JP2005331889A - 蛍光顕微鏡及び蛍光観察方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】励起光の照射による褪色や損傷を回避するよう使用者に警告を発する蛍光顕微鏡等を提供する。
【解決手段】観察対象である試料に蛍光色素を導入し、光学系に配置して励起光を照射し、該励起光によって励起されて発される蛍光を受光して蛍光像を結像する蛍光顕微鏡は、試料に照射する励起光を発する励起光源と、励起光源が照射する励起光の照射時間を計時する計時部と、計時部で計時された計時時間が、所定の基準値を超えたかどうかを判定するための判定部と、判定部に制御されて、励起光源から試料に照射される励起光を低減するための警告動作を行う警告部とを備える。これにより、蛍光顕微鏡の操作者は警告の有無によって基準値を超える励起光が照射されたか否かを判別することができ、励起光過多による試料への悪影響を回避し得る。
【選択図】図1
【解決手段】観察対象である試料に蛍光色素を導入し、光学系に配置して励起光を照射し、該励起光によって励起されて発される蛍光を受光して蛍光像を結像する蛍光顕微鏡は、試料に照射する励起光を発する励起光源と、励起光源が照射する励起光の照射時間を計時する計時部と、計時部で計時された計時時間が、所定の基準値を超えたかどうかを判定するための判定部と、判定部に制御されて、励起光源から試料に照射される励起光を低減するための警告動作を行う警告部とを備える。これにより、蛍光顕微鏡の操作者は警告の有無によって基準値を超える励起光が照射されたか否かを判別することができ、励起光過多による試料への悪影響を回避し得る。
【選択図】図1
Description
本発明は、試料の蛍光像を撮像して表示する機能を備えた蛍光顕微鏡及び蛍光観察方法に関する。
従来より、細胞の微細構造や分子の局在等を観察するために、蛍光顕微鏡やレーザ顕微鏡が使用されている。蛍光顕微鏡では、試料内の注目する特定の分子に特異的に結合する蛍光分子(蛍光プローブ等と呼ばれ、例えば注目するタンパク質の抗体に蛍光分子を共有結合させたものなどが使用される)を付けて、この分子の分布や動きを観察する。落射蛍光顕微鏡の一例を、図9に基づいて説明する。落射照明は、光源光を対物レンズ950を通して照射し、試料Wからの蛍光をその対物レンズ950を通して観察する照明法である。照明光(励起光)と観察光(蛍光)が対物レンズ950の同じ光路を使用し、対物レンズ950はコンデンサを兼用している。図9において、落射照明による観察を実現する構成を達成するために、落射蛍光顕微鏡はダイクロイックミラー914を用いている。ダイクロイックミラー914は一般にダイクロイックキューブ(フィルタセット)と呼ばれる箱状体に、励起フィルタ912と吸収(バリア)フィルタ916と共にセットされている。光源の照射光は、まず励起フィルタ912で余分な波長の光がカットされ、使用する蛍光染料の蛍光分子が吸収する波長の光のみ通過させる。これによって観察の障害となる背景光が減衰される。この励起光は光軸に対して約45°に傾いたダイクロイックミラー914で直角に反射されて対物レンズ950を通して試料Wに到達する。試料Wから発する蛍光は、励起光と逆向きに進んで対物レンズ950を通してダイクロイックミラー914に到着する。ダイクロイックミラー914は、特定波長以下の光を反射して、それ以上長い波長の光を通過する性質を持つので、蛍光はこのミラーを透過する。蛍光を通過した後に、吸収フィルタ916により、注目する蛍光以外の波長をカットし、背景ができるだけ暗くなるようにした後、経過光を接眼レンズ9に導く(特許文献1参照)。ここで、試料に導入される蛍光色素とフィルタの組み合わせとして、代表的な蛍光色素とその励起フィルタ、吸収フィルタの組み合わせの一覧を図10に示す。図10において、蛍光色素の試薬名(通称)とその励起光の波長、および吸収光の波長を、帯域中の主要なピーク値で示している。
このような蛍光観察においては、蛍光像は極めて微弱な光であるため、必要な蛍光を得るために非常に強い励起光を試料に照射する必要がある。しかしながらこの場合、褪色しやすい試料の場合には励起光によって蛍光褪色が早くなるばかりか、生きた試料の場合には試料に対するダメージも大きくなるという欠点がある。一般には、励起光の照射時間に応じて徐々に蛍光強度の減衰(褪色)が見られ、蛍光していない部分(バックグラウンド)とのコントラストが低下していき、蛍光像が正しく撮影できなくなってしまう。特に生きている培養細胞を、タイムラプス撮影と呼ばれる長時間の経時観察をする場合は、励起光を照射しすぎると細胞自体がダメージを受けて褪色したり死滅してしまうことがある。したがって、褪色や損傷から試料を保護するため、励起光の照射には十分な配慮が必要となるが、従来はどの程度まで励起光を照射することができるのか、使用者側で判断することが困難であった。
特開2000−227556号公報
本発明は、従来のこのような問題点を解決するためになされたものである。本発明の主な目的は、励起光の照射による褪色や損傷を回避し得る蛍光顕微鏡及び蛍光観察方法を提供することにある。
上記の目的を達成するために、本発明の蛍光顕微鏡は、観察対象である試料に蛍光色素を導入し、光学系に配置して励起光を照射し、該励起光によって励起されて発される蛍光を受光して蛍光像を結像する蛍光顕微鏡であって、試料に照射する励起光を発する励起光源と、励起光源が照射する励起光の照射時間を計時する計時部と、計時部で計時された計時時間が、所定の基準値を超えたかどうかを判定するための判定部と、判定部に制御されて、励起光源から試料に照射される励起光を低減するための警告動作を行う警告部とを備える。これによって、蛍光顕微鏡の操作者は警告の有無によって基準値を超える励起光が照射されたか否かを判別することができ、励起光過多による試料への悪影響を回避し得る。
