JP2014512379A - ヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１を特異的に認識するモノクローナル抗体、前記抗体を生産するハイブリドーマ細胞株及びその用途 - Google Patents

ヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１を特異的に認識するモノクローナル抗体、前記抗体を生産するハイブリドーマ細胞株及びその用途 Download PDF

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Abstract

本発明は、ヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１を特異的に認識するモノクローナル抗体、前記抗体を生産するハイブリドーマ細胞株及びその用途に関するもので、ヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１に特異的に結合して組職、血液などでヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１の発現量を客観的に分析するために使用することができるので、尿または血液から肝癌を簡便に且つ迅速に診断することができる。

Description

本発明は、組職及び血液のようなヒト臨床検体でヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１の発現量を客観的に分析するために使用することができるヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１を特異的に認識するモノクローナル抗体、前記抗体を生産するハイブリドーマ細胞株及びその用途に関する。
ヒトカルボキシルエステラーゼ(ｈＣＥ：ｈｕｍａｎ ｃａｒｂｏｘｙｌｅｓｔｅｒａｓｅ)は、ｈＣＥ１、ｈＣＥ２、ｈＣＥ３などのお互いに異なる性質と構造を有するイソフォーム(ｉｓｏｆｏｒｍ)に分類することができる(Ｉｍａｉ Ｔ、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ., ｖｏｌ.２１、ｐｐ.１７３−１８５、２００６)。ヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１(ｈＣＥ１)は、主に肝で生合成される酵素として、組職内に吸収される化学物質に対して親水性分子のアシル基(ａｃｙｌ ｇｒｏｕｐ)を認識して分解させる。一方、ヒトカルボキシルエステラーゼ２(ｈＣＥ２)は、主に腸から発現される酵素として、ｈＣＥ１との同質性(ｈｏｍｏｌｏｇｙ)が４７％で別個のタンパク質であり、腸内に吸収される疎水性分子のアシル基と反応する。ヒトカルボキシルエステラーゼ３(ｈＣＥ３)は、主に脳から発現される酵素として、ｈＣＥ１と５０％の同質性があって、これも別個のタンパク質であると言える。
肝−カルボキシルエステラーゼ１は、肝、腸、腎臓、肺、心臓、大食細胞などから発現される酵素であるが、肝から１０倍〜１００倍以上高く発現され、主要役目は大きく３種に分類される。１．薬物学的異物代謝(ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ)として人体内に流入される非活性薬物のエステル(ｅｓｔｅｒ)、アミド(ａｍｉｄ)構造を変形させて活性薬物に転換する作用をする。その例として、ロバスタチン(ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ)を活性型で転換してコレステロール低下効果を示すようにし、体内で毒性作用をするコカイン(ｃｏｃａｉｎ)及びヘロイン(ｈｅｒｏｉｎ)を非毒性型であるコカエチレン(ｃｏｃａｅｔｈｙｌｅｎｅ)とモルヒネ(ｍｏｒｐｈｉｎｅ)に各々転換させる役目をする。２．体内のコレステロールと脂肪酸のエステル構造を必要によって分解及び結合してコレステロール代謝を調節する。３．細胞内小胞体(ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｍ)で大食細胞免疫の認識タンパク質であるＣ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ(ＣＰＲ)と直接的に結合して機能を調節する役目をする(Ｒｅｄｉｎｂｏ ＭＲ., Ｂｉｏｃｈｅｍ. Ｓｏｃ. Ｔｒａｎｓ., ３１, ｐｐ.６２０−６２４, ２００３; Ｒｅｄｉｎｂｏ ＭＲ., Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ. Ｔｏｄａｙ., １０, ｐｐ.３１３−３２５, ２００５)。肝−カルボキシルエステラーゼ１の他の特性は、化学物質により肝癌が誘導されたラットの肝マイクロゾムで酵素の活性が急激に低下される(Ｍａｋｉ Ｔ., Ｊｐｎ. Ｊ. Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ., ８２, ｐｐ.８００−８０６, １９９１)ことであり、この機序は今まで明かされなかった。
今まで生体内の肝−カルボキシルエステラーゼ１の活性度分析は、エステラーゼ酵素の非特異的気質であるパラ−ニトロフェニルリン酸(ｐ−ｎｉｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ)やパラ−ニトロフェニル酢酸(ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌａｃｅｔａｔｅ)を用いて酵素力価反応値で分析した。このような方法は、特に血液内でエステラーゼ機能を有するアルブミン、アセチルコリンエステラーゼ、ブチルコリンエステラーゼなども同一な活性があるため、肝−カルボキシルエステラーゼ１のみの特異的な活性を測定することが不可能である(Ｌｉ Ｂ., Ｎｉｏｃｈｅｍ. Ｐｈａｒｍａｃｏｌ., ７０, ｐｐ.１６７３−１６８４, ２００５)。したがって、短時間で多量の検体から肝−カルボキシルエステラーゼ１タンパク質を選択的で且つ効果的に分析することができる方法が必要である。このような方法では酵素免疫分析方法がある。酵素免疫分析方法は、目的するタンパク質(抗原)と結合する抗体を反応させて抗原−抗体結合を誘導し、結合程度を抗体に結合された酵素と気質複合反応を利用することで発色または蛍光発色などから臨床検体内の目的タンパク質を定量する方法である。
