JP5445135B2 - 蛍光顕微鏡 - Google Patents
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Description
【0001】
本発明は、波長特性を表示する表示装置を有する蛍光顕微鏡に関する。
【背景技術】
【0002】
従来、蛍光顕微鏡では励起フィルタ、吸収フィルタもしくはバリアフィルタ、及びダイクロイックミラー等の波長特性を有する光学素子が光路中に配置されて所望の蛍光を検出装置で検出しモニター等の表示装置に表示し、観察者が観察していた(例えば、特開平11−223773号公報参照)。
【0003】
しかしながら、従来の蛍光顕微鏡では、所望の蛍光を検出するために光路中に挿入する励起フィルタ、吸収フィルタもしくはバリアフィルタ、及びダイクロイックミラー等の波長特性と所望の蛍光の波長特性とがスペック表としてカタログなどで個別に与えられるのみである。従って、ユーザは蛍光顕微鏡で観察できる蛍光像がどの波長帯域の波長特性を持つものか、すなわち前もって所望の波長領域の蛍光像が得られるか否かを視覚的に知ることができないと言う課題がある。
【発明の開示】
【0004】
そこで本発明は、上記課題に鑑みて行われたものであり、光学系の光路に配置されるレンズ、フィルタ、あるいはビームスプリッタ等の波長特性と蛍光色素との波長特性とから、所望の波長領域の蛍光像を取得ができるか否かを前もって視覚的に知ることを可能にする蛍光顕微鏡を提供することを目的とする。
【0005】
上記課題を解決するため、本発明は、
励起光を標本に照射する照明光学系と、
前記標本からの蛍光を検出する蛍光検出光学系と、
前記蛍光検出光学系を介して前記蛍光を検出する検出部と、
前記蛍光検出光学系の光路に配置され得る複数の光学部材と、
前記複数の光学部材から選択された光学部材の組み合わせが前記蛍光検出光学系の光路に配置されたときに前記検出部が検出可能な前記蛍光の波長範囲を、前記光学部材の波長特性に基づいて演算する制御手段と、
前記演算された前記波長範囲を表示する表示手段と、を具備することを特徴とする蛍光顕微鏡を提供する。
【0006】
本発明によれば、光学系の光路に配置されるレンズ、フィルタ、あるいはビームスプリッタ等の波長特性と蛍光色素との波長特性とから、所望の波長領域の蛍光像を取得ができるか否かを前もって視覚的に知ることを可能にする蛍光顕微鏡を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0007】
図1は、実施の形態にかかる蛍光顕微鏡の概略構成図を示す。
図2は、励起用ダイクロイックミラーの波長透過率特性の一例を示す。
図3は、第1ダイクロイックミラーの波長透過率特性の一例を示す。
図4は、第1吸収フィルタの波長透過率特性の一例を示す。
図5は、第2ダイクロイックミラーの波長透過率特性の一例を示す。
図6は、第2吸収フィルタの波長透過率特性の一例を示す。
図7は、第3吸収フィルタの波長透過率特性の一例を示す。
図8は、光路中に配置されたダイクロイックミラー、吸収フィルタの波長透過率特性を重ねて表示した一例を示す。
図9は、ダイクロイックミラーと吸収フィルタの合成波長透過率特性の一例を示す。
図10は、合成波長透過率特性と蛍光色素の発光特性を重ねて表示した一例を示す。
図11は、カラーバーと共に各光学部材の合成波長透過範囲を表示した一例を示す。
図12は、実施の形態の変形例のモニター画面例を示す。
図13は、実施の形態にかかるコンフォーカル顕微鏡の概略構成図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【0008】
本発明の一実施の形態について図面を参照しつつ説明する。なお、以下の実施の形態は、発明の理解を容易にするためのものに過ぎず、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲において当業者により実施可能な付加・置換等を施すことを排除することは意図していない。
【0009】
