JP4735758B2 - 共焦点顕微鏡装置 - Google Patents

Description

本発明は、試料の観察層からの射出光による画像と、観察層の両側の層からの射出光による画像とを１回のスキャンで取得することの可能な共焦点顕微鏡装置に関する。

特許文献１には、試料の観察層からの射出光による画像と、観察層の両側の層からの射出光による画像とを１回のスキャンで取得することの可能な共焦点顕微鏡装置が開示されている。この共焦点顕微鏡装置では、それら２種類の画像の合成方法を変えることによりセクショニング幅及び画像の明るさ変更することができる。

従ってこの共焦点顕微鏡装置のユーザは、画像取得後にそれら２種類の画像の合成方法を変えることによってセクショニング幅及び画像の明るさを自由に変えることができるので、何度も画像を取り直す必要が無いため、短時間で適正な画像が得られ、試料への光ダメージを軽減できる。
国際公開２００７／０１０６９７号パンフレット

しかしながら１つの観察視野内に著しく暗い部位と著しく明るい部位とが存在する場合、観察したい部位の明るさに合わせて合成方法をその都度変更する必要があった。

そこで本発明は、観察視野の全域又は全波長成分を一括して観察するのに適した画像を生成することのできる共焦点顕微鏡装置を提供することを目的とする。

本発明の共焦点顕微鏡装置は、光源と、前記光源からの光を試料に集光する照明光学系と、前記試料からの光を集光する集光光学系と、前記集光光学系の集光位置に配置され、入射する光を少なくとも前記試料の前記集光点の近傍からの光と、その周辺からの光とに分離し、それぞれ検出する検出手段と、前記検出手段から出力される前記集光点の近傍からの光の信号と、前記周辺からの光の信号とを演算処理して前記試料の画像を生成すると共に、前記集光点の近傍からの光の信号と前記周辺からの光の信号との比率を前記画像の領域毎にそれぞれ設定する画像生成手段と、を備えることを特徴とする。

なお、前記画像生成手段は、前記設定された前記比率に応じて、前記集光点の近傍からの光の信号と前記周辺からの光の信号との和の演算又は差の演算を行ってもよい。

また、前記画像生成手段は、前記集光点の近傍からの光の信号に基づいて前記比率を設定してもよい。

また、前記画像生成手段は、前記領域毎に前記比率を設定しながら、順次、前記画像を生成してもよい。

また、前記画像生成手段は、前記集光点の近傍からの光の信号と前記周辺からの光の信号とをそれぞれ記憶する記憶手段を備え、前記記憶手段内において前記領域毎に前記比率を設定してもよい。

また、前記画像生成手段は、前記領域毎の前記比率の設定を、ユーザからの指示に応じて行ってもよい。

また、本発明の別の共焦点顕微鏡装置は、光源と、前記光源からの光を試料に集光する照明光学系と、前記試料からの光を集光する集光光学系と、前記集光光学系の集光位置に配置され、入射する光を少なくとも前記試料の前記集光点の近傍からの光と、その周辺からの光とに分離し、それぞれを波長成分に分光すると共に、それぞれを前記波長成分毎に検出する検出手段と、前記検出手段から出力される前記波長成分毎の前記集光点の近傍からの光の信号と、前記波長成分毎の前記周辺からの光の信号とを演算処理して前記試料の画像を前記波長成分毎に生成すると共に、前記集光点の近傍からの光の信号と前記周辺からの光の信号との比率を、前記波長成分毎の前記画像の領域毎にそれぞれ設定する画像生成手段と、を備えることを特徴とする。

なお、前記画像生成手段は、前記設定された前記比率に応じて、前記集光点の近傍からの光の信号と前記周辺からの光の信号との和の演算又は差の演算を行ってもよい。

また、前記画像生成手段は、前記比率を前記集光点の近傍からの光の信号に基づいて設定してもよい。

また、前記画像生成手段は、前記領域毎に前記比率を設定しながら、順次、前記画像を生成してもよい。

また、前記画像生成手段は、前記集光点の近傍からの光の信号と前記周辺からの光の信号とをそれぞれ記憶する記憶手段を備え、前記記憶手段内において前記領域毎に前記比率を設定してもよい。

また、前記画像生成手段は、前記領域毎の前記比率の設定を、ユーザからの指示に応じて行ってもよい。

本発明によれば、観察視野の全域又は全波長成分を一括して観察するのに適した画像を生成することのできる共焦点顕微鏡装置が実現する。

共焦点顕微鏡装置の光学系の構成図である。 光分離部材１９を説明する図である。 集光レンズ１８の焦点面上の領域を説明する図である。 試料１０の観察層と、その両側の層とを説明する図である。 共焦点顕微鏡装置の制御系の構成図である。 蛍光信号ＩｓのＺ方向の感度特性を示す図である。 第１実施形態のＣＰＵ２２１の動作フローチャートである。 ルックアップテーブルを説明する図である。 第１実施形態の適正画像を説明する図である。 第２実施形態のＣＰＵ２２１の動作フローチャートである。 第２実施形態のモニタ２３に表示される画像を説明する図である（スキャン直後の様子）。 第２実施形態のモニタ２３に表示される画像を説明する図である（領域が指定された様子）。 第２実施形態のモニタ２３に表示される画像を説明する図である（セクショニング幅が変更された様子）。 第３実施形態の共焦点顕微鏡装置の光学系の構成図である。 第３実施形態のＣＰＵ２２１の動作フローチャートである。 第３実施形態の適正画像を説明する図である。

