JP5270337B2 - 抗Aβ抗体を精製する方法 - Google Patents
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Description
本願は、2005年6月17日出願の米国仮特許出願第60/691,821号明細書「Fc領域を有するタンパク質を精製する方法(METHODS OF PURIFYING Fc REGION CONTAINING PROTEINS)」の優先権を主張するものである。本願の内容全体は本明細書中に援用される。
Selkoe(1989年)Cell 58:611〜612頁 Hardy(1997年)Trends Neurosci.20:154〜159頁 LorenzoおよびYankner(1996年)Ann.NY Acad.Sci.777:89〜95頁 Kohら(1990年)Brain Research 533:315〜320頁 Mattsonら(1992年)J.Neurosciences 12:376〜389頁 Chenら(2000年)Nature 408:975〜985頁 Walshら(2002年)Nature 416:535〜539頁 Bardら(2000年)Nat.Med.6:916〜919頁 Bardら(2003年)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:2023〜2028頁 Buttiniら(2005年)J.Neurosci.25:9096〜101頁
本発明は、Aβ結合タンパク質、特に、Aβ結合抗体を精製する方法を特徴とする。本発明の方法は、ヒトへの投与のために開発されたタンパク質(例えば抗体)の精製に特に適する。特に、本発明は、細胞培養物中に産生される、定常領域を有するタンパク質、特にFc領域を有するタンパク質(例えば抗体)の精製を特徴とする。
本発明のさらなる説明に先立ち、本明細書で用いられる特定の用語の定義を示すことは、その理解に役立つものでありうる。本明細書で示される定義は分類されているものであり、これはあくまで参照を容易にするためであって限定を目的とするものではない。
本発明は、Aβ結合タンパク質、特にAβ結合抗体を精製する方法を特徴とする。特に本発明は、細胞培養物内で生成される、定常領域を有するタンパク質、特にFc領域を有するタンパク質(例えば抗体)の精製を特徴とする。様々な態様では、本発明は、抗−Aβ抗体などのFc領域を有するAβ結合タンパク質を、タンパク質およびその1種もしくは複数種のリードスルー変異体、例えばイントロンリードスルー変異体などを含有する溶液から精製するための方法を提供する。特徴的な態様では、本発明の方法を用いることで、タンパク質調製物中、例えば抗体調製物中での1種もしくは複数種のイントロンリードスルー(IRT)変種のレベルが低下する。「イントロンリードスルー変異体」および「イントロンリードスルー変種」という用語は、本明細書で同義的に用いられ、Aβ結合タンパク質の合成においてポリペプチド鎖伸長がコーディング領域上流のイントロン内の停止コドンによってコーディング領域の転写の上流で終結する場合のプロセスの産物を示す。産物は、1つもしくは複数の不完全なドメインを有するかまたはそのドメインを欠いた目的タンパク質の変異体(すなわちイントロンリードスルー変異体)である。かかるイントロンは、数種の異なるイントロンリードスルー変異体を生成する可能性をもたらす2つ以上の停止コドンを有しうる。
本明細書で用いられる「ソース液体」という用語は、少なくとも1種の標的物質を含有する液体を示し、同物質は共存する他の物質から精製されることが求められる。ソース液体は、例えば水溶液、有機溶媒系、または水/有機溶媒混合物もしくは溶液でありうる。ソース液体は、多種の生体分子(タンパク質、抗体、ホルモン、およびウイルスなど)、小分子(塩、糖類、脂質など)、および微粒子物質までも含有する複合混合物または溶液である場合が多い。典型的な生物学的起源を有するソース液体が水溶液または懸濁液として出発しうる一方、それは溶媒沈殿、抽出などの初期分離ステップで用いられる有機溶媒も含有しうる。本発明の様々な実施形態による精製に準じた貴重な生体物質を含有しうるソース液体の例として、バイオリアクターからの培養上清、均質化された細胞懸濁液、血漿、血漿画分、および乳液(ミルク)が挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書に記載の本発明に従って精製されるべきAβ結合タンパク質、例えば抗−Aβ抗体は、当該技術分野で十分に確立されており、例えば合成技術(組換え技術およびペプチド合成またはこれらの技術の組み合わせなど)を含む技術を用いて調製されうるか、またはタンパク質の内因性ソースから単離されうる。