JP5798679B2 - ヒト肝−カルボキシルエステラーゼ1を特異的に認識するモノクローナル抗体、前記抗体を生産するハイブリドーマ細胞株及びその用途 - Google Patents
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Description
以下、本発明を実施例を通じて詳しく説明する。しかし、下記実施例は本発明を例示することで、本発明の範囲が下記実施例に限定されるものではない。
肝組織50mgは、細胞溶解RIPA緩衝溶液[50mMトリス(Tris)、150mM塩化ナトリウム(NaCl)、1%NonidetP−40、0.25%デオキシコール酸ナトリウム(sodium deoxycholate)、pH7.4]に入れて、4℃冷蔵条件で粉碎し、14000rpmで20分間遠心分離してタンパク質溶液を回収した。
肝−カルボキシルエステラーゼ1の3次構造で最適の抗原決定基を有するペプチドの選定は、韓国内の抗体製作会社であるAbFrontier社のソフトウェアを使用して分析した。分析されたペプチドリストで免疫化させるマウスの該当タンパク質のアミノ酸配列と異なるものを確認し、実際の研究で分析して肝−カルボキシルエステラーゼ1に特異的なペプチドを基準で再選別して最終13個のアミノ酸配列を有するペプチドを合成した(表1参照)。
ペプチド基の各々同量の補助抗原(Freund's adjuvant)を乳状化して4匹の雌BALB/cの腹腔に1次注射し、4週後に2次注射し、また2週後に3次注射して免疫化させた。
前記実施例3で選択した#3マウスの脾臓細胞を分離してSp2/0−Ag14ミエローマ細胞と融合させた後、HAT培地に希釈させて8個の96−ウェルプレートに分株して培養した。培養された細胞は、250ng/wellで合成されたペプチドを抗原として酵素免疫分析法を実行して吸光度が一番高い11個のウェルを選択し、各細胞は、24−ウェルで培養されて同一な方法の酵素免疫分析法で5個のウェル(#1B2、#1G11、#2F4、#3C1、#3F2)を選定した。また、各細胞は、96−ウェルプレートに分株して培養され、酵素免疫分析法を3回反復実行してその中で一番高い反応性を示す5個のクローン細胞(#1A9、#4H3、#6A10、#8F11、#10E8)を選択した。
磁石型ビードである「Dynabead MyOneTM Tosylactivated」(Invitrogen)は、製造社マニュアルによって抗−肝−カルボキシルエステラーゼ1ポリクローナル抗体(Abcam社、#Ab1875)と抗−肝−カルボキシルエステラーゼ1モノクローナル抗体(クローン#10E8)で各々コーティングされた。各抗−肝−カルボキシルエステラーゼ1抗体が結合されたビード10μl、20μl、30μl、40μl、50μlは、肝組織タンパク質100μgと一緒に1mLチューブで2時間の間免疫沈降させた。pH2で合わせたPBS−T緩衝溶液を使用して抗体に結合したタンパク質を回収し、免疫ブロッティングを実行してポリクローナル抗体とモノクローナル抗体(クローン#10E8)から結合された肝−カルボキシルエステラーゼ1の変化をImageQuantプログラムを使用してポリクローナル抗体と比較分析した。
各々10名の健常者、肝炎患者、肝硬変患者、肝癌患者の血漿を混合した後、同一な200μlを実施例5で使われた肝−カルボキシルエステラーゼ1ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体#10E8と免疫沈降反応した後、ウェスタンブロット分析法を実行した。同一条件でスキャンするためにスキャン解像度を100マイクロンにした時、分析された肝−カルボキシルエステラーゼ1の信号強度をImageQuantプログラムを使用して分析した。
希釈濃度が0.5mg/mLである前記モノクローナル抗体#10E8、ELISA適用可能なAbcam社の二つのポリクローナル抗体1と抗体2のポリクローナル抗体(#Ab1875、#Ab77730)200μlを96−ウェルプレートに添加した。前記96−ウェルプレートに添加して冷蔵状態で10時間反応させた後、比較試料で肝−カルボキシルエステラーゼ1の標準タンパク質を混合した200μlを前記ウェルに添加して2時間の間反応させた。2次結合抗体としてHRP酵素が結合されたhCE1抗体(#Ab34595)を5000:1で同一に添加し、1時間反応させた後、TMB発色試薬を添加した。
Claims (8)
- 寄託番号KCLRF−BP−00282のハイブリドーマにより生産されるヒト肝−カルボキシルエステラーゼ1タンパク質に特異的に結合することを特徴とするモノクローナル抗体。
- ヒト肝−カルボキシルエステラーゼ1タンパク質の配列番号1に示されるエピトープ配列を認識することを特徴とする請求項1に記載のモノクローナル抗体。
- IgG1の兔疫グロブリン単位型(isotype)であることを特徴とする請求項1に記載のモノクローナル抗体。
- 請求項1のモノクローナル抗体を生産する寄託番号KCLRF−BP−00282であることを特徴とするハイブリドーマ細胞。
- 請求項1によるモノクローナル抗体を含むことを特徴とするヒト肝−カルボキシルエステラーゼ1タンパク質の分離及び精製用組成物。
- 請求項1によるモノクローナル抗体を含むことを特徴とするヒト肝−カルボキシルエステラーゼ1の検出用組成物。
- 請求項1によるモノクローナル抗体を試料サンプルと接触させて抗原−抗体複合体形成を検出する段階を含むことを特徴とする尿または血中ヒト肝−カルボキシルエステラーゼ1の濃度検出方法。
- 請求項1によるモノクローナル抗体を含むことを特徴とする肝癌診断キット。
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