［第１実施形態］
本発明の共焦点顕微鏡装置の第１実施形態を説明する。

図１は、共焦点顕微鏡装置の光学系の構成図である。図１に示すとおり、共焦点顕微鏡装置には、レーザユニット１１、光ファイバ７、コリメートレンズ１２、フィルタ１３、ダイクロイックミラー１４、ガルバノスキャナ１５、リレーレンズ１６１、対物レンズ１６、試料１０、フィルタ１７、集光レンズ１８、光分離部材１９、光ファイバ１９ｓ、光ファイバ１９ｍ、光検出器２０ｓ、光検出器２０ｍなどが配置される。

試料１０は、例えば生体細胞を培養した培養標本であり、その生体細胞は所定の蛍光物質により予め染色されている。試料１０の光軸方向の位置は、観察対象物が対物レンズ１６の焦点面に存在するよう不図示の顕微鏡の上下動機構によって予め調整されている。以下、対物レンズ１６の光軸方向をＺ方向とし、試料１０のうち対物レンズ１６の焦点深度内に存在する層を「観察層」という。

レーザユニット１１は、前記所定の蛍光物質の励起波長と同じ波長のレーザ光を出射する。レーザユニット１１から射出したレーザ光は、光ファイバ７の内部を伝搬してからコリメートレンズ１２において平行光束化された後、フィルタ１３を介してダイクロイックミラー１４へ入射する。そのレーザ光はダイクロイックミラー１４を通過し、ガルバノスキャナ１５の２つのミラーで順に反射した後、リレーレンズ１６１及び対物レンズ１６を通り、試料１０の観察層の１箇所に集光する。レーザ光が照射された領域、即ち集光点及びその前後では蛍光物質が励起され、蛍光を発する。

発生した蛍光は、その集光点に向かったレーザ光と同じ光路を逆に辿りながら、対物レンズ１６、リレーレンズ１６１、ガルバノスキャナ１５を通り、ダイクロイックミラー１４へ向かう。その蛍光はダイクロイックミラー１４で反射し、フィルタ１７を介して集光レンズ１８へ入射する。その蛍光は、集光レンズ１８によって集光されつつ光分離部材１９へ入射し、２つの蛍光Ｌｓ，Ｌｍに分離される。この光分離部材１９の詳細は後述する。

光分離部材１９において分離された一方の蛍光Ｌｓは、光ファイバ１９ｓの内部を伝搬してから光検出器２０ｓへ入射し、蛍光信号Ｉｓに変換される。光分離部材１９において分離された他方の蛍光Ｌｍは、光ファイバ１９ｍの内部を伝搬してから光検出器２０ｍへ入射し、蛍光信号Ｉｍに変換される。

したがって、以上の共焦点顕微鏡装置は、レーザユニット１１と、ガルバノスキャナ１５と、光検出器２０ｓと、光検出器２０ｍとを同期駆動することにより、試料１０をレーザ光でスキャンしながら２種類の蛍光信号Ｉｓ，Ｉｍを並列的に取得することができる。

図２は、光分離部材１９を説明する図である。図２に示すとおり光分離部材１９の全体は、入射する蛍光に対し透明な部材であり、その部材上に光分離面１９ｓと光分離面１９ｍと反射面１９Ａとが形成されている。

光分離面１９ｓは、微小円形の透過面（ピンホール）１９ｓ’と、そのピンホール１９ｓ’の周辺領域をカバーする反射面１９ｓ”とからなり、光分離面１９ｍは、円形の透過面１９ｍ’と、その透過面１９ｍ’の周辺領域をカバーする反射面１９ｍ”とからなる。このうち、ピンホール１９ｓ’の径ｒｓは前述した集光点の径に対応しており、透過面１９ｍ’の径ｒｍは、ピンホール１９ｓ’の径ｒｓよりも大きく、例えばｒｍ＝２×ｒｓである。

集光レンズ１８から光分離部材１９へ入射した蛍光は、光分離面１９ｓへ入射し、ピンホール１９ｓ’を透過する蛍光と、反射面１９ｓ”を反射する蛍光とに分離される。このうち反射面１９ｓ”を反射した蛍光は、反射面１９Ａへ向かい、その反射面１９Ａを反射した後に光分離面１９ｍへ入射し、透過面１９ｍ’を透過する蛍光と、反射面１９ｍ”を反射する蛍光とに分離される。このうち、ピンホール１９ｓ’を透過した蛍光が前述した蛍光Ｌｓであり、透過面１９ｍ’を透過した蛍光が前述した蛍光Ｌｍである。

ここで、ピンホール１９ｓ’の配置箇所とピンホール１９ｍ’の配置箇所とは、集光レンズ１８の焦点深度に比べて光路長差が十分に短いので、同一焦点面とみなすことができる。

図３に示すとおり、集光レンズ１８の焦点面上の領域を考えると、蛍光Ｌｓは、集光レンズ１８の焦点面中央の円形領域Ａｓに向かう蛍光に相当し、蛍光Ｌｍは、その円形領域Ａｓの外側のリング領域Ａｍに向かう蛍光に相当する（円形領域Ａｓの径が前述したｒｓに相当し、リング領域Ａｍの外径が前述したｒｍに相当する。）。