また本発明の他の蛍光顕微鏡は、警告部が、励起光源から試料に照射される励起光の光路に配置され、試料に照射される励起光を遮断可能な遮断部を備えており、判定部の判定結果に基づき、遮断部によって強制的に励起光を遮断するよう構成されている。これによって、励起光が基準値を超えると遮断部によって自動的に励起光が遮断されるため、確実に試料が励起光過多から保護される。
さらに本発明の他の蛍光顕微鏡は、警告部が、励起光のレベルが基準値以上に達したことを警告するための警告表示部を備えており、判定部の判定結果に基づき、警告表示部が音声または/及び文字表示によって警告を発し、励起光を低減するための処置を促すよう構成している。これによって、励起光が基準値を超えると使用者にその旨が告知されるので、必要な措置を講じることができ試料の保護が図られる。
さらにまた本発明の他の蛍光顕微鏡は、計時部が励起光の連続照射時間を計時する。これによって、励起光の連続照射時間が自動的に計算され、基準値を超えると警告が得られるため、確実に試料の保護が図られる。
さらにまた本発明の他の蛍光顕微鏡は、計時部が励起光の累積照射時間を演算する。これによって、励起光の累積時間によって試料への影響を推測できるので、蛍光観察の度に面倒な観測時間の記録や加算を行う必要もなく、使い勝手のよい蛍光顕微鏡が実現される。
さらにまた本発明の他の蛍光顕微鏡は、さらに観察対象の試料を特定する試料特定部を備えており、試料特定部で特定された試料毎に、計時部が累積照射時間の演算を行う。これにより、試料毎に累積照射時間を演算できるので、複数の試料を観察する場合であっても各試料毎に励起光の影響を把握して確実な褪色防止や試料保護を図ることが可能となる。
さらにまた本発明の他の蛍光顕微鏡は、さらに試料の観察条件を入力するための観察条件指定部を備えており、観察条件指定部から入力された観察条件に従って、判定部が所定の基準値を設定するよう構成されている。これにより、観察条件に従って適切な励起光許容値の基準を演算でき、試料に応じた基準値を自動で設定して使い勝手のよい蛍光顕微鏡とできる。
さらにまた本発明の他の蛍光顕微鏡は、所定の基準値を設定するための観察条件が、試料に導入される蛍光色素の種類及び/又はpH濃度である。これにより、観察条件のパラメータとして蛍光色素の種類やpH濃度に応じて適切な励起光許容値の基準を演算でき、観察条件に応じた基準値を自動で設定して使い勝手のよい蛍光顕微鏡とできる。
さらにまた本発明の他の蛍光顕微鏡は、観察対象である試料に蛍光色素を導入し、光学系に配置して励起光を照射し、該励起光によって励起されて発される蛍光を受光して蛍光像を結像する蛍光顕微鏡であって、試料に照射する励起光を発する励起光源と、励起光源が照射する励起光の照射時間を計時する計時部と、計時部で計時された計時時間を表示するための表示部とを備える。これによって、使用者は励起光の照射時間を表示部で確認できるので、照射時間の経過に応じて励起光照射を中止、低減するなど必要な措置を講じることができる。
また、本発明の蛍光観察方法は、観察対象である試料に蛍光色素を導入し、光学系に配置して励起光を照射し、該励起光によって励起されて発される蛍光を受光して蛍光像を結像する蛍光顕微鏡を用いた蛍光観察方法であって、試料の観察条件を指定するステップと、指定された観察条件に基づいて所定の基準値を設定するステップと、励起光源で試料に励起光の照射を開始した時点から照射時間を計時するステップと、計時された照射時間が所定の基準値を超えたか否かを判定し、超えたと判定した場合に警告動作を行うステップとを有する。これにより、蛍光顕微鏡の操作者は警告の有無によって基準値を超える励起光が照射されたか否かを判別することができ、励起光過多による試料への悪影響を回避し得る。
本発明の蛍光顕微鏡及び蛍光観察方法によれば、長時間にわたって強い励起光を照射した結果試料の褪色や試料自体の損傷が生じる事態を効果的に阻止できる。それは、本発明の蛍光顕微鏡及び蛍光観察方法が、励起光の照射時間を計時することにより、試料に影響を与える照射時間を使用者に告知して警告することができるからである。したがって使用者は、励起光照射時間から試料の状態を把握でき、これに応じて必要な措置を講じることにより適切な試料の保護を図ることができる。
以下、本発明の実施の形態を図面に基づいて説明する。ただし、以下に示す実施の形態は、本発明の技術思想を具体化するための蛍光顕微鏡及び蛍光観察方法を例示するものであって、本発明は蛍光顕微鏡及び蛍光観察方法を以下のものに特定しない。特に本明細書は、特許請求の範囲に示される部材を、実施の形態の部材に特定するものでは決してない。なお、各図面が示す部材の大きさや位置関係等は、説明を明確にするため誇張していることがある。さらに以下の説明において、同一の名称、符号については同一もしくは同質の部材を示しており、詳細説明を適宜省略する。さらに、本発明を構成する各要素は、複数の要素を同一の部材で構成して一の部材で複数の要素を兼用する態様としてもよいし、逆に一の部材の機能を複数の部材で分担して実現することもできる。
