JP2000098244A - 蛍光顕微鏡 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】安価で装置自体及び操作に要する空間を充分小
さなものとしながら、簡単な操作で迅速に異なる多種類
の蛍光色素を定量的で正確に分離識別する。 【解決手段】光源からの光を選択的に透過する励起フィ
ルタ4 、この励起フィルタ4 を透過した励起光を標本11
へ導くと共にこの標本11からの蛍光を透過するダイクロ
ックミラー5 、及び上記標本11からの蛍光を選択的に透
過する吸収フィルタ6 を備え、複数の蛍光色素で染色さ
れた標本を観察するための蛍光顕微鏡において、励起フ
ィルタ4 の透過波長帯域を変更する波長シフトフィルタ
3 と、このフィルタ3 の選択波長をその角度により検出
する角度検出部19と、標本11の像を撮像する撮像装置15
と、選択波長と撮像した波長変更による像の変化を比較
し、記憶装置20に予め記憶された各種データを参照して
標本11が染色されている蛍光色素の種類及び位置を識別
する演算制御部17とを備える。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、主に医学、生物学
で利用される、多くの異なる種類の蛍光色素で染色され
た１つの標本の蛍光色素を分離して、それぞれの蛍光色
素の像を別々にモノクロの撮像素子で撮像し、その後で
重ね合わせて同時に観察するための蛍光顕微鏡に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】一般に落射蛍光顕微鏡は、医学及び生物
学を始め、その他の分野において生物組織や細胞上で蛍
光標識を施した蛋白や遺伝子等を検出する目的で広く利
用されている。

【０００３】特に、近年では各種の蛍光色素の開発によ
り、様々な物質を異なる蛍光色素で標識し識別する多重
染色によって特定物質同士の位置相互関係を調べたり、
細胞内における特定物質の局在を調べたりするために使
用されている。

【０００４】ところで、従来かかる落射蛍光顕微鏡を用
いて多重染色標本を観察する場合、それぞれ単一の蛍光
色素を観察するための励起フィルタ、ダイクロックミラ
ー、吸収フィルタを１組とする蛍光フィルタセットをそ
れぞれの特定の蛍光色素毎に予め用意しておき、蛍光フ
ィルタセットを切換えながら蛍光色素に最適な組合せに
して１つずつ特定の蛍光色素を観察していた。そして、
それぞれの蛍光色素の位置関係を調べる場合には、それ
ぞれの蛍光像について写真やビデオメモリに多重記録し
て表示していた。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、以上の
ような落射蛍光顕微鏡においては、多種類の蛍光フィル
タセットを用意しなくてはならず、高価になるばかりで
なく、蛍光フィルタの切換操作に時間がかかり、また装
置及び操作のために大きな空間を必要とするため、好ま
しくない。

【０００６】一方、特開平２−２８５４２に記載の如
く、Ｃａ₂ ⁺ イオンなどのイオン濃度変化に反応して励
起スペクトル（励起され易い波長）が変化する蛍光色素
を利用して、細胞内のイオン濃度分布や経時的変化を画
像として観察する方法がある。この方法では、ある特定
の異なる２つのイオン濃度のそれぞれの状態の時に蛍光
色素が最も励起され易い波長を選択する励起フィルタを
２種類用意し、この励起フィルタを切換えて、それぞれ
の励起状態での蛍光強度の比を計算することで、イオン
濃度分布を表示している。

【０００７】この方法によれば、蛍光フィルタセットを
切換えることなく、励起フィルタのみを切換えることで
蛍光色素の特性の変化を捕らえることができるので、少
ないフィルタ枚数で実現でき、安価で占有する空間も小
さくすることができる。

【０００８】しかしながらこの方法は、あくまでも１種
類の蛍光色素の特性の変化を識別する方法であって、異
なる種類の蛍光色素を識別する方法ではない。また、蛍
光色素の種類の識別に適用しようとした場合でも、やは
り識別しようとする蛍光色素の種類と同じ枚数の励起フ
ィルタを用意して切換える操作を行なわなければなら
ず、結果として全体にフィルタ枚数が多く、高価になっ
てしまうという不具合や、切換え操作に時間がかかり、
大きな空間を必要とするいった不具合を解決することは
できない。

【０００９】さらに従来技術として公知である、フィル
タを切換えることなくフィルタの透過波長帯域を変更す
る手段が特開平５−１５０１６４号公報及び特開平５−
１８８２９９号公報に記載されている。これらはいずれ
も、複数の蛍光色素を同時に観察するための複数の透過
波長帯域をもった蛍光フィルタセットに組合わせて、さ
らに別の干渉膜を利用した励起フィルタまたは吸収フィ
ルタを用意し、この励起フィルタまたは吸収フィルタを
光軸に対して垂直な回転軸を中心に回転させ、干渉光路
長を変化させることで透過波長帯域を変更している。

【００１０】しかしながら、これらの方法は、複数の蛍
光色素を同時に観察する場合に、各蛍光色素の蛍光の明
るさのバランスを適当に調整し、観察し易くするための
ものであり、異なる蛍光色素を分離して識別するもので
はない。

【００１１】また前述したように、これらの公報に蛍光
フィルタセットを切換えることなく同時に異なる複数の
蛍光色素を観察可能な蛍光フィルタセットが記載されて
いる。この蛍光像を撮像しようとする場合、カラーの撮
像素子で撮像する方法と、蛍光像をマイケルソンの干渉
計や回析格子を利用して分光してモノクロの撮像素子で
撮像する方法がある。

