JP2022542884A - Ｆｃｒｎアンタゴニストで抗体媒介性障害を処置する方法 - Google Patents

Ｆｃｒｎアンタゴニストで抗体媒介性障害を処置する方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、改変されたＦｃドメインを含むＦｃＲｎアンタゴニスト、例えば、結合ポリペプチド（例えば、抗体および／またはイムノアドヘシン）を使用して、抗体媒介性障害（例えば、自己免疫疾患）を処置する方法を提供する。本開示はまた、本明細書に開示されるＦｃＲｎアンタゴニストを使用して、画像診断を増強する方法を提供する。本開示は、本明細書に開示されるＦｃＲｎアンタゴニストを使用して、画像診断の間に放射性標識した抗体に対する正常組織の曝露を減少させる方法をさらに提供する。治療有効量の本明細書に開示されるＦｃＲｎアンタゴニストを対象に投与することを含む方法も提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国仮特許出願第６２／８７８，５４１号（２０１９年７月２５日出願）の優先権を主張し、その開示全体が参照により本明細書に組み入れられる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。２０２０年７月２３日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、０２２５４８＿ＷＯ０６２＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられており、８，１９３バイトである。
新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との抗体の相互作用は、抗体およびＦｃ由来の治療剤の血清半減期の維持および延長における決定因子である。ＦｃＲｎは、ＭＨＣクラス－Ｉ様α－ドメインおよびβ２－マクログロブリン（β２－ｍ）サブユニットのヘテロダイマーであり、他のＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）とは明らかに異なる抗体Ｆｃドメインの領域を認識する。ＦｃＲｎは様々な組織で発現されるが、主に血管内皮および腎臓および血液脳関門において作用すると考えられる。
ＦｃＲｎへの抗体結合は高度にｐＨ依存性であり、相互作用は低ｐＨ（ｐＨ＜６．５）でのみ高い親和性で（高ナノモル～低マイクロモル）生じるが、生理学的ｐＨ（およそｐＨ７．４）では生じない。エンドソームを６．５未満のｐＨまで酸性化すると、ＩｇＧとＦｃＲｎとの間の相互作用は非常に有利となり、ＦｃＲｎ結合抗体の分解の阻害および細胞表面へのリサイクリングの促進の直接の原因となる。ｐＨの増加は相互作用を弱め、抗体の血流への放出を促進する。
増強された結合が、野生型ＩｇＧ抗体と比較して延長された血清半減期の直接の結果として治療用抗体についての増加した効能および減少した投薬頻度をおそらくもたらすので、ハイスループット変異誘発アプローチを使用したＦｃ操作が、ＦｃＲｎ結合親和性を増強するバリアントを同定するために広く探求されてきた。しかし、ＦｃＲｎ結合親和性を増強するバリアントは、予測されない結果を有する可能性がある。例えば、とりわけＮ４３４ＷまたはＰ２５７Ｉ／Ｑ３１１Ｉ置換のようなｐＨ６．０でＦｃＲｎ親和性の大幅な増加を示す特定のＩｇＧバリアントは、カニクイザルおよびヒトＦｃＲｎ（ｈＦｃＲｎ）に関するトランスジェニックマウスにおいて野生型のまたは重度に減少した血清半減期を有する（例えば、Ｋｕｏ ｅｔ ａｌ．、Ｍａｂｓ．（２０１１）３（５）：４２２－３０；Ｄａｔｔａ－Ｍａｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（２００７）２８２：１７０９－１７；およびＤａｔｔａ－Ｍａｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｐｏｓ．（２００７）３５：８６－９４を参照のこと）。Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ（ＱＬ）バリアントは、動物モデルにおいてＦｖ特異的な結果を示した（例えば、Ｄａｔｔａ－Ｍａｎｎａｎ、２００７、上記；およびＨｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００６）１７６：３４６－５６を参照のこと）。Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（ＹＴＥ、ＥＵナンバリング）バリアントは、インビトロで１０倍の増強を示したが、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体に対する親和性の２分の１の減少に起因してインビボで減少した抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示す（例えば、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００２）１６９（９）：５１７１－８０を参照のこと）。
増強された親和性および減少したｐＨ依存性でＦｃＲｎを結合するＦｃバリアントは、ＩｇＧの血液循環からのクリアランスの増加に使用を見出すことができる。ＦｃＲｎ媒介性ＩｇＧリサイクリングが、ヒトにおいてＩｇＧ血漿濃度を維持するための優勢なプロセスであることが見出された（Ｘｉａｏ、Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１２）２０１２：２８２９８９）。ＩｇＧの血液循環からのクリアランスを増加させることは、例えば、自己免疫疾患、例えば、全身性エリテマトーデス（循環する自己反応性抗体が原因の病状）およびＩｇＧ－複合型毒素、薬物、または診断剤が身体から急速に排除される必要がある状況で望ましいであろう。望ましくない抗体のクリアランスの増加は、ＦｃＲｎアンタゴニスト、例えば、操作されたＦｃを有する抗体（これは高親和性でＦｃＲｎに結合し、中性に近いｐＨで急速に解離しない）を使用することによって達成され得る。このような操作された抗体は、ＩｇＧ分解を増強する抗体であることから、Ａｂｄｅｇと呼ばれる（Ｓｗｉｅｒｃｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ．（２０１４）５５（７）：１２０４－７）。このようなＦｃＲｎアンタゴニストは細胞から放出されないが、代わりに、ＦｃＲｎに結合したままになり、他の、より低い親和性のＩｇＧの結合をブロックすることが予測されるであろう。結果として、ＦｃＲｎ機能がブロックされ、内因性または望ましくないＩｇＧが分解のためリソソーム経路に向かうであろう。
ＦｃＲｎへの増強された結合親和性を有し、ＦｃＲｎに対するそれらの結合におけるｐＨ依存性の喪失を示すＦｃバリアントを使用することによってＩｇＧ媒介性疾患を処置する方法が必要である。
本開示は、それを必要とする対象において抗体媒介性（例えば、ＩｇＧ媒介性）障害を処置する方法であって、改変されたＦｃドメインを含む治療有効量のＦｃＲｎアンタゴニストを対象（例えば、ヒト）に投与することを含む方法を提供する。治療有効量のＦｃＲｎアンタゴニストは、処置される対象における血清ＩｇＧクリアランスの割合を増加させる。
いくつかの実施形態において、改変されたＦｃドメインは：
アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）、およびアミノ酸位置３０７にトリプトファン（Ｗ）またはグルタミン（Ｑ）を含み、ここでアミノ酸位置２５４はトレオニン（Ｔ）ではなく、ならびに：
アミノ酸位置４３４にフェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）；およびアミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）をさらに含む、少なくとも四つのアミノ酸置換の組合せを含む。別の指示がない限り、本明細書に記載される全てのＦｃ残基位置は、ＥＵナンバリングシステムに従う。
いくつかの実施形態において、改変されたＦｃドメインは：
ａ）アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置３０７にグルタミン（Ｑ）、およびアミノ酸位置４３４にチロシン（Ｙ）；ｂ）アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６にグルタミン酸（Ｅ）、アミノ酸位置３０７にトリプトファン（Ｗ）、およびアミノ酸位置４３４にチロシン（Ｙ）；ｃ）アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６にグルタミン酸（Ｅ）、アミノ酸位置３０７にグルタミン（Ｑ）、およびアミノ酸位置４３４にチロシン（Ｙ）；ｄ）アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置３０７にグルタミン（Ｑ）、およびアミノ酸位置４３４にフェニルアラニン（Ｆ）；ｅ）アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）；アミノ酸位置３０７にトリプトファン（Ｗ）、およびアミノ酸位置４３４にチロシン（Ｙ）；ｆ）アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置３０７にトリプトファン（Ｗ）、およびアミノ酸位置４３４にフェニルアラニン（Ｆ）；ｇ）アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）およびアミノ酸位置４３４にチロシン（Ｙ）；ｈ）アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置３０７にトリプトファン（Ｗ）、およびアミノ酸位置４３４にチロシン（Ｙ）；ｉ）アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）、およびアミノ酸位置４３４にチロシン（Ｙ）；またはｊ）アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置３０７にトリプトファン（Ｗ）、およびアミノ酸位置４３４にチロシン（Ｙ）からなる群から選択されるアミノ酸残基の組合せを含む。
特定の実施形態において、改変されたＦｃドメインは、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｙ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｙ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｙ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｆ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｙ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｆ、Ｍ２５２Ｙ／Ｎ４３４Ｙ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｙ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｎ４３４Ｙ、およびＴ２５６Ｄ／３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｙからなる群から選択されるアミノ酸置換の組合せを含む。
特定の実施形態において、改変されたＦｃドメインは、改変されたヒトＩｇＧ Ｆｃドメイン、例えば改変されたヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ Ｆｃドメイン、または一つまたはそれ以上のヒトＦｃドメインから誘導されたＦｃドメインである。
特定の実施形態において、改変されたＦｃドメインは、一つまたはそれ以上の種、例えば、ヒト、カニクイザル、マウス、およびラットからのＦｃＲｎに対して結合親和性を有する。例えば、改変されたＦｃドメインは、ヒトＦｃＲｎ（ｈＦｃＲｎ）およびラットＦｃＲｎ（ｒＦｃＲｎ）の両方に対して結合親和性を有する。
特定の実施形態において、改変されたＦｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比較して増強されたＦｃＲｎ結合親和性（例えば、ｈＦｃＲｎに対する増強された結合親和性）を有する。特定の例となる実施形態において、改変されたＦｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比較して酸性ｐＨ（例えば、約６．０）で増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。特定の例となる実施形態において、改変されたＦｃドメインは、５重変異Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ（「ＹＴＥＫＦ」）を有するＦｃドメインと比較して酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。
特定の実施形態において、改変されたＦｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比較して非酸性ｐＨ（例えば、約７．４）で増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。特定の例となる実施形態において、改変されたＦｃドメインは、ＹＴＥＫＦ変異を有するＦｃドメインと比較して非酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。
特定の実施形態において、改変されたＦｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比較して、酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性および非酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。特定の例となる実施形態において、改変されたＦｃドメインは、ＹＴＥＫＦ変異を有するＦｃドメインと比較して、酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性および非酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。
特定の実施形態において、改変されたＦｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比較して減少したＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する。
特定の実施形態において、ＦｃＲｎアンタゴニストは、結合ポリペプチド、例えば抗体であるまたはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｆｖフラグメント、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ－Ｈ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２）を含む。結合ポリペプチドは、ＦｃＲｎではない一つまたはそれ以上の標的であってもよい。
いくつかの実施形態において、本方法によって処置されるＩｇＧ媒介性障害は、自己免疫疾患である。特定の例となる実施形態において、自己免疫疾患は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症筋無力症、全身性硬化症（ＳＳｃ）／強皮症、関節リウマチ、乾癬性関節炎、骨関節炎、糖尿病、多発性硬化症、尋常性天疱瘡、アトピー性皮膚炎、乾癬、喘息、アレルギー、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、および化膿性汗腺炎からなる群から選択される。
特定の態様において、本開示は、画像診断を増強する方法であって、本明細書に記載される治療有効量のＦｃＲｎアンタゴニストを対象に投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態において、方法は、有効量の放射性標識した抗体を対象に投与することをさらに含む。さらなる実施形態において、ＦｃＲｎアンタゴニストは、放射性標識した抗体の後に投与され、放射性標識した抗体に対するコントラストを増強する。
特定の態様において、本開示は、画像診断の間に放射性標識した抗体に対する、非標的組織の曝露を減少させる方法であって、本明細書に記載される治療有効量のＦｃＲｎアンタゴニストを対象に投与することを含む方法を提供する。
本処置および診断方法における使用のための医薬ならびに本処置および診断方法における使用のためのＦｃＲｎアンタゴニストの製造のための、本明細書のＦｃＲｎアンタゴニストの使用も提供される。
本開示はまた、ＦｃＲｎアンタゴニストポリペプチドをコードする核酸、ポリペプチドを製造するための組換え発現ベクターおよび宿主細胞、ならびに本明細書に開示されるＦｃＲｎアンタゴニストを含む医薬組成物も提供される。疾患を処置するために本開示のＦｃＲｎアンタゴニストを使用する方法も提供される。
本発明の前述のおよび他の特徴および利点は、添付の図面と併せて、例となる実施形態の以下の詳細な説明からより十分に理解される。
図１Ａおよび１Ｂは、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域と相互作用するＦｃＲｎの構造を図示する図である。図１Ａに、αドメイン（灰色）およびβ２－ｍ（明灰色）ｈＦｃＲｎサブユニットとの複合体にある、「グリカン」によって標識された、棒状のものとして示されるグリコシル化を含めて、１つのＦｃモノマー（暗灰色のリボン）を示す、ｈＦｃＲｎとＩｇＧ１ Ｆｃ（ｐｄｂ：４ｎ０ｕ）の間の相互作用を図示する。ＦｃＲｎとの相互作用に関与する抗体残基の大部分は、ＣＨ２－ＣＨ３界面（点線）に直接隣接して、グリコシル化部位の反対側にあるループに位置する。図１Ｂに、図１Ａに対して７５°回転したＩｇＧ１ Ｆｃ結晶構造（ｐｄｂ：５ｄ４ｑ）の表面表現を図示する。ＦｃＲｎ結合界面は、ＣＨ２およびＣＨ３のドメインの残基で構成される。飽和ライブラリを、表示のように、棒状のものとして示される１１個の位置：Ｍ２５２；Ｉ２５３；Ｓ２５４；Ｔ２５６；Ｋ２８８；Ｔ３０７；Ｋ３２２；Ｅ３８０；Ｌ４３２；Ｎ４３４およびＹ４３６に構築した。これらの残基は全て、ＦｃＲｎに極めて近接しているかまたはこれと直接接触している。ｐＨ依存性を担う極めて重要なヒスチジン残基（Ｈ３１０、Ｈ４３３、Ｈ４３５）の表面は、目的の位置の近くにクラスター化しており、表示のとおりである。 図２Ａ～Ｄは、Ｏｃｔｅｔスクリーニングアッセイおよび結果を図示する図である。図２ＡにＯｃｔｅｔスクリーニングアッセイを概略的に提示する。ＮｉＮＴＡバイオセンサーは、ヒスチジンタグ付き抗原を、続いてラットＦｃＲｎ（ｒＦｃＲｎ）結合動態用の抗体バリアントを、捕捉する。図２Ｂに、ｒＦｃＲｎ会合フェーズの開始に位置合せした、野生型（実線）、Ｔ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ（ＡＡＡ）のバリアント（短い破線）、ＬＳ（短い一点鎖線）、ＹＴＥ（長い破線）、Ｈ４３５Ａ（長い一点鎖線）およびＨ３１０Ａ／Ｈ４３５Ｑ（長い二点鎖線）の各抗体のｐＨ６．０でのｒＦｃＲｎ結合動態プロファイルを図示する。Ｈ４３５ＡおよびＨ３１０Ａ／Ｈ４３５Ｑのバリアントは、ＦｃＲｎ結合をほとんどまたはまったく示さなかった。ＹＴＥバリアントは、Ｏｃｔｅｔ ｒＦｃＲｎ結合アッセイのうちで調べた、最も遅いＦｃＲｎ解離速度を有した。図２Ｃに、Ｏｃｔｅｔスクリーンから得られた突然変異体のサブセットによる、ｐＨ６．０でのＦｃＲｎ結合動態の正規化をグラフで図示する。ほとんどの突然変異体はｒＦｃＲｎへの有意な結合を保持したが、いくつかはモック対照（点線）に似ており、全ｒＦｃＲｎ結合の喪失を示した（点線（モック）の下に位置する長い破線）。２つのバリアント（Ｎ４３４ＦおよびＮ４３４Ｙ；実線）は、より遅いｒＦｃＲｎ解離速度を有した。２つのバリアント（実線）は野生型抗体（太い長い破線）よりも遅いｒＦｃＲｎ解離速度を有した。図２Ｄに、全ての点突然変異についてｒＦｃＲｎ解離速度の散布図解析を図示するが、この場合、観察可能なｒＦｃＲｎ結合動態が残基の位置によって個別化されている。飽和バリアントは、以下の４つのｒＦｃＲｎ解離速度レジームのうちの１つに属した：結合なし（示さず）、より速い結合（黒）、野生型様結合（白）、より遅い結合（灰色）。１８個の突然変異体（Ｅ３８０Ｃ、Ｋ２８８Ｄ、Ｋ２８８Ｎ、Ｍ２５２Ｙ、Ｔ２５６Ｄ、Ｔ２５６Ｅ、Ｎ４３４Ｆ、Ｎ４３４Ｐ、Ｎ４３４Ｙ、Ｔ３０７Ａ、Ｔ３０７Ｅ、Ｔ３０７Ｆ、Ｔ３０７Ｍ、Ｔ３０７Ｑ、Ｔ３０７Ｗ、Ｙ４３６Ｈ、Ｙ４３６ＮおよびＹ４３６Ｗ）は、野生型抗体（黒の破線）よりも、ｒＦｃＲｎからの有意に遅い解離速度を示した。 図２－１の続き。 ｐＨ６．０およびｐＨ７．４でのヒトＦｃＲｎおよびラットＦｃＲｎを用いたベンチマークおよび野生型のバリアントのＢｉａｃｏｒｅ（商標）動態をグラフで図示する図である。野生型（左上）、ＡＡＡバリアント（右上）、Ｍ４２８／Ｎ４３４Ｓ（ＬＳ）バリアント（左下）およびＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（ＹＴＥ）バリアント（右下）の濃度系列の全てのＦｃＲｎ結合曲線が、ｐＨ６．０（第１の行と第３の行）およびｐＨ７．４（第２の行と第４の行）での、ヒトＦｃＲｎ（第１の列と第３の列）およびラットＦｃＲｎ（第２の列と第４の列）それぞれについて、示されている。ＡＡＡ、ＬＳおよびＹＴＥ各バリアントは、野生型抗体よりも、ＦｃＲｎからのより遅い解離速度を示した。概して、抗体は野生型と比較して概１０倍向上した親和性でｒＦｃＲｎを結合する。ＬＳバリアントは、ｈＦｃＲｎに対してｐＨ７．４で最も緊密な親和性およびｐＨ７．４で最大の残留結合を有したが、一方、ｒＦｃＲｎは最も緊密にＹＴＥバリアントを結合した。 ｐＨ６．０でのヒトＦｃＲｎおよびラットＦｃＲｎによるリード飽和バリアントのＢｉａｃｏｒｅ（商標）動態をグラフで図示する図である。１８個のリード飽和バリアントの濃度系列のＦｃＲｎ結合動態トレースが示されている。Ｍ２５２Ｙ、Ｔ２５６Ｄ、Ｔ２５６Ｅ、Ｎ４３４Ｆ、Ｎ４３４Ｐ、Ｎ４３４Ｙ、Ｔ３０７Ａ、Ｔ３０７Ｅ、Ｔ３０７Ｆ、Ｔ３０７ＱおよびＴ３０７Ｗは、ヒトＦｃＲｎとラットＦｃＲｎの両方からのより遅い解離速度を有した。残りのバリアントはラットＦｃＲｎのみに特異的であった。 ｐＨ６．０でのヒトＦｃＲｎとの、ＷＴ、ベンチマークおよびリード単一飽和の各バリアントのＦｃＲｎ結合動態をグラフで図示する図である。ｐＨ６．０でのヒトＦｃＲｎとの、ＷＴ、ＬＳ、ＹＴＥおよび１８個の飽和バリアントの濃度系列によるＦｃＲｎ結合センサーグラム。組合せライブラリに使用される単一飽和バリアントは、下線が引かれ太字体である。 図５Ａ～Ｄは、複数のバリアントがＨ６．０でヒトＦｃＲｎとラットＦｃＲｎの両方からのより遅い解離速度を有することを示すデータを図示する図である。図５Ａおよび５Ｂに、種々のバリアントのＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラムを図示する。図５Ａに、ＹＴＥバリアント（長い一点鎖線）、ＬＳバリアント（長い二点鎖線）、野生型（ＷＴ；点線）およびリード飽和バリアント（Ｅ３８０Ｃ、Ｋ２８８Ｄ、Ｋ２８８Ｎ、Ｍ２５２Ｙ、Ｔ２５６Ｄ、Ｔ２５６Ｅ、Ｎ４３４Ｆ、Ｎ４３４Ｐ、Ｎ４３４Ｙ、Ｔ３０７Ａ、Ｔ３０７Ｅ、Ｔ３０７Ｆ、Ｔ３０７Ｍ、Ｔ３０７Ｑ、Ｔ３０７Ｗ、Ｙ４３６Ｈ、Ｙ４３６Ｎ、およびＹ４３６Ｗの各リード；種々の濃淡の実線）についてｐＨ６．０でのヒトＦｃＲｎの解離速度を図示する。図５Ａに、正規化センサーグラムが図示されており、ＷＴと比較して改善されたｈＦｃＲｎ解離速度を示す。図５Ｂに、ＡＡＡバリアント（点線）、ＬＳバリアント（二点鎖線）、ＹＴＥバリアント（一点鎖線）、野生型（実線）および１８個のリード飽和バリアント（種々の隙間頻度と太さの破線）についてのｐＨ６．０でのラットＦｃＲｎの解離速度を図示する。明確にするために、１１個のリード抗体のそれぞれの代表的な注入が示されている。これらリード単一バリアントは、野生型と比較して、ヒトＦｃＲｎとラットＦｃＲｎの両方からの解離速度動態の改善を示した。図５Ｃおよび図５Ｄに、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）動態測定から得られた結合速度および解離速度を使用した、ヒトＦｃＲｎ（図５Ｃ）およびラット（図５Ｄ）ＦｃＲｎに対する、１８個のリード飽和抗体バリアント（白丸）および野生型抗体バリアント（黒丸）について結合親和性プロットを、図示する。ベンチマークバリアントが示されている：ＡＡＡ（右下に向かう斜め縞）、ＬＳ（斑点）およびＹＴＥ（左下に向かう斜め縞）。ＦｃＲｎ解離速度の改善にもかかわらず、会合動態がより遅いことに起因して、バリアントの大多数はヒトＦｃＲｎまたはラットＦｃＲｎに対してより緊密な親和性を有していなかった。１１個のバリアントは、両種のＦｃＲｎからのより遅い解離速度を有した。 図５－１の続き。 図６Ａ～Ｄは、リード飽和突然変異の組合せによってＦｃＲｎ解離速度および結合親和性がさらに改善したことを示すデータを図示する図である。図６Ａおよび図６Ｂに、それぞれヒトＦｃＲｎおよびラットＦｃＲｎのＦｃＲｎ解離速度を示す代表的なＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラムを図示する。図６Ａに、野生型（点線）およびＬＳバリアント（長い二点鎖線）と比較した、単一（Ｔ２５６Ｅ；破線）、二重（バリアントＹＥＴＮ（Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ）；明灰色の実線）、三重（バリアントＭＤＱＹ（Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｙ）；灰色の実線）および四重（バリアントＹＥＱＹ（Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｙ）；黒の実線）の組合せバリアントの、代表的なバリアントのヒトＦｃＲｎについて正規化センサーグラムを図示する。図６Ｂに、野生型（点線）およびＹＴＥのバリアント（実線）と比較した、単一（長い二点鎖線）、二重（バリアントＭＥＴＦ；長い一点鎖線）、三重（バリアントＭＥＷＹ；長い破線）および四重（バリアントＹＤＷＦ；短い破線）の組合せバリアントの、代表的なバリアントのラットＦｃＲｎについて正規化センサーグラムを図示する。複数の突然変異の組込みによって、ベンチマークバリアントよりも大きな程度までにＦｃＲｎに対する解離速度が低下し、結合親和性が増強した。図６Ｃおよび図６Ｄに、ヒト（図６Ｃ）ＦｃＲｎまたはラット（図６Ｄ）ＦｃＲｎの解離速度の関数として結合速度を示す組合せ飽和バリアントのプロットを図示するが、これが明らかにしたところは、ベンチマークバリアントと比較して、組合せ飽和バリアントの大多数がｐＨ６．０でＦｃＲｎへの増強した結合を保有したことである。ヒトＦｃＲｎおよびラットＦｃＲｎに対する最も緊密な結合バリアントは、それぞれ、四重の組合せ（ｈＦｃＲｎについて、各バリアントＹＤＷＹ、ＹＤＱＹ、ＹＤＷＦ、ＹＥＷＹおよびＹＥＱＹの各バリアント）および二重の組合せ（ｒＦｃＲｎについて、ＹＴＴＹ、ＹＴＴＦ、ＭＤＴＹ、ＹＤＴＦおよびＭＴＷＹの各バリアント）であった。 図６－１の続き。 図７Ａ～Ｄは、ｐＨ６．０で増強されたＦｃＲｎ結合が相互作用のｐＨ依存性を崩壊させたことを示すデータを図示する図である。図７Ａおよび図７Ｂに、野生型（点線）およびＬＳバリアント（図７Ａ、実線）およびＹＴＥバリアント（図７Ｂ、実線）と比較した、単一（長い二点鎖線）、二重（長い一点鎖線）、三重（長い破線）および四重（短い破線）の組合せバリアントのｐＨ７．４でのＢｉａｃｏｒｅ（商標）ＦｃＲｎ結合動態の代表的なセンサーグラムを図示する。ＦｃＲｎ結合増強の突然変異の数が増加すると、生理学的ｐＨでの残留結合がより大きいという結果となったが、この場合、ほとんどの二重、三重および四重の各バリアントは両種のＦｃＲｎに対する堅牢な結合を示した。図７Ｃおよび図７Ｄに、ｐＨ６．０での結合親和性の関数としてのｐＨ７．４でのヒトＦｃＲｎ（図７Ｃ）またはラットＦｃＲｎ（図７Ｄ）への全飽和バリアントの、定常状態の共鳴ユニット（ＲＵ；
Figure 2022542884000001
 ）のプロットを図示する。図７Ｃに、ｐＨ７．４での残留ＦｃＲｎ結合とｐＨ６．０でのＦｃＲｎ結合親和性との比較を示す。ＦｃＲｎ結合特性の改善を有するリード組合せ（ＭＤＱＮ、ＭＤＷＮ、ＹＥＴＮ、ＹＴＷＮ、ＹＤＱＮおよびＹＥＱＮ）は、ＬＳベンチマークバリアント（ひし形）で定められた左下象限を占める。図７Ｄにおいて、ＬＳ（ひし形）およびＹＴＥ（三角）のバリアントは、それぞれリード検証用のカットオフとして機能する。これら２つのバリアントは、それぞれヒトＦｃＲｎおよびラットＦｃＲｎに対してｐＨ６．０で最も緊密な結合親和性およびｐＨ７．４で最も多い残留結合を有した。図７Ｃおよび７Ｄの両方に、単一（白丸）、二重（明灰色の丸）、三重（暗灰色の丸）、および四重（黒丸）の各バリアントならびにＹＴＥバリアント（三角）を示す。
