RU2415865C2 - СПОСОБЫ ОЧИСТКИ БЕЛКОВ, СОДЕРЖАЩИХ ОБЛАСТЬ Fc - Google Patents
СПОСОБЫ ОЧИСТКИ БЕЛКОВ, СОДЕРЖАЩИХ ОБЛАСТЬ Fc Download PDFInfo
- Publication number
- RU2415865C2 RU2415865C2 RU2007143162/10A RU2007143162A RU2415865C2 RU 2415865 C2 RU2415865 C2 RU 2415865C2 RU 2007143162/10 A RU2007143162/10 A RU 2007143162/10A RU 2007143162 A RU2007143162 A RU 2007143162A RU 2415865 C2 RU2415865 C2 RU 2415865C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- antibody
- varieties
- salt
- column
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
- C07K16/065—Purification, fragmentation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ очистки белка, имеющего область Fc от исходной жидкости путем адсорбции такого белка на веществе, связывающем Fc, таком как Белок А или Белок G, с последующей промывкой буферным раствором, содержащим соль бивалентного катиона, с целью удаления примесей и последующим выделением белка из вещества, связывающего область Fc. Способ позволяет эффективно очищать белок, имеющий область Fc от исходной жидкости, содержащей указанный белок и одну или более примесей, выбранной из группы, состоящей из: разновидностей прочтения интронов (IRT), разновидностей с пониженным содержанием дисульфидных связей (UDB) и разновидностей с низкой молекулярной массой (LMW). 40 з.п. ф-лы, 12 табл.
Description
РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке "СПОСОБЫ ОЧИСТКИ БЕЛКОВ, СОДЕРЖАЩИХ ОБЛАСТЬ Fc", поданной 17 июня 2005 г., имеющей серийный номер 60/691821. Содержание данной заявки полностью включено в настоящую заявку.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Антитела являются мощными компонентами иммунной системы многих животных и, в частности, человека. Недавние успехи технологии рекомбинантных ДНК позволяют получать антитела против практически любой мишени, например раковых клеток, бактерий и вирусов. Обычно антитело получают с применением линии клеток, измененной таким образом, чтобы она экспрессировала высокие уровни данного антитела. Затем измененную линию клеток выращивают в культуре, которая содержит сложную смесь сахаров, аминокислот и факторов роста, а также различные белки, включая, например, белки сыворотки. Однако отделение полных антител от побочных продуктов клеток и компонентов культуры до степени чистоты, достаточной для применения в исследованиях или в качестве лекарственных средств, представляет собой сложную задачу. Очистка молекул антител особенно важна, если антитела предполагается использовать в качестве лекарственных средств для введения людям.
Традиционные схемы (или линии) очистки антител часто включают этап хроматографии, использующий способность молекулы антитела предпочтительно связывать твердую фазу или удерживаться твердой фазой (или функционализированной твердой фазой) хроматографической колонки по сравнению со связыванием или удерживанием различных примесей. Были предложены или реализованы схемы очистки антител, в которых белки, содержащие область СН2/СН3, сначала связываются с Белком А, иммобилизованным на твердой фазе, после чего связанные с твердой фазой примеси удаляют путем промывки твердой фазы раствором гидрофобного растворителя-электролита, а за этим следует выделение белков, содержащих область СН2/СН3, из твердой фазы. Однако эти схемы имеют ограничение, связанное с тем, что условия, которые применяют для предпочтительного связывания белков, содержащих область СН2/СН3, способствуют также связыванию примесей (например, антител с неполными областями СН2/СН3). Для разработки лечебных средств для людей такие примеси очень нежелательны.
Соответственно, существует потребность в улучшении очистки белков или полипептидов, обладающих константными областями, в частности белков, обладающих областями Fc (например, антител), продуцируемых в культуре клеток.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В различных аспектах настоящего изобретения предложены способы очистки белка, имеющего область Fc, из исходной жидкости, содержащей этот белок и одну или более примесей. В способах согласно настоящему изобретению белок, имеющий область Fc (целевой белок), адсорбируют на веществе, связывающем Fc, а затем вещество, связывающее Fc, промывают буферным раствором, содержащим соли бивалентных катионов, с целью удаления одной или более примесей. Затем белок отделяют от вещества, связывающего Fc, в растворе для элюции. Способы согласно настоящему изобретению особенно полезны для удаления примесей, таких как разновидности прочтения интронов (intron read through variant species, IRT-варианты), разновидности с пониженным содержанием дисульфидных связей (under disulfide bonded species, UDB-варианты) и/или низкомолекулярные разновидности (low molecular weight variant species, LMW-варианты). Способы согласно настоящему изобретению также эффективны для удаления таких примесей, как белки (НСР) и ДНК клеток-хозяев.
