KR100975852B1 - 간-카르복실에스터라제 1 단백질과 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 간암 진단 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 간암 진단용 마커인 간-카르복실에스터라제 1과 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 간암을 진단하는 방법 및 그 항체 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 간암 진단용 마커는 정상인보다 간암 혈액에서 증가하는 차이를 확인함으로써, 간암의 발병을 조기 진단하는 데에 이용될 수 있다.
간암, 진단마커, 혈장, 간-카르복실에스터라제 1

Description

간-카르복실에스터라제 1 단백질과 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 간암 진단 조성물{COMPOSITION FOR LIVER CANCER DIAGNOSIS COMPRISING LIVER CARBOXYLESTERASE 1-SPECIFIC ANTIBODY}
본 발명은 간암 진단용 조성물에 관한 것으로, 특히 2차원 형광전기영동, 자석비드-항체면역침강법, 항체-면역블랏팅, 질량분석기기를 이용하여 정상에 비하여 간암 혈액에서 그 발현량이 변화하는 간암 진단용 표지마커로서의 간-카르복실에스터라제 1 단백질을 측정함으로써 간암을 진단하는 간암 진단용 조성물에 관한 것이다.
간암은 세계적으로 6번째로 발병되는 주요 암으로 알려져 있으며 그 사망률은 4번째로 높다. 주로 아프리카와 아시아 등에서 많이 발병하는 주된 암 종류 중의 하나이며, 폐암, 위암, 유방암 등과 달리 암 진단 후 환자의 95% 이상이 5년 이내에 사망하는 것으로 알려져 있다(Parkin, D.M., et al., 2002. CA Cancer J. Clin. 55, 2005)..
비록 간암 증상이 잘 알려져 있고, 간암에 대한 연구가 계속하여 진행되고 있지만, 이 질환을 조기 진단하기가 어려울 뿐 아니라, 간암 진단 이후 생존 가능성이 3%~5%로 매우 낮기 때문에, 이를 조기 진단할 수 있는 암 진단마 커(biomarker)의 중요성이 큰 이슈가 되고 있다.
최근의 전산화 단층촬영(computed tomography; CT)이나 자기공명 영상장치(magnetic resonance imaging; MRI)를 사용하는 조직검사 이외에도, 간암을 진단할 수 있는 임상시료로서 혈장과 같은 체액에서의 단백질 분석을 동시에 측정하여 간암 존재 또는 발병 가능성 여부를 판단하고 있다.
현재 간암 환자 검별 방법으로는, 알파-페토프로틴(alpha-fetoprotein; AFP), 데스-감마-카르복시프로트롬빈(Des-gamma carboxyprothrombin; DCP), 글리피칸-3 (Glypican-3; GPC3)와 같은 진단마커의 단일 또는 복합 측정 방법이 사용되고 있다. 비록 상기의 진단마커들이 간암 감별에 가장 유용한 진단마커로 알려져 있지만, 낮은 민감도(sensitivity)와 암특이도(specificity)를 갖고 있다. 예를 들어, 간암 혈청 진단마커로 알려져 있는 AFP의 경우 76%~94%의 높은 암특이도를 갖는 반면, 39%~65%의 낮은 민감도를 가진다. 따라서 현재까지도 새로운 진단마커 개발이 많은 연구를 통하여 요구되고 있다(Wright, L.M., et al., Cancer Detect. Prev. 31, 2007).
이에, 본 발명자 등은 간암 환자와 정상인 혈장 임상시료에 대한 단백질 변화 양상을 암 진행과 관련 있는 단백질 합성후 변형(Post-translational modification) 중의 하나인 N 형태 결합 당쇄화 단백질(N-linked glycosylated protein)을 중심으로 2차원 전기영동을 통하여 분리하고, 변화된 단백질을 동정한 후, 생물정보학적 기술(bioinformatic tool)을 이용하여 간암 특이적인 단백질 마커를 발굴하였다.