図７－１の続き。 図８Ａ～Ｃは、ベンチマークバリアントのＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーおよび示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）から得られたデータを図示する図である。図８Ａに、ＷＴ（黒実線）、ＡＡＡ（点線）、ＬＳ（長い二点鎖線）、ＹＴＥ（長い一点鎖線）、Ｈ４３５Ａ（明灰色の実線）およびＨ３１０Ａ／Ｈ４３５Ｑ（ＡＱ；暗灰色の実線）の各バリアントについての正規化した溶出プロファイルを図示する。ｐＨをグラフの上部に記す。ＦｃＲｎ結合ヌルバリアント（Ｈ４３５Ａ、Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ｑ）は、カラムに結合せず、フロースルー（＜１０ｍＬ）で溶出する。ＡＡＡ、ＬＳおよびＹＴＥの各バリアントは、ＷＴ抗体よりも高いｐＨで溶出する。図８Ｂに、ＷＴ（黒）、ＬＳ（灰色）およびＹＴＥ（暗灰色）の各バリアントのＤＳＦプロファイルを図示する。ＹＴＥはＷＴおよびＬＳと比較して不安定化していた。図８Ｃに、ＷＴおよびＬＳバリアント（垂直点線）と比較した、組合せバリアントに使用される７つのリード単一バリアントのＦｃＲｎアフィニティーカラム溶出プロファイルを図示する。２つのバリアント（Ｎ４３４Ｆ／Ｙ）はＬＳよりも高いｐＨで溶出するが、このことは、これらの突然変異を含有するバリアントについてはＦｃＲｎとの相互作用へのｐＨ依存性が減少することを物語っている。 図８－１の続き。 図９Ａ～Ｄは、組合せバリアントがｐＨ依存性および熱安定性を有意に撹乱したことを示すデータを図示する図である。図９Ａに、単一（長い二点鎖線）、二重（長い一点鎖線）、三重（長い破線）および四重（短い破線）の各バリアントの代表的なＦｃＲｎアフィニティークロマトグラムを図示する。ＦｃＲｎ結合増強の突然変異の数が増加すると、溶出がより高いｐＨ値へとシフトした；ＬＳバリアント（垂直の小さい点線）。図９Ｂに、単一（白丸）、二重（水平縞）、三重（垂直縞）および四重（格子柄）の突然変異体の各バリアントを含めて、リード飽和バリアントおよび組合せバリアントについての溶出ｐＨの箱ひげ図を図示しており、これによって、ＦｃＲｎ増強突然変異体の数が増加するにつれてより高いｐＨ値への傾向が示された。図９Ｃに、ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーからの溶出ｐＨとＢｉａｃｏｒｅ（商標）を使用したｈＦｃＲｎ解離速度との間の高い相関（Ｒ２＝０．９４）によって、ＦｃＲｎ解離動態の改善とともに抗体－ＦｃＲｎ相互作用のｐＨ依存性が喪失することが明らかになったことを図示する。ＡＡＡ（右下に向かう斜め縞）、ＬＳ（斑点）およびＹＴＥ（左下に向かう斜め縞）の各バリアントは、二重バリアントと類似したｈＦｃＲｎ解離速度および溶出ｐＨ値を有した。図９Ｄに、組合せ飽和バリアントのＤＳＦから得られたＴｍの箱ひげ図によって、さらなるＦｃＲｎ結合増強の突然変異が、ＷＴ、単一またはベンチマークの各バリアントと比較して、抗体を不安定化することが明らかになったことを図示する。 図９－１の続き。 図１０Ａおよび１０Ｂは、７つのリードバリアントのＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーおよびＤＳＦから得られたデータを図示する図である。図１０Ａに、Ｍ２５２Ｙ（実線）、Ｔ２５６Ｄ（短い一点鎖線）、Ｔ２５６Ｅ（長い破線）、Ｔ３０７Ｑ（長い一点鎖線）、Ｔ３０７Ｗ（長い二点鎖線）、Ｎ４３４Ｆ（点線）およびＮ４３４Ｙ（短い破線）の各バリアントのＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーを図示する。クロマトグラムによって、野生型抗体およびＬＳ抗体（垂直点線）と比較して溶出ｐＨのシフトが明らかになった。Ｎ４３４ＦおよびＮ４３４Ｙは、ＬＳバリアント（垂直点線）よりも高い溶出ｐＨ（概ｐＨ８．３）を有した。ある特定の溶出体積でのｐＨを、参照のためにクロマトグラムの上に表示する。図１０Ｂに、７つのリードバリアントのＤＳＦプロファイルを図示するが、これが示したところは、７つのリード単一バリアントのいずれも、ＹＴＥバリアント（垂直の点線）と同程度まで抗体を不安定化することはなかったことである。Ｔ３０７Ｑ（長い一点鎖線）を除く全てのバリアントが、ＷＴ（垂直の点線）と比較して不安定化した。 図１１Ａ～Ｃは、ＦｃγＲＩＩＩａ結合がＭ２５２Ｙ含有組合せバリアントにおいて減少したことを示すデータを図示する図である。図１１Ａに、ＷＴ（黒）、ＬＳ（灰色）およびＹＴＥ（暗灰色）の各バリアントのＦｃγＲＩＩＩａ結合センサーグラムによって、ＹＴＥバリアントによる結合応答の低下が明らかになったことを示す。図１１Ｂに、ベンチマーク、単一および組合せのバリアントのＦｃγＲＩＩＩａ結合応答の箱ひげ図を図示する。Ｍ２５２Ｙ突然変異を有するバリアントは、４重バリアントの全てを含めて、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合応答の減少を含有する。Ｎ４３４Ｆ／Ｙとの組合せは典型的には、ＦｃγＲＩＩＩａでの応答の向上を示す。図１１Ｃに、ＷＴおよびＹＴＥのバリアント（水平の点線）と比較した７つのリード単一バリアントのＦｃγＲＩＩＩａ結合応答を図示する。Ｍ２５２Ｙ突然変異は、ＷＴと比較してＦｃγＲＩＩＩａ結合の減少を示すが、一方、６つはこの受容体へのＷＴ様結合または結合の向上を示す。 図１１－１の続き。 図１２Ａ～Ｄは、７つのリード組合せバリアントのＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィー、ＤＳＦおよびＦｃγＲＩＩＩａ結合から得られたデータを図示する図である。図１２Ａに、野生型抗体およびＬＳバリアント（それぞれ垂直の点線および垂直の実線）と比較した７つのリード組合せバリアントのＦｃＲｎアフィニティークロマトグラムを図示する。各リードバリアントはＬＳバリアントの近くに溶出ｐＨを有した。図１２Ｂに、ＹＴＥおよび野生型のバリアント（表示のとおり垂直の点線）と比較したリード組合せバリアントのＤＳＦプロファイルを示す。７つのリードバリアントのうち６つが、ＹＴＥバリアントと同様のまたはこれよりも不安定なＴｍを有した：ＭＤＷＮ（長い二点鎖線）。ＹＴＷＮ（長い破線）；ＹＤＴＮ（実線）；ＹＥＴＮ（長い一点鎖線）；ＹＤＱＮ（点線）；ＹＥＱＮ（短い一点鎖線）。ＭＤＱＮバリアントは、野生型抗体（短い破線）と同様のＴｍを有した。図１２Ｃに、野生型（より大きな点線）およびＹＴＥのバリアント（太い長い破線）と比較した、７つのリードバリアントのＦｃγＲＩＩＩａ結合動態のＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラムを図示する。Ｍ２５２Ｙ含有バリアント、ＹＤＴＮ（実線）、ＹＤＱＮ（短い一点鎖線）、ＹＴＷＮ（長い破線）、ＹＥＴＮ（長い一点鎖線）およびＹＥＱＮ（より小さい点線）それぞれが、ＹＴＥと類似した様式で減少した定常状態ＲＵを保有した。図１２Ｄに、７つのリードバリアント、野生型およびＹＴＥのバリアントの定常状態ＲＵを示す。ＭＤＷＮおよびＭＤＱＮのバリアントのみが、野生型抗体と同様のＦｃγＲＩＩＩａに対する親和性を保有した。 図１２－１の続き。 図１２Ｅ～Ｈは、３つのリードバリアントが様々な鍵となる抗体の特質を提示したことを示すデータを図示する図である。図１２Ｅに、ＷＴおよびＬＳ（垂直の点線）と比較した、ＤＱ（実線）、ＤＷ（点線）およびＹＤ（破線）の各バリアントのＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィー溶出プロファイルを示す。各二重バリアントは、ＷＴとＬＳの間の溶出ｐＨを示した。図１２Ｆに、ＹＴＥおよびＷＴ変異体（垂直点線）と比較した３つの変異体のＤＳＦ蛍光プロファイルによって、ＹＤ（破線）およびＤＷ（点線）がＹＴＥと比較してわずかに不安定化していたが、ＤＱ（実線）はＷＴと同様であったことを明らかにしたことを図示する。図１２Ｇに、ＷＴおよびＹＴＥ（水平の点線）と比較したＦｃγＲＩＩＩａ結合センサーグラムを図示する。ＹＤ（破線）はＹＴＥと同様の結合応答を示したが、一方、ＤＱ（実線）およびＤＷ（点線）は、ＷＴと比較してわずかな減少を示した。図１２Ｈに、均一ブリッジングＲＦ ＥＬＩＳＡによって、３つのリードバリアントおよびＹＴＥが、ＬＳとは異なり、有意に減少したまたはＷＴ様のＲＦ結合を示したことが明らかになったことを示すデータを図示する。＊＊ｐ＜０．００１、＊ｐ＜０．０１。 図１２－３の続き。 図１３Ａ～Ｄは、ｐＨ６．０およびｐＨ７．４でのリード組合せバリアントのＦｃＲｎ結合動態の比較を示すデータを図示する図である。図１３Ａおよび図１３Ｂに、ｐＨ６．０での、野生型（点線）およびＬＳ（ｈＦｃＲｎ、図１３Ａ、太く長い破線）またはＹＴＥ（ｒＦｃＲｎ、図１３Ｂ、太く長い破線）のいずれかと比較した、ヒトＦｃＲｎ（図１３Ａ）またはラットＦｃＲｎ（図１３Ｂ）についてのリード組合せバリアントのＢｉａｃｏｒｅ（商標）ＦｃＲｎ結合センサーグラムを示す。各組合せバリアントは、変更された結合速度および解離速度にもかかわらずそれぞれのＦｃＲｎに対して全体でより緊密な結合親和性を有した。図１３Ｃおよび図１３Ｄに、ｐＨ７．４でのＢｉａｃｏｒｅ（商標）ＦｃＲｎセンサーグラムを示す。各ｈＦｃＲｎリードバリアントは、ＬＳバリアントと比較して同様のまたは減少した定常状態ＦｃＲｎ結合応答を有した。ＭＤＱＮおよびＭＤＷＮのバリアントのみが、ＹＴＥバリアントよりもｐＨ７．４での少ないｒＦｃＲｎ結合を示した。 図１３－１の続き。 単一の突然変異を用いる特定の実施形態による飽和ライブラリのＯｃｔｅｔ ｒＦｃＲｎ結合解離速度を図示する表の図である。野生型（ＷＴ）および野生型様（ＷＴ様）種を白四角で表示する；ＷＴ種は表示のとおりである。野生型と比較して、ｒＦｃＲｎ結合をほとんどまたは全く有しないバリアントを暗灰色の四角で表示する。野生型と比較してより速いｒＦｃＲｎ解離速度を有するバリアントを明灰色の四角で表示し、野生型と比較してより遅いｒＦｃＲｎ解離速度を有するバリアントを黒四角で表示する。 図１５Ａ～Ｃは、ＣＭ５センサーチップを使用して開発された新しい結合アッセイを図示する図である。図１５Ａはアッセイの概略図である。図１５ＢにＦｃＲｎの直接固定化を示す。図１５Ｃに、ビオチン化ＦｃＲｎのストレプトアビジン捕捉を示す。 図１６Ａおよび１６Ｂは、ｐＨ６．０でのｍＡｂ２のＦｃＲｎ結合を図示する図である。図１６ＡにヒトのＦｃＲｎを図示する。図１６ＢにマウスＦｃＲｎを図示する。 図１７Ａおよび１７Ｂは、ｐＨ７．４でのｍＡｂ２のＦｃＲｎ結合を図示する。図１７ＡにヒトＦｃＲｎを図示する。図１７ＢにマウスＦｃＲｎを図示する。 種々のｍＡｂ２バリアントのｐＨ依存性をグラフで図示する図である。リードバリアントは、ＬＳよりもｐＨ６で高い結合親和性を維持し、ｐＨ７．４で低い残留結合を維持した。 ｍＡｂ１およびｍＡｂ２の骨格を使用したＦｃＲｎ結合ｐＨ依存性の比較を図示する図である。ｍＡｂ１およびｍＡｂ２は、２つの無関係な抗原を標的とするヒトＩｇＧ１抗体である。 ｍＡｂ１およびｍＡｂ２の骨格を使用した熱安定性の比較を図示する図である。 ｍＡｂ１およびｍＡｂ２の骨格を使用したＦｃγＲＩＩＩａ結合の比較を図示する図である。 ＤＱ、ＤＷおよびＹＤの各バリアントがＩｇＧ１骨格間で移すことが可能であったことを示すプロットのパネルの図である。パネルａ～ｃに、低ｐＨで類似した動態を示す、ＷＴ（明灰色）、ＬＳ（暗灰色）、ＤＱ（黒実線）、ＤＷ（点線）およびＹＤ（破線）の各バリアントを用いた３つのＩｇＧ１骨格におけるｐＨ６．０での正規化ＦｃＲｎ結合センサーグラムを図示する。これら３つのバリアント、ＤＱ、ＤＷおよびＹＤは、ＬＳバリアントよりもわずかに速い結合速度および解離速度を保有したが、より緊密なＦｃＲｎ結合親和性を維持していた。パネルｄ～ｆに、ｐＨ７．４でのＦｃＲｎ結合センサーグラムを図示する；ＬＳベンチマークバリアント（黒実線）。パネルｇ～ｉに、ＷＴ（灰色）、ＬＳ（暗灰色）、ＤＱ（黒実線）、ＤＷ（空白）およびＹＤ（空白の四角）の各バリアントを有する各抗体骨格についてのｐＨ６．０での結合親和性と比較したｐＨ７．４でのＦｃＲｎ結合応答を図示する。ＤＱ、ＤＷおよびＹＤは、ｐＨ６．０での増強された結合およびｐＨ７．４での最小の結合を持って、改善されたＦｃＲｎ特徴を示す。 図２３Ａ～Ｃは、ｍＡｂ２骨格の３つのリードバリアントがカニクイザルＦｃＲｎへの結合を同様に改善することを示す図である。図２３Ａに、ｈＦｃＲｎと類似した結合動態および親和性を示すＷＴ（灰色）、ＬＳ（暗灰色）、ＤＱ（黒実線）、ＤＷ（点線）およびＹＤ（破線）のｐＨ６．０での正規化ｃＦｃＲｎ結合センサーグラムを図示する。図２３Ｂに、３つのバリアントについてのｃＦｃＲｎ結合応答が生理的ｐＨで劇的に減少したことを図示する；ＬＳ（暗灰色）はしかし、ｈＦｃＲｎと同様の様式でＷＴ（灰色）よりも大きい結合を示した。図２３Ｃに、ＷＴ（灰色）、ＬＳ（暗灰色）、ＤＱ（黒一色）、ＤＷ（空白）およびＹＤ（空白の四角）に関する、ｐＨ７．４での残留ｃＦｃＲｎ結合応答とｐＨ６．０でのｃＦｃＲｎ結合親和性との比較を図示するが、３つのバリアント全てによってｈＦｃＲｎで観察されたＦｃＲｎ結合特性の改善が維持されていたことが、明らかである。 図２３－１の続き。 図２４Ａおよび２４Ｂは、リードバリアントによって抗体の血清半減期が延長したことを示す図である。ＷＴ（黒丸と黒の実線）、ＬＳ（白丸と黒の破線）、ＤＱ（明灰色の丸と明灰色の実線）、ＤＷ（暗灰色の丸と暗灰色の実線）およびＹＤ（黒丸と黒の点線）各抗体の、カニクイザル（図２４Ａ）およびｈＦｃＲｎトランスジェニックマウス（図２４Ｂ）における時間の関数としての血漿抗体濃度の薬物動態プロファイル。３つのリードバリアント全てが、ＷＴと比較して抗体の半減期を延長する。 ｐＨ６．０での結合親和性の関数としてのｐＨ７．４でのヒトＦｃＲｎに対する全ての飽和バリアントの定常状態ＲＵのプロットを図示する図である。ｐＨ７．４での残留ＦｃＲｎ結合とｐＨ６．０でのＦｃＲｎ結合親和性との比較を示す。ｐＨ６．０とｐＨ７．４の両方でＦｃＲｎ結合特性が改善された四重組合せを、プロットの右上の象限に枠で囲んで示す。単一（白丸）、二重（明灰色の丸）、三重（暗灰色の丸）および四重（黒丸）の各バリアントならびにベンチマークのＡＡＡ、ＬＳおよびＹＴＥの各バリアント（表示のとおり）を示す。 ビオチン化ＦｃＲｎを捕捉するために使用されるＢｉｏｔｉｎ ＣＡＰｔｕｒｅ法の概略図を図示する図である。 図２７Ａ～Ｇは、表示のように、ＹＴＥＫＦ（ＡＢＤＥＧ（商標））ベンチマークおよびＦｃＲｎアンタゴニストのｐＨ６．０、ｐＨ７．４およびｐＨ８．０でのヒトＦｃＲｎおよびｃｙｎｏ ＦｃＲｎの結合動態を示すプロットを図示する図である。図２７Ａおよび図２７Ｂに、ＷＴ、ＹＴＥＫＦおよびＦｃＲｎアンタゴニストのｐＨ６．０での、それぞれヒトＦｃＲｎおよびｃｙｎｏ ＦｃＲｎへの濃度依存性結合を示す。図２７Ｃおよび図２７Ｄに、ＷＴ、ＹＴＥＫＦおよびＦｃＲｎアンタゴニストのｐＨ７．４での、それぞれヒトＦｃＲｎおよびｃｙｎｏ ＦｃＲｎへの濃度依存性結合を示す。図２７Ｅおよび図２７Ｆに、ＷＴ、ＹＴＥＫＦおよびＦｃＲｎアンタゴニストのｐＨ８．０での、それぞれヒトＦｃＲｎおよびｃｙｎｏ ＦｃＲｎへの濃度依存性結合を示す。図２７Ｇに、ＹＥＱＦおよびＹＥＷＦのバリアントのｐＨ６．０でのヒトＦｃＲｎおよびラットＦｃＲｎへの濃度依存性結合を示す。 図２７－１の続き。 図２７－２の続き。 図２７－３の続き。 図２７－４の続き。 図２７－５の続き。 図２７－６の続き。 図２８Ａ～Ｈは、種々のｐＨレベルでのＹＴＥＫＦベンチマークと比較した、例示的なＦｃＲｎアンタゴニスト（ＹＤＱＹ、ＹＥＷＹ、ＹＥＱＹ、ＹＤＱＦ、ＹＤＷＹ、ＹＴＷＹ、ＹＤＷＦ、ＹＤＴＹ、ＭＤＷＹおよびＹＴＴＹ）のヒトＦｃＲｎ結合動態を示す図である。図２８Ａに、ＷＴ（破線）およびＹＴＥＫＦ（点線）と比較した、ｐＨ６．０でのｈＦｃＲｎからの解離速度における有意な改善を有するＦｃＲｎアンタゴニスト（実線）の正規化センサーグラムを示す。図２８Ｂに、ｐＨ７．４でのｈＦｃＲｎ結合のセンサーグラムを示しており、これは、ＹＴＥＫＦおよびＷＴ（結合なし）と比較したＦｃＲｎアンタゴニストの上昇したｐＨでの有意な結合を実証する。図２８Ｃに、ｐＨ７．４でのセンサーグラムの正規化を示しており、これは、ＹＴＥＫＦと比較したＦｃＲｎアンタゴニストの有意な解離速度を実証する。図２８Ｄに、ｐＨ８．０でのｈＦｃＲｎ結合のセンサーグラムを示しており、これは、ＹＴＥＫＦおよびＷＴ（結合なし）と比較したＦｃＲｎアンタゴニストの生理学的状態よりも大きいｐＨでの有意な結合を実証する。図２８Ｅに、ｐＨ８．０でのセンサーグラムの正規化を示しており、これは、ＦｃＲｎアンタゴニストおよびＹＴＥＫＦの測定可能な解離速度および親和性を実証する。図２８Ｆに、ｐＨ９．０は、ＦｃＲｎアンタゴニストバリアントのｈＦｃＲｎ結合を有意に損なうのに十分であり、このｐＨでのＷＴ結合に類似していたことを示す。図２８Ｇに、ＦｃＲｎアンタゴニスト、ＹＴＥＫＦ（白四角）およびＷＴ（ｐＨ６．０のみ）のｐＨ６．０（黒）、７．４（灰色）および８．０（明灰色）でのｈＦｃＲｎ結合親和性の等親和性（ｉｓｏａｆｆｉｎｉｔｙ）プロットを示す。複数のバリアントが、全てのｐＨでＹＴＥＫＦよりも大きいｈＦｃＲｎ結合親和性を保有した。図２８Ｈに、ｐＨの関数としてのＦｃＲｎアンタゴニストの結合親和性を示すとともに、ｐＨ単位毎のｈＦｃＲｎ結合親和性の一桁の減少を実証する。 図２８－１の続き。 図２８－２の続き。 図２８－３の続き。 図２９Ａ～Ｈは、種々のｐＨレベルでのＹＴＥＫＦベンチマークと比較した、図２８Ａ～Ｈで試験のＦｃＲｎアンタゴニストのｃｙｎｏ ＦｃＲｎ（ｃＦｃＲｎ）結合動態を示す図である。図２９Ａに、ＷＴ（破線）およびＹＴＥＫＦ（点線）と比較した、ｐＨ６．０でのｃＦｃＲｎからの解離速度の有意な改善を示すＦｃＲｎアンタゴニスト（実線）の正規化センサーグラムを示す。図２９Ｂに、ＹＴＥＫＦおよびＷＴ（結合なし）と比較した、ＦｃＲｎアンタゴニストの上昇したｐＨでの有意な結合を示す、ｐＨ７．４でのｃＦｃＲｎ結合のセンサーグラムを示す。図２９Ｃに、ｐＨ７．４でのセンサーグラムの正規化を示しており、これは、ＹＴＥＫＦと比較したＦｃＲｎアンタゴニストの有意な解離速度を実証する。図２９Ｄに、ｐＨ８．０でのｈＦｃＲｎ結合のセンサーグラムを示しており、ＹＴＥＫＦおよびＷＴ（結合なし）と比較した、ＦｃＲｎアンタゴニストの生理学的状態よりも大きいｐＨで有意な結合を示す。図２９Ｅに、ｐＨ８．０でのセンサーグラムの正規化を示しており、これは、ＦｃＲｎアンタゴニストおよびＹＴＥＫＦの測定可能な解離速度および親和性を示す。図２９Ｆに、ｐＨ９．０は、ＦｃＲｎアンタゴニストのｃＦｃＲｎ結合を有意に損なうのに十分であり、このｐＨでのＷＴ結合に類似していたことを示す。図２９Ｇに、ＦｃＲｎアンタゴニスト、ＹＴＥＫＦ（白四角）およびＷＴ（ｐＨ６．０のみ）のｐＨ６．０（黒）、７．４（灰色）および８．０（明灰色）でのｃＦｃＲｎ結合親和性の等親和性プロットを示す。複数のバリアントが、全てのｐＨでＹＴＥＫＦよりも大きいｃＦｃＲｎ結合親和性を保有した。図２９Ｈにおいて、ｐＨの関数としてのＦｃＲｎアンタゴニストの結合親和性を示すとともに、ｐＨ単位毎のｃＦｃＲｎ結合親和性の一桁の減少を実証する。 図２９－１の続き。 図２９－２の続き。 図２９－３の続き。 図３０Ａ～Ｃは、表示された用量のＹＤＱＹまたはＹＴＥＫＦ ｈＩｇＧ１バリアントの後の経時的なトレーサー（ＷＴ）ｈＩｇＧ濃度を示すグラフの図である。図３０Ａに、全群のクリアランスプロファイルを示す。図３０Ｂに、群２（対照）および群６のみのプロファイルを示す。図３０Ｃに、群２（対照）、群４（ＹＤＱＹ ｈＩｇＧ１）および群７（ＹＴＥＫＦ ｈＩｇＧ１）のプロファイルを示す。 図３０－１の続き。 図３０－２の続き。 表示された用量でマウスに投与された後の経時的なＹＤＱＹ ｈＩｇＧ１バリアント（Ａ）またはＹＴＥＫＦ ｈＩｇＧ１バリアント（Ｂ）のタンパク質濃度を示すグラフの図である。 表示された用量でマウスに投与された後の経時的なＹＤＱＹ ｈＩｇＧ１バリアント（Ａ）またはＹＴＥＫＦ ｈＩｇＧ１バリアント（Ｂ）のタンパク質濃度を示すグラフの図である。 残基２３１～４４７（Ｅｕナンバリング）からのヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の各定常領域の配列アラインメントを示す図である。本明細書に記載のＦｃＲｎ突然変異誘発位置（Ｍ２５２、Ｔ２５６、Ｔ３０７およびＮ４３４）は、４つのサブクラス全てで保存されている。 複数のｐＨ状態下でのＦｃＲｎ結合Ｆｃバリアントのｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒトＦｃＲｎ結合特性評価パラメーターを示す図である。各バリアントについて、ＷＴ配列（Ｍ２５２／Ｔ２５６／Ｔ３０７／Ｎ４３４；ＭＴＴＮ）に関連する置換突然変異は太字体で下線が引かれている（例えば、ＭＤＷＹはＴ２５６Ｄ、Ｔ３０７ＷおよびＮ４３４Ｙの各突然変異を有するバリアントを指す）。 複数のｐＨ状態下でのＦｃＲｎ結合Ｆｃバリアントのｉｎ ｖｉｔｒｏでのｃｙｎｏ結合特性評価パラメーターを示す図である。
本開示は、変更されたＦｃＲｎ結合親和性を有するポリペプチド（例えば、モノクローナル抗体またはそのフラグメント）を提供する。これらのポリペプチドは改変されたＩｇＧ Ｆｃドメインを含有し、これは野生型ＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）Ｆｃドメインと比較して、酸性および非酸性条件の両方の条件下で増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。したがって、野生型ＩｇＧ Ｆｃドメインと異なり、本ポリペプチドは、ｐＨ依存性が低い様式でＦｃＲｎに結合する。これらのポリペプチドは、異なるｐＨ条件を有する細胞表面と細胞質との間をＦｃＲｎが輸送される間、ＦｃＲｎに結合したまま残る。結果として、野生型の（より低い）ＦｃＲｎ結合親和性を有する他のＩｇＧ分子（例えば、血清ＩｇＧ）は、ＦｃＲｎへの結合からブロックされ、分解のためリソソーム経路に向かう割合が増加し、身体からのＩｇＧ分子のより速いクリアランスをもたらす。
ＩｇＧリサイクリングを媒介することおよび血清ＩｇＧレベルを維持することにおいて、それらのＦｃＲｎの正常な機能を破壊することに起因して、本ポリペプチドは「ＦｃＲｎアンタゴニスト」と呼ばれる。本開示のＦｃＲｎアンタゴニストは、抗体、イムノアドヘシンまたは別の形態のＦｃ融合タンパク質、またはそのＦｃフラグメントまたは部分であってもよい。ＦｃＲｎアンタゴニストは、例えば、モノマータンパク質またはダイマー（ヘテロまたはホモダイマー）タンパク質であってもよい。ＦｃＲｎアンタゴニストは身体からの血清ＩｇＧクリアランスを増強するため、それらは、ＩｇＧ媒介性疾患または障害（例えば、自己免疫疾患）に罹患している患者を処置すること、または身体から望ましくないＩｇＧ（例えば、もはや必要または有益ではない治療または診断抗体）を除去することに使用され得る。
この開示に記載される方法は、特定の方法に限定されず、このような方法および条件として本明細書に開示される実験条件は変わり得ることが理解される。また、本明細書に使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的だけのためのものであり、限定することは意図されないことが理解される。
さらに、本明細書に記載される実験は、別の指示がない限り、当業者の範囲内の従来の分子および細胞生物学ならびに免疫学的技術を使用する。このような技術は当業者に周知であり、文献において十分に説明されている。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｅｄｓ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、ＮＹ、Ｎ．Ｙ．（１９８７－２００８）、全ての補遺を含む；Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｅｄｓ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｈａｐｔｅｒ １４、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（２０１３、２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）を参照されたい。
別の定義がなければ、本明細書において使用される科学用語および技術用語は、当業者により一般的に理解される意味を有する。潜在的な曖昧性の事象において、本明細書に提供される定義は、辞書または外部の定義に先行する。文脈により別の必要がなければ、単数形は複数を含むものとし、複数形は単数を含むものとする。「または」の使用は、別の記述がなければ、「および／または」を意味する。「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」のような他の形態の用語の使用を限定するものではない。「有する（ｈａｖｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形の用語は、記述された整数または整数の群を含むことを意味すると理解されるが、他の整数または整数の群を除外するものではない。
一般に、本明細書に記載される細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学およびタンパク質および核酸化学、およびハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法は周知であり、当該分野で一般的に使用されている。本明細書において提供される方法および技術は、通常は当該分野で周知の従来の方法に従って行われ、別の指示がない限り、本明細書の全体を通して引用され、考察される様々な一般的およびより具体的な参考文献において記載されるとおりである。酵素反応および精製技術は、当該分野で一般的に遂行されているかまたは本明細書に記載されるように、製造者の仕様書に従って行われる。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、および医学および医薬化学に関連して使用される命名法、ならびにそれらの実験手順および技術は、当該分野において周知であり一般的に使用されるものである。化学合成、化学分析、医薬調製物、処方、および送達、ならびに患者の処置のために標準的な技術が使用される。本明細書において言及される、全ての刊行物および他の参考文献は、その全体が参照によって組み入れられる。本開示がより容易に理解され得るように、選択した用語が以下で定義される。
用語「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリマー鎖を指し、文脈により矛盾がなければ、天然または人工のタンパク質、ポリペプチドアナログまたはタンパク質配列のバリアント、またはそれらのフラグメントを包含する。ポリペプチドはモノマーでもポリマーでもよい；すなわち、用語は、一つまたはそれ以上の共有結合性にカップルした、または非共有結合性にカップルした、ポリペプチド鎖を有するタンパク質を包含する。ポリペプチドフラグメントは、例えば少なくとも約５つの連続したアミノ酸、少なくとも約１０の連続したアミノ酸、少なくとも約１５の連続したアミノ酸、または少なくとも約２０の連続したアミノ酸を含む。
用語「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」は、その由来する起源もしくは供給源のために、その天然の状態で伴っている天然で関連する成分が関連していないか；同じ種由来の他のタンパク質を実質的に含まないか；異なる種由来の細胞により発現されるか；または天然に存在しない、タンパク質またはポリペプチドを指す。したがって、化学合成されるかまたはそれが天然で由来する細胞とは異なる細胞系で合成されるタンパク質またはポリペプチドは、その天然で関連する成分から「単離されている」。タンパク質またはポリペプチドはまた、当該分野で周知のタンパク質精製技術を使用した単離により、天然で関連する成分を実質的に含まないようにされ得る。
本明細書で使用される用語「結合タンパク質」または「結合ポリペプチド」は、目的の標的抗原（例えば、ヒト標的抗原）に選択的に結合する原因である少なくとも１つの結合部位を含有するタンパク質またはポリペプチド（例えば、抗体またはイムノアドヘシン）を指すものとする。例となる結合部位としては、抗体可変ドメイン、受容体のリガンド結合部位、またはリガンドの受容体結合部位が挙げられる。特定の態様において、結合タンパク質または結合ポリペプチドは、複数（例えば、二つ、三つ、四つ、またはそれ以上）の結合部位を含む。特定の態様において、結合タンパク質または結合ポリペプチドは治療用酵素ではない。
用語「リガンド」は、別の物質に結合することができるか、または結合を受けることができるいずれかの物質を指す。同様に、用語「抗原」は、それに対して抗体が生成され得るいずれかの物質を指す。「抗原」は抗体結合基質を参照して一般的に使用され、「リガンド」は受容体結合基質を参照する場合にしばしば使用されるが、これらの用語は互いに区別されず、広範囲の重複する化学実体を包含する。疑念を避けるために、抗原およびリガンドは本明細書全体を通して交換可能に使用される。抗原／リガンドは、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、アプタマー、多糖、糖分子、炭水化物、脂質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、合成分子、無機分子、有機分子、およびそれらのいずれかの組合せであり得る。
本明細書で使用される用語「特異的に結合する」は、多くとも約１×１０－６Ｍ、約１×１０－７Ｍ、約１×１０－８Ｍ、約１×１０－９Ｍ、約１×１０－１０Ｍ、約１×１０－１１Ｍ、約１×１０－１２Ｍもしくはそれ以下の解離定数（Ｋｄ）で抗原に結合し、および／または非特異的抗原に対するその親和性よりも少なくとも約二倍大きい親和性で抗原に結合する、抗体またはイムノアドヘシンの能力を指す。
本明細書で使用される用語「抗体」は、目的の抗原に対して有意な既知の特異的免疫反応活性を有するような集合体（例えば、インタクトな抗体分子、イムノアドヘシン、またはそれらのバリアント）を指す。抗体および免疫グロブリンは、それらの間に鎖間共有結合を有するかまたは有していない軽鎖および重鎖を含む。脊椎動物系における基本的な免疫グロブリン構造は、比較的十分に理解されている。
以下により詳細に考察されるように、「抗体」という総称は、生化学的に区別することができる五つの異なるクラスの抗体を含む。抗体の全ての五つのクラスが明確に本開示の範囲内であるが、本明細書の考察は概してＩｇＧクラスの免疫グロブリン分子に関するものである。ＩｇＧに関して、免疫グロブリンは、分子量およそ２３，０００ダルトンの二つの同一の軽鎖、および分子量５３，０００～７０，０００の二つの同一の重鎖を含む。四つの鎖はジスルフィド結合で「Ｙ」の配置で接合されており、ここで軽鎖は重鎖に取り付けられており、「Ｙ」の口の部分で開始し、可変領域を通して続く。
免疫グロブリンの軽鎖は、カッパ（κ）またはラムダ（λ）のいずれかに分類される。各重鎖クラスは、カッパまたはラムダ軽鎖のいずれかと結合され得る。一般に、軽鎖および重鎖は、互いに共有結合で結合しており、２つの重鎖の「尾」部分は、ジスルフィド共有結合により、または非共有結合により互いに結合される（免疫グロブリンがハイブリドーマ、Ｂ細胞、または遺伝子操作された宿主細胞のいずれかにより生成された場合）。重鎖において、アミノ酸配列は、Ｙ配置のフォーク状末端でＮ末端から各鎖の一番下でＣ末端まで伸びる。当業者には当然のことながら、重鎖がガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）、またはイプシロン（ε）として（その中にいくつかのサブクラスがある（例えば、γｌ～γ４））分類される。抗体の「クラス」または「アイソタイプ」をそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ ＩｇＧ、またはＩｇＥと決定するのはこの鎖の性質である。免疫グロブリンアイソタイプサブクラスまたはサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１など）は、十分に特徴づけされており、機能の特殊化を付与することが知られている。これらのクラスおよびアイソタイプの各々の改変されたバージョンは、本開示を考慮して当業者に容易に認識可能であり、従って、本開示の範囲内である。
軽鎖および重鎖の両方が、構造的および機能的相同性の領域に分けられる。用語「領域」は、免疫グロブリンまたは抗体鎖の一部または部分を指し、定常領域または可変領域ならびに前記領域のさらに別個の一部または部分を含む。例えば、軽鎖可変領域は、本明細書で定義されるように「フレームワーク領域」または「ＦＲ」の間に組み入れられた「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」を含む。
免疫グロブリン重鎖または軽鎖の領域は、「定常領域」の場合は様々なクラスメンバーの領域内での配列変化が比較的乏しいことに基づいて、または「可変領域」の場合には様々なクラスメンバーの領域内での有意な変化に基づいて、「定常」（Ｃ）領域または「可変」（Ｖ）領域として定義され得る。用語「定常領域」および「可変領域」は機能的にも使用され得る。この関連で、当然のことながら、免疫グロブリンまたは抗体の可変領域は、抗原認識および特異性を決定する。逆に、免疫グロブリンまたは抗体の定常領域は、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合などのような重要なエフェクター機能を付与する。様々な免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造および三次元配置が周知である。