Способы согласно настоящему изобретению включают один или более этапов выделения путем хроматографии и дополнительно могут включать один или более этапов фильтрации. Этапы выделения путем хроматографии могут быть непрерывными или с перерывами (т.е. периодический подход) либо могут представлять собой комбинацию обоих подходов. В различных вариантах реализации способы включают один или более этапов фильтрации, например, для удаления вирусов, концентрирования и буферизации раствора, содержащего целевой белок, а также для удаления загрязняющих примесей (контаминантов) микробиологического происхождения.
В различных вариантах реализации белок, содержащий область Fc, представляет собой антигенсвязывающий полипептид (например, антитело или его фрагмент) или иммуноадгезин (например, иммуноадгезин рецептора к ФНО). В различных вариантах реализации белок, содержащий область Fc, представляет собой содержащий антитело рекомбинантный продукт, антитело мыши, химерное антитело или гуманизированное антитело. В предпочтительном способе реализации белок, содержащий область Fc, представляет собой анти-IL-13 антитело человека (т.е. антитело против интерлейкина IL-13) или гуманизированное анти-IL-13 антитело. В качестве альтернативы в других вариантах реализации белок, содержащий область Fc, способен связывать антиген, такой как Аβ, CD3, CD52, VEGF (фактор роста эндотелии сосудов), EGFR (эпидермальный фактор роста), CD33, CD20, HER-2, ФНОα, CD25, RSV (респираторно-синцитиальный вирус), IgE, gp IIb/IIIa, CD11a или интегрин α4.
В различных вариантах реализации белок, содержащий область Fc, получают по технологии рекомбинантной ДНК. В различных вариантах реализации белок, содержащий область Fc, получают по технологии рекомбинантной ДНК в клетке яичника китайского хомячка (СНО).
В различных вариантах реализации одна или более примесей содержат одно или более из следующего: белок клетки-хозяина, ДНК клетки-хозяина, белок культуры клеток и нежелательные разновидности белков, имеющих область Fc, а также их смеси.
Например, в различных вариантах реализации настоящего изобретения нежелательные разновидности белка, содержащего область Fc, включают одну или более цепей антитела или фрагментов цепей, имеющих последовательность, представляющую собой другой вариант прочитывания интронов, одну или более цепей антитела или фрагментов цепей, имеющих неправильную дисульфидную связь, половинчатое антитело или его фрагмент, димер легкой цепи или его фрагмент, а также димер тяжелой цепи или его фрагмент.
В одном аспекте способами согласно настоящему изобретению белок, имеющий область Fc, очищают от исходной жидкости, содержащей этот белок и одну или более примесей, путем первоначального адсорбирования белка при помощи вещества, связывающего Fc, за которым следует промывка вещества, связывающего Fc, буферным раствором, содержащим соль бивалентного катиона, с целью удаления одной или более примесей и последующее выделение белка из вещества, связывающего Fc. В различных вариантах реализации этапы адсорбирования белка на веществе, связывающем Fc, и промывки вещества, связывающего Fc буферным раствором, содержащим соль бивалентного катиона, выполняют при температуре в диапазоне от приблизительно 2°С до приблизительно 24°С. В различных вариантах реализации этап выделения белка из вещества, связывающего Fc, включает элюирование белка буфером для элюции, имеющим рН в диапазоне от приблизительно 2,0 до приблизительно 6,5.
В различных вариантах реализации вещество, связывающее область Fc, содержит одно или более из следующих: Белок А и Белок G. В предпочтительном способе реализации вещество, связывающее Fc, иммобилизовано на твердой фазе. Твердая фаза может включать, например, одно или более из следующего: гранула, агарозная матрица, оксид кремния и их смеси.
Соли бивалентных катионов, присутствующие в буфере, который применяют для промывки вещества, связывающего Fc, могут включать, например, хаотропные соли. Соли бивалентных катионов, подходящие для приготовления буферного раствора для промывки, включают, без ограничения, хлорид магния, хлорид кальция, хлорид никеля и их смеси. В различных вариантах реализации соли бивалентных катионов, подходящие для приготовления промывочного буферного раствора, включают, без ограничения, такие соли, как тиоцианат (SCN-), перхлорат (ClO4 -), нитрат (NO3 -), хлорид и бромид бивалентных катионов II группы (например, магний, кальций, барий и т.д.), катионов бивалентных переходных металлов (например, медь, никель, марганец и т.д.), а также комбинации этих солей.