様々な実施形態では、抗体は、例えばポリクローナル抗体調製物、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であってもよい。抗体を産生するための技術は以下にさらに記載される。他の実施形態では、Aβ結合タンパク質は、Aβに結合可能なタンパク質またはポリペプチドの一部に融合される抗体Fc領域を含む抗体融合タンパク質であってもよい。抗体融合タンパク質の調製についても以下にさらに記載される。
ポリクローナル抗体を、免疫原で適切な被験体を免疫することにより調製してもよい。免疫された被験体における抗体力価を、例えば固定化された標的抗原を用いる酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を用いた標準技術により経時的に監視してもよい。標的抗原に特異的な抗体分子を、必要に応じて哺乳動物から(例えば血液から)単離し、さらにプロテインA Sepharoseクロマトグラフィーなどの周知の技術により精製して抗体、例えばIgGの画分を取得してもよい。免疫後の適切な時間、例えば抗−抗原抗体力価が最大である場合、抗体産生細胞を被験体から取得し、コーラー(Kohler)およびミルスタイン(Milstein)(1975年) Nature 256:495〜497頁)に最初に記載されたハイブリドーマ技術など(ブラウン(Brown)ら(1981年) J.Immunol.127:539〜46頁;ブラウン(Brown)ら(1980年) J.Biol.Chem.255:4980〜83頁;イェー(Yeh)ら(1976年) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:2927〜31頁;およびイェー(Yeh)ら(1982年) Int.J.Cancer 29:269〜75頁も参照)の標準技術によりモノクローナル抗体を調製するのに用いてもよい。キメラポリクローナル抗体の調製においては、ベクラー(Buechler)ら、米国特許第6,420,113号明細書を参照のこと。
リンパ球と不死化細胞株を融合させるために用いられる多数の周知のプロトコルのうちのいずれかをモノクローナル抗体を産生する目的で適用してもよい(例えば、G.ガルフレ(G.Galfre)ら(1977年) Nature 266:55052頁;ゲフター(Gefter)ら、Somatic Cell Genet、上記;レーナー(Lerner)、Yale J.Biol.Med.、上記;ケネス(Kenneth)、Monoclonal Antibodies、上記を参照)。さらに、当業者は、かかる方法には多数のバリエーションがあり、これらもまた有用であることを理解するであろう。典型的には、不死化細胞株(例えば骨髄腫細胞株)はリンパ球と同じ哺乳類種に由来する。例えば、マウスハイブリドーマを本発明の免疫原性調製物で免疫されたマウス由来のリンパ球と不死化マウス細胞株との融合により作製してもよい。好ましい不死化細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培地(「HAT培地」)に感受性を示すマウス骨髄腫細胞株である。多数の骨髄腫細胞株(例えばP3−NS1/1−Ag4−1、P3−x63−Ag8.653またはSp2/O−Ag14骨髄腫株)のいずれかを、標準技術に従い融合パートナーとして用いてもよい。これらの骨髄腫株はATCCから入手可能である。典型的には、HAT−感受性のマウス骨髄腫細胞は、ポリエチレングリコール(「PEG」)を用いてマウス脾細胞に融合される。次いで、融合物から得られるハイブリドーマ細胞がHAT培地を用いて選択され、それは未融合骨髄腫細胞および非生産的に融合された骨髄腫細胞を死滅させる(未融合脾細胞は形質転換されていないため数日後に死滅する)。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、標準ELISAアッセイを用いた、ハイブリドーマ培養上清を標的抗原に結合する抗体についてスクリーニングすることにより検出される。