免疫グロブリン重鎖および軽鎖の定常領域および可変領域は折りたたまれてドメインとなる。用語「ドメイン」は、例えば、β－プリーツシートおよび／または鎖内ジスルフィド結合により安定化されたペプチドループを含む（例えば、３～４つのペプチドループを含む）重鎖または軽鎖の球状領域を指す。免疫グロブリンの軽鎖の定常領域ドメインは、交換可能に「軽鎖定常領域ドメイン」、「ＣＬ領域」または「ＣＬドメイン」と呼ばれる。重鎖の定常ドメイン（例えば、ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメイン）は、交換可能に「重鎖定常領域ドメイン」、「ＣＨ」領域ドメインまたは「ＣＨドメイン」と呼ばれる。軽鎖の可変ドメインは、交換可能に「軽鎖可変領域ドメイン」、「軽鎖可変領域」、「ＶＬ領域ドメイン」または「ＶＬドメイン」と呼ばれる。重鎖の可変ドメインは、交換可能に「重鎖可変領域ドメイン」、「重鎖可変領域」、「ＶＨ領域ドメイン」または「ＶＨドメイン」と呼ばれる。
慣習により、可変定常領域ドメインのアミノ酸のナンバリングは、それらが抗原結合部位または免疫グロブリンもしくは抗体のアミノ末端からより離れるにつれて増加する。各重鎖および軽鎖免疫グロブリン鎖のＮ末端は可変領域であり、Ｃ末端は定常領域である。ＣＨ３およびＣＬドメインは、それぞれ重鎖および軽鎖のカルボキシ末端を含む。従って、軽鎖免疫グロブリンのドメインは、ＶＬ－ＣＬ配向で配置されているが、重鎖のドメインはＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３配向で配置される。
アミノ酸の各可変領域ドメインへの帰属は、Ｋａｂａｔ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９８７ ａｎｄ １９９１）の定義に従う。Ｋａｂａｔはまた、広く使用されている慣習的なナンバリング法も提供し（Ｋａｂａｔナンバリング）、このナンバリング法では、異なる重鎖可変領域間または異なる軽鎖可変領域間の対応する残基は同じ番号に割り当てられる。ＶＬドメインのＣＤＲ１、２および３はまた、本明細書においてそれぞれＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３、またはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３と呼ばれる。ＶＨドメインのＣＤＲ１、２および３はまた、本明細書においてそれぞれＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３、またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３と呼ばれる。そのように示される場合、ＣＤＲの帰属はＫａｂａｔの代わりにＩＭＧＴ（登録商標）（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．、Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００３）２７：５５－７７）に従う。重鎖定常領域のナンバリングはＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９８７ ａｎｄ １９９１）に記されるようにＥＵインデックスに従う。
本明細書で使用される用語「ＶＨドメイン」は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインを含み、用語「ＶＬドメイン」は、免疫グロブリン軽鎖のアミノ末端可変ドメインを含む。
本明細書で使用される用語「ＣＨ１ドメイン」は、例えば、Ｋａｂａｔナンバリングシステムでおよそ位置１１４～２２３（ＥＵ位置１１８～２１５）から伸びる免疫グロブリン重鎖の第一（最もアミノ末端側）の定常領域ドメインを含む。ＣＨ１ドメインはＶＨドメインに隣接し、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域に対してアミノ末端にあり、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の一部を形成しない。
本明細書で使用される用語「ヒンジ領域」は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに繋ぐ重鎖分子の部分を含む。ヒンジ領域は、およそ２５残基を含み、可動性であり、したがって二つのＮ末端抗原結合領域が独立して移動することを可能にする。ヒンジ領域は、三つの個別のドメインに細分化することができる：上部、中間、および下部ヒンジドメイン（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８）１６１：４０８３）。
本明細書で使用される用語「ＣＨ２ドメイン」は、例えば、Ｋａｂａｔナンバリングシステムでおよそ位置２４４～３６０（ＥＵ位置２３１～３４０）に伸びる重鎖免疫グロブリン分子の一部を含む。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密に対合していない点で独特である。むしろ、二つのＮ連結分枝炭化水素鎖が、インタクトな天然ＩｇＧ分子の二つのＣＨ２ドメイン間に挿入される。一実施形態において、本開示の結合ポリペプチドは、ＩｇＧ１分子（例えば、ヒトＩｇＧ１分子）から誘導されたＣＨ２ドメインを含む。
本明細書で使用される用語「ＣＨ３ドメイン」は、ＣＨ２ドメインのＮ末端からおよそ１１０残基伸びる重鎖免疫グロブリン分子の一部、例えばＫａｂａｔナンバリングシステムのおよそ位置３６１～４７６（ＥＵ位置３４１～４４７）を含む。ＣＨ３ドメインは、典型的には抗体のＣ末端部分を形成する。しかし、いくつかの免疫グロブリンにおいて、さらなるドメインがＣＨ３ドメインから伸びて分子のＣ末端部分を形成し得る（例えば、ＩｇＭのμ鎖およびＩｇＥのε鎖におけるＣＨ４ドメイン）。一実施形態において、本開示の結合ポリペプチドは、ＩｇＧ１分子（例えば、ヒトＩｇＧ１分子）から誘導されたＣＨ３ドメインを含む。
本明細書で使用される用語「ＣＬドメイン」は、例えば、Ｋａｂａｔ位置約１０７ＡからＫａｂａｔ位置約２１６まで伸びる免疫グロブリン軽鎖の定常領域ドメインを含む。ＣＬドメインはＶＬドメインに隣接する。一実施形態において、本開示の結合ポリペプチドは、カッパ軽鎖（例えば、ヒトカッパ軽鎖）から誘導されたＣＬドメインを含む。
本明細書で使用される用語「ＦｃＲｎアンタゴニスト」は、Ｆｃ領域を介してＦｃＲｎに特異的に結合し、免疫グロブリンのＦｃＲｎへの結合を阻害する、Ｆｃ領域（例えば、本明細書に開示されるバリアントＦｃ領域）を含むいずれかの剤を指す。
本明細書で使用される用語「Ｆｃ」、「Ｆｃドメイン」、「Ｆｃ領域」、または「Ｆｃフラグメント」は、交換可能に使用され、パパイン切断部位（すなわち、ＩｇＧの残基２１６、重鎖定常領域の最初の残基を１１４とする）のすぐＮ末端側のヒンジ領域から開始し、重鎖のＣ末端で終わる重鎖定常領域の一部と定義される。したがって、完全Ｆｃ、Ｆｃドメイン、Ｆｃ領域、またはＦｃフラグメントは、少なくともヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む。例となるヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４ Ｆｃドメインの部分（ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、残基２３１から４４７、Ｅｕナンバリング）の配列アラインメントは、図３２に示される。用語は、本明細書に記載される天然／野生型ＦｃおよびＦｃバリアントを包含し、抗体全体から消化されようと他の手段、例えば組換え技術によって産生されようと、モノマーまたはマルチマー（例えば、ダイマー）形態の分子を含む。例えば、Ｙｉｎｇ ｅｔ ａｌ．、ＪＢＣ（２０１３）２８８：２５１５４－１６４；およびＹａｎｇ ｅｔ ａｌ．、ＪＢＣ（２０１９）２９４：１０６３８－４８を参照されたい。いくつかの実施形態において、本開示の改変されたＦｃは、図３２に示される配列番号１、２、３、もしくは４の全体またはＦｃＲｎ－結合部分（または、その天然に存在するバリアント）を含み、ここで、配列は改変されて本明細書に記載されるアミノ酸置換を含む。
天然Ｆｃの元の免疫グロブリン供給源は、典型的にはヒト起源であり、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２など、いずれの免疫グロブリンでもよい。天然Ｆｃ分子は、共有結合（すなわち、ジスルフィド結合）および非共有結合により連結されてダイマーまたはマルチマーとなり得るモノマーポリペプチドで構成される。天然Ｆｃ分子のモノマーサブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ）またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）に依存して１～４の範囲に及ぶ。天然Ｆｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化から生じるジスルフィド結合ダイマーである。本明細書で使用される用語「天然Ｆｃ」は、モノマー、ダイマーおよびマルチマー形態の総称である。
本明細書で使用される用語「Ｆｃバリアント」、「改変されたＦｃ」または「改変されたＦｃドメイン」は、天然／野生型Ｆｃから改変されているがＦｃＲｎに対する結合部位をなお含む分子または配列を指す。Ｆｃバリアントまたは改変されたＦｃドメインはまた、天然Ｆｃよりも短くまたは長くてもよい（例えば、Ｅｕナンバリングで、ヒトＩｇＧの残基２１６から４４７にわたる配列よりも短いまたは長い）；例えば、Ｆｃバリアントまたは改変されたＦｃは、天然Ｆｃの特定のＮ末端および／またはＣ末端アミノ酸残基を欠いてもよい、または天然Ｆｃと比較してＮ末端および／またはＣ末端にさらなるアミノ酸残基を含有してもよい。改変されたＦｃドメイン自体は、抗体または抗体バリアントの抗原結合ドメイン、またはイムノアドヘシンの標的結合ドメインを含まないが、改変されたＦｃドメインが、そのようなドメインに連結して非ＦｃＲｎ標的にも結合するＦｃＲｎアンタゴニストを形成してもよい。用語は、非ヒト天然Ｆｃからヒト化された分子または配列を包含する。さらに、天然Ｆｃは、本明細書に記載されるＦｃＲｎアンタゴニスト（例えば、抗体様結合ポリペプチド）に必要ない構造的特徴または生物学的活性を提供するので除去することができる領域を含む。したがって、用語は：
（１）ジスルフィド結合形成、（２）選択された宿主細胞との不適合性、（３）選択された宿主細胞における発現の際のＮ末端異種性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体（ＦｃγＲ）への結合、または（７）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）に影響を及ぼすかまたはこれらに関与する、一つまたはそれ以上の天然Ｆｃ部位または残基を欠いている分子または配列、または一つまたはそれ以上のＦｃ部位または残基が改変されている分子または配列を包含する。
上に示されるように、抗体の可変領域は、抗体が抗原上のエピトープを選択的に認識し、特異的に結合することを可能にする。すなわち、抗体のＶＬドメインおよびＶＨドメインは、三次元抗原結合部位を規定する可変領域（Ｆｖ）を組み合わさって形成する。この四次抗体構造は、Ｙの各アームの末端に存在する抗原結合部位を形成する。より詳細には、抗原結合部位は、重鎖および軽鎖の可変領域の各々上の三つの相補性決定領域（ＣＤＲ）により規定される。本明細書で使用される用語「抗原結合部位」は、抗原（例えば、細胞表面または可溶性抗原）に特異的に結合する（免疫反応する）部位を含む。抗原結合部位は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖可変領域を含み、これらの可変領域により形成された結合部位は、抗体の特異性を決定する。抗原結合部位は、抗体ごとに変動する可変領域により形成される。ＦｃＲｎアンタゴナイズ結合ポリペプチド（ＦｃＲｎ－ａｎｔａｇｏｎｉｚｉｎｇ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、例えば、本開示の抗体は、少なくとも一つの抗原結合部位を含む。
特定の実施形態において、本開示の結合ポリペプチドは、結合ポリペプチドの選択された抗原との会合を提供する少なくとも二つの抗原結合ドメインを含む。抗原結合ドメインは、必ずしも同じ免疫グロブリン分子から誘導される必要はない。この関連で、可変領域は、液性応答を開始し、所望の抗原に対して免疫グロブリンを生成するために導入され得るいずれかのタイプの動物に由来し得るかまたは由来するものである。そのようなものとして、結合ポリペプチドの可変領域は、例えば哺乳動物起源であり得、例えば、ヒト、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル、アカゲザル、マカクザルなど）、オオカミ（ｌｕｐｉｎｅ）、またはラクダ科動物（例えば、ラクダ、ラマおよび関連種）であり得る。
天然に存在する抗体において、抗体は水性環境でその三次元配置をとることを前提として、各抗体に存在する六つのＣＤＲは、抗原結合部位を形成するように特異的に位置づけられたアミノ酸の短い不連続な配列である。重鎖および軽鎖の可変ドメインの残りは、アミノ酸配列においてより低い分子間可変性（ｉｎｔｅｒ－ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）を示し、フレームワーク領域と呼ばれる。フレームワーク領域は大部分β－シート立体構造をとり、ＣＤＲはβ－シート構造を接続し、いくつかの場合ではβ－シート構造の一部を形成するループを形成する。従って、これらのフレームワーク領域は、鎖間非共有相互作用により正しい方向で六つのＣＤＲの位置づけを提供する足場を形成するのに作用する。位置づけられたＣＤＲにより形成される抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープに対する表面相補性を規定する。この相補性表面は、免疫反応性抗原エピトープへの抗体の非共有結合を促進する。
例となる結合ポリペプチドとしては抗体バリアントが挙げられる。本明細書で使用される用語「抗体バリアント」としては、それらが天然に存在しないように変更された抗体の合成および操作された形態、例えば、少なくとも二つの重鎖部分を含むが二つの完全重鎖を含まない抗体（例えば、ドメイン欠失抗体またはミニボディ）；二つまたはそれ以上の異なる抗原にまたは単一の抗原上の異なるエピトープに結合するように変更された多重特異性形態の抗体（例えば、二重特異的、三重特異的など）；ｓｃＦｖ分子に接合された重鎖分子などが挙げられる。さらに、用語「抗体バリアント」は、抗体の多価形態（例えば、三価、四価など、同じ抗原の三つ、四つまたはそれ以上のコピーに結合する抗体）を含む。
本明細書で使用される用語「結合価」は、ポリペプチドにおける潜在的な標的結合部位の数を指す。各標的結合部位は、一つの標的分子または標的分子上の特異的部位に特異的に結合する。ポリペプチドが一つより多くの標的結合部位を含む場合、各標的結合部位は、同じかまたは異なる分子に特異的に結合し得る（例えば、異なるリガンドもしくは異なる抗原、または同じ抗原上の異なるエピトープに結合し得る）。主題の結合ポリペプチドは、典型的にはヒト抗原分子に特異的な少なくとも一つの結合部位を有する。
用語「特異性」は、所定の標的抗原（例えば、ヒト標的抗原）に特異的に結合する（例えば、免疫反応する）能力を指す。結合ポリペプチドは、単一特異性であり得、標的に特異的に結合する一つまたはそれ以上の結合部位を含有し、またはポリペプチドは多重特異性であり得、同じまたは異なる標的に特異的に結合する二つまたはそれ以上の結合部位を含有し得る。特定の実施形態において、結合ポリペプチドは、同じ標的の二つの異なる（例えば、非オーバーラップ）部分に対して特異的である。特定の実施形態において、結合ポリペプチドは、一つより多くの標的に対して特異的である。抗原に結合する抗原結合部位を含む例となる結合ポリペプチド（例えば、抗体）は当該分野で公知であり、このような抗体からの一つまたはそれ以上のＣＤＲが本明細書に記載される抗体に含まれ得る。
本明細書で使用される用語「抗原」または「標的抗原」は、結合ポリペプチドの結合部位による結合を受ける能力がある分子または分子の一部を指す。標的抗原は、一つまたはそれ以上のエピトープを有し得る。
用語「約」または「およそ」は、所定の値または範囲の約２０％以内、例えば約１０％以内、約５％以内、または約１％もしくはそれ以下以内を意味する。
本明細書で使用される「投与する」または「投与」は、身体の外側に存在する物質（例えば、本明細書において提供されるＦｃＲｎアンタゴニスト）を、限定されないが、例えば肺（例えば、吸入）、粘膜（例えば、鼻腔内）、皮内、静脈内、筋肉内、皮下送達および／または本明細書に記載されるかもしくは当該分野で公知のいずれかの他の物理的送達の方法により、患者に注入するかまたはその他の方法で物理的に送達する行動を指す。疾患またはその症状が管理されているかまたは処置されている場合、物質の投与は典型的には疾患またはその症状の開始後に起こる。疾患またはその症状が予防されている場合、物質の投与は、典型的には疾患またはその症状の開始前に起こり、長く継続されて疾患関連症状の出現または規模を延期し得るかまたは減少し得る。
本明細書で使用される用語「組成物」は、特定された成分（例えば、本明細書において提供されるＦｃＲｎアンタゴニスト）を、場合により特定された量で、さらには特定された成分の組合せから直接または間接的に生じるいずれかの生成物を、場合により特定された量で含有する製品を包含することを意図される。
「有効量」は、その薬剤を必要とする個体において所望の生理学的結果を達成するために十分な活性薬剤（例えば、本開示のＦｃＲｎアンタゴニスト）の量を意味する。有効量は、処置される個体の健康および身体状態、組成物の処方、個々の医学状態の評価、および他の関連する因子に依存して個体間で変化し得る。
本明細書で使用される用語「対象」および「患者」は、交換可能に使用される。本明細書で使用される対象は哺乳動物、例えば非霊長類（例えば、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌなど）または霊長類（例えば、サルおよびヒト）である。好ましい実施形態において、対象はヒトである。
本明細書で使用される用語「治療」は、疾患またはそれに関連する症状を予防する、管理する、処置する、および／または軽快させることにおいて使用され得るいずれかのプロトコル、方法および／または薬剤を指す。いくつかの実施形態において、用語「治療」は、ＩｇＧ媒介性疾患（例えば、自己免疫応答）または対象の状態またはそれに関連する症状のモジュレーションに使用され得るいずれかのプロトコル、方法および／または薬剤を指す。いくつかの実施形態において、用語「治療（ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）」および「治療（ｔｈｅｒａｐｙ）」は、医療関係者のような当業者に公知の疾患もしくはそれに関連する症状を予防する、管理する、処置する、および／もしくは軽快させることにおいて有用な、生物学的治療、支持療法、ならびに／または他の治療を指す。他の実施形態において、用語「治療（ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）」および「治療（ｔｈｅｒａｐｙ）」は、医療関係者のような当業者に公知の対象における免疫応答もしくはそれに関連する症状のモジュレーションにおいて有用な、生物学的治療、支持療法、ならびに／または他の治療を指す。
本明細書で使用される用語「処置する」、「処置」および「処置すること」は一つまたはそれ以上の治療（本明細書において提供されるＦｃＲｎアンタゴニストなどの一つまたはそれ以上の予防用または治療用の薬剤の投与を含むがこれに限定されない）の投与の結果として生じた、疾患またはそれに関連する症状の進行、重症度および／または期間の減少または軽快を指す。本明細書において使用される用語「処置すること」はまた、処置されている対象の疾患経過を変更することにも言及し得る。処置の治療効果としては、限定することなく、疾患の発生または再発を予防すること、症状の軽減、疾患の直接的または間接的な病理的帰結の減少、疾患の進行速度を減少させること、疾患状態の軽快または緩和、および緩解または改善された予後が挙げられる。
ＦｃＲｎアンタゴニスト
本発明のＦｃＲｎアンタゴニストは、改変されたＦｃドメインを含む（からなるまたはから本質的になるを含む）、また、例えば、抗体、抗体バリアントまたはフラグメント、例えば、Ｆｃフラグメント、イムノアドヘシン、およびＦｃ融合タンパク質であってもよい。ＦｃＲｎアンタゴニストは、モノマーまたはダイマーのＦｃフラグメントを含み得る。
いずれかのＩｇＧサブタイプからのＦｃドメインを使用して本開示のＦｃＲｎを生成することができる。いくつかの実施形態において、改変されたＦｃは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ Ｆｃドメインから誘導され、野生型の起源と比較して本明細書に記載される置換を含む。特定の他の実施形態において、改変されたＦｃは、一つより多くのＩｇＧサブタイプから誘導された人工のＦｃである。他の実施形態において、Ｆｃドメインは、キメラヒンジ（すなわち、異なる抗体アイソタイプのヒンジドメインから誘導されたヒンジ部分を含むヒンジ、例えば、ＩｇＧ４分子由来の上部ヒンジドメインおよびＩｇＧ１中間ヒンジドメイン）を含む。
特定の実施形態において、改変されたＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインから誘導される。他の実施形態において、改変されたＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインから誘導される。他のサブタイプのＦｃドメインの場合、当業者には当然のことながら、本明細書に記載されるアミノ酸置換のいずれも適切に適合され得る（図３２を参照されたい）。別の指示がない限り、本明細書に記載されるＦｃ残基位置は、ＥＵ Ｉｇナンバリングシステムに従う。図３２に見られるように、ヒトＩｇＧ ＣＨ２およびＣＨ３ドメインは、四つの異なるサブタイプの間で高度に保存されている。Ｅｕナンバリングシステムは、全てのサブタイプに適用される。
いくつかの実施形態において、改変されたＦｃドメインは、Ｍ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｔ２５６、Ｋ２８８、Ｔ３０７、Ｋ３２２、Ｅ３８０、Ｌ４３２、Ｎ４３４、またはＹ４３６、およびそのいずれかの組合せから選択されるアミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施形態において、改変されたＦｃドメインは、Ｍ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｔ２５６、Ｋ２８８、Ｔ３０７、Ｋ３２２、Ｅ３８０、Ｌ４３２、Ｎ４３４、およびＹ４３６から選択されるいずれか二つのアミノ酸位置に二重アミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施形態において、改変されたＦｃドメインは、Ｍ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｔ２５６、Ｋ２８８、Ｔ３０７、Ｋ３２２、Ｅ３８０、Ｌ４３２、Ｎ４３４、およびＹ４３６から選択されるいずれか三つのアミノ酸位置に三重アミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施形態において、改変されたＦｃドメインは、Ｍ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｔ２５６、Ｋ２８８、Ｔ３０７、Ｋ３２２、Ｅ３８０、Ｌ４３２、Ｎ４３４、およびＹ４３６から選択されるいずれか四つのアミノ酸位置に四重アミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施形態において、改変されたＦｃドメインが、Ｍ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｔ２５６、Ｋ２８８、Ｔ３０７、Ｋ３２２、Ｅ３８０、Ｌ４３２、またはＹ４３６、およびそのいずれかの組合せから選択されるいずれかのアミノ酸位置にアミノ酸置換を含むことが望ましくあり得、ここでアミノ酸位置Ｎ４３４は置換されていない（すなわち、アミノ酸位置Ｎ４３４は野生型である）。
いくつかの実施形態において、改変されたＦｃドメインは、Ｍ２５２Ｙ（すなわち、アミノ酸位置２５２のチロシン）、Ｔ２５６Ｄ、Ｔ２５６Ｅ、Ｋ２８８Ｄ、Ｋ２８８Ｎ、Ｔ３０７Ａ、Ｔ３０７Ｅ、Ｔ３０７Ｆ、Ｔ３０７Ｍ、Ｔ３０７Ｑ、Ｔ３０７Ｗ、Ｅ３８０Ｃ、Ｎ４３４Ｆ、Ｎ４３４Ｐ、Ｎ４３４Ｙ、Ｙ４３６Ｈ、Ｙ４３６Ｎ、またはＹ４３６Ｗ、およびそれらのいずれかの組合せから選択されるアミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施形態において、改変されたＦｃドメインは、Ｍ２５２［ここで置換はＭ２５２Ｙである］；Ｔ２５６［ここで置換はＴ２５６Ｄ、またはＴ２５６Ｅである］；Ｋ２８８［ここで置換はＫ２８８Ｄ、またはＫ２８８Ｎである］；Ｔ３０７［ここで置換はＴ３０７Ａ、Ｔ３０７Ｅ、Ｔ３０７Ｆ、Ｔ３０７Ｍ、Ｔ３０７Ｑ、またはＴ３０７Ｗである］；Ｅ３８０［ここで置換はＥ３８０Ｃである］；Ｎ４３４［ここで置換はＮ４３４Ｆ、Ｎ４３４Ｐ、またはＮ４３４Ｙである］；Ｙ４３６［ここで置換はＹ４３６Ｈ、Ｙ４３６Ｎ、またはＹ４３６Ｗである］から選択される二重アミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施形態において、改変されたＦｃドメインは、Ｍ２５２［ここで置換はＭ２５２Ｙである］；Ｔ２５６［ここで置換はＴ２５６Ｄ、またはＴ２５６Ｅである］；Ｋ２８８［ここで置換はＫ２８８Ｄ、またはＫ２８８Ｎである］；Ｔ３０７［ここで置換はＴ３０７Ａ、Ｔ３０７Ｅ、Ｔ３０７Ｆ、Ｔ３０７Ｍ、Ｔ３０７Ｑ、またはＴ３０７Ｗである］；Ｅ３８０［ここで置換はＥ３８０Ｃである］；Ｎ４３４［ここで置換はＮ４３４Ｆ、Ｎ４３４Ｐ、またはＮ４３４Ｙである］；Ｙ４３６［ここで置換はＹ４３６Ｈ、Ｙ４３６Ｎ、またはＹ４３６Ｗである］から選択される三重アミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施形態において、改変されたＦｃドメインは、Ｍ２５２［ここで置換はＭ２５２Ｙである］；Ｔ２５６［ここで置換はＴ２５６Ｄ、またはＴ２５６Ｅである］；Ｋ２８８［ここで置換はＫ２８８Ｄ、またはＫ２８８Ｎである］；Ｔ３０７［ここで置換はＴ３０７Ａ、Ｔ３０７Ｅ、Ｔ３０７Ｆ、Ｔ３０７Ｍ、Ｔ３０７Ｑ、またはＴ３０７Ｗである］；Ｅ３８０［ここで置換はＥ３８０Ｃである］；Ｎ４３４［ここで置換はＮ４３４Ｆ、Ｎ４３４Ｐ、またはＮ４３４Ｙである］；Ｙ４３６［ここで置換はＹ４３６Ｈ、Ｙ４３６Ｎ、またはＹ４３６Ｗである］から選択される四重アミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施形態において、改変されたＦｃドメインが、Ｍ２５２Ｙ、Ｔ２５６Ｄ、Ｔ２５６Ｅ、Ｋ２８８Ｄ、Ｋ２８８Ｎ、Ｔ３０７Ａ、Ｔ３０７Ｅ、Ｔ３０７Ｆ、Ｔ３０７Ｍ、Ｔ３０７Ｑ、Ｔ３０７Ｗ、Ｅ３８０Ｃ、Ｙ４３６Ｈ、Ｙ４３６Ｎ、またはＹ４３６Ｗ、およびそのいずれかの組合せから選択されるアミノ酸位置のいずれかにアミノ酸置換を含むことが望ましくあり得、アミノ酸位置Ｎ４３４はフェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）で置換されていない。いくつかの実施形態において、改変されたＦｃドメインが、Ｍ２５２Ｙ、Ｔ２５６Ｄ、Ｔ２５６Ｅ、Ｋ２８８Ｄ、Ｋ２８８Ｎ、Ｔ３０７Ａ、Ｔ３０７Ｅ、Ｔ３０７Ｆ、Ｔ３０７Ｍ、Ｔ３０７Ｑ、Ｔ３０７Ｗ、Ｅ３８０Ｃ、Ｙ４３６Ｈ、Ｙ４３６Ｎ、またはＹ４３６Ｗ、およびそのいずれかの組合せから選択されるアミノ酸位置のいずれかにアミノ酸置換を含むことが望ましくあり得、アミノ酸位置Ｎ４３４はチロシン（Ｙ）で置換されていない。いくつかの実施形態において、改変されたＦｃドメインが、Ｍ２５２Ｙ、Ｔ２５６Ｄ、Ｔ２５６Ｅ、Ｋ２８８Ｄ、Ｋ２８８Ｎ、Ｔ３０７Ａ、Ｔ３０７Ｅ、Ｔ３０７Ｆ、Ｔ３０７Ｍ、Ｔ３０７Ｑ、Ｔ３０７Ｗ、Ｅ３８０Ｃ、Ｙ４３６Ｈ、Ｙ４３６Ｎ、またはＹ４３６Ｗ、およびそのいずれかの組合せから選択されるアミノ酸位置のいずれかにアミノ酸置換を含むことが望ましくあり得、アミノ酸位置Ｎ４３４は置換されていない（すなわち、アミノ酸位置Ｎ４３４は野生型である）。
特定の実施形態において、改変されたＦｃドメインは、Ｍ２５２、Ｔ２５６、Ｔ３０７、またはＮ４３４、およびそのいずれかの組合せから選択されるアミノ酸置換を含み得る。特定の実施形態において、改変されたＦｃドメインは、Ｍ２５２、Ｔ２５６、Ｔ３０７、およびＮ４３４から選択されるいずれか二つのアミノ酸位置に二重アミノ酸置換を含み得る。特定の実施形態において、改変されたＦｃドメインは、Ｍ２５２、Ｔ２５６、Ｔ３０７、およびＮ４３４から選択されるいずれか三つのアミノ酸位置に三重アミノ酸置換を含み得る。特定の実施形態において、改変されたＦｃドメインは、アミノ酸位置Ｍ２５２、Ｔ２５６、Ｔ３０７、およびＮ４３４での四重アミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施形態において、改変されたＦｃドメインが、Ｍ２５２、Ｔ２５６、またはＴ３０７、およびそのいずれかの組合せから選択されるアミノ酸置換を含むことが望ましくあり得、ここでアミノ酸位置Ｎ４３４は置換されていない（すなわち、アミノ酸位置Ｎ４３４は野生型である）。