В различных вариантах реализации значение рН буферного раствора, содержащего соли бивалентных ионов, лежит в диапазоне от приблизительно 4 до приблизительно 8, от приблизительно 4,5 до приблизительно 7,5 или от приблизительно 6 до приблизительно 8. Охваченные значения и диапазоны и/или промежуточные значения или диапазоны в пределах диапазонов, описанных в настоящей заявке, также входят в объем настоящего изобретения. Например, значение рН соли бивалентного 7,1 до приблизительно 7,9, 7,2 до приблизительно 7,9, 7,3 до приблизительно 7,7, 7,4 до приблизительно 7,6, 4 до приблизительно 5, 5 до приблизительно 6, 6 до приблизительно 7 или от приблизительно 8 до приблизительно 9.
Более того, предполагается, что диапазоны, которые включают указанные значения в качестве верхнего или нижнего предела, входят в объем настоящего изобретения. Например, значение рН соли бивалентного катиона составляет по меньшей мере приблизительно (или приблизительно) 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5 или 8.
В различных вариантах реализации концентрация соли бивалентного катиона в буферном растворе лежит в пределах от приблизительно 0,1 М до приблизительно 5 М, 5 а в некоторых вариантах реализации от приблизительно 0,5 М до приблизительно 3 М, от приблизительно 1,0 М до приблизительно 3 М или от приблизительно 0,6 М до приблизительно 2,5 М. Например, буфер бивалентного катиона может содержать по меньшей мере 0,6 М CaCl2, или по меньшей мере 2 М MgCl2, или по меньшей мере 2 М CaCl2. Охваченные значения и диапазоны и/или промежуточные значения или диапазоны в пределах диапазонов, описанных в настоящей заявке, также входят в объем настоящего изобретения. Например, концентрация соли бивалентного катиона в буферном растворе составляет от приблизительно 0,5 М до приблизительно 0,75 М, от приблизительно 0,5 М до приблизительно 0,8 М, от приблизительно 0,5 М до приблизительно 0,9 М, приблизительно от 0,5 М до 1,0 М, приблизительно от 0,5 М до 2 М, от приблизительно 1,5 М до приблизительно 2,0 М, от приблизительно 1,5 М до приблизительно 2,5 М, от приблизительно 1,5 М до приблизительно 3,0 М или от приблизительно 2,5 М до приблизительно 3 М.
Более того, предполагается, что диапазоны, которые включают указанные значения в качестве верхнего или нижнего предела, входят в объем настоящего изобретения. Например, концентрация соли бивалентного катиона в буферном растворе, равная по меньшей мере приблизительно (или приблизительно) 0,6 М, 1 М, 1,5 М, 2 М, 2,5 М или 3 М. В различных вариантах реализации температура буферного раствора, содержащего соль бивалентного катиона, лежит в диапазоне от приблизительно 2°С до приблизительно 24°С.
В различных вариантах реализации этап очистки белка от вещества, связывающего Fc, включает элюирование белка буфером элюции, рН которого лежит в диапазоне от приблизительно 2,0 до приблизительно 6,5, предпочтительно в диапазоне от приблизительно 2,0 до приблизительно 4,0, более предпочтительно - в диапазоне от приблизительно 2,5 до приблизительно 3,5. Охваченные значения и диапазоны и/или промежуточные значения или диапазоны в пределах диапазонов, описанных в настоящей заявке, также входят в объем настоящего изобретения. Например, рН буфера элюции составляет от приблизительно 2 до приблизительно 3 или от приблизительно 3 до приблизительно 4.
Более того, предполагается, что диапазоны, которые включают указанные значения в качестве верхнего или нижнего предела, входят в объем настоящего изобретения. Например, рН буфера элюции составляет по меньшей мере приблизительно (или приблизительно) 2, 2,5, 3, 3,5 или 4.
В различных вариантах реализации выделенные белки можно подвергнуть дополнительным этапам очистки либо до, либо после этапа хроматографии с веществом, связывающим Fc. Например, примеры дополнительных этапов очистки включают, без ограничения: анионообменную хроматографию, катионообменную хроматографию, аффинную хроматография с иммобилизованными металлами, хроматографию гидрофобного взаимодействия (HIC), гидроксиапатитную хроматографию, диализ, аффинную хроматографию, осаждение сульфатом аммония, осаждение этанолом, обращенно-фазовую ВЭЖХ (ОФ-ВЭЖХ), хроматофокусирование, ультрафильтрацию, диафильтрацию, микрофильтрацию и гель-фильтрацию. В различных вариантах реализации за этапом хроматографии с веществом, связывающим Fc, следуют этап анионообменной хроматографии и хроматографии гидрофобного взаимодействия. В различных вариантах реализации за этапом хроматографии следует также этап фильтрации вирусов, этап ультрафильтрации/диафильтрации и/или этап фильтрации микробных контаминантов.