最近、本発明者らは、ヒト血漿で肝−カルボキシルエステラーゼ１の存在を証明し、肝癌組職で正常肝組織より発現量が低くなったこととは反対に、肝癌患者の血漿では健常者の血漿に比べて平均２.８倍以上増加することを証明した(Ｎａ Ｋ. ｅｔ ａｌ., Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ. ９, ｐｐ.３９８９−３９９９, ２００９)。しかし、前記実験で使用された肝−カルボキシルエステラーゼ１の抗体は、商業的に製品化されたポリクローナル抗体(Ａｂｃａｍ, ａｂ１８７５)として、非特異的な他のタンパク質が結合されることができ、免疫沈降反応の効率性も落ちる短所がある。
Ｉｍａｉ Ｔ、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ., ｖｏｌ.２１、ｐｐ.１７３−１８５、２００６ Ｒｅｄｉｎｂｏ ＭＲ., Ｂｉｏｃｈｅｍ. Ｓｏｃ. Ｔｒａｎｓ., ３１, ｐｐ.６２０−６２４, ２００３ Ｒｅｄｉｎｂｏ ＭＲ., Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ. Ｔｏｄａｙ., １０, ｐｐ.３１３−３２５, ２００５ Ｍａｋｉ Ｔ., Ｊｐｎ. Ｊ. Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ., ８２, ｐｐ.８００−８０６, １９９１ Ｌｉ Ｂ., Ｎｉｏｃｈｅｍ. Ｐｈａｒｍａｃｏｌ., ７０, ｐｐ.１６７３−１６８４, ２００５ Ｎａ Ｋ. ｅｔ ａｌ., Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ. ９, ｐｐ.３９８９−３９９９, ２００９
したがって、前記のような従来の諸問題点を解消するために提案されたものであって、本発明の目的は、組職、血液などで肝−カルボキシルエステラーゼ１を効果的に分析することができる肝−カルボキシルエステラーゼ１のモノクローナル抗体と前記抗体を生産するハイブリドーマ細胞株を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記モノクローナル抗体を利用して肝−カルボキシルエステラーゼ１を分離精製するか、血中から検出するか、特異的に肝癌を診断する前記抗体の用途を提供することにある。
前記目的を達成するために本発明は、寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２８２であるハイブリドーマにより生産される、ヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。
また、本発明によるモノクローナル抗体を生産する寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２８２であるハイブリドーマ細胞を提供する。
また、本発明によるモノクローナル抗体を含むヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１タンパク質の分離及び精製用組成物を提供する。
また、本発明によるモノクローナル抗体を含むヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１の検出用組成物を提供する。
また、本発明によるモノクローナル抗体を試料サンプルと接触させて抗原−抗体複合体形成を検出する段階を含む尿または血中ヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１の濃度検出方法を提供する。
また、本発明によるモノクローナル抗体を含む肝癌診断キットを提供する。
本発明のヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１のモノクローナル抗体は、ヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１タンパク質との高い特異結合を通じて、組職、細胞、血液などで肝−カルボキシルエステラーゼ１の探知に使われることができる。特に、血液で簡便に肝癌を早期診断するために有用に使用することができる。
抗原ペプチド基をマウスに３次まで免疫化した後、マウスの尻尾から血清を分離して肝−カルボキシルエステラーゼ１を分析した結果を示した図である。 肝−カルボキシルエステラーゼ１の抗原ペプチドに対する免疫化されたマウスの脾臓細胞とミエローマの融合細胞に対する反応性を示した写真図である。 肝−カルボキシルエステラーゼ１の抗原ペプチドにより反応性が高い免疫化されたマウスの脾臓細胞を利用して肝−カルボキシルエステラーゼ１のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞株を選別した結果を示したす図である。 本発明のモノクローナル抗体と公知の肝−カルボキシルエステラーゼ１のポリクローナル抗体の抗原−抗体結合程度を比較した結果である。 本発明のモノクローナル抗体と公知の肝−カルボキシルエステラーゼ１のポリクローナル抗体を利用して健常者、肝炎患者、肝硬変患者、肝癌患者の血漿(ｐｌａｓｍａ)で抗原−抗体結合程度を比較した結果である。 (ａ)は、本発明のモノクローナル抗体と公知の肝−カルボキシルエステラーゼ１のポリクローナル抗体を利用して抗原−抗体結合による試料の発色結果であり、(ｂ)は、肝−カルボキシルエステラーゼ１の濃度別抗原−抗体結合による吸光度数値を示した図である。
以下、本発明の構成を詳しく説明する。
本発明者らは、既存の商業的に販売されているヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１の抗体より効率性が高いモノクローナル抗体とその抗体を生産するハイブリドーマ細胞株を開発し、血漿内の肝−カルボキシルエステラーゼ１を分離してその酵素の量を客観的に比較分析する手段を提供することで、本発明を完成した。