これら各蛍光の射出元を示すと、円形領域Ａｓに向かう蛍光Ｌｓの射出元は、図４に示すとおり試料１０の観察層１０ｓであり、リング領域Ａｍに入射する蛍光Ｌｍの射出元は、観察層１０ｓの両側の層１０ｍである。したがって、本実施形態の共焦点顕微鏡装置では、観察層１０ｓからの蛍光Ｌｓと、その両側の層１０ｍからの蛍光Ｌｍとが並列的かつ個別に検出される。

なお、光分離部材１９を省略し、蛍光Ｌｓの強度と蛍光Ｌｍの強度とを個別に検出可能な光検出器を光分離部材１９の配置箇所へ配置してもよい。このような光検出器の受光面は、円形領域Ａｓと同形状の受光領域と、リング領域Ａｍと同形状の受光領域とを有する。

図５は、共焦点顕微鏡装置の制御系の構成図である。図５に示すとおり、共焦点顕微鏡には、コントローラ２１と、コンピュータ２２と、モニタ２３と、入力器２４とが備えられる。

コントローラ２１には、２つのＩ／Ｖ変換器２１１ｓ，２１１ｍと、２つのＡ／Ｄ変換器２１２ｓ，２１２ｍと、制御回路２１０とが備えられる。コンピュータ２２には、ＣＰＵ２２１と、２つのフレームメモリ２２０ｓ，２２０ｍと、ＲＡＭ２２２と、ハードディスクドライブ２２３と、表示用メモリ２２４と、インタフェース２２５とが備えられる。

光検出器２０ｓから出力される蛍光信号Ｉｓは、Ｉ／Ｖ変換器２１１ｓを通り電圧信号に変換される。そのＩ／Ｖ変換器２１１ｓから出力される蛍光信号Ｉｓは、Ａ／Ｄ変換器２１２ｓを通りディジタル信号に変換される。そのＡ／Ｄ変換器２１２ｓから出力される蛍光信号Ｉｓはフレームメモリ２２０ｓへ入力される。

光検出器２０ｍから出力される蛍光信号Ｉｍは、Ｉ／Ｖ変換器２１１ｍを通り電圧信号に変換される。そのＩ／Ｖ変換器２１１ｍから出力される蛍光信号Ｉｍは、Ａ／Ｄ変換器２１２ｍを通りディジタル信号に変換される。そのＡ／Ｄ変換器２１２ｍから出力される蛍光信号Ｉｍはフレームメモリ２２０ｍへ入力される。

制御回路２１０は、ＣＰＵ２２１からのスキャン指示に応じて、前述したレーザユニット１１、ガルバノスキャナ１５、光検出器２０ｓ、光検出器２０ｍを同期制御してスキャンを行う。そのスキャンにより、フレームメモリ２２０ｓには１フレーム分の蛍光信号Ｉｓが、フレームメモリ２２０ｍに１フレーム分の蛍光信号Ｉｍがそれぞれ並列的に蓄積される。スキャンが終了すると、制御回路２１０はＣＰＵ２２１へ終了信号を与える
スキャンによってフレームメモリ２２０ｓに蓄積される１フレーム分の蛍光信号Ｉｓは、試料１０の観察層１０ｓ（図４参照）の画像を示し、スキャンによってフレームメモリ２２０ｍに蓄積される１フレーム分の蛍光信号Ｉｍは、観察層の両側の層１０ｍ（図４参照）の画像を示す。

コンピュータ２２のハードディスクドライブ２２３には予め観察用のプログラムが格納されており、ＣＰＵ２２１はその観察用のプログラムをＲＡＭ２２２上へ読み出し、そのプログラムを実行する。その際、ＣＰＵ２２１は必要に応じて、入力器２４及びインタフェース２２５を介してユーザの指示を認識したり、制御回路２１０へスキャン指示を与えたりする。

また、ＣＰＵ２２１は、スキャン時にフレームメモリ２２０ｓに蓄積される１フレーム分の蛍光信号Ｉｓを読み出し、それを表示用メモリ２２４の所定領域へ書き込むことにより、モニタ２３に対し観察層１０ｓの画像を表示することができる。また、ＣＰＵ２２１は、スキャン時にフレームメモリ２２０ｓ，２２０ｍに蓄積される蛍光信号Ｉｓ，Ｉｍを読み出し、両者の和からなる和信号（Ｉｓ＋Ｉｍ）を生成し、それを表示用メモリ２２４の所定領域へ書き込むことにより、モニタ２３に対し観察層１０ｓと両側の層１０ｍとを含む全体層の画像を表示することができる。すなわち、ＣＰＵ２２１は、蛍光信号Ｉｓによるセクショニング幅の狭い画像と、和信号（Ｉｓ＋Ｉｍ）によるセクショニング幅の広い画像とを表示することができる。

また、ＣＰＵ２２１は、スキャンで取得された画像をハードディスクドライブ２２３へ保存することもできる。この際、蛍光信号Ｉｓが示す画像と、蛍光信号Ｉｍが示す画像とは個別に保存されることが望ましい。個別に保存しておけば、セクショニング幅の異なる２種類の画像を任意のタイミングで任意の回数だけ生成することができるからである。

ここで、蛍光信号Ｉｓのレベルと、試料１０中のＺ位置との関係（感度特性）を示すと、図６の太曲線のようになる。蛍光信号Ｉｓは、観察層（Ｚ＝−０．３〜＋０．３）から射出された蛍光の信号を多く含んでいることが分かる。なお、図６の横軸においてＺ＝０が対物レンズ１６の焦点面を示している。