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマの調製に代わり、モノクローナル抗体を、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー(例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー)を標的抗原によりスクリーニングすることによって標的抗原に結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離することにより、同定し、単離してもよい。ファージディスプレイライブラリの生成およびスクリーニングのためのキットは市販されている(例えば、ファルマシア(Pharmacia)製Recombinant Phage Antibody System、カタログ番号27−9400−01;およびストラタジーン(Stratagene)製SurfZAP(商標)Phage Display Kit、カタログ番号240612)。さらに、特に抗体ディスプレイライブラリーの生成およびスクリーニングでの使用に準じた方法および試薬の例が、例えば、ラドナー(Ladner)ら、米国特許第5,223,409号明細書;カン(Kang)ら、PCT国際公開第92/18619号パンフレット;ダウワー(Dower)ら、PCT国際公開第91/17271号パンフレット;ウインター(Winter)ら、PCT国際公開第92/20791号パンフレット;マークランド(Markland)ら、PCT国際公開第92/15679号パンフレット;ブレイトリング(Breitling)ら、PCT国際公開第93/01288号パンフレット;マッカファーティ(McCafferty)ら、PCT国際公開第92/01047号パンフレット;ガラード(Garrard)ら、PCT国際公開第92/09690号パンフレット;ラドナー(Ladner)ら、PCT国際公開第90/02809号パンフレット;フックス(Fuchs)ら(1991年) Bio/Technology 9:1370〜1372頁;ヘイ(Hay)ら(1992年) Hum.Antibod.Hybridomas 3:81〜85頁;フセ(Huse)ら(1989年) Science 246:1275〜1281頁;グリフィス(Griffiths)ら(1993年) EMBO J 12:725〜734頁;ホーキンス(Hawkins)ら(1992年) J.Mol.Biol.226:889〜896頁;クラークソン(Clarkson)ら(1991年) Nature 352:624〜628頁;グラム(Gram)ら(1992年) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:3576〜3580頁;ガラッド(Garrad)ら(1991年) Bio/Technology 9:1373〜1377頁;フーゲンブーム(Hoogenboom)ら(1991年) Nuc.Acid Res.19:4133〜4137頁;バーバス(Barbas)ら(1991年) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7978〜7982頁;およびマッカファーティ(McCafferty)ら、Nature (1990年)348:552〜554頁にて見出されうる。
さらに、標準の組換えDNA技術を用いて作製可能な、ヒト部分と非ヒト部分の双方を含む、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体などの組換え抗体は、本発明の範囲内にある。
あるいは、今では免疫時、内因性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体の完全レパートリーを産生可能なトランスジェニック動物(例えばマウス)を作製することは可能である。例えば、キメラおよび生殖系列変異マウスにおける抗体の重鎖結合領域(JH)遺伝子のホモ接合性欠失が内因性抗体産生の完全な阻害を招くことが記載されている。かかる生殖系列変異マウスにおけるヒト生殖系列の免疫グロブリン遺伝子アレイの移入が、抗原チャレンジの際にヒト抗体の産生をもたらす。例えば、米国特許第6,150,584号明細書;米国特許第6,114,598号明細書;および米国特許第5,770,429号明細書を参照のこと。