したがって、本発明は、寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２８２のハイブリドーマにより生産される、ヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体、前記モノクローナルを生産するハイブリドーマ細胞及びその製造方法を提供する。
本明細書で「ヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１」は、タンパク質その自体、その遺伝子再組合タンパク質及びこれらの人工変異体及び突然変異体だけではなくタンパク質の天然形態及びその機能的等価物を含む。
本発明のヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１に対して特異的なモノクローナル抗体は、本発明が属する技術分野においてよく知られている融合方法(ｆｕｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ)により製造することができる(Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ(１９７６) Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｎｒａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６:５１１−５１９参照)。モノクローナル抗体を分泌する「ハイブリドーマ」を作るために融合される二つの細胞集団の中で一つの集団は、ヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１を注射したマウスのような免疫学的に適した宿主動物の細胞を利用し、残り一つの集団では、癌または骨髓種細胞株を利用する。このような二つの集団の細胞をポリエチレングリコールのような本発明が属する技術分野において公知されている方法により融合させてから抗体−生産細胞を標準的な組職培養方法により増殖させる。限界希釈法(ｌｉｍｉｔｅｄ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ)によるサブクローニングにより均一な細胞集団を収得した後、ヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１に対して特異的な抗体を生産することができるハイブリドーマ細胞株を酵素免疫測定法(ＥＬＩＳＡ：ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ)またはウェスタンブロット分析法で選別し、標準技術に従って試験管内または生体内で大量に培養する。前記生体内での大量培養はハイブリドーマ細胞株をマウスの腹腔に注射して高濃度の抗体生産を誘導した後、腹水(ａｓｃｉｔｅｓ)から分離することを意味する。
前記ハイブリドーマ細胞株が生産するモノクローナル抗体は、精製しないで使用するか、本発明が属する技術分野においてよく知られている方法によって高純度(例えば、９５％以上)に精製して使用することができる。このような精製技術では、例えば、ゲル電気泳動、透析、塩沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、親和性抗原コラムクロマトグラフィーなどの方法を利用して培養培地または腹水(ａｓｃｉｔｅｓ)から分離することができる。
本発明によるモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマをハイブリドーマＹＰＲＣ １０Ｅ８で名付けて、これを２０１２年３月２８日付けでソウル市鍾路区蓮建洞所在のソウル大学校医科大学癌研究所内の国際寄託機関である韓国細胞株研究財団(Ｋｏｒｅａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ)に寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２８２で寄託した。本明細書で、「ハイブリドーマＹＰＲＣ １０Ｅ８」が生産するモノクローナル抗体を「ＹＰＲＣ １０Ｅ８」で名付けた。
抗原を検出するためにモノクローン抗体を使用する場合は、モノエピトープを認知することで特定の相互作用を有する利点がある。このように抗原と抗体間の相互作用に関与するエピトープをマッピング(ｍａｐｐｉｎｇ)するために多様な接近方法を利用することができる。例えば、ファージディスプレイペプチドライブラリを使用してバイオパンニングする方法、抗原ポリペプチドをプロテアーゼで分解して生成された断片を免疫ブロッティングしてスクリーニングすることでエピトープ配列を含む断片を決定する方法、活性化された膜またはポリエチレンピンのような固体上に固定されたペプチドアレイをスクリーニングする方法、エピトープ配列内の各々のアミノ酸配列残基の重要な可溶性ペプチドを使用した競争的ＥＬＩＳＡ検定方法などがある。
本発明のモノクローナル抗体が認知するヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１上のエピトープは、ＡｂＦｒｏｎｔｉｅｒ社のソフトウェアを使用してヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１の３次構造で分析し、分析されたペプチドリストから免疫化させるマウスの該当タンパク質のアミノ酸配列と異なることを確認した後、分析されたヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１に特異的なペプチドを基準で再選別して選定した。
このようなエピトープを土台としてヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１のアミノ酸配列のうちＣ−末端の５５４〜５６７に該当する配列目録の配列番号１の線形エピトープを指定することができた。
前記モノクローナル抗体の抗原結合親和性は、通常の方法によって決定でき、特別に限定しないが、より具体的には、放射能免疫分析法(ＲＩＡ)、酵素免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)、免疫沈降法、免疫蛍光法、色彩粒子結合法、化学発光物質結合法または免疫ブロッティングを通じて抗原との結合親和性を測定する。本発明のモノクローナル抗体は、ポリクローナル抗体対比２０倍以上の結合親和度を示す。