また、蛍光信号Ｉｍのレベルと、試料１０中のＺ位置との関係（感度特性）を示すと、図６の細曲線のようになる。蛍光信号Ｉｍは、観察層の両側の層（Ｚ＝−０．５の近傍、及びＺ＝＋０．５の近傍）から射出された蛍光の信号を多く含んでいることが分かる。

したがって、蛍光信号Ｉｓと蛍光信号Ｉｍとの重み付け和からなる和信号（Ｉｓ＋αＩｍ）を考えると、α＞０であるときの和信号（Ｉｓ＋αＩｍ）は、セクショニング幅が広く明るい画像を示し、α＜０であるときの和信号（Ｉｓ＋αＩｍ）は、セクショニング幅の狭い画像を示す。

これを拡張して考えると、αの値を連続的に変化させると、セクショニング幅を連続的に変化させることも可能である。よって、ＣＰＵ２２１が和信号（Ｉｓ＋αＩｍ）が示す画像を表示し、かつその係数αを−１〜＋１の範囲で連続的に変化させると、その画像のセクショニング幅を連続的に変化させることができる。以下、セクショニング幅に寄与するこの係数αを、「セクショニング係数」と称す。

なお、通常の観察では、セクショニング係数αの変化の範囲は−０．５〜＋１で十分である。よって、以下ではセクショニング係数αの変化の範囲を−０．５〜＋１とする。

図７は、ＣＰＵ２２１の動作フローチャートである。

ステップＳ１１：ＣＰＵ２２１は、ユーザから観察開始指示が入力されたか否かを判別する。入力された場合にはステップＳ１２へ進む。

ステップＳ１２：ＣＰＵ２２１は、制御回路２１０へスキャン指示を与える。これによってスキャンが開始され、フレームメモリ２２０ｓ，２２０ｍに蛍光信号Ｉｓ，Ｉｍがそれぞれ蓄積され始める。

ステップＳ１３：ＣＰＵ２２１は、フレームメモリ２２０ｓ，２２０ｍに蓄積される蛍光信号Ｉｓ，Ｉｍを読み出す。本ステップでは、蛍光信号Ｉｓ，Ｉｍが読み出されるものとする。

ステップＳ１４：ＣＰＵ２２１は、読み出された蛍光信号Ｉｓに基づき、画素毎にセクショニング係数αを算出する。このとき、例えば、図８に示すような入出力特性のルックアップテーブルが使用される。このルックアップテーブルによると、蛍光信号Ｉｓの値が大きいほどセクショニング係数αの値は小さくなり、蛍光信号Ｉｓの値が小さいほどセクショニング係数αの値は大きくなる。

ステップＳ１５：ＣＰＵ２２１は、算出したセクショニング係数αと、読み出した蛍光信号Ｉｓと、読み出した蛍光信号Ｉｍとに基づき、和信号Ｉを生成する。各画素の和信号Ｉは、その画素と共通の画素番号を持つ蛍光信号Ｉｓ，Ｉｍと、その画素と共通の画素番号を持つセクショニング係数αとにより、Ｉ＝Ｉｓ＋αＩｍで表される。

ステップＳ１６：ＣＰＵ２２１は、和信号Ｉを、表示用メモリ２２４の対応するアドレスへ書き込む。

ステップＳ１７：ＣＰＵ２２１は、制御回路２１０からの終了信号の有無により、スキャンが終了したか否かを判別する。終了していない場合はステップＳ１３へ戻って次の処理を開始し、終了した場合はフローを終了する。

以上のＣＰＵ２２１の動作によると、モニタ２３には、例えば図９（Ｄ）に示すとおり和信号Ｉ＝Ｉｓ＋αＩｍが示す画像が表示される。この画像のセクショニング係数αは、領域毎に異なり、しかも各領域のセクショニング係数αは、その領域に存在する物体の明るさに適した値を採る。以下、この画像を「適正画像」と称して詳しく説明する。

図９（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）には、適正画像（図９（Ｄ））の比較対象となる３種類の画像を示した。これら３種類の画像の適正画像との相違は、セクショニング係数αが画像内で一様という点にある。図９（Ａ）に示す画像全体のセクショニング係数αは−０．５であり、図９（Ｂ）に示す画像全体のセクショニング係数αは±０であり、図９（Ｃ）に示す画像全体のセクショニング係数αは＋１である。

ここで、図９（Ｂ）の画像に、適正な明るさの領域と、霞がかかった領域と、黒潰れした領域とが存在していたと仮定する。この場合に画像全体のセクショニング係数αを±０から１へと変更すると、例えば図９（Ｃ）に示すとおり、適正な明るさであった領域には、霞がかかり、黒潰れしていた領域は適正な明るさになる。その反対に画像全体のセクショニング係数αを±０から−０．５へと変更すると、例えば図９（Ａ）に示すとおり、適正な明るさであった領域は黒潰れし、霞がかかっていた領域は適正な明るさとなる。

本実施形態のＣＰＵ２２１がステップＳ１４で行ったのは、図９（Ｂ）に示す画像の各領域の明るさに基づき、各領域に適したセクショニング係数αを算出する処理である。例えばＣＰＵ２２１は、図９（Ｂ）に示す画像上で適正な明るさであった領域のセクショニング係数αの値を±０と算出し、図９（Ｂ）に示す画像上で霞がかかっていた領域のセクショニング係数αの値を−０．５と算出し、図９（Ｂ）に示す画像上で黒潰れしていた領域のセクショニング係数αの値を＋１と算出する。