간암 진단마커 후보 단백질로서, 간-카르복실에스터라제 1(liver carboxylesterase 1)은 간, 폐, 심장, 뇌, 전립선, 난소 등 거의 모든 조직에 발현되며, 특히 간암조직에서는 정상조직보다 발현량이 감소한다고 알려져 있다(Xie, M., et al., Drug Metab. Dispos. 30, 2002). 그러나, 인간 체액인 혈장에서 간-카르복실에스터라제 1의 존재 및 존재량은 확실하게 확인되지 않았다.
인간 혈장내의 간-카르복실에스터라제 1의 존재 관점으로 연구된 논문에서, 카르복실에스터라제를 세파로즈(sepharose) 친화성 크로마토그래피로 정제하고, 그의 가수분해 활성을 기질인 트리올렌(triolein) 또는 p-니트로페닐아세테이트(p-nitrophenyl acetate)를 사용하여 그 단백질 존재를 확인한 논문이 보고되었으나, 최근의 논문에서 이러한 활성은 혈장에 존재하는 부티릴콜린에스터라제(butyrylcholinesterase), 파라옥소나제(paraoxonase), 알부민(albumin)의 에스터라제 활성이라고 보고되었고(Li, B., et al., Biochem. Pharmacol. 70, 2005), 특이적 저해제인 비스-p-니트로페닐포스페이트(bis-p-nitrophenylphosphate; BNPP)를 사용하였음에도 그 활성이 억제가 되지 않았기 때문에, 인간 혈장에는 이 단백질이 존재하지 않는다고 보고하였다(Shi, D., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 319, 2006).
간-카르복실에스터라제가 혈장내에 존재한다는 이러한 많은 문헌들은 대부분 비특이적인 기질을 사용한 효소활성 측정법으로 연구된 것이었고, 본 발명자 등은 혈장내의 존재를 확인하기 위하여 국제적 논문에 보고된 혈장 단백질 데이터베이스(http//www.plasmaproteomedatabase.org)를 통하여 간-카르복실에스터라제 1을 조사하여 보았지만 발견하지 못하였다.
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이러한 점에서, 혈액에서 간-카르복실에스터라제 1과 간암의 발병 상관관계에 대 한 보고는 아직 없었으며, 본 발명자 등은 간암 진단용 마커로서 간-카르복실에스터라제 1이 간암 혈장에서 정상인 보다 특이적으로 발현됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 간암에 대한 효과적인 진단 마커를 제공하는 데 있다. 본 발명의 간암 진단용 표지 마커 검출을 위한 조성물은 간-카르복실에스터라제 1 단백질과 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.
상기 항체는 통상적으로 사용되는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체, 간-카르복실에스터라제 1 단백질의 결합 도메인을 갖는 폴리펩타이드에서 선택될 수 있다.
상기 조성물은 간-카르복실에스터라제 1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하고, 항체에 혈액의 혈청 또는 혈장을 혼합하여, 정상 대조군과 비교하여 간-카르복실에스터라제 1 단백질의 발현량의 증가를 검출한다.
또한 본 발명의 간-카르복실에스터라제 1의 검출방법은, 항체와 혈장 시료의 혼합으로부터 간-카르복실에스터라제 1의 존재를 확인하는 제1 단계와, 그리고 자석비드-항체면역침강법, 항체-면역블랏팅, ELISA, 질량분석기기의 적어도 하나의 정량 분석에 의하여 간-카르복실에스터라제 1 단백질의 발현량의 변화를 측정하는 제 2단계를 포함하여 구성된다.
오늘날 다수의 혈액에서 특정 질환이나 암을 진단하기 위해 널리 활용되고 있는 방법은, 목적하는 표지 마커 단백질과 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 방법인 효소면역항체법 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)이 주를 이루고 있다. 그 예로서, 전립선암에는 Prostate specific antigen (PSA) 단백질, 대장암은 Carcinoembryonic antigen (CEA) 단백질, 췌장암은 CA19-9 단백질, 난소암은 CA-125 단백질용 ELISA 키트가 사용되고 있다. 항체 조성물을 포함한 ELISA 키트 대부분은 2시간 이내에 96개 이상의 혈액에 대하여 특정 질환 또는 암의 존재 여부를 확인할 수 있는 강점을 갖기 때문에, 상용화를 위해서는 표지 마커 단백질과 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 방법을 통하여 해결해야 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 간-카르복실에스터라제 1 단백질의 간암 조직 발현량 변화에 대하여 2차원 형광 전기영동과 항체-면역블랏팅 결과로서 제공한다.
