CN104066749A - 用于特异性识别人肝羧酸酯酶1的单克隆抗体、生成单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可特异性识别人肝羧酸酯酶1的单克隆抗体、生成单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其用途。本发明可通过与人肝羧酸酯酶1的特异性结合来客观地分析组织和血液中人肝羧酸酯酶1的表达数量等。从而，可从尿液或血液中简单且迅速地诊断出肝癌。

Description

用于特异性识别人肝羧酸酯酶1的单克隆抗体、生成单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其用途
技术领域
本发明涉及用于特异性识别人肝羧酸酯酶1的单克隆抗体、生成所述抗体的杂交瘤细胞株及其用途，该单克隆抗体用于从人体临床标本如组织和血液中客观地分析出人肝羧酸酯酶1的表达水平。
背景技术
人羧酸酯酶(hCE)可主要被分为具有不同特性和结构的异构体，如人羧酸酯酶1(hCE1)、人羧酸酯酶2(hCE2)和人羧酸酯酶3(hCE3)(Imai T,Drug Metab Pharmacokinet.,vol.21,pp.173-185,2006)。hCE1为一般在肝脏中被生物合成的酶，并能识别亲水性分子的酰基而分解摄入到组织内的化学物质。然而，hCE2为一般在肠内被表达的酶，是与hCE1的同源率为47％的独立蛋白质，而且与摄入到肠内的亲水性分子的酰基反应。hCE3为一般在大脑中被表达的酶，同时也是与hCE1的同源率为50％的独立蛋白质。
肝-羧酸酯酶1是一种在肝、肠、肾、肺、心脏或巨噬细胞中被表达的酶，但在肝中的表达比其他地方高出10～100倍。所述肝-羧酸酯酶1具有三种主要作用：第一，它具有外来物质代谢功能，其通过改变非活性药物的酯或酰胺结构，将摄入到人体中的非活性药物转化成活性物质。例如，洛伐他汀(lovastatin)可被转化成有活性形式来降低胆固醇，还用来将在体内有毒性的***和***分别转化成无毒的可卡乙碱和***。第二，根据需要它通过分解和组合体内的胆固醇和脂肪酸的酯结构来调节胆固醇代谢，以及第三，它可以通过直接与蛋白质，即与可识别内质网中巨噬细胞免疫的C-反应蛋白(CPR)结合而调节功能(Redinbo MR.,Biochem.Soc.Trans.,31,pp.620-624,2003；Redinbo MR.,Drug Discov.Today.,10,pp.313-325,2005)。肝-羧酸酯酶1的另一特性是，在由化学物质引发肝癌的小鼠的肝微粒体中其酶活性会大幅下降(Maki T.,Jpn.J.Cancer Res.,82,pp.800-806,1991)，但尚未发现其机制。
至今，通过使用酯酶的非特异性底物，如磷酸对硝基苯酯或乙酸对硝基苯酯，来分析体内肝-羧酸酯酶1的活性程度并使之作为酶滴定值。根据此方法，无法测定单独肝-羧酸酯酶1的特异性活性，因为在血液中具有酯酶功能的白蛋白、胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶等也有相同的活性(Li B.,Niochem.Pharmacol.,70,pp.1673-1684,2005)。因此，需要一种在短时间内能够从大量的标本中有选择地并有效地分析肝-羧酸酯酶1蛋白的方法，这种方法就 是酶免疫测定法。酶免疫测定法是一种通过抗体与目标蛋白质(抗原)的结合反应来诱导抗原-抗体结合、并在结合于酶上的抗体与底物间形成的复合反应中由结合度所产生的显色或荧光显色来定量临床标本中目标蛋白质的方法。
