KR101523077B1 - pH 미터를 이용한 바이오 물질 검출 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 바이오 물질 검출 방법 및 장치에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 pH meter 혹은 pH indicator와 같은 상업용 pH 측정장치를 이용하여 바이오 물질을 신속하게 정량 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 바이오물질-자성나노입자-아세틸콜린에스테라제 복합체를 이용하여 에스테르화합물을 포함하는 표준 시약의 pH를 변화시키는 방법을 제공한다.

Description

pH 미터를 이용한 바이오 물질 검출 방법{methods of sensing for biomaterials using commercial pH meter}
본 발명은 바이오 물질 검출 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 pH meter 혹은 pH indicator와 같은 pH 측정장치를 이용하여 바이오 물질을 검출하는 방법에 관한 것이다.
단백질, 효소, 핵산, 세포, 병원균 등과 같이 생명 현상에 직간접적으로 관련된 각종 바이오 물질을 효과적으로 검출하기 위한 바이오센서들이 개발되고 있다. 방사선 동위 원소나 형광체를 표지로 이용하는 항원항체를 이용한 면역검사, 비표지식(label-free) 바이오센서로서 표면 플라스몬 공진 바이오센서(SurfacePlasmon Resonance Biosensor), 전반사 일립소미트리 바이오센서(Total Internal Reflection Ellipsometry Biosensor), 광 도파로 바이오센서 (Waveguide Biosensor) 등의 광학 바이오 센서들이 주목 받고 있다. 대한민국 특허 공개 제2009-0061270호에서는 나노 복합체와 공진 반사광 필터를 이용해서 바이오 물질을 검출하는 방안들이 개시되어 있다.
그러나, 종래 바이오 물질의 검출 방법은 고가의 장비가 필요하다는 단점이 있어, 상용 pH측정기와 같이 보다 경제적인 측정 장비를 이용해서 바이오 물질을 측정할 수 있는 방법에 대한 요구가 계속되고 있다.
본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 pH를 이용해서 바이오 물질을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위해서, 본 발명에 따른 검출 방법은 바이오 물질에 자성나노입자와 아세틸콜린에스테라제를 결합시켜 복합체를 형성하고, 상기 복합체로 에스테르 화합물을 포함하는 표준 시료의 pH를 변화시키고, 이를 분석하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 바이오물질을 포함하는 피검 시료에 자성나노입자를 투입하여 바이오물질에 자성나노입자를 결합시키고 자석을 이용하여 분리하는 단계;
자성나노입자와 함께 분리된 바이오물질에 아세틸콜린에스테라제를 결합시켜 바이오물질-자성나노입자-아세틸콜린에스테라제 복합체를 형성하는 단계;
바이오물질-자성나노입자-아세틸콜린에스테라제 복합체를 에스테르 화합물을 포함하는 표준 시약에 투입하여 pH를 변화시키는 단계; 및
pH 변화를 이용하여 정량하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
이론적으로 한정된 것은 아니지만, 피검 시료에 포함된 바이오물질의 함량이 증가하면 시료에서 분리되는 바이오물질과 자성나노입자의 결합체의 함량이 증가하며, 바이오물질에 아세틸콜린에스테라제를 추가로 반응시켜 얻어지는 바이오물질-자성나노입자-아세틸콜린에스테라제 복합체의 함량도 증가한다. 복합체의 함량의 증가는 아세틸콜린을 함유하는 표준 시료에서 에스테르 화합물에 의한 가수분해에 의한 pH의 변화량-변화정도 및/또는 변화속도-을 증가시키게 되어, 이를 통해 시료에 포함된 바이오 물질의 정성 및 정량분석이 가능하게 되는 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 바이오 물질은 생명 현상에 직간접적으로 관련된 물질로서, 단백질, 핵산, 세포, 세균, 병원균과 같은 물질을 의미한다.
본 발명의 실시에 있어서, 상기 단백질은 Troponin I, 심장 질환 표지 물질인 Troponin C, Troponin T, 암 표지 물질인 Alpha fero-Protein(AFP), Prostate Specific Protein(PSA), Carcinoembryonic antigen(CEA) 등이 포함되며, 나아가 감염에 대한 면역 반응의 표지 물질이 되는 Interleukin 단백질등이 있다.