본 발명은 또한 혈장 단백질의 존재를 마커 단백질과 특이적으로 결합하는 항체와 혼합시켜 항원-항체 복합체를 형성시킨 후 나노 액체 크로마토그래피 질량분석기기를 통하여 마커 단백질의 존재 여부를 증명한다. 또한, 본 발명은 상기 단백질이 간암 혈장에서 정상인 보다 증가함을 항체-면역블럿팅으로부터 제공한다.
상기 항체는 통상적으로 사용되는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체, 간-카르복실에스터라제 1 단백질의 결합 도메인을 갖는 폴리펩타이드에서 선택될 수 있다.
간-카르복실에스터라제 1은 N-결합 당단백질(N-linked glycoprotein)이므로, 본 발명에서는 상기 단백질들을 분석하기 위하여 정상 간조직과 간암조직의 분쇄물을 당단백질 분리용 렉틴 컬럼을 사용하였고, 2차원 형광 전기영동을 수행하여, 분자량 약 62 kDa과 pI 4.5-5.3 부분에서 위치를 확인하였다.
간-카르복실에스터라제 1은 정상 간조직에서 발현량이 간암조직보다 월등히 증가함을 확인하였고, 기존 논문과 같은 결과를 얻었다. 혈액에서의 간-카르복실에스터라제 1 단백질은 아직까지 확실히 확인되지 않았다. 이에 본 발명자 등은 간-카르복실에스터라제 1 단백질과 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 그의 존재를 확인하였다.
그 방법으로서, 항체를 고정시키는 표면적이 넓기 때문에 항원을 회수하기 효율적인 자석형 비드(Dynabead, Invitrogen)를 사용한 항체면역침강법과 고감도인 나노 액체 크로마토그래피 질량분석 기기를 사용하여 간-카르복실에스터라제 1이 혈장에 존재함을 증명하였다. 또한, 다이나비드(Dynabead)의 사용량과 혈장 농도의 조건 확립을 통하여, 정상인과 간암 환자의 혈장으로부터 간-카르복실에스터라제 1의 존재량을 면역블랏팅을 통하여 비교 분석할 수 있음을 밝혔다.
본 발명에서, 항체를 이용한 혈액내 간-카르복실에스터라제 1의 존재는 다음 단계를 포함하는 방법을 통하여 확인할 수 있다.
1) 혈액은 채취한 즉시 디포타시움 에틸렌디아민 테트라아세트산(Dipotassium ethylenediamine tetraacetic acid; K2EDTA)이 포함된 튜브에 30분간 상온에 방치한 후 2,400 xg에서 15분 동안 원심분리하여, 상층액 혈장을 수득함.
2) 항-간-카르복실에스터라제 1 항체 400 ug과 자석비드 10 mg을 결합시킨 후, 그중 50 ug을 취하여 정상인과 간암환자 혈장 8 mg과 함께 1mL 튜브에서 2시간 동안 면역침강시킨 후 간-카르복실에스터라제 1 단백질을 분리함.
3) 제2 단계에서 분리한 정상인과 간암환자 시료액은 용해완충용액에서 단백질 변형시킨 후, 1차원 전기영동으로 분리함.
4) 62 kDa 위치의 겔 밴드(band)를 잘라내어 트립신 절단(trypsin digestion)을 통하여 단백질을 펩티드 형태로 잘라냄.
5) 고감도 나노액체크로마토그래피를 사용하여 간-카르복실에스터라제 1 단백질을 확인함(도 4 및 도 5 참조).
