CN103642825A - 一种重组hCE1蛋白的可溶性表达和纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种重组hCE1蛋白的可溶性表达和纯化方法，包括以生物信息学软件预测hCE1蛋白最佳抗原表位区的分布；用PCR技术扩增含hCE1蛋白最佳抗原表位区的基因截短片段；将得到的基因截短片段克隆至原核表达载体，构建hCE1基因原核表达重组质粒；将构建的hCE1基因原核表达重组质粒转化宿主细胞，获得转化的宿主细胞；培养转化的宿主细胞，以表达重组hCE1蛋白；分离、纯化重组hCE1蛋白。采用本发明方法，达到了理想的蛋白纯度和产量，为后期制备优质的抗hCE1多克隆抗体、抗hCE1单克隆抗体及高特异性的hCE1ELISA试剂盒等研究工作提供了物质基础。

Description

一种重组hCE1蛋白的可溶性表达和纯化方法

技术领域

本发明涉及生物基因工程领域中重组人基因的可溶性表达和纯化方法，特别涉及到重组人羧酸酯酶1（hCE1）基因的可溶性表达和纯化。 

背景技术

人羧酸酯酶1（human carboxylesterase 1,hCE1）主要由肝脏合成，亦被称为肝羧酸酯酶，是丝氨酸水解酶超家族的重要成员之一，在肝脏的药物水解代谢功能方面发挥着重要作用。该酶能有效地催化含酯键、硫酯键、酰胺键基团的多种药物或前体药物的水解代谢，并与多种药物、环境毒物及致癌物的解毒和代谢有关。hCE1还参与体内脂肪酸、胆固醇酯的运输和代谢，能催化内源性化合物的水解，可保护机体中枢神经***免受酯类、酰胺类化合物的损伤，是人血脑屏障***的重要组成部分。 

肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是一种严重危害人类健康的恶性肿瘤，其恶性程度高、进展较快、预后差，且目前HCC患者漏诊率较高。研究表明，HCC患者血浆中hCE1含量显著升高，可作为HCC早期诊断的一种良好的血清学标志物。hCE1是一种N-糖基化蛋白，含有内质网滞留信号肽，它可通过高尔基体从肝脏分泌到血浆中。在HCC发生发展过程中，癌细胞的增长可大量激活hCE1N-糖基化，使其分泌到血浆中的量急剧增加。Paik等报道，HCC患者血浆中hCE1的含量是正常人血浆hCE1含量的2-5倍（Paik YK,Seoul KN.Plasma biomarker tool for the diagnosis of liver cancer comprising liver carboxylesterase 1 and liver cancer screening method12/994406.04/28/2011.）。Na等证实了HCC患者血浆中hCE1的含量显著高于慢性肝炎、胃癌、胰腺癌患者及健康志愿者，且hCE1诊断HCC的灵敏度及特异度分别可达到70.8%、92.3%（Na K,Lee EY,Lee HJ,et al.Human plasma carboxylesterase 1,a novel serologic biomarker candidate for hepatocellular carcinoma.Proteomics,2009,9(16):3989-3999.）。若将hCE1联合目前诊断HCC灵敏度已达到60%-70%的甲胎蛋白（alpha-fetoprotein,AFP）指标，HCC阳性患者的诊断率将进一步提高，可大大 降低AFP对早期HCC的漏诊率，利于HCC患者进行早期手术治疗，极大地提高患者生存质量。 

在国内，于梅、朱晓美等分别于2011年、2009年制备了兔抗人hCE1多抗（于梅,路胜,刘红.抗人羧酸酯酶1多克隆抗体的制备与鉴定.黑龙江医药,2011,24(4):573-575.朱晓美,李淑珍,吴春铃,等.兔抗人羧酸酯酶1多克隆抗体的制备与鉴定.细胞与分子免疫学杂志,2009,25(6):516-518.），但是用于制备hCE1多抗的原核表达蛋白均以包涵体形式存在，而包涵体蛋白必须变性后才能免疫动物制备抗体。变性蛋白可将原有天然蛋白被包在内部的抗原决定簇暴露出来，用来免疫动物具备较强的抗原性。用该变性抗原制备的抗体可以检测变性抗原，但是用于检测天然蛋白（如HCC血清诊断）就会出现较高的假阳性率。于梅、朱晓美等由变性蛋白制备的hCE1多抗的特异性及敏感度均不高，若用于HCC早期诊断则会出现较高的假阳性率。 