본 발명의 다른 실시에 있어서, 상기 핵산은 DNA와 RNA를 포함하며 식중독균, 결핵균, 뇌막염균, 폐렴균의 DNA 등이 있다.
본 발명의 다른 실시에 있어서, 상기 세포는 체내 방어 기작 중 하나인 백혈구 혹은 암을 일으키는 암종양세포 등이 있다.
본 발명의 다른 실시에 있어서, 상기 병원균은 식중독의 원인이 되는 병원성 대장균, 리스테리아균, 비브리오균, 노로 바이러스, 살모넬라균, 황색포도상구균, 장염비브리오, 장관출혈성 대장균 O157, 캠필로벡터균, 바실러스세레우스균, 웰슈군, 보틀루리스균 등이다
본 발명의 일 실시 예에 있어서, 상기 바이오 물질은 troponin I과 같은 단백질이다. troponin I은 심근에 결합된 단백질로 알려져 있으며, 심근에 피해가 가해지면 troponin I은 심근으로부터 떨어져 나와 혈관을 떠돌아 혈관 내 troponin I의 농도는 수십 pg/mL이며 심근에 이상이 있는 환자의 경우 수 ng/mL에 달한다. 이에 따라 혈관 내의 troponin I의 농도 증가를 감지하여 심장 질환의 예후를 알고 대비할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시 예에 있어서, 상기 식중독을 일으킬 수 있는 살모넬라균이다.
본 발명에 있어서, 상기 자성나노입자는 자력에 반응하는 자성을 띤 미세입자로 이해된다. 상기 자성 나노 입자는 1~10000 나노미터, 바람직하게는 50~1000 나노미터이며, 보다 더 바람직하게는 100~500 나노미터 크기를 가지는 것으로 이해된다. 본 발명의 실시에 있어서, 상기 자성 나노입자들은 공지된 방법을 통해서 제조해서 사용하는 것도 가능하며, 상업적으로 구입해서 사용할 수 있으며, 일 예로 상기 자성 나노입자로는 γ-Fe2O3 를 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 자성나노입자는 바이오 물질에 결합가능한 관능기가 부착된 자성나노입자이다. 상기 관능기는 바이오 물질의 종류에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, 상기 표적 바이오 물질이 DNA나 RNA 등의 핵산일 경우에는 이와 상보적 결합이 가능한 염기 서열을 가진 핵산이 사용될 수 있다. 또, 예를 들면, 상기 바이오 물질이 면역 반응을 하는 항원이나 단백질, 세포인 경우에는 그에 대응하는 항체일 수 있다.
본 발명의 실시에 있어서, 자성 나노입자는 트로포닌 I과 결합할 수 있도록 표면 또는 내부에 트로포닌 I과 결합할 수 있는 기능기가 형성될 수 있다. 트로포닌 I과 결합될 수 있는 기능기는 트로포닌 I에 결합가능한 항체들이며, 트로포닌 I에 결합할 수 있는 다양한 항체들이 공지되어 있다. 나노 입자의 표면에 트로포닌 I이 결합 가능한 항체를 형성하는 방법은, 본 발명에서 전체로 참고문헌으로 도입되는 Jun ha 등은 Biomaterials 32 (2011) 1177~1184의 "A multicomponent recognition and separation system established via fluorescent, magnetic, dualencoded multifunctional bioprobes" 논문등에 기재되어 있다.
본 발명의 일 실시에 있어서, 상기 항체들은 트로포닌 I에 결합할 수 있는 공지된 항체를 사용할 수 있다. 이 경우, 트로포닌 I과 자성 나노입자의 결합은 항원-항체 결합으로 이루어질 수 있으며, 하나의 트로포닌 I에 다수의 자성입자, 혹은 하나의 자성입자에 다수의 트로피닌들이 결합될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 아세틸콜린에스테라제는 바이오 물질과 결합할 수 있는 기능기, 예를 들어, 바이오 물질과 결합할 수 있는 항체나 상보적 염기서열일 수 있다.
상기 바이오 물질과 결합할 수 있는 기능기는 아세틸콜린에스테라제에 공지된 연결물질을 통해서 결합될 수 있다. 상기 연결 물질은 상기 바이오 물질과 생화학적으로, 예를 들면, 항원-항체 반응에 의하여 결합될 수 있는 물질일 수 있으며, 일 예로 탄소수 3 내지 9의 에톡시 실란계 탄화수소 또는 탄소수 2 내지 9의 메톡시 실란계 탄화수소를 사용할 수 있다.