또한 본 발명에서, 혈액에서 간-카르복실에스터라제 1과 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 다음과 같은 단계를 포함하는 방법으로부터 간암을 진단할 수 있다.
1) 간-카르복실에스터라제 1은 2차 형광전기영동 및 면역블랏팅 결과로부터 간암환자의 간암조직에서 정상조직보다 월등히 감소된다는 것을 확인함.
2) 상기 간-카르복실에스터라제 1의 존재 확인 방법 제 1 및 제 2 단계와 같이 혈장을 수득한 후 면역침강시켜 간-카르복실에스터라제 1 용액을 얻음.
3) 면역블랏팅으로 항-간-카르복실에스터라제 1 항체를 이용하여 간-카르복실에스터라제 1의 신호(signal)를 확인함.
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4) 정상 혈장에서보다 간암 혈장에서 간-카르복실에스터라제 1의 신호가 높음을 확인함(도 6 및 도 7 참조).
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이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 실시예는 본 발명을 설 명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위는 이에 한정되지 않는다.
실시예 1 임상조직과 혈장 수득
병리학적으로 환자의 개별 정보가 확보된 간암조직과, 같은 환자로부터 분취된 정상 간조직들은 연세의과대학 병리학연구실에서 제공받았다. 정상인의 혈장은 간암 지표 표준 검사 요소인 면역결핍바이러스(HIV) 유래인 HIV-1 및 HIV-2 항체, HIV-1 항원, B형간염 표면항원(hepatitis B surface antigen), B형간염 핵항원(hepatitis B core antigen), C형간염 바이러스(hepatitis C virus), T세포백혈병 바이러스(HTLV-I/II) 항원, 매독균 검사에서 음성으로 나타났으며, 세계인간프로테옴기구(HUPO)에서 공식적으로 표준화된 시료 분리 방법으로 얻어내었다.
상기 정상인 검사에서 음성으로 판정된 8명과 간암으로 판정된 8명의 혈액 20 mL (이디티에이이칼륨(K2EDTA)이 포함된 5mL 튜브의 총 4개)은 30분간 상온에 방치한 후 2,400 xg에서 15분 동안 원심분리하여, 상층액의 혈장(plasma)을 얻어내었다. 간조직, 간암조직 및 혈장 시료는 -70°C에서 실험전 까지 보관하여 사용하였다. 간조직 및 혈장의 입수는 연세의대암연구소(yonsei medical center)의 임상시험위원회(IRB) 규정에 따랐다.
실시예 2 정상 간조직 및 간암조직에서 당단백질 분리
각 조직 100 mg은 잘게 부수어 세포용해 RIPA 완충용액[50 mM 트리스(Tris), 150 mM 염화나트륨(NaCl), 1% NonidetP-40, 0.25% 디옥시콜레이트나트륨(sodium deoxycholate), pH 7.4]에 넣어 4°C 냉장 조건에서 분쇄하였다. 당단백질은 5가지의 렉틴을 사용한 친화성 크로마토그래피를 사용하였고, 렉틴은 아가로스(agarose)에 결합된 콘카나발린 A(Concanavalin A), 맥아응집소(wheat germ agglutinin), 자칼린(Jacalin), 엘더베리(Sambucus nigra), 들주발버섯(Aleuria aurantia)을 사용하였다. 이들 렉틴은 당단백질의 각 구성당과 결합하는 물질의 혼합으로, PD-10 컬럼(Pierce)에 최종 2 mL이 되도록 충진하였다. 시료의 당단백질은 결합용 완충용액[20 mM 트리스, 1 mM 염화망간(MnCl2), 1 mM 염화칼슘(CaCl2), 0.15 M 염화나트륨 (NaCl), pH7.4]과 함께 30분 동안 렉틴에 결합시켰고, 결합된 당단백질은 각 구성당을 분리시키는 분리용 완충용액[0.2 M 메틸-D-만노피로사이드(methyl-D-mannopyroside), 0.2 M 메틸-D-글루코피로사이드(methyl-D-glucopyroside), 0.2 M N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine), 0.2 M 갈락토오스, 0.1 M 락토오스, 0.1 M 퓨코오스(fucose), 20 mM 트리스, 0.5 M 염화나트륨, pH7.0]을 사용하여 회수하였다. 이후, 5 kDa 막여과지로 농축하였고, 50% 트리클로로초산(trichloroacetic acid)과 100% 아세톤(acetone)으로 침전시킨 후, 침전물은 2-D 용해(lysis) 완충용액[7 M 우레아, 2 M 티오우레아, 4% 챕스(CHAPS), 30 mM 트리스, pH 8.5]으로 녹였다. 단백질 용액은 pH 8.5로 맞추었으며, 단백질 농도는 2D Quant kit(GE Healthcare)을 사용하여 측정하였다.