因此，本领域迫切需要开发高效表达和纯化重组hCE1蛋白的方法，以便能够大量生产用于优质的抗hCE1单克隆抗体的制备、灵敏度高、高特异性的hCE1ELISA试剂盒的研制、hCE1药物代谢动力学研究和肝细胞肝癌早期诊断的可溶形式的重组hCE1蛋白。 

发明内容

本发明的目的是提供一种重组hCE1蛋白的可溶性高效表达和纯化方法。 

本发明提供的重组hCE1蛋白的可溶性表达和纯化方法，包括以下步骤： 

（1）以生物信息学软件预测hCE1蛋白优势抗原表位区的分布； 

（2）用PCR技术扩增含步骤（1）所述的hCE1蛋白优势抗原表位区的基因截短片段； 

（3）将步骤（2）得到的基因截短片段克隆至原核表达载体，构建hCE1基因原核表达重组质粒； 

（4）将步骤（3）构建的hCE1基因原核表达重组质粒转化宿主细胞，获得转化的宿主细胞； 

（5）培养步骤（4）所述转化的宿主细胞，以表达重组hCE1蛋白； 

（6）分离、纯化步骤（5）所述重组hCE1蛋白。 

作为改进，步骤（1）所述优势抗原表位区是hCE1蛋白第500-567位氨基 酸序列区。 

作为改进，步骤（2）所述PCR扩增引物是： 

正向引物：5′-GGAATTCCATATGGAATTCTGGGCCAACTTTGCTCGC-3′； 

反向引物：5′-CCGCTCGAGTCACAGCTCTATGTGTTCTGTCTGG-3′。 

作为改进，步骤（3）所述原核表达载体是pET-42a(+)。 

作为改进，将步骤（2）得到的基因截短片段和pET-42a(+)用限制性内切酶EcoR Ⅰ 和Xho Ⅰ进行双酶切。 

作为改进，步骤（4）所述宿主细胞是E.coli BL21(DE3)plys细胞。 

作为改进，步骤（5）所述表达经IPTG诱导，IPTG浓度为0.lmM。 

作为改进，步骤（6）所述分离、纯化包括经2次超声破胞和镍亲和层析法纯化。 

本发明还提供一种重组hCE1蛋白，将hCE1第500-567位氨基酸截短序列***pET-42a(+)载体的多克隆位点获得。 

本发明对hCE1蛋白的序列进行分析，筛选出了最佳抗原表位，可有效提高抗体识别天然抗原的特异度。确定hCE1蛋白的第500-567位氨基酸序列区为hCE1蛋白的优势抗原表位区。将hCE1蛋白的C末端序列（第500-567位氨基酸）相应的基因序列克隆并构建于大肠杆菌的表达载体中，并利用该表达体系得到了His-hCE1融合蛋白。 

本发明应用原核表达***实现了hCE1蛋白的可溶性表达。应用原核表达***表达出用于制备优质的hCE1单克隆抗体的可溶性hCE1融合蛋白，与真核表达体系相比，操作简单，成本低廉，具有省时省力的优点。 

采用带有融合标签的pET原核表达载体***，可以促进融合蛋白的高效表达和纯化，本发明建立的优化原核表达体系可实现较高的蛋白产量。用pET-42a(+)作为载体表达外源蛋白的功能非常强，且可以通过诱导物浓度来控制其目的蛋白的表达水平，该载体在N端有GST标签和His标签，能较方便的通过GST标签或His标签亲和层析纯化，得到较纯的融合蛋白。将重组表达质粒pET-42a(+)/hCE1转化入宿主细胞，经诱导高效表达了主要以可溶形式存在的融合蛋白。 

本发明选用His标签亲和纯化法对初级蛋白产物进行纯化。pET-42a(+)载体 含有六聚组氨酸（His），可融合表达融合蛋白质His-X,其中His接头可与镍离子特异性结合，因此表达的融合蛋白以His标签蛋白纯化树脂（Ni-NTA Resin）进行亲和层析纯化，既提高了蛋白产物的质量，又避免了在目的蛋白洗脱过程中的不必要流失，以收获高产高质的His-hCE1融合蛋白。1L大肠杆菌培养物可得到纯度>95%的10-15mg融合蛋白，经Western Blot鉴定为正确表达。 

本发明重组hCE1蛋白的可溶性表达和纯化方法，达到了理想的蛋白纯度和产量，为后期制备优质的抗hCE1单克隆抗体、抗hCE1多克隆抗体及高特异性的hCE1 ELISA试剂盒等研究工作提供了物质基础。 