【００１２】しかしながら、蛍光像は一般に微弱な光で
あるため、カラー撮像素子では感度が不足して露光時間
が長くなるばかりでなく画像中のノイズ成分も多くな
り、また解像度も劣化するといった不具合がある。

【００１３】また、蛍光像を分光してモノクロ撮像素子
で撮像する方法では、分光する装置が大型で高価なもの
となり、設置に大きな空間を必要とするばかりでなく、
分光するために時間がかかり、やはり好ましくない。

【００１４】さらに、上記カラーの撮像素子で撮像する
方法と、モノクロの撮像素子で撮像する方法のいずれの
方法共に、蛍光像の分光強度特性と蛍光色素の発光蛍光
の分光特性を比較して蛍光色素を特定するものであり、
定量的でなく正確性に欠けるという不具合もあった。

【００１５】本発明は上記のような実情に鑑みてなされ
たもので、その目的とするところは、安価で装置自体及
び操作に要する空間を充分小さなものとしながら、簡単
な操作で迅速に異なる多種類の蛍光色素を定量的で正確
に分離識別可能な蛍光顕微鏡を提供することにある。

【００１６】

【課題を解決するための手段】請求項１記載の発明は、
光源からの光を選択的に透過する励起フィルタ、この励
起フィルタを透過した励起光を標本へ導くと共にこの標
本からの蛍光を透過するダイクロックミラー、及び上記
標本からの蛍光を選択的に透過する吸収フィルタを備
え、複数の蛍光色素で染色された上記標本を観察するた
めの蛍光顕微鏡において、上記励起フィルタと上記吸収
フィルタの少なくとも一方の透過波長帯域を変更する変
更手段と、この変更手段で選択された波長を検出する検
出手段と、上記標本の像を撮像する撮像素子と、上記検
出手段で得た選択波長と上記撮像素子で撮像した波長変
更による像の変化を比較し、上記標本が染色されている
蛍光色素の種類及び位置を識別する識別手段とを具備し
たことを特徴とする。

【００１７】このような構成とすれば、予め、変更した
励起フィルタまたは吸収フィルタの透過波長特性の変化
と像の強度変化の相関関係が分かっていれば、検出した
選択波長の信号と撮像素子で撮像した単色の像の光強度
の情報に基づいて、強度変化を検出して蛍光色素の種類
及び位置を特定できるため、実際の蛍光の分光強度特性
を検出して、蛍光色素の蛍光発光特性と比較する方法に
比べ、簡単な操作ながら、より定量的で正確に蛍光色素
の種類及び位置を特定することができる。

【００１８】請求項２記載の発明は、上記請求項１記載
の発明において、上記励起フィルタ及び吸収フィルタの
少なくとも一方は、それぞれ独立して透過波長帯域を変
更可能な複数のフィルタから構成されることを特徴とす
る。

【００１９】このような構成とすれば、上記請求項１記
載の発明の作用に加えて、フィルタ１枚あたりの透過波
長帯域の波長変更量が少なくても、複数枚を組合わせる
ことで、少ない波長変更量で大きな蛍光強度の変化とし
て捕らえることが可能であり、正確に蛍光色素の種類及
び位置を特定することができる。

【００２０】請求項３記載の発明は、上記請求項１記載
の発明において、上記励起フィルタ及び吸収フィルタの
少なくとも一方は干渉フィルタであり、上記変更手段
は、上記干渉フィルタを光軸に対して垂直な回転軸を中
心に回転することにより透過波長帯域を変更することを
特徴とする。

【００２１】このような構成とすれば、上記請求項１記
載の発明の作用に加えて、フィルタを傾けるといった簡
単な手法で透過波長帯域を変更可能なため、簡単な構造
で安価であり、また装置の小型化を図ることができる。

【００２２】

【発明の実施の形態】（第１の実施の形態）以下本発明
を落射蛍光顕微鏡に適用した場合の第１の実施の形態に
ついて図面を参照して説明する。

【００２３】図１は全体の構成を示すもので、光源１を
出射した照明光は、照明レンズ２ａで概略平行光とな
り、波長シフトフィルタ３を透過し、照明レンズ２ｂで
対物レンズ１０の射出瞳付近へ集光される。このとき該
照明光は、励起フィルタ４を透過する際に波長選択され
た後、ダイクロックミラー５により反射されてから対物
レンズ１０を透過した後、ステージ１２上に配された標
本１１に照射される。

【００２４】この照射により標本１１から発した蛍光
は、対物レンズ１０により平行光となってダイクロック
ミラー５を透過した後、吸収フィルタ６により波長選択
されて透過し、結像レンズ１３により蛍光像として投影
され、それから接眼レンズ１４を通して目視で観察した
り、あるいは蛍光像が投影される例えばＣＣＤでなる撮
像素子１６を有する撮像装置１５により撮像してその画
像をここでは図示しないモニタで観察することが可能と
なる。

【００２５】また、この撮像装置１５で得られた画像の
蛍光強度分布情報が演算制御部１７に送られる。演算制
御部１７は、上記波長シフトフィルタ駆動部１８に依り
波長シフトフィルタ３の回転角度を駆動制御させ、その
波長シフトフィルタ３の回転か駆動を角度検出部１９に
より検出させながら、上記撮像装置１５から送られてく
る蛍光強度分布情報と、記憶装置２０に予め記憶されて
いる蛍光色素のスペクトルデータ、上記波長シフトフィ
ルタ３の分光特性データ、及び蛍光フィルタセット７の
分光特性データとを読出して後述する演算を実行して蛍
光色素の種類及び位置を算出して表示出力する。