실시예 3 2차원 형광 전기영동
5명의 정상조직 및 간암조직 10개의 시료에 대하여 각 분석시료와 그에 해당하는 표준시료 50 ug은 형광염료인 400 pmol Cy3, Cy5, Cy2 (GE Healthcare)로 암조건에서 30분간 표지시켰고, 1 uL 10 mM 라이신(lysine)으로 반응을 정지시켰다. 각 표지된 3개의 시료는 혼합되어 최종 450 uL가 되도록 시료완충용액[6 M 우레아, 2 M 티오우레아, 4% 챕스, 60 mM 디티오트레이톨(dithiothreitol; DTT), 30 mM 트리스, pH 8.5]을 첨가하였고, 2% IPG 3-10NL 완충용액과 함께 상온에서 16시간 동안 재수화(rehydration)시켰다. 등전집속(isoelectric focusing; IEF)은 이모빌린 드라이스트립(Immobiline DryStrip) pH 3-10NL(GE Healthcare)을 사용하여 MultiPhor II 전기영동(electrophoresis) 시스템(GE Healthcare)에서 최적요건인 95,000 V까지 진행되었으며, 트리부틸포스핀(Tributylphosphine) 완충용액[6 M 우레아, 2% 황산염(Sodium dodecyl sulfate, SDS), 30 mM 트리스, 20% 글리세롤(glycerol), 2.5% 아크릴아미드 용액(acrylamide solution), 5 mM 트리부틸포스핀]으로 25분 동안 원-스텝 환원 및 알킬화되었다.
2차 수직전기영동은 Ettan Dalttwelve 전기영동시스템(GE Healthcare)을 사용하여 9%~16% 폴리아크릴아마이드겔을 사용하여 분리하였고, 전기영동이 끝난 후 Typhoon 9400(GE Healthcare) 스캐너를 이용하여 Cy2, Cy3, Cy5에 해당하는 파장으로 스캔하였다. 각 겔 이미지는 DeCyder 2-D 분석소프트웨어(GE Healthcare)를 이용하여 분석하였다.
실시예 4 2차원 형광 전기영동 겔의 단백질 동정
이미지 분석 후, 유의적으로 변화된 단백질 스팟은 쿠마시블루(Coomassie blue) 염료로 염색된 겔로부터 피킹(picking)하였고, 탈색하여 트립신으로 절단(digestion)하였으며, 절단된 펩티드들은 포로스(Poros) R2 및 올리고(Oligo) R3 레진(resin) 혼합물을 사용하여 탈염(desalting)시켰다. 단백질 동정은 4800 MALDI-TOF-MS (Applied Biosystem)로 분석하였으며, MALDI-TOF-MS로부터 얻은 스펙트럼은 MASCOT 데이터베이스를 이용하여 동정하였다.