したがって、この場合に生成される適正画像（図９（Ｄ））は、図９（Ａ）に示す画像のうち適正な明るさの領域と、図９（Ｂ）に示す画像のうち適正な明るさの領域と、図９（Ｃ）に示す画像のうち適正な明るさの領域とを互いに繋ぎ合わせたものとなる。したがって、適正画像（図９（Ｄ））は、観察視野内の各領域をそれぞれ適正な明るさで表現する。

なお、本実施形態のＣＰＵ２２１は、セクショニング係数αを画素毎に設定したが、その処理時間を短縮するために、複数の画素からなる小領域毎に設定してもよい。

また、本実施形態のＣＰＵ２２１は、適正画像の生成及び表示を蛍光信号の取得期間中にリアルタイムで行ったが、適正画像の生成及び表示を蛍光信号の取得期間の終了後に行ってもよい。或いは、その表示のみを蛍光信号の取得期間の終了後に行ってもよい。

また、本実施形態のＣＰＵ２２１は、セクショニング係数αの算出をルックアップテーブルにより行ったが計算式により行ってもよい。

また、本実施形態のＣＰＵ２２１は、生成した適正画像（又は算出したセクショニング係数αの値）をユーザからの保存指示などに応じてハードディスクドライブ２２３へ保存してもよい。その際には、その適正画像（又は算出したセクショニング係数αの値）が、同じスキャンで取得された蛍光信号Ｉｓが示す画像と、蛍光信号Ｉｍが示す画像とに対応づけられることが望ましい。

また、本実施形態のＣＰＵ２２１は、画像の各領域のセクショニング係数αを決定するに当たり、セクショニング係数αが０である画像（つまり蛍光信号Ｉｓが示す画像）の輝度分布を参照したが、セクショニング係数αが０以外である画像（例えば和信号（Ｉｓ＋Ｉｍ）が示す画像）の輝度分布を参照してもよい。

［第２実施形態］
本発明の共焦点顕微鏡装置の第２実施形態を説明する。ここでは、第１実施形態との相違点のみを説明する。相違点は、ＣＰＵ２２１の動作にある。

図１０は、本実施形態のＣＰＵ２２１の動作フローチャートである。図７に示したフローチャートとの相違点は、ステップＳ１４に代えてステップＳ２４が実行され、ステップＳ１７の後段にステップＳ２５〜Ｓ２７が実行される点にある。以下、ステップＳ２４，Ｓ２５〜Ｓ２７を説明する。

ステップＳ２４：ＣＰＵ２２１は、全画素のセクショニング係数αを１に設定する。したがって、本実施形態のスキャンによると、モニタ２３上に例えば図１１に示すような画像が表示される。この画像では全ての領域の明るさが適正になるとは限らない。ここでは、図１１に示すとおり、適正な明るさの領域と、霞がかった領域との２種類が存在しているものと仮定する。

このときモニタ２３には、画像全体のセクショニング係数αをユーザがＣＰＵ２２１へ指定するためのＧＵＩ画像（スラーダーバー１００）が表示される。画像の表示当初、セクショニング係数αは１なので、スラーダーバー１００は「低」のポジションを指している。

この状態でユーザは入力器２４を操作し、例えば図１２に示すとおり画像上に矩形枠（又は閉曲線）を描くことができる。これによって、画像上の１又は複数の任意の領域がＣＰＵ２２１へと指定される。領域が指定された場合、スラーダーバー１００は、指定された領域のセクショニング係数αをユーザがＣＰＵ２２１へ指定するためのＧＵＩ画像となる。

したがって、ユーザは、画像内でセクショニング係数αを変更すべき領域、すなわち画像内で霞がかかっている領域を指定してから、スラーダーバー１００をスライド操作すればよく、画像全体に霞がかかっていた場合は、領域を指定せずにスラーダーバー１００をスライド操作すればよい。

ステップＳ２５：ＣＰＵ２２１は、スラーダーバー１００の操作の有無に基づきセクショニング係数αが新たに指定されたか否かを判別し、新たに指定された場合にはステップＳ２６へ移行し、新たに指定されなかった場合には待機する。

ステップＳ２６：ＣＰＵ２２１は、スラーダーバー１００のスライド位置に基づきユーザが指定したセクショニング係数αを認識し、そのセクショニング係数αを使用してユーザが指定した領域内の和信号Ｉ＝Ｉｓ＋αＩｍを再生成する。なお、ＣＰＵ２２１は、その時点でユーザが領域を指定していなかった場合には、ユーザが画像全体を指定したものとみなして同様の処理を行う。

ステップＳ２７：ＣＰＵ２２１は、再生成した和信号Ｉを、表示用メモリ２２４のうち、ユーザが指定した領域に対応するアドレスに書き込み、ステップＳ２５へ戻る。

したがって、ユーザが画像上で領域を指定し、かつスラーダーバー１００をスライド操作すると、モニタ２３上の画像は、図１２に示す状態から図１３に示す状態へとリアルタイムで変化する。ユーザが領域及びセクショニング係数αを適切に指定すれば、その画像は適正画像（つまり観察視野内の暗い物体と明るい物体とをそれぞれ適正な明るさで表現する画像）となる。

なお、本実施形態のＣＰＵ２２１は、ユーザが指定した領域のセクショニング係数αをユーザに変更させ、非指定領域のセクショニング係数αを１に固定したが、ユーザからの指示に応じてその関係を反転させてもよい。このようにしておけば、画像内に著しく輝度の低い領域が多かった場合と、画像内に著しく輝度の高い領域が多かった場合との双方に対処することができる。