【００２６】なお、撮像装置１５はモノクロの画像を撮
像するものであり、以下に撮像装置１５で撮像した蛍光
像をモニタで観察する場合に関して説明する。次いで上
記実施の形態の動作を説明する。

【００２７】ここで、まず上記励起フィルタ４、ダイク
ロックミラー５、及び吸収フィルタ６を１組とする蛍光
フィルタセット７の分光特性を、標本１１に関して図３
を用いて詳述する。

【００２８】標本１１は、予め２種類の異なる蛍光色
素、Ｂｌｕｅ（青）励起色素、Ｇｒｅｅｎ（緑）励起色
素で染色されているものとする。蛍光フィルタセット７
は、この２種類の蛍光色素を同時に観察できるようにな
っており、その分光特性のグラフを図３に示す。

【００２９】同図中、グラフは横軸が波長、たて軸が透
過率を表す。このグラフからわかるように、励起フィル
タ４、ダイクロックミラー５、及び吸収フィルタ６は共
に２つの透過波長帯域をもっている。

【００３０】励起フィルタ４は、２種の蛍光色素各々が
励起され易い波長域に透過波長帯域をもっており、ダイ
クロックミラー５、吸収フィルタ６は蛍光色素各々の蛍
光発光波長域に透過波長帯域をもっている。このため、
蛍光フィルタ７を切換えることなく、２種類の蛍光色素
を同時に観察することができる。

【００３１】次に、上記波長シフトフィルタ３に関して
図２を用いて詳述する。図２（Ａ）に示すグラフは、波
長シフトフィルタ３と励起フィルタ４の分光透過率を示
すものである。

【００３２】波長シフトフィルタ３は干渉膜で構成され
ており、このグラフに示すように励起フィルタ４の透過
波長帯域よりも波長幅の広い透過帯域をもっており、励
起フィルタ４とは異なって透過波長帯域は１つである。

【００３３】一方、図１の矢印Ｉでその動きを示すよう
に、波長シフトフィルタ３は照明光軸８に垂直な回転軸
を中心に回転可能に保持されており、波長シフトフィル
タ駆動部１８により、照明光軸８に垂直な位置と４５°
傾いた位置（図中点線）の２段階の位置のいずれか一方
に位置決めされ、駆動されるようになっている。

【００３４】また、波長シフトフィルタ３が照明光軸８
に対して垂直な位置にあるのか、または４５°傾いた位
置にあるのかを検出する角度検出部１９が波長シフトフ
ィルタ３に配されている。

【００３５】この波長シフトフィルタ３を回転して傾け
た状態での分光透過率の変化を図２（Ａ）のグラフに示
してある。すなわち、実線は波長シフトフィルタ３を照
明光軸８に対して垂直な状態（図中フィルタ０°）とし
て、Ｂｌｕｅ励起色素用の励起波長帯域を透過させるよ
うになっており、一方の破線は波長シフトフィルタ３を
照明光軸８に対して４５°の状態（図中フィルタ４５
°）として、Ｇｒｅｅｎ励起色素用の励起波長帯域を透
過させるようにしたものである。

【００３６】このように、波長シフトフィルタ３を傾
け、その干渉光路長を変化させることにより、透過波長
帯域がシフトさせ、２種類の色素の内、１種類の色素だ
けを励起することが可能となる。

【００３７】次いで、実際に蛍光色素の種類、位置を識
別する手法を説明する。まず、図２（Ｂ）に示す波長シ
フトフィルタ３の傾きが０°の状態Ｎｏ．１の場合、図
２（Ａ）で上述した如くＢｌｕｅ励起色素だけが励起さ
れ蛍光を発している。この状態Ｎｏ．１では、波長シフ
トフィルタ３が０°であることを角度検出手段９により
検出し、その情報が演算制御部１７に送られている。

【００３８】ところで、記憶装置２０には予め波長シフ
トフィルタ３と蛍光フィルタセット７それぞれの分光透
過率データと、蛍光色素の励起スペクトルデータが記憶
されており、特に波長シフトフィルタ３に関しては、回
転角度と分光透過率の変化の関係のデータも記憶されて
いる。

【００３９】演算制御部１７は、角度検出手段９からの
波長シフトフィルタ３が０°であることの情報を受け
て、記憶装置２０から波長シフトフィルタ３が０°の時
の分光透過率データを読出し、さらに、蛍光フィルタセ
ット７の分光透過率データと蛍光色素の励起スペクトル
データも読出して、これを比較することで現在Ｂｌｕｅ
励起色素だけが励起されていることを認識する。

【００４０】次に演算制御部１７は、撮像装置１５から
実際の像の蛍光強度の２次元分布データである蛍光強度
分布情報を読込み、撮像素子１６上で光っている部分が
Ｂｌｕｅ励起色素であることを判定する。

【００４１】次に演算制御部１７は、波長シフトフィル
タ駆動装置１８に指令を送出して波長シフトフィルタ３
を照明光軸８に対して４５°傾けさせ、図２（Ｂ）で示
す状態Ｎｏ．２とさせる。この場合、やはり上述した如
く標本１１ではＧｒｅｅｎ励起の色素だけが励起され、
蛍光を発する。この状態Ｎｏ．２でも演算制御部１７は
上記状態Ｎｏ．１と同じように、角度検出手段１９から
の情報を受け、記憶装置２０からデータを読出し、現在
Ｇｒｅｅｎ励起色素のみが励起されていることを認識
し、次に撮像装置１５から実際の蛍光強度分布データを
読込んで、これらを比較することでＧｒｅｅｎ励起色素
が光っている位置を判定する。