二重特異性抗体(BsAb)は、少なくとも2つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。かかる抗体は、完全長の抗体または抗体断片(例えばF(ab)’2二重特異性抗体)から誘導可能である。二重特異性抗体を作製するための方法は、当該技術分野で既知である。従来からの完全長二重特異性抗体の産生は2つの免疫グロブリンの重鎖−軽鎖ペアの共発現に基づくものであり、この場合、2つの鎖は異なる特異性を有する(ミルスタイン(Millstein)ら、Nature、305:537〜539頁(1983年))。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖がランダムに分かれることから、これらのハイブリドーマ(クアドローマ(quadromas))は異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生する(国際公開第93/08829号パンフレットおよびトラウネッカー(Traunecker)ら、EMBO J.、10:3655〜3659頁(1991年)を参照)。
本発明で用いられるFc領域を有するAβ結合タンパク質は、Aβに結合可能な非抗体タンパク質またはポリペプチドに融合される抗体の少なくともFc部分を有する融合タンパク質でありうる。したがって、Aβに結合可能でありかつFcに関連した機能(血清安定性、Fc受容体結合など)を有する可溶性融合タンパク質が生成される。抗体融合タンパク質(当該技術分野ではFc融合タンパク質またはIg融合タンパク質とも称される)は、標準の組換えDNA技術を用いて調製可能なものであり、当該技術分野で記載されており、例えば米国特許第5,116,964号明細書、米国特許第5,225,538号明細書、米国特許第5,336,603号明細書および米国特許第5,428,130号明細書(すべてカポン(Capon)らによる)を参照のこと。
一般に、本発明の抗体としては、Aβペプチドの標的化によるアミロイド生成性疾患(amyloidogenic diseases)、特にアルツハイマー病の治療を目的とした種々の抗体挙げられる。
一般に、本発明の実行には、他に指示がない限り、化学、分子生物学、組換えDNA技術、免疫学(特に、例えば免疫グロブリン技術)、および電気泳動における標準技術に関する従来技術が用いられる。例えば、サムブルック(Sambrook)、フリッツ(Fritsch)およびマニアティス(Maniatis)、Molecular Cloning:コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)(1989年);Antibody Engineering Protocols(Methods in Molecular Biology)、510、ポール S.(Paul S.)、ヒュマーナ・プレス(Humana Pr)(1996年);Antibody Engineering:A Practical Approach(Practical Approach Series、169)、マッカファーティ(McCafferty)編、アイアールエル・プレス(Irl Pr)(1996年);Antibodies:A Laboratory Manual、ハーロウ(Harlow)ら、シーエスエイチエル・プレス(C.S.H.L.Press)発行(1999年);Current Protocols in Molecular Biology、アウスベル(Ausubel)ら編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ(John Wiley & Sons)(1992年);ブセ(Bousse)ら、Protein Sizing on a Microchip、Anal.Chem.73、1207〜1212頁(2001年);ナップ(Knapp)ら、Commercialized and Emerging Lab−on−a−Chip Applications;Proceedings of the μTAS 2001 Symposium、ラムゼイ J.M.(Ramsey J.M.)およびファンデンベルグ A.(van den Berg A.)、7〜10頁(2001年);およびムハトル(Mhatre)ら、Strategies for locating disulfide bonds in a monoclonal antibody via mass spectrometry、Rapid Commun.Mass Spectrom、13(24)2503〜2510頁(1999年)を参照のこと。
標的抗体を、例えば懸濁液培養物中で増殖させた組換え哺乳類細胞株を用いて産生してもよい。生成バイオリアクター内で目的の抗体を含有する馴化培地を生成する。得られた生成物を回収し、例えば精密濾過および0.22μmの濾過、または遠心分離、あるいはパッド濾過および0.22μmの濾過などの任意の適切な清澄化ステップを用いて清澄化することが可能である。
