し、0.54%のバックグラウンドが確立された。RHO2−L5−14メガヌクレアーゼをコードするAAVを注射したマウス網膜から単離したDNAでは、インデルが3.92%で検出され、バックグラウンドよりも約7倍高かった(表3)。他の実験(データは示さず)では、対照マウスはより低頻度のインデルを示し、典型的には約0.01%であった。
ディープシーケンシングのデータは、RHO2−L5−14メガヌクレアーゼをコードするAAVの網膜下注射が、切断及び非相同末端結合後に、網膜色素変性症のマウスモデルにおいてP23H RHO1−2認識配列の突然変異をもたらしたことを実証している。
1.網膜細胞のウエスタンブロット分析
AAV送達後の野生型マウスの網膜細胞においてRHO2−L5−14メガヌクレアーゼを発現させ得ることを確認するために、上記のように網膜下注射によって、RHO2−L5−14をコードするscAAVを5匹の野生型マウスに投与した。OS(左)及びOD(右)の両方の眼に感染させた。注射の30日後に網膜を切開し、全細胞溶解物を調製し、上記のように抗I−CreI抗体を使用してウエスタンブロット分析を実施した。
ウエスタンブロット分析により、マウスに網膜下送達したRHO2L−5−14をコードするscAAVがRHO1−2メガヌクレアーゼの発現をもたらしたことが実証された。ヒトP23H RHO遺伝子に関するマウスモデルからのインデルデータと一緒に総合すると、これらのデータは、RHO1−2メガヌクレアーゼのAAV送達が、P23H RHO対立遺伝子に欠失を引き起こすのに有効であることを示唆している。
Claims (16)
- 配列番号1からなるP23H認識配列と結合及び切断する設計されたメガヌクレアーゼであって、第1のサブユニット及び第2のサブユニットを含み、
前記第1のサブユニットが前記P23H認識配列の第1の認識ハーフサイトと結合し、且つ第1の超可変(HVR1)領域を含み、
前記第2のサブユニットが前記P23H認識配列の第2の認識ハーフサイトと結合し、且つ第2の超可変(HVR2)領域を含み、
前記組換えメガヌクレアーゼは、配列番号7と少なくとも97%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、設計されたメガヌクレアーゼ。 - 前記第1のサブユニットが、配列番号7の残基198〜344と少なくとも97%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第2のサブユニットが、配列番号7の残基7〜153と少なくとも97%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の設計されたメガヌクレアーゼ。
- 前記第1のサブユニットが、配列番号7の残基198〜344を含む、請求項1又は2に記載の設計されたメガヌクレアーゼ。
- 前記第2のサブユニットが、配列番号7の残基7〜153を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の設計されたメガヌクレアーゼ。
- 配列番号7のアミノ酸配列を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の設計されたメガヌクレアーゼ。
- 配列番号5からなる認識配列と比べて、配列番号1からなるP23H認識配列を優先的に認識及び切断する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の設計されたメガヌクレアーゼ。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の設計されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項7に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、組換えDNA構築物。
- 組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターをコードする、請求項8に記載の組換えDNA構築物。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の設計されたメガヌクレアーゼをコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含み、前記設計されたメガヌクレアーゼをコードする前記核酸は、プロモーターに作動可能に連結されている、組換えAAVベクター。
- 血清型5である、請求項10に記載の組換えAAVベクター。
- 血清型2である、請求項10に記載の組換えAAVベクター。
- 自己相補的AAVベクターである、請求項10〜12のいずれか1項に記載の組換えAAVベクター。
- 前記プロモーターが網膜細胞特異的プロモーターである、請求項10〜13のいずれか1項に記載の組換えAAVベクター。
- 前記プロモーターが桿体視細胞特異的プロモーターである、請求項10〜14のいずれか1項に記載の組換えAAVベクター。
- 前記プロモーターがヒトGタンパク質共役型受容体プロテインキナーゼ1(GRK1)プロモーターである、請求項15に記載の組換えAAVベクター。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201562215460P | 2015-09-08 | 2015-09-08 | |
US62/215,460 | 2015-09-08 | ||
PCT/US2016/050809 WO2017044649A1 (en) | 2015-09-08 | 2016-09-08 | Treatment of retinitis pigmentosa using engineered meganucleases |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020168987A Division JP7068413B2 (ja) | 2015-09-08 | 2020-10-06 | 設計されたメガヌクレアーゼを使用した網膜色素変性症の治療 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2018531624A JP2018531624A (ja) | 2018-11-01 |
JP2018531624A5 JP2018531624A5 (ja) | 2020-10-01 |
JP6775584B2 true JP6775584B2 (ja) | 2020-10-28 |
Family
ID=57003577
Family Applications (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018531315A Active JP6775584B2 (ja) | 2015-09-08 | 2016-09-08 | 設計されたメガヌクレアーゼを使用した網膜色素変性症の治療 |
JP2020168987A Active JP7068413B2 (ja) | 2015-09-08 | 2020-10-06 | 設計されたメガヌクレアーゼを使用した網膜色素変性症の治療 |
JP2022074109A Pending JP2022110004A (ja) | 2015-09-08 | 2022-04-28 | 設計されたメガヌクレアーゼを使用した網膜色素変性症の治療 |
JP2023182410A Pending JP2024023183A (ja) | 2015-09-08 | 2023-10-24 | 設計されたメガヌクレアーゼを使用した網膜色素変性症の治療 |
Family Applications After (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020168987A Active JP7068413B2 (ja) | 2015-09-08 | 2020-10-06 | 設計されたメガヌクレアーゼを使用した網膜色素変性症の治療 |
JP2022074109A Pending JP2022110004A (ja) | 2015-09-08 | 2022-04-28 | 設計されたメガヌクレアーゼを使用した網膜色素変性症の治療 |
JP2023182410A Pending JP2024023183A (ja) | 2015-09-08 | 2023-10-24 | 設計されたメガヌクレアーゼを使用した網膜色素変性症の治療 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US10603363B2 (ja) |