발명의 실시에 있어서, 아세틸콜린에스테라제에는 트로포닌 I과 결합할 수 있는 기능기, 예를 들어, 트로포닌 I에 결합가능한 항체들을 아세틸콜린에스테라제에 고정하여 트로포닌 I-자성 나노입자의 결합체에 결합될 수 있다. 항체가 고정된 아세틸콜린에스테라제의 형성방법은, 본 발명에서 전체로 참고문헌으로 도입되는 Nature Chemistry, 2011, 3, 697-703에 기재되어 있다. 트로포닌 I과 인버타제의 결합은 항원-항체 결합으로 이루어질 수 있으며, 하나의 트로포닌 I에 다수의 아세틸콜린에스테라제들이 결합될 수 있다. 본 발명의 실시에 있어서, 상기 아세틸콜린에스테라제와 트로피닌 I 항체의 결합은 공지된 연결 물질, 예를 들어 1,4-페닐렌 다이아이소싸이오사이아네이트 (PDITC)을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 복합체는 바이오물질에 자성나노입자와 아세틸콜린에스테라제가 결합되는 복합체이며, 아세틸콜린에스테라제의 활성을 유지하는 복합체를 의미하는 것으로 이해된다.
상기 "아세틸콜린에스테라제의 활성을 유지"는 결합되지 않은 아세틸콜린에스테라제의 활성에 대비해서, 50 %이상, 바람직하게는 70 %이상, 가장 바람직하게는 80% 이상의 활성을 가지는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 표준 시료에 포함된 에스테르 화합물은 아세틸콜린에스테라제에 의해서 가수 분해될 수 있는 화합물을 의미한다. 상기 가수분해에 의해서 pH 변화를 일으킬 수 있는 반응물은 아세틸콜린, 트라이아세틴, 아세트산에틸등을 포함한다. 바람직하게는 아세틸콜린은 아세틸콜린에스테라제와 가장 반응성이 좋다는 점에서, 트라이아세틴은 한번 분해 시 3개의 아세트산 물질이 생성된다는 점에서 특히 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 에스테르 화합물의 분해는 아세틸콜린에스테라제의 변성이 일어나지 않는 범위에서, 온도를 올려 진행할 수 있으며, 바람직하게는 상온에서 65 ℃의 범위에서 이루어질 수 있다. 아세틸콜린에스테라제의 온도에 따른 활성 차이가 높지 않아 상온에서 이루어지는 것이 좋다.
본 발명에 있어서, 아세틸콜린의 가수분해로 인한 pH 변화는 pH meter 혹은 pH paper를 이용하여 측정 가능하며, pH meter의 경우 용액의 pH 변화를 실시간으로 측정할 수 있으며 pH 종이를 이용한 경우, 간편한 전후 pH 확인이 가능하다.
본 발명은 바이오 물질, 자성나노입자, 및 아세틸콜린에스테라제가 결합되고, 에스테르 화합물를 포함하는 표준 시료의 pH를 변화시키는 신규한 물질을 제공한다.
본 발명에 의해서, 상용 pH 측정장치를 이용하여 간편하게 바이오물질을 정량적으로 측정할 수 있는 방법이 제공되었다. 본 발명에 따른 측정 방법은 온도에 따른 변화폭이 크지 않아 상온에서 쉽게 측정할 수 있다.