В одном из аспектов настоящее изобретение обеспечивает способы очистки антитела от его раствора, содержащего примеси. В различных вариантах реализации указанный способ включает первоначальную адсорбцию белка на веществе, связывающем Fc, за которой следует промывка вещества, связывающего Fc, буферным раствором, содержащим соль бивалентного катиона, с целью удаления одной или более примесей и последующее выделение белка из вещества, связывающего Fc, с получением первого объединенного элюента.
В различных вариантах реализации процесс продолжают, подвергая первый объединенный элюент ионообменной хроматографии путем приведения первого объединенного элюента в контакт с ионообменной смолой таким образом, чтобы целевой белок не адсорбировался на смоле, и выделения протекающего через колонку целевого белка с получением второго объединенного элюента. В различных вариантах реализации этап ионообменной хроматографии дополнительно включает промывку ионообменной смолы буферным промывочным раствором с целью выделить по меньшей мере часть адсорбированного целевого белка.
В различных вариантах реализации процесс очистки продолжают, подвергая второй объединенный элюент хроматографии гидрофобного взаимодействия, в процессе которой целевой белок адсорбируют на гидрофобной смоле (например, твердая фаза, функционализированная гидрофобными лигандами), промывают гидрофобную смолу буферным раствором для промывки с ионной силой, которая не способствует существенному элюированию целевого белка, и выделяют очищенный целевой белок (обычно при помощи буфера для элюции, ионная сила которого достаточно низка, чтобы обеспечить десорбцию целевого белка из гидрофобной смолы).
В предпочтительных вариантах реализации различных аспектов настоящего изобретения вещество, связывающее Fc, иммобилизовано на твердой фазе, которую в предпочтительном случае уравновешивают подходящим буфером перед тем, как привести в контакт с исходной жидкостью. Твердая фаза предпочтительно представляет собой колонку, содержащую агарозну, на которой иммобилизовано вещество, связывающее Fc. В различных вариантах реализации колонка покрыта реагентом, таким как глицерин, для предотвращения неспецифического связывания на колонке.
В различных вариантах реализации белки, очищенные способом согласно настоящему изобретению, можно смешать с фармацевтически приемлемым растворителем и применять в диагностических, терапевтических целях или в других целях, известных для таких молекул.
В различных аспектах настоящее изобретение обеспечивает способы очистки белка, содержащего область Fc, от раствора, содержащего этот белок и ITR-варианты (варианты прочтения интронов) этого белка. В предложенных аспектах способы согласно настоящему изобретению применяют для снижения уровней одной или более разновидностей, представляющих собой варианты прочтения интронов в препарате белка, например в препарате антитела. В различных вариантах реализации уровень вариантов прочтения интронов в белке, выделенном из вещества, связывающего Fc, по меньшей мере в 5 раз ниже уровня вариантов прочтения интронов в исходной жидкости, а в некоторых вариантах реализации - по меньшей мере в 10 раз ниже уровней вариантов прочтения интронов в исходной жидкости. В различных вариантах реализации варианты прочтения интронов в растворе, содержащем указанный белок, выделенный из вещества, связывающего Fc, составляют менее приблизительно 1,0%, 0,8%, 0,5%, 0,2% или 0,1% разновидностей указанного белка.
В различных аспектах настоящее изобретение обеспечивает способы очистки белка, содержащего область Fc, от раствора, который содержит этот белок и его варианты с низкой молекулярной массой (LMW). В предложенных аспектах способы согласно настоящему изобретению применяют для снижения уровней одного или более разновидностей, представляющих собой варианты с низкой молекулярной массой, в препарате белка, например в препарате антитела. В различных вариантах реализации уровень вариантов с низкой молекулярной массой в белке, выделенном из вещества, связывающего Fc, по меньшей мере в 5 раз ниже уровня вариантов с низкой молекулярной массой в исходной жидкости, а в некоторых вариантах реализации - по меньшей мере в 10 раз ниже уровней вариантов с низкой молекулярной массой в исходной жидкости. В различных вариантах реализации варианты с низкой молекулярной массой в растворе, содержащем указанный белок, выделенный из вещества, связывающего Fc, составляют менее приблизительно 1,0%, 0,8%, 0,5%, 0,2% или 0,1% разновидностей указанного белка.