本明細書で例示される標的モノクローナル抗体(AAB、12A11)の精製は、プロテインAの親和性クロマトグラフィー上での標的分子の捕捉からなる。これは、rmpプロテインA Sepharose(商標)Fast Flow、プロテインA Sepharose(商標)Fast Flow、またはMabSelectプロテインAから構成されうる。次いで各実験に記載のように樹脂を洗浄し、生成物を溶出させ、不純物レベルについて試験する。
逆相HPLC(RP−HPLC)を用い、AABモノクローナル抗体試料中に存在するIRTの量を定量した。サイズ排除クロマトグラフィー(SEC−HPLC)を用い、単量体タンパク質(単量体IgG)種、高分子量(HMW)種、および低分子量(LMW)種の百分率を測定した。変性SEC−HPLC分析を行い、試料中のアンダージスルフィド結合(UDB)種の相対量を測定した。試験試料中のHCPのレベルを酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を用いて測定した。
(逆相HPLC(AAB IRT分析))
RP−HPLCを以下のように行った。各試料のジスルフィド還元を、2.5mM DTTの存在下、40℃で60分間のインキュベーションにより行った。アルキル化を5.5mMヨード酢酸の存在下、室温でのインキュベーションにより行った。還元およびアルキル化を行ってから、全試料を1M DTT5μlでクエンチした。このアッセイでの定量限界は0.5%である。還元しアルキル化した試料各々約40μgをPOROS R1/H RP−HPLCカラムに注入し、以下の条件下で70分間実験した。
カラム:Poros R1/H RP−HPLC
カラム温度:50℃;
移動相A:水中、0.1%TFA(w/v);
移動相B:95%アセトニトリル中、0.1%TFA(w/v);
流速:1.0mL/分
検出:217nm
運転時間:70分
注入:各々、約40μgで3連
勾配時間を表1に列挙する。
変性SEC−HPLCを以下のように行った。変性SECアッセイ用の試料の前処理として、200μg/mLのタンパク質、3MグアニジンHCl、および100mMトリス(pH7.4)の最終濃度での試薬/試料混合物が含まれる。試料を反転により混合しながら80℃で20分間加熱した。このアッセイにおいては、2種の対照を用いてUDBレベルの限度設定(bracketing)を可能にした。低レベルのUDBおよび高レベルのUDBを伴う内部参照を対照として用いた。
カラム:Tosoh BioSep G3000 SWxl
カラム温度:周囲温度
移動相:3MグアニジンHCl、25mM NaPO4、pH6.8
勾配:アイソクラティック
流速:0.5mL/分
検出:280nm
運転時間:50分
注入:50μL(10μg)で3連
この実施例では、抗−Aβモノクローナル抗体AABを含有する不純溶液をプロテインAカラム上への吸着により精製した後、CaCl2、MgCl2、NaClまたはプロピレングリコールのいずれかを含有する洗浄緩衝液を用いて1回目の洗浄を行った。
カラム寸法−1.0cm×11.4cm
運転流速−150cm/時
平衡化1−20mMトリス、150mM NaCl、pH7.5(5カラム容量)
フラッシュ−20mMトリス、150mM NaCl、pH7.5(1カラム容量)
洗浄1−洗浄1を含まない実験#1を除き一定でない(表2参照)
洗浄2−20mMトリス、1.0M NaCl、pH7.5(5カラム容量)
洗浄3−10mMトリス、75mM NaCl、pH7.5(7カラム容量)
溶出−50mMグリシン、75mM NaCl、pH3.1(6カラム容量)
剥離1−20mMクエン酸ナトリウム、pH2.7(5カラム容量)
剥離2−6MグアニジンHCl(2カラム容量)
剥離洗浄−20mMトリス、150mM NaCl、pH7.5(5カラム容量)
保存−16%エタノール(5カラム容量)
運転温度:2〜8℃
この実施例では、大規模な抗体精製を、IRT種を除去するためのCaCl2洗浄を伴うプロテインAのクロマトグラフィーを用いて行った。
カラム寸法−13cm×18cm
運転流速−150cm/時、300cm/時
平衡化1−20mMトリス、150mM NaCl、pH7.5(5カラム容量)
フラッシュ−20mMトリス、150mM NaCl、pH7.5(2カラム容量)
洗浄1−実験#1では50mMトリス、2M CaCl2、pH7.5、実験#2では洗浄1を行わない