도 1은 상용 pH 미터 기반 검출법 순서도이다. (a) 항체가 고정된 자성 나노입자와 바이오 물질의 결합 (b) 아세틸콜린에스테라제의 결합 (c) 표준시료에 아세틸콜린 첨가 및 가수분해 (d) pH 변화 측정
도 2는 반응물 별 분해 반응 테스트 결과(흑색 : 아세틸콜린, 적색 : 트라이아세틴, 청색 : 아세트산에틸
도 3은 온도 별 분해 반응 테스트 결과
도 4는 염기성 조건에서의 효소 유무 별 분해 반응 테스트 결과
도 5는 (a) pH 별 분해 반응 테스트 결과 (b) 낮은 pH에서의 효소 유무에 따른 분해 반응 테스트 결과
도 6은 아세틸콜린에스테라아제(Acetylcholinesterase)를 이용한 Troponin I 검출 결과 (a) 농도별 반응 시간에 따른 pH 변화 (흑색 : 0 ng/mL, 자색 : 0.01 ng/mL, 주황색 : 0.1 ng/mL, 녹색 : 1 ng/mL, 청색 : 10 ng/mL, 적색 : 100 ng/mL) (b) 반응 후 10분에서의 농도별 pH 값
도 7은 아세틸콜린에스테라아제(Acetylcholinesterase)를 이용한 식중독균 검출 결과
(a) 농도별 반응 시간에 따른 pH 변화 (흑색 : 0 cfu/mL, 주황색 : 102 cfu/mL, 녹색 : 104 cfu/mL, 청색 : 106 cfu /mL, 적색 : 108 cfu /mL) (b) 반응 후 10분에서의 농도별 pH 값
이하, 실시예를 통해서 본 발명을 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 상세하게 기재하고 있지만, 본 발명을 예시하기 위한 것이며 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이며, 본 발명의 범위는 특허청구범위에 의해서 정하여짐을 유의하여야 한다.
시약 및 장비
아이언(III) 클로라이드(Iron(III) chloride, FeCl3), 요소(Urea), 소디움 시트레이트(Sodium citrate), 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide), 아미노프로필 트라이에톡시실레인 ([3-Aminopropyl]triethoxysilane, APTES), 글루타르알데하이드(Glutaraldehyde), 소혈청 알부민 (Bovine serum albumin, BSA), 아세틸콜린에스테라아제(Acetylcholinesterase), 1,4-페닐렌다이아이소싸이오사이아네이트(1,4-phenylene diisothiocyanate, PDITC). 1-부탄올(1-Butanol), 디메틸포름아미드(dimethylformamide, DMF), 아세틸콜린 (Acetylcholine), 인간 혈청(Human Serum)은 시그마-알드리치 社에서 구매되었다. Troponin I 에 대한 항체는 HyTest 社에서 구매하였다.
살모넬라균에 대한 항체는 ABCam 社에서 구매하였다.
정제된 항체-효소 연결체를 얻기 위해 사용된 Amicon-100K 및 Amicon-300K 필터는 Amicon社에서 구매하였다.
pH 변화를 측정하기 위한 상용 pH 미터, 휴대용 pH 미터, pH indicator는 각각 inoLab社, HANNA instruments社, Merck社에서 구매하였다.
탈이온증류수는 상용 초순수제조장치(Human Science 社, 한국)를 이용하여 얻어졌고 자성 나노 입자 클러스터 합성 및 Phosphate 버퍼 용액을 만드는데 사용되었다.
비결합 Troponin I 및 비결합 아세틸콜린에스테라제의 분리에 사용된 네오듐 자석은 서울자석 社에서 구매한 것으로 가우스미터를 이용하여 측정한 자석의 세기는 30 밀리테슬라이다.
실시예 1. pH 미터를 이용한 Troponin I의 검출
1 단계. Fe3O4 자성 나노입자 클러스터(이하 자성 나노 입자) 합성 및 항체 고정
Fe3O4 자성 나노입자는 one-pot solvothermal method를 이용하여 합성되었다. 먼저 4 밀리몰의 아이언 클로라이드와 12 밀리몰의 요소 그리고 8 밀리몰의 소디움 시트레이트를 80 밀리리터의 물에 녹인다. 그 후, 자석막대를 이용하여 계속 섞어주면서 0.6 그램의 폴리아크릴아마이드를 첨가한다. 이렇게 만들어진 반응 용액을 100 밀리리터 부피의 테프론 재질의 오토클레이브 용기에 옮기고 온도를 섭씨 200 도로 12 시간 동안 유지시킴으로써 합성반응을 일으킨다. 그 후 용액을 상온까지 식힌 뒤 합성된 입자들을 자석을 이용하여 모은 뒤 나머지 반응물질들을 버리고 에탄올과 물을 이용하여 수 번 씻어냄으로써 최종적으로 Fe3O4 자성 나노입자를 얻을 수 있다. 이때 얻어진 나노입자의 크기는 약 200 나노미터이다.