【００４２】このように状態Ｎｏ．１と状態Ｎｏ．２と
で波長シフトフィルタ３の回転位置切換えることによ
り、各々での判定結果から最終的に蛍光色素の種類と位
置を識別可能となるもので、判定した結果を表示出力さ
せる。

【００４３】このように本発明の第１の実施の形態によ
れば、ユーザが行なう波長シフトフィルタ３を単に照明
光軸８に対して傾けるといった簡単な動作で、蛍光色素
の種類、位置を識別することができ、蛍光フィルタセッ
ト７を切換える必要がないため、装置を安価で小規模の
ものとすることができる。

【００４４】また、照明側の波長シフトフィルタ３を傾
けるだけなので、蛍光フィルタセット７を切換えた場合
に発生する、吸収フィルタ６、ダイクロックミラー５の
くさびによる観察光軸の中心がずれてしまうような不具
合も発生し得ない。

【００４５】（第２の実施の形態）以下本発明を落射蛍
光顕微鏡に適用した場合の第２の実施の形態について図
面を参照して説明する。

【００４６】図４は全体の構成を示すもので、基本的に
は上記図１に示したものと同様であるので、同一部分に
は同一符号を付してその説明は省略する。しかして、こ
の図４では上記波長シフトフィルタ３と同様の複数枚、
例えば２枚の第１及び第２の波長シフトフィルタ３ａ，
３ｂを照明光軸８上に配設し、それぞれの照明光軸８に
対する回転位置を波長シフトフィルタ駆動部１８により
個別に制御し、その回転位置を角度検出部１９により検
出するものとする。

【００４７】次いで上記第２の実施の形態の動作につい
て説明する。ここで標本１１は、３種類の蛍光色素、す
なわちＢｌｕｅ（青）励起色素、Ｇｒｅｅｎ（緑）励起
色素、Ｒｅｄ（赤）励起色素で染色されているものとす
る。

【００４８】蛍光フィルタセット７は第１の実施の形態
と同様の特性を有し、３種類の蛍光色素に対応するため
に透過波長帯域が３つになっている点のみ異なるものと
する。

【００４９】次に第１の波長シフトフィルタ３ａ及び第
２の波長シフトフィルタ３ｂに関して図５により説明す
る。第１及び第２の波長シフトフィルタ３ａ，３ｂは、
照明光軸８上に配列されており、各々分光透過率が異な
るもので、その分光透過率を示すのが図４（Ａ）のグラ
フである。

【００５０】第１の波長シフトフィルタ３ａは、励起フ
ィルタ４の透過波長帯域よりも多少波長幅の広い非透過
帯域を有しており、一方の第２の波長シフトフィルタ３
ｂは、ちょうど励起フィルタ４の透過波長帯域の２倍分
の波長幅の透過帯域を１つ有しているものとする。

【００５１】第１及び第２の波長シフトフィルタ３ａ，
３ｂは、上記第１の実施の形態１と同様に波長シフトフ
ィルタ駆動部１８の回転駆動により照明光軸８に対して
傾いて位置決めされるようになっており、その位置決め
は独立して行われる。

【００５２】図４（Ａ）のグラフ中の破線は、第１及び
第２の波長シフトフィルタ３ａ，３ｂを各々４５°傾け
た状態での特性を示す。この２つの波長シフトフィルタ
３ａ，３ｂを独立して傾ける状態を組合わせると、図４
（Ｂ）に示すように状態Ｎｏ．１乃至状態Ｎｏ．３の３
つの状態を設定することができる。図中の○印は第１の
波長シフトフィルタ３ａと第２の波長シフトフィルタ３
ｂの傾き状態を表わす。

【００５３】状態Ｎｏ．１ではＢｌｕｅ励起色素だけが
励起され蛍光を発光し、状態Ｎｏ．２ではＲｅｄ励起色
素だけが励起され蛍光を発光し、状態Ｎｏ．３ではＧｒ
ｅｅｎ励起色素だけが励起され蛍光を発光することがわ
かる。

【００５４】これらの状態Ｎｏ．１〜Ｎｏ．３を第１及
び第２の波長シフトフィルタ３ａ，３ｂを回転駆動して
動作させ、上記第１の実施の形態と同様に演算制御部１
７にて演算処理を施して判定することで、３種類の蛍光
色素の種類及び位置を識別することが可能となる。

【００５５】このように第２実施の形態によれば、第１
の実施の形態と同様の効果を奏すると共に、波長シフト
フィルタ３を複数枚、例えば２枚組合せて使用している
ため、１枚の波長シフトフィルタ３を単独で使用して傾
けることにより得られる波長のシフト量を大きく設計で
きない場合においても、それぞれ少ない該シフト量で、
励起波長の離れた多種類、例えば３種類もの蛍光色素を
分離して識別することが可能となる。

【００５６】（第３の実施の形態）以下本発明を落射蛍
光顕微鏡に適用した場合の第３の実施の形態について図
面を参照して説明する。

【００５７】尚、全体の構成については基本的に上記図
１に示したものと同様であるとして、同一部分には同一
符号を付してその図示及び説明は省略する。次いで上記
第３の実施の形態の動作について説明する。

【００５８】ここで標本１１は、４種類の蛍光色素、す
なわちＵＶ（紫外光）励起色素、Ｂｌｕｅ（青）励起色
素、Ｇｒｅｅｎ（緑）励起色素、及びＲｅｄ（赤）励起
色素で染色されており、蛍光フィルタセット７は、上記
４種類の蛍光色素に対応しているものとする。

【００５９】波長シフトフィルタ３は、上記第１の実施
の形態と同様の構成及び動作により透過波長帯域が回転
位置に応じてシフトするようになっており、その分光透
過率特性と波長シフトによる変化を図６（Ａ）に示す。