本発明によるモノクローナル抗体は、ＩｇＧ１の兔疫グロブリン単位型(ｉｓｏｔｙｐｅ)である。
したがって、本発明は、ヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１のアミノ酸配列のうちＣ−末端の５５４〜５６７に該当する配列目録の配列番号１の線形エピトープを認識し、ヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１に特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。
本明細書で使われた用語「モノクローナル抗体」とは、当該分野において公知された用語として、単一抗原性部位に対して指示される高度の特異的な抗体を意味する。通常的に、相異なっているエピトープ(抗原決定基)に対して指示される相異なっている抗体を含むポリクローナル抗体とは異なり、モノクローナル抗体は、抗原上の単一決定基に対して指示される。モノクローナル抗体は、抗原−抗体結合を利用する診断及び分析学的分析法の選択性と特異性を改善させる長所があり、また、ハイブリドーマ培養により合成されるので、他の兔疫グロブリンにより汚染されない長所を有する。本明細書では、ヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１に対する抗体として、全体抗体だけではなく抗体分子の機能的な断片を含む。全体抗体は、２個の全体長さの軽鎖及び２個の全体長さの重鎖を有する構造であり、各々の軽鎖は重鎖とジスルフィド結合で連結されている。重鎖不変領域は、ガンマ(γ)、ミュー(μ)、アルファ(α)、デルタ(δ)、エプシロン(ε)タイプを有し、サブクラスでガンマ１(γ１)、ガンマ２(γ２)、ガンマ３(γ３)、ガンマ４(γ４)、アルファ１(α１)及びアルファ２(α２)を有する。軽鎖の不変領域は、カッパー(κ)及びラムダ(λ)タイプを有する(Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ, Ｗｏｎｓｉｅｗｉｃｚ, Ｍ. Ｊ., Ｅｄ.,Ｃｈａｐｔｅｒ ４５, ｐｐ. ４１−５０, Ｗ. Ｂ. Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ. Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ, ＰＡ(１９９１); Ｎｉｓｏｎｏｆｆ, Ａ., Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ, ２ｎｄ Ｅｄ., Ｃｈａｐｔｅｒ ４,ｐｐ. ４５−６５, Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ, Ｉｎｃ., Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ, ＭＡ (１９８４))。
抗体分子の機能的な断片とは、抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ')、Ｆ(ａｂ')２及びＦｖなどを含む。抗体断片の中でＦａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域及び重鎖の一番目の不変領域(ＣＨ１)を有する構造で、１個の抗原結合部位を有する。Ｆａｂ'は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域(ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ)を有する点でＦａｂと差がある。Ｆ(ａｂ')２抗体は、Ｆａｂ'のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合を成している。Ｆｖは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のみを有している最小の抗体切れでＦｖ断片を生成する再組合せ技術は、国際公開特許ＷＯ８８/１０６４９、ＷＯ８８/１０６６３０、ＷＯ８８/０７０８５、ＷＯ８８/０７０８６及びＷＯ８８/０９３４４に開示されている。ｄｓＦｖ(二鎖Ｆｖ)は、非共有結合で重鎖可変領域と軽鎖可変領域が連結されており、ｓｃＦｖ(単鎖Ｆｖ)は、一般的にペプチドリンカーを通じて重鎖の可変領域と単鎖の可変領域が共有結合で連結されるかまたはＣ末端ですぐ連結されているので、ｄｓＦｖのようにダイマー構造を成すことができる。
このような抗体断片は、タンパク質加水分解酵素を利用して得ることができ(例えば、全体抗体をパパインで制限切断すれば、Ｆａｂを得ることができ、ペプシンで切断すれば、Ｆ(ａｂ')２断片を得ることができる)、好ましくは、遺伝子再組合せ技術を通じて製作することができる。本発明で抗体は、好ましくは、Ｆａｂ形態であるか全体抗体である。また、重鎖不変領域は、ガンマ(γ)、ミュー(μ)、アルファ(α)、デルタ(δ)またはエプシロン(ε)のいずれか一つのタイプから選択されることができる。軽鎖不変領域は、カッパーまたはラムダ型であることができる。
また、本発明の抗体は、キメラ抗体またはキメラ抗体の免疫原性を一層減少させるためのヒト化抗体(ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ)またはＣＤＲ−移植抗体(ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ)である。
キメラ(ｃｈｉｍｅｒｉｃ)抗体とは、抗体可変領域(ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ)は、ヒト以外の動物(例えば、マウス、兎、家擒類など)から由来し、抗体不変領域(ｃｏｎｓｔａｎｔ ｄｏｍａｉｎ)は、ヒトから由来した抗体を意味する。このようなキメラ抗体は、当業界に公知された遺伝子再組合などの方法で製造することができる。