例となる実施形態において、改変されたＦｃドメインは、Ｍ２５２［ここで置換はＭ２５２Ｙである］；Ｔ２５６［ここで置換はＴ２５６Ｄ、またはＴ２５６Ｅである］；Ｔ３０７［ここで置換はＴ３０７Ｑ、またはＴ３０７Ｗである］；またはＮ４３４［ここで置換はＮ４３４Ｆ、またはＮ４３４Ｙである］、およびそのいずれかの組合せから選択されるアミノ酸置換を含み得る。特定の実施形態において、改変されたＦｃドメインは、Ｍ２５２［ここで置換はＭ２５２Ｙである］；Ｔ２５６［ここで置換はＴ２５６Ｄ、またはＴ２５６Ｅである］；Ｔ３０７［ここで置換はＴ３０７Ｑ、またはＴ３０７Ｗである］；またはＮ４３４［ここで置換はＮ４３４Ｆ、またはＮ４３４Ｙである］から選択されるいずれか二つのアミノ酸位置に二重アミノ酸置換を含み得る。特定の実施形態において、改変されたＦｃドメインは、Ｍ２５２［ここで置換はＭ２５２Ｙである］；Ｔ２５６［ここで置換はＴ２５６Ｄ、またはＴ２５６Ｅである］；Ｔ３０７［ここで置換はＴ３０７Ｑ、またはＴ３０７Ｗである］；またはＮ４３４［ここで置換はＮ４３４Ｆ、またはＮ４３４Ｙである］から選択されるいずれか三つのアミノ酸位置に三重アミノ酸置換を含み得る。特定の実施形態において、改変されたＦｃドメインは、Ｍ２５２［ここで置換はＭ２５２Ｙである］；Ｔ２５６［ここで置換はＴ２５６Ｄ、またはＴ２５６Ｅである］；Ｔ３０７［ここで置換はＴ３０７Ｑ、またはＴ３０７Ｗである］；またはＮ４３４［ここで置換はＮ４３４Ｆ、またはＮ４３４Ｙである］から選択されるアミノ酸位置に四重アミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施形態において、改変されたＦｃドメインが、Ｍ２５２Ｙ、Ｔ２５６Ｄ、Ｔ２５６Ｅ、Ｔ３０７Ｑ、またはＴ３０７Ｗ、およびそのいずれかの組合せから選択されるアミノ酸置換を含むことが望ましくあり得、ここでアミノ酸位置Ｎ４３４はフェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）で置換されていない。いくつかの実施形態において、改変されたＦｃドメインが、Ｍ２５２Ｙ、Ｔ２５６Ｄ、Ｔ２５６Ｅ、Ｔ３０７Ｑ、またはＴ３０７Ｗ、およびそのいずれかの組合せから選択されるアミノ酸置換を含むことが望ましくあり得、ここでアミノ酸位置Ｎ４３４はチロシン（Ｙ）で置換されていない。いくつかの実施形態において、改変されたＦｃドメインが、Ｍ２５２Ｙ、Ｔ２５６Ｄ、Ｔ２５６Ｅ、Ｔ３０７Ｑ、またはＴ３０７Ｗ、およびそのいずれかの組合せから選択されるアミノ酸置換を含むことが望ましくあり得、ここでアミノ酸位置Ｎ４３４は置換されていない（すなわち、アミノ酸位置Ｎ４３４は野生型である）。
特定の実施形態において、改変されたＦｃドメインは、Ｔ２５６Ｄ、もしくはＴ２５６Ｅ、および／またはＴ３０７Ｗ、もしくはＴ３０７Ｑから選択されるアミノ酸置換を含み得、Ｎ４３４Ｆ、もしくはＮ４３４Ｙ、またはＭ２５２Ｙから選択されるアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、改変されたＦｃドメインが、Ｔ２５６Ｄ、もしくはＴ２５６Ｅ、および／またはＴ３０７Ｗ、もしくはＴ３０７Ｑから選択されるアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換Ｍ２５２Ｙをさらに含むことが望ましくあり得、ここでアミノ酸位置Ｎ４３４はフェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）で置換されていない。いくつかの実施形態において、改変されたＦｃドメインが、Ｔ２５６Ｄ、もしくはＴ２５６Ｅ、および／またはＴ３０７Ｗ、もしくはＴ３０７Ｑから選択されるアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換Ｍ２５２Ｙをさらに含むことが望ましくあり得、ここでアミノ酸位置Ｎ４３４はチロシン（Ｙ）で置換されていない。いくつかの実施形態において、改変されたＦｃドメインが、Ｔ２５６Ｄ、もしくはＴ２５６Ｅ、および／またはＴ３０７Ｗ、もしくはＴ３０７Ｑから選択されるアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換Ｍ２５２Ｙをさらに含むことが望ましくあり得、ここでアミノ酸位置Ｎ４３４は置換されていない（すなわち、アミノ酸位置Ｎ４３４は野生型である）。
いくつかの実施形態において、改変されたＦｃドメインは、図３３に示されるアミノ酸置換を含み得る。例えば、改変されたＦｃドメインは、二重アミノ酸置換Ｍ２５２Ｙ／Ｎ４３４Ｙ（ＹＹ）；またはＭ２５２Ｙ／Ｔ３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｙ（ＹＷＹ）、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｎ４３４Ｙ（ＹＤＹ）、およびＴ２５６Ｄ／３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｙ（ＤＷＹ）から選択される三重アミノ酸置換を含み得る。
いくつかの実施形態において、改変されたＦｃドメインは、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｆ（ＹＤＱＦ）、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｆ（ＹＤＷＦ）、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｙ（ＹＤＱＹ）、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｙ（ＹＥＱＹ）、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｙ（ＹＤＷＹ）、およびＭ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｙ（ＹＥＷＹ）から選択される四重アミノ酸置換を含み得る。
いくつかの実施形態において、改変されたＦｃドメインは、本明細書に開示される一つまたはそれ以上、例えば、二つまたはそれ以上、三つまたはそれ以上、または四つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有する。
改変されたＦｃは、その野生型のカウンターパートと比較して酸性ｐＨ（例えば、約７．０未満、約６．５以下、または約６．０以下）および非酸性ｐＨ（例えば、約７．０以上、または約７．４以上）の両方で増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。
本明細書で使用される用語「増強された」は、所定のパラメーターにおける１０％増加を指し、対照、ベースライン、または前のイン－タイム（ｐｒｉｏｒ－ｉｎ－ｔｉｍｅ）値に対して少なくとも２０％増加、３０％増加、４０％増加、５０％増加、６０％増加、７０％増加、８０％増加、９０％増加、９５％増加、９７％増加、９９％またはさらに１００％増加を包含し得る。用語「増強された」は、対照、ベースライン、または前のイン－タイム値に対して所定のパラメーターの少なくとも１倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１０００倍増加を指し得る。特定の実施形態において、用語「増強された」は、野生型標準、例えば、野生型Ｆｃドメインと比較した増加を指す。他の実施形態において、用語「増強された」は、ＦｃＲｎアンタゴニスト、例えば、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆを含むＦｃＲｎアンタゴニスト（「ＹＴＥＫＦ ｈＩｇＧ１」；例えば、Ｓｗｉｅｒｃｚら、前出、を参照されたい）と比較した増加を指す。
いくつかの実施形態において、ＦｃＲｎアンタゴニストは、種特異的ＦｃＲｎ結合親和性を示し得る。いくつかの実施形態において、ＦｃＲｎアンタゴニストは、ヒトならびにカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＦｃＲｎ結合親和性を示し得る。一実施形態において、結合ポリペプチドは、ラットおよび／またはマウスＦｃＲｎ結合親和性を示し得る。いくつかの実施形態において、結合ポリペプチドは、異種間（ｃｒｏｓｓ－ｓｐｅｃｉｅｓ）ＦｃＲｎ結合親和性を示し得る。このような結合ポリペプチドは、一つまたはそれ以上の異なる種にわたって交差反応性であると言われる。一実施形態において、結合ポリペプチドは、ヒトおよびラットＦｃＲｎ結合親和性の両方を示し得る。
新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、抗体のＦｃ領域と相互作用して、正常リソソーム分解からのレスキューによりリサイクリングを促進する。このプロセスは、酸性ｐＨ（例えば、６．５未満のｐＨ）でエンドソームにおいて発生するが、血流の生理的ｐＨ条件下（例えば、非酸性ｐＨ）では発生しないｐＨ依存性プロセスである。本開示のＦｃＲｎアンタゴニストは、野生型Ｆｃドメインを含むポリペプチドと比較して酸性および非酸性条件下の両方で、増強されたＦｃＲｎ結合親和性またはより遅いＦｃＲｎ解離速度を有する。酸性ｐＨは、約７．０未満のｐＨ、例えば、約ｐＨ６．５、約ｐＨ６．０、約ｐＨ５．５、約ｐＨ５．０である。上昇した非酸性ｐＨは、約７もしくはそれ以上のｐＨ、例えば、約ｐＨ７．４、約ｐＨ７．６、約ｐＨ７．８、約ｐＨ８．０、約ｐＨ８．５、または約ｐＨ９．０である。特定の実施形態において、本明細書に記載される改変されたＦｃドメインを含むポリペプチドは、ＦｃＲｎ結合におけるｐＨ依存性の喪失を示す；すなわち、野生型Ｆｃと異なり、そのポリペプチドは、酸性条件と比較して非酸性条件下で、ＦｃＲｎに対して劇的に低い結合親和性を有しない。したがって、このようなポリペプチドは、循環から野生型ＦｃＲｎ結合特性を有するＩｇＧのクリアランスを促進するＦｃＲｎアンタゴニストとして有用であり、その理由は、ＦｃＲｎアンタゴニストが、ｐＨ非依存的、または、より低いｐＨ依存的な様式でＦｃＲｎに緊密に結合することによって、野生型（すなわち、より低い）ＦｃＲｎ結合親和性を有するＩｇＧのＦｃＲｎ媒介性リサイクリングを破壊する。
免疫グロブリンのＦｃドメインは、非抗原結合機能に関与し、Ｆｃ受容体への結合、例えばＦｃＲｎの結合により媒介されるいくつかのエフェクター機能を有する。図１Ａに説明されるように、ＦｃドメインはＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインから構成される。ＦｃＲｎとの相互作用に関与するＦｃ残基の大部分は、ＣＨ２－ＣＨ３界面（図１Ａ、点線）に直接隣接し、グリコシル化部位の反対側にあるループに位置する。図１Ｂは、ＩｇＧ１ Ｆｃ結晶構造（ｐｄｂ：５ｄ４ｑ）の表面描写を示し、ＦｃＲｎ結合界面を構成するＣＨ２およびＣＨ３ドメインにおける残基を示す。
特定の実施形態において、本発明のＦｃＲｎアンタゴニストは、一つまたはそれ以上のアミノ酸変異（例えば、置換）を含む改変されたＦｃドメインを含み得、これが、野生型Ｆｃドメインを有することを除いてＦｃＲｎアンタゴニストと同じ構造を有する分子などの対応する野生型分子と比較して、Ｆｃドメインのエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣまたはＣＤＣ機能）を変更する。抗体ＦｃＲｎアンタゴニストに関して、その対応する野生型分子は、およそ同じ免疫原性の抗体を含む変更されていない抗体全体であってもよい。例えば、減少したＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣエフェクター機能を有するＦｃＲｎアンタゴニスト（例えば、ＬＡＬＡ変異を含有するもの）は、患者に投与されると、望ましくない副作用の原因となる可能性が低い。
特定の実施形態において、本発明のＦｃＲｎアンタゴニストは、一つまたはそれ以上のアミノ酸変異（例えば、置換）を含む改変されたＦｃドメインを含み得、これが、対応する野生型分子と比較して、ＦｃＲｎアンタゴニストの循環半減期（例えば、血清半減期）を変更（例えば、増加または減少）する。例えば、血清半減期の減少は、ＦｃＲｎアンタゴニストが延長期間に患者の身体に存在することが所望されない場合に有利であり得る。
特定の実施形態において、本発明のＦｃＲｎアンタゴニストは、一つまたはそれ以上の変異（例えば、置換）を含む改変されたＦｃドメインを含み得、これが、対応する野生型分子と比較して、一つまたはそれ以上の所望の生化学的な特徴、例えば、モノマーのまま残る能力、非共有結合性にダイマー化する能力、標的部位、およびグリコシル化パターンに局在化する増加した能力を提供する。例えば、改変されたＦｃドメインは、減少したグリコシル化（例えば、Ｎ－またはＯ－連結グリコシル化）を有し得る。減少したまたは変更されたグリコシル化を付与する例となるアミノ酸置換は、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／０１８５７２号に開示される。いくつかの実施形態において、Ｆｃドメインは、グリコシル化を除去するよう改変される（例えば、「アグリ」抗体）。「アグリ」ＦｃＲｎアンタゴニストは、ｉｎ ｖｉｖｏでの改善された安全性および安定性プロファイルを有し得る。多数の当該分野で認識された方法が、「アグリ」抗体または変更されたグリカンを有する抗体を製造するために利用可能である。例えば、改変されたグリコシル化経路（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ欠失）を有する遺伝子操作された宿主細胞（例えば、改変された酵母、例えば、ピキア（Ｐｉｃｃｈｉａ）、またはＣＨＯ細胞）を使用してこのような抗体を産生させることができる。
特定の実施形態において、Ｆｃドメインは、当該分野で公知の技術を使用してエフェクター機能を減少するように変異され得る。いくつかの実施形態において、本明細書の改変されたＦｃはまた、Ｆｃ－ガンマ受容体（ＦｃγＲ）に対する変更された結合親和性を有する。ＦｃγＲは、いくつかのメンバー、例えばＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、およびＦｃγＲＩＩＩｂを含むファミリーに属する。いくつかの実施形態において、本明細書の改変されたＦｃは、野生型Ｆｃドメインと比較して、増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有すると同時に、減少したＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する。
いくつかの実施形態において、ＦｃＲｎアンタゴニストは抗体である。適切な抗体は、限定することなく、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体を含み、全長抗体または単鎖抗体であってもよい。抗体は、疾患状態に関連する可溶性標的（例えば、サイトカインおよび分泌される循環タンパク質）を標的とし得る。
抗体を含めて、低い熱力学的安定性を有するタンパク質は、ミスフォールディングおよび凝集の増加した傾向を有し、有用な治療剤としてのタンパク質の活性、効能、および可能性を限定するかまたは阻むだろう。特定の実施形態において、ＦｃＲｎアンタゴニストは、野生型Ｆｃドメインまたは三重アミノ酸置換Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（ＹＴＥ）を有する改変されたＦｃドメインを含むポリペプチドとおよそ同じまたはそれに匹敵する熱安定性を有する。
改変の結果として得られる生理学的プロファイル、バイオアベイラビリティおよび他の生化学的効果、例えば、局在化、体内分布および血清半減期は、過度の実験なしに周知の免疫学的技術を使用して容易に測定および定量され得る。
特定の実施形態において、本開示のＦｃＲｎアンタゴニストは単離された結合ポリペプチドであり、改変されたＦｃドメインに融合された抗体から誘導される抗原結合フラグメントを含む。用語「抗原結合フラグメント」は、抗原に結合するまたは抗原結合（すなわち、特異的結合）についてインタクトな抗体（すなわち、それらが由来するインタクト抗体）と競合する免疫グロブリンまたは抗体のポリペプチドフラグメントを指す。
いくつかの実施形態において、結合ポリペプチドは、本明細書の改変されたＦｃに融合された単鎖可変領域配列（ＳｃＦｖ）を含む。単鎖可変領域配列は、一つまたはそれ以上の抗原結合部位、例えば、可動性リンカーによりＶＨドメインに連結されたＶＬドメインを有する単一のポリペプチドを含む。ＳｃＦｖ分子は、ＶＨ－リンカー－ＶＬ配向でまたはＶＬ－リンカー－ＶＨ配向で構築され得る。抗原結合部位を構成するＶＬおよびＶＨドメインを連結する可動性ヒンジは、約１０～約５０アミノ酸残基を含む。ペプチドの接続は当該分野で公知である。
いくつかの実施形態において、本開示の結合ポリペプチドは、ＳｃＦｖ分子（例えば、変更されたＳｃＦｖ分子）を有する抗体をコードするＤＮＡ配列を融合することにより製造される多価（例えば、四価）抗体である。例えば、一実施形態において、ＳｃＦｖ分子（例えば、変更されたＳｃＦｖ分子）がそのＮ末端またはＣ末端で可動性リンカー（例えば、ｇｌｙ／ｓｅｒリンカー）を介して抗体のＦｃフラグメントに連結されるように、これらの配列を組み合わせる。別の実施形態において、本開示の四価抗体は、ＳｃＦｖ分子を接続ペプチドに融合し、これを改変されたＦｃドメインに融合して、ＳｃＦｖ－Ｆａｂ四価分子を構築することにより作られ得る。
別の実施形態において、本開示の結合ポリペプチドは変更されたミニボディである。本開示の変更されたミニボディは、それぞれがＳｃＦｖ分子を含む二つのポリペプチド鎖で構成されたダイマー分子であり、これは接続ペプチドを介して改変されたＦｃドメインに融合される。ミニボディは、ＳｃＦｖ成分を構築し、当該分野で記載された方法を使用してペプチド成分を接続することにより作られ得る（例えば、米国特許第５，８３７，８２１号またはＷＯ９４／０９８１７を参照されたい）。別の実施形態において、四価ミニボディが構築され得る。四価ミニボディは、二つのＳｃＦｖ分子が可動性リンカーを使用して連結されることを除いてミニボディと同じ様式で構築され得る。次いで、連結されたｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ構築物を改変されたＦｃドメインに接合する。
別の実施形態において、本開示の結合ポリペプチドはダイアボディを含む。ダイアボディは、ダイマーの四価分子であり、同じポリペプチド鎖のＶＬおよびＶＨドメインが相互作用できないように、それぞれがｓｃＦｖ分子に似たポリペプチドを有するが、両方の可変ドメインを接続する通常は短い（１０未満、例えば、約１～約５つの）アミノ酸残基リンカーを有する。代わりに、一つのポリペプチド鎖のＶＬおよびＶＨドメインは、第二のポリペプチド鎖の（それぞれ）ＶＨおよびＶＬドメインと相互作用する（例えば、ＷＯ０２／０２７８１を参照されたい）。本開示のダイアボディは、改変されたＦｃドメインに融合されたｓｃＦｖ様分子を含む。
他の実施形態において、結合ポリペプチドは、同じポリペプチド鎖に連続して一つまたはそれ以上の可変ドメインを含む多重特異性または多価抗体、例えば、タンデム可変ドメイン（ＴＶＤ）ポリペプチドを含む。例となるＴＶＤポリペプチドは、米国特許第５，９８９，８３０号に記載される「ダブルヘッド」または「デュアル－Ｆｖ」配置を含む。デュアル－Ｆｖ配置において、二つの異なる抗体の可変ドメインは二つの別々の鎖（一つの重鎖および一つの軽鎖）にタンデム配向で発現され、ここで一方のポリペプチド鎖は、ペプチドリンカーで分離された二つの連続したＶＨドメインを有し（ＶＨ１－リンカー－ＶＨ２）、他方のポリペプチド鎖は、ペプチドリンカーにより連続して接続される相補的ＶＬドメインからなる（ＶＬ１－リンカー－ＶＬ２）。クロスオーバーダブルヘッド配置において、二つの異なる抗体の可変ドメインがタンデム配向で二つの別々のポリペプチド鎖に発現され（一つの重鎖および一つの軽鎖）、ここで一方のポリペプチド鎖は、ペプチドリンカーにより分離された二つの連続したＶＨドメインを有し（ＶＨ１－リンカー－ＶＨ２）、他方のポリペプチド鎖は、ペプチドリンカーにより逆向きの配向で連続して接続された相補的ＶＬドメインからなる（ＶＬ２－リンカー－ＶＬ１）。「二重－Ｆｖ」形式に基づくさらなる抗体バリアントとしては、二重－可変－ドメイン（Ｄｕａｌ－Ｖａｒｉａｂｌｅ－Ｄｏｍａｉｎ）ＩｇＧ（ＤＶＤ－ＩｇＧ）二重特異性抗体（米国特許第７，６１２，１８１号を参照されたい）およびＴＢＴＩ形式（ＵＳ２０１０／０２２６９２３Ａ１を参照されたい）が挙げられる。いくつかの実施形態において、結合ポリペプチドは、改変されたＦｃドメインに融合された同じポリペプチド鎖に連続して一つまたはそれ以上の可変ドメインを含む多重特異性または多価抗体を含む。
別の例となる実施形態において、結合ポリペプチドは、「ダブルヘッド」配置に基づくクロスオーバー二重可変ドメインＩｇＧ（ＣＯＤＶ－ＩｇＧ）二重特異性抗体を含む（ＵＳ２０１２０２５１５４１Ａ１を参照されたい）。
別の例となる実施形態において、結合ポリペプチドはイムノアドヘシンである。本明細書で使用される「イムノアドヘシン」は、免疫グロブリン定常ドメイン（すなわち、Ｆｃ領域）に連結された、一つまたはそれ以上の結合ドメインを含む結合ポリペプチド（例えば、受容体、リガンド、または細胞接着分子由来）を指す（例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９５）８（２）：１０４－１５、ａｎｄ Ｉｓａａｃｓ、Ｂｒｉｔ Ｊ Ｒｈｅｕｍ．（１９９７）３６：３０５－７を参照されたい、これらはそれら全体が参照によって本明細書に組み入れられる）。イムノアドヘシンの例は、受容体のリガンド結合ドメインとＩｇＧ Ｆｃドメインの間のキメラ分子である。いくつかの実施形態において、ＦｃＲｎアンタゴニストは、炎症に関与するサイトカインに結合し、隔離するイムノアドヘシンである。
イムノアドヘシンは、それらの国際一般名（ＩＮＮ）において末尾「－セプト（－ｃｅｐｔ）」により識別される。抗体と同様に、イムノアドヘシンは長い循環半減期を有し、アフィニティーベースの方法により容易に精製され、二価性により付与されるアビディティーの利点を有する。市販の治療用イムノアドヘシンの例としては、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標））、アバタセプト（ＯＲＥＮＣＩＡ（登録商標））、リロナセプト（ＡＲＣＡＬＹＳＴ（登録商標））、アフリベルセプト（ＺＡＬＴＲＡＰ（登録商標）／ＥＹＬＥＡ（登録商標））、およびベラタセプト（ＮＵＬＯＪＩＸ（登録商標））が挙げられる。
特定の実施形態において、単離された結合ポリペプチドは、抗体模倣体、例えば、本明細書に記載される改変されたＦｃドメインに融合された、アフィボディ、アフィリン（ａｆｆｉｌｉｎ）、アフィマー（ａｆｆｉｍｅｒ）、アフィチン（ａｆｆｉｔｉｎ）、アルファボディー（ａｌｐｈａｂｏｄｙ）、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー（Ｆｙｎｏｍｅｒ）、Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド、モノボディー、およびｎａｎｏＣＬＡＭＰｓである。
特定の実施形態において、結合ポリペプチドは免疫グロブリン様ドメインを含む。適切な免疫グロブリン様ドメインとしては、限定することなく、フィブロネクチンドメイン（例えば、Ｋｏｉｄｅ ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（２００７）３５２：９５－１０９を参照されたい、これはその全体が参照によって本明細書に組み入れられる）、ＤＡＲＰｉｎ（例えば、Ｓｔｕｍｐｐ ｅｔ ａｌ．、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ（２００８）１３（１５－１６）：６９５－７０１を参照されたい、これはその全体が参照によって本明細書に組み入れられる）、プロテインＡのＺドメイン（例えば、Ｎｙｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．、ＦＥＢＳ Ｊ．（２００８）２７５（１１）：２６６８－７６を参照されたい、これはその全体が参照によって本明細書に組み入れられる）、リポカリン（例えば、Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．（２００８）ＦＥＢＳ Ｊ．２７５（１１）：２６７７－８３を参照されたい、これはその全体が参照によって本明細書に組み入れられる）、アフィリン（例えば、Ｅｂｅｒｓｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（２００７）３７２（１）：１７２－８５を参照されたい、これはその全体が参照によって本明細書に組み入れられる）、アフィチン（例えば、Ｋｒｅｈｅｎｂｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ．、（２００８）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．３８３（５）：１０５８－６８を参照されたい、これはその全体が参照によって本明細書に組み入れられる）、アビマー（例えば、Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．、（２００５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（１２）：１５５６－６１を参照されたい、これはその全体が参照によって本明細書に組み入れられる）、フィノマー（例えば、Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（２００７）２８２（５）：３１９６－３２０４を参照されたい、これはその全体が参照によって本明細書に組み入れられる）、およびＫｕｎｉｔｚドメインペプチド（例えば、Ｎｉｘｏｎ ｅｔ ａｌ．、（２００６）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｄｅｖｅｌ ９（２）：２６１－８を参照されたい、これはその全体が参照によって本明細書に組み入れられる）が挙げられる。
本明細書に記載される改変されたＦｃドメインを含む本開示の結合ポリペプチドは、既知の「親」抗体のＣＤＲ配列または可変ドメイン配列を含み得る。いくつかの実施形態において、親抗体および本開示の抗体は、本明細書に開示されるＦｃドメインに対する改変を除いて類似するかまたは同一の配列を共有し得る。
核酸および発現ベクター
本明細書に開示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、典型的には、記載されるポリペプチド、例えば、抗体、そのフラグメント、またはイムノアドヘシンの所望の量を産生させるために使用され得る宿主細胞への導入のための発現ベクターに挿入される。従って、特定の態様において、本発明は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含む発現ベクター、ならびにこれらのベクターおよびポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。
用語「ベクター」または「発現ベクター」は、明細書および特許請求の範囲の目的のために、所望の遺伝子を細胞に導入し、発現させるために使用されるベクターを意味するために本明細書において使用される。このようなベクターは、プラスミド、ファージ、およびウイルス（例えば、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、およびレトロウイルス）からなる群から容易に選択され得る。一般に、ベクターは、選択マーカーおよび所望の遺伝子のクローニングを促進するための適切な制限部位、ならびに真核生物細胞または原核生物細胞に進入し、および／または複製するベクターの能力を含む。
多数の発現ベクター系が使用され得る。例えば、ベクターの一つのクラスは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶまたはＭＯＭＬＶ）、またはＳＶ４０ウイルスなどの動物ウイルスに由来するＤＮＡエレメントを利用する。その他は、内部リボソーム結合部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ）を有するポリシストロニック系の使用を含む。さらに、ＤＮＡをそれらの染色体に組み込んだ細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする一つまたはそれ以上のマーカーを導入することにより選択され得る。マーカーは、栄養要求性宿主に対する原栄養性、殺生物剤抵抗性（例えば、抗生物質）または銅のような重金属に対する抵抗性を提供し得る。選択可能なマーカー遺伝子は、発現させるＤＮＡ配列に直接連結されても、同時形質転換により同じ細胞に導入されてもよい。さらなるエレメントもｍＲＮＡの最適な合成のために必要であるかもしれない。これらのエレメントはシグナル配列、スプライスシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサー、および終結シグナルを含み得る。いくつかの実施形態において、クローンされた可変領域遺伝子は、上で考察されるように合成された重鎖および軽鎖定常領域遺伝子（例えばヒト遺伝子）とともに発現ベクターに挿入される。
他の実施形態において、本明細書に記載される結合ポリペプチドは、ポリシストロニック構築物を使用して発現され得る。このような発現系において、抗体の重鎖および軽鎖などの目的の複数の遺伝子産物が、単一のポリシストロニック構築物から産生され得る。これらの系は内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を有利に使用して、比較的高いレベルのポリペプチドを真核生物宿主細胞に提供する。適合するＩＲＥＳ配列は米国特許第６，１９３，９８０号に開示される。
より一般的に、本開示のＦｃＲｎアンタゴニストをコードするベクターまたはＤＮＡ配列が製造されると、発現ベクターは適切な宿主細胞に導入され得る。宿主細胞へのプラスミドの導入は、様々な技術、例えば、トランスフェクション（電気泳動および電気穿孔を含む）、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エンベロープＤＮＡでの細胞融合、マイクロインジェクション、およびインタクトなウイルスでの感染によって達成され得る。形質転換された細胞を、本結合ポリペプチドの産生のために適切な条件下で増殖させ、それらの合成についてアッセイする。例となるアッセイ技術としては、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または蛍光活性化セルソーター分析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学などが挙げられる。
本ポリペプチドの発現のために使用される宿主細胞は、真核生物（例えば、哺乳動物、昆虫、酵母または植物）または原核生物起源のものであってもよい。いくつかの実施形態において、ポリペプチドの発現のために使用される宿主細胞株は哺乳動物起源のものである；当業者は、そこで発現させる所望の遺伝子産物に最も適した特定の宿主細胞株を決定することができる。例となる宿主細胞株としては、限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ株、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶＩ（サル腎臓系統）、ＣＯＳ（ＳＶ４０Ｔ抗原を有するＣＶＩ由来細胞）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓系統）、ＳＰ２／Ｏ（マウスミエローマ）、ＢＦＡ－１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）、および２９３（ヒト腎臓）が挙げられる。一実施形態において、細胞株は、それらから発現された結合ポリペプチド（例えば、抗体）の変更されたグリコシル化、例えば、フコース欠損（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６．ＲＴＭ．（Ｃｒｕｃｅｌｌ）またはＦＵＴ８－ノックアウトＣＨＯ細胞株（ＰＯＴＥＬＬＩＧＥＮＴ（商標）細胞）（Ｂｉｏｗａ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ））をもたらす。一実施形態において、ＮＳ０細胞が使用され得る。宿主細胞株は、典型的には商業サービス、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎまたは公開された文献から入手可能である。組織培養条件下での哺乳動物細胞培養のための技術は当該分野で公知であり、例えば、エアリフトリアクターもしくは連続撹拌リアクター中の均一懸濁培養、または例えば、中空繊維、マイクロカプセル、アガロースマイクロビーズもしくはセラミックカートリッジにおいて固定もしくは捕捉された細胞培養が挙げられる。必要な場合および／または所望される場合、ポリペプチドの溶液は、慣用のクロマトグラフィー方法、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ－セルロースでのクロマトグラフィーおよび／または（イムノ－）アフィニティークロマトグラフィーにより精製され得る。