실시예 5 조직내 간암 마커 단백질 발현량 검증; 항체-면역블럿팅
간암 진단마커 단백질의 간암조직에 존재하는 단백질 농도 차이를 검증하기 위하여, 10명에 대한 정상조직과 간암조직의 동일한 단백질 양으로부터 항체를 이용한 면역블럿팅(Western blot analysis)을 수행하였다. 조직 단백질 5 ug은 10% SDS-PAGE에서 분리되었고, 겔은 니트로셀루로오스(nitrocellulose; NC) 막으로 전환(transfer)한 후 5% 탈지유(skimmed milk)가 포함된 TBS-T 완충용액 [20 mM 트리스, 137 mM 염화나트륨, 0.1% 트윈20(Tween-20), pH 7.6]으로 1시간동안 블로킹하였다. 항-간-카르복실에스터라제 1 항체(CE1, Abcam)와 양성 대조군인 마우스 베타액틴(β-actin) 항체(Santa Cruz)를 5% 탈지유가 포함된 TBS-T 완충용액에 1:10000배씩 희석하여 1차 처리하고 항-토끼(rabbit) IgG-HRP (Santa Cruz)를 1:20000배를 2차 처리하였다. 최종 NC막은 ECL Plus 웨스턴블랏 시약(GE Healthcare)으로 3분간 반응시켰고, Typhoon 9400 스캐너로 스캔하여 분석하였다.
실시예 6 혈장내 간암 마커 단백질 존재량 검증; 자석비드-항체면역침강법 및 항체-면역블럿팅
자석형비드인‘Dynabead MyOne™ Tosylactivated’ (Invitrogen)는 제조사 매뉴얼에 따라 항-간-카르복실에스터라제 1 항체로 코팅되었다. 10 mg의 비드(bead)와 400 ug의 항-간-카르복실에스터라제 1 항체는 결합 완충용액[0.1 M 나트륨붕산염(sodium borate), 1 M 황산암모늄(ammonium sulfate), pH 9.5]에서 37℃에서 16시간 동안 교반 반응되었고, 5% 탈지유가 포함된 TBS-T 완충용액으로 16시간 동안 추가로 블러킹시켜 사용하였다. 항-간-카르복실에스터라제 1 항체가 결합된 비드 50 ug은 정상인과 간암환자 혈장 8 mg과 함께 1mL 튜브에서 2시간 동안 면역침강시켰다. pH 2로 맞춘 TBS-T 완충용액을 사용하여 항체에 결합한 단백질을 회수 하였고, 면역블럿팅을 수행하여 정상인과 간암환자 사이의 혈장내 간-카르복실에스터라제 1의 변화를 분석하였다. 이때 사용한 항체는 실시예 5에서 사용된 항-간-카르복실에스터라제 1 항체(Abcam)를 1:1000배 희석하여 1차 처리하였고, 항-토끼(rabbit) IgG-HRP (Santa Cruz)를 1:5000배 희석액을 2차 처리하였다.
실시예 7 혈장내 간-카르복실에스터라제 1 단백질 검증법
실시예 6에서 수행된 면역블럿팅에서 측정된 간-카르복실에스터라제 1의 해당 겔 밴드(band)를 잘라내고, 디티오트리에톨(dithiothrietol, DTT)/아이오도초산(iodoacetic acid, IAA)처리를 통하여 단백질 환원과 알킬화를 시켰으며, 트립신을 처리하여 펩티드로 절단시킨 후 나노 액체 크로마토그래피 질량분석 기기와 이온포획질량분석(linear trap quadrupole, LTQ) 검출기를 이용하여 겔내의 간-카르복실에스터라제 1 단백질을 확인하였다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명으로부터 발굴된 새로운 간암 진단용 단백질 마커는 혈장내 해당 단백질 발현량의 확인으로 간암의 조기 진단을 가능하게 할 수 있는 요소로 작용하여, 국내에서 꾸준히 증가하고 있는 간암 환자의 생존율을 향상 시키시는데 기여할 수 있다.
도 1은 간암환자의 정상조직의 당단백질에 대한 2차원 전기영동 이미지와 간-카르복실에스터라제 1의 위치를 나타낸 사진이다.
도 2는 간암환자의 간암조직의 당단백질에 대한 2차원 전기영동 이미지와 간-카르복실에스터라제 1의 위치를 나타낸 사진이다.