最近，本发明人证明了在人血浆中存有肝-羧酸酯酶1，在肝癌组织中肝-羧酸酯酶1的表达水平与正常的肝组织中肝-羧酸酯酶1的表达水平相比有下降，但在肝癌患者的血浆中肝-羧酸酯酶1的表达水平比正常人的血浆中肝-羧酸酯酶1的表达水平平均增长2.8倍或更多(Na K.et al.,Proteomics.9,pp.3989-3999,2009)。然而，所述实验中使用的肝-羧酸酯酶1的抗体是市面上可见的多克隆抗体(Abcam,ab1875)，而且非特异性蛋白质可以与之结合，此外其免疫沉淀反应的有效性会有下降。
发明内容
技术问题
本发明在于提供能够有效地分析组织或血液中肝-羧酸酯酶1的肝-羧酸酯酶1的单克隆抗体、以及由所述抗体生成的杂交瘤细胞株。
进一步，本发明在于提供所述抗体的用途，即该抗体可用于分离并纯化肝-羧酸酯酶1，从血液中检测肝-羧酸酯酶1，而且能特异性地诊断肝癌。
技术方案
本发明的一方面提供与人肝羧酸酯酶1蛋白特异性结合的单克隆抗体，该单克隆抗体是由保藏号为KCLRF-BP-00282的杂交瘤所生成的。
本发明的另一方面提供保藏号为KCLRF-BP-00282的杂交瘤细胞，它能生成本发明的单克隆抗体。
进一步，本发明的另一方面提供用于分离并纯化人肝羧酸酯酶1蛋白的、含有本发明的单克隆抗体的组合物。
进一步，本发明的另一方面提供用于检测人肝羧酸酯酶1的、含有本发明的单克隆抗体的组合物。
进一步，本发明的另一方面提供用于检测尿液或血液中人肝羧酸酯酶1浓度的方法，该方法包括通过将本发明的单克隆抗体与样本进行接触来检测抗原-抗体复合物的形成。
进一步，本发明的另一方面提供用于诊断肝癌的、包含发明的单克隆抗体的试剂盒。
有益效果
根据本发明，人肝羧酸酯酶1的单克隆抗体可基于与人肝羧酸酯酶1蛋白的高度特异性结合用来探测在组织、细胞或血液中的肝-羧酸酯酶1。尤其，所述单克隆抗体有助于在早期从血液中简便地诊断出肝癌。
附图说明
图1展示了用抗原肽组进行三次免疫化的小鼠尾部的血清中分离出肝-羧酸酯酶1的分析结果。
图2为展示了被肝-羧酸酯酶1的抗原肽免疫化的小鼠脾细胞与骨髓瘤的融合细胞的反应性的图片。
图3展示了通过使用由于肝-羧酸酯酶1的抗原肽具有高反应性的被免疫化的小鼠脾细胞对能够生成肝-羧酸酯酶1的单克隆抗体的杂交瘤细胞株进行筛选的结果。
图4展示了本发明的单克隆抗体与已知肝-羧酸酯酶1的多克隆抗体之间的抗原-抗体结合度的对比结果。
图5展示了通过使用本发明的单克隆抗体和已知肝-羧酸酯酶1的多克隆抗体对正常人、肝炎患者、肝硬化患者和肝癌患者的血浆中抗原-抗体结合度的对比结果。
图6展示了基于使用本发明的单克隆抗体和已知肝-羧酸酯酶1的多克隆抗体的抗原-抗体结合的样本显色结果(a)、以及基于所述肝-羧酸酯酶1浓度的抗原-抗体结合的光密度值(b)。
具体实施方式
下面将具体描述本发明的组成部分。
本发明人通过以下方法实现本发明，即研发出比市场上可见的人肝羧酸酯酶1的抗体具有更高有效性的单克隆抗体以及生成该抗体的杂交瘤细胞株，以提供分离血浆中的肝-羧酸酯酶1并客观地对比分析酶的量的方法。
因此，本发明提供一种单克隆抗体、生成该单克隆抗体的杂交瘤细胞及其制备方法，该单克隆抗体能与由保藏号为KCLRF-BP-00282的杂交瘤所生成的人肝羧酸酯酶1蛋白进行特异性结合。
这里使用的“人肝羧酸酯酶1”包括蛋白质本身、其基因重组蛋白质、这些蛋白质的人工变异体及突变体、蛋白质的天然形态及其功能性等价物。