附图说明

图1为hCE1蛋白最佳抗原表位的预测图。 

图2为hCE1基因截短片段PCR产物的琼脂糖电泳分析图； 

M，DNA Marker（2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp） 

1-3，hCE1 PCR产物，PCR扩增hCE1蛋白第500-567位氨基酸序列对应的基因序列。 

图3为重组质粒pET-42a(+)/hCE1酶切鉴定图； 

M，DNA Marker（2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp） 

1，重组质粒pET-42a(+)/hCE1；2，经EcoR Ⅰ 和Xho Ⅰ双酶切的重组质粒pET-42a(+)/hCE1。 

图4为重组质粒pET-42a(+)/hCE1测序结果比对图。 

图5为重组蛋白His-hCE1纯化的SDS-PAGE图； 

M，蛋白Marker（118kD，90kD，50kD，36kD） 

1，His-hCE1，全细胞；2，His-hCE1，第二次破胞上清；3，His-hCE1，第一次破胞沉淀；4，His-hCE1，洗杂；5-7，His-hCE1，纯蛋白。 

图6为His-hCE1蛋白的Western Blot鉴定图； 

1，2，3分别为纯蛋白（1μL），纯蛋白（2μL），纯蛋白（5μL）上样。 

具体实施方式

为了表达高纯度、可溶的重组hCE1蛋白，本发明实施例以DNAStar软件预测了hCE1蛋白最佳抗原表位区的分布，扩增hCE1蛋白最佳抗原表位区相对应的基因截短片段，选用带有His标签的pET-42a(+)原核表达载体并构建原核表 达重组质粒pET-42a(+)/hCE1，经IPTG诱导表达了相应的His-hCE1蛋白，并以镍亲和层析法对蛋白进行了纯化。 

在本发明中，除hCE1蛋白最佳抗原表位的预测、原核表达载体及宿主细胞的选择、蛋白表达及分离纯化条件外，其他工艺条件均采用本领域的常规条件。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，按照Sambrook等人所编著的《分子克隆实验指南（第三版）》（科学出版社，2002）中所述的方法进行具体实验。 

所用到的实验材料为：质粒pCMV-SPOT6-hCE1、pET-42a(+)载体、大肠杆菌菌株DH5α、BL21(DE3)pLysS由长沙赢润生物技术有限公司购得。限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、T4连接酶等工具酶、DNA分子量标准、蛋白分子量标准购自Fermentas公司。PCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。 

实施例1  hCE1蛋白最佳抗原表位的预测 

在选择抗原表位区时，主要考量4个参数抗原指数、亲水性、蛋白表面可能性及柔韧性，各项参数的参考标准及对应的预测方法主要为： 

（1）抗原指数（Antigenic index）≥0（Jameson-Wole）； 

（2）亲水性(hydrophilcity)≥0（Kyte-Doolittle）； 

（3）蛋白表面可及性(Surface probability)≥1（Emini）； 

（4）柔韧性(Flexible regions)无具体参数，可从图形中进行选取（Karplus-Schultz）。 

利用DNAStar软件对hCE1氨基酸序列的抗原指数、亲水性、蛋白表面可能性及柔韧性参数进行综合分析，如图1所示。各参数的优势氨基酸序列区域如下： 

（1）抗原指数 

79-93,101-116,330-342,393-418,451-472,479-492，503-527,551-566; 

（2）亲水性 

65-96,100-112,125-133,179-192,332-343,434-470，501-546,550-567; 

（3）蛋白表面可及性 

124-132,309-315,444-455,503-510,516-526,534-543,554-563; 

（4）柔韧性 

57-115,124-132,208-227,257-319,396-415,435-490,504-543,553-563; 

从以上指标的最优氨基酸序列区域可知，在hCE1的C-端500-567位氨基酸各项指标预测结果均较满意，且位于保守序列区，选取该段序列作为最优抗原表位。 

实施例2  hCE1基因截短片段的PCR扩增 

根据hCE1蛋白的最佳抗原表位区相对应的基因序列，设计合成引物，引物序列为： 

正向引物：5′-GGAATTCCATATGGAATTCTGGGCCAACTTTGCTCGC-3′ 

反向引物：5′-CCGCTCGAGTCACAGCTCTATGTGTTCTGTCTGG-3′ 

以pCMV-SPOT6-hCE1为模板，PCR扩增hCE1蛋白第500-567位氨基酸序列相对应的目的基因片段。PCR反应体系（50.0μL）： 

表1 

PCR反应条件： 

表2 

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳初步检测后，切胶回收PCR产物。图2为 hCE1基因截短片段PCR产物琼脂糖电泳分析图，PCR产物大小约为235bp，与预期基因片段大小相符。 