합성된 자성 나노입자는 APTES(3-(aminopropyl)triethoxysilane)와 글루타르알데하이드와 각각 반응시킴으로써 표면에 아민기가 활성화되고 항체와 결합할 수 있게 된다. 그 후 Troponin-I 항체와 자성 나노입자를 섞어 항체를 입자 표면에 고정시킨 뒤 BSA(Bovine Serum Albumin) 및 Tween-20 처리를 하여 비선택성 접합(non-specific binding)을 방지함으로써 항체고정을 완료한다.
2 단계. 아세틸콜린에스테라아제와 항체 고정
아세틸콜린에스테라아제와 항체의 고정은 1,4-페닐렌 다이아이소싸이오사이아네이트 (PDITC)라는 연결 물질을 이용한다. 0.2 마이크로몰의 항체를 100 마이크로리터의 버퍼 용액에 분산시킨 후, 20 마이크로그램의 PDITC가 녹아 있는 1 밀리리터의 디메틸포름아미드(DMF)에 첨가한다. 상기에서 생성된 혼합용액을 상온에서 빛과 차단된 채로 2시간 동안 교반 시킨 후, 혼합용액에 5 밀리리터의 물과 5 밀리리터의 1-부탄올을 첨가한다. 원심분리를 가하면 혼합용액은 상층의 유기 용액과 하층의 수용액으로 나뉘어지며 이 후 미반응 PDITC가 포함된 상층의 유기 용액을 제거한다. 이어서 3 밀리리터의 1-부탄올의 첨가 및 원심분리, 나아가 상층의 유기 용액 층의 제거를 여러 번 반복한다. PDITC-항체 연결체는 Amicon-100K 필터를 이용하여 상기의 과정을 거친 수용액으로부터 정제해낼 수 있다. 정제된 연결체는 다시 버퍼 용액에 분산되며 10 밀리그램의 아세틸콜린에스테라아제를 첨가한 후 상온에서 48시간 동안 반응시킨다. 이 후 효소와 연결되지 않은 PDITC-항체는 Amicon-300K 필터를 이용하여 제거됨으로써 정제된 아세틸콜린에스테라아제-항체 연결체를 얻을 수 있다.
3 단계. Troponin I-자성 나노입자 복합체 형성
Troponin I가 포함된 인간 혈청에 20 마이크로그램에 해당하는 자성 나노입자를 첨가한다. 상온에서 1시간 동안 교반시킨 후 영구자석을 이용하여 Troponin I-자성 나노입자 복합체를 분리해내고 나머지 물질은 제거한다. 분리된 복합체는 버퍼 용액에 재분산되며 미처 다 제거되지 못한 물질이 남아있을 시 영구자석을 이용한 복합체의 분리 및 재분산 과정을 반복한다.
4 단계. Troponin I-자성 나노입자 복합체와 항체 고정 아세틸콜린에스테라아제의 결합
3 단계에서 얻어진 Troponin I-자성 나노입자 복합체 용액에 10 마이크로리터의 항체 고정 아세틸콜린에스테라아제를 첨가한 후 상온에서 1시간 가량 교반시킨다. 그리고 영구자석을 이용하여 Troponin I-자성 나노입자-아세틸콜린에스테라아제의 복합체를 분리해낸 후 버퍼용액에 재분산시킨다. 복합체를 이용한 Troponin I 검출 과정은 5 단계와 같다.
5 단계. 최적 반응물을 선정 테스트
아세틸콜린에스테라제는 다양한 에스터 물질을 가수분해시킬 수 있다. 이러한 특성을 바탕으로 가장 많은 pH 변화를 일으킬 수 있는 반응물을 찾기 위한 테스트를 진행하였다. 아세틸콜린, 트라이아세틴, 아세트산에틸을 후보로 선정하였다. 아세틸콜린은 아세틸콜린에스테라제와 가장 반응성이 좋은 물질이며 트라이아세틴은 한번 분해 시 3개의 아세트산 물질이 생성된다는 장점이 있다. 테스트 결과 세 물질 중 아세틸콜린에 의한 pH 변화가 가장 컸다.(도 2)
6 단계. 트로포닌의 검출에서 반응 온도 pH 변화 테스트
아세틸콜린에스테라제는 온도에 따라 효소 반응성이 증가하며 최적의 반응온도를 찾기 위해 반응 온도별 아세틸콜린 분해에 의한 pH 변화를 측정하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, 상온(25 ℃)과 변성이 일어나기 전인 55 ℃와의 반응성 차이가 약 10 %정도 밖에 안 되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 아세틸콜린에스테라제가 이미 분당 약 십 만개의 분자를 분해할 수 있는 우수한 효소 반응성을 가지고 있어 상온에서도 충분히 많은 분자를 분해시키기 때문이다. 따라서 별도의 장비 없이 반응이 가능한 상온을 최적의 반응온도로 설정하였다.