洗浄2−20mMトリス、1.0M NaCl、pH7.5(5カラム容量)
洗浄3−10mMトリス、75mM NaCl、pH7.5(5カラム容量)
溶出−50mMグリシン、25mM NaCl、pH3.1(6カラム容量)
剥離1−50mMグリシン、0.5M NaCl、pH2.7(5カラム容量)
剥離2−6MグアニジンHCl(2カラム容量)
剥離洗浄−20mMトリス、150mM NaCl、pH7.5(5カラム容量)
保存−16%エタノール(5カラム容量)
運転温度:2〜8℃
この実施例では、CaCl2洗浄がAABモノクローナル抗体を含有する調製物から宿主細胞DNAを除去する能力について試験した。
カラム寸法−1.1cm×20cm
運転流速−300cm/時
平衡化1−20mMトリス、150mM NaCl、pH7.5(5カラム容量)
フラッシュ−20mMトリス、150mM NaCl、pH7.5(2カラム容量)
洗浄1−50mMトリス、2.0M CaCl2、pH7.5(5カラム容量)(実験2および3のみ)
洗浄2−20mMトリス、1.0M NaCl、pH7.5(5カラム容量)(実験1および3のみ)
洗浄3−10mMトリス、75mM NaCl、pH7.5(7カラム容量)
溶出−50mMグリシン、75mM NaCl、pH3.0(6カラム容量)
剥離−50mMグリシン、0.5M NaCl、pH2.7(5カラム容量)
剥離洗浄−20mMトリス、150mM NaCl、pH7.5(5カラム容量)
保存−16%エタノール(5カラム容量)
運転温度:18〜24℃
この実施例では、宿主細胞タンパク質(HCP)の除去能について様々な洗浄条件を試験した精製実験において第2の抗−Aβモノクローナル抗体12Al1を用いた。
樹脂容量−50μL
洗浄用賦形剤−塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム
賦形剤濃度−100、250、500、1000、1500、および2000mM
賦形剤pH−6.0および7.5
溶出緩衝液−25mMヘペス、10mM NaCl、pH3.0、25mMヘペス、100mM NaCl、pH3.0、50mMグリシン、10mM NaCl、pH3.0、50mMグリシン、100mM NaCl、pH3.0および100mMアルギニン、10mM NaCl、pH3.0、100mMアルギニン、100mM NaCl、pH3.0
運転温度:18〜24℃
この実施例では、CaCl2洗浄におけるアンダージスルフィド結合種(UDB)を除去する能力について試験した。
カラム寸法−1.0cm×11.4cm
運転流速−150cm/時
平衡化1−20mMトリス、150mM NaCl、pH7.5(5カラム容量)
フラッシュ−20mMトリス、150mM NaCl、pH7.5(1カラム容量)
洗浄1−実験1では50mM酢酸塩、2.0M CaCl2、pH5.0、実験2ではなし
洗浄2−20mMトリス、1.0M NaCl、pH7.5(5カラム容量)
洗浄3−10mMトリス、75mM NaCl、pH7.5(7カラム容量)
溶出−50mMグリシン、75mM NaCl、pH3.1(6カラム容量)
剥離1−20mMクエン酸ナトリウム、pH2.7(5カラム容量)
剥離2−6MグアニジンHCl(2カラム容量)
剥離洗浄−20mMトリス、150mM NaCl、pH7.5(5カラム容量)
保存−16%エタノール(5カラム容量)
運転温度:2〜8℃
この実施例では、MnCl2またはNiCl2のいずれかを含有する洗浄が、抗−Aβモノクローナル抗体AABを含有する調製物から不純物を除去する能力について試験した。
カラム寸法−1.0cm×11.5cm(9mL)
運転流速−300cm/時(平衡化、洗浄2、溶出、再生、保存)
運転流速−230cm/時(ロード、フラッシュ、洗浄1)
平衡化1−50mMトリス、150mM NaCl、pH7.5(5.0カラム容量)
洗浄1−変動(組成については表8を参照)
洗浄2−50mMトリス、10mM NaCl、pH7.5(5カラム容量)
溶出−50mMグリシン、10mM NaCl、pH3.0(3カラム容量)
再生−50mM NaOH、0.5M Na2SO4(5カラム容量)
保存−16%エタノール、50mMトリス、150mM NaCl、pH7.5(5カラム容量)
運転温度:18〜24℃
当業者は、単なる通常の実験を用いて、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多数の等価物について理解するかまたは確認できるであろう。かかる等価物は、添付の特許請求の範囲にて包含されるように意図されている。