また、本実施形態のＣＰＵ２２１は、セクショニング係数αの異なる２種類の領域を画像内に混在させたが、セクショニング係数αの異なる３種類以上の領域を画像内に混在させてもよい。その場合、ユーザは、２種類以上の領域を指定し、それら領域の各々についてセクショニング係数αを指定することになる。

なお、本実施形態のＣＰＵ２２１は、セクショニング係数αが１である画像の生成及び表示を蛍光信号の取得期間中にリアルタイムで行ったが、その生成及び表示を蛍光信号の取得期間の終了後に行ってもよい。或いは、その表示のみを蛍光信号の取得期間の終了後に行ってもよい。

また、本実施形態のＣＰＵ２２１は、前述した適正画像（又はユーザが指定したセクショニング係数αの値）をユーザからの保存指示などに応じてハードディスクドライブ２２３へ保存してもよい。その際には、その適正画像（又はユーザが指定したセクショニング係数αの値）が、同じスキャンで取得された蛍光信号Ｉｓが示す画像と、蛍光信号Ｉｍが示す画像とに対応づけられることが望ましい。

［第３実施形態］
本発明の共焦点顕微鏡装置の第３実施形態を説明する。ここでは、第１実施形態との相違点のみを説明する。第１の相違点は、光検出器２０ｓ,２０ｍの各々が２チャンネル化され、それに対応してＩ／Ｖ変換器２１１ｓ，２１１ｍ，Ａ／Ｄ変換器２１２ｓ，２１２ｍ,フレームメモリ２２０ｓ，２２０ｍの各々が２系統化された点にある。よって、合計すると光検出器，Ｉ／Ｖ変換器，Ａ／Ｄ変換器，フレームメモリの数はそれぞれ４となる。また、第２の相違点はＣＰＵ２２１の動作にある。

図１４は、本実施形態の共焦点顕微鏡装置の光学系の構成図である。この光学系に配置される試料１０は、励起波長の異なる２種類の蛍光物質（第１の蛍光物質，第２の蛍光物質）により予め染色されており、レーザユニット１１は、第１の蛍光物質の励起波長と同じ波長のレーザ光と、第２の蛍光物質の励起波長と同じ波長のレーザ光とを照射する。

したがって、試料１０では第１の蛍光物質と第２の蛍光物質との双方が励起され、試料１０から発する蛍光には、波長の異なる２つの波長成分が含まれることになる。以下、これら２つの波長成分の一方が赤色に相当するＲ色成分であり、他方が緑色に相当するＧ色成分であると仮定する。この場合、光分離部材１９から射出する一方の蛍光ＬｓにはＲ色成分とＧ色成分とが含まれ、光分離部材１９から射出する他方の蛍光ＬｍにもＲ色成分とＧ色成分とが含まれる。

この共焦点顕微鏡装置において、光ファイバ１９ｓから射出した蛍光Ｌｓは、ダイクロイックミラー２０１ｓへ入射し、Ｒ色成分ＬｓｒとＧ色成分Ｌｓｇとに分離される。このうちＲ色成分Ｌｓｒは光検出器２０ｓｒへ入射し、蛍光信号Ｉｓｒに変換される。また、Ｇ色成分Ｌｓｇは光検出器２０ｓｇへ入射し、蛍光信号Ｉｓｇに変換される。

また、光ファイバ１９ｍから射出した蛍光Ｌｍは、ダイクロイックミラー２０１ｍへ入射し、Ｒ色成分ＬｍｒとＧ色成分Ｌｍｇとに分離される。このうちＲ色成分Ｌｍｒは光検出器２０ｍｒへ入射し、蛍光信号Ｉｍｒに変換される。また、Ｇ色成分Ｌｍｇは光検出器２０ｍｇへ入射し、蛍光信号Ｉｍｇに変換される。

以上の４種類の蛍光信号Ｉｓｒ，Ｉｓｇ，Ｉｍｒ，Ｉｍｇは、第１実施形態の２種類の蛍光信号Ｉｓ，Ｉｍが別々の経路を経て並列的に２つのフレームメモリへ蓄積されたのと同様に、別々の経路を経て並列的に４つのフレームメモリへ蓄積される。

図１５は、本実施形態のＣＰＵ２２１の動作フローチャートである。

ステップＳ１１：ＣＰＵ２２１は、ユーザから観察開始指示が入力されたか否かを判別する。入力された場合にはステップＳ１２へ進む。

ステップＳ１２：ＣＰＵ２２１は、制御回路２１０へスキャン指示を与える。これによってスキャンが開始され、フレームメモリ２２０ｓ，２２０ｍに蛍光信号Ｉｓ，Ｉｍがそれぞれ蓄積され始める。

ステップＳ１７：ＣＰＵ２２１は、制御回路２１０からの終了信号の有無により、スキャンが終了したか否かを判別する。終了していない場合は待機し、終了した場合はステップＳ３３へ移行する。

ステップＳ３３：ＣＰＵ２２１は、スキャンによって４つのフレームメモリに蓄積された１フレーム分の蛍光信号Ｉｓｒ，１フレーム分の蛍光信号Ｉｓｇ，１フレーム分の蛍光信号Ｉｍｒ，１フレーム分の蛍光信号Ｉｍｇを読み出す。