EP (1) | EP3347463A1 (ja) |
JP (4) | JP6775584B2 (ja) |
AU (3) | AU2016321244B2 (ja) |
CA (1) | CA2997909A1 (ja) |
WO (1) | WO2017044649A1 (ja) |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015134812A1 (en) | 2014-03-05 | 2015-09-11 | Editas Medicine, Inc. | Crispr/cas-related methods and compositions for treating usher syndrome and retinitis pigmentosa |
EP3286571B1 (en) | 2015-04-24 | 2021-08-18 | Editas Medicine, Inc. | Evaluation of cas9 molecule/guide rna molecule complexes |
AU2016321244B2 (en) | 2015-09-08 | 2020-09-24 | Precision Biosciences, Inc. | Treatment of retinitis pigmentosa using engineered meganucleases |
EP4269596A3 (en) | 2017-04-21 | 2024-02-14 | Precision Biosciences, Inc. | Engineered meganucleases specific for recognition sequences in the pcsk9 gene |
AU2018372763A1 (en) * | 2017-11-21 | 2020-05-28 | Bayer Healthcare Llc | Materials and methods for treatment of autosomal dominant Retinitis Pigmentosa |
CA3137975A1 (en) | 2019-05-07 | 2020-11-12 | Precision Biosciences, Inc. | Optimization of engineered meganucleases for recognition sequences |
CA3159316A1 (en) * | 2019-12-06 | 2021-06-10 | Benjamin OAKES | Compositions and methods for the targeting of rhodopsin |
WO2021212686A1 (zh) * | 2020-04-21 | 2021-10-28 | 北京中因科技有限公司 | RHO-adRP基于基因编辑的方法和组合物 |
WO2021231259A1 (en) | 2020-05-11 | 2021-11-18 | Precision Biosciences, Inc. | Self-limiting viral vectors encoding nucleases |
WO2021231495A1 (en) * | 2020-05-12 | 2021-11-18 | Precision Biosciences, Inc. | Treatment of retinitis pigmentosa using improved engineered meganucleases |
AU2022368911A1 (en) * | 2021-10-19 | 2024-05-30 | Precision Biosciences, Inc. | Gene editing methods for treating alpha-1 antitrypsin (aat) deficiency |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4873192A (en) | 1987-02-17 | 1989-10-10 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Process for site specific mutagenesis without phenotypic selection |
US6015832A (en) | 1997-12-31 | 2000-01-18 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods of inactivating bacteria including bacterial spores |
US6506803B1 (en) | 1999-04-28 | 2003-01-14 | Regents Of The University Of Michigan | Methods of preventing and treating microbial infections |
US6635676B2 (en) | 1999-04-28 | 2003-10-21 | Regents Of The University Of Michigan | Non-toxic antimicrobial compositions and methods of use |
US7767216B2 (en) | 1999-04-28 | 2010-08-03 | The Regents Of The University Of Michigan | Antimicrobial compositions and methods of use |
US6559189B2 (en) | 1999-04-28 | 2003-05-06 | Regents Of The University Of Michigan | Non-toxic antimicrobial compositions and methods of use |
EP2341135A3 (en) | 2005-10-18 | 2011-10-12 | Precision Biosciences | Rationally-designed meganucleases with altered sequence specificity and DNA-binding affinity |
CA2704383A1 (en) | 2007-10-31 | 2009-05-07 | James Jefferson Smith | Rationally-designed single-chain meganucleases with non-palindromic recognition sequences |
WO2011095475A1 (en) * | 2010-02-02 | 2011-08-11 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods for the diagnosis and therapy of retinitis pigmentosa |
WO2011141825A1 (en) * | 2010-05-12 | 2011-11-17 | Cellectis | Meganuclease variants cleaving a dna target sequence from the rhodopsin gene and uses thereof |
US20120204282A1 (en) | 2011-02-04 | 2012-08-09 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for treating occular disorders |
EP3489366B1 (en) | 2011-06-01 | 2019-12-25 | Precision Biosciences, Inc. | Methods for producing engineered mammalian cell lines with amplified transgenes |