ヒト化抗体(ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ)またはＣＤＲ−移植抗体(ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ)は、動物由来のモノクローナル抗体の高い親和度と特異性は維持しながら人体内での免疫誘発能を減少させるために、動物由来のモノクローナル抗体の抗原結合領域(ＣＤＲ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ)をヒト抗体に移植させて製造される抗体を意味し、抗原に対する親和度と人体内での免疫誘発程度を考慮してヒト化させる程度を選択することができる。
また、他の様態として、本発明は、本発明によるモノクローナル抗体を含むヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１タンパク質の分離及び精製用組成物に関する。
前記抗体を含む分離及び精製用組成物は、通常のイオン交換クロマトグラフィー及び親和性クロマトグラフィーなどの精製方法などに使われて、試料からヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１タンパク質を容易に分離及び精製することができるようにする。
また、他の様態として、本発明は、本発明によるモノクローナル抗体を含むヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１の検出用組成物を提供する。
また、本発明による一クローン抗体を試料サンプルと接触させて抗原−抗体複合体の形成を検出する段階を含む尿または血中ヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１の濃度検出方法を提供する。
本発明は、前記モノクローナル抗体をヒトの尿、血清または血漿と接触させて抗原−抗体複合体形成を検出することでヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１を検出することができる。
本明細書で使われた用語「抗原−抗体複合体」は、ヒトの尿、血清または血漿などの生物学的試料中のヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１の存在または不在を確認するための前記酵素とそれを認知するモノクローナル抗体の結合物を意味する。
前記抗原−抗体複合体は、検出標識(ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌａｂｅｌ)を利用して検出することができる。例えば、酵素、蛍光物質、リガンド(ｌｉｇａｎｄ)、発光物質、微細粒子(ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ)、レドックス分子または放射線同位元素などから選択することができ、これに特別に限定されるものではない。
前記酵素には、例えば、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ヘキソキナーゼとＧＤＰａｓｅ、ＲＮａｓｅ、グルコースオキシダーゼとルシフェラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ホスフェノールピルビン酸デカルボキシラーゼ、β−ラクタマーゼなどがあり、これに限定されるものではない。蛍光物質には、フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、フルオレスカミンなどがあり、これに限定されるものではない。リガンドには、ビオチン誘導体などがあり、これに限定されるものではない。発光物質には、アクリジニウムエステル、ルシフェリン、ルシフェラーゼなどがあり、これに限定されるものではない。微細粒子には、コロイド金、着色されたラテックスなどがあり、これに限定されるものではない。レドックス分子には、フェロセン、ルテニウム錯体、ビオロゲン、キノン、Ｔｉイオン、Ｃｓイオン、ジイミド、１,４−ベンゾキノン、ハイドロキノン、Ｋ４Ｗ(ＣＮ)８、[Ｏｓ(ｂｐｙ)３]２＋、[ＲＵ(ｂｐｙ)３]２＋または[ＭＯ(ＣＮ)８]４−などがあり、これに限定されるものではない。放射線同位元素には、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉまたは１８６Ｒｅなどがあり、これに限定されるものではない。
前記抗原−抗体複合体の形成は、比色法(ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ)、電気化学法(ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ)、蛍光法(ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ)、発光法(ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｙ)、粒子計数法(ｐａｒｔｉｃｌｅ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ)、視覚測定法(ｖｉｓｕａｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ)、またはシンチレーション計数法(ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ)などを使用して検出することができる。例えば、フローサイトメトリー(ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ)、兔疫細胞化学法、放射能免疫分析法(ＲＩＡ)、酵素免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)、ウエスタンブロッティング(Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ)、免疫沈降分析法(Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ)、免疫拡散分析法(Ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ａｓｓａｙ)、補体固定分析法(Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｆｉｘａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ)、タンパク質チップ(ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｉｐ)などにより検出することができる。より具体的に、少量の目的タンパク質を回収するために有用な免疫沈降法(ｉｍｍｕｎｅ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ)及び免疫ブロッティングを通じて検出することができる。