図1に、本発明の一実施の形態に係る蛍光顕微鏡のブロック図を示す。なお以下の例では、蛍光顕微鏡を用いて、試料W(標本、検体、サンプル等とも呼ばれる)に複数の蛍光染料(蛍光色素)を導入して多色で染色、発現させる多色蛍光観察を行う例について説明する。この図に示す蛍光顕微鏡100は、励起光源48、コレクタレンズ54、フィルタセット1、対物レンズ50、結像レンズ52、撮像部22、遮断部72を備える。これらの部材は一定の光路上に配置される。励起光源48は蛍光染料を励起する励起光を発する。例えば高圧水銀ランプや高圧キセノンランプなどが用いられる。これらは、幅広い波長の光を放出する。また励起光源48として、低消費電力で小型、高効率の発光ダイオードを用いることもできる。また励起光源などの部材はユニット化し、ユニットを組み合わせて蛍光顕微鏡システムを構成することもできる。これらの励起光源48からの照明光は、コレクタレンズ54でほぼ平行な光束にされてフィルタセット1に励起光として導入される。コレクタレンズ54は、落射照明の場合蛍光落射照明レンズ等が利用できる。なお以下の例では試料の照明を落射照明型とするが、同様に透過型照明や全反射照明型等他の照明方法についても本発明は適用可能である。また図1の例では撮像部22のみを図示し、目視用の接眼レンズを設けていないが、目視用の機構を設けることもできることはいうまでもない。この場合ミラー等を利用して結像レンズを経た蛍光を選択的に切り替え、反射、分岐させることができる。
フィルタセット1は、特定の蛍光染料の観察に適した波長の光を選択的に透過するシングルパスのフィルタおよびミラーの組み合わせであり、図に示すように励起フィルタ12と吸収フィルタ16とダイクロイックミラー14を備える。さらにフィルタセット1は、複数種類が切り替え可能に構成されている。各フィルタセット1は、使用する蛍光染料に応じた励起フィルタ12と吸収フィルタ16とダイクロイックミラー14の組み合わせからなり、これらを切り替えることでそれぞれ異なる単色画像を撮像できる。複数のフィルタセット1はフィルタホルダ56にセットされ、フィルタ切替部18で切り替えられる。フィルタセット1の励起フィルタ12で選択された励起光はダイクロイックミラー14で反射され、対物レンズ50を通過して試料Wに投射される。対物レンズ50は、コンデンサレンズを兼用している。対物レンズ50は観察目的に応じて交換可能であり、ネジ式などにより脱着式に、あるいはレボルバ等で複数の対物レンズ50を切り替え可能に構成できる。
(暗室空間46)
(暗室空間46)
試料Wは、試料載置部28に載置される。一般に蛍光試料などの微弱光試料の観察は、外乱光を排除する必要があるため暗室で行われる。本実施の形態に係る蛍光顕微鏡100は、試料載置部28および光学系10の光路を外乱光から遮断された暗室空間46内に配置し、この暗室空間46を暗室状態とすることにより、暗室を用意することなく蛍光観察を行え、使い勝手を改善している。試料載置部28はXYステージなどが利用でき、X軸、Y軸方向に移動可能である。また試料載置部28は上下方向(Z軸方向)にも移動可能とすることにより、光学系10との相対距離を変化させてフォーカスの調整を可能としている。
図1において、試料Wに含まれる蛍光染料の内、照射された励起光に対応する蛍光染料が蛍光を発し、この蛍光が対物レンズ50を通過してフィルタセット1に入射され、ダイクロイックミラー14を通過する。このようにダイクロイックミラー14は、照明光を反射して蛍光を透過する。さらに吸収フィルタ16で蛍光を通過し、照明光等蛍光以外の光成分を選択的に吸収する。吸収フィルタ16はバリアフィルタとも呼ばれ、ダイクロイックミラー14よりも蛍光像の形成面側に配置される。フィルタセット1を出た光は結像レンズ52を通過して撮像部22に入射される。撮像部22は対物レンズ50の焦点面と共役な位置に配置される。この撮像部22は蛍光を電気信号に変換し、この信号に基づいて画像が生成され、表示部24にて表示される。このため撮像部22は撮像素子で構成され、CCDカメラ等の半導体撮像素子が好適に利用できる。CCDカメラは2次元上に配列されており、レーザ顕微鏡のように画面を順次走査することなく一画面を同時に撮像できる。CCDカメラは冷却することでノイズ特性を向上できるので、ペルチエ素子や液体窒素等で冷却する機構を備えるCCDカメラを使用してもよい。以上のように蛍光顕微鏡は、シングルパスのフィルタセット1をフィルタ切替部18によって自動で切り替えでき、各フィルタセット1で撮像した単色画像と、これらを重ね合わせた重ね合わせ画像を、同時に表示できる。
(遮断部72)
(遮断部72)
さらに蛍光顕微鏡は、撮像部22に連結されて制御部26と遮断部72を備える。制御部26は外部接続機器であるコンピュータおよび表示部と接続されている。励起光源とコレクタレンズとの間には、遮断部72が設けられる。遮断部72は、励起光源から出射される励起光の光路上に配置されており、出射光路に挿入されると強制的に励起光を遮断する。この遮断部72はシャッタ式、開閉式等の構成により励起光を選択的に通過、遮断させるよう開放位置と遮断位置を切り替え可能である。遮断部72は制御部26によって制御され、開放/遮断を切り替えるモータの動作を制御部26は制御する。遮断部72は、一般に励起条件や観察条件を変更する際に、励起光を遮断し、励起フィルタ、ダイクロイックミラー、吸収フィルタを切り換えた後に再び励起光を照射するよう開放される。なお図1の例では、遮断部72は励起光源とコレクタレンズとの間に配置されているが、この例に限られず例えばコレクタレンズとフィルタセットの間に遮断部を配置することもできる。
(制御部26)
(制御部26)