通过本领域所熟知的融合法制备对人肝羧酸酯酶1特异性的本发明的单克隆抗体(参照Kohler and Milstein(1976)European Journal of Immunology6:511-519)。为形成能够分泌所述单克隆抗体的“杂交瘤”而被融合的两组细胞群中，一组细胞群可以使用注射了人 肝羧酸酯酶1的、免疫学上适合的宿主动物如小鼠的细胞，另一组细胞群则使用癌症或骨髓瘤细胞株。通过本领域所知的方法如聚乙二醇融合这两组细胞群，然后通过标准的组织培养方法使抗体生成细胞进行增殖。通过有限稀释法实施亚克隆并收集均匀的细胞群，然后通过酶联免疫吸附法(ELISA)或免疫印迹法选取能够生成对人肝羧酸酯酶1特异性的抗体的杂交瘤细胞株，并根据标准技术在体外或体内进行大量培养。所述的体内大量培养是指，将杂交瘤细胞株注射到小鼠腹腔内而诱导生成高浓度的抗体后从其腹水中分离所述杂交瘤细胞株。
由所述杂交瘤细胞株生成的单克隆抗体可无需提纯，或根据本领域所熟知的方法进行高纯度(如，95％或更高)提纯。利用这种提纯技术，如凝胶电泳、透析、盐析、离子交换层析或抗原亲和柱层析，可从培养基或腹水中分离所述单克隆抗体。
将本发明的生成单克隆抗体的杂交瘤叫做杂交瘤YPRC 10E8，2012年3月28日被保藏在韩国细胞株研究基金会，该基金会是位于首尔市钟路区莲建洞的首尔大学校医科大学癌症研究所内的国际保藏机构，保藏号为KCLRF-BP-00282。在本说明书中，将由“杂交瘤YPRC 10E8”生成的单克隆抗体叫做“YPRC 10E8”。
将所述单克隆抗体用于检测抗原的优点在于，所述单克隆抗体由于能够识别单一表位而具有特异性相互作用。为了绘制参与到抗原与抗体之间相互作用的表位的图谱，可使用多种方法。例如，此方法包括，通过使用噬菌体表面展示肽库的生物淘选、包含用蛋白酶分解抗原肽来生成片段并通过免疫印迹法筛选此片段而获得的表位序列的片段的确定、被固定于固体如活性化膜或聚乙烯针之上的肽阵列的筛选、以及用可溶性肽的证明表位序列中每个氨基酸序列残基的重要性的竞争性ELISA法。
使用由AbFrontier制作的软件，从所述人肝羧酸酯酶1的三维结构中分析出由本发明的单克隆抗体识别的人肝羧酸酯酶1上的表位，而从所分析的肽序列表中检测获得其与被免疫化小鼠的相应蛋白质的氨基酸序列是不同的。然后，基于对所分析的人肝羧酸酯酶1特异性的肽进行重选并确定表位。
基于这种表位，可以指定对应于所述人肝羧酸酯酶1的氨基酸序列C-末端处的554～567氨基酸的、列于SEQ ID NO:1的线性表位。
根据传统方法可以判断所述单克隆抗体的抗原结合亲和性，但本发明不限于此。更具体地，通过放射免疫分析法(RIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫沉淀法、免疫荧光法、有色粒子结合法、化学发光物质结合法或免疫印迹法检测所述抗原结合亲和性。本发明的单克隆抗体具有比多克隆抗体高出20倍的结合亲和性。
本发明的单克隆抗体可以为IgG1的同型免疫球蛋白。
因此，本发明提供一种单克隆抗体，该单克隆抗体可识别对应于本发明的人肝羧酸酯酶1的氨基酸序列中C-末端处的554～567氨基酸的、列于SEQ ID NO:1的线性表位，并与所述人肝羧酸酯酶1进行特异性结合。