【００６０】同図（Ａ）に示すようにここで波長シフト
フィルタ３は、４つの透過波長帯域を有しており、照明
光軸８に対する回転位置を０°から４５°に傾けると、
グラフ中の実線から破線の状態に変化する。このときの
４種類の蛍光色素用の励起光強度の変化を表したのが図
６（Ｂ）である。ここで図中の強度［％］は、励起フィ
ルタ４の各透過波長帯域を透過した励起光が全て標本に
照射されている状態を１００［％］として表わした。

【００６１】このように、波長シフトフィルタ３が０°
の状態Ｎｏ．１から波長シフトフィルタ３が４５°の状
態Ｎｏ．２に変化した場合、ＵＶ励起は１００％から５
０％へ、Ｂｌｕｅ励起は１００％から９０％とそれぞれ
励起光強度が低下し、反対にＧｒｅｅｎ励起は９０％か
ら１００％へ、Ｒｅｄ励起は５０％から１００％へとそ
れぞれ励起光強度が上昇している。

【００６２】しかして、演算制御部１７は上記第１の実
施の形態出の動作と同様に角度検出部１９からの波長シ
フトフィルタ３の回転位置情報と、記憶装置２０からの
各種データを読込み、また、撮像装置１５から状態Ｎ
ｏ．１と状態Ｎｏ．２のときの蛍光強度分布情報を読込
み、撮像装置１５の撮像素子１６の各画素に対応する状
態Ｎｏ．１と状態Ｎｏ．２の蛍光強度比を計算し、状態
の変化を認識する。

【００６３】ここで例えば状態Ｎｏ．１から状態Ｎｏ．
２に変化した際に演算制御部１７は、角度検出部１９と
記憶装置２０から得られるデータで、ＵＶ励起であれば
蛍光強度が１００％から５０％に変化することがわかっ
ているため、実際に取込んだ蛍光像の強度比の計算結果
と比較することで、ＵＶ励起色素の位置を特定すること
ができる。

【００６４】他の蛍光色素も同様に位置を特定すること
で、結果として４種類の蛍光色素全ての種類と位置を分
離し識別することが可能となる。このような手法をとる
ことで、上記第１及び第２の実施の形態では波長シフト
フィルタ３（３ａ，３ｂ）及び励起フィルタ４の枚数を
合計すると識別する色素の数と同数が必要であったが、
この第３の実施の形態では、例えば１枚の波長シフトフ
ィルタを１回傾けるといった、少ないフィルタ枚数及び
傾けの動作数でも４種類もの蛍光色素の種類、位置を一
括して識別することが可能であり、装置を安価で且つ小
規模なものとすることができるばかりでなく、識別処理
に要する作業をより短時間で終了させることができる。

【００６５】尚、上記第３の実施の形態の変形例とし
て、図７に示す如く第１及び第２の２種類の波長シフト
フィルタ３ａ，３ｂを用意し、また、各々の波長シフト
フィルタ３ａ，３ｂに特性が合致した蛍光フィルタセッ
ト７も２種類用意して、各々特性の合致した組合わせ
で、例えば波長シフトフィルタ３ａ，３ｂであればスラ
イダ機構により照明光軸８上に選択的に切換えて挿脱す
ることで、さらに２倍の８種類の蛍光色素までその種類
と位置とを識別することができるようになる。

【００６６】（第４の実施の形態）以下本発明を落射蛍
光顕微鏡に適用した場合の第４の実施の形態について図
面を参照して説明する。

【００６７】図８は全体の構成を示すもので、基本的に
は上記図１に示したものと同様であるので、同一部分に
は同一符号を付してその説明は省略する。しかして、蛍
光フィルタセット７の励起フィルタ４の構成を簡略化し
ており、照明レンズ２ｂで集光された照明光は蛍光フィ
ルタセット７において直接ダイクロックミラー５で反射
され、観察光軸９に偏向されて対物レンズ１０に至るこ
ととなる。

【００６８】次いで上記第４の実施の形態の動作につい
て説明する。ここで、標本１１は２種類の蛍光色素、Ｂ
ｌｕｅ（青）励起色素、及びＧｒｅｅｎ（緑）励起色素
で染色されているものとする。

【００６９】波長シフトフィルタ３及び蛍光フィルタセ
ット７は、図８（Ａ）のグラフに示すような分光透過率
であり、一般的に使用される単一の蛍光色素用の蛍光フ
ィルタセットから励起フィルタを除いたものである。こ
こでは、励起フィルタの機能は、波長シフトフィルタ３
が併せ持つものとし、同図（Ａ）のグラフに示す通り、
狭い波長幅の透過帯域を１つだけ有しているものとす
る。

【００７０】波長シフトフィルタ３の通過波長帯域をシ
フトさせる手法は上記第１の実施の形態と全く同一であ
り、グラフ中の破線が４５°傾いた状態での特性であ
る。この標本１１を染色している２種類の蛍光色素は、
互いに励起スペクトルが近く、また励起波長と発光蛍光
の波長が離れているため、どちらの色素を励起しても、
励起光はダイクロックミラー点で反射し、蛍光は、ダイ
クロックミラー５、吸収フィルタ６を透過することがで
きる。

【００７１】以上のような手法において、波長シフトフ
ィルタ３の波長をシフトする前の状態Ｎｏ．１と後の状
態Ｎｏ．２を図９（Ｂ）に示す。２種類の蛍光色素は励
起スペクトルが近いため、例えば状態Ｎｏ．１で、Ｂｌ
ｕｅ励起色素の励起スペクトルに合った励起波長が選択
されていても、Ｇｒｅｅｎ励起の色素も多少は蛍光を発
してしまう。このため、各々の色素に合った励起波長が
選択されている時の蛍光強度を１００％とすると、状態
Ｎｏ．１では、Ｇｒｅｅｎ励起の色素の蛍光強度は１０
％となる。