도 3은 10명의 추가 간암 환자에 대한 정상조직과 간암조직의 간-카르복실에스터라제 1의 발현량 변화를 면역블럿팅으로 확인한 결과를 나타낸 사진이다.
N: normal tissue (정상 조직)
T: cancer tissue (간암 조직)
도 4는 혈장내의 간-카르복실에스터라제 1의 존재를 증명하기 위해서 나노 액체 크로마토그래피 질량분석 기기를 이용하여 정상인과 간암환자의 혈장에서 각각 측정된 간-카르복실에스터라제 1의 펩티드를 나타낸다.
도 5는 도 4의 대표적인 공통 펩티드에 대한 나노 액체 크로마토그래프이다.
도 6는 대표적인 3명의 정상인과 간암환자 혈장의 간-카르복실에스터라제 1의 변화를 면역침강 후 면역블럿팅으로 확인한 결과를 나타낸 사진이다.
Np: normal plasma (정상인 혈장)
Tp: cancer plasma (간암환자 혈장)
도 7은 총 8명의 정상인과 간암환자 혈장의 간-카르복실에스터라제 1의 존재량에 대한 비교 그래프이다.

Claims (8)

  1. 간-카르복실에스터라제 1 단백질과 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 간암진단 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체, 간-카르복실에스터라제 1 단백질의 결합 도메인을 갖는 폴리펩타이드에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 간-카르복실에스터라제 1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하고, 상기 항체에 혈액의 혈청 또는 혈장을 혼합하여, 정상 대조군과 비교하여 간-카르복실에스터라제 1 단백질의 발현량의 증가를 검출하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 항체와 혈장 시료의 혼합으로부터 간-카르복실에스터라제 1의 존재를 확인하는 제1 단계와, 그리고 자석비드-항체면역침강법, 항체-면역블랏팅, ELISA, 질량분석기기의 적어도 하나의 정량 분석에 의하여 간-카르복실에스터라제 1 단백질의 발현량의 변화를 측정하는 제 2단계를 포함하는 간-카르복실에스터라제 1의 검출방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 제1 단계가
    1) 혈액은 채취한 즉시 디포타시움 에틸렌디아민 테트라아세트산이 포함된 튜브에 30분간 상온에 방치한 후 2,400 xg에서 15분 동안 원심분리하여, 상층액 혈장을 수득하고,
    2) 항-간-카르복실에스터라제 1 항체 400 ug과 자석비드 10 mg을 결합시킨 후, 그중 50 ug을 취하여 정상인과 간암환자 혈장 8 mg과 함께 1mL 튜브에서 2시간 동안 면역침강시킨 후 간-카르복실에스터라제 1 단백질을 분리하고,
    3) 상기 2) 단계에서 분리한 정상인과 간암환자 시료액은 용해완충용액에서 단백질 변형시킨 후, 1차원 전기영동으로 분리하고,
    4) 62 kDa 위치의 겔 밴드를 잘라내어 트립신 절단을 통하여 단백질을 펩티드 형태로 잘라내고,
    5) 고감도 나노액체크로마토그래피를 사용하여 간-카르복실에스터라제 1 단백질을 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 제2 단계가
    1) 간-카르복실에스터라제 1은 2차 형광전기영동 및 면역블랏팅 결과로부터 간암환자의 간암조직에서 정상조직보다 월등히 감소된다는 것을 확인하고,
    2) 혈장을 수득한 후 면역침강시켜 간-카르복실에스터라제 1 용액을 얻고,
    3) 면역블랏팅으로 항-간-카르복실에스터라제 1 항체를 이용하여 간-카르복실에스터라제 1의 신호를 확인하고,
    4) 정상 혈장에서보다 간암 혈장에서 간-카르복실에스터라제 1의 신호가 높음을 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제4항에 있어서, 항체-면역블랏팅에 의한 간-카르복실에스터라제 1 단백질의 발현량이 간암 혈장에서 정상 혈장보다 높은 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 삭제
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US14/302,128 USRE46572E1 (en) 2008-03-14 2008-10-01 Plasma biomarker tool for the diagnosis of liver cancer comprising liver carboxylesterase 1 and liver cancer screening method
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012144784A3 (ko) * 2011-04-18 2013-01-17 연세대학교 산학협력단 인간 간-카르복실에스터라제 １을 특이적으로 인식하는 단일클론 항체, 상기 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100975852B1 (ko) * 2008-03-14 2010-08-13 연세대학교 산학협력단 간-카르복실에스터라제 1 단백질과 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 간암 진단 조성물