这里使用的术语“单克隆抗体”为本领域所熟知的术语，是指针对单一抗原部位的高特异性抗体。通常，与包含针对不同表位(抗原决定簇)的不同抗体的多克隆抗体不同，单克隆抗体只针对抗原上的单一决定簇。单克隆抗体可通过利用抗原-抗体结合来改善诊断和分析方法的选择性及特异性，而且由于通过杂交瘤培养所合成，从而不会受到不同免疫球蛋白的污染。在本说明书中，所述单克隆抗体，作为人肝羧酸酯酶1的抗体，其不仅包括整个抗体，还包括抗体分子的功能性片段。所述整个抗体具有2个全长轻链和2个全长重链的结构，而且每条轻链与所述重链通过二硫键相连。重链恒定区为γ、μ、α、δ或ε型，其可被分成子类，如γ1、γ2、γ3、γ4、α1和α2。轻链恒定区为κ或λ型(Cellular and Molecular Immunology,Wonsiewicz,M.J.,Ed.,Chapter45,pp.41-50,W.B.Saunders Co.Philadelphia,PA(1991)；Nisonoff,A.,Introduction to Molecular Immunology,2nd Ed.,Chapter4,pp.45-65,Sinauer Associates,Inc.,Sunderland,MA(1984))。
单克隆抗体的功能性片段为具有抗原结合性能的片段，该片段包括Fab、F(ab')、F(ab')2和Fv。抗体片段Fab是具有轻、重链的可变区、轻链恒定区以及重链的第一恒定区(CH1)的结构，并且具有一个抗原结合部位。Fab’与Fab的区别在于，Fab’具有铰链区，该铰链区在重链CH1区的C末端包含至少一个半胱氨酸残基。F(ab’)2抗体具有由Fab’铰链区的半胱氨酸残基构成的二硫键。Fv是仅具有重链可变区和轻链可变区的最小的抗体节段，而且WO 88/10649、WO 88/106630、WO 88/07085、WO 88/07086和WO 88/09344中公开了生成Fv片段的重组技术。在具有稳定二硫键的Fv(dsFv)中，重链可变区与轻链可变区一般通过非共价键相连，而在单链Fv(scFv)中，重链可变区与轻链可变区一般通过连接肽的共价键相连，或直接与C末端相连，从而形成如dsFv一样的结构，如二聚体。
这种抗体片段可用蛋白水解酶来获得(例如，可用木瓜蛋白酶分解整个抗体而获得Fab，而用胃蛋白酶分解所述抗体而获得F(ab’)2片段)，优选地，可通过基因重组技术制作所述抗体片段。在本发明中，所述抗体优选为Fab型、或整个抗体。此外，所述重链恒定区可以为选自包括γ、μ、α、δ以及ε型的同种型中。所述轻链恒定区可以为κ或λ型。
此外，本发明的抗体可以为人源化抗体或CDR移植抗体，以进一步降低嵌合抗体或嵌合抗体的免疫原性。
嵌合抗体包括源自除人以外动物(例如，小鼠、兔子、家禽等)的可变区、和源自人的恒定区。此嵌合抗体可以通过本领域所知的基因重组进行制备。
人源化抗体或CDR移植抗体是指将源自动物的单克隆抗体的互补决定区(CDR)移植到人抗体中来维持源自动物的单克隆抗体的高度亲和性及特异性并降低免疫诱发性而制备的抗体，而且人源化程度可考虑对应于抗原的亲和性及诱导人体免疫的水平而进行选取。
进一步，本发明提供用于分离及纯化含有本发明的单克隆抗体的人肝羧酸酯酶1的组合物。
用于分离及纯化的含有所述抗体的组合物能够用于传统的离子交换层析和亲和层析中，从而可容易地从样本中分离并纯化所述人肝羧酸酯酶1。
进一步，本发明提供用于检测人肝羧酸酯酶1的、含有本发明的单克隆抗体的组合物。
进一步，本发明提供用于检测尿液或血液中的人肝羧酸酯酶1浓度的方法，该方法包括将本发明的单克隆抗体与样本进行接触来检测抗原-抗体复合物的形成。
根据本发明，将所述单克隆抗体与人尿、血清或血浆进行接触来检测抗原-抗体复合物的形成，从而检测所述人肝羧酸酯酶1。
这里使用的术语“抗原-抗体复合物”指酶和识别所述酶的单克隆抗体的组合物，所述酶可用于确认在生物样本人尿、血清或血浆中人肝羧酸酯酶1的存在与否。