【００７２】このような状態Ｎｏ．１と状態Ｎｏ．２の
変化により、上記第３の実施の形態の場合と同様に、選
択された励起波長と蛍光強度比を基に、記憶装置２０か
らのからのデータと実際に取込んだ蛍光像の強度比の計
算結果と比較することで、２種類の蛍光色素の種類と位
置を識別することができる。

【００７３】したがって本実施の形態によれば、励起フ
ィルタの機能を波長シフトフィルタで兼用しているた
め、上記図１に示した構成に比して、より少ないフィル
タ枚数としながら色素の識別を行なうことができ、装置
をより安価なものとすることができる。

【００７４】（第５の実施の形態）以下本発明を落射蛍
光顕微鏡に適用した場合の第５の実施の形態について図
面を参照して説明する。

【００７５】図１０は全体の構成を示すもので、基本的
には上記図１に示したものと同様であるので、同一部分
には同一符号を付してその説明は省略する。しかして、
波長シフトフィルタ３′として、照明光軸８に対する回
転位置を変化させるものではなく、膜厚が連続的に変化
する干渉膜フィルタを用いる。すなわちこの干渉膜フィ
ルタは、断面がクサビ状の形をして膜厚が連続的に変化
するもので、図中に矢印ＩＩで示すように照明光軸８と
垂直な方向（図中矢印方向）に移動させることにより膜
の干渉光路長を変化させて、透過波長帯域をシフトする
ものとなる。

【００７６】尚、上記第４の実施の形態の場合と同様、
蛍光フィルタセット７の励起フィルタ４の機能は波長シ
フトフィルタ３′を構成する干渉膜フィルタが併せ持つ
ものとし、励起フィルタ４自体の構成は省略するものと
する。

【００７７】次いで上記第５の実施の形態の動作につい
て説明する。ここで、標本１１は３種類の蛍光色素、す
なわちＢｌｕｅ（青）励起色素、Ｇｒｅｅｎ（緑）励起
色素、Ｒｅｄ（赤）励起色素で染色されているものと
し、ダイクロックミラー５及び吸収フィルタ６は蛍光色
素の蛍光発光波長に合わせて、各々３つの透過波長帯域
を有しており、また上記波長シフトフィルタ３′を構成
する干渉膜フィルタは図１１（Ａ）に示すように波長幅
が狭く、透過率の高い透過帯域を１つだけ有しているも
のとする。

【００７８】図１１に示す状態Ｎｏ．１では、Ｂｌｕｅ
励起色素の励起スペクトルに合った波長、状態Ｎｏ．２
ではＧｒｅｅｎ励起色素、状態Ｎｏ．３ではＲｅｄ励起
色素に合った波長となるように波長シフトフィルタ３′
の透過波長帯域が設定され、これらの状態Ｎｏ．１乃至
状態３の状態に切換可能なように、波長シフトフィルタ
３′の移動方向には図示しないクリック等の位置決め機
構が設けられているものとする。

【００７９】そして、波長シフトフィルタ駆動部１８が
波長シフトフィルタ３′の位置をスライド駆動して変化
させ、その位置は位置検出部１９′により検出されるも
のとする。

【００８０】演算制御部１７は波長シフトフィルタ３′
を構成する干渉膜フィルタの位置を波長シフトフィルタ
駆動部１８により上記状態Ｎｏ．１乃至状態Ｎｏ．３と
なるようにそれぞれ切換えさせることで、標本１１にお
いてＢｌｕｅ、Ｇｒｅｅｎ、Ｒｅｄの各蛍光色素のみを
励起させるため、演算制御部１７は得られた蛍光強度分
布に演算処理を施して記憶装置２０からのデータと比較
して判定することで、これら３種類の蛍光色素の種類及
び位置を識別することが可能となる。

【００８１】このように本実施の形態によれば、連続的
に膜厚の変化する干渉膜フィルタでなる波長シフトフィ
ルタ３′を使用しており、該干渉膜フィルタにおける膜
厚の変化する度合いを自由に設定できるため、干渉フィ
ルタを照明光軸８に対して傾ける方式に比べて透過波長
帯域のシフト量をより大きく設定でき、波長シフトフィ
ルタ３（３′）を構成するフィルタの枚数をより少なく
することができ、装置の価格をより低減させることが可
能となる。

【００８２】（第６の実施の形態）以下本発明を落射蛍
光顕微鏡に適用した場合の第６の実施の形態について図
面を参照して説明する。

【００８３】図１２は全体の構成を示すもので、基本的
には上記図１に示したものと同様であるので、同一部分
には同一符号を付してその説明は省略する。しかして、
波長シフトフィルタ３″として、照明光軸８に対する回
転位置を変化させるものではなく、可変位相板２１を挟
んで一対の偏光板２２を対峙させたものを用いる。

【００８４】可変位相板２１は、例えば液晶板で構成さ
れ、その印加電圧を変化させることで液晶物質の結晶軸
方向を変化させて、その光学軸方向の位相のみをシフト
させるようになっており、そのシフト量が可変になって
いる。

【００８５】また、光源１を偏光板２２は光源１側のポ
ラライザ２２ａと蛍光フィルタセット７側のアナライザ
２２ｂとで構成され、可変位相板２１の光学軸とポララ
イザ２２ａの偏向方向はある角度を持って配置されてお
り、ポラライザ２２ａを透過した直線偏光は可変位相板
２１により偏向方向が回転させられ、だ円偏光となる。