实施例3  重组表达质粒pET-42a(+)/hCE-Ia的构建 

分别将PCR产物和pET-42a(+)以限制性内切酶EcoR Ⅰ 和Xho Ⅰ进行双酶切；用胶回收试剂盒（长沙赢润生物技术有限公司）回收酶切产物（hCE1的PCR酶切产物约235bp，pET-42a(+)酶切产物约5930bp）；以T4 DNA Ligase进行连接，连接反应体系（10.0μL）如下： 

表3 

将上述混合物置于恒温水浴锅，16℃连接反应14小时。将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布含25μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃培养12-14h，挑取单克隆扩大培养，采用碱裂解法小量提取重组质粒DNA，经酶切鉴定筛选出阳性克隆，并通过DNA序列测定进行进一步验证。 

酶切鉴定：EcoR Ⅰ 和Xho Ⅰ酶切鉴定如图3所示，切出的两条带大小分别为235bp、5930bp，与hCE1 PCR产物、载体pET-42a(+)大小相符合。 

DNA序列测定：pET-42a(+)/hCE1测序结果和NCBI上hCE1的基因序列（GenBank登录号：BC110338.1）比较，如图4所示，结果与预期完全一致，hCE1基因片段成功克隆入pET-42a(+)表达载体中。获得的pET-42a(+)/hCE1中His-hCE1段的序列如下： 

TGGGCCAACT TTGCTCGCAA TGGAAACCCC AATGGGGAAG GGCTGCCCCA CTGGCCAGAG  60 

TACAACCAGA AGGAAGGGTA TCTGCAGATT GGTGCCAACA CCCAGGCGGC CCAGAAGCTG  120 

AAGGACAAAG AAGTAGCTTT CTGGACCAAC CTCTTTGCCA AGAAGGCAGT GGAGAAGCCA  180 

CCCCAGACAG AACACATAGA GCTGTGA  207 

并且其相应的氨基酸序列如下： 

Trp Ala Asn Phe Ala Arg Asn Gly Asn Pro       Asn Gly Glu Gly Leu Pro His Trp Pro Glu  20  

Tyr Asn Gln Lys Glu Gly Tyr Leu Gln IIe       Gly Ala Asn Thr Gln Ala Ala Gln Lys Leu  40  

Lys Asp Lys Glu Val Ala Phe Trp Thr Asn       Leu Phe Ala Lys Lys Ala Val Glu Lys Pro  60  

Pro Gln Thr Glu His IIe Glu Leu   69 

实施例4重组His-hCE 1蛋白的可溶性表达 

将已鉴定的重组质粒pET-42a(+)/hCE1转化E.coli BL21(DE3)pLysS感受态细胞，涂布含25μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃培养12-14h。挑取阳性单克隆接种于含25μg/mL卡那霉素的5mL LB液体培养基中，37℃，250rpm振荡培养至菌液OD值为0.6～0.8。取上述1mL菌液接种于含25μg/mL卡那霉素的500mL LB培养基中，37℃，250rpm振荡培养至OD值约为0.4～0.6时，加入IPTG至终浓度为1mM，180rpm，37℃诱导培养4h。 

实施例5重组His-hCE 1蛋白的分离纯化 

在4℃，8,000rpm下离心5min收集菌体，将菌体沉淀充分悬浮于冰冷的20mL 1×PBS溶液中，然后经4℃，8,000rpm离心5min再次收集菌体，冻存至-80℃备用。将菌体沉淀充分悬浮于冰冷的20mL 1×PBS溶液中，加入1%（V/V）Triton X-100和1%（V/V）PMSF（10mmol/L），混匀。冰上超声破胞每次5sec，间歇25sec，总超声25次。超声裂解产物在4℃，12,000rpm下超速离心15min，弃去第一次破胞上清，收集第一次破胞沉淀。 

将第一次破胞沉淀充分悬浮于冰冷的20mL 1×PBS溶液中，加入1%（V/V）Triton X-100、1%（V/V）PMSF（10mmol/L）和0.5%（V/V）SDS，充分混匀。冰上超声破胞每次5 sec，间歇25 sec，总超声25次。超声裂解产物在4℃，12,000rpm下超速离心15min，收集第二次的破胞上清。 