より具体的には、抗原−抗体複合体を酵素免疫測定法(ＥＬＩＳＡ：ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ)を利用して検出することができる。前記ＥＬＩＳＡは、固体支持体に付着された抗原を認知する標識された抗体を利用する直接的ＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着された抗原を認知する抗体の複合体で捕獲抗体を認知する標識された抗体を利用する間接的ＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着された抗体と抗原の複合体で抗原を認知する標識されたまた他の抗体を利用する直接的サンドイッチＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着された抗体と抗原の複合体で抗原を認知するまた他の抗体と反応させた後、この抗体を認知する標識された２次抗体を利用する間接的サンドイッチＥＬＩＳＡなど多様なＥＬＩＳＡ方法を含む。
前記ＥＬＩＳＡ検出方法によって、尿、血液、血清または血漿などの生物学的試料は、固体支持体、例えば、マイクロタイタープレート、メンブレン、テストストリップなどにコーティングされた本発明のモノクローナル抗体と接触される。具体的一例として、マイクロタイタープレートのウェルを本発明のモノクローナル抗体でコーティングし、占有されなかった(ｎｏｎｏｃｃｕｐｉｅｄ)結合部位を、例えば、ＢＳＡで遮断した後、コーティングされたプレートのウェルを試料サンプルとインキュベーションし、引き継いで抗原−抗体複合体の存在を決定することができる。抗原−抗体複合体の存在は、抗原−抗体複合体の抗原に対して特異的な抗体、例えば、ヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１に特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を使用して確認することができる。前記モノクローナルまたはポリクローナル抗体は検出標識を有することができ、検出標識を有しない場合、これらモノクローナルまたはポリクローナル抗体を検出することができるまた他の抗体で処理して確認することができる。
具体的には、支持体に付着された捕獲モノクローナル抗体を生物学的試料と反応させて、引き継いでヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１に特異的に結合するモノクローナル抗体を結合させてそれから検出標識信号を測定するか、これら複合体に検出可能な信号を生成することができる標識を有する２次抗体を添加してそれから検出標識信号を測定して、ヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１を検出することができる。
また、本発明は、本発明によるモノクローナル抗体を含む肝癌診断キットに関する。
本発明の肝癌診断キットに使われるモノクローナル抗体は、この抗体がヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１を選別的に認知することができる限り、モノクローナル抗体の断片も使用することができる。このような抗体断片は、Ｆ(ａｂ')２、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆｖ断片などを含むことができる。
前記肝癌診断キットは、本発明のモノクローナル抗体が付着されたタンパク質チップ形態で製造することができる。
本発明の肝癌診断キットには、ヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１を選別的に認知するモノクローナル抗体またはその断片及び免疫学的分析に使われる道具/試薬が含まれる。
前記免疫学的分析に使われる道具/試薬には、適した担体、検出可能な信号を生成することができる標識物質、溶解剤、洗浄剤などが含まれる。また、標識物質が酵素の場合には、酵素活性を測定することができる気質及び反応停止剤を含むことができる。
適した担体では、これに限定されないが、可溶性担体、例えば、当分野に公知された生理学的に許容される緩衝液、例えば、ＰＢＳ、不溶性担体、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、仮橋デキストラン、ポリサカライド、ラテックスに金属をメッキした磁性微粒子のような高分子、その他紙、ガラス、金属、アガロース及びこれらの組合せであることができる。
本発明の検出方法及び診断キットに使用するための検定システムは、これに限定されるものではないが、ＥＬＩＳＡプレート、ディップ−ステッキデバイス、免疫クロマトグラフィー試験ストリップ及び放射分割免疫検定デバイス及び流水式(ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ)デバイスなどを含む。
発明の実施のための形態
以下、本発明を実施例を通じて詳しく説明する。しかし、下記実施例は本発明を例示することで、本発明の範囲が下記実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞肝組織と血漿試料の需給