図1は、実施の形態にかかる蛍光顕微鏡の概略構成図を示す。図2は励起用ダイクロイックミラーの波長透過率特性の一例を示す。図3は第1ダイクロイックミラーの波長透過率特性の一例を示す。図4は第1吸収フィルタの波長透過率特性の一例を示す。図5は第2ダイクロイックミラーの波長透過率特性の一例を示す。図6は第2吸収フィルタの波長透過率特性の一例を示す。図7は第3吸収フィルタの波長透過率特性の一例を示す。図8は光路中に配置されたダイクロイックミラー、吸収フィルタの波長透過率特性を重ねて表示した一例を示す。図9は、ダイクロイックミラーと吸収フィルタの合成波長透過率特性の一例を示す。図10は合成波長透過率特性と蛍光色素の発光特性を重ねて表示した一例を示す。
【0010】
図1において、励起用のレーザ光源1から出射されたレーザ光(例えば、波長λ1=408nm)は、ミラー2によってダイクロイックミラー3方向に反射され、ダイクロイックミラー3を透過して、ダイクロイックミラー4でエキスパンダレンズ5方向に反射される。また、励起用のレーザ光源6から射出されたレーザ光(例えば、波長λ2=488nm)は、ダイクロイックミラー3でダイクロイックミラー4方向に反射され、ダイクロイックミラー4でエキスパンダレンズ5方向に反射される。また、励起用のレーザ光源7から射出されたレーザ光(例えば、λ3=633nm)は、ダイクロイックミラー4を透過してエキスパンダレンズ5に入射する。3つの励起用のレーザ光源1、6、7から射出したそれぞれのレーザ光は、合成されてエキスパンダレンズ5に入射する。この様にして励起用レーザ光源装置110が構成されている。なお、励起用のレーザ光源は3つに限定されず適宜変更可能である。
【0011】
エキスパンダレンズ5で拡大され略平行にされた合成レーザ光は、励起用ダイクロイックミラー8に入射し、対物レンズ9方向に反射され、対物レンズ9でステージ10に載置された標本11に集光される。励起用ダイクロイックミラー8は、図2に示す波長透過率特性8(部材と同じ符号を付して説明する。他も同様とする)を有し、波長λ1、波長λ2、および波長λ3のレーザ光を反射し標本11に照射する。図2において、縦軸は透過率(単位:%)を、横軸は波長(単位:nm)を示し、これは以降の図においても同様であり、以降の図では説明を省略する。
【0012】
標本11に入射した励起用のレーザ光で励起された蛍光は、図1に示すように対物レンズ9で集光され励起用ダイクロイックミラー8を透過して第1ダイクロイックミラー12に入射する。また標本11で反射された合成レーザ光は、励起用ダイクロイックミラー8でエキスパンダレンズ5方向に反射される。エキスパンダレンズ5から対物レンズ9で照明光学系120が構成されている。
【0013】
第1ダイクロイックミラー12は、図3に示す波長透過率特性12を有し、略490nm以下の波長の光を第1吸収フィルタ13方向に反射し、これを超える波長の光を透過する。第1吸収フィルタ13は図4に示す波長透過率特性13を有し、略420nmから略470nmの光を透過し、この範囲を超える波長の光を反射する。図1に示すように第1吸収フィルタ13を透過した光は、集光レンズ14で集光され第1ホトマルチプライヤ15(以後「PMT」と略記する)で光強度が検出される。対物レンズ9からPMT15で第1検出光学系130が構成されている。この様に、第1検出光学系130は、標本11において波長λ1(408nm)の励起用レーザ光で励起されて発現した第1の蛍光を検出する。
【0014】
また、波長特性の異なる複数の第1ダイクロイックミラー12を光路に交換可能に不図示の電動ターレットに装着し、ターレットを回転させた際に光路に挿入されている第1ダイクロイックミラー12を検出するフォトカプラーや電気スイッチなどの検出手段を設け、例えばパーソナルコンピュータ等から構成される制御装置23(以後単に「PC」と記す)でターレットの回転制御や第1ダイクロイックミラーの検出をするように構成する。
【0015】
図1に示すように第1ダイクロイックミラー12を透過した光は、第2ダイクロイックミラー16に入射する。第2ダイクロイックミラー16は、図5に示す波長透過率特性16を有し、略450nm以下の波長の光を第2吸収フィルタ17方向に反射し、これを超える波長の光を透過する。第2吸収フィルタ17は図6に示す波長透過率特性17を有し、略495nmから略550nmの光を透過し、この範囲を超える波長の光を反射する。図1に示すように第2吸収フィルタ17を透過した光は、集光レンズ18で集光され第2PMT19で検出される。対物レンズ9からPMT19で第2検出光学系140が構成されている。この様に、第2検出光学系140は、標本11において波長λ2(488nm)の励起用レーザ光で励起されて発現した第2の蛍光を検出する。