【００８６】可変位相板２１の位相シフト量は波長によ
って異なるため、偏光方向の回転角も異なり、この波長
毎に異なる回転角になった偏光のある角度成分をアナラ
イザ２２ｂで選択的に透過させることで、特定の波長帯
域のみを選択的に透過させることができる。

【００８７】可変位相板２１の位相シフト量を変更設定
することで、この選択される波長も異なるため、この原
理を利用して波長シフトフィルタ３″は、透過波長帯域
をシフトしている。詳しい原理は“ＴＵＮＡＢＬＥ Ｃ
ＯＬＯＲ ＦＩＬＴＥＲ”ＵＳ５６８９３１７公報に記
載されている。

【００８８】また、上記波長シフトフィルタ駆動部１８
に代えて位相差変更部２３を、角度検出部１９に代えて
位相差検出部２４をそれぞれ配設し、透過波長帯域の変
更動作と位相差の検出動作とを行なわせる。

【００８９】尚、上記第４及び第５の実施の形態の場合
と同様、蛍光フィルタセット７の励起フィルタ４の機能
は波長シフトフィルタ３″が併せ持つものとし、励起フ
ィルタ４自体の構成は省略するものとする。

【００９０】次いで上記第６の実施の形態の動作を説明
する。ここで、標本１１は３種類の蛍光色素、すなわち
Ｂｌｕｅ（青）励起色素、Ｇｒｅｅｎ（緑）励起色素、
Ｒｅｄ（赤）励起色素で染色されているものとし、ダイ
クロックミラー５及び吸収フィルタ６は蛍光色素の蛍光
発光波長に合わせて、各々３つの透過波長帯域を有して
おり、また上記波長シフトフィルタ３″は図１１（Ａ）
に示すように波長幅が狭く、透過率の高い透過波長帯域
を１つだけ有しているものとする。

【００９１】図１１に示す状態Ｎｏ．１では、Ｂｌｕｅ
励起色素の励起スペクトルに合った波長、状態Ｎｏ．２
ではＧｒｅｅｎ励起色素、状態Ｎｏ．３ではＲｅｄ励起
色素に合った波長となるように可変位相板２１の液晶板
への印加電圧で位相シフト量を変更することで波長シフ
トフィルタ３″の透過波長帯域が設定される。

【００９２】そして、位相差変更部２３が波長シフトフ
ィルタ３″の位相シフト量を変化させ、その位相差は位
相差検出部２４により検出されて演算制御部１７へ送出
される。

【００９３】演算制御部１７は波長シフトフィルタ３″
での位相シフト量を位相差変更部２３により上記状態Ｎ
ｏ．１乃至状態Ｎｏ．３となるようにそれぞれ切換えさ
せることで、標本１１においてＢｌｕｅ、Ｇｒｅｅｎ、
Ｒｅｄの各蛍光色素のみを励起させるため、演算制御部
１７は得られた蛍光強度分布に演算処理を施して記憶装
置２０からのデータと比較して判定することで、これら
３種類の蛍光色素の種類及び位置を識別することが可能
となる。

【００９４】このように本実施の形態によれば、波長シ
フトフィルタ３″を構成する可変位相板２１の印加電圧
を変更することで位相差のシフト量を変更し、透過波長
帯域をシフトしているため、透過波長帯域のシフト動作
を高速化させることができ、短時間で色素の種類及び位
置が識別することができる。また、機械的な可動部がな
いために故障が少なく、耐久性に優れたものとすること
ができる。

【００９５】（第７の実施の形態）以下本発明を落射蛍
光顕微鏡に適用した場合の第７の実施の形態について図
面を参照して説明する。

【００９６】図１３は全体の構成を示すもので、基本的
には上記図１２に示したものと同様であるので、同一部
分には同一符号を付してその説明は省略する。しかし
て、波長シフトフィルタ３″を照明レンズ２ａ，２ｂ間
ではなく、九州フィルタとして観察光軸９上の蛍光フィ
ルタセット７と結像レンズ１３との間に配設するものと
する。

【００９７】また、蛍光フィルタセット７において励起
フィルタ４を新たに配接続するものとする。次いで上記
第７の実施の形態の動作を説明する。

【００９８】ここで、標本１１は３種類の発光蛍光、す
なわちＢｌｕｅ（青）励起色素、Ｇｒｅｅｎ（緑）励起
色素、Ｒｅｄ（赤）励起色素で染色されているものと
し、ダイクロックミラー５及び吸収フィルタ６は蛍光色
素の蛍光発光波長に合わせて、各々３つの透過波長帯域
を有しており、また上記波長シフトフィルタ３″は図１
１（Ａ）に示すように波長幅が狭く、透過率の高い透過
波長帯域を１つだけ有しているものとする。

【００９９】図１４は、状態Ｎｏ．１乃至状態Ｎｏ．３
での波長シフトフィルタ３″の分光透過率グラフとその
各状態で透過する蛍光を示したものである。波長シフト
フィルタ３″では、演算制御部１７が可変位相板２１に
印加する電圧を位相差変更部２３により可変設定してそ
の位相差シフト量を制御し、波長シフトフィルタ３″で
の透過する波長の帯域をシフトさせることで状態Ｎｏ．
１乃至状態Ｎｏ．３で示すように各々の蛍光色素の発光
蛍光のみを順次透過させるようになる。