Claims (34)
- Fc領域を有する抗Aβ抗体を、前記抗Aβ抗体および1種もしくは複数種の不純物を含有するソース液体から精製するための方法であって、
前記抗Aβ抗体を、プロテインAおよびプロテインGのうちの1種または複数種を含むFc結合剤に吸着させるステップ、
前記抗Aβ抗体と結合した前記Fc結合剤を濃度0.5M〜3MのCaCl2を含有する5〜6、6〜8または8〜9の範囲のpHを有する緩衝溶液で洗浄し、1種もしくは複数種の不純物を低下させるステップであって、前記1種もしくは複数種の不純物がイントロンリードスルー変種(IRT)、アンダージスルフィド結合種(UDB)、高分子量種(HMW)および低分子量種(LMW)からなる群から選択されるステップ、ならびに
前記抗Aβ抗体を2〜4の範囲のpHを有する溶出緩衝溶液中に溶出させることによっての前記Fc結合剤から前記抗Aβ抗体を回収するステップ
を含む、方法。 - 前記1種もしくは複数種の不純物がIRTである請求項1に記載の方法。
- 前記抗Aβ抗体が、抗体融合体、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体からなる群から選択される請求項1に記載の方法。
- 前記抗Aβ抗体がヒト化抗−Aβ抗体である請求項1に記載の方法。
- 前記ヒト化抗Aβ抗体が、以下
ATCCに寄託されているPTA−5130細胞株より産生される3D6抗体のヒト化バージョン、
ATCCに寄託されているPTA−5129細胞株より産生される10D5抗体のヒト化バージョン、
ATCCに寄託されているPTA−7271細胞株より産生される12A11抗体のヒト化バージョン、
ATCCに寄託されているPTA−6123細胞株より産生される266抗体のヒト化バージョン、
ATCCに寄託されているPTA−7270細胞株より産生される15C11抗体のヒト化バージョン
からなる群から選択される、請求項4に記載の方法。 - Fc領域を有する前記抗Aβ抗体が組換え生成される請求項1に記載の方法。
- Fc領域を有する前記抗Aβ抗体がチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞内で組換え生成される請求項6に記載の方法。
- 前記Fc結合剤がプロテインAを含む請求項1に記載の方法。
- 前記Fc結合剤が固相上に固定化される請求項1に記載の方法。
- 前記固相がビーズ、ゲル、樹脂、および粒子のうちの1つもしくは複数を含有する請求項9に記載の方法。
- 前記CaCl2を含有する緩衝溶液が7.3〜7.7の範囲内のpH値を有する請求項1に記載の方法。
- 前記CaCl 2 を含有する緩衝溶液が0.5〜2Mの範囲内のCaCl2濃度を有する請求項1に記載の方法。
- 前記CaCl 2 を含有する緩衝溶液が1.5M〜2.5MのCaCl2を含有する請求項1に記載の方法。
- 前記CaCl 2 を含有する緩衝溶液が1.5M〜2MのCaCl2を含有する請求項1に記載の方法。
- 前記抗Aβ抗体をFc結合剤に吸着させるステップと前記Fc結合剤を洗浄するステップとが2℃〜24℃の範囲内の温度で行われる請求項1に記載の方法。
- 前記1種もしくは複数種の不純物が宿主細胞タンパク質および宿主細胞DNAのうちの1種もしくは複数種を含む請求項1に記載の方法。
- 前記抗Aβ抗体を前記Fc結合剤から回収するステップが、2.5〜3.5の範囲内のpHを有する溶出緩衝液を用いて前記抗Aβ抗体を溶出させるステップを含む請求項1に記載の方法。
- 前記方法が、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、固定化金属親和性クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)からなる群から選択されるクロマトグラフィーステップをさらに含む請求項1に記載の方法。
- 前記方法が、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、透析、親和性クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、エタノール沈殿、逆相HPLC(RP−HPLC)、およびクロマトフォーカシングからなる群から選択されるさらなる精製ステップをさらに含む請求項1に記載の方法。