肝組織５０ｍｇは、細胞溶解ＲＩＰＡ緩衝溶液[５０ｍＭトリス(Ｔｒｉｓ)、１５０ｍＭ塩化ナトリウム(ＮａＣｌ)、１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、０.２５％デオキシコール酸ナトリウム(ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ)、ｐＨ７.４]に入れて、４℃冷蔵条件で粉碎し、１４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離してタンパク質溶液を回収した。
病理学的に患者の個別情報が確保された健常者、肝炎患者、肝硬変患者、肝癌患者から分取された血漿は、延世セブランス病院の遺伝子銀行から提供を受けた。健常者の血漿は、肝癌指標標準検査要素である免疫欠乏ウイルス(ＨＩＶ)由来のＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２抗体、ＨＩＶ−１抗原、Ｂ型肝炎表面抗原(ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ)、Ｂ型肝炎核抗原(ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｃｏｒｅ ａｎｔｉｇｅｎ)、Ｃ型肝炎ウイルス(ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ)、Ｔ細胞白血病ウイルス(ＨＴＬＶ−Ｉ/ＩＩ)抗原、梅毒菌検査で陰性で判別された試料を使用した。試料は、−７０℃で実験前まで保管して使用した。血漿の入手は 延世医大癌研究所(ｙｏｎｓｅｉ ｍｅｄｉｃａｌ ｃｅｎｔｅｒ)の臨床試験委員会(ＩＲＢ)の規定によった。
＜実施例２＞最適抗原決定基の選定
肝−カルボキシルエステラーゼ１の３次構造で最適の抗原決定基を有するペプチドの選定は、韓国内の抗体製作会社であるＡｂＦｒｏｎｔｉｅｒ社のソフトウェアを使用して分析した。分析されたペプチドリストで免疫化させるマウスの該当タンパク質のアミノ酸配列と異なるものを確認し、実際の研究で分析して肝−カルボキシルエステラーゼ１に特異的なペプチドを基準で再選別して最終１３個のアミノ酸配列を有するペプチドを合成した(表１参照)。
＜実施例３＞マウスの免疫化
ペプチド基の各々同量の補助抗原(Ｆｒｅｕｎｄ'ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ)を乳状化して４匹の雌ＢＡＬＢ/ｃの腹腔に１次注射し、４週後に２次注射し、また２週後に３次注射して免疫化させた。
前記各々の注射前に全てのマウスの尻尾から血清を分離して酵素免疫分析法でペプチド抗原とマウスで生産された抗体反応程度を測定した。
また、同時にタンパク質水準でも分析されるようにウェスタンブロット分析法も共に進行した。肝−カルボキシルエステラーゼ１タンパク質との結合性測定は、ウェスタンブロット方法で実施し、基準試料(ｓｔａｎｄａｒｄ ｓａｍｐｌｅ)として肝組織のタンパク質を使用した。
定量されて添加された肝組織のタンパク質５μｇは、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ゲルは、ニトロセルロース(ＮＣ：ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｏｓｅ)膜にトランスファーした後(ｔｒａｎｓｆｅｒ)、５％脱脂乳(ｓｋｉｍｍｅｄ ｍｉｌｋ)が含まれたＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液 [２０ｍＭトリス、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、０.１％ツイン２０(Ｔｗｅｅｎ−２０)、ｐＨ７.６]で１時間の間ブロッキングした。ペプチドで免疫化されたマウスの血清を１次抗体として５００：１の割合で５％脱脂乳とともに反応させた。２次抗体として抗−マウスＩｇＧ−ＨＲＰ(Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ)を５０００：１の割合で反応させた。最終ＮＣ膜は、ＥＣＬ Ｐｌｕｓウェスタンブロット試薬(ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ)で３分間反応させて、Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４００スキャナを利用してスキャンして抗原−抗体結合で反応した肝−カルボキシルエステラ−ゼ１タンパク質の信号を分析した。
図１は、免疫化期間別マウス血清での肝−カルボキシルエステラーゼ１の分析度を示した写真として、ゲル写真においてＭは、タンパク質分子量別標準マーカー(５μｇ)を意味し、５μｇは、肝組織タンパク質を意味する。
図１に示したように、＃３マウスで高い抗原−抗体反応性を示して前記マウスを選択した。
＜実施例４＞モノクローナル抗体を生産する最適ハイブリドーマ細胞株の選別
前記実施例３で選択した＃３マウスの脾臓細胞を分離してＳｐ２/０−Ａｇ１４ミエローマ細胞と融合させた後、ＨＡＴ培地に希釈させて８個の９６−ウェルプレートに分株して培養した。培養された細胞は、２５０ｎｇ/ｗｅｌｌで合成されたペプチドを抗原として酵素免疫分析法を実行して吸光度が一番高い１１個のウェルを選択し、各細胞は、２４−ウェルで培養されて同一な方法の酵素免疫分析法で５個のウェル(＃１Ｂ２、＃１Ｇ１１、＃２Ｆ４、＃３Ｃ１、＃３Ｆ２)を選定した。また、各細胞は、９６−ウェルプレートに分株して培養され、酵素免疫分析法を３回反復実行してその中で一番高い反応性を示す５個のクローン細胞(＃１Ａ９、＃４Ｈ３、＃６Ａ１０、＃８Ｆ１１、＃１０Ｅ８)を選択した。
図２は、前記酵素免疫測定法で高い力価を有する各々一つの＃３ウェル−細胞の培養液をウェスタンブロット分析した結果として、肝−カルボキシルエステラーゼ１の位置と結合程度を示した写真である。＃３Ｆ２融合細胞で高い反応性を示した。
図３は、選別された５個の＃ウェル細胞を更に９６−ウェルプレートに分株して高い力価を示すウェルを３回反復して分析して最終選別されたウェルの細胞をウェスタンブロット分析した結果を示した写真として、＃１０Ｅ８ハイブリドーマ細胞で高い反応性を示した。
したがって、高い抗原−抗体反応性を示す＃１０Ｅ８ハイブリドーマ細胞株を最終選択し、これをマウスの腹腔に注射してから１週後、腹水を取って抗原−親和性精製コラムを使用して最終濃度が２ｍｇ/ｍＬになるように濃縮して実験前まで冷凍保管した。