処置方法
一態様において、本開示は、それを必要とする対象（例えば、ヒト患者）を処置する方法であって、本明細書に開示される有効量のＦｃＲｎアンタゴニストを投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態において、本開示は、このような処置方法における使用のための、製品（例えば、キット）を提供する。患者は、ＩｇＧ媒介性疾患または障害を有し、本開示のＦｃＲｎアンタゴニストで処置されることによって血清のＩｇＧのより速いクリアランスから利益を受ける。本明細書で使用される用語「抗体関連」、「抗体媒介性」、および「抗体応答性」障害、状態、または疾患は、望ましくない抗体（例えば、患者にもはや必要または有益とされない特定の自己反応性ＩｇＧ、または外因性に提供される治療または診断上のＩｇＧ）の除去により軽快し得る障害、状態、または疾患を指す。
特定の実施形態において、ＩｇＧ媒介性障害は、自己免疫疾患、例えば、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症筋無力症、全身性硬化症（ＳＳｃ）／強皮症、関節リウマチ、乾癬性関節炎、骨関節炎、糖尿病、多発性硬化症、尋常性天疱瘡、アトピー性皮膚炎、乾癬、喘息、アレルギー、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、および化膿性汗腺炎であり得る。
特定の実施形態において、ＩｇＧ媒介性障害はアレルギーであり得る。アレルギーは、例えば、食物アレルギー（例えば、卵アレルギー、魚アレルギー、甲殻類アレルギー、果実アレルギー、ニンニクアレルギー、トウガラシアレルギー、カラスムギアレルギー、食肉アレルギー、ミルクアレルギー、ピーナッツアレルギー、コメアレルギー、ゴマアレルギー、大豆アレルギー、亜硫酸アレルギー、タルトラジンアレルギー、ツリーナッツアレルギー、コムギアレルギーなど）、薬物アレルギー（例えば、テトラサイクリンアレルギー、ダイランチンアレルギー、タグレトールアレルギー、ペニシリンアレルギー、セファロスポリンアレルギー、スルホンアミドアレルギー、非ステロイド抗炎症剤アレルギー、静脈内造影色素アレルギーなど）、環境アレルギー（例えば、草アレルギー、花粉アレルギー、ネコアレルギー、イヌアレルギー、昆虫アレルギー、カビアレルギー、芳香剤アレルギー、化粧品アレルギー、***アレルギー、ラテックスアレルギー、水アレルギー、イエダニアレルギー、ニッケルアレルギー、金アレルギー、クロムアレルギー、塩化コバルトアレルギー、現像液アレルギー、殺菌剤アレルギーなど）および接触アレルギー（例えば、ラテックスアレルギー、パラフェニレンジアミンアレルギー、グリセリルモノチオグリコレートアレルギー、トルエンスルファノミドホルムアルデヒド（ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆａｎｏｍｉｄｅ ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）アレルギーなど）であり得る。
特定の実施形態において、本明細書に開示されるＦｃＲｎアンタゴニストは、一つまたはそれ以上のさらなる治療剤との組合せに使用され得る。特定の実施形態において、本明細書に開示されるＦｃＲｎアンタゴニストを含む組合せ療法は、例えば、炎症促進性サイトカインに結合することおよび循環から炎症促進性サイトカインを除去することによって、生来の免疫系および／または適応免疫系を標的とすることができる。いくつかの実施形態において、ＦｃＲｎアンタゴニスト自身は、炎症促進性サイトカインに結合および炎症促進性サイトカインを除去することができ、自己反応性血清ＩｇＧならびに炎症促進性サイトカインを除去する組合せ効果を達成する。特定の実施形態において、本明細書に開示されるＦｃＲｎアンタゴニストを含む組合せ療法は、ＴＬＲ－阻害剤、例えば、ＩＲＡＫ－４阻害剤を含み得る。
特定の実施形態において、ＦｃＲｎアンタゴニストを使用して、対象においてＦｃ－含有剤（例えば、治療または診断剤）の血清レベルを減少することができる。Ｆｃ－含有剤のクリアランスは、Ｆｃ－含有剤が対象に対して有害（例えば、毒性）であるまたはＦｃ－含有試薬が特定の期間に対象に存在することのみが所望される場合において所望されてもよく、例えば、それぞれＦｃ－含有剤が免疫原性であるときまたはＦｃ－含有剤が抗体－薬物コンジュゲートであるときである。特定の実施形態において、Ｆｃ－含有剤のクリアランスは、Ｆｃ－含有剤に対する対象の曝露量を減少させる。血清中のいずれかのＦｃ－含有剤のレベルは、本明細書に記載されるＦｃＲｎアンタゴニストを使用することによって減少させ得る。したがって、特定の実施形態において、本明細書に開示されるＦｃＲｎアンタゴニストを使用して、Ｆｃ－含有剤を投与されている対象においてＦｃ－含有剤の血清レベルを減少させる。
別の態様において、画像診断を増強する方法であって、本明細書に開示される治療有効量のＦｃＲｎアンタゴニストを対象に投与することを含む方法を提供する。本明細書に開示されるＦｃＲｎアンタゴニストを使用して、画像診断の間に放射性標識した抗体に対するバックグラウンドレベルおよび全身曝露の両方を減少させることができる。特定の実施形態において、画像診断としては、限定することなく、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、単一光子放出コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、ＰＥＴおよびコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）の組合せなどが挙げられる。
特定の実施形態において、対象は有効量の放射性標識した抗体を投与され、場合により、ＦｃＲｎアンタゴニストは放射性標識した抗体の投与後に投与される。特定の実施形態において、放射性標識した抗体のコントラストは、例えば、非結合の放射性標識した抗体を循環からクリアランスすることなどによって、本明細書に記載されるＦｃＲｎアンタゴニストを使用して対象中で増強して、増加したコントラスト（例えば、減少したバックグラウンドシグナル）および放射性標識した抗体に対する曝露の有害な効果の減少を可能にする。したがって、特定の実施形態において、画像診断の間に放射性標識した抗体に対する正常組織の曝露を減少させる方法であって、本明細書に開示される治療有効量のＦｃＲｎアンタゴニストを対象に投与することを含む方法を提供する。
特定の実施形態において、本明細書に開示されるＦｃＲｎアンタゴニストを使用して治療剤を対象から排除することができる。例えば、治療剤を投与された対象は、投与された治療剤の利用可能性および／または効能を減少させる、抗薬物抗体などの抗体を発生させ得る。対象における抗薬物抗体の存在は、望まれない副作用を生じ得る。したがって、本明細書に開示されるＦｃＲｎアンタゴニストは、対象に発生する抗薬物抗体を除去する。
当業者は、慣用の実験により、本明細書に記載される有効量のＦｃＲｎアンタゴニスト（例えば、増強されたＦｃＲｎ結合をｐＨ６．０およびｐＨ７．４で有する四重バリアント）を決定できるであろう。特定の実施形態において、有効量のＦｃＲｎアンタゴニストは非毒性である。ＦｃＲｎアンタゴニストの治療有効量は様々な因子に応じて変動し得る。例えば、限定することなく、ＦｃＲｎアンタゴニストを投与される対象の年齢、性別、病期、および病歴は、ＦｃＲｎアンタゴニストの治療有効量の適切な決定に影響し得る。適切な投薬レジメンは、対象に有効な治療応答を提供するために決定され得る。投薬量は分けられ、特定の期間にわたり投与されてもよい（例えば、一週間毎日投与）。
特定の実施形態において、本開示は、このような処置を必要とする哺乳動物対象における障害、例えば、ＩｇＧ媒介性障害の診断および／または処置のためのキットおよび方法を提供する。例となる実施形態において、対象はヒトである。
医薬組成物およびその投与
本ＦｃＲｎアンタゴニストを製造し、対象に投与する方法は、当業者に周知であるまたは容易に決定され得る。投与経路は、経口、非経口、局所または吸入であり得る。本明細書で使用される用語「非経口」としては、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸または膣投与が挙げられる。全てのこれらの投与形態は、本開示の範囲内であると明確に企図されるが、投与形態は、注射用液剤、特に静脈内もしくは動脈内注射または点滴用であろう。通常は、注射に適切な医薬組成物は、緩衝液（例えば、酢酸、ヒスチジン、リン酸またはクエン酸緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、場合により安定剤（例えば、ヒトアルブミン）、保存剤などを含み得る。いくつかの実施形態において、ＦｃＲｎアンタゴニストは、有害な細胞集団の部位に直接送達され得、それにより患部組織の治療剤への曝露を増加させる。
非経口投与のための製剤としては、滅菌水性または非水性液剤、懸濁剤、および乳剤が挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、および注射可能有機エステル類、例えばオレイン酸エチルである。水性担体は、生理食塩水および緩衝化媒体を含めて、水、アルコール性／水性液剤、乳剤または懸濁剤を含む。本開示の組成物および方法において、薬学的に許容される担体としては、限定されないが、０．０１～０．１Ｍ、例えば、０．０５Ｍリン酸緩衝液、または０．８％食塩水が挙げられる。他の一般的な非経口ビヒクルとしては、リン酸ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、体液（ｆｌｕｉｄ）および栄養補給剤、電解質補給剤、例えば、リンゲルデキストロースに基づくもの、および同様のものが挙げられる。保存料ならびに例えば、抗菌薬、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどの他の添加剤も存在していてもよい。より詳細には、注射可能用途に適切な医薬組成物としては、滅菌水性液剤（水溶性の場合）または分散剤、および滅菌注射可能液剤または分散剤の即時調製のための滅菌粉剤が挙げられる。このような場合、組成物は無菌でなければならず、容易な注射可能性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度まで流動性であるべきである。これは製造および貯蔵の条件下で安定であるべきであり、典型的には細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して守られる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール、および同様のもの）を含有する溶媒または分散媒体、およびそれらの適切な混合物であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散の場合には必要な粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により維持され得る。
微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールおよび同様のものにより達成され得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖類、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムが組成物中に含まれる。吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含めることにより、注射可能組成物の延長された吸収が起こり得る。
いずれの場合にも、滅菌注射可能液剤は、必要量の活性化合物（例えば、それ自体、または他の活性薬剤と組み合わせた改変された結合ポリペプチド）を、本明細書において列挙された成分のうちの一つまたは組合せとともに適切な溶媒中に組み込み、要求に応じ、続いて滅菌濾過することにより製造され得る。一般に、分散剤は、活性化合物を滅菌ビヒクルに組み込むことにより製造され、これは基本の分散媒体および上で列挙したものからの必要な他の成分を含有する。滅菌注射可能液剤の調製のための滅菌粉剤の場合、例となる製造方法としては真空乾燥および凍結乾燥が挙げられ、これにより、前もって滅菌濾過したその溶液からの活性成分といずれかのさらなる所望の成分との粉末が得られる。注射のための製剤は、当該分野公知の方法に従って、加工され、アンプル、バッグ、瓶、シリンジまたはバイアルなどの容器中に充填され、無菌条件下で密封される。さらに、製剤はパッケージングされてキットの形態で販売され得る。このような製品は、典型的には、関連する組成物が、ＩｇＧ媒介性障害に罹患しているかまたはＩｇＧ媒介性障害にかかりやすい対象を処置するために有用であるということを示すラベルまたは添付文書を有する。
本医薬組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の健康状態、病歴、年齢、性別、および重量を含む多くの異なる因子に依存して変動する。処置投薬量は、安全性および効能を最適化するために当業者の公知の慣用の方法を使用して滴定され得る。
本ＦｃＲｎアンタゴニストは複数回投与され得る。単回投薬間の間隔は、毎週、毎月または毎年であり得る。間隔は、患者におけるＩｇＧの血中レベルを測定することにより示される適切性に従い、不規則であってもよい。いくつかの方法において、投薬が調整されて、約１－１０００μｇ／ｍｌの血漿ＦｃＲｎアンタゴニスト濃度が達成され、また、いくつかの方法において、約２５－３００μｇ／ｍｌの血漿ＦｃＲｎアンタゴニスト濃度が達成される。あるいは、ＦｃＲｎアンタゴニストは持続性放出処方として投与され得、この場合、必要とされる投与頻度はより低い。抗体について、投薬量および頻度は患者における抗体の半減期に依存して変動する。
本明細書の医薬組成物は、一つまたはそれ以上の種の本ＦｃＲｎアンタゴニストおよび生理食塩水、非毒性緩衝液などの薬学的に許容される非毒性の無菌担体を含み得る。投薬量および投与頻度は、処置が予防的かまたは治療的かに依存して変動し得る。予防的適用において、ＦｃＲｎアンタゴニストを含有する医薬組成物またはそのカクテルは、疾患の発生に対する患者（例えば、遺伝的に感受性の患者）の抵抗性を増強するためにまだ疾患状態ではない患者に投与される。このような量は、「予防有効用量」と定義される。この使用において、正確な量は、この場合もやはり患者の健康状態および全身の免疫に依存するが、一般に、用量あたり約０．１～約２５ｍｇ、特に用量あたり約０．５～約２．５ｍｇの範囲に及ぶ。比較的低い投薬量が、比較的低頻度の間隔で長期間にわたって投与される。一部の患者は彼らの寿命の残りの間処置を受け続ける。治療適用において、比較的高い投薬量（例えば、用量あたり抗体約１～４００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約５～２５ｍｇの投薬量）が比較的短い間隔で、疾患の進行が減少するかもしくは終結するまで、または患者が疾患症状の部分的もしくは完全な軽快を示すまで、必要とされることもある。その後、患者は予防的レジメンを投与され得る。
例となる実施形態
本開示の例となる非限定的な実施形態が、以下に提供される。
１．それを必要とする対象において抗体媒介性障害を処置する方法であって、アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）、およびアミノ酸位置３０７にトリプトファン（Ｗ）またはグルタミン（Ｑ）［ここで、アミノ酸位置２５４はトレオニン（Ｔ）ではない］を含み、ならびに：
アミノ酸位置４３４にフェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）；および
アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）［ここで、アミノ酸位置は、ＥＵナンバリングに従う］
をさらに含む少なくとも四つのアミノ酸置換の組合せを含む改変されたＦｃドメインを含む治療有効量のＦｃＲｎアンタゴニストを対象に投与することを含む方法。
２．それを必要とする対象において抗体媒介性障害を処置する方法であって、
ａ）アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置３０７にグルタミン（Ｑ）、およびアミノ酸位置４３４にチロシン（Ｙ）；
ｂ）アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６にグルタミン酸（Ｅ）、アミノ酸位置３０７にトリプトファン（Ｗ）、およびアミノ酸位置４３４にチロシン（Ｙ）；
ｃ）アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６にグルタミン酸（Ｅ）、アミノ酸位置３０７にグルタミン（Ｑ）、およびアミノ酸位置４３４にチロシン（Ｙ）；
ｄ）アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置３０７にグルタミン（Ｑ）、およびアミノ酸位置４３４にフェニルアラニン（Ｆ）；または
ｅ）アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置３０７にトリプトファン（Ｗ）、およびアミノ酸位置４３４にチロシン（Ｙ）、
［ここで、アミノ酸置換は、ＥＵナンバリングに従う］
からなる群から選択される位置アミノ酸置換の組合せを有する改変されたＦｃドメインを含む治療有効量のＦｃＲｎアンタゴニストを対象に投与することを含む方法。
３．それを必要とする対象において抗体媒介性障害を処置する方法であって、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｙ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｙ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｙ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｆ、およびＭ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｙからなる群から選択される四重アミノ酸置換［ここで、アミノ酸置換はＥＵナンバリングに従う］を含む改変されたＦｃドメインを含む治療有効量のＦｃＲｎアンタゴニストを対象に投与することを含む方法。
４．それを必要とする対象において抗体媒介性障害を処置する方法であって、ＥＵナンバリングに従って、アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置３０７にグルタミン（Ｑ）、およびアミノ酸位置４３４にチロシン（Ｙ）を含む改変されたＦｃドメインを含む治療有効量のＦｃＲｎアンタゴニストを対象に投与することを含む方法。
５．それを必要とする対象において抗体媒介性障害を処置する方法であって、ＥＵナンバリングに従って、アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６にグルタミン酸（Ｅ）、アミノ酸位置３０７にトリプトファン（Ｗ）、およびアミノ酸位置４３４にチロシン（Ｙ）を含む改変されたＦｃドメインを含む治療有効量のＦｃＲｎアンタゴニストを対象に投与することを含む方法。
６．それを必要とする対象において抗体媒介性障害を処置する方法であって、ＥＵナンバリングに従って、アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６にグルタミン酸（Ｅ）、アミノ酸位置３０７にグルタミン（Ｑ）、およびアミノ酸位置４３４にチロシン（Ｙ）を含む改変されたＦｃドメインを含む治療有効量のＦｃＲｎアンタゴニストを対象に投与することを含む方法。
７．それを必要とする対象において抗体媒介性障害を処置する方法であって、ＥＵナンバリングに従って、アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置３０７にグルタミン（Ｑ）、およびアミノ酸位置４３４にフェニルアラニン（Ｆ）を含む改変されたＦｃドメインを含む治療有効量のＦｃＲｎアンタゴニストを対象に投与することを含む方法。
８．それを必要とする対象において抗体媒介性障害を処置する方法であって、ＥＵナンバリングに従って、アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置３０７にトリプトファン（Ｗ）、およびアミノ酸位置４３４にチロシン（Ｙ）を含む改変されたＦｃドメインを含む治療有効量のＦｃＲｎアンタゴニストを対象に投与することを含む方法。
９．改変されたＦｃドメインは改変されたヒトＦｃドメインである、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
１０．改変されたＦｃドメインは改変されたＩｇＧ１ Ｆｃドメインである、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
１１．ＦｃＲｎアンタゴニストはヒトＦｃＲｎ結合親和性を有する、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
１２．ＦｃＲｎアンタゴニストはヒトおよびラットＦｃＲｎ結合親和性を有する、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
１３．ＦｃＲｎアンタゴニストは、野生型Ｆｃドメインを含むＦｃＲｎアンタゴニストと比較して、増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
１４．ＦｃＲｎアンタゴニストは、野生型Ｆｃドメインを含むＦｃＲｎアンタゴニストと比較して、酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
１５．ＦｃＲｎアンタゴニストは、ＥＵナンバリングに従って、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆを含むＦｃＲｎアンタゴニストと比較して、酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
１６．ＦｃＲｎアンタゴニストは、野生型Ｆｃドメインを含むＦｃＲｎアンタゴニストと比較して、非酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
１７．ＦｃＲｎアンタゴニストは、ＥＵナンバリングに従って、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆを含むＦｃＲｎアンタゴニストと比較して、非酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
１８．ＦｃＲｎアンタゴニストは、野生型Ｆｃドメインを含むＦｃＲｎアンタゴニストと比較して、酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性および非酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
１９．ＦｃＲｎアンタゴニストは、ＥＵナンバリングに従って、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆを含むＦｃＲｎアンタゴニストと比較して、酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性および非酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
２０．酸性ｐＨは約６．０である、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
２１．非酸性ｐＨは約７．４である、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
２２．ＦｃＲｎアンタゴニストは、野生型Ｆｃドメインを含むＦｃＲｎアンタゴニストと比較して、減少した血清半減期を有する、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
２３．ＦｃＲｎアンタゴニストは、ＥＵナンバリングに従って、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆを含むＦｃＲｎアンタゴニストと比較して、減少した血清半減期を有する、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
２４．ＦｃＲｎアンタゴニストは、野生型Ｆｃドメインを含むＦｃＲｎアンタゴニストと比較して、減少したＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
２５．ＦｃＲｎアンタゴニストは、野生型Ｆｃドメインを含むＦｃＲｎアンタゴニストと比較して、減少した熱安定性を有する、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
２６．ＦｃＲｎアンタゴニストは結合ポリペプチドである、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
２７．ＦｃＲｎアンタゴニストはＦｖフラグメント、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ－Ｈ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｄＡｂ、およびそのマルチマーバージョン、単一ドメイン抗体、マキシボディ（ｍａｘｉｂｏｄｙ）、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖＮＡＲ、ならびにｂｉｓ－ｓｃＦｖからなる群から選択される抗体またはそのフラグメントである、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
２８．抗体はモノクローナル抗体である、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
２９．抗体はキメラ、ヒト化、またはヒト抗体である、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
３０．抗体は全長抗体である、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
３１．ＦｃＲｎアンタゴニストは、アフィボディ、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディー、アンチカリン、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー、Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド、モノボディー、およびｎａｎｏＣＬＡＭＰからなる群から選択される抗体模倣体である、実施形態１～２５のいずれか一つに記載の方法。
３２．ＦｃＲｎアンタゴニストはアフィボディである、実施形態３１に記載の方法。
３３．ＦｃＲｎアンタゴニストはアルブミン結合ドメインをさらに含む、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
３４．ＦｃＲｎアンタゴニストは一つまたはそれ以上の標的に特異的に結合する、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
３５．抗体媒介性障害は自己免疫疾患である、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
３６．自己免疫疾患は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症筋無力症、全身性硬化症（ＳＳｃ）／強皮症、関節リウマチ、乾癬性関節炎、骨関節炎、糖尿病、多発性硬化症、尋常性天疱瘡、アトピー性皮膚炎、乾癬、喘息、アレルギー、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、および化膿性汗腺炎からなる群から選択される、実施形態３５に記載の方法。
３７．画像診断を増強する方法であって、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｙ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｙ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｙ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｆ、およびＭ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｙからなる群から選択される四重アミノ酸置換［ここで、アミノ酸置換はＥＵナンバリングに従う］を含む改変されたＦｃドメインを含む治療有効量のＦｃＲｎアンタゴニストを対象に投与することを含む方法。
３８．有効量の放射性標識した抗体を対象に投与することをさらに含む、実施形態３７に記載の方法。
３９．ＦｃＲｎアンタゴニストは放射性標識した抗体の後に投与される、実施形態３８に記載の方法。
４０．放射性標識した抗体に対するコントラストを増強する、実施形態３７または３８に記載の方法。
４１．画像診断の間に放射性標識した抗体に対する、非標的組織の曝露を減少させる方法であって、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｙ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｙ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｙ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｆ、およびＭ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｙからなる群から選択される四重アミノ酸置換［ここで、アミノ酸置換はＥＵナンバリングに従う］を含む改変されたＦｃドメインを含む治療有効量のＦｃＲｎアンタゴニストを対象に投与することを含む方法。
本明細書において言及されるかまたは引用される論文、特許、および特許出願、ならびに全ての他の書類および電子的に利用可能な情報の内容は、各個々の刊行物が具体的かつ個別に参照により組み入れられると示される同じ程度まで、それら全体が参照により本明細書に組み入れられる。出願人らは、いずれかのこのような論文、特許、特許出願、または他の物理的および電子的書類からのいずれかおよび全ての材料および情報を本出願に物理的に組み入れる権利を有する。