【0016】
なお、第1ダイクロイックミラー12と同様に、波長特性の異なる複数の第2ダイクロイックミラー16を光路に交換可能に不図示のターレットに装着し、ターレットを回転させた際に光路に挿入されている第2ダイクロイックミラー16を検出するフォトカプラーや電気スイッチなどの検出手段を設け、PC23でターレットの回転制御や第2ダイクロイックミラー16の検出をするように構成する。
【0017】
図1に示すように第2ダイクロイックミラー16を透過した光は、第3吸収フィルタ20に入射する。第3吸収フィルタ20は図7に示す波長透過率特性20を有し、略650nmを超える光を透過し、これ以下の波長の光を反射する。図1に示すように第3吸収フィルタ20を透過した光は、集光レンズ21で集光され第3PMT22で検出される。対物レンズ9からPMT22で第3検出光学系150が構成されている。この様に、第3検出光学系150は、標本11において波長λ3(633nm)の励起用レーザ光で励起されて発現した第3の蛍光を検出する。
【0018】
各PMT15、19、22で検出された蛍光による信号は、それぞれPC23に送られ、PC23で画像処理され、モニター23aに表示される。この様にして、実施の形態にかかる蛍光顕微鏡100が構成されている。
【0019】
なお、上記説明において、照明光学系120、第1検出光学系130、第2検出光学系140、および第3検出光学系150は一部の光学系を共有して構成されている。
【0020】
本実施の形態にかかる蛍光顕微鏡100では、図2、図3、及び図5に示す各ダイクロイックミラー8,12、及び16や図4、図6、及び図7に示す各吸収フィルタ13、17、及び20の波長透過率特性がPC23の記憶部に記憶してあり、光路に挿入されたダイクロイックミラー、及び吸収フィルタの波長透過率特性を表示手段であるPC23のモニター23aに表示することができるように構成されている。ここでPC23は、波長透過率特性を表示する表示装置として機能する。
【0021】
例えば、図8に示すように、光路に挿入されている各ダイクロイックミラー8,12、及び16、及び各吸収フィルタ13、17、及び20の波長透過率特性を重ねてモニター23aに表示し、透過する波長の範囲を示すことによりPMT15、19、22で検出できる波長範囲を使用者が視覚的に確認することを可能にしている。
【0022】
また、図9に示すようにPC23は、演算手段で各波長透過率特性を掛け算し合成した結果をモニター23aに表示することができ、透過する波長の範囲を視覚的に確認することができる。図9は、図8に示す各波長透過率特性を掛け算して合成した結果を示す。図9において、(12×13)は第1ダイクロイックミラー12と第1吸収フィルタ13の波長透過率特性を演算して得られた波長透過率特性を示し、(16×17)は第2ダイクロイックミラー16と第2吸収フィルタ17の波長透過率特性を演算して得られた波長透過率特性を示し、(16×20)は第2ダイクロイックミラー16と第3吸収フィルタ20の波長透過率特性を演算して得られる波長透過率特性をそれぞれ示している。この様に各波長透過率特性を合成することでグラフが1本となり、使用者はダイクロイックミラーと吸収フィルタが検出しようとしている蛍光色素に対応したもの否か、そして実際に蛍光画像として取得できるか否かを視覚的に判断することができる。
【0023】
また、PC23は各種の蛍光色素の蛍光波長特性が予め入力されたメモリに有しており、ユーザが標本11に投入した蛍光色素の蛍光波長特性をPC23のメモリに入力することで、図10に示すように蛍光顕微鏡100側の各種光学部材の合成波長透過率特性(13×13)、(16×17)、(16×20)と共に、投入された蛍光色素のλ1蛍光、λ2蛍光、λ3蛍光をそれぞれ重ねてモニター23aに表示する。
【0024】