WO2013068413A1 (en) | 2011-11-08 | 2013-05-16 | Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung, Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research | Rod cell-specific promoter |
AU2016321244B2 (en) | 2015-09-08 | 2020-09-24 | Precision Biosciences, Inc. | Treatment of retinitis pigmentosa using engineered meganucleases |
-
2016
- 2016-09-08 AU AU2016321244A patent/AU2016321244B2/en active Active
- 2016-09-08 EP EP16771036.7A patent/EP3347463A1/en active Pending
- 2016-09-08 US US15/758,366 patent/US10603363B2/en active Active
- 2016-09-08 CA CA2997909A patent/CA2997909A1/en active Pending
- 2016-09-08 JP JP2018531315A patent/JP6775584B2/ja active Active
- 2016-09-08 WO PCT/US2016/050809 patent/WO2017044649A1/en active Application Filing
-
2020
- 2020-02-14 US US16/791,687 patent/US10758595B2/en active Active
- 2020-07-17 US US16/932,653 patent/US20210000928A1/en not_active Abandoned
- 2020-10-06 JP JP2020168987A patent/JP7068413B2/ja active Active
- 2020-12-23 AU AU2020294264A patent/AU2020294264A1/en not_active Abandoned
-
2022
- 2022-01-26 US US17/585,527 patent/US20220143155A1/en not_active Abandoned
- 2022-04-28 JP JP2022074109A patent/JP2022110004A/ja active Pending
-
2023
- 2023-07-13 US US18/351,633 patent/US20240238387A1/en active Pending
- 2023-08-03 AU AU2023210619A patent/AU2023210619A1/en active Pending
- 2023-10-24 JP JP2023182410A patent/JP2024023183A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2016321244A1 (en) | 2018-04-12 |
US20210000928A1 (en) | 2021-01-07 |
CA2997909A1 (en) | 2017-03-16 |
JP2018531624A (ja) | 2018-11-01 |
US10603363B2 (en) | 2020-03-31 |
US10758595B2 (en) | 2020-09-01 |
JP2024023183A (ja) | 2024-02-21 |
AU2023210619A1 (en) | 2023-08-24 |
JP2022110004A (ja) | 2022-07-28 |
AU2020294264A1 (en) | 2021-01-28 |
US20200179495A1 (en) | 2020-06-11 |
US20180250370A1 (en) | 2018-09-06 |
JP7068413B2 (ja) | 2022-05-16 |
WO2017044649A1 (en) | 2017-03-16 |
EP3347463A1 (en) | 2018-07-18 |
US20240238387A1 (en) | 2024-07-18 |
JP2021054824A (ja) | 2021-04-08 |
AU2016321244B2 (en) | 2020-09-24 |
US20220143155A1 (en) | 2022-05-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7068413B2 (ja) | 設計されたメガヌクレアーゼを使用した網膜色素変性症の治療 | |
US20230001016A1 (en) | Rna guided eradication of human jc virus and other polyomaviruses | |
CN107530399B (zh) | 治疗分子在体外和体内的有效递送 | |
EP3212770B1 (en) | Methods for efficient delivery of therapeutic molecules in vitro and in vivo | |
US20230067480A1 (en) | Method for treating usher syndrome and composition thereof | |
AU2017260426B2 (en) | Engineered nucleases useful for treatment of hemophilia A | |
JP2017512767A (ja) | 改変ヌクレアーゼを用いたジストロフィン遺伝子エクソンの欠失 | |
US20180327743A1 (en) | Antisense Polynucleotides to Induce Exon Skipping and Method of Treating Dystrophies | |
EP2480659A2 (en) | Meganuclease reagents of uses thereof for treating genetic diseases caused by frame shift/non sense mutations | |
JP6875500B2 (ja) | Cas9タンパク質およびガイドRNAを含む眼疾患治療用薬学組成物 | |
Dara et al. | Dystrophin gene editing by CRISPR/Cas9 system in human skeletal muscle cell line (HSkMC) | |
WO2024073093A2 (en) | Arrdc1-mediated microvesicle-based delivery of therapeutic agents to cells and tissues of the eye |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190905 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20190905 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200820 |
|
A871 | Explanation of circumstances concerning accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871 Effective date: 20200820 |
|
A975 | Report on accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971005 Effective date: 20200820 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20200908 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20201006 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6775584 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |