JP6147726B2 - タンパク質精製のためのバッファー系 - Google Patents
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本発明は、一連のクロマトグラフィユニット操作を用いた、細胞培養物または発酵ブロスからの組換えタンパク質精製の分野に関する。より詳細には、本発明は、タンパク質精製のための一連のユニット操作を通して用いられる塩化ナトリウム非含有バッファー系に関し、ここで、酸および塩基成分が、第三のナトリウム塩バッファー成分と共に決められた比率で組み合わされ、堅固なクロマトグラフィ操作のための適切なpHおよび導電率の制御が提供される。
組換えタンパク質の回収のための直交精製プロセス(orthogonal purification processes)は、バイオプロセス産業において充分に確立されており、改善されたスループット、不純物除去、商品コストの削減、開発時間の短縮、拡張性などのために進化を続けている。近年、プラットフォーム手法は、必要とされる開発労力が最小限である汎用テンプレートプロセスを、組換えタンパク質の様々なサブクラス、特にモノクローナル抗体の回収に用いることができるところまで著しく成熟してきた。この場合、モノクローナル抗体およびその他のタンパク質のためのプラットフォームプロセス開発の基礎となるコアコンセプトは、広範囲のクラスのターゲット分子に適用可能である一般的なユニット操作の識別および実行であり、それは、拡張性を有する堅固なプロセスの短時間での設計に用いることが可能であり得る精製工程のフレームワークへと繋がる。一連のクロマトグラフィおよび膜/ろ過工程に対する操作条件が確立されると、重要な検討事項は、堅固性およびプロセス性能の向上に繋がるバッファー成分の注意深い選択である。系統的な手法を行わず、従来からのベンチスケールでの実験を通したバッファー選択プロセスでは、ユニット操作からユニット操作へ必ずしも統合されていない数多くの成分に繋がる場合が多く、大スケールでの製造において実行することが困難であり得る。このような課題を克服し、統合されたプロセスに必要であるバッファー成分の数を制限するために、発明者らは、本明細書において、塩化ナトリウム非含有二成分バッファー系を提案する。
クロマトグラフィのモードは、プロテインAクロマトグラフィ、アニオン交換クロマトグラフィ、カチオン交換クロマトグラフィ、および混合モード(mixed-mode)クロマトグラフィからなる群より選択され、
クロマトグラフィのモードは、結合‐溶出モード(bind-elute mode)またはフロースルーモード(flow-through mode)のいずれかで操作され、
この多成分バッファー系は、有機酸、その有機酸の共役塩基のアルカリ金属もしくはアンモニウム塩、および有機塩基を含み、ならびに
クロマトグラフィのモードは、NaClを添加することなく作製されたバッファーを用いて実施される。
(a)固相上に固定されたプロテインAを、55mMトリス塩基、45mM酢酸を含む約pH7.5のプロテインA平衡バッファーを用いて平衡化すること、
(b)不純物含有溶液からのタンパク質を、固相上に固定されたプロテインAに吸着させること、
(c)55mMトリス塩基、45mM酢酸、300mM酢酸ナトリウムを含む約pH7.5の第一のプロテインA洗浄バッファーを用いて固相を洗浄することにより、不純物を除去すること、ならびに
(d)1.8mM酢酸ナトリウム、28.2mM酢酸を含む約pH3.6のプロテインA溶出バッファーを用いて、固相からタンパク質を回収すること、ここでバッファーはすべて、NaClを添加することなく作製される。
(a)アニオン交換マトリックスを、55mMトリス塩基、45mM酢酸を含む約pH7.5のアニオン平衡バッファーを用いて平衡化すること、
(b)不純物含有溶液をこのアニオン交換マトリックスに適用し、第一のフロースルーを回収すること、ならびに
(c)55mMトリス塩基、45mM酢酸、300mM酢酸ナトリウムを含む約pH7.5のアニオン洗浄バッファーをアニオン交換マトリックスに適用し、第二のフロースルーを回収すること、ここでバッファーはすべて、NaClを添加することなく作製される。
(a)カチオン交換マトリックスを、25mM酢酸ナトリウム、12.1mM酢酸を含む約pH5.0のカチオン平衡バッファーを用いて平衡化すること、
(b)不純物含有溶液からのタンパク質を、カチオン交換マトリックスに吸着させること、
(c)25mM酢酸ナトリウム、12.1mM酢酸を含む約pH5.0の第一のカチオン洗浄バッファーを用いて固相を洗浄することにより、不純物を除去すること、ならびに
(d)175mM酢酸ナトリウム、75mM酢酸を含む約pH5.0のカチオン溶出バッファーを用いて、固相からタンパク質を回収すること、ここでバッファーはすべて、NaClを添加することなく作製される。
プロセスから塩化ナトリウムを排除することにより、高濃度の塩化物溶液によるステンレススチール製プロセス装置に対する腐食の影響が管理され、全体として回避されることが確実になされる。
(a)固相上に固定されたプロテインAを、約55mMトリス塩基、約45mM酢酸を含む約pH7.5のプロテインA平衡バッファーを用いて平衡化すること、
(b)不純物含有溶液からのタンパク質を、固相上に固定されたプロテインAに吸着させること、
(c)約55mMトリス塩基、約45mM酢酸、300mM酢酸ナトリウムを含む約pH7.5の第一のプロテインA洗浄バッファーを用いて固相を洗浄することにより、不純物を除去すること、ならびに
(d)約1.8mM酢酸ナトリウム、約28.2mM酢酸を含む約pH3.6のプロテインA溶出バッファーを用いて、固相からタンパク質を回収すること、ここで、バッファーはすべて、NaClを添加することなく作製される。
(e)約30mM酢酸、約100mMHClを用いて、回収されたタンパク質を含有する溶液を約pH3.0まで滴定すること、
(f)工程(e)の溶液を、約30から約60分間約pH3.0に維持すること、および
(g)工程(f)の溶液のpHを、約1M トリスを用いて約pH7.5に調節すること。
(a)アニオン交換マトリックスを、約55mMトリス塩基、約45mM酢酸を含む約pH7.5のアニオン平衡バッファーを用いて平衡化すること、
(b)不純物含有溶液をアニオン交換マトリックスに適用し、第一のフロースルーを回収すること、および
(c)55mMトリス塩基、約45mM酢酸、約300mM酢酸ナトリウムを含む約pH7.5のアニオン洗浄バッファーをアニオン交換マトリックスに適用し、第二のフロースルーを回収すること、ここでバッファーはすべて、NaClを添加することなく作製される。
(a)カチオン交換マトリックスを、約25mM酢酸ナトリウム、約12.1mM酢酸を含む約pH5.0のカチオン平衡バッファーを用いて平衡化すること、
(b)不純物含有溶液からのタンパク質を、カチオン交換マトリックスに吸着させること、
(c)約25mM酢酸ナトリウム、約12.1mM酢酸を含む約pH5.0の第一のカチオン洗浄バッファーを用いて固相を洗浄することにより、不純物を除去すること、および
(d)175mM酢酸ナトリウム、75mM酢酸を含む約pH5.0のカチオン溶出バッファーを用いて、固相からタンパク質を回収すること、ここでバッファーはすべて、NaClを添加することなく作製される。
二成分バッファー系に組み込むことが可能であり得る数多くの可能性のあるバッファー成分を、イオン強度調節のための第三の成分(意図的に塩化ナトリウムは除く)と共に、抗体精製のためのプラットフォームプロセスを通して評価した。表2に、一般的にバイオプロセスとの適合性を有すると見なされているこれらの成分を挙げる。これらの実験では、図2aに示されるように、勾配供給機能を有する液体クロマトグラフィシステムを用いて濃縮バッファー溶液を混合し、様々な比率にてpHおよび導電率を測定した。図3、4、5、6は、それぞれ、酢酸/トリス塩基、クエン酸/トリス塩基、酢酸/リン酸ナトリウム、およびクエン酸/リン酸ナトリウムのサンプル結果をそれぞれ示す。これらの図では、白丸のデータポイントは、バッファーモル濃度の関数としての実験測定されたpH値を表し、一方実線および点線は、水溶液中でのイオンの挙動を予測するための詳細に確立されたDavies数学モデル[5]の溶液によって決定される、算出されたpH、導電率(全体として、溶液導電率に比例)、および緩衝容量の値を表す。これらの曲線により、特定のpHおよびイオン強度レベルが得られるイオン種の混合物を作製するために必要とされるバッファー比を決定することができ、従って、それは、特定のクロマトグラフィ工程におけるバッファーの適切性を評価するためのツールとなる。
クロマトグラフィプロセスはすべて、GEヘルスケア(ピスカタウェイ,ニュージャージー州,米国)製のAKTA Explorer 100システムを用いて実施する。MabSelect SuReプロテインAおよびCaptoQクロマトグラフィ媒体は、GEヘルスケア(ピスカタウェイ,ニュージャージー州,米国)から入手する。GigaCapS 650Mカチオン交換樹脂は、トーソーバイオサイエンス(Tosoh Bioscience)(モンゴメリービル(Montgomeryville),ペンシルベニア州,米国)から入手する。クロマトグラフィ媒体は、ミリポアコーポレーション(ベッドフォード,マサチューセッツ州,米国)から入手した直径1.1cmのVantageカラム中、製造元の推奨に従って、25cmの層高さに充填する。本研究に用いたIgGモノクローナル抗体は、グラクソスミスクラインのアッパーメリオン事業所(GlaxoSmithKline Upper Merion site)(キングオブプルシア(King of Prussia),ペンシルベニア州,米国)にて、哺乳類細胞培養を用いて組換え発現されたものである。化学薬品はすべて、JTベーカー(JT Baker)(フィリップスバーグ(Phillipsburg),ニュージャージー州,米国)またはシグマアルドリッチ(セントルイス,ミズーリ州,米国)から入手したものであり、USPグレードである。
MabSelect SuReを用いたプロテインA親和性クロマトグラフィによるモノクローナル抗体の精製は、表2に従って実施する。まず、カラムを、55mMトリス塩基、45mM酢酸、pH7.5により平衡化する。次に、清澄化哺乳類細胞培養ブロスのカラムへの適用を、充分なロード質量がカラムに適用されるまで行う。次に、カラムを55mMトリス塩基、45mM酢酸、300mM酢酸ナトリウム、pH7.5で洗浄する。溶出の前に、カラムを55mMトリス塩基、45mM酢酸、pH7.5により再平衡化する。続いて、カラムに、1.8mM酢酸ナトリウム、28.2mM酢酸、pH3.6による一段の溶出を施す。
前工程からのプロテインA溶出液を、30mM酢酸、100mMHClによりpH3.5に調節する。この低pH調節物を、30から60分間保持し、次に1M トリス塩基によりpH7.5に中和する。次に、続いての精製工程への準備として、中和プールをろ過する。
さらなる精製は、WFI(注射用水)による予備平衡リンスに続いて、55mMトリス塩基、45mM酢酸、pH7.5によりCaptoQカラムを平衡化することによって実施する。プロテインA平衡化に用いたものと同じ平衡バッファーをこの工程で再度用いており、それによって、作製する必要のあるバッファー溶液を最小限に抑えるという利点が得られていることに留意されたい。次に、中和プールをカラムに適用し、ここで、対象のタンパク質は流出し、回収され、不純物はカラムに結合して残留する。タンパク質の適用後、次に、残されたタンパク質がカラムから洗い流されて回収可能となるように、カラムを適切な平衡バッファーで洗浄する。
アニオン交換フロースルー工程から回収したタンパク質を、30mM酢酸、100mMHClにてpH5.0に滴定する。ここでも、この工程でのpH調節に、低pH処理溶液を再度使用していることに留意されたい。GigaCapS 650Mカラムを、25mM酢酸ナトリウム、12.1mM酢酸、pH5.0により平衡化する。次に、滴定したロードを、所望されるロード質量に達するまでカラムに適用する。続いて、カラムを、25mM酢酸ナトリウム、12.1mM酢酸、pH5.0により再度平衡化する。次に、175mM酢酸ナトリウム、75mM酢酸、pH5.0をカラムに適用することによって、カラムに一段の溶出を施す。カラムからの排出液を回収し、さらなる処理のために保持する。
Claims (17)
- 一連のクロマトグラフィ工程によるタンパク質の精製のための多成分バッファー系であって、
クロマトグラフィのモードは、親和性クロマトグラフィ、アニオン交換クロマトグラフィ、カチオン交換クロマトグラフィ、および混合モードクロマトグラフィからなる群より選択され、
前記クロマトグラフィのモードは、結合‐溶出モードまたはフロースルーモードのいずれかで操作され、
前記多成分バッファー系は、有機酸、前記有機酸の共役塩基のアルカリ金属もしくはアンモニウム塩、および有機塩基を含み、ならびに
前記クロマトグラフィのモードは、NaClを添加することなく作製されたバッファーを用いて実施される、多成分バッファー系。 - 前記親和性クロマトグラフィが、固相上に固定されたスーパー抗原を用いて実施される、請求項1に記載の系。
- 前記スーパー抗原が、プロテインA、プロテインG、およびプロテインLからなる群より選択される、請求項2に記載の系。
- 前記有機酸が、ギ酸、酢酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、マレイン酸、グリシン、グリシルクリシン、コハク酸、TES(2‐{[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]アミノ}エタンスルホン酸)、MOPS(3‐(N‐モルホリノ)プロパンスルホン酸)、PIPES(ピペラジン‐N,N’‐ビス(2‐エタンスルホン酸))、およびMES(2‐(N‐モルホリノ)エタンスルホン酸)からなる群より選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の系。
- 前記有機塩基が、トリス塩基、ビス‐トリス、ビス‐トリス‐プロパン、ビシン(N,N‐ビス(2‐ヒドロキシエチル)グリシン)、HEPES(4‐2‐ヒドロキシエチル‐1‐ピペラジンエタンスルホン酸)、TAPS(3‐{[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]アミノ}プロパンスルホン酸)、およびトリシン(N‐トリス(ヒドロキシメチル)メチルグリシン)からなる群より選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の系。
- 前記有機酸の前記共役塩基が、前記有機酸の前記共役塩基のナトリウム、カリウム、またはアンモニウム塩である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の系。
- 前記有機酸が酢酸である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の系。
- 前記有機塩基がトリス塩基である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の系。
- 前記有機酸が酢酸であり、かつ酢酸の前記共役塩基がナトリウム塩である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の系。
- 前記タンパク質が、抗原結合タンパク質である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の系。
- 前記抗原結合タンパク質が、IgGクラスの抗体である、請求項10に記載の系。
- 前記抗原結合タンパク質が、免疫グロブリン単一可変ドメインである、請求項10に記載の系。
- 前記一連のクロマトグラフィ工程が、プロテインAクロマトグラフィ、およびフロースルーアニオン交換クロマトグラフィを含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の系。
- 前記一連のクロマトグラフィ工程が、プロテインAクロマトグラフィ、フロースルーアニオン交換クロマトグラフィ、およびカチオン交換クロマトグラフィを含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の系。
- 前記一連のクロマトグラフィ工程が、55mMトリス塩基、45mM酢酸の存在下、pH7.5にて実施されるプロテインAクロマトグラフィを含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の系。
- 前記一連のクロマトグラフィ工程が、55mMトリス塩基、45mM酢酸の存在下、pH7.5にて実施されるフロースルーアニオン交換クロマトグラフィを含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載の系。
- 前記一連のクロマトグラフィ工程が、25mM酢酸ナトリウム、12.1mM酢酸の存在下、pH5.0にて実施されるカチオン交換クロマトグラフィを含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載の系。
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