JP5485289B2 - 分解能増進顕微鏡法 - Google Patents
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Description
前記サンプルは、ラベル分子を用いて活性化され、
前記ラベル分子は、活性化状態でのみ特定のルミネセンス放射を放出するように励起することができるように、スイッチング信号によって活性化することができ、
前記方法は、次の各ステップ、すなわち、
a)前記サンプルに存在する前記ラベル分子のサブセットのみが活性化されるように前記スイッチング信号を前記サンプル上に導入するステップであって、
前記サンプル内にエリアの各部分が存在し、
前記各部分において、活性化されたラベル分子が、最も近い近傍の活性化されたラベル分子まである距離を有し、前記ある距離は、少なくとも所定の光学分解能に起因する長さ以上である、
前記スイッチング信号を前記サンプル上に導入するステップと、
b)前記活性化された分子をルミネセンス放射を放出するように励起するステップと、
c)前記ルミネセンス放射を前記所定の光学分解能で検出するステップと、
d)ステップc)において記録された前記ルミネセンス放射からフレームを生成するステップであって、
ルミネセンス放射を放出する前記ラベル分子の幾何学的ロケーションが、前記所定の光学分解能を超えて増進された空間分解能で特定される、
フレームを生成するステップと、
を有し、
これらのステップは、数回繰り返され、
そのようにして得られたそれらいくつかの前記フレームが組み合わされて全体像にされる
方法において、
前記各フレームの取得の制御は、
ステップd)の後に、前記フレームのうち少なくとも1つを評価すること、又は、一群の前記フレームを評価することと、
ステップa〜dの少なくとも1つの変数を、ステップa〜dの後続の繰り返しのために変更することと
によって行われることを特徴とする、方法。
1.検出側:
a.周波数帯域/フィルター;
b.増幅率(たとえばプリアンプ利得、EMCCD利得);
c.検出器の温度;
d.検出の積分時間;
e.検出の検出モード(たとえば光子カウント、ベースラインクランプ);
f.特定のROIのみの読み出し;
g.検出された放射の偏光;
h.焦点。
2.励起側:
a.放射励起及び/又は活性化励起;
i.パルス形状又はCW;
ii.出力及びパルス周波数;
iii.波長;
b.放射持続時間;
c.局所的に特定の(ピクセルごとの)励起、又は特定のROIの励起、又はエリア全体にわたる励起;
d.照明場のサイズ;
e.TIRF照明の場合の侵入深さ;
f.焦点位置。
3.サンプル側:
サンプル内の観測領域の位置。
1.染料特性:
a.ブリーチングレート;
b.励起/放出スペクトル;
c.寿命;
d.活性化しきい値;
e.1分子当たりの光子レート;
f.フラッシュ頻度;
2.結像/像特性:
a.個々の活性化された分子の測定された点像分布関数の形状及び強度だけでなく、サンプルに組み込まれる可能性のある標識(たとえば金のビード)の測定された点像分布関数の形状及び強度、さまざまな色で測定されたPSFの形状及び強度の差;
b.個々の分子が平均して可視的である期間;
c.1つの点像分布関数当たりの、空間的かつ時間的に重なり合う活性化された分子の数(「活性化密度」の尺度);
d.(局所的に規定された)ラベル分子密度。たとえばさらに別の波長の蛍光の強度によって測定されたラベル分子密度。これは、(たとえばtdEosのような)2つの蛍光状態間でスイッチング/変換する染料について可能である。ラベル分子密度は、たとえば早期像(すでに変換されたがブリーチングされていなさまざまなラベル分子を見ることができるもの)によって、測定波長の蛍光を介して求めることもできる。加えて、さらに別の相関着色又は他のコントラスト方法を介してラベル密度も推定することもできる。
e.1分子当たりの収集された光子の数;
f.1フレーム当たりの活性化された分子の数;
g.1フレーム当たりの分子の平均ロケーション精度;
h.カメラを保護するために、一つには、用いられるフィルターと個々のレーザー波長の励起線との組み合わせを用いることができ、また、もう一つには、他の波長で検出される蛍光の測定強度を用いることもできる。
i.異なり得る励起波長を用いて取得された各蛍光像の相関、又は、たとえばDIC等のさらに別のコントラスト方法からの像との相関。
Claims (12)
- 活性化状態でのみ特定のルミネセンス放射を放出するように励起することができるように、スイッチング信号によって活性化することができるラベル分子を用いてラベル付けされるサンプルの、ルミネセンス顕微鏡法のための方法であって、
前記方法は、次の各ステップ、すなわち、
a)前記サンプルに存在する前記ラベル分子のサブセットのみが活性化されるように前記スイッチング信号を前記サンプル上に導入するステップであって、
前記サンプル内にエリアの各部分が存在し、
前記各部分において、活性化されたラベル分子が、最も近い近傍の活性化されたラベル分子まである距離を有し、前記ある距離は、少なくとも所定の光学分解能に起因する長さ以上である、
前記スイッチング信号を前記サンプル上に導入するステップと、
b)前記活性化された分子をルミネセンス放射を放出するように励起するステップと、
c)前記ルミネセンス放射を前記所定の光学分解能で検出するステップと、
d)ステップc)において記録された前記ルミネセンス放射からフレームを生成するステップであって、
ルミネセンス放射を放出する前記ラベル分子の幾何学的ロケーションが、前記所定の光学分解能を超えて増進された空間分解能で特定される、