また、PC23の演算手段では、投入された蛍光色素の蛍光波長と、蛍光顕微鏡100側の合成波長透過特性とを比較し、蛍光色素の蛍光波長が検出できない場合にはユーザに対して、どの蛍光色素の蛍光波長が検出できないかを報知する警告表示をモニター23aに表示する。モニター23aに表示される警告表示としては、例えば、現状、検出不可能として表示された蛍光色素を検出するのに適した光学部材種類の組み合わせおよびそれらの波長特性を具体的に報知する。
【0025】
ここで、蛍光色素の蛍光波長特性は、最大発光強度を100(%)として規格化することで合成波長透過率特性と重ねて表示することを可能にしている。これにより図10の実線で示す各光学部材(12×13)、(16×17)、(16×20)による合成波長透過率特性と、各波長λ1、λ2、λ3による各蛍光波長特性との関係を視覚的に確認することができる。この結果、所望の蛍光を検出することができるか否かを、励起レーザ光1,6,7を標本11に照射する前に確認することができ、蛍光検出ミスを防止することができる。
【0026】
また、表示装置(モニター23a)は図11に示すように、カラーバーCBと共に各光学部材(12×13)、(16×17)、(16×20)による合成波長透過範囲を枠表示することで、より視覚的に認識できる。また、合成波長透過範囲を枠表示により視覚的に認識できるようにしたが、例えば、枠表示に代えて色の濃淡によりその範囲を識別できるようにしても良い。
【0027】
なお、上述の説明では、3つのダイクロイックミラー、3つの吸収フィルタ、および3つの蛍光色素(3つの励起レーザ光)について説明したが、ダイクロイックミラー、吸収フィルタ、および蛍光色素の組合せは自由であり、光路に挿入されているダイクロイックミラー、吸収フィルタ、および蛍光色素の各波長特性を自動、または手動で指定することで、検出可能な蛍光の波長範囲を事前に確認することができる。
【0028】
また、PC23は、ダイクロイックミラー、吸収フィルタに限らず、蛍光顕微鏡100が持っている光学部材、例えばエキスパンダレンズ、コンデンサレンズ、励起フィルタ、対物レンズ、集光レンズ等の波長透過率特性、受光素子の波長感度特性などをメモリに記憶しておき、上述の如く合成してモニター23aに表示することで、使用者はより正確に自分の使用したい蛍光色素に対応した光学部材を選択・設定すること、あるいは使用する光学系において蛍光色素からの蛍光を検出可能か否かを事前に知ることができる。
【0029】
(変形例)
次に、本実施の形態の変形例について説明する。図12は、実施の形態の変形例のモニター画面例を示す。
【0030】
図12に示す実施の形態の変形例は、ユーザがセットした各種フィルタ、ダイクロイックミラーの組合せによる蛍光検出波長範囲の候補をモニター23a上に示し、その候補の中から所望のものを選択・決定することで、最終的にダイクロイックミラーと各種フィルタとのセットが顕微鏡に設定される。
【0031】
具体的には、ユーザが図1に示す光学部材2〜4,12,13,16,17,20等の複数の組合せを任意に設定した時々に応じて、図12のように蛍光検出波長範囲の表示をモニター23a上に選択候補として複数表示し、その組合せをPC23の記憶部に記憶する。なお、図12では、この候補として2つの候補を表示しているが、3つ以上でもよい。モニター23a上に表示される候補数は、光学部材の組合わせによって(ユーザの設定)決まる。そして、ユーザはモニター23aに表示された蛍光検出波長範囲の候補から、最終的に所望するフィルタの組合せを選択し、例えばモニター23a上のチェック欄「□」にチェックを入れることで、候補の選択を完了する。
【0032】
これにより、種々の蛍光検出波長範囲の候補の中から、ユーザが実験に最適な蛍光検出範囲の光学部材(バリアフィルタ、励起フィルタ、ダイクロイックミラーなど)の組合せを選択できる。
【0033】
次に、本実施の形態にかかるコンフォーカル顕微鏡について説明する。図13は、実施の形態にかかるコンフォーカル顕微鏡の概略構成図である。
【0034】
図13において、本コンフォーカル顕微鏡は、顕微鏡本体200とレーザ光源ユニット210とセンサユニット220とから構成されている。顕微鏡本体200は、ピンホール201、光学部材であるダイクロイックミラーターレット202(複数の異なる波長特性を有するダイクロイックミラーを含む)を備える。また、レーザ光源ユニット210は、レーザ光源213〜215の異なる3つの励起光源と、それぞれレーザ光源の前に設置されてレーザ光の遮断/開放を制御するシャッタ216〜218と、光学部材である励起フィルタ211、212とを備える。また、センサユニット220は、フィルタブロック261、262(複数の異なる波長特性を有するフィルタキューブ(ダイクロイックミラーとバリアフィルタの組合せから構成)を含む)を備える。光ファイバー230,240によって、顕微鏡本体200とレーザ光源ユニット210やセンサユニット220が光学的に接続される。