制御部26は、励起光源が照射する励起光の照射時間を計時し、所定の基準値を超えたかどうかを判定し、判定結果に応じて警告動作を行う。すなわち、試料に対して励起光が照射されている間の時間を計測しておき、一定期間(基準値)連続して励起し続けている場合、あるいは同一の試料に対して励起光が照射された累積時間が基準値を超えた場合に、警告動作を行う。このため制御部26は、計時部として計時を行うタイマを備えている。励起光の照射が開示されるとタイマで計時を開始し、励起光の連続的な照射時間を計時する。また励起光照射が停止されると計時を停止する。これにより、連続的な照射時間のみならず、離散的な照射の累積時間も計時できる。
(試料特定部)
(試料特定部)
さらに、制御部26は試料毎に励起光照射時間を計時できる。例えば複数の試料を切り替えて、あるいは交換して蛍光観察する場合に、試料毎に励起光の照射時間を記憶しておくことにより、各試料の状態を正確に把握することができる。試料の特定は、試料特定部により行われる。例えば、使用者が試料を切り替える毎に試料の切り替えを手動で指示する方法や、蛍光顕微鏡側で自動的に試料の切り替えを検知して、切り替えられた試料を特徴に基づいて判別して、判別された試料毎に照射時間を保持する。試料の自動判別に利用する特徴量としては、試料の形状の画像認識や蛍光の輝度、波長などが利用できる。また試料の切り替えは、例えば試料を蛍光顕微鏡に挿入するパネルの開閉を検出したり、試料裁置部に裁置される試料をセットしたプレパラートの交換をセンサなどで検出したり、試料裁置部の初動動作検出、あるいは使用者が手動で試料の切り替えを指示する等の方法が利用できる。このように、試料の自動判別を行う場合は、蛍光顕微鏡が試料の切り替えを検出すると、試料の特徴量の検出を行って試料を判別する。試料特定部は、制御部26によって実現される。なお制御部26はマイクロプロセッサ(MPU)やCPU、LSI、FPGAやASIC等のゲートアレイで実現できる。図1において制御部26は、請求項の計時部、判定部、試料特定部に対応する。なお、蛍光顕微鏡に外部接続された外部接続機器であるコンピュータにこれら計時部、判定部、試料特定部等の機能を実行させることもできる。
(基準値)
(基準値)
次に、試料に応じた励起光の照射時間の基準値を決定する。基準値は、試料に導入する蛍光色素の強度やpH濃度等の観察条件に依存する。そこで、本実施の形態においては観察条件指定部から予め観察条件を指定し、指定された観察条件に従って基準値を設定する。なお基準値は、励起光の連続照射時間又は/及び累積照射時間を計時して、基準値に至ったか否かを判定する。ただ、励起光の連続照射時間と累積照射時間を個別に指定することもできる。計時部で連続照射時間および累積照射時間の双方を個別に計時しておき、いずれか一方が対応する基準値を超えた時点で警告動作を行う。なお、計時部で連続照射時間または累積照射時間のいずれか一方のみを計時し、計時された照射時間に対応する基準値の判定を行う構成とすることもできる。この場合、使用者は予め連続照射時間または累積照射時間のいずれをモニタするかを指定する。また、いずれか一方のみの計時が可能な蛍光顕微鏡とすることもできる。
(観察条件指定部)
(観察条件指定部)
観察条件指定部は、使用者が蛍光観察条件のパラメータを指定する。この例では、試料に導入される蛍光色素の種類及び/又はpH濃度である。この指定に基づいて、適切な励起光照射時間の基準値を制御部26で決定する。決定方法は、予め観察条件のパラメータの組み合わせに応じた基準値を規定したルックアップテーブルを制御部26に記憶しておき、指定された観察条件からテーブルに基づいて基準値を決定する。これにより、観察条件に応じた基準値を自動で設定して使い勝手のよい蛍光顕微鏡とできる。図1の例では、外部接続機器であるコンピュータの入力デバイスが観察条件指定部に対応する。
なお観察条件指定部は、使用者が指定する他、蛍光顕微鏡側で自動的に観察条件を検出する構成としてもよい。例えば使用される蛍光色素の強度やpH濃度を蛍光顕微鏡が検出し、これに応じて蛍光観察条件を判別して、さらにこの蛍光観察条件に基づいて基準値を演算する。この構成では、蛍光顕微鏡がすべて自動で必要な条件設定から演算を行ってくれるので、使用者はこれらを意識することなく、初心者でも扱い易い励起光照射時間警告機能付き蛍光顕微鏡とできる。また、蛍光顕微鏡による自動検出と使用者による手動指定を適宜組み合わせることもできる。例えば、検出される蛍光色から蛍光顕微鏡が自動的にその波長を演算し、これに基づいて蛍光色素を類推して表示部に一覧表示させる。使用者は、この一覧中から適切な蛍光色素を選択する。これによって誤検出を回避してより確実かつ正確な観察条件の指定、試料の特定および基準値の選択を行える。
(警告動作)
(警告動作)
設定された基準値を、制御部26で計時された照射時間の連続照射時間や累積時間が超えると、制御部26は警告動作を行うよう指示する。ここで警告動作としては、基準値を超えたことを表示部上にメッセージで表示したり、音声ガイダンスや警告音、光の点滅、個別の部材として設けられた警告インジケータの動作、あるいはこれらの組み合わせが挙げられる。警告動作の一例として、表示部に表示される警告メッセージの例を図2に示す。例えば連続照射時間が基準値を超えた場合、図2(a)に示すように警告メッセージ74として「励起光の連続照射時間が○○分を超えました」等と表示し、また累積照射時間が基準値を超えた場合も同様に図2(b)に示すように警告メッセージ74Bとして「励起光の累積照射時間が○○分を超えました」等と表示する。これによって、ユーザは励起光の照射が限界に近づいたことを認識できるので、蛍光観察の早期終了や中止、励起光の照射停止など、必要な措置を講じることができる。また、遮断部72を閉塞して励起光の照射を強制的に停止させることもできる。これによって、試料を確実に保護できる。このように励起光照射時間の計時によって試料の状態を把握することができるので、使用者は試料の褪色を可能な限り抑制するように、最低限必要なピントあわせ、視野あわせ、撮影以外の無駄な励起光照射時間を可能な限り短くするよう操作する。