【０１００】演算制御部１７は、撮像装置１５から得ら
れた蛍光強度分布に演算処理を施して記憶装置２０から
のデータと比較して判定することで、これら３種類の蛍
光色素の種類及び位置を識別することが可能となる。

【０１０１】このように本実施の形態によれば、上記第
６の実施の形態と同様に、九州フィルタとして配置設定
される波長シフトフィルタ３″を構成する可変位相板２
１の印加電圧を変更することで位相差のシフト量を変更
し、発光蛍光の波長帯域を選択して透過させているた
め、各色素の蛍光波長が非常に近い場合や、オーバーラ
ップしている場合には、波長シフトフィルタ３″の透過
波長帯域を狭く設定することで、所望する色素の蛍光以
外の他の色素の蛍光を排除することができ、より正確に
標本１１における蛍光色素の種類及び位置を識別するこ
とができる。

【０１０２】尚、本発明は上記第１乃至第７の実施の形
態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範
囲内で種々変形して実施することが可能であるものとす
る。また、請求項４に係る発明は、上記請求項１記載の
発明において、上記励起フィルタ及び吸収フィルタの少
なくとも一方は、光軸に挿入する部位の膜厚を連続的に
可変設定することが可能な干渉フィルタであり、この干
渉フィルタを光軸に対して移動することにより透過波長
帯域を変更する透過波長帯域変更手段を有することを特
徴とするものとする。

【０１０３】このような構成とすれば、請求項１記載の
発明の作用効果に加えて、膜厚の変化の度合いを適当に
設定すれば所望の透過波長帯域の変更量を容易に設定可
能となる。

【０１０４】また、請求項５記載に係る発明は、上記請
求項１記載の発明において、上記励起フィルタ及び上記
吸収フィルタの少なくとも一方は、偏光板と位相差が可
変な可変位相板とで構成され、上記変更手段は、該可変
位相板の位相を変更することにより透過波長帯域を変更
することを特徴とするものとする。

【０１０５】このような構成とすれば、請求項１記載の
発明の作用効果に加えて、位相の変化を適当に設定すれ
ば所望の波長変更量が容易に設定可能となるだけでな
く、機械的な可動部なしに位相量を変更することも可能
なため、変更動作を高速化することができると共に耐久
性にも優れた構成とし、なおかつ装置をより小規模で実
現することができる。

【０１０６】

【発明の効果】以上詳記した如く本発明によれば、安価
で装置自体及び操作に要する空間を充分小さなものとし
ながら、簡単な操作で迅速に異なる多種類の蛍光色素を
定量的で正確に分離識別することが可能な蛍光顕微鏡を
提供できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の第１の実施の形態に係る構成を示す
図。

【図２】同実施の形態に係る動作を説明するための図。

【図３】同実施の形態に係る動作を説明するための図。

【図４】本発明の第２の実施の形態に係る構成を示す
図。

【図５】同実施の形態に係る動作を説明するための図。

【図６】本発明の第３の実施の形態に係る動作を説明す
るための図。

【図７】上記実施の形態に係る変形例の構成を示す図。

【図８】本発明の第４の実施の形態に係る構成を示す
図。

【図９】同実施の形態に係る動作を説明するための図。

【図１０】本発明の第５の実施の形態に係る構成を示す
図。

【図１１】同実施の形態に係る動作を説明するための
図。

【図１２】本発明の第６の実施の形態に係る構成を示す
図。

【図１３】本発明の第７の実施の形態に係る構成を示す
図。

【図１４】同実施の形態に係る動作を説明するための
図。

【符号の説明】 １…光源 ２ａ，２ｂ…照明レンズ ３，３′，３″…波長シフトフィルタ ４…励起フィルタ ５…ダイクロックミラー ６…吸収フィルタ ７…蛍光フィルタセット ８…照明光軸 ９…観察光軸 １０…対物レンズ １１…標本 １２…ステージ １３…結像レンズ １４…接眼レンズ １５…撮像装置 １６…撮像素子 １７…演算制御部 １８…波長シフトフィルタ駆動部 １９…角度検出部 １９′…位置検出部 ２０…記憶装置 ２１…可変位相板 ２２…偏光板 ２２ａ…ポラライザ ２２ｂ…アナライザ ２３…位相差変更部 ２４…位相差検出部

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 光源からの光を選択的に透過する励起フ
   ィルタ、この励起フィルタを透過した励起光を標本へ導
   くと共にこの標本からの蛍光を透過するダイクロックミ
   ラー、及び上記標本からの蛍光を選択的に透過する吸収
   フィルタを備え、複数の蛍光色素で染色された上記標本
   を観察するための蛍光顕微鏡において、 上記励起フィルタと上記吸収フィルタの少なくとも一方
   の透過波長帯域を変更する変更手段と、 この変更手段で選択された波長を検出する検出手段と、 上記標本の像を撮像する撮像素子と、 上記検出手段で得た選択波長と上記撮像素子で撮像した
   波長変更による像の変化を比較し、上記標本が染色され
   ている蛍光色素の種類及び位置を識別する識別手段とを
   具備したことを特徴とする蛍光顕微鏡。
2. 【請求項２】 上記励起フィルタ及び吸収フィルタの少
   なくとも一方は、それぞれ独立して透過波長帯域を変更
   可能な複数のフィルタから構成されることを特徴とする
   請求項１記載の蛍光顕微鏡。
3. 【請求項３】 上記励起フィルタ及び吸収フィルタの少
   なくとも一方は干渉フィルタであり、 上記変更手段は、上記干渉フィルタを光軸に対して垂直
   な回転軸を中心に回転することにより透過波長帯域を変
   更することを特徴とする請求項１記載の蛍光顕微鏡。