ステップＳ３４：ＣＰＵ２２１は、読み出された蛍光信号Ｉｓｒ，Ｉｓｇに基づき、Ｒ色成分のセクショニング係数αｒとＧ色成分のセクショニング係数αｇとを算出する。Ｒ色成分のセクショニング係数αｒは、蛍光信号Ｉｓｒのフレーム内平均値に基づき算出され、Ｇ色成分のセクショニング係数αｇは、蛍光信号Ｉｓｇのフレーム内平均値に基づき算出される。

その平均値とセクショニング係数との関係は、第１実施形態における蛍光信号Ｉｓとセクショニング係数αとの関係（図８参照）と同じである。よって、本ステップでも第１実施形態で使用したのと同じ入出力特性を有したルックアップテーブルが使用される。

ステップＳ３５：ＣＰＵ２２１は、算出したＲ色成分のセクショニング係数αｒと、読み出した蛍光信号Ｉｓｒと、読み出した蛍光信号Ｉｍｒとに基づき、Ｒ色成分の和信号Ｉｒ＝Ｉｓｒ＋αｒ・Ｉｍｒを生成する。また、ＣＰＵ２２１は、算出したＧ色成分のセクショニング係数αｇと、読み出した蛍光信号Ｉｓｇと、読み出した蛍光信号Ｉｍｇとに基づき、Ｇ色成分の和信号Ｉｇ＝Ｉｓｇ＋αｇ・Ｉｍｇを生成する。そして、ＣＰＵ２２１は、生成した２種類の和信号Ｉｒ，Ｉｇから和信号Ｉを生成する。和信号Ｉは、Ｒ色成分及びＧ色成分のみからなる２色カラーの色信号である。和信号ＩのＲ色成分には和信号Ｉｒの値が付与され、和信号ＩのＧ色成分には和信号Ｉｇの値が付与される。

ステップＳ３６：ＣＰＵ２２１は、生成した和信号Ｉを表示用メモリ２２４の所定領域へ書き込み、フローを終了する。

以上のＣＰＵ２２１の動作によると、モニタ２３には、例えば図１６（Ｄ）に示すとおり和信号Ｉが示す画像が表示される。なお、図１６では、画像が２つの色成分を有していることを示すために、Ｒ色成分とＧ色成分とをオーバーラップさせて描いた（Ｒ色成分が手前）。

この画像のセクショニング係数αは、色成分毎に異なり、しかも各色成分のセクショニング係数αｒ，αｇは、その色成分に対応する物体の明るさに適した値を採る。以下、この画像を「適正画像」と称して詳しく説明する。

図１６（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）には、適正画像（図１６（Ｄ））の比較対象となる３種類の画像を示した。これら３種類の画像の適正画像との相違は、セクショニング係数αがＧ色成分とＲ色成分との間で共通という点にある。図１６（Ａ）に示す画像のセクショニング係数αｒ，αｇは何れも−０．５であり、図１６（Ｂ）に示す画像のセクショニング係数αｒ，αｇは何れも±０であり、図１６（Ｃ）に示す画像のセクショニング係数αｒ，αｇは何れも＋１である。

ここで、図１６（Ｂ）の画像のＲ色成分は適正な明るさであり、Ｇ色成分は黒潰れしていたと仮定する。この場合にセクショニング係数αｒ，αｇの双方を±０から１へと変更すると、例えば図１６（Ｃ）に示すとおり、適正な明るさであったＲ色成分には霞がかかり、黒潰れしていたＧ色成分は適正な明るさになる。その反対に、セクショニング係数αｒ，αｇの双方を±０から−０．５へと変更すると、例えば図１６（Ａ）に示すとおり、適正な明るさであったＲ色成分が黒潰れする。

本実施形態のＣＰＵ２２１がステップＳ３４で行ったのは、図１６（Ｂ）に示す画像の各色成分の明るさに基づき、各色成分に適したセクショニング係数αｒ，αｇを算出する処理である。例えばＣＰＵ２２１は、図１６（Ｂ）に示す画像上で適正な明るさであったＲ色成分のセクショニング係数αｒの値を±０と算出し、図１６（Ｂ）に示す画像上で黒潰れしていたＧ色成分のセクショニング係数αｇの値を＋１と算出する。

したがって、この場合に生成される適正画像（図１６（Ｄ））は、図１６（Ｂ）に示す画像の適正な明るさの色成分（Ｒ色成分）と、図１６（Ｃ）に示す画像の適正な明るさの色成分（Ｇ色成分）とを互いに重ね合わせたものとなる。したがって、適正画像（図１６（Ｄ））は、観察視野のＲ色成分及びＧ色成分をそれぞれ適正な明るさで表現する。

なお、本実施形態のＣＰＵ２２１は、セクショニング係数αの算出をルックアップテーブルにより行ったが計算式により行ってもよい。

また、本実施形態のＣＰＵ２２１は、セクショニング係数αを画像の色成分毎に設定したが、画像の色成分毎かつ領域毎に設定してもよい。つまり、本実施形態に第１実施形態を組み合わせてもよい。その場合、適正画像の生成及び表示を蛍光信号の取得期間中にリアルタイムで行ってもよい。

また、本実施形態のＣＰＵ２２１は、画像のＲ色成分のセクショニング係数αｒを決定するに当たり、セクショニング係数αｒが０である画像（つまり蛍光信号Ｉｓｒが示す画像）の平均輝度を参照したが、セクショニング係数αｒが０以外である画像（例えば和信号（Ｉｓｒ＋Ｉｍｒ）が示す画像）の平均輝度を参照してもよい。