(経過時間の表示)
(経過時間の表示)
さらに、所定の基準値に達した場合に警告を与える構成とする以外にも、励起光照射の連続時間・累積時間を表示部に表示させることもできる。この実施の形態に係る表示部の表示例を図3に示す。図3(a)では、表示部24に照射時間表示部76として、計時部で計時された照射時間を表示すると共に、基準時間を「警告時間」として併記している。これにより、使用者は現在の励起光の状態を把握できる。また、基準時間に達するまでの残り時間を表示させてもよい。さらに図3(b)の例では、照射時間表示部76Bとして、数値に代わってグラフ表示で照射時間を表示している。この例では照射時間表示部76Bをレベルメータ状として照射時間を表示し、さらに基準値に相当する位置には三角形等のマークやラインを表示し、かつ基準値を超えた領域では赤色に変更するなどして、基準値との関係を視覚的に表現している。このようにレベルメータやインジケータの状態で経過時間を表示することにより、視覚的に試料へのダメージ状態を認識できる。またこれらの表示はリアルタイムに更新する他、一定の時間間隔で更新することもできる。さらに上記の数値表示とグラフ表示を組み合わせることも可能であることはいうまでもない。さらにまた、経過時間の表示と警告動作とを組み合わせてもよい。例えば、照射時間が基準値に達した時点で、図3(a)、(b)のような表示を行ってもよい。このように経過時間を常時表示させることで、使用者は試料の状態を常に把握できる。一般に、試料に導入される蛍光色素は暗く、時間経過による褪色が生じ易いので、迅速な作業が要求される。このため、照射時間の経過や所定の基準値を超えたことを使用者に告知することで、使用者は試料の状態を危険レベルとの相対関係で把握でき、褪色や試料へのダメージを配慮しつつ蛍光観察を行うことができる。
以下、上記蛍光顕微鏡を用いて警告動作を行う蛍光観察方法を、図4に示すフローチャートに基づいて説明する。まず初期化を行った後、ステップS1で制御部26が基準値を演算する。具体的には、観察条件指定部で観察条件を指定し、指定された観察条件に基づいて制御部26が基準値を選択する。さらに、複数の試料に対して試料毎に照射時間を記録する場合は、試料特定部が試料の特定を行う。次に、指定された観察条件において励起光の照射が開始されると、ステップS2で計時部のタイマが計時を開始する。そしてステップS3で、計時時間が基準値に達したか否かを制御部26は判定する。基準値に達していない場合は、ステップS3をループする。そして基準値に達した時点でステップS4に進み、警告メッセージの表示や励起光の遮断など、所定の警告動作を行う。
(フィルタセット1)
(フィルタセット1)
フィルタセット1は、一般にダイクロイックキューブと呼ばれる箱状体に、励起フィルタ12と吸収フィルタ16とダイクロイックミラー14の組を含んでいる。フィルタセット1は、試料Wに導入する蛍光染料に応じて励起フィルタ12、ダイクロイックミラー14、吸収フィルタ16の組み合わせが決定される。蛍光染料で発現される色のみが正しく観察できるように、所望の波長成分の光を抽出し他の波長成分を排除するよう、シングルパスのバンドパスフィルタの組み合わせが決定される。したがって、使用される蛍光染料に応じて、使用されるフィルタセット1は決定される。一般には各々蛍光色の異なるフィルタセット1が使用され、例えばRGB、CMYなど、蛍光色素に応じた色の組み合わせが適宜採用できる。ここで、フィルタセットと蛍光色素の組み合わせは、蛍光色素とその励起光、蛍光波長によって決定され、図10に示す一覧等に基づいて蛍光観察に応じて適宜選択される。複数のフィルタセット1はフィルタ切替部18により切り替え可能に構成されている。複数のフィルタセット1はフィルタホルダ56にセットされ、フィルタ切替部18により複数のフィルタセット1のいずれか一を光路上にセットさせる。フィルタ切替部18は、モータなどの駆動により回転式あるいはスライド式にフィルタセット1を切り替えるターレットなどが利用できる。フィルタ切替部18の制御は切替設定部20により設定される。フィルタセット1を使用して必要な組の励起フィルタ12、吸収フィルタ16、ダイクロイックミラー14を一括して切り替えることができ、切り替え動作部分を一箇所にまとめて高速動作やメンテナンスを容易にすることができる。ただ、励起フィルタ、吸収フィルタ、ダイクロイックミラーが組になったフィルタセットを使用することなく、複数の励起フィルタ、吸収フィルタ、ダイクロイックミラーをそれぞれ個別に切り替える個別の切替手段を設け、各切替手段を連動して制御することによって所定の組の励起フィルタ、吸収フィルタ、ダイクロイックミラーを光路上に配置する構成としてもよい。さらには、フィルタ類を移動させることなく、ミラーなどで光路を変更することでも実質的にフィルタ類を切り替えて撮像することが可能である。
また蛍光顕微鏡を利用して多色蛍光観察を行う方法としては、蛍光顕微鏡にCCDカメラなどの撮像素子を装着して、複数の蛍光色素を同時に観察できるデュアル、トリプルバンドパスフィルタを使用する方法や、使用する蛍光色素それぞれに対応したシングルパス(単色用)のフィルタセットを切り替えて使用する方法等も適宜利用できる。
(表示部24)
(表示部24)