フレームを生成するステップと、
を有し、
前記ステップa〜dのうち少なくとも1つは、最適化されるべき少なくとも1つの操作変数を持ち、
前記ステップa〜dは、複数回繰り返され、
得られた複数の前記フレームが組み合わされて全体像にされる
方法において、
前記各フレームの取得の制御は、
ステップd)の後に、前記フレームのうち少なくとも1つを評価すること、又は、一群の前記フレームを評価することと、
ステップa〜dの前記少なくとも1つの操作変数を、ステップa〜dの後続の繰り返しのために変更することと
によって行われ、
前記制御中に、品質関数が評価されるとともに、前記品質関数の値が最大にされ、
前記品質関数は、直接的又は間接的に、前記ラベル分子の部分の尺度になるように選ばれ、
前記部分は、前記サンプル内における、活性化されたラベル分子であって、その最も近い近傍の活性化されたラベル分子までの距離が、少なくとも前記所定の光学分解能で解像することができる距離となる、そのようなラベル分子の部分である、方法。 - 前記品質関数は、分離されたラベル分子の密度の測定値であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 近傍のルミネセント領域から分離されたルミネセント領域が、前記評価されるフレームのそれぞれにおける前記品質関数の前記評価用に特定され、
前記分離されたルミネセント領域それぞれによって放出された前記ルミネセンス放射の量の尺度が、各分離されたルミネセント領域について特定され、
尺度がしきい値未満となる前記ルミネセント領域の部分が、前記品質関数の値として取得される
ことを特徴とする、請求項2に記載の方法。 - 前記放出されるルミネセンス放射の量の前記尺度は、前記ルミネセンス放射の強度の積分であるか、又は、前記ルミネセンス放射の強度の最大値であることを特徴とする、請求項3に記載の方法。
- 前記品質関数を評価するために、近傍のルミネセント領域から分離されたルミネセント領域が、前記評価されるフレームのそれぞれにおいて特定され、
これらの分離されたルミネセント領域のそれぞれについて、最も近い近傍のルミネセント領域までの最小距離が求められ、
前記最小距離が、解像可能最小距離よりも、又は、当該解像可能最小距離の事前に設定された倍数よりも、大きくなるルミネセント領域の部分が、前記品質関数の値として選ばれ、
前記解像可能最小距離は、前記所定の光学分解能に基づいて規定されることを特徴とする、請求項2に記載の方法。 - 前記最小距離を求めるために、各前記ルミネセント領域の幾何学的中心の周りに1つの円が配置され、
前記円は、前記最も近い近傍のルミネセント領域まで延びる
ことを特徴とし、かつ、
前記円の半径が、前記距離よりも、又は、前記距離の事前に設定された倍数よりも、大きくなる前記領域の部分が、前記品質関数の値として取得される
ことを特徴とする、請求項5に記載の方法。 - 一群の連続したフレームが評価され、
近傍のルミネセント領域から分離されたルミネセント領域が、前記評価されるフレームのそれぞれにおいて特定され、
前記一群のうち、ただ1つのみのフレームでルミネセンスする前記ルミネセント領域の部分が、前記品質関数の値として取得されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。 - 前記操作変数は、以下のパラメーター、すなわち、
‐フィルタリング、偏光フィルタリング、増幅、検出器温度、積分持続時間、検出場の選択、前記ルミネセンス放射の前記検出中の焦点の位置及びサイズと、
‐出力、パルス形状、パルス周波数、波長、放射持続時間、放射場の選択、TIRF照明の侵入深さ、前記スイッチング信号の導入中又は前記活性化された分子の前記励起中の焦点の位置及びサイズと、
のうちの少なくとも1つを含むことを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。 - 次の操作変数、すなわち、
前記ラベル分子のブリーチングレート、前記ラベル分子の励起スペクトル及び放出スペクトル、前記ラベル分子のルミネセンス状態の寿命、前記ラベル分子の活性化しきい値、前記ラベル分子の点滅レート、個々のラベル分子が平均して可視的である期間、前記光学分解能の範囲内を同時に占めるルミネセントラベル分子の数、1ルミネセントラベル分子当たりの収集された光子の数、1フレーム当たりの活性化されたラベル分子の数、1フレーム当たりの前記ラベル分子の平均ロケーション精度、
のうちの少なくとも1つが記録され、前記フレームのうち少なくとも1つを前記評価することにおいて、又は、一群の前記フレームを前記評価することにおいて、評価されることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。 - 通常の光学分解能を有するさらなる蛍光像が複数の励起波長において記録され、
前記各フレームは、前記評価用にこれらの蛍光像と相関される
ことを特徴とする、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。 - 通常の光学分解能を有するさらなる蛍光像がコントラスト方法を用いて記録され、
前記各フレームは、前記評価用にこれらの蛍光像と相関される
ことを特徴とする、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。 - 前記さらなる蛍光像は、前記フレームの取得中に取得されることを特徴とする、請求項10または11に記載の方法。
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