所述抗原-抗体复合物可以通过使用检测标记来进行检测。例如，可选取酶、荧光物质、配体、发光物质、微粒、氧化还原分子或放射性同位素，但本发明不会特别地受此限制。
例如，所述酶可以为β-葡萄糖醛酸苷酶、β-D-葡萄糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶、己糖激酶和GDPase、核糖核酸酶、葡萄糖氧化酶和荧光素酶、磷酸果糖激酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、天冬氨酸转氨酶、磷酸烯醇式丙酮酸脱羧酶或β-内酰胺酶，但不限于此。所述荧光物质可以为荧光素、异硫氰酸酯、罗丹明(rhodamine)、藻红蛋白(picoerythrin)、藻蓝蛋白(phycocyanin)、别藻蓝蛋白、邻苯二醛或荧光胺，但不限于此。所述配体可以为生物素衍生物，但不限于此。所述发光物质可以为吖啶酯、荧光素或荧光素酶，但不限于此。所述微粒可以为胶体金或有色乳胶，但不限于此。所述氧化还原分子可以为二茂铁、钌配合物、biologen、醌、钛离子、铯离子、二酰亚胺、1,4-苯醌、对苯二酚、K4W(CN)8、[Os(bpy)3]2+、[RU(bpy)3]2+或[MO(CN)8]4-，但不限于此。放射性同位素可以为3H、14C、 32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I或186Re，但不限于此。
所述抗原-抗体复合物的形成可通过使用比色法、电化学法、荧光法、发光测定法、粒子计数法、视觉评估法或用闪光计数法进行检测。例如，所述抗原-抗体复合物的形成可通过流式细胞术、免疫细胞化学法、RIA、ELISA、免疫印迹法、免疫沉淀测定法、免疫扩散测定法、补体结合测定法或蛋白质芯片进行检测。更具体地，所述抗原-抗体复合物的形成可通过有益于回收少量所需蛋白质的免疫沉淀测定法和免疫印迹法进行检测。
最具体地，可用ELISA检测所述抗原-抗体复合物。所述ELISA包括多种ELISA方法，即包括：直接性ELISA，其使用用于识别附着于固相载体上的抗原的标记抗体；间接性ELISA，其使用用于识别抗体复合物中的捕获抗体的标记抗体，该抗体复合物可识别附着于固相载体上的抗原；直接夹心ELISA，其使用用于识别附着于固相载体上的抗体和抗原的复合物中的抗原的另一标记抗体；以及间接夹心ELISA，其使用标记二级抗体，该标记二级抗体可识别待另一抗体与附着于固相载体的抗体和抗原的复合物中的抗原进行反应后的所述另一抗体。
根据ELISA检测方法，将生物样本如尿液、血液、血清或血浆与涂敷于固相载体上的本发明的单克隆抗体接触，所述固相载体为如微量滴定板、膜或测试条。具体如，在微量滴定板的孔上涂敷本发明的单克隆抗体，用如牛血清蛋白(BSA)隔离未被占据的结合部位，将被涂敷的板与样本一同进行培养，最后可判断抗原-抗体复合物的存在与否。通过对所述抗原-抗体复合物的抗原特异性的抗体，如通过能与人肝羧酸酯酶1特异性结合的单克隆抗体或多克隆抗体，可确定抗原-抗体复合物的存在与否。所述单克隆抗体或多克隆抗体可以具有检测标记，否则可通过能检测所述单克隆抗体或多克隆抗体的其他抗体进行确认。
具体例子如下，可通过将附着于载体上的捕获单克隆抗体与生物样本反应，然后从与人肝羧酸酯酶1进行特异性结合的单克隆抗体中测定检测标记信号，或从所述复合物上具有可生成检测信号标记的二级抗体中测定检测标记型号，来进行测定人肝羧酸酯酶1。