表示部24は、光学系10で撮像された画像を表示するディスプレイである。表示部24を構成するディスプレイは、高解像度表示が可能なモニタであり、CRTや液晶パネル等が利用される。表示部24は、蛍光顕微鏡に組み込みあるいは外付けされたモニタの他、図5に示すように蛍光顕微鏡200に接続された外部接続機器58で表示させるようにしてもよい。例えば外部接続機器58としてコンピュータ58Aを使用する場合、コンピュータ58Aのモニタ24Aにて表示部の機能を実現することができる。もちろん、蛍光顕微鏡200側および外部接続機器58側の両方で複数の表示部を利用することもできる。
図6は、蛍光顕微鏡で撮像された画像の表示形態を設定する蛍光顕微鏡画像表示プログラムのユーザインターフェース画面の一例を示している。このプログラムは、図5に示すように、蛍光顕微鏡200と接続されたコンピュータ58Aにインストールされ、蛍光顕微鏡200で撮像された画像データを受け取って表示部として機能するモニタ24Aで表示すると共に、設定に従って所望の画像表示を得るよう蛍光顕微鏡200の動作を制御する。なお図5は構成の一例であって、本発明において蛍光顕微鏡システムは種々の構成が利用でき、例えば蛍光顕微鏡自体に制御部26や操作部、モニタ等を設け、外部接続機器を接続することなくスタンドアロンで設定、動作を完結することもできる。あるいは一のコンピュータで複数の蛍光顕微鏡を接続して、各々連動してあるいは独立して操作することもできる。
蛍光顕微鏡画像表示プログラムのGUIイメージを、表示部24の表示画面の一例を図6に示す。この図に示すように、表示部24は複数の画像表示領域Gを備えており、各画像表示領域Gで異なる画像を表示し、複数の画像を同時に表示して対比させることができる。特に、本実施の形態においては画像表示領域Gの一を重ね合わせ画像表示領域Oとして、各フィルタセットで観察された画像を重ね合わせた重ね合わせ画像を表示することができる。これにより、各フィルタセットで観察された画像と、これらの重ね合わせ画像とを同一画面で比較することができる。特に後述するように、本実施の形態においてはほぼリアルタイムで各画像を表示できるため、様々な条件での試料の状態を容易に観察することが可能となる。図6の例では4枚の画像表示領域Gとし、その内の1枚を重ね合わせ画像表示領域Oとしている。もちろん、画像表示領域は3枚以下、あるいは5枚以上とすることもできる。好ましくは、フィルタホルダにセットされたフィルタセットの数に、重ね合わせ画像表示用を加えた数の画像表示領域とすることで、すべてのフィルタセットとこれらの重ね合わせ画像を一画面で同時に観察できる。もちろん、選択した任意の画面を拡大表示したり、拡大表示画面を各フィルタセット毎、あるいは重ね合わせ画像に切り替えて表示させることもできる。またすべての画像を同一画面で表示させる必要はなく、各画像毎に別ウィンドウで表示させたり、あるいは全画面表示に切り替えることもできる。このように表示の態様は、フィルタセットの数や観察目的、ユーザの嗜好等に応じて適宜変更できる。図6の例においては、蛍光染料1〜3にそれぞれ対応した3つのフィルタセットをフィルタホルダ56にセットし、これらを切り替えて撮像した各単色画像と、単色画像を重ね合わせた重ね合わせ画像を表示する例を示している。
(画像調整部40)
(画像調整部40)
また、図6に示す設定画面は、撮像された画像を調整する画像調整部40を備えている。この図に示す設定画面の例においては、画像調整部40として視野移動のための位置、高さ、倍率、明るさ、コントラスト等の画像調整パラメータを調整するためのスイッチ類を、画像表示領域Gの右側に設けている。またこれらの画像調整パラメータは、ユーザが調整する他、自動的に最適に設定することもできる。例えば露光時間を自動的に調整する「ワンタッチ・オート」ボタンや、焦点を自動調整する「ワンタッチ・フォーカス」ボタンなどを備える。各画像調整パラメータの調整の内、位置の調整はXY方向への移動であり、表示中の画像の視点を移動できる。例えば画像表示領域Gの画面で任意の位置をマウスでドラッグし、所望の方向に移動させることによって位置すなわち視点を移動できる。マウスの移動量に従って、試料載置部28はXY方向に移動される。また上下左右ボタンや十字ボタンを用いて移動させることもできる。さらに現在表示中の視点が、表示可能な領域のどの部分に位置するかを表示するガイドを設けることもできる。
また高さの調整はZ方向すなわち試料Wと光学系10(対物レンズ50)の相対距離であり、これによって画像のフォーカスが調整される。高さ指定部で高さを調整することにより、試料載置部28を上下に移動させる。高さや倍率などの調整は、スライダやレベルメータ、スケール等を使用して連続的、視覚的に調整できる。図6の例では高さ指定部としてスライダ32Aを使用している。なお、いずれの場合も試料載置部28を移動させて調整しているが、光学系10を移動させても同様の結果が得られることはいうまでもない。
倍率の調整は、結像レンズ52によって行われる。結像レンズ52は、フィルタセット1の吸収フィルタ16からの蛍光を結像させるレンズであり、フィルタセット1と撮像部22との間に配置されている。この例では結像レンズ52をズーム変倍レンズとしており、一の結像レンズ52を使って例えば倍率を10倍〜100倍に連続的に可変することができる。なお対物レンズ及び結像レンズの倍率、開口数、作動距離等は、観察目的や条件に応じて適切な値に設定される。結像レンズ52により結像された蛍光像は撮像部22に投影され、電気信号に変換されて外部接続された表示部24に表示される。また、蛍光像の画像データは、コンピュータ58A等の外部接続機器58に取り込まれて処理される。処理条件や処理結果は、コンピュータ58Aのディスプレイに表示される。なおコンピュータディスプレイ58Aと表示部を兼用することもできる。観察者は、表示部により蛍光像を観察でき、さらにコンピュータ58Aを操作して、蛍光像に所望の処理を施し、その結果を表示部やディスプレイで観察できる。