また、本実施形態のＣＰＵ２２１は、画像のＧ色成分のセクショニング係数αｇを決定するに当たり、セクショニング係数αｇが０である画像（つまり蛍光信号Ｉｓｇが示す画像）の平均輝度を参照したが、セクショニング係数αｇが０以外である画像（例えば和信号（Ｉｓｇ＋Ｉｍｇ）が示す画像）の平均輝度を参照してもよい。

また、本実施形態のＣＰＵ２２１は、生成した適正画像（又は算出したセクショニング係数αｒ，αｇの値）をユーザからの保存指示などに応じてハードディスクドライブ２２３へ保存してもよい。その際には、その適正画像（又は算出したセクショニング係数αｒ，αｇの値）が、同じスキャンで取得された蛍光信号Ｉｓｒが示す画像、蛍光信号Ｉｓｇが示す画像、蛍光信号Ｉｍｒが示す画像、蛍光信号Ｉｍｇが示す画像に対応づけられることが望ましい。

また、本実施形態のＣＰＵ２２１は、各色成分のセクショニング係数αｒ，αｇを自動的に決定したが、少なくとも１つの色成分のセクショニング係数をユーザに指定させてもよい。つまり、前述した第２実施形態は第１実施形態の変形例であったが、本実施形態を同様に変形してもよい。

また、本実施形態の顕微鏡装置のチャンネル数は２であったが、３以上に増やしてもよい。その場合は、画像の色成分が増えるので、個別に設定すべきセクショニング係数もその分だけ増える。

Claims (12)

1. 光源と、
   前記光源からの光を試料に集光する照明光学系と、
   前記試料からの光を集光する集光光学系と、
   前記集光光学系の集光位置に配置され、入射する光を少なくとも前記試料の前記集光点の近傍からの光と、その周辺からの光とに分離し、それぞれ検出する検出手段と、
   前記検出手段から出力される前記集光点の近傍からの光の信号と、前記周辺からの光の信号とを演算処理して前記試料の画像を生成すると共に、前記集光点の近傍からの光の信号と前記周辺からの光の信号との比率を前記画像の領域毎にそれぞれ設定する画像生成手段と、
   を備えることを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
2. 請求項１に記載の共焦点顕微鏡装置において、
   前記画像生成手段は、
   前記設定された前記比率に応じて、前記集光点の近傍からの光の信号と前記周辺からの光の信号との和の演算又は差の演算を行う
   ことを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
3. 請求項１又は請求項２に記載の共焦点顕微鏡装置において、
   前記画像生成手段は、
   前記集光点の近傍からの光の信号に基づいて前記比率を設定する
   ことを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
4. 請求項１〜請求項３の何れか一項に記載の共焦点顕微鏡装置において、
   前記画像生成手段は、
   前記領域毎に前記比率を設定しながら、順次、前記画像を生成する
   ことを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
5. 請求項１に記載の共焦点顕微鏡装置において、
   前記画像生成手段は、
   前記集光点の近傍からの光の信号と前記周辺からの光の信号とをそれぞれ記憶する記憶手段を備え、前記記憶手段内において前記領域毎に前記比率を設定する
   ことを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
6. 請求項５に記載の共焦点顕微鏡装置において、
   前記画像生成手段は、
   前記領域毎の前記比率の設定を、ユーザからの指示に応じて行う
   ことを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
7. 光源と
   前記光源からの光を試料に集光する照明光学系と、
   前記試料からの光を集光する集光光学系と、
   前記集光光学系の集光位置に配置され、入射する光を少なくとも前記試料の前記集光点の近傍からの光と、その周辺からの光とに分離し、それぞれを波長成分に分光すると共に、それぞれを前記波長成分毎に検出する検出手段と、
   前記検出手段から出力される前記波長成分毎の前記集光点の近傍からの光の信号と、前記波長成分毎の前記周辺からの光の信号とを演算処理して前記試料の画像を前記波長成分毎に生成すると共に、前記集光点の近傍からの光の信号と前記周辺からの光の信号との比率を、前記波長成分毎の前記画像の領域毎にそれぞれ設定する画像生成手段と、
   を備えることを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
8. 請求項７に記載の共焦点顕微鏡装置において、
   前記画像生成手段は、
   前記設定された前記比率に応じて、前記集光点の近傍からの光の信号と前記周辺からの光の信号との和の演算又は差の演算を行う
   ことを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
9. 請求項７又は請求項８に記載の共焦点顕微鏡装置において、
   前記画像生成手段は、
   前記比率を前記集光点の近傍からの光の信号に基づいて設定する
   ことを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
10. 請求項７〜請求項９の何れか一項に記載の共焦点顕微鏡装置において、
    前記画像生成手段は、
    前記領域毎に前記比率を設定しながら、順次、前記画像を生成する
    ことを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
11. 請求項７に記載の共焦点顕微鏡装置において、
    前記画像生成手段は、
    前記集光点の近傍からの光の信号と前記周辺からの光の信号とをそれぞれ記憶する記憶手段を備え、前記記憶手段内において前記領域毎に前記比率を設定する
    ことを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
12. 請求項１１に記載の共焦点顕微鏡装置において、
    前記画像生成手段は、
    前記領域毎の前記比率の設定を、ユーザからの指示に応じて行う
    ことを特徴とする共焦点顕微鏡装置。

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