本発明はその特定の実施形態を参照して記載されてきたが、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更がなされ得、均等物が置き換えられ得るということが当業者により理解されるべきである。本明細書に記載される方法の他の適切な改変および適合が、本明細書に開示される実施形態の範囲から逸脱することなく適切な均等物を使用してなされ得るということが当業者には容易に明らかとなろう。さらに、多くの改変が、特定の状況、材料、組成物、方法、プロセス工程を、本発明の目的、精神および範囲に適合させるためになされ得る。全てのこのような改変は、本明細書に添付の特許請求の範囲内であることが意図される。特定の実施形態を詳細に記載してきたが、これらは以下の実施例を参照することにより、より明確に理解され、これら実施例は、説明の目的のみのために含まれ、限定することを意図されない。
本発明を、以下の実施例によりさらに例示する。それらはさらなる限定であると解釈されるべきではない。
材料および方法
タンパク質試薬：
以下のタンパク質を発現させ単離した：Ｃ末端８×ヒスチジンタグを含む抗原（配列番号５）；ラットＦｃＲｎ（ｒＦｃＲｎ、ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ１３５９、ｐ５１サブユニット：残基２３～２９８；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ０７１５１、β２－ｍ：残基２１～１１９）；ビオチン化カニクイザルＦｃＲｎ（ｃｙｎｏＦｃＲｎ、ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ８ＳＰＶ９、ｐ５１サブユニット：Ｃ末端Ａｖｉ－タグを含む残基２４～２９７；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ８ＳＰＷ０、β２－ｍ：残基２１～１１９）；ビオチン化ヒトＦｃＲｎ（ｈＦｃＲｎ、ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ５５８９９、ｐ５１サブユニット：Ｃ末端Ａｖｉ－タグを含む残基２４～２９７；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ６１７６９、β２－ｍ：残基２１～１１９）；ヒトＣＤ１６ａ（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ０８６３７、ＦｃγＲＩＩＩａ：Ｃ末端ＨＰＣ４タグおよび１５８位にバリン（Ｖ１５８）を含む残基１７～２０８）。Ｈ４３５ＡおよびＨ３１０Ａ／Ｈ４３５Ｑの重鎖バリアントをＨＥＫ２９３条件培地から得た。ｍＡｂ２（ＩｇＧ１）バリアントをＥｖｉｔｒｉａによりクローニングし、ｍＡｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ（商標）アフィニティーカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して懸濁液ＣＨＯ Ｋ１条件培地から精製し、その後の実験用にリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４へと緩衝液交換を行った。
飽和ライブラリ構築
リーダーＤＮＡ配列を有するＷＴ ＩｇＧ１ ｍＡｂ１（ＩｇＧ１）抗体の重鎖および軽鎖を、ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素部位を使用して、それぞれｐＢＨ６４１４およびｐＢＨ６３６８の哺乳動物発現プラスミドに組み込んだ。飽和ライブラリを、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ａｇｉｌｅｎｔ）およびＮＮＫ（Ｎ＝Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ｋ＝Ｇ／Ｔ）およびＷＷＣ（Ｗ＝Ａ／Ｔ）のプライマー（ＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて作製して、可能な全てのアミノ酸を以下の位置に導入した：Ｍ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｔ２５６、Ｋ２８８、Ｔ３０７、Ｋ３２２、Ｅ３８０、Ｌ４３２、Ｎ４３４およびＹ４３６（ＥＵナンバリング）。ｍＡｂ１骨格における３つの対照バリアント、ＡＡＡ（Ｔ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ）、ＬＳ（Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ）およびＹＴＥ（Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ）の重鎖ＤＮＡ配列を、ＬａｋｅＰｈａｒｍａ製のｐＢＨ６４１４ベクターに構築した。
ＰＣＲ反応において、Ｑ５ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（ＮＥＢｉｏｌａｂｓ）ならびにＷＴおよびＭ２５２ＹのテンプレートとともにＴ２５６Ｄ、Ｔ２５６Ｅ、Ｔ３０７Ｑ、Ｔ３０７Ｗ、Ｎ４３４ＦおよびＮ４３４Ｙの各プライマーを用いた、ｍＡｂ１重鎖の部位特異的突然変異誘発を通して、組合せ飽和ライブラリを得た。ｍＡｂ３骨格への突然変異組込みを、Ｍ２５２Ｙ、Ｔ２５６Ｄ、Ｔ３０７ＱおよびＴ３０７Ｗの各プライマーとともにＱ５（登録商標）Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（ＮＥＢｉｏｌａｂｓ）を使用して行った。全てのＦｃバリアントの作製を、Ｓａｎｇｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｇｅｎｅｗｉｚ，Ｉｎｃ．）により確認した。
組み換え抗体発現および精製
条件培地スクリーニングの場合、ｍＡｂ１の突然変異型重鎖および野生型軽鎖を含有するＤＮＡを、製造者の取扱説明書に従って発現用のＥｘｐｉ２９３哺乳動物細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））１ｍＬにトランスフェクトした。細胞を、２ｍＬ ９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）で、３７℃で５％二酸化炭素および湿度８０％で毎分９００回転（ＲＰＭ）にて振盪しながらインキュベートするとともに通気膜で密封した。条件培地をトランスフェクション後の５日目に採取し、使用するまで－８０℃で保存した。ｍＡｂ１骨格およびｍＡｂ３骨格中のリードバリアントを、３０ｍＬスケールで０．２μｍベント付きキャップ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を備えた１２５ｍＬのフラスコ中で発現させた。１２５ｍＬ培養フラスコを発現期間全体の間１２５ＲＰＭで振盪した。条件培地をトランスフェクション後の５日目に採取し、０．２２μｍ、５０ｍＬコニカルフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に通して濾過し、精製まで４℃で保存した。
ｍＡｂ１およびｍＡｂ３の単離を、ｍＡｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ（商標）ＨｉＴｒａｐ（登録商標）カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）１ｍＬを使用して行った。１０カラムの体積に対してのＰＢＳ ｐＨ７．４の洗浄段階に続いて、抗体を０．１Ｍクエン酸ｐＨ３．０（Ｓｉｇｍａ）５カラムの体積で溶出し、１Ｍトリス塩基ｐＨ９．０（Ｓｉｇｍａ）０．５ｍＬで中和した。溶出させた抗体を、ＰＢＳ ｐＨ７．４に対して緩衝液交換を行い、その後の試験用に３０ｋＤａ ＭＷＣＯ Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標））を使用して＞１ｍｇ ｍＬ－１に濃縮した。精製した抗体の濃度を、適切な吸光係数を用いて２８０ｎｍでのそれらのＵＶ吸光度（ＵＶ２８０）から決定した。
Ｏｃｔｅｔ条件培地スクリーニングおよび解析
ｍＡｂ１バリアントを含有する条件培地のスクリーニングを、Ｎｉ－ＮＴＡバイオセンサーを備えたＯｃｔｅｔ ＱＫ ３８４（ＰＡＬＬ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行った。Ｈｉｓタグ化抗原を、ＰＢＳ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ）および０．０１％ Ｔｗｅｅｎ－２０（Ｓｉｇｍａ）ｐＨ７．４（ＰＢＳＴ－ＢＳＡ ７．４）中で、１５μｇ ｍＬ－１で３００秒間捕捉し、これに続いてＰＢＳＴ－ＢＳＡ ｐＨ７．４で２０秒洗浄した。ＰＢＳＴ－ＢＳＡ ｐＨ７．４を用いて１：１希釈の条件培地中で２００秒間抗体を捕捉した。ｐＨ６．０緩衝剤中での緩衝剤洗浄段階に続いて、ｐＨ６．０でのそれぞれ１５０秒および２００秒の会合時間および解離時間の間、２００ｎＭ ｒＦｃＲｎを使用して、ＦｃＲｎ結合動態を得た。Ｏｃｔｅｔスクリーニング過程の全段階にて、振盪速度１０００ＲＰＭの条件で、温度を３０℃とした。ｒＦｃＲｎ結合動態プロファイルを、ＦｃＲｎ会合フェーズの開始に対して補正し、Ｏｃｔｅｔ ７．１解析ソフトウェアを使用して１：１結合モデルにモデル化した。
ＦｃＲｎ結合動態
複数のｐＨ状態（ｐＨ６．０、７．４、８．０および９．０）下でのＦｃＲｎ結合動態を、ビオチンＣＡＰｔｕｒｅキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）使用してＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して測定した（例えば、Ａｂｄｉｃｈｅら、ＭＡｂｓ（２０１５）７：３３１～３４３頁；Ｋａｒｌｓｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２０１６）５０２：５３～６３頁を参照されたい）。ＣＡＰｔｕｒｅ試薬を＞１５００ＲＵの表面密度までＣＡＰチップに捕捉し、これに続いてＦｃＲｎを３０μＬ ｍｉｎ－１で可変捕捉時間で捕捉して、より高いｐＨでの結合親和性の減少について説明した。各ｐＨのＦｃＲｎ濃度および捕捉時間は次のとおりである：ｐＨ６．０：０．１μｇ ｍＬ－１ＦｃＲｎを２４秒間、ｐＨ７．４および８．０：１μｇ ｍＬ－１を６０秒間、ｐＨ９．０：１０μｇ ｍＬ－１を６０秒間。全てのｐＨ状態のランニング緩衝剤は、ｐＨをｐＨ６．０、７．４、８．０および９．０に適宜調整した、２０ｍＭ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓプロパン；１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０とした。３倍希釈で１０００ｎＭから始まる各抗体バリアントの濃度系列を確立して、結合親和性の広範囲をカバーした。動態的測定を、それぞれ１８０秒および３６０秒の会合時間および解離時間の間で行い、これに続いて、各サイクルで塩酸グアニジンおよび水酸化ナトリウムを用いてＣＡＰ表面の再生を行った。ｐＨ７．４、８．０および９．０での定常状態のＲＵ測定値を、３連で１０００ｎＭにて得た。各ｐＨでのセンサーグラムを、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ＴＭ評価ソフトウェアを使用して１：１または２価の結合モデルにフィットさせた。二価モデルによって、高いＦｃＲｎ捕捉レベルおよびＩｇＧあたり２つのＦｃＲｎ結合部位で観察されるアビディティ効果について説明する。例えば、Ｓｕｚｕｋｉら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１０）１８４：１９６８～７６頁を参照されたい。各濃度系列を個別にフィットさせて、平均の結合速度および解離速度および結合親和性を得た。残留結合を、解離フェーズの開始前の定常状態の結合応答から決定し、平均化した。
ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィー
一実験では、ＦｃＲｎアフィニティーカラムを、Ｓｃｈｌｏｔｈａｕｅｒら、ｍＡｂｓ（２０１３）５：５７６～８６頁から応用したプロトコルから作製した。Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＨＰ ＨｉＴｒａｐ（登録商標）カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）１ｍＬを、５カラムの体積に対して１ｍＬ ｍｉｎ－１で結合緩衝剤（２０ｍＭリン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）ｐＨ７．４、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ；Ｓｉｇｍａ））を用いて平衡化し、これに続いてビオチン化ｃｙｎｏＦｃＲｎ ４ミリグラムを注入した。カラムを結合緩衝剤で洗浄し、使用するまで４℃で保存した。
ＦｃＲｎアフィニティーカラムを、５カラムの体積に対して低ｐＨ緩衝剤（２０ｍＭ ２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ；Ｓｉｇｍａ）ｐＨ５．５；１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を用いて平衡化した後、各抗体３００μｇを注入した。抗体溶液のｐＨを、低ｐＨ緩衝剤を用いてｐＨ５．５に調整した。低ｐＨ緩衝剤で１０カラムの体積の洗浄に続いて、１ｍＬ画分で１ｍＬ ｍｉｎ－１にて３０カラムの体積にわたって、高ｐＨ緩衝剤（２０ｍＭ １，３－ビス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン（ビストリスプロパン；Ｓｉｇｍａ）ｐＨ９．５；１５０ｍＭ ＮａＣｌ）との直線状ｐＨ勾配によって、ＵＶ２８０をモニタリングしながら、抗体を溶出した。ＦｃＲｎアフィニティーカラムを、その後のラン用に１０カラムの体積の低ｐＨ緩衝剤でまたは貯蔵用に結合緩衝剤で、再平衡化した。全てのバリアントについて３連で行った。
各バリアントについてのＦｃＲｎアフィニティーカラム溶出プロファイルを、Ｓｉｇｍａｐｌｏｔ １１（Ｓｙｓｔａｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）で等式１
Figure 2022542884000002
 を使用して単一ガウシアン分布にモデル化し、ＵＶ２８０極大での溶出体積を決定した：
式中、ｘ０はＵＶ２８０ピーク極大での溶出体積であり、ｙ０はベースラインＵＶ２８０吸光度であり、ａおよびｂは分布の半値全幅に関連する。各画分のｐＨをＣｏｒｎｉｎｇ Ｐｉｎｎａｃｌｅ ５４０ ｐＨメーターにより測定し、線形回帰を使用して溶出体積に対して関連付けた。
別の実験では、ＦｃＲｎアフィニティーカラムを、ストレプトアビジンＨＰ ＨｉＴｒａｐ（登録商標）カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）１ｍＬでビオチン化ｈＦｃＲｎを用いてＳｃｈｌｏｔｈａｕｅｒら、前出から応用した。このカラムに、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＫＴＡ）で、低ｐＨ緩衝剤（２０ｍＭ ２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ；Ｓｉｇｍａ）ｐＨ５．５；１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中の各抗体３００μｇを注入した。０．５ｍＬ ｍｉｎ－１にて３０カラムの体積にわたって、低および高ｐＨ緩衝剤（２０ｍＭ １，３－ビス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン（ビストリスプロパン；Ｓｉｇｍａ）ｐＨ９．５；１５０ｍＭ ＮａＣｌ）にて作製した直線状ｐＨ勾配によって、吸光度およびｐＨをモニタリングしながら、抗体を溶出した。カラムを、その後のラン用に低ｐＨ緩衝剤で再平衡化した。全てのバリアントについて３連で行った。ＦｃＲｎアフィニティーカラム溶出プロファイルを、Ｓｉｇｍａｐｌｏｔ １１（Ｓｙｓｔａｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）で単一ガウシアン分布にフィットさせて、ＵＶ２８０極大での溶出体積およびｐＨを決定した。
示差走査蛍光定量法
示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）実験を、反応物２０μＬでＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ９６（商標）リアルタイム系サーマルサイクラー（ＢｉｏＲａｄ）で行った。抗体試料およびＳｙｐｒｏ（商標）Ｏｒａｎｇｅ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））の５０００×ストックを、ＰＢＳ ｐＨ７．４で、それぞれ、０．４ｍｇ ｍＬ－１および１０×に希釈した。各抗体０．２ｍｇ ｍＬ－１および５×Ｓｙｐｒｏ（商標）Ｏｒａｎｇｅ色素の最終濃度へと、抗体およびＳｙｐｒｏ（商標）Ｏｒａｎｇｅを９６ウェルＰＣＲプレート中で１：１の比で混合し、接着性ｍｉｃｒｏｓｅａｌ（登録商標）（ＢｉｏＲａｄ）で密封した。全ての抗体バリアントについて３連で行った。サーマルサイクラープログラムを、２０℃での２分の平衡化段階、これに続いて、最終温度１００℃への一定の温度傾斜率０．５℃／５秒からなるものとした。各ウェルの蛍光測定値を、Ｓｙｐｒｏ（商標）ｏｒａｎｇｅ蛍光に適したＦＡＭ励起波長（４８５ｎｍ）およびＲＯＸ発光（６２５ｎｍ）検出器を使用して獲得した（例えば、Ｂｉｇｇａｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（２０１２）５３：２３１～３８頁を参照されたい）。ＤＳＦ蛍光強度プロファイルおよび一次導関数をＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ（商標）Ｍａｎａｇｅｒからエクスポートし、Ｓｉｇｍａｐｌｏｔ １１で解析した。Ｔｍは蛍光強度プロファイルにおける第１の遷移の中間点として定義した。
ＦｃγＲＩＩＩａ結合動態
結合動態および親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して測定した（Ｚｈｏｕら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．（２００８）９９：６５２～６５頁）。抗ＨＰＣ４抗体（Ｒｏｃｈｅ）を、アセテートｐＨ４．５中５０μｇ ｍＬ－１で、最終密度＞２０，０００ＲＵへと、アミン化学を用いて１０μｌ ｍｉｎ－１で６００秒間、ＣＭ５センサーチップの表面にカップリングさせた。ＦｃγＲＩＩＩａ結合動態実験用のランニング緩衝剤は、ｐＨ７．４での０．０５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ－２０（ＨＢＳ－Ｐ＋、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および２ｍＭ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２、Ｆｌｕｋａ）を含むＨＥＰＥＳ緩衝食塩水とした。各動態トレースを、５μｌ ｍｉｎ－１にて３０秒間のＨＰＣ４タグ化ＦｃγＲＩＩＩａ－Ｖ１５８ １．２５μｇ ｍＬ－１の捕捉で開始した。各バリアント３００ｎＭでの会合動態および解離動態を、５μｌ ｍｉｎ－１にて、各段階につき１２０～１８０秒間、各バリアントについて測定した。動態測定が完了次第、ＣＭ５チップを、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（Ａｍｂｉｏｎ（登録商標））を補充したＨＢＳ－Ｐ＋緩衝剤で再生した。次の動態測定の前に、ＣａＣｌ２を含むＨＢＳ－Ｐ＋で１２０秒間、ＣＭ５チップを洗浄した。
一実験では、ＦｃγＲＩＩＩａ動態実験を、ｐＨ７．４でのＦｃＲｎ結合について記載と同様の様式で解析した。ＷＴ、ベンチマーク、リード単一およびリード組合せの各バリアントについて、１０００ｎＭからの一連の３倍系列希釈で動態を得て、ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合親和性を決定した。各濃度および重複での定常状態ＲＵを決定し、抗体濃度の関数としてプロットし、等式２
Figure 2022542884000003
 に示されるように定常状態モデルに対してフィットさせた：
式中、オフセットは０ｎＭ抗体でのベースラインＲＵであり、Ｒｍａｘは高抗体濃度でのプラトーＲＵであり、［抗体］は抗体の濃度であり、ＫＤ，ａｐｐはバリアントとＦｃγＲＩＩＩａとの間の相互作用の見かけの結合親和性である。
別の実験では、ＦｃγＲＩＩＩａ動態実験を、平均定常状態結合応答を使用して、ｐＨ７．４でのＦｃＲｎ結合について記載と同様の様式で解析した。全てのバリアントについて、３００ｎＭ抗体の定常状態ＲＵを３連で決定し平均化した。ＷＴと比べた応答変化の変化倍率（応答の変化倍率）を、各骨格におけるバリアント間の比較のために決定した。
等電点電気泳動
リードバリアントの等電点（ｐＩ）を、Ｍａｕｒｉｃｅ Ｃ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ）でのキャピラリー電気泳動を使用して決定した。各試料２００μＬに、０．３５％メチルセルロース（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ）、４％ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ３－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、１０ｍＭアルギニン（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ）、抗体０．２ｍｇ ｍＬ－１ならびに４．０５および９．９９ｐＩマーカー（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ）を含有せしめた。試料を１５００Ｖで１分間キャピラリーへとロードし、これに続いて３０００Ｖでの６分間の分離フェーズを行い、トリプトファン蛍光を使用してモニタリングした。各バリアントについてｐＩを、Ｍａｕｒｉｃｅ Ｃソフトウェアを使用して決定し、主要な種についての蛍光極大でのｐＨと定義した。
均一ブリッジングリウマチ因子（ＲＦ）ＥＬＩＳＡ
抗体をビオチン化し、製造者の取扱説明書に従って、ＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－ＢｉｏｔｉｎおよびＭｉｘ－ｎ－Ｓｔａｉｎ（商標）ジゴキシゲニン抗体標識キット（Ｂｉｏｔｉｕｍ）を使用してジゴキシゲニン標識した。ビオチン化およびジゴキシゲニン標識化抗体４μｇ ｍＬ－１を含有するストック溶液を各バリアントについて製造し、１：１の比で３００Ｕ／ｍＬ ＲＦ（Ａｂｃａｍ）と混合した。室温で２０時間インキュベートした後に、各抗体－ＲＦ混合物１００μＬをＳｔｒｅｐｔａｗｅｌｌ（商標）プレート（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に添加し、室温で２時間インキュベートした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ ｐＨ７．４で３回プレートを洗浄し、ＨＲＰコンジュゲート抗ジゴキシゲニン二次抗体（Ａｂｃａｍ）の１：２０００希釈１００μＬを各ウェルに添加した。室温での２時間インキュベーション後に、ウェルを洗浄し、ＴＭＢ基質（Ａｂｃａｍ）１００μＬで室温にて１５分間処理した。停止溶液（Ａｂｃａｍ）１００μＬを用いて反応を停止させ、吸光度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）プレートリーダーで４５０ｎｍにて測定した。抗体－ＲＦ混合物を含有しないウェルによってブランク差引きが与えられ、実験については３回繰り返した。スチューデントｔ検定を使用してＰ値を決定した。
条件培地における飽和点突然変異のＯｃｔｅｔスクリーニング
ＦｃＲｎは、ＭＨＣクラス－Ｉ様α－ドメインおよびβ２－マイクログロブリン（β２－ｍ）サブユニットのヘテロダイマー（図１Ａ）であり、Ｆｃ受容体の大多数に共通している。ＦｃＲｎは、他のＦｃγＲとは明らかに異なる抗体Ｆｃ重鎖上の領域を認識する（例えば、Ｏｇａｎｅｓｙａｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（２０１４）２８９：７８１２～２４頁；およびＳｈｉｅｌｄｓら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（２００１）２７６：６５９１～６０４頁を参照されたい）。
ＷＴ抗体よりも遅いＦｃＲｎ解離速度を有するバリアントを特定するために、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）ベースのアッセイを、条件培地中の抗体バリアントをハイスループット様式でスクリーニングするために設計した（図２Ａ）。本アッセイは、ＷＴ抗体と比較して、ｐＨ６．０でＦｃＲｎに対する親和性を増強する（ＡＡＡ、ＬＳおよびＹＴＥ）かまたは減少する（Ｈ４３５Ａ、Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ｑ）いくつかのベンチマークバリアントを使用して開発した。ＮｉＮＴＡバイオセンサーは、条件培地を模倣するようにｐＨ７．４で、ｈｉｓタグ化抗原を捕捉し、続いて各抗体バリアントを捕捉する（図２Ａ）。ヒトＩｇＧ１からおよそ２５分の１へと低下した解離速度を有し、ヒトＦｃＲｎ（ｈＦｃＲｎ）よりもＯｃｔｅｔ研究にいっそう適合するラットＦｃＲｎ（ｒＦｃＲｎ）へのｐＨ６．０での結合動態を、バリアントのそれぞれについて測定した（図２Ｂ）。Ｈ４３５Ａ（図２Ｂ、長い一点鎖線）およびＨ３１０Ａ／Ｈ４３５Ｑ（図２Ｂ、長い二点鎖線）の各バリアントは、ＦｃＲｎ結合動態をほとんどまたは全く示さない（例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓら、前出；Ｍｅｄｅｓａｎら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７）１５８：２２１１～７頁；およびＲａｇｈａｖａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９５）３４（４５）：１４６４９～５７頁も参照されたい）。ＡＡＡ（図２Ｂ、短い破線）、ＬＳ（図２Ｂ、短い一点鎖線）およびＹＴＥ（図２Ｂ、長い破線）の各バリアントは全て、ＷＴ（図２Ｂ、実線）と比較してより遅い解離動態を提示し、２分の１～７．３分の１の間のＦｃＲｎ解離速度へと低下した。このことにより、Ｏｃｔｅｔスクリーニングは、ｒＦｃＲｎ解離動態が撹乱されたバリアント同士間を区別するのに適していることが実証された。
ＩｇＧ１抗体、ｍＡｂ１は、減少したＦｃＲｎ解離速度を有する突然変異体をスクリーニングする飽和突然変異誘発ライブラリを作製するためのモデル系として機能した。ｍＡｂ１のＦｃ領域中の１１の位置を、これらがＦｃＲｎ界面に近いことまたは直接的寄与することに基づいて選択した（図１Ａおよび１Ｂ）（例えば、Ｏｇａｎｅｓｙａｎら、前出；およびＳｈｉｅｌｄｓら、前出を参照されたい）。これらの位置での全ての点突然変異を、部位特異的突然変異誘発を使用して構築し、発現のためにＥｘｐｉ２９３細胞にトランスフェクトした。条件培地スクリーニングを、上記のように飽和ライブラリ突然変異体について行った。バリアントのサブセットについての正規化されたＦｃＲｎ結合Ｏｃｔｅｔセンサーグラム（長い破線）を、野生型（図２Ｃ、太い長い破線）およびモック陰性対照（図２Ｃ、点線）とともに、図２Ｃに示す。モックは観察可能なＦｃＲｎ結合の欠如を示した。動態プロファイルにおいてシグナル変化がほとんどまたは全く観察されなかったことから、いくつかのバリアントはｒＦｃＲｎの結合を明らかに崩壊させていた（図２Ｃ、長い破線、点線（モック）の下に位置する）。改善されたＦｃＲｎ解離速度を有するバリアントについてのカットオフを、ＷＴ抗体の平均よりも低い３つの標準偏差と定義した。図２Ｃに示した突然変異のサブセットにおいて、２つ（図２Ｃ、実線）が野生型抗体（図２Ｃ、太い長い破線）と比較して有意に減少した解離速度を有したが、一方、残りのバリアントは、同様の（図２Ｃ、短い一点鎖線）またはより速い（図２Ｃ、点線（モック）の上の長い破線）ｒＦｃＲｎ解離速度を有した。
単一点突然変異の全てについてのｒＦｃＲｎ解離速度を図２Ｄおよび図１４に位置および突然変異ごとに示す。図１４において、データは野生型と比較したｒＦｃＲｎ解離速度の変化倍率に応じて４つのカテゴリーのうちの１つに仕分けられており、野生型種は黒四角で表示されている。
図１４では、飽和ライブラリの１１個の位置での可能な全ての置換についてｒＦｃＲｎ解離速度の変化倍率を、ＷＴ抗体の平均に対して正規化し、カラーコード化した。全ての突然変異体は４つのカテゴリーのうちの１つに属する：結合ほとんどなしから全くなし（暗灰色）、より速いｒＦｃＲｎ解離速度（灰色）、ＷＴ様ｒＦｃＲｎ解離速度（水平縞）およびより遅いｒＦｃＲｎ解離速度（グリッド）。複数のバリアントが、ＷＴ抗体よりも遅いｒＦｃＲｎ解離速度を保有した（グリッド）。
図１４において暗灰色に着色された突然変異体は、モック（図２Ｃ、点線）と同様の様式でｒＦｃＲｎへの結合をほとんどまたは全く示さず、Ｍ２５２、Ｉ２５３およびＳ２５４ループに局在した。Ｉ２５３での唯一の突然変異は、メチオニンおよびバリンであり、両方ともｒＦｃＲｎ解離速度を有意に向上させたが、これは、さらにＦｃＲｎ相互作用に対するＩ２５３の重要性を支持する。別の１２０個のバリアント（図２Ｄおよび図１４、明灰色の四角）は、ＣＨ２およびＣＨ３のドメインそれぞれに位置してｒＦｃＲｎとの相互作用を概５０％不安定化した。２５個の突然変異体はＷＴ様解離速度を有したが（図２Ｄおよび図１４、白四角）、この場合、１１個の位置のうちの８つは、少なくとも１つのＷＴ様突然変異を保有した（図１４、白四角）。以下の突然変異は、野生型と比較して有意に減少したｒＦｃＲｎ解離速度を有した（図２Ｄおよび図１４、黒四角）：Ｍ２５２Ｙ、Ｔ２５６Ｄ／Ｅ、Ｋ２８８Ｄ／Ｎ、Ｔ３０７Ａ／Ｅ／Ｆ／Ｍ／Ｑ／Ｗ、Ｅ３８０Ｃ、Ｎ４３４Ｆ／Ｐ／ＹおよびＹ４３６Ｈ／Ｎ／Ｗ。Ｍ２５２Ｙ、Ｎ４３４ＦおよびＮ４３４Ｙの各突然変異は、ＷＴ抗体から２分の１未満へと低下した解離速度を保有した（図２Ｄ）。これらの突然変異を発現させ、さらなるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＦｃＲｎ動態特性評価向けにプロテインＡクロマトグラフィーを用いて精製した。
ｐＨ６．０でのＢｉａｃｏｒｅ（商標）ＦｃＲｎ結合動態