【0035】
これら光学部材は、ターレット上に配置され、手動もしくはモータにより駆動され、所望のものが選択できる。同様に、励起フィルタ211,212を選択するためにシャッタ216〜218の1つが開放され、他が遮断される。上述した図1と同様に、これら光学部材の波長透過率特性データは、コントローラ300の記憶部に記憶されており、これら光学部材の選択(シャッタ216〜218の選択含む)は、コントローラ300により制御され、光学部材の設定が電気制御される。
【0036】
従って、上述した図12の如く、蛍光検出波長範囲の候補がモニター23a上に表示され、ユーザが所望する候補を選択すると、コントローラ300が最適な光学部材を設定する。
【0037】
このように、本コンフォーカル顕微鏡では、複雑に各種波長特性を有する光学部材が配置されているが、本発明の如く構成すれば、ユーザが所望する蛍光検出波長範囲を素早く設定することができる。また、PMT(センサ)251は、設定された光学部材の波長特性によってはセンサに届く光がこれら光学特性の影響を受けるので、その影響された分のゲイン調整(露光時間調整など含む)がコントローラ300により行われる。
【0038】
なお、本実施の形態にかかる表示装置は、上述のレーザ蛍光顕微鏡のみならず、落射蛍光顕微鏡、透過蛍光顕微鏡、共焦点蛍光顕微鏡、共焦点走査型蛍光顕微鏡等、各種の蛍光顕微鏡の表示手段として使用することが可能である。
Claims (8)
- 励起光を標本に照射する照明光学系と、
前記標本からの蛍光を検出する蛍光検出光学系と、
前記蛍光検出光学系を介して前記蛍光を検出する検出部と、
前記蛍光検出光学系の光路に配置され得る複数の光学部材と、
前記複数の光学部材から選択された光学部材の組み合わせが前記蛍光検出光学系の光路に配置されたときに前記検出部が検出可能な前記蛍光の波長範囲を、前記光学部材の波長特性に基づいて演算する制御手段と、
前記演算された前記波長範囲を表示する表示手段と、を具備することを特徴とする蛍光顕微鏡。 - 前記蛍光検出光学系および前記検出部を、それぞれ複数具備し、
前記表示手段は、前記複数の検出部が検出可能な前記蛍光の前記波長範囲を同一画面上に表示することを特徴とする請求項1に記載の蛍光顕微鏡。 - 前記表示手段は、前記標本に投入された蛍光色素の蛍光波長と、前記検出部が検出可能な前記蛍光の前記波長範囲とを同一画面上に表示することを特徴とする請求項1又は2に記載の蛍光顕微鏡。
- 前記蛍光検出光学系の光路に配置され得る複数の光学部材は、前記光路に交換可能に配置され、
前記光路に配置された前記光学部材を検出する光学部材検出手段をさらに有し、
前記制御手段において、前記光学部材検出手段により検出される前記光学部材の組み合わせが選択されることを特徴とする請求項1から3のいずれか1項に記載の蛍光顕微鏡。 - 前記光学部材は、ダイクロイックミラーを含むことを特徴とする請求項1から4のいずれか1項に記載の蛍光顕微鏡。
- 前記光学部材は、吸収あるいはバリアフィルタを含むことを特徴とする請求項1から5のいずれか1項に記載の蛍光顕微鏡。
- 前記表示手段は、前記検出部が検出可能な前記蛍光の前記波長範囲と、前記標本に投入された蛍光色素の蛍光波長とを比較し、前記投入された蛍光色素の蛍光波長が、前記検出部が検出可能な蛍光検出波長範囲に入らないときに前記表示手段に警告表示をする
ことを特徴とする請求項1から6のいずれか1項に記載の蛍光顕微鏡。 - 前記表示手段は、前記検出部が検出可能な前記蛍光の前記波長範囲の候補を、選択可能に複数表示し、
前記制御手段は、選択された候補に従って前記光学部材を、前記蛍光検出光学系の光路に配置することを特徴とする請求項1から7のいずれか1項に記載の蛍光顕微鏡。
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