将第二次的破胞上清与His标签蛋白纯化树脂（Ni-NTA Resin）充分混匀，摇床冰上孵育1h。孵育完全后，将孵育液加入重力流柱（Gravity-Flow Column）进行穿透。用含有50mM咪唑的1×PBS缓冲溶液（pH 7.6）洗脱杂蛋白，用含有250mM咪唑和0.5%（V/V）SDS的1×PBS缓冲溶液（pH 7.6）洗脱目的蛋白。最后将所得产物在4℃下，于含有1mM DTT和1mM EDTA的1×PBS缓冲溶液（pH 7.6）中透析4-6小时，即得到高纯度可溶的His-hCE-I蛋白，冻存 于-80℃备用。 

分别取样（全细胞，第一次破胞沉淀，第二次破胞上清，洗杂，纯蛋白），以10%的SDS-PAGE胶电泳，考马斯亮蓝染色10min，随后用25%乙醇及5%的醋酸脱色，扫描仪扫描成像，结果如图5，箭头所示重组蛋白His-hCE-I表达的位置，约为42kD，与理论大小相符。 

实施例6重组His-hCE 1蛋白的Western Blot鉴定 

将纯化的蛋白分别以1μL、2μL、5μL的量上样，以10%SDS-PAGE胶电泳，电泳结束后将凝胶转膜至PVDF膜，转膜时间1h。将PVDF膜置于含5%脱脂奶粉的PBS封闭液，4℃封闭过夜，PBST洗膜3次，每次10min。以鼠抗His标签单克隆抗体（Anti-His-Tag）为一抗（1:5000），孵育2h，PBST洗膜3次，每次10min。以HRP标记的羊抗兔IgG抗体为二抗（1:5000），孵育2h，PBST洗膜3次，每次10min。避光显色10min，观察结果，如图6。 

本发明方法也可以应用真核表达***表达hCE1蛋白，但是真核表达的实验步骤较繁琐，成本较高，且蛋白的表达量较低，难以满足单克隆抗体筛选的要求。 

Claims (9)

1.一种重组hCE1蛋白的可溶性表达和纯化方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）以生物信息学软件预测hCE1蛋白优势抗原表位区的分布；

（2）用PCR技术扩增含步骤（1）所述的hCE1蛋白优势抗原表位区的基因截短片段；

（3）将步骤（2）得到的基因截短片段克隆至原核表达载体，构建hCE1基因原核表达重组质粒；

（4）将步骤（3）构建的hCE1基因原核表达重组质粒转化宿主细胞，获得转化的宿主细胞；

（5）培养步骤（4）所述转化的宿主细胞，以表达重组hCE1蛋白；

（6）分离、纯化步骤（5）所述重组hCE1蛋白。

2.如权利要求1所述的重组hCE1蛋白的可溶性表达和纯化方法，其特征在于步骤（1）所述优势抗原表位区是hCE1蛋白第500-567位氨基酸序列区。

3.如权利要求1所述的重组hCE1蛋白的可溶性表达和纯化方法，其特征在于，步骤（2）所述PCR扩增引物是：

正向引物：5′-GGAATTCCATATGGAATTCTGGGCCAACTTTGCTCGC-3′；

反向引物：5′-CCGCTCGAGTCACAGCTCTATGTGTTCTGTCTGG-3′。

4.如权利要求1所述的重组hCE1蛋白的可溶性表达和纯化方法，其特征在于步骤（3）所述原核表达载体是pET-42a(+)。

5.如权利要求4所述的重组hCE1蛋白的可溶性表达和纯化方法，其特征在于将步骤（2）得到的基因截短片段和pET-42a(+)用限制性内切酶EcoR Ⅰ 和Xho Ⅰ进行双酶切。

6.如权利要求1所述的重组hCE1蛋白的可溶性表达和纯化方法，其特征在于步骤（4）所述宿主细胞是E.coli BL21(DE3)plys细胞。

7.如权利要求1所述的重组hCE1蛋白的可溶性表达和纯化方法，其特征在于步骤（5）所述表达经IPTG诱导，IPTG浓度为0.lmM。

8.如权利要求1所述的重组hCE1蛋白的可溶性表达和纯化方法，其特征在于步骤（6）所述分离、纯化包括经2次超声破胞和镍亲和层析法纯化。

9.一种重组hCE1蛋白，其特征在于：将hCE1第500-567位氨基酸截短序列***pET-42a(+)载体的多克隆位点获得。

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