- 前記1種もしくは複数種の不純物が前記抗Aβ抗体の1種もしくは複数種のイントロンリードスルー変異体を含み、かつ回収された前記抗体を含有する溶出溶液中のイントロンリードスルー変異体のレベルが前記ソース液体中のイントロンリードスルー変異体のレベルの少なくとも1/5未満である請求項1に記載の方法。
- 回収された前記抗体を含有する溶出溶液中のイントロンリードスルー変異体のレベルが前記ソース液体中のイントロンリードスルー変異体のレベルの少なくとも1/10未満である請求項20に記載の方法。
- 前記1種もしくは複数種の不純物が前記抗Aβ抗体の1種もしくは複数種のイントロンリードスルー変異体を含み、かつ前記イントロンリードスルー変異体が、回収された前記抗体を含有する溶出溶液中で前記抗体の種の1%未満を構成する請求項1に記載の方法。
- 前記イントロンリードスルー変異体が、回収された前記抗体を含有する溶出溶液中で前記抗体の種の0.8%未満、0.5%未満または0.2%未満を構成する請求項22に記載の方法。
- 前記1種もしくは複数種の不純物が前記抗Aβ抗体の1種もしくは複数種の低分子量種を含み、かつ前記低分子量種が、回収された前記抗体を含有する溶出溶液中で前記抗体の種の1%未満を構成する請求項1に記載の方法。
- 前記低分子量種が、回収された前記抗体を含有する溶出溶液中で前記抗体の種の0.8%未満、0.5%未満または0.2%未満を構成する請求項24に記載の方法。
- 前記1種もしくは複数種の不純物が前記抗Aβ抗体の1種もしくは複数種のアンダージスルフィド結合変異体を含み、かつ前記アンダージスルフィド結合変異体が、回収された前記抗体を含有する溶出溶液中で前記抗体の種の15%未満を構成する請求項1に記載の方法。
- 前記アンダージスルフィド結合変異体が、回収された前記抗体を含有する溶出溶液中で前記抗体の種の10%未満、5%未満または2%未満を構成する請求項26に記載の方法。
- CaCl2による洗浄後、少なくとも濃度10mMのNaClを含む緩衝溶液により、前記抗Aβ抗体に結合したFc結合剤を洗浄するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記1種以上の不純物がイントロンリードスルー変種、アンダージスルフィド結合種、低分子量種、宿主細胞タンパク質または宿主細胞DNAのうちの1種以上を含み、かつ前記1種以上の不純物がソース液体中のレベルよりも半分以下のレベルに低下される、請求項1に記載の方法。
- 前記抗Aβ抗体が、配列番号1の残基24〜39のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号1の残基55〜61のアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号1の残基94〜102のアミノ酸配列を有するCDR3の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖を含み、かつ配列番号2の残基31〜35のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号2の残基50〜65のアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号2の残基99〜108のアミノ酸配列を有するCDR3の重鎖相補性決定領域を含む重鎖を含むヒト化3D6抗体である、請求項1〜29のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ヒト化3D6抗体が、配列番号1の残基1〜112のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域、及び配列番号2の残基1〜119のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域を含む、請求項30に記載の方法。
- 前記ヒト化3D6抗体が配列番号:1のアミノ酸配列を含む軽鎖および配列番号:2の残基1〜448のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項31に記載の方法。
- 前記抗体がアイソタイプIgM、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4のものである、請求項1に記載の方法。
- 前記抗体がアイソタイプIgG1のものである、請求項33に記載の方法。
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