CN102175843A (zh) * 2011-01-20 2011-09-07 复旦大学附属中山医院 一组高分化早期肝癌的分子标志物及其应用
JP6507101B2 (ja) 2013-01-31 2019-04-24 ブラッコ・イメージング・ソシエタ・ペル・アチオニＢｒａｃｃｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓ．Ｐ．Ａ． Ｍｒにおける代謝マーカーとしての過分極エステル
EP3016687B1 (en) 2013-07-01 2017-08-09 Bracco Imaging S.p.A Hyperpolarized 1-13c-1,1-bis(acetoxy(methyl))-2,2'-cyclopropane as metabolic marker for mr
CN108277259A (zh) * 2018-03-30 2018-07-13 沈阳北创医学检验所有限公司 一种测定复杂生物体系中ce2活性的检测试剂盒
CN111337674A (zh) * 2018-12-18 2020-06-26 上海底物生化科技有限公司 一种用于预测心血管事件风险的试剂盒
CN112904023B (zh) * 2021-01-20 2022-06-14 宁波海壹生物科技有限公司 一种降钙素原化学发光免疫检测试剂盒
CN113740544A (zh) * 2021-07-29 2021-12-03 山东第一医科大学(山东省医学科学院) 鉴定人垂体组织泌乳激素蛋白质存在形式生物标志物方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002002760A2 (en) * 2000-06-29 2002-01-10 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 25869, a human carboxylesterase and uses thereof

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU755251B2 (en) 1998-02-19 2002-12-05 St. Jude Children's Research Hospital Compositions and methods for sensitizing and inhibiting growth of human tumor cells
JP2001188069A (ja) * 1999-12-28 2001-07-10 Japan Science & Technology Corp 肝障害の診断方法
WO2002006454A2 (en) 2000-07-17 2002-01-24 Bayer Aktiengesellschaft Regulation of human carboxylesterase-like enzyme
CN1769455A (zh) * 2005-09-14 2006-05-10 上海第二医科大学附属第九人民医院 口腔白斑癌变相关基因
CN100419075C (zh) * 2006-04-17 2008-09-17 哈尔滨医科大学 分泌人羧酸酯酶2单克隆抗体的杂交瘤细胞株及人羧酸酯酶2的单克隆抗体
US7906637B2 (en) * 2006-06-23 2011-03-15 St. Jude Children's Research Hospital Compositions and methods for inducing or inhibiting activities of selected human cells
KR100975852B1 (ko) * 2008-03-14 2010-08-13 연세대학교 산학협력단 간-카르복실에스터라제 1 단백질과 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 간암 진단 조성물

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002002760A2 (en) * 2000-06-29 2002-01-10 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 25869, a human carboxylesterase and uses thereof

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012144784A3 (ko) * 2011-04-18 2013-01-17 연세대학교 산학협력단 인간 간-카르복실에스터라제 １을 특이적으로 인식하는 단일클론 항체, 상기 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도
KR101338517B1 (ko) 2011-04-18 2013-12-10 연세대학교 산학협력단 인간 간-카르복실에스터라제 １을 특이적으로 인식하는 단일클론 항체, 상기 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도
CN104066749A (zh) * 2011-04-18 2014-09-24 延世大学校产学协力团 用于特异性识别人肝羧酸酯酶1的单克隆抗体、生成单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其用途
CN104066749B (zh) * 2011-04-18 2016-03-30 延世大学校产学协力团 用于特异性识别人肝羧酸酯酶1的单克隆抗体、生成单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其用途

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