最終モノクローナル抗体＃１０Ｅ８のサブクラスアイソタイプ(ｓｕｂｃｌａｓｓ ｉｓｏｔｙｐｅ)測定結果、ＩｇＧ１型で判明された(表２参照)。
＜実施例５＞モノクローナル抗体の抗原−抗体反応の効率性分析：免疫沈降法及び免疫ブロッティング
磁石型ビードである「Ｄｙｎａｂｅａｄ ＭｙＯｎｅＴＭ Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ」(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)は、製造社マニュアルによって抗−肝−カルボキシルエステラーゼ１ポリクローナル抗体(Ａｂｃａｍ社、＃Ａｂ１８７５)と抗−肝−カルボキシルエステラーゼ１モノクローナル抗体(クローン＃１０E８)で各々コーティングされた。各抗−肝−カルボキシルエステラーゼ１抗体が結合されたビード１０μｌ、２０μｌ、３０μｌ、４０μｌ、５０μｌは、肝組織タンパク質１００μｇと一緒に１ｍＬチューブで２時間の間免疫沈降させた。ｐＨ２で合わせたＰＢＳ−Ｔ緩衝溶液を使用して抗体に結合したタンパク質を回収し、免疫ブロッティングを実行してポリクローナル抗体とモノクローナル抗体(クローン＃１０Ｅ８)から結合された肝−カルボキシルエステラーゼ１の変化をＩｍａｇｅＱｕａｎｔプログラムを使用してポリクローナル抗体と比較分析した。
図４は、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体(クローン＃１０Ｅ８)の抗原−抗体結合程度を比較した図として、ｐＨＣＣは、肝癌患者１５名の血漿を混合した試料２００μｌを抗体が結合されたビード３０μｌとともに免疫沈降したことで、５μｇは、肝組織タンパク質を意味する。
図４に示したように、同一な条件でポリクローナル抗体よりモノクローナル抗体＃１０Ｅ８が２０倍高い抗原−抗体反応性を示した。
＜実施例６＞モノクローナル抗体を利用した血漿内の肝−カルボキシルエステラーゼ１タンパク質の分析：免疫沈降及び免疫ブロッティング
各々１０名の健常者、肝炎患者、肝硬変患者、肝癌患者の血漿を混合した後、同一な２００μｌを実施例５で使われた肝−カルボキシルエステラーゼ１ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体＃１０Ｅ８と免疫沈降反応した後、ウェスタンブロット分析法を実行した。同一条件でスキャンするためにスキャン解像度を１００マイクロンにした時、分析された肝−カルボキシルエステラーゼ１の信号強度をＩｍａｇｅＱｕａｎｔプログラムを使用して分析した。
図５及び表３に示したように、モノクローナル抗体と結合した肝−カルボキシルエステラーゼ１の強度がポリクローナル抗体を使用した時より平均３０倍以上分析効率が増加されたことを確認した。
＜実施例７＞モノクローナル抗体を利用した血漿内の肝−カルボキシルエステラーゼ１タンパク質の分析：ＥＬＩＳＡ分析
希釈濃度が０.５ｍｇ/ｍＬである前記モノクローナル抗体＃１０Ｅ８、ＥＬＩＳＡ適用可能なＡｂｃａｍ社の二つのポリクローナル抗体１と抗体２のポリクローナル抗体(＃Ａｂ１８７５、＃Ａｂ７７７３０)２００μｌを９６−ウェルプレートに添加した。前記９６−ウェルプレートに添加して冷蔵状態で１０時間反応させた後、比較試料で肝−カルボキシルエステラーゼ１の標準タンパク質を混合した２００μｌを前記ウェルに添加して２時間の間反応させた。２次結合抗体としてＨＲＰ酵素が結合されたｈＣＥ１抗体(＃Ａｂ３４５９５)を５０００：１で同一に添加し、１時間反応させた後、ＴＭＢ発色試薬を添加した。
図６は、前記モノクローナル抗体＃１０Ｅ８とＥＬＩＳＡ適用可能なＡｂｃａｍ社の二つの抗体１と抗体２のポリクローナル抗体(＃Ａｂ１８７５、＃Ａｂ７７７３０)の抗原−抗体結合程度を比較した結果として、(Ａ)は、抗原−抗体結合による試料の発色結果であり、(Ｂ)は、肝−カルボキシルエステラーゼ１の濃度別抗原−抗体結合による吸光度数値を示した図である。
図６に示したように、標準曲線の分析された吸光度数値を比較すれば、本発明の＃１０Ｅ８抗体は、同一な含量の抗体対比本発明のモノクローナル抗体の結合効率性が既存抗体より顕著に高いことを確認した。
本発明は、タンパク質または疾病診断分野で使用することができる。

Claims (8)

  1. 寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２８２のハイブリドーマにより生産されるヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１タンパク質に特異的に結合することを特徴とするモノクローナル抗体。
  2. モノクローナル抗体は、ヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１タンパク質のＣ−末端のアミノ酸５５４〜５６７のエピトープ配列を認識することを特徴とする請求項１に記載のモノクローナル抗体。
  3. ＩｇＧ１の兔疫グロブリン単位型(ｉｓｏｔｙｐｅ)であることを特徴とする請求項１に記載のモノクローナル抗体。
  4. 請求項１のモノクローナル抗体を生産する寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２８２であることを特徴とするハイブリドーマ細胞。
  5. 請求項１によるモノクローナル抗体を含むことを特徴とするヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１タンパク質の分離及び精製用組成物。
  6. 請求項１によるモノクローナル抗体を含むことを特徴とするヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１の検出用組成物。
  7. 請求項１によるモノクローナル抗体を試料サンプルと接触させて抗原−抗体複合体形成を検出する段階を含むことを特徴とする尿または血中ヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１の濃度検出方法。
  8. 請求項１によるモノクローナル抗体を含むことを特徴とする肝癌診断キット。
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