ＡＡＡ、ＬＳおよびＹＴＥの各バリアントは、ｐＨ６．０でのヒトＦｃＲｎおよびラットＦｃＲｎの両方に対するＢｉａｃｏｒｅ（商標）を使用したＦｃＲｎ結合動態測定において陽性対照として機能した。ＦｃＲｎへの濃度依存性結合を、野生型、ベンチマーク（図３）およびリード（図４Ａおよび４Ｂ）を含めて、全てのバリアントについて観察し、ヒトＦｃＲｎおよびラットＦｃＲｎの単回注入の結合プロファイルをそれぞれ図５Ａおよび５Ｂに示す。野生型抗体は、ヒトＦｃＲｎおよびラットＦｃＲｎについてそれぞれ２３８０±４７０ｎＭおよび２０７±４３ｎＭ親和性の結合親和性を有した（表１）。
Figure 2022542884000004
表１に示す全てのデータは、各列の上部に示す実験技法を使用して得た。
精製されたタンパク質を使用したＯｃｔｅｔによるｒＦｃＲｎ解離速度を、条件培地におけるスクリーニングから得られた速度定数と比較して測定した。溶出ｐＨを、３連（ｎ＝３）でＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーにより決定し、ＤＳＦにより３連（ｎ＝３）で熱安定性を探索した。ヒトＦｃＲｎおよびラットＦｃＲｎに対するＦｃＲｎ結合動態を、２連で（ｎ＝２）一連の抗体濃度を用いてＢｉａｃｏｒｅ（商標）から得、個別にフィットさせた。ｐＨ７．４でのヒトＦｃＲｎおよびラットＦｃＲｎとの各バリアントの定常状態結合応答（ＲＵ）を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）を使用して３連（ｎ＝３）で１０００ｎＭ抗体を用いて測定した。各測定の単位は以下のとおりである：Ｏｃｔｅｔ ｐＨ６．０ ｒＦｃＲｎ解離速度（×１０－３ｓ－１）；溶出ｐＨ（無単位）；ＤＳＦ Ｔｍ（℃）；Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）ｐＨ６．０ ｈＦｃＲｎ結合速度（×１０４Ｍ－１ｓ－１）、解離速度（×１０－１ｓ－１）およびＫＤ，ａｐｐ（×１０９Ｍ）；Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）ｐＨ６．０ ｒＦｃＲｎ結合速度（×１０４Ｍ－１ｓ－１）、解離速度（×１０－３ｓ－１）およびＫＤ，ａｐｐ（×１０９Ｍ）；ならびにＢｉａｃｏｒｅ（商標）ｐＨ７．４定常状態結合応答（ＲＵ）。
図５Ｂにおいて、ＡＡＡ（点線）、ＬＳ（二点鎖線）およびＹＴＥ（一点鎖線）の各バリアントは、ＷＴと比較して１．６倍と１０．４倍との間で増強された結合親和性を有した。ＬＳは、ｈＦｃＲｎに対して最も緊密な親和性を有したが、一方、ｒＦｃＲｎはＹＴＥに対してより緊密な親和性を有したことから、最も緊密なＦｃＲｎ親和性を有するベンチマークバリアントのアイデンティテイは種特異的であった（表２Ａ）。
Figure 2022542884000005
ヒトＦｃＲｎとラットＦｃＲｎの両方についてリードバリアントの圧倒的多数（図５Ａおよび５Ｂ、種々の濃淡の実線）は、ＷＴまたはベンチマークのバリアントよりも有意に遅い結合速度を有した（２分の１未満へと低下）（表１）。Ｎ４３４ＦおよびＮ４３４Ｙの突然変異が、ＦｃＲｎに関し両種に対して増強された結合速度を提示した唯一のバリアントであった。いかなる理論にも束縛されないが、ｈＦｃＲｎとのより遅い会合動態の結果として、リードバリアントのみかけの結合親和性は、ｒＦｃＲｎと違ってＷＴよりも全体として弱かった（図５Ｃおよび５Ｄ、表１）。ｒＦｃＲｎの親和性はＹＴＥよりも弱かった（図５Ｄ、左下に向かう斜め縞、表２Ａ）。
いかなる理論にも束縛されないが、これらの結果によって、単一の突然変異はＬＳおよびＹＴＥのバリアントを上回るように親和性を増強するのには十分でなかった、ということが示された。ＦｃＲｎ解離速度の順位付け（ｈＦｃＲｎに対するバリアントの弱い結合親和性による）によって、ヒトＦｃＲｎとラットＦｃＲｎの両方に対する減少した解離速度を有するサブセット：Ｍ２５２Ｙ、Ｎ４３４Ｆ／Ｐ／Ｙ、Ｔ２５６Ｄ／ＥおよびＴ３０７Ａ／Ｅ／Ｆ／Ｑ／Ｗが、明らかとなった（表２Ａ）。これらのバリアントは、ベンチマークバリアントを上回るＦｃ領域のＦｃＲｎ結合能をさらに改善する組合せの点でさらに興味深い。
リードバリアントのｉｎ ｖｉｔｒｏ特性評価パラメーターを表２Ｂに示す。
Figure 2022542884000006
表２Ｂにおいて、全てのデータは、各列の上部の実験技法を使用して得た。ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィー、ＤＳＦおよびＦｃγＲＩＩＩａ結合を３連（ｎ＝３）で行った。ヒトＦｃＲｎおよびラットＦｃＲｎに対するＦｃＲｎ結合動態を４連で得、個別にフィットさせた。単位：ＤＳＦ Ｔｍ（℃）；ＦｃγＲＩＩＩａ結合（ＷＴと比べた変化倍率）、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）ｐＨ６．０ ｈＦｃＲｎ結合速度（×１０４Ｍ－１ｓ－１）、解離速度（×１０－１ｓ－１）およびＫＤ，ａｐｐ（×１０９Ｍ）；Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）ｐＨ６．０ ｒＦｃＲｎＫＤ，ａｐｐ（×１０９Ｍ）；Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）ｐＨ７．４ ｈＦｃＲｎおよびｒＦｃＲｎ定常状態ＲＵ（ＲＵ）。
組合せバリアントはＦｃＲｎ結合解離速度をさらに低下させる
Ｔ３０７およびＮ４３４のように、複数のリード突然変異が単一の位置に位置していたが（図１４、黒四角）、ここで、より遅いＦｃＲｎ解離動態を示したそれぞれ６つおよび３つの突然変異を特定した。これらの位置にてｈＦｃＲｎに対する最も遅いＦｃＲｎ解離速度を有する突然変異のみを組合せバリアントの作製に使用した。この場合、Ｔ３０７Ｑ、Ｔ３０７Ｗ、Ｎ４３４ＦおよびＮ４３４ＹをＭ２５２Ｙ、Ｔ２５６ＤおよびＴ２５６Ｅと混合して、混合プライマーＰＣＲおよび部位特異的突然変異誘発を使用して、二重、三重および四重バリアントを得た。合計で、組合せライブラリは、７つのリード単一、１８個のリード二重、２０個のリード三重、８つのリード四重の各バリアントおよびＷＴ抗体を含む５４個のバリアントからなるとした。これらのバリアントの命名は以下のとおりである：野生型バックグラウンドは、Ｍ２５２、Ｔ２５６、Ｔ３０７およびＮ４３４を含有し、ＭＴＴＮと新しい名称を付ける。したがって、三重バリアントＹＴＱＹは、Ｍ２５２Ｙ、Ｔ３０７ＱおよびＮ４３４Ｙの各突然変異を含有するが、一方、２５６位にＷＴスレオニンを維持する。
単一突然変異においては、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）を使用したｐＨ６．０でのＦｃＲｎ結合動態を使用して、どの組合せバリアントが改善された親和性を有するか決定した。単一（長い二点鎖線）、二重（長い一点鎖線）、三重（長い破線）および四重（短い破線）それぞれの代表的ＦｃＲｎ結合動態トレースを、ＷＴ（点線）およびＦｃＲｎ（ｈＦｃＲｎ：ＬＳ（長い二点鎖線）；ｒＦｃＲｎ：ＹＴＥ（実線））のそれぞれの種に対して最も緊密な親和性を有するベンチマークバリアントと比較して、図６Ａおよび６Ｂに示す。ｈＦｃＲｎの結合速度および解離速度（図６Ｃ）によって、２つの単一、１５個の二重、１８個の三重および８つの四重の各バリアントが、ＬＳバリアント（図６Ｃ、斑点）よりも増強された結合親和性を有することが明らかとなった。同様に、１つの三重バリアントを除いて全ての組合せが、ＹＴＥ（図６Ｄ、左下に向かう斜め縞）よりもｒＦｃＲｎに対して緊密な親和性を有した。ｈＦｃＲｎの場合、さらなるＦｃＲｎ増強突然変異が結合親和性をさらに向上させた（図６Ｃ）。ｈＦｃＲｎへの最も緊密な親和性を有する５つの組合せは、全て四重バリアント（図６Ｃ、格子柄）であり、結合親和性は野生型よりも概５００倍大きかった。最も高い親和性を有するバリアントは二重バリアントであったけれども（図６Ｄ、水平縞）、同様の現象はｒＦｃＲｎとは起こらなかった（図６Ｄ）。三重（図６Ｄ、垂直縞）および四重（図６Ｄ、格子柄）のバリアントは典型的には、解離速度のわずかな低下（２分の１未満へと低下）しか示さなかったが、低下した会合速度も提示した（図６Ｄ）。いかなる理論にも束縛されないが、これらの結果によって、ｒＦｃＲｎで到達したがｈＦｃＲｎでは到達しなかった（図６Ｂ）、ＦｃＲｎ見かけの結合親和性に関した下限がおそらく存在することが（概０．５ｎＭ）、示唆される。合計で、４０個超の組合せバリアントが、ベンチマークバリアントよりも緊密な親和性を有したが、さらなる特性評価が、ｉｎ ｖｉｖｏ研究向けに好都合な特性を有する組合せを選択するために必要である。
組合せバリアントは生理的ｐＨで有意な結合を保持する
ｐＨ６．０での有意に改善されたＦｃＲｎ親和性の結果として、ｐＨ依存性に及ぼす効果を、ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーおよびｐＨ７．４でのＢｉａｃｏｒｅ（商標）定常状態測定を使用して調べた。ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーでは、直線状ｐＨ勾配を用いて、突然変異によるｐＨ依存性の撹乱を直接測定した。Ｈ４３５ＡおよびＨ３１０Ａ／Ｈ４３５Ｑ、弱いＦｃＲｎ結合を有するバリアントは、ｐＨにかかわらずカラムに結合しなかった（図８Ａ）。ＷＴは生理的ｐＨ付近（ｐＨ７．３７±０．０５）で溶出したが、一方、ＡＡＡ、ＬＳおよびＹＴＥにはより高いｐＨが必要であった（表２Ｂ）。全ての組合せバリアントおよび７つのリード単一バリアントは、アフィニティーカラムから溶出するのにＷＴよりも高いｐＨが必要であった（図８Ａおよび８Ｃ）。Ｎ４３４Ｆ／ＹバリアントはＬＳよりも大きいｐＨで溶出したが（表２Ｂ）、このことにより、科学的理論に束縛されることを意図しないが、これらバリアントによって単独および組合せの両方でｐＨ依存性が崩壊したことが、示される。代表的なクロマトグラムでは、突然変異の数とともにより高い溶出ｐＨへ明らかにシフトすることが示された（図９Ａおよび９Ｂ）。溶出ｐＨとｈＦｃＲｎ解離速度との間の強い相関（Ｒ２＝０．９４）（図９Ｃ）が示すところは、ｐＨ６．０でのより遅いＦｃＲｎ解離速度が、ＦｃＲｎバリアントについて溶出ｐＨが高まったことの直接の原因であったことである。
生理的状態下での残留結合活性を測定するために、ＦｃＲｎ結合動態実験をＢｉａｃｏｒｅ（商標）を使用してｐＨ７．４で行った。一部のバリアントは、不確かな動態を示し、このｐＨで結合をほとんどまたは全く示さなかったことから、定常状態ＲＵを残留ＦｃＲｎ結合親和性の尺度として使用した。単一（長い二点鎖線）、二重（長い一点鎖線）、三重（長い破線）および四重（短い破線）の各バリアントの代表的動態トレースをＬＳ（図７Ａ、実線）およびＹＴＥ（図７Ｂ、実線）と比較して、図７Ａおよび７Ｂに示す。これら２つのバリアントは、それぞれ、ｐＨ７．４でヒトＦｃＲｎおよびラットＦｃＲｎに対して最も大きい残留結合を提示した。リード単一バリアントの大多数は、ＷＴ（４．３±１．０ＲＵ）と比較してわずかに上昇したＦｃＲｎ結合を有したが、Ｎ４３４Ｆ／Ｙ突然変異を除いて、ＡＡＡ（１３．１±１．７ＲＵ）、ＬＳ（１８．５±２．６ＲＵ）およびＹＴＥ（１３．１±１．６ＲＵ）よりも小さいＦｃＲｎ結合を有した（表２Ａおよび２Ｂ）。組合せバリアントはまた、Ｎ４３４Ｆ／Ｙよりもさらに大きな程度にｐＨ７．４での両種のＦｃＲｎへの有意な残留結合を保有した（図７Ａおよび７Ｂ）。いかなる理論にも束縛されないが、ｉｎ ｖｉｖｏ研究用に理想的な候補とは、低ｐＨで向上したＦｃＲｎ結合を有するバリアント（例えば、ＡＡＡ、ＬＳおよびＹＴＥの各バリアント）であるが、ＷＴと同じ様式で、上昇したｐＨで低レベルの結合を維持するものである。図７Ｃおよび７Ｄに示すプロットにおいて、これらの組合せは、それぞれヒトＦｃＲｎおよびラットＦｃＲｎに対する各ｐＨでのＬＳおよびＹＴＥのバリアントの親和性により指定された左下象限を占めるであろう。
ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィー
組合せバリアントは、ｐＨ６．０での見かけの結合親和性とｐＨ７．４での定常状態ＲＵとの間に中程度の正の相関（ｈＦｃＲｎ：Ｒ２＝０．６９、ｒＦｃＲｎ：Ｒ２＝０．７１）を示した（図７Ｃおよび７Ｄ）。いかなる理論にも束縛されないが、これらの結果が示すところは、ｐＨ６．０での有意により高い親和性が典型的には、ｐＨ７．４でのより高い残留ＦｃＲｎ結合につながるということである。これらのバリアントは、高ＦｃＲｎ親和性のＡｂｄｅｇ突然変異と同様に、血流中のＦｃＲｎに依然として結合したままであることおよび短い血清半減期を有することかつ／またはそれらのクリアランスを促進することができた（例えば、Ｓｗｉｅｒｃｚら、Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ．（２０１４）５５：１２０４～７頁；およびＶａｃｃａｒｏら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００５）２３：１２８３～８頁を参照されたい）。ＩｇＧ－ＦｃＲｎ相互作用はｐＨ依存性であり、低ｐＨ（＜ｐＨ６．５）でしか起こらないので、飽和突然変異は、疎水性由来のまたは電荷由来の寄与による相互作用を強化することができ、これらの相互作用は、重要なヒスチジン残基の脱プロトン化（図１Ｂ、表示のとおり）および生理学的ｐＨでこの相互作用の減退を妨害することができる。結果として、ＦｃＲｎ結合相互作用はしたがってその環境のｐＨでは低感受性となる。
ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーでは、直線状ｐＨ勾配を用いて、ＦｃＲｎ相互作用のｐＨ依存性の撹乱を直接測定した（例えば、Ｓｃｈｌｏｔｈａｕｅｒら、前出を参照されたい）。ＡＡＡ、ＬＳ、ＹＴＥ、Ｈ４３５ＡおよびＨ３１０Ａ／Ｈ４３５Ｑの各バリアントを用いたＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーによって、Ｈ４３５Ａ（図８Ａ、明灰色の実線）およびＨ３１０Ａ／Ｈ４３５Ｑ（図８Ａ、ＡＱ、暗灰色の実線）はｐＨ５．５でもＦｃＲｎに結合せず、素通り画分に溶出することが明らかとなった。野生型抗体は、生理的ｐＨ付近（ｐＨ７．３７±０．０５）で溶出したが、一方、Ｏｃｔｅｔ（図２Ｂ～Ｄ）およびＢｉａｃｏｒｅ（商標）（図３）によって野生型よりも遅い解離速度およびこれらよりも緊密なＦｃＲｎ結合親和性を有するＡＡＡ、ＬＳおよびＹＴＥには、カラムから解離するのにかなりより高いｐＨ（ＡＡＡ：７．９４±０．０６；ＬＳ：８．２９±０．０３；ＹＴＥ：８．１４±０．０３）が必要であった。溶出プロファイルによって、組合せライブラリのバリアントの全てにとって、アフィニティーカラムから溶出するのに野生型よりも高いｐＨが必要であることが明らかとなった。単一（長い二点鎖線）、二重（長い一点鎖線）、三重（長い破線）および四重（短い破線）の各バリアントについて平均溶出ｐＨでの代表的なクロマトグラムを図９Ａに示す。７つのリード単一バリアント（Ｍ２５２Ｙ、Ｔ２５６Ｄ、Ｔ２５６Ｅ、Ｔ３０７Ｑ、Ｔ３０７Ｗ、Ｎ４３４ＦおよびＮ４３４Ｙ）には、ＷＴと比較してカラムから解離するのにより高いｐＨが必要であったが（図１０Ａ、表３）、一方、ｈＦｃＲｎに対して野生型様動態を有するもの（Ｋ２８８Ｄ／Ｎ、Ｙ４３６Ｈ／Ｈ／Ｗ）全てが野生型と同様のｐＨで溶出した。
Figure 2022542884000007
全てのデータは、各列の上部の実験技法を使用して得た。溶出ｐＨを、３連（ｎ＝３）でＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーにより決定し、ＤＳＦにより３連（ｎ＝３）で熱安定性を探索した。ヒトＦｃＲｎおよびラットＦｃＲｎに対するＦｃＲｎ結合動態を、一連の抗体濃度を用いてＢｉａｃｏｒｅ（商標）から得（ｎ＝４）、個別にフィットさせた。各測定についての単位は以下のとおりである：溶出ｐＨ（無単位）；ＤＳＦ Ｔｍ（℃）；Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）ｐＨ６．０ ｈＦｃＲｎ 結合速度（×１０４Ｍ－１ｓ－１）、解離速度（×１０－１ｓ－１）およびＫＤ，ａｐｐ（×１０９Ｍ）；Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）ｐＨ６．０ ｒＦｃＲｎ 結合速度（×１０４Ｍ－１ｓ－１）、解離速度（×１０－３ｓ－１）およびＫＤ，ａｐｐ（×１０９Ｍ）。
Ｎ４３４Ｆ／Ｙバリアントは両方とも、ＬＳバリアントよりも高いｐＨで溶出し（Ｎ４３４Ｆ：８．３０±０．０５；Ｎ４３４Ｙ：８．４６±０．０２）、ｐＨ７．４でかなりのＦｃＲｎ結合を示した（表４）。これらの結果は、それらのバリアントだけがｐＨ依存性を崩壊させることができることを示す。概して、平均溶出ｐＨは、ＦｃＲｎ結合増強の突然変異の数が増加するにつれて上昇した（図９Ｂ）。強い相関（Ｒ２＝０．９４）が、ｈＦｃＲｎ解離速度と比較して溶出ｐＨで出現した（図９Ｃ）；いかなる理論にも束縛されないが、このことによって、相互作用のｐＨ依存性の崩壊が、ｐＨ６．０で組合せライブラリについて観察されたより遅いＦｃＲｎ解離速度の直接の原因であること、が示される。
熱安定性
抗体を含めて、低い熱力学的安定性を有する大部分のタンパク質は、ミスフォールディングおよび凝集の増加した傾向を有し、それらの活性、効能および新規治療剤としての可能性を限定するかまたは阻むと思われる。各バリアントの熱安定性をＤＳＦを使用して決定し、報告された融解温度（Ｔｍ）をＳｙｐｒｏ（商標）Ｏｒａｎｇｅ蛍光強度プロファイルにおける第１遷移の中間点として定義した。６９．０±０．２℃のＴｍを有するＷＴと比較して、ＬＳバリアントはＷＴ様であり（６８．５±０．３℃）、ＡＡＡおよびＹＴＥは、およそ８℃（ＡＡＡ：６１．３±０．６℃；ＹＴＥ：６１．２±０．３℃）だけ熱的に不安定化している（図８Ｂ、９Ｂ、および１０Ｂ；ならびに表２Ｂ、３および４）。６９．０±０．２℃のＴｍを有するＷＴおよびＬＳと比較して、ＡＡＡおよびＹＴＥのバリアントは、ＤＳＦによりおよそ８℃だけより低い熱安定性を有した。
Figure 2022542884000008
野生型骨格へと導入された突然変異は下線が引かれている。全てのデータは各列の上部に示す実験技法を使用して得た。溶出ｐＨおよびＴｍを３連（ｎ＝３）で決定した。ｐＨ６．０でのヒトＦｃＲｎおよびラットＦｃＲｎに対するＦｃＲｎ結合動態をＢｉａｃｏｒｅ（商標）から得（ｎ＝４）、個別にフィットさせた。ｐＨ７．４での定常状態ＦｃＲｎ結合応答を、３連で単一抗体濃度でＢｉａｃｏｒｅ（商標）を使用して測定した。ＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）を使用して２連で一連の抗体濃度から決定した。各測定についての単位は以下のとおりである：溶出ｐＨ（無単位）；ＤＳＦ Ｔｍ（℃）；Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）ｐＨ６．０ ｈＦｃＲｎ結合速度（×１０５Ｍ－１ｓ－１）、解離速度（×１０－２ｓ－１）およびＫＤ，ａｐｐ（×１０９Ｍ）；Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）ｐＨ６．０ ｒＦｃＲｎ 結合速度（×１０５Ｍ－１ｓ－１）、解離速度（×１０－３ｓ－１）およびＫＤ，ａｐｐ（×１０９Ｍ）；Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）ｐＨ７．４定常状態結合応答（ＲＵ）およびＦｃγＲＩＩＩａ ＫＤ，ａｐｐ（×１０９Ｍ）。
１８個のリード飽和バリアントのうち１２個（Ｅ３８０Ｃ、Ｍ２５２Ｙ、Ｔ２５６Ｄ、Ｔ２５６Ｅ、Ｋ２８８Ｎ、Ｋ２８８Ｄ、Ｎ４３４Ｐ、Ｔ３０７Ａ、Ｔ３０７Ｗ、Ｙ４３６Ｈ、Ｙ４３６Ｎ、Ｙ４３６Ｗの各バリアント）は、野生型と比較して減少したＴｍを有しており、Ｔ３０７突然変異のうちのいくつか（Ｔ３０７Ｅ／Ｆ／Ｍ／Ｑ）は、わずかな安定化を示した（表４）。組合せに使用した７つの単一バリアントのうちのいずれも（図１０Ｂおよび表４）、ＹＴＥと比べて有意に安定化していなかった（図８Ｂおよび表５）。二重（図９Ｄ、水平縞）、三重（図９Ｄ、垂直縞）および四重（図９Ｄ、格子柄）の各突然変異をＦｃドメインに添加することにより、単一突然変異（図９Ｄ、白丸）と比較して全体的な熱安定性のさらなる低下がもたらされた。複数のバリアントが、ＡＡＡまたはＹＴＥよりも低いＴｍを呈したが（６１．２±０．℃）、この場合、これらのバリアントの＞６０％はＴ３０７Ｗを含有した。四重バリアント（図９Ｄ、格子柄）は、融解温度に関し区別することが可能な二峰性分布を示したが、この場合、Ｔ３０７Ｑを含有する組合せは、Ｔ３０７Ｗを保有するものよりも概６℃のいっそうの熱安定性を有した（図９Ｄ）。
ＦｃバリアントはＦｃγＲＩＩＩａとの結合相互作用を変更する
ＦｃＲｎとの相互作用のほかにも、Ｆｃ領域ヒンジおよびＣＨ２ドメインは、ＦｃγＲＩＩＩａを含めて、他のＦｃ受容体との相互作用を担う。組合せ飽和ライブラリの構築向けに使用された７つの単一バリアントのうちの５つはＣＨ２ドメイン内に位置するので、それらの受容体と相互作用する能力は、相互作用界面から遠いそのバリアント位置にもかかわらず、野生型と比べて損なわれる可能性がある。ｐＨ７．４でＦｃＲｎ結合と同様の様式でＦｃγＲＩＩＩａ結合を測定するためにＢｉａｃｏｒｅ（商標）を使用することにより、ＹＴＥ（図１１Ａ、暗灰色）バリアントが野生型（図１１Ａ、黒）と比較して結合応答において概５０％の減少を示したことが明らかとなった。いかなる理論にも束縛されないが、Ｍ２５２Ｙバリアントだけがこの受容体に対する有意に低下した親和性を有するので、ＹＴＥについてＦｃγＲＩＩＩａ結合の減少は、Ｍ２５２Ｙ突然変異の結果である（図１１Ｂ、一番下の白丸）。その他の単一突然変異は、こういった親和性の減少を共有しておらず（図１１Ｂ、白丸）、Ｎ４３４Ｆ／Ｙバリアントだけが結合を１６～４０％増強した。このような効果はそれらの対応する組合せの全てではないが大部分においても保持された。例えば、Ｍ２５２Ｙ含有組合せは、ＦｃγＲＩＩＩａ結合において１７％と７２％との間の減少を有した（表５）。
Figure 2022542884000009
１つのバリアントＭＤＱＦ（図１１Ｂ、三重バリアントカテゴリー中で最高）は、ＦｃγＲＩＩＩａ結合において劇的な１４０％向上を示した。したがって、組合せ飽和ライブラリによって、特定のエフェクター機能をもつ治療用抗体を目的に合わせるのに活用すること可能な広範囲のＦｃ受容体機能を有するバリアントが、提供された。
図１１Ｃに、ＷＴおよびＹＴＥのバリアントと比較した、７つのリード単一バリアントのＦｃγＲＩＩＩａ結合応答の箱ひげ図を示す。
７つのリード組合せはＦｃＲｎ相互作用のｐＨ依存性のバランスを保つ
いかなる理論にも束縛されないが、ｉｎ ｖｉｖｏでのさらなる研究用の候補バリアントは、図７Ｃおよび７Ｄに示すプロットの左下象限を占めた。７つのバリアントはｈＦｃＲｎについてこれらの基準を満たし、５つの二重組合せおよび２つの三重組合せ（ＭＤＱＮ、ＭＤＷＮ、ＹＤＴＮ、ＹＥＴＮ、ＹＴＷＮ、ＹＤＱＮおよびＹＥＱＮ）を含んでおり、Ｎ４３４位に突然変異を含有しなかった（表３）。これらの組合せのそれぞれは、ＡＡＡ（ｐＨ７．９４±０．０６）とＬＳ（ｐＨ８．２９±０．０３）との間でＦｃＲｎアフィニティーカラムから溶出しており、ＹＤＱＮは最も高いｐＨ８．５１±０．１４で溶出したが（図１２Ａ、表５）、このことが示すところは、ｐＨ７．４でのｐＨ依存性におけるわずかに過ぎない撹乱およびより高い残留結合である（表２Ａ）。バリアントのうちの１つ（ＭＤＱＮ）は野生型様熱安定性を保有しており、ＹＴＥバリアントと比較して６つは同様のまたは減少したＴｍを有した（図１２Ｂ、表４）。ＦｃγＲＩＩＩａ結合アッセイでは、５つの組合せバリアントがＹＴＥと同様の減少を示した（表４）。単一突然変異を用いたさらなる調査により、Ｍ２５２Ｙは、ＦｃγＲＩＩＩａ結合に有意に影響を及ぼした、いかなる理論にも束縛されないが、この効果がその突然変異を有する組合せにおいても保持されるということが、明らかになった。残りの６つの単一突然変異はＷＴ様であったか、またはこの受容体に対してわずかに改善された結合を保有した。
３つの組合せバリアントを、それらのＦｃＲｎ結合特性、熱安定性およびＦｃγＲＩＩＩａ結合に基づいたさらなる研究向けに選択した。ＤＱ（Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｑ）、ＤＷ（Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｗ）およびＹＤ（Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ）それぞれによって、ＬＳバリアント（図１２Ｅ）のような最適なＦｃＲｎ結合特性がもたらされた（表２Ｂ）。各バリアントは、様々な機能性をもたらした多様な熱安定性およびＦｃγＲＩＩＩａ結合特性を可能とする（図１２Ｆおよび１２Ｇ、表２Ｂ）。図１２Ｈは均一ブリッジングＲＦのプロットである。
それぞれ、ＬＳバリアント（図１３Ａ、濃い長い破線）およびＹＴＥバリアント（図１３Ｂ、濃い長い破線）と比較した、ｐＨ６．０でのヒトＦｃＲｎおよびラットＦｃＲｎの両方についての見かけの結合親和性の増強は、結合速度と解離速度との間の折り合いであった（図１３Ａおよび１３Ｂ、表４）。典型的には、より速い解離速度を有する組合せはより速い結合速度も保有したが、その逆も当てはまった。こういった観察は、ヒトＦｃＲｎとラットＦｃＲｎとの間で維持された（表４）。さらに、これらのバリアントの全ては、ｐＨ７．４でｈＦｃＲｎに対してＬＳバリアント（図１３Ｃ、濃い長い破線）よりも低い定常状態応答を有した。これらの結果は、５つのＭ２５２Ｙ含有バリアント、ＹＤＴＮ、ＹＥＴＮ、ＹＴＷＮ、ＹＤＱＮおよびＹＥＱＮがＹＴＥと比較してｐＨ７．４で向上したＦｃＲｎ結合を有したのであるが（表５）、ｒＦｃＲｎとは一致してはいなかった。ＭＤＱＮおよびＭＤＷＮのバリアントがヒトＦｃＲｎとラットＦｃＲｎとの間で交差反応性であった唯一の組合せであった。さらに、これら２つのバリアントは、Ｍ２５２Ｙ含有バリアントと同様の程度までにはＦｃγＲＩＩＩａとの相互作用を撹乱しなかった（図１２Ｃおよび１２Ｄならびに表５；ＭＤＱＮ：６００±４ｎＭ；ＭＤＷＮ：５１２±３０ｎＭ；ＷＴ：４６７±９９ｎＭ）。したがって、鍵となるＦｃＲｎ相互作用位置での飽和および組合せの突然変異誘発によって、相互作用のｐＨ依存性のバランスを保ち、Ｆｃ受容体との機能性を維持し、ｉｎ ｖｉｖｏでＦｃＲｎ機能性を増強することができ、治療用抗体の血清半減期を延長することができたリードバリアントの特定に至った。
リード組合せバリアントのリウマチ因子結合特徴
これらの突然変異は抗体表面電荷および免疫原性を変更することができるので、リードバリアントの等電点およびＲＦ結合について調べた。より酸性の抗体が抗体薬物動態を延長すると考えられた。ＷＴおよびＬＳの各対照と比較して、３つのリード全てによって、Ｔ２５６Ｄ置換の結果としてｐＩがおよそ０．２ｐＨ単位減少するという結果となった。ＦｃＲｎ増強突然変異は、オーバーラップしている相互作用界面に起因して、リウマチ因子（ＲＦ）のような宿主抗体への結合を同時に変更することができる。均一ブリッジングＥＬＩＳＡを、リードバリアントについてＲＦ結合の変化を測定するために応用した。興味深いことに、ＬＳおよびＹＴＥが、ＷＴと比較してＲＦ結合において完全に相反するシフトを示した（図１２Ｈ）。ＬＳはＲＦ結合を有意に向上させたが、一方、ＹＴＥは有意な低下（ｐ＜０．００１）を示した。ＹＤ（ｐ＜０．００１）およびＤＷ（ｐ＜０．０１）もまたＲＦ結合を有意に減少したが、一方、ＤＱはＷＴと同様の応答を生じた。いかなる理論にも束縛されないが、これらの結果は、ＤＱ、ＤＷおよびＹＤがＬＳと比較して免疫原性の利点をもたらすことができることを示す。ＹＤ、ＤＷおよびＤＱの各バリアントは、ベンチマークＹＴＥおよびＬＳのバリアントに優る改善されたＦｃＲｎ結合特性と併せて活用することができる様々な鍵となる抗体特徴を表す。
リード組合せバリアントは他の抗体に移すことが可能である
図１５Ａに図示のように、ＣＭ５センサーチップを使用して新しい結合アッセイを開発した。結合アッセイは、ビオチン化ＦｃＲｎを捕捉するためにＣＭ５センサーチップ上にストレプトアビジンを約３０ＲＵまで固定化する段階を含み、これは必要に応じて補充される。抗体結合動態をｐＨ６．０および７．４で、ならびに再生向けにｐＨ８．５で測定した。図１５Ｂおよび１５Ｃに、新しい結合アッセイを使用した、それぞれＦｃＲｎの直接固定化およびビオチン化ＦｃＲｎのストレプトアビジン捕捉を示す。
ｐＨ６．０でのＭＡｂ２のＦｃＲｎ結合：マウスＦｃＲｎでは、リードｍＡｂ２バリアントは、ＬＳバリアント（破線）および野生型（黒）よりも遅い解離速度を実証する（図１６Ａ）。ヒトＦｃＲｎの場合、リードバリアントは全てより速い結合速度を有するが、ＬＳ（破線）と同様の解離速度を有する（図１６Ｂ）。
ｐＨ７．４でのＭＡｂ２のＦｃＲｎ結合：全てのリードバリアントは、ＬＳ（破線）と比較してｐＨ７．４でヒトＦｃＲｎ結合の減少を示した（図１７Ａ）。ｍＡｂ１ｍＡｂ１’バックグラウンドと同様に、ＤＷ（ＭＤＷＮ）およびＤＱ（ＭＤＱＮ）の各バリアントもまた、ｐＨ７．４でマウス（ラット）ＦｃＲｎに対してより低い残留結合を示した（図１７Ｂ）。
リードバリアントは、ＬＳと比較してｐＨ６．０でより高い結合親和性およびｐＨ７．４でより低い残留結合を維持した（図１８）。重要なことには、バリアントは、ＦｃＲｎ結合に及ぼす影響がほとんどない状態で、異なるＩｇＧ１バックグラウンド間で移すことが可能であることが見出された。図１９に示すように、ＬＳはバックグラウンドにかかわらず同様の溶出ｐＨを有した。ｍＡｂ２バックグラウンドにおけるＷＴ、ＤＱおよびＤＷは、おそらくｍＡｂ２バックグラウンドにおけるｐＨ６．０でのより緊密な結合の結果として、ｍＡｂ１バックグラウンドにおけるよりも高い溶出ｐＨを示した。
ＭＡｂ２バックグラウンドバリアントは全て、図２０に示すように、わずかに向上した熱安定性を示した。
図２１に示すように、ＭＡｂ１バックグラウンドと同様に、ＹＤ（ＹＤＴＮ）は、ＦｃγＲＩＩＩａの結合応答（左）および親和性（右）において減少を示した。ＤＱ（明灰色）およびＤＷ（暗灰色）は、ＭＡｂ２バックグラウンドにおいて、ＷＴ（黒）と同様のＦｃγＲＩＩＩａ結合特性を示した。ＬＳに対するＦｃγＲＩＩＩａ結合に及ぼす効果は、ＭＡｂ１とｍＡｂ２との間で一致した。
したがって、ｍＡｂ２バックグラウンドにおけるリードバリアントは、ＭＡｂ１バックグラウンドにおける同じリードバリアントと比較して、ＦｃＲｎ結合、ｐＨ依存性、熱安定性、またはＦｃγＲＩＩＩａ結合に有意に影響を及ぼさない。
一実施形態では、ＤＱ（Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｑ）、ＤＷ（Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｗ）およびＹＤ（Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ）の各バリアントを、さらなるＩｇＧ１抗体および組み換えＦｃ断片に組み込んだ：ｍＡｂ２は、ｍＡｂ１と異なる抗原を認識し、ｍＡｂ３はＦｃ断片である。いずれの場合にも、ｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合動態（図２２）は、溶出ｐＨ、熱安定性およびＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性に加えて、高度に類似していた（表２Ｂ、および表６）。いかなる理論にも束縛されないが、これらの結果が示すところは、ＤＱ、ＤＷおよびＹＤの各バリアントによって、これらの改善されたＦｃＲｎ結合特性が、Ｆｃドメインで構成されるタンパク質に付与されたことである。