进一步，本发明涉及用于诊断肝癌的试剂盒，该试剂盒包含本发明的单克隆抗体。
进一步，本发明的用于诊断肝癌的试剂盒所用的单克隆抗体，只要所述抗体可有选择地识别所述人肝羧酸酯酶1，便可使用所述单克隆抗体的片段。这种抗体片段可包括F(ab')2、Fab、Fab'或Fv片段。
用于诊断肝癌的试剂盒可被制成贴有本发明的单克隆抗体的蛋白质芯片型。
本发明的用于诊断肝癌的试剂盒中，包括有选择地识别人肝羧酸酯酶1的单克隆抗体或其片段、以及在免疫分析中所用的工具/试剂。
作为在免疫分析中所用的工具/试剂，包括适当的载体、生成检测信号的标记物质、溶剂或清洗剂。此外，当所述标记物质为酶时，可包括用于测定酶活性的底物和反应终止剂。
作为适当的载体，例如，可使用本领域所知的生理上可接受的缓冲液，如PBS、不溶性载体如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚丙烯腈、氟化树脂、交联葡聚糖、多糖、聚合物如胶乳上镀有金属的磁性微粒、其他纸、玻璃、金属、琼脂糖或其组合物，但本发明不限于此。
所用的用于本发明的检测方法和诊断试剂盒的检测***包括ELISA板、dip-stick装置、免疫层析试纸条、放射免疫测定装置及流通装置，但本发明不限于此。
实施例
下面，本发明将结合实施例进行详细描述。所提供的实施例仅用于例证本发明，本发明的范围不会受限于实施例。
实施例1>肝组织和血浆样本的提供
将50mg肝组织置于细胞裂解RIPA缓冲液[50mM Tris、150mM氯化钠(NaCl)、1％NonidetP-40、0.25％脱氧胆酸钠、pH7.4]中，在4℃冷藏条件下使其分解，在14000rpm下离心分离20分钟，回收蛋白质溶液。
从Severance医院的基因库中获得了确保病理学上各项数据的、取自正常人、肝炎患者、肝硬化患者和肝癌患者的血浆。作为正常人的血浆，使用了从肝癌标准测试因素中被判定为阴性的样本，如源自人免疫缺陷病毒(HIV)的HIV-1和HIV-2抗体、HIV-1抗原、乙肝表面抗原、乙肝核心抗原、丙型肝炎病毒、T细胞白血病病毒(HTLV-I/II)抗原和***测试，在测试前保管于-70℃下。所述血浆的供应遵守了延世医疗中心机构审查委员会(IRB)的规定。
<实施例2>最佳抗原决定簇的选取
通过使用由AbFrontier制作的软件分析在所述肝-羧酸酯酶1的三维结构中具有最佳抗原决定簇的肽的选取，并且从所分析的肽序列表中可确认，所选取的肽与待免疫化的小鼠的相应蛋白质的氨基酸序列是不同的。最终，通过在实际研究中进行分析并基于对所述肝-羧酸酯酶1特异性的肽进行重选，从而合成具有13个氨基酸序列的肽(参考表1)。
[表1]
<实施例3>小鼠的免疫化
在每个肽组中，乳化相同量的辅助抗原(Freund's佐剂)并分别先注射于四只BALB/c小鼠的腹腔中，四周后注射第二次，再过2周后注射第三次，完成免疫化。
在每次注射之前从每只小鼠的尾部中分离血清，然后通过酶免疫测定法测定肽抗原与从所述小鼠中所生成的抗体之间的反应程度。
为分析蛋白质水平，同时进行免疫印迹法。通过免疫印迹法测定与所述肝-羧酸酯酶1的结合能力，而且使用肝组织蛋白质作为标准样本。
从10％SDS-PAGE中分离被定量添加的5μg干组织蛋白质，将凝胶移至硝化纤维(NC)膜上并用含有5％脱脂乳的TBS-T缓冲液[20mM Tris、137m氯化钠、0.1％吐温20、pH7.6]隔离1小时。将用肽免疫化的小鼠的血清作为一抗与5％脱脂乳以500:1比例进行反应，而将作为二抗的抗小鼠IgG-HRP(Santa Cruz)以5000:1比例进行反应。用ECL Plus免疫印迹试剂(GE Healthcare)使最终NC膜反应3分钟，用台风9400扫描仪扫描，分析以抗原-抗体结合进行反应的肝-羧酸酯酶1蛋白的信号。