7 단계. 최적 pH 조건 설정
아세틸콜린에스테라제는 중성 이상의 pH 에서 반응성이 가장 좋으나 이 경우 아세틸콜린이 하이드록실 이온에 의해서도 가수분해가 되는 문제가 있다. 하이드록실 이온에 의한 가수분해 반응은 효소에 의한 가수분해 반응에 대한 노이즈로 작용하게 되며 정확한 측정을 어렵게 만든다. 따라서 효소 활성을 유지하면서도 하이드록실 이온에 의한 비특이적 가수분해 반응을 줄일 수 있는 pH 조건을 찾기 위한 실험을 진행하였다. 도 4에서 도시된 바와 같이, (a) 결과 pH 6에서 하이드록실 이온에 의한 비특이적 가수분해 반응이 억제되고 효소 활성이 어느 정도 유지되는 것을 확인할 수 있었으며 pH 6을 최적 pH로 설정하여 검출을 진행하였다. (도 4) (b)
8 단계. 분리된 Troponin I-자성 나노입자-아세틸콜린에스테라아제 복합체를 이용한 가수 분해 및 pH 측정 방법
4 단계에서 얻어진 Troponin I-자성 나노입자-아세틸콜린에스테라아제의 복합체를 25 밀리몰의 아세틸콜린 1 밀리리터 용액에 첨가한다. 복합체 내의 아세틸콜린에스테라아제는 아세틸콜린의 가수분해 반응에 대한 촉매로서 아세트산의 생성을 촉진시킨다. 아세틸콜린에스테라아제의 활성은 65 ℃에서 변성이 일어나기 전까지 온도 상승에 따라 증가하며 가수분해 반응을 촉진시키기 위하여 반응 온도를 상승시킬 수 있다. 아세틸콜린의 가수분해로 인한 pH 변화는 pH meter 혹은 pH paper를 이용하여 측정 가능하며, pH meter의 경우 용액의 pH 변화를 실시간으로 측정할 수 있으며 pH 종이를 이용한 경우, 간편한 전후 pH 확인이 가능하다. (도 6)
실시예 2. pH 미터를 이용한 살모넬라균의 검출
1 단계. 자성나노입자와 항체 고정
살모넬라균의 항체를 이용하여 실시예 1의 1 단계에서와 같이, Fe3O4 자성 나노입자 클러스터(이하 자성 나노 입자) 합성하고 항체를 고정하였다.
2 단계. 아세틸콜린에스테라제와 살모넬라균 항체 고정
살모넬라 항체를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1의 2단계와 동일하게 이루어졌다.
3 단계. 살모넬라균-자성 나노입자 복합체 형성 및 분리
살모넬라균이 포함된 10 mL의 우유에 20 마이크로그램에 해당하는 자성 나노입자를 첨가한다. 상온에서 1시간 동안 교반시킨 후 영구자석을 이용하여 살모넬라-자성 나노입자 복합체를 분리해내고 나머지 물질은 제거한다. 분리된 복합체는 버퍼 용액에 재분산되며 미처 다 제거되지 못한 물질이 남아있을 시 영구자석을 이용한 복합체의 분리 및 재분산 과정을 반복한다.
4 단계. 살모넬라균-자성 나노입자 복합체와 항체 고정 아세틸콜린에스테라아제의 반응
3 단계에서 얻어진 살모넬라-자성 나노입자 복합체 용액에 10 마이크로리터의 항체 고정 아세틸콜린에스테라아제를 첨가한 후 상온에서 1시간 가량 교반시킨다. 그리고 영구자석을 이용하여 살모넬라-자성 나노입자-아세틸콜린에스테라아제의 복합체를 분리해낸 후 버퍼용액에 재분산시킨다. 복합체를 이용한 살모넬라 검출 과정은 5 단계와 같다.