Figure 2022542884000010
リードバリアントはｉｎ ｖｉｖｏ血漿抗体排出半減期を延長した
ＤＱ、ＤＷおよびＹＤの各バリアントの薬物動態（ＰＫ）を、ＷＴ対照およびＬＳ対照と比較して、カニクイザルおよびｈＦｃＲｎトランスジェニックマウス（系統Ｔｇ３２）（例えば、Ａｖｅｒｙら、Ｍａｂｓ（２０１６）８：１０６４～７８頁を参照されたい）を用いて、抗体循環半減期に及ぼすそれらの効果ついて調べた。カニクイザルＦｃＲｎを用いたＦｃＲｎ結合研究によって、ｈＦｃＲｎに対する同様の結合親和性が明らかとなった（図２３Ａ～２３Ｂ；表６）。各動物にＷＴ、ＬＳ、ＤＱ、ＤＷまたはＹＤの各バリアントを静脈注射し、抗体濃度を質量分析アプローチにより定量化して、サル（図２４Ａ）およびｈＦｃＲｎトランスジェニックマウス（図２４Ｂ）におけるクリアランス速度および血清半減期を決定した。クリアランス速度および血清半減期を、時間の関数として抗体濃度の非コンパートメントモデルから得た。３つ全てのリードバリアントおよびＬＳは、サルとマウスの両方においてＷＴと比較して有意に減少したクリアランス速度を示した（ｐ＜０．００１）。ＷＴ抗体の血漿半減期は、それぞれサルおよびマウスにおいて９．９±０．５日および１１．７日であった。さらに、ＬＳベンチマークおよび特定されたバリアントは、両種において野生型と比較して排出半減期の有意な延長を呈した（それぞれサルおよびマウスにおいて２．５倍および１．７倍の延長）（表７）。ＤＱ、ＤＷおよびＹＤは、ＬＳベンチマークと比較して半減期の同様の延長を示した（表７）。飽和突然変異誘発により本明細書において特定されたＤＱ、ＤＷおよびＹＤの各突然変異によって、マウスと非ヒト霊長類動物のモデルの両方において、それらのＷＴカウンターパートよりも有意に延長された血漿半減期が実証された。
Figure 2022542884000011
表７では、クリアランス速度および血漿半減期を、ｍＡｂ２を使用して決定した。各クリアランス速度および半減期は、カニクイザルについてｎ＝３の平均とし、ｎ＝６ ｈＦｃＲｎトランスジェニックマウスのプールから単一の評価とした。ＷＴに対する倍率およびＬＳに対する倍率とは、それぞれＷＴおよびＬＳと比較した血清半減期の相対的改善を示す。＊ＡＤＡ形成のためにｎ＝２、＊＊投与に関し部分的皮下経路のためにｎ＝２
ｐＨ６．０およびｐＨ７．４で増強ＦｃＲｎ結合を有する組合せバリアント
実施例２に記載のＯｃｔｅｔスクリーニング（ＢＬＩベースのスクリーニング）に基づいて、種々の単一、二重、三重、および四重の各バリアントを生成し、ｐＨ６．０およびｐＨ７．４でのＦｃＲｎへのそれらの結合について評価した（表８；置換残基に下線が引かれている）。
Figure 2022542884000012
Figure 2022542884000013
表８に、種々の単一、二重、三重、および四重の突然変異体、ならびにベンチマークバリアント（ＡＡＡ、ＬＳ、ＹＴＥ）についてのｐＨ６．０でのＦｃＲｎに対する結合親和性およびｐＨ７．４でのＦｃＲｎに対する定常状態結合を示す。
これらの値を図２５にプロットした。図２５に、ｐＨ６．０での結合親和性およびｐＨ７．４でのＲＵの比較を示す。示されるように、ベンチマークバリアントＬＳは、試験されたベンチマークバリアント（ＡＡＡ、ＬＳ、ＹＴＥ）のうちｐＨ６．０で最も緊密な結合親和性およびｐＨ７．４で最大の残留結合を有した。
図２５に示されるいくつかの組合せバリアントが、ｐＨ６．０およびｐＨ７．４で増強ＦｃＲｎ結合親和性を呈したことを決定した。組合せバリアントのいずれがｐＨ６．０およびｐＨ７．４の両方で、ＭＳＴ－ＨＮバリアント（本明細書で「ＹＴＥＫＦベンチマーク」と呼ばれ、Ｍｅｔ２５２、Ｓｅｒ２５４、Ｔｈｒ２５６、Ｈｉｓ４３３およびＡｓｎ４３４にＴｙｒ２５２、Ｔｈｒ２５４、Ｇｌｕ２５６、Ｌｙｓ４３３およびＰｈｅ４３４への突然変異を含有する）よりも緊密な結合を示したかどうか調べるために、以下の方法論を行った。ビオチン化ヒトＦｃＲｎおよびカニクイザルＦｃＲｎの捕捉を、Ｂｉｏｔｉｎ ＣＡＰｔｕｒｅ法（概略図については図２６を参照されたい）により行った。ｐＨ６．０の場合、１０００ｎＭからの濃度系列（５ｐｔｓ）を２連で行った。ｐＨ７．４および８．０の場合、１０００ｎＭからの濃度系列を２連で行ったことに加えて、単一の濃度（１０００ｎＭ）の注射を３連で行った。ｐＨ７．４および８．０の実験を、このｐＨでの結合を観察するために、ｐＨ６．０と比較して１０倍上昇したＦｃＲｎ捕捉レベルで行った。ｐＨ９．０の場合、単一濃度（１０００ｎＭ）の注射を３連で行った。ｐＨ９．０の実験は、このｐＨでの結合を観察するために、ｐＨ６．０と比較して１００倍上昇したＦｃＲｎ捕捉レベルで行った。ｐＨ６．０の場合、１０００ｎＭからの濃度系列（５ｐｔｓ）を２連で行った。ｐＨ７．４の場合、単一濃度（１０００ｎＭ）の注射を３連で行った（このｐＨでの結合を観察するために、各ＦｃＲｎの捕捉レベルを１０倍上昇させた）。会合：１８０秒；解離：３００秒。
図２７Ａ～Ｇに示された、野生型、ＹＴＥＫＦベンチマークおよび１０個のＦｃＲｎアンタゴニストの組合せバリアントの、ｐＨ６．０（ヒト：図２７Ａ、Ｃｙｎｏ：図２７Ｂ）、ｐＨ７．４（ヒト：図２７Ｃ、Ｃｙｎｏ：図２７Ｄ）およびｐＨ８．０（ヒト：図２７Ｅ、Ｃｙｎｏ：図２７Ｆ）でのヒトＦｃＲｎおよびｃｙｎｏ ＦｃＲｎの結合動態センサーグラム。調べた全てのバリアントは、ｐＨ６．０でのＷＴと比較して、ヒトとｃｙｎｏの両ＦｃＲｎに対して２桁より緊密な親和性およびより高いｐＨで観察可能な動態を示した。調べたバリアントは、ＦｃＲｎに対して親和性が増強していたことから、６つの四重（ＹＤＱＦ、ＹＤＱＹ、ＹＤＷＦ、ＹＤＷＹ、ＹＥＱＹ、ＹＥＷＹ）、３つの三重（ＭＤＷＹ、ＹＤＴＹ、ＹＴＷＹ）、１つの二重（ＹＹ）の各組合せとした（表８）。２つのさらなる四重バリアント、ＹＥＱＦおよびＹＥＷＦ（図２７Ｇ）は、ヒトＦｃＲｎおよびラットＦｃＲｎに対する親和性がより弱い結果として、選択しなかった。
図２８Ａ～Ｈおよび２９Ａ～Ｈに、ＹＴＥＫＦベンチマーク（点線）およびＷＴ（破線）と比較した、１０個のＦｃＲｎアンタゴニストバリアント（黒実線）のヒトＦｃＲｎおよびｃｙｎｏ ＦｃＲｎの結合動態を示す。図２８Ａおよび２９Ａに、バリアントの１０個のうちの８つは、ＹＴＥＫＦベンチマークよりも遅い解離速度を呈し、ｐＨ６．０でヒトＦｃＲｎおよびｃｙｎｏ ＦｃＲｎと同様の結合速度を示した（表９および１０）。全てのバリアントは、ｐＨ７．４およびｐＨ８．０で、ヒト（図２８Ｂおよび２８Ｄ）とｃｙｎｏ（図２９Ｃおよび２９Ｄ）の両ＦｃＲｎに対して有意なＦｃＲｎ結合を呈する（表９および１０）。５つの四重バリアント、ＹＤＱＦ、ＹＤＱＹ、ＹＤＷＹ、ＹＥＱＹおよびＹＥＷＹは、ＹＴＥＫＦベンチマークよりも高い結合シグナル、このｐＨでの親和性が増強した徴候を示した。それぞれヒトＦｃＲｎおよびｃｙｎｏのＦｃＲｎに対するｐＨ７．４（図２８Ｃおよび２９Ｃ）およびｐＨ８．０（図２８Ｅおよび２９Ｅ）でのセンサーグラムの正規化が示したところは、これら５つのバリアントがＹＴＥＫＦベンチマークよりもより遅い解離速度を持ってこれらのｐＨで有意なＦｃＲｎ結合を呈したことである。図２８Ｆおよび２９Ｆにおいて、ｐＨ９．０では、ヒトＦｃＲｎおよびｃｙｎｏ ＦｃＲｎ結合は、ＷＴおよびＹＴＥＫＦバリアントと同様のレベルへと減少した。図２８Ｇおよび２９Ｇは、ＹＴＥＫＦベンチマーク（白四角）およびＷＴ（黒、ｐＨ６．０のみ）と比較した、ヒトＦｃＲｎ（２８Ｇ）およびｃｙｎｏ ＦｃＲｎ（図２９Ｇ）の結合について３つのｐＨ（ｐＨ６．０、黒、ｐＨ７．４、暗灰色、ｐＨ８．０、灰色）での等親和性プロットを示す。ＹＴＥＫＦベンチマークおよびリード組合せのバリアントは、ｐＨ６．０でＷＴよりも２～３桁大きいヒトＦｃＲｎおよびｃｙｎｏ ＦｃＲｎの結合親和性を有する。ＦｃＲｎ結合親和性は、ｐＨが上昇するにつれて減少し、ベンチマークおよび組合せのバリアントは、調べた全てのｐＨで同様の親和性を提示した。３つのバリアント、ＹＤＱＹ、ＹＤＷＹおよびＹＥＷＹは、全てのｐＨでヒトＦｃＲｎおよびｃｙｎｏ ＦｃＲｎに対してより大きい結合を呈した（表９および１０）。ｐＨの関数としてのヒトＦｃＲｎ（図２８Ｈ）およびｃｙｎｏ ＦｃＲｎ（図２９Ｈ）に対するＦｃＲｎ結合親和性を比較すると、調べた全ての組合せバリアントについて、ｐＨ単位あたりＦｃＲｎ親和性が１０分の１に低下することが示された。
図３３および図３４に、選択された組合せバリアント、ＹＴＥＫＦベンチマークおよびＷＴの、ｐＨ６．０、７．４、８．０および９．０での、ヒトＦｃＲｎ（図３３）およびｃｙｎｏ ＦｃＲｎ（図３４）に対する、結合速度、解離速度、結合親和性および定常状態結合を示す。全てのバリアントがｐＨ６．０で測定可能な結合動態（結合速度、解離速度および結合親和性）を呈したのではあるが、このｐＨでは定常状態の結合レベルが報告されていない。ｐＨ９．０では全てのバリアントのＦｃＲｎ結合親和性が有意に減少していることから、このｐＨでの残留結合の尺度として定常状態の結合レベルのみを示す。挿入された突然変異は、ＷＴ配列（ＭＴＴＮ：Ｍ２５２／Ｔ２５６／Ｔ３０７／Ｎ４３４）中に太字体であり下線が引かれている。例えば：ＭＤＷＹは、Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｙ突然変異および２５２位のＷＴ残基を含有した。
ＦｃＲｎアンタゴニストバリアント、ＹＥＴＫベンチマークおよびＷＴの他の特性評価パラメーター、例えばＦｃγＲＩＩＩａへの結合、熱安定性および溶出ｐＨを決定し、表９に示した。挿入された突然変異は、ＷＴ配列（ＭＴＴＮ：Ｍ２５２／Ｔ２５６）中に太字体であり下線が引かれている。／Ｔ３０７／Ｎ４３４）。例えば：ＭＤＷＹは、Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｙ突然変異および２５２位のＷＴ残基を含有した。
Figure 2022542884000014
表９に示すように、全てのＦｃＲｎアンタゴニストは、ＷＴと比較して、熱的に不安定であり、ＦｃＲｎカラムから有意により高いｐＨで溶出した。ＦｃγＲＩＩＩａ結合は高度に不定であったが、この場合、ＷＴと比較して定常状態の結合は類似または減少していた。挿入された突然変異は、ＷＴ配列（ＭＴＴＮ：Ｍ２５２／Ｔ２５６／Ｔ３０７／Ｎ４３４）中に太字体で下線が引かれている。例えば：ＭＤＷＹは、Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｙ突然変異および２５２位のＷＴ残基を含有した。
ＦｃＲｎアンタゴニストはＩｇＧ分解を促進する
ＦｃＲｎアンタゴニストを、ＩｇＧの枯渇を決定するためにヒトＩｇＧと共投与した。実験を、ヒトＦｃＲｎホモ接合トランスジェニックマウス（Ｔｇ３２；例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ株＃０１４５６５、Ｍ０１遺伝子型）を使用して行ったが、これにより、ヒトの動態を予測するためのスケーリングが可能になる。
血清ＩｇＧレベルに及ぼすＦｃＲｎアンタゴニストの効果（例えば、図３３および３４に記載の四重バリアントのいずれか；例えば、ＹＤＱＹ、ＹＥＷＹ、ＹＥＱＹ、ＹＤＱＦおよびＹＤＷＹ）を、Ｔｇ３２マウスで決定した。Ｔｇ３２マウスに、静脈内ボーラス注射により非ターゲットヒトＩｇＧ１ ５ｍｇ／ｋｇを投与した。６時間後、マウスに、ＦｃＲｎアンタゴニストを含むヒトＩｇＧ１（例えば、図３３および３４に記載のような；例えば、ＹＤＱＹ、ＹＥＷＹ、ＹＥＱＹ、ＹＤＱＦおよびＹＤＷＹ）、またはＦｃＲｎアンタゴニストを含むターゲティング抗体（例えば、図３３および３４に記載のような；例えば、ＹＤＱＹ、ＹＥＷＹ、ＹＥＱＹ、ＹＤＱＦおよびＹＤＷＹ）、またはビヒクル対照のいずれかを投与した。動物に、表１０に記載の投薬スケジュールに従って投与した。
Figure 2022542884000015
血液試料を、表１１に記載の採血（ｂｌｅｅｄ）スケジュールに従って採取した。ＦｃＲｎアンタゴニストＩｇＧ１（ＦｃＲｎ－Ａ；ヒトＩｇＧ１および四重バリアントを含むターゲティング抗体）、非ターゲティングヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ）、内因性マウスＩｇＧ（ｍｕｒＩｇＧ）およびマウス血清アルブミン（ｍｕｒＡｌｂ）のそれぞれのレベルを、定量的ＬＣ－ＭＳ／ＭＳおよびＥＬＩＳＡ法によって決定した。
Figure 2022542884000016
ＦｃＲｎアンタゴニストはＩｇＧ分解を増強する
本実施例に、共投与されたＩｇＧのクリアランスが例示的なＦｃＲｎアンタゴニストによって増強されたことを示す研究について記載する。本研究では、ｍＡｂ１ ＹＤＱＹ（ｈＩｇＧ１バリアント）を野生型ｍＡｂ１とともにｈＦｃＲｎホモ接合トランスジェニックマウス（Ｔｇ３２；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 株＃０１４５６５、Ｍ０１遺伝子型）に投与したが、これにより、動態についてヒトへのスケーリング予測が可能になる。研究の一環として、ＰＫ測定値をＹＤＱＹ ｈＩｇＧ１とＷＴ ｈＩｇＧ１の両方について得た。アルブミンの測定により、ＦｃＲｎ阻害がアルブミン結合部位を干渉しないことがさらに確認されると思われる。
より具体的には、ＷＴ ｈＩｇＧ１（「トレーサーＩｇＧ」）５ｍｇ／ｋｇを、静脈内ボーラス注射によってＴｇ３２マウスに与えた。６時間後、ＹＴＥＫＦ ｈＩｇＧ１（ＡＢＤＥＧ（商標））またはＹＤＱＹ ｈＩｇＧ１のいずれかを、表１２に記載の投薬スケジュールに従ってマウスに投与した。全ての用量を１０ｍＬ／ｋｇの投薬体積で投与した。
Figure 2022542884000017
データが示すところは、ＹＤＱＹ ｈＩｇＧ１の３回の２０ｍｇ／ｋｇ用量（６、２４および４８時間目）がトレーサーＷＴ ｈＩｇＧ１濃度を有意に減少させ（群６；図３０Ａおよび３０Ｂ；表１３）、ＹＴＥＫＦ ｈＩｇＧ１よりも有意に改善された結果が得られたことである。ＹＤＱＹｈＩｇＧ１またはＹＴＥＫＦ ｈＩｇＧ１の単回用量によってトレーサーＷＴ ＩｇＧにおいて堅牢な低下が引き起こされたとは思えなかった（図３０Ｃ；表１３）。
Figure 2022542884000018
ＹＤＱＹ ｈＩｇＧ１のクリアランスは（約２．６ｍＬ／ｈ／ｋｇ）、Ｔｇ３２マウスにおいての典型的なＩｇＧ（およそ０．１～１．０ｍＬ／ｈ／ｋｇ）またはＹＴＥＫＦ ｈＩｇＧ（およそ１．１ｍＬ／ｈ／ｋｇ）よりも速かったが（図３１Ａおよび３１Ｂ）、研究期間を通して持続曝露であった。結果が示すところは、本ＦｃＲｎアンタゴニストは十分な期間宿主に留まって、ＷＴ ＩｇＧのＦｃＲｎ媒介性リサイクリングを減少させることおよびＷＴ ＩｇＧクリアランスを促進することができることである。

Claims (35)

  1. それを必要とする対象においてＩｇＧ媒介性障害を処置する方法であって、ＥＵナンバリングに従って、
    アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、
    アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）、
    アミノ酸位置３０７にトリプトファン（Ｗ）またはグルタミン（Ｑ）、および
    アミノ酸位置４３４にフェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）；
    の四つのアミノ酸残基の組合せを含む改変されたＦｃドメインを含む治療有効量のＦｃＲｎアンタゴニストを対象に投与することを含み、治療有効量のＦｃＲｎアンタゴニストは、対象における血清ＩｇＧのクリアランスを増加させる、前記方法。
  2. 改変されたＦｃドメインは：
    ａ）アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置３０７にグルタミン（Ｑ）、およびアミノ酸位置４３４にチロシン（Ｙ）；
    ｂ）アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６にグルタミン酸（Ｅ）、アミノ酸位置３０７にトリプトファン（Ｗ）、およびアミノ酸位置４３４にチロシン（Ｙ）；
    ｃ）アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６にグルタミン酸（Ｅ）、アミノ酸位置３０７にグルタミン（Ｑ）、およびアミノ酸位置４３４にチロシン（Ｙ）；
    ｄ）アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置３０７にグルタミン（Ｑ）、およびアミノ酸位置４３４にフェニルアラニン（Ｆ）；
    ｅ）アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置３０７にトリプトファン（Ｗ）、およびアミノ酸位置４３４にチロシン（Ｙ）；ならびに
    ｆ）アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置３０７にトリプトファン（Ｗ）、およびアミノ酸位置４３４にフェニルアラニン（Ｆ）
    からなる群から選択されるアミノ酸残基の組合せを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 改変されたＦｃドメインは、
    Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｙ、
    Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｙ、
    Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｙ、
    Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｆ、
    Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｙ、および
    Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｆ
    からなる群から選択される四重アミノ酸置換を含む、請求項１に記載の方法。
  4. それを必要とする対象においてＩｇＧ媒介性障害を処置する方法であって、Ｅｕナンバリングに従って、アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置３０７にグルタミン（Ｑ）、およびアミノ酸位置４３４にチロシン（Ｙ）を含む改変されたＦｃドメインを含む治療有効量のＦｃＲｎアンタゴニストを対象に投与することを含み、治療有効量のＦｃＲｎアンタゴニストは、対象における血清ＩｇＧのクリアランスを増加させる、前記方法。
  5. それを必要とする対象においてＩｇＧ媒介性障害を処置する方法であって、Ｅｕナンバリングに従って、アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６にグルタミン酸（Ｅ）、アミノ酸位置３０７にトリプトファン（Ｗ）、およびアミノ酸位置４３４にチロシン（Ｙ）を含む改変されたＦｃドメインを含む治療有効量のＦｃＲｎアンタゴニストを対象に投与することを含み、治療有効量のＦｃＲｎアンタゴニストは、対象における血清ＩｇＧのクリアランスを増加させる、前記方法。
  6. それを必要とする対象においてＩｇＧ媒介性障害を処置する方法であって、Ｅｕナンバリングに従って、アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６にグルタミン酸（Ｅ）、アミノ酸位置３０７にグルタミン（Ｑ）、およびアミノ酸位置４３４にチロシン（Ｙ）を含む改変されたＦｃドメインを含む治療有効量のＦｃＲｎアンタゴニストを対象に投与することを含み、治療有効量のＦｃＲｎアンタゴニストは、対象における血清ＩｇＧのクリアランスを増加させる、前記方法。
  7. それを必要とする対象においてＩｇＧ媒介性障害を処置する方法であって、Ｅｕナンバリングに従って、アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置３０７にグルタミン（Ｑ）、およびアミノ酸位置４３４にフェニルアラニン（Ｆ）を含む改変されたＦｃドメインを含む治療有効量のＦｃＲｎアンタゴニストを対象に投与することを含み、治療有効量のＦｃＲｎアンタゴニストは、対象における血清ＩｇＧのクリアランスを増加させる、前記方法。
  8. それを必要とする対象においてＩｇＧ媒介性障害を処置する方法であって、Ｅｕナンバリングに従って、アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置３０７にトリプトファン（Ｗ）、およびアミノ酸位置４３４にチロシン（Ｙ）を含む改変されたＦｃドメインを含む治療有効量のＦｃＲｎアンタゴニストを対象に投与することを含み、治療有効量のＦｃＲｎアンタゴニストは、対象における血清ＩｇＧのクリアランスを増加させる、前記方法。
  9. それを必要とする対象においてＩｇＧ媒介性障害を処置する方法であって、Ｅｕナンバリングに従って、
    ａ）アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）およびアミノ酸位置４３４にチロシン（Ｙ）、
    ｂ）アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置３０７にトリプトファン（Ｗ）、およびアミノ酸位置４３４にチロシン（Ｙ）、
    ｃ）アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）、およびアミノ酸位置４３４にチロシン（Ｙ）、または
    ｄ）アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置３０７にトリプトファン（Ｗ）、およびアミノ酸位置４３４にチロシン（Ｙ）、
    のアミノ酸残基の組合せを含む改変されたＦｃドメインを含む治療有効量のＦｃＲｎアンタゴニストを対象に投与することを含み、治療有効量のＦｃＲｎアンタゴニストは、対象における血清ＩｇＧのクリアランスを増加させる、前記方法。
  10. 改変されたＦｃドメインは、
    Ｍ２５２Ｙ／Ｎ４３４Ｙ、
    Ｍ２５２Ｙ／Ｔ３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｙ、
    Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｎ４３４Ｙ、および
    Ｔ２５６Ｄ／３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｙ
    からなる群から選択されるアミノ酸置換の組合せを含む、請求項９に記載の方法。
  11. ＩｇＧ媒介性障害は自己免疫疾患である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 自己免疫疾患は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症筋無力症、全身性硬化症（ＳＳｃ）／強皮症、関節リウマチ、乾癬性関節炎、骨関節炎、糖尿病、多発性硬化症、尋常性天疱瘡、アトピー性皮膚炎、乾癬、喘息、アレルギー、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、および化膿性汗腺炎からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
  13. それを必要とする対象において画像診断を増強する方法であって、Ｅｕナンバリングに従って、
    Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｙ、
    Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｙ、
    Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｙ、
    Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｆ、
    Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｙ、
    Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｆ、
    Ｍ２５２Ｙ／Ｎ４３４Ｙ、
    Ｍ２５２Ｙ／Ｔ３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｙ、
    Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｎ４３４Ｙ、および
    Ｔ２５６Ｄ／３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｙ、
    からなる群から選択されるアミノ酸置換の組合せを含む改変されたヒトＩｇＧ Ｆｃドメインを含む治療有効量のＦｃＲｎアンタゴニストを対象に投与することを含む前記方法。
  14. 放射性標識したＩｇＧ抗体を対象に投与することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
  15. ＦｃＲｎアンタゴニストは放射性標識した抗体の後に投与され、それにより放射性標識した抗体に対するコントラストを増強する、請求項１４に記載の方法。
  16. それを必要とする対象において、画像診断の間に放射性標識した抗体に対する非標的組織の曝露を減少させる方法であって、Ｅｕナンバリングに従って、
    Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｙ、
    Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｙ、
    Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｙ、
    Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｆ、
    Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｙ、
    Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｆ、
    Ｍ２５２Ｙ／Ｎ４３４Ｙ、
    Ｍ２５２Ｙ／Ｔ３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｙ、
    Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｎ４３４Ｙ、および
    Ｔ２５６Ｄ／３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｙ、
    からなる群から選択されるアミノ酸置換の組合せを含む改変されたＦｃドメインを含む有効量のＦｃＲｎアンタゴニストを対象に投与することを含む前記方法。
  17. 改変されたＦｃドメインは改変されたヒトＩｇＧ Ｆｃドメインである、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 改変されたＦｃドメインは改変されたヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである、請求項１７に記載の方法。
  19. 改変されたＦｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比較して、酸性ｐＨおよび非酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有し、場合により、酸性ｐＨは約６．０であり、場合により、非酸性ｐＨは約７．４である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 改変されたＦｃドメインは改変されたヒトＩｇＧ Ｆｃドメインであり、アミノ酸置換Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆを含む同じサブタイプのヒトＩｇＧ Ｆｃドメインと比較して酸性ｐＨおよび／または非酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有し、場合により、酸性ｐＨは約６．０であり、場合により、非酸性ｐＨは約７．４である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 改変されたＦｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比較して減少したＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. ＦｃＲｎアンタゴニストは、アミノ酸置換を有する、アミノ酸配列の配列番号１、２、３、もしくは４またはそのＦｃＲｎ－結合部分を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. ＦｃＲｎアンタゴニストは、ＦｃＲｎではない一つまたはそれ以上の標的に結合する結合ポリペプチドである、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. ＦｃＲｎアンタゴニストは、抗体であるまたはその抗原結合フラグメントを含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
  25. ＦｃＲｎアンタゴニストはモノクローナル抗体である、請求項２４に記載の方法。
  26. 抗体はキメラ、ヒト化、またはヒト抗体である、請求項２５に記載の方法。
  27. ＦｃＲｎアンタゴニストはＦｃ融合タンパク質である、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
  28. Ｆｃ融合タンパク質はイムノアドヘシンである、請求項２７に記載の方法。
  29. ＦｃＲｎアンタゴニストはＦｃフラグメントである、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
  30. 請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法において、それを必要とする対象を処置するための医薬の製造のための、ＦｃＲｎアンタゴニストの使用。
  31. 請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法において、それを必要とする対象を処置するための使用のためのＦｃＲｎアンタゴニスト。
  32. 請求項１～１０のいずれか一項に記載のアミノ酸置換の組合せを含む改変されたＦｃドメインからなる、単離されたポリペプチド。
  33. 改変されたＦｃドメインは改変されたヒトＩｇＧ Ｆｃドメインである、請求項３２に記載の単離されたポリペプチド。
  34. 改変されたＦｃドメインは、記載された置換を有する、アミノ酸配列の配列番号１、２、３、もしくは４またはそのＦｃＲｎ－結合部分を含む、請求項３３に記載の単離されたポリペプチド。
  35. 請求項３２～３４のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
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