图1为展示了根据免疫化阶段的小鼠血清中肝-羧酸酯酶1的分析图的图片，其中M表示每蛋白质分子量的标准标记(5μg)，而5μg指肝组织蛋白质。
如图1所示，由于#3小鼠展示了高抗原-抗体反应性，因此选择了该小鼠。
<实施例4>生成单克隆抗体的最佳杂交瘤细胞的筛选
分离从实施例3中所选取的#3小鼠的脾细胞，使之与SP2/O-Ag14骨髓瘤细胞融合并在HAT培养基中进行稀释，然后分配于8个96孔板中进行培养。将用在250ng/孔中所合成肽作为抗原对所培养的细胞进行酶免疫测定，从而选取11个光密度最高的孔。在24孔中培养每个细胞，通过酶免疫测定法从中选取5个孔(#1B2、#1G11、#2F4、#3C1和#3F2)。将每组细胞分配于96孔板中进行培养，并进行3次的酶免疫测定法。从所述细胞中，选取5个反应性最高的克隆细胞(#1A9、#4H3、#6A10、#8F11和#10E8)。
图2为展示了所述肝-羧酸酯酶1的位置和结合程度的图片，其为在酶免疫测定中对具有高滴定值的#3孔细胞的培养溶液进行免疫印迹分析的结果。在#3F2融合细胞中展示了高反应性。
图3为展示了将所筛选的5个#孔的细胞再次分配于96孔板中并对具有高滴定值的孔分析3次而对最终筛选出的孔进行免疫印迹分析的结果的图片。在#10E8杂交瘤细胞中展示了高反应性。
因此，最终选取了显示高抗原-抗体反应性的#10E8杂交瘤细胞。一周后，将所述细 胞注射到小鼠的腹腔中。从所述小鼠提取腹水，用抗原亲和层析柱进行浓缩至最终浓度2mg/ml，然后在实验前保存于冷藏箱内。
测定最终单克隆抗体#10E8的子类同种型的结果，判定为IgG1型(参考表2)。
[表2]
<实施例5>单克隆抗体的抗原-抗体反应的有效性分析：免疫沉淀法和免疫印迹法
根据制作商手册，分别用抗肝-羧酸酯酶1多克隆抗体(Abcam，#Ab1875)和抗肝-羧酸酯酶1单克隆抗体(克隆#10E8)涂敷磁珠Dynabead MyOneTosylactivated(Invitrogen)。10、20、30、40和50μl的与抗肝-羧酸酯酶1抗体结合的所述微珠分别与100μg肝组织蛋白质在1ml试管中进行2小时的免疫沉淀。用被调至pH2的PBS-T缓冲液回收与所述抗体结合的蛋白质，然后通过免疫印迹法用ImageQuan程序分析了与多克隆抗体相比之下在多克隆抗体和单克隆抗体(克隆#10E8)的结合肝-羧酸酯酶1中的变化。
图4展示了多克隆抗体与单克隆抗体(克隆#10E8)之间抗原-抗体结合程度的比较。pHCC为将200μl混合了15名肝癌患者的血浆的样本与30μl抗体结合微珠进行免疫沉淀，5μg指肝组织蛋白质。
如图4所示，在相同条件下，所述单克隆抗体#10E8展示出比所述多克隆抗体高出20倍的抗原-抗体反应性。
<实施例6>用单克隆抗体对血浆中肝-羧酸酯酶1蛋白的分析：免疫沉淀法和免疫印迹法混合每组各10名的正常人、肝炎患者、肝硬化患者和肝癌患者的血浆，用实施例5中所用的肝-羧酸酯酶1多克隆抗体和单克隆抗体#10E8对200μl每个血浆组进行免疫沉淀，然后进行免疫印迹分析。为以相同条件进行扫描，通过使用ImageQuant程序分析当扫描分辨率调至100微米时所分析得到的肝-羧酸酯酶1的信号强度。
如图5和表3所示，可以确认与所述单克隆抗体结合的肝-羧酸酯酶1的强度与用所述多克隆抗体时相比平均增加30倍或更多。