(倒立型蛍光顕微鏡)
(倒立型蛍光顕微鏡)
図1の例では、正立型の蛍光顕微鏡の例について説明したが、本発明は倒立型の蛍光顕微鏡にも同様に適用できることはいうまでもない。図7に、本発明のさらに他の実施の形態に係る倒立型蛍光顕微鏡のブロック図を示す。倒立型蛍光顕微鏡においては、試料裁置部の下方に対物レンズ50、フィルタセット1、結像レンズ52及び撮像部22が順に配置される構造となる。なお、図7に示すように倒立型蛍光顕微鏡においては、目視用の接眼レンズを省略することで、倒立型蛍光顕微鏡の構成を簡素化することができる。従来の倒置型蛍光顕微鏡では、試料裁置部の下方に設けられた対物レンズやフィルタセットを介して得られる蛍光を、偏光ミラーなどで上向きに光路を偏光することで使用者の目の高さに接眼レンズを配置するよう構成しており、このように光路を折曲して延長させるために構成が複雑になり、システムが大型化しコストアップの要因となっていた。そこでこのような接眼レンズを排除し、撮像部で撮像された画像を表示する表示部を外部に接続する構成とすることで、システムを簡素化して装置の小型化を実現できる。
(制御系64)
(制御系64)
次に蛍光顕微鏡の制御系64を構成するブロック図の一例を、図8に示す。なおこの図においては光学系10の詳細表示を省略している。この図に示すように、蛍光顕微鏡は撮像系66として、試料Wを載置する試料載置部28の一形態であるステージ28Aと、ステージ28Aを移動させるステージ昇降器30Aと、励起光源48(図8に図示せず)からステージ28A上に載置された試料Wに対して照射された励起光により蛍光染料を励起し、蛍光を撮像部22上に結像させる光学系10と、撮像部22の一形態として、ステージ28Aに固定された試料Wから光学系10を介して入射される蛍光を2次元状に配置された画素毎に電気的に読み取るCCD22Aと、CCD22Aを駆動制御するCCD制御回路22Bとを備える。ステージ昇降器30Aは、高さ調整部30の一形態であり、例えばステッピングモータ30aと、ステッピングモータ30aの昇降を制御するモータ制御部30bで構成される。ステッピングモータ30aは、光軸方向のZ軸方向、および光軸方向と垂直な面内であるXY方向にステージ28Aを移動させる。
また、これらの撮像系66を制御する制御系64として、撮像系66とデータ等の電気信号を通信などの手段によりやりとりするためのインターフェイス部68と、撮像部22によって電気的に読み取られた画像データを保持するためのメモリ部34と、撮像、合成された画像や各種設定等を表示するための表示部24と、表示部24上に表示される画面に基づいて入力、設定その他の操作を行うための操作部70と、操作部70で設定された条件に従い撮像系66を制御して撮像を行うと共に、取得された画像データを合成して立体画像を生成、あるいは画像処理その他の各種処理を行う制御部26とを備える。以上の撮像系66と制御系64は、蛍光顕微鏡に含めることで蛍光顕微鏡装置のみで動作を完結させることもできるし、図5に示すように、コンピュータ58Aなどの外部接続機器58を蛍光顕微鏡200に接続し、蛍光顕微鏡200で撮像系を、外部接続機器58で制御系を機能させることもできる。また撮像系と制御系は構成部材を厳密に区別するものでなく、例えばメモリ部を撮像系に持たせたり、逆にCCD制御回路やモータ制御部を制御系に持たせてもよい。
操作部70は蛍光顕微鏡システムを構成する蛍光顕微鏡もしくはコンピュータと有線もしくは無線で接続され、あるいはコンピュータに固定されている。一般的な操作部としては、例えばマウスやキーボード、スライドパッド、トラックポイント、タブレット、ジョイスティック、コンソール、ジョグダイヤル、デジタイザ、ライトペン、テンキー、タッチパッド、アキュポイント等の各種ポインティングデバイスが挙げられる。またこれらの操作部は、蛍光顕微鏡画像表示プログラムの操作の他、蛍光顕微鏡やその周辺機器の操作にも利用できる。さらに、インターフェース画面を表示するディスプレイ自体にタッチスクリーンやタッチパネルを利用して、画面上をユーザが手で直接触れることにより入力や操作を可能としたり、または音声入力その他の既存の入力手段を利用、あるいはこれらを併用することもできる。図8の例では、操作部70はマウスを備える(図5参照)。マウスによって、高さ指定部32であるスライダ32Aを操作したり、画像に対して合焦点位置合わせ等の各種操作を行える。このように表示部24で画像と共に操作メニューや設定などを表示させ、イメージ上で操作項目を選択したり操作を行うことによりユーザは操作内容や状態などを正確に把握でき、操作ミスも防止でき、また感覚的で操作しやすい操作体系が実現される。
本発明の蛍光顕微鏡及び蛍光観察方法は、例えば患者の血清と細胞核とを反応させ、蛍光標識を加えて蛍光顕微鏡で坑核坑体を観察し、坑核坑体の蛍光により陽性、陰性を判定する蛍光抗体検査等に利用可能である。
100、200…蛍光顕微鏡
1…フィルタセット
9…接眼レンズ
10…光学系
12…励起フィルタ
14…ダイクロイックミラー
16…吸収フィルタ
18…フィルタ切替部
20…切替設定部
22…撮像部;22A…CCD;22B…CCD制御回路
24…表示部;24A…モニタ
26…制御部
28…試料載置部;28A…ステージ
30…高さ調整部;30A…ステージ昇降器
30a…ステッピングモータ;30b…モータ制御部
32…高さ指定部;32A…スライダ
34…メモリ部
40…画像調整部
42…色補正部