5 단계. 살모넬라균-자성나노입자-아세틸콜린에스테라아제 복합체를 이용한 가수 분해 및 pH 측정을 통한 정량
4 단계에서 얻어진 살모넬라-자성 나노입자-아세틸콜린에스테라아제의 복합체를 25 밀리몰의 아세틸콜린 1 밀리리터 용액에 첨가한다. 복합체 내의 아세틸콜린에스테라아제는 아세틸콜린의 가수분해 반응에 대한 촉매로서 아세트산의 생성을 촉진시킨다. 아세틸콜린에스테라아제의 활성은 65 ℃에서 변성이 일어나기 전까지 온도 상승에 따라 증가하며 가수분해 반응을 촉진시키기 위하여 반응 온도를 상승시킬 수 있다. 아세틸콜린의 가수분해로 인한 pH 변화는 pH meter 혹은 pH paper를 이용하여 측정 가능하며, pH meter의 경우 용액의 pH 변화를 실시간으로 측정할 수 있으며 pH 종이를 이용한 경우, 간편한 전후 pH 확인이 가능하다. (도 7)

Claims (17)

  1. 바이오 물질과 자성나노입자와 아세틸콜린에스테라제를 결합시켜 복합체를 형성하고, 상기 복합체로 에스테르 화합물을 포함하는 표준 시료의 pH를 변화시키고, 이를 분석하는 것을 특징으로 하며,
    상기 바이오 물질은
    Troponin I, Troponin C, Troponin T, Alpha fero-Protein(AFP), Prostate Specific Protein(PSA), 및 Carcinoembryonic antigen(CEA)으로 이루어 것을 그룹에서 하나 이상 선택되는 단백질, 또는
    병원성 대장균, 리스테리아균, 비브리오균, 노로 바이러스, 살모넬라균, 황색포도상구균, 장염비브리오, 장관출혈성 대장균 O157, 캠필로벡터균, 바실러스세레우스균, 웰슈군, 및 보틀루리스균으로 이루어진 그룹에서 하나 이상 선택되는 세균인 것인,
    바이오 물질 검출 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 복합체는 에스테르 화합물을 가수분해시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 에스테르 화합물은 아세틸콜린, 트라이아세틴, 아세트산에틸을 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 복합체는 바이오 물질에 자성나노입자와 아세틸콜린에스테라제가 결합된 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 자성나노입자와 아세틸콜린에스테라제에는 바이오물질에 결합가능하는 관능기가 형성된 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 관능기는 바이오물질이 항원일 경우 항체이며, DNA 또는 RNA일 경우 상보적 염기사슬인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 관능기는 연결물질을 통해 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 바이오 물질을 포함하는 피검 시료에 자성나노입자를 투입하여 바이오물질에 자성나노입자를 결합시키고 자석을 이용하여 분리하는 단계;
    자성나노입자와 함께 분리된 바이오물질에 아세틸콜린에스테라제를 결합시켜 바이오물질-자성나노입자-아세틸콜린에스테라제 복합체를 형성하는 단계;
    바이오물질-자성나노입자-아세틸콜린에스테라제 복합체를 에스테르 화합물을 포함하는 표준 시약에 투입하여 pH를 변화시키는 단계; 및
    pH 변화를 이용하여 정량하는 단계
    를 포함하고,
    상기 바이오 물질은
    Troponin I, Troponin C, Troponin T, Alpha fero-Protein(AFP), Prostate Specific Protein(PSA), 및 Carcinoembryonic antigen(CEA)으로 이루어 것을 그룹에서 하나 이상 선택되는 단백질, 또는
    병원성 대장균, 리스테리아균, 비브리오균, 노로 바이러스, 살모넬라균, 황색포도상구균, 장염비브리오, 장관출혈성 대장균 O157, 캠필로벡터균, 바실러스세레우스균, 웰슈군, 및 보틀루리스균으로 이루어진 그룹에서 하나 이상 선택되는 세균인 것을 특징으로 하는 것인,
    바이오 물질 검출 방법.
  12. 삭제
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110054105A (ko) * 2009-11-17 2011-05-25 강릉원주대학교산학협력단 분석물질의 검출 방법 및 장치
KR20120118412A (ko) * 2011-04-18 2012-10-26 연세대학교 산학협력단 인간 간-카르복실에스터라제 １을 특이적으로 인식하는 단일클론 항체, 상기 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도

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Yu Xiang et al., Nature Chemistry, 2011, 3, p697-703 *
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