[表3]
抗体种类 正常人 肝炎患者 肝硬化患者 肝癌患者
多克隆抗体 191,363 182,431 178,140 738,366
单克隆抗体 5,586,315 6,676,570 3,314,999 24,906,430
<实施例7>用单克隆抗体对血浆中肝-羧酸酯酶1蛋白的分析：ELISA 在96孔板中分别200μl的被稀释至浓度为0.5mg/ml的单克隆抗体#10E8以及适于ELISA的由Abcam制备的两种多克隆抗体1和2(#Ab1875,#Ab77730)。在冷藏箱中将所添加到96孔板中的抗体进行反应10小时后，将200μl的作为对照样本的混合了肝-羧酸酯酶1的标准蛋白质的样本加入所述孔中，反应2小时。以5000:1比例添加作为二级结合抗体的HRP酶结合hCE1抗体(#Ab34595)，并使之反应1小时，然后加入TMB显色试剂。
图6为所述单克隆抗体#10E8与适于ELISA的由Abcam制备的两种多克隆抗体1和2(#Ab1875,#Ab77730)之间的抗原-抗体结合程度的比较结果，其展示了根据抗原-抗体结合的样本的显色结果(a)以及根据肝-羧酸酯酶1浓度的抗原-抗体结合的光密度(b).
如图6所示，通过比较标准曲线的分析而得的光密度，可以确定本发明的#10E8抗体与相同量的抗体相比明显具有更高的单克隆结合有效性。
工业应用性
本发明可应用于蛋白质或疾病诊断领域。
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<160> 1
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> liver carboxylesterase 1 c-terminal 554 - 567 aa from Homo sapiens
<400> 1
Lys Ala Val Glu Lys Pro Pro Gln Thr Glu His Ile Glu Leu
1 5 10

Claims (8)

1.一种特异性结合至人肝羧酸酯酶1蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体由保藏号为KCLRF-BP-00282的杂交瘤生成。
2. 根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体能够识别所述人肝羧酸酯酶1蛋白的C-末端处的554-567氨基酸表位序列。
3. 根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为IgG1的同型免疫球蛋白。
4. 保藏号为KCLRF-BP-00282的杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞能够生成权利要求1所述的单克隆抗体。
5. 用于分离和纯化人肝羧酸酯酶1蛋白的组合物，该组合物包含权利要求1所述的单克隆抗体。
6. 用于检测人肝羧酸酯酶1的组合物，该组合物包含权利要求1所述的单克隆抗体。
7. 用于检测尿液或血液中的人肝羧酸酯酶1的浓度的方法，该方法包括：通过使权利要求1所述的单克隆抗体与样本进行接触来检测抗原-抗体复合物的形成。
8. 用于诊断肝癌的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1所述的单克隆抗体。
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