44…インジケータ;44B…設定インジケータ
46…暗室空間
48…励起光源
50…対物レンズ
52…結像レンズ
54…コレクタレンズ
56…フィルタホルダ
58…外部接続機器;58A…コンピュータ
64…制御系
66…撮像系
68…インターフェイス部
70…操作部
72…遮断部
74、74B…警告メッセージ
76、76B…照射時間表示部
912…励起フィルタ;914…ダイクロイックミラー;916…吸収フィルタ
W…試料;G…画像表示領域;O…重ね合わせ画像表示領域
1…フィルタセット
9…接眼レンズ
10…光学系
12…励起フィルタ
14…ダイクロイックミラー
16…吸収フィルタ
18…フィルタ切替部
20…切替設定部
22…撮像部;22A…CCD;22B…CCD制御回路
24…表示部;24A…モニタ
26…制御部
28…試料載置部;28A…ステージ
30…高さ調整部;30A…ステージ昇降器
30a…ステッピングモータ;30b…モータ制御部
32…高さ指定部;32A…スライダ
34…メモリ部
40…画像調整部
42…色補正部
44…インジケータ;44B…設定インジケータ
46…暗室空間
48…励起光源
50…対物レンズ
52…結像レンズ
54…コレクタレンズ
56…フィルタホルダ
58…外部接続機器;58A…コンピュータ
64…制御系
66…撮像系
68…インターフェイス部
70…操作部
72…遮断部
74、74B…警告メッセージ
76、76B…照射時間表示部
912…励起フィルタ;914…ダイクロイックミラー;916…吸収フィルタ
W…試料;G…画像表示領域;O…重ね合わせ画像表示領域
Claims (11)
- 観察対象である試料に蛍光色素を導入し、光学系に配置して励起光を照射し、該励起光によって励起されて発される蛍光を受光して蛍光像を結像する蛍光顕微鏡であって、
試料に照射する励起光を発する励起光源と、
前記励起光源が照射する励起光の照射時間を計時する計時部と、
計時部で計時された計時時間が、所定の基準値を超えたかどうかを判定するための判定部と、
前記判定部に制御されて、前記励起光源から試料に照射される励起光を低減するための警告動作を行う警告部と、
を備えることを特徴とする蛍光顕微鏡。 - 請求項1に記載の蛍光顕微鏡であって、前記警告部が、前記励起光源から試料に照射される励起光の光路に配置され、試料に照射される励起光を遮断可能な遮断部を備えており、前記判定部の判定結果に基づき、前記遮断部によって強制的に励起光を遮断するよう構成されてなることを特徴とする蛍光顕微鏡。
- 請求項1または2に記載の蛍光顕微鏡であって、前記警告部が、励起光のレベルが基準値以上に達したことを警告するための警告表示部を備えており、前記判定部の判定結果に基づき、前記警告表示部が音声または/及び文字表示によって警告を発し、励起光を低減するための処置を促すよう構成してなることを特徴とする蛍光顕微鏡。
- 請求項1または2に記載の蛍光顕微鏡であって、前記警告部が、励起光のレベルが基準値以上に達したことを警告するための警告表示部を備えており、前記判定部の判定結果に基づき、前記警告表示部が音声または/及び文字表示によって警告を発し、励起光を低減するための処置を促すよう構成してなることを特徴とする蛍光顕微鏡。
- 請求項1から3のいずれかに記載の蛍光顕微鏡であって、前記計時部が励起光の連続照射時間を計時することを特徴とする蛍光顕微鏡。
- 請求項1から3のいずれかに記載の蛍光顕微鏡であって、前記計時部が励起光の累積照射時間を演算することを特徴とする蛍光顕微鏡。
- 請求項6に記載の蛍光顕微鏡であって、さらに観察対象の試料を特定する試料特定部を備えており、前記試料特定部で特定された試料毎に、前記計時部が累積照射時間の演算を行うことを特徴とする蛍光顕微鏡。
- 請求項1から7のいずれかに記載の蛍光顕微鏡であって、さらに試料の観察条件を入力するための観察条件指定部を備えており、
前記観察条件指定部から入力された観察条件に従って、前記判定部が所定の基準値を設定するよう構成されてなることを特徴とする蛍光顕微鏡。 - 請求項8に記載の蛍光顕微鏡であって、所定の基準値を設定するための観察条件が、試料に導入される蛍光色素の種類及び/又はpH濃度であることを特徴とする蛍光顕微鏡。
- 観察対象である試料に蛍光色素を導入し、光学系に配置して励起光を照射し、該励起光によって励起されて発される蛍光を受光して蛍光像を結像する蛍光顕微鏡であって、
試料に照射する励起光を発する励起光源と、
前記励起光源が照射する励起光の照射時間を計時する計時部と、
計時部で計時された計時時間を表示するための表示部と、
を備えることを特徴とする蛍光顕微鏡。 - 観察対象である試料に蛍光色素を導入し、光学系に配置して励起光を照射し、該励起光によって励起されて発される蛍光を受光して蛍光像を結像する蛍光顕微鏡を用いた蛍光観察方法であって、
試料の観察条件を指定するステップと、
指定された観察条件に基づいて所定の基準値を設定するステップと、
励起光源で試料に励起光の照射を開始した時点から照射時間を計時するステップと、
計時された照射時間が所定の基準値を超えたか否かを判定し、超えたと判定した場合に警告動作を行うステップと、
を有することを特徴とする蛍光観察方法。
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JP2004152549A JP2005331889A (ja) | 2004-05-21 | 2004-05-21 | 蛍光顕微鏡及び蛍光観察方法 |
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