В различных аспектах настоящее изобретение обеспечивает способы очистки белка, содержащего область Fc, от раствора, содержащего этот белок и UDB-варианты (варианты с пониженным содержанием дисульфидных связей) этого белка. В предложенных аспектах способы согласно настоящему изобретению применяют для снижения уровней одной или более разновидностей, представляющих собой варианты с пониженным содержанием дисульфидных связей, в препарате белка, например в препарате антитела. В различных вариантах реализации уровень вариантов с пониженным содержанием дисульфидных связей в белке, выделенном из вещества, связывающего Fc, по меньшей мере в 5 раз ниже уровня вариантов с пониженным содержанием дисульфидных связей в исходной жидкости, а в некоторых вариантах реализации - по меньшей мере в 10 раз ниже уровней вариантов с пониженным содержанием дисульфидных связей в исходной жидкости. В различных вариантах реализации варианты с пониженным содержанием дисульфидных связей в растворе, содержащем указанный белок, выделенный из вещества, связывающего Fc, составляют менее приблизительно 1,0%, 0,8%, 0,5%, 0,2% или 0,1% разновидностей указанного белка.
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает белок, содержащий область Fc, очищенный способом согласно настоящему изобретению.
В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает систему для реализации любого из способов согласно настоящему изобретению, которая включает по меньшей мере первый этап адсорбции белка на веществе, связывающем Fc, с последующей промывкой вещества, связывающего Fc, буферным раствором, содержащим соль бивалентного катиона, с целью удаления одной или более примесей и последующим выделением белка из вещества, связывающего Fc.
В других аспектах настоящее изобретение обеспечивает линию очистки для реализации любого из способов согласно настоящему изобретению, которые содержат по меньшей мере первый этап адсорбции белка на веществе, связывающем Fc, с последующей промывкой вещества, связывающего Fc, буферным раствором, содержащим соль бивалентного катиона, с целью удаления одной или более примесей и последующим выделением белка из вещества, связывающего Fc.
Различные аспекты настоящего изобретения предусматривают также наборы для применения в реализации способов согласно настоящему изобретению. В различных вариантах реализации набор содержит по меньшей мере один реагент и инструкции по применению набора. Например, набор может содержать один или более таких реагентов, как вещество, связывающее Fc, соль бивалентного катиона и реагенты для приготовления буферного раствора, содержащего соль бивалентного катиона, а также инструкции по применению набора.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Перед тем как приступить к более подробному описанию изобретения, полезно уяснить приведенные ниже определения терминов, встречающихся в данной заявке. Приведенные определения объединены в группы для облегчения обращения к ним, а не с целью ограничения.
Определения, относящиеся к белку
В различных аспектах настоящего изобретения предложены способы очистки белка, содержащего область Fc, от раствора, содержащего этот белок и один или более вариантов прочитывания этого белка, таких как, например, варианты прочтения интронов (ITR-варианты). В предложенных аспектах способы согласно настоящему изобретению применяют для снижения уровней одной или более разновидностей, представляющих собой варианты прочтения интронов в препарате белка, например в препарате антитела. В настоящей заявке термины "вариант прочтения интронов" и "разновидность [молекул], представляющая собой вариант прочтения интрона," являются взаимозаменяемыми и относятся к продукту процесса, в котором при синтезе представляющего интерес белка, содержащего область Fc (например, целевого белка), стоп-кодон, расположенный в интроне перед какой-либо кодирующей областью, обуславливает терминацию удлинения цепи полипептида до того, как произойдет транскрипция данной кодирующей области. В результате образуется вариант представляющего интерес белка (т.е. вариант прочтения интрона), у которого один или более доменов являются неполными или отсутствуют. Такие интроны могут содержать более одного стоп-кодона, что обуславливает возможность образования нескольких различных вариантов прочтения интрона.
Термин "вариант с пониженным содержанием дисульфидных связей" или "UDB-вариант" относится к любой молекуле, в которой отсутствует по меньшей мере одна дисульфидная связь. Отсутствовать может либо внутримолекулярная дисульфидная связь, либо межмолекулярная дисульфидная связь, либо комбинация того и другого.
Термин "разновидность с низкой молекулярной массой" или "LMW-разновидность" относится к вариантам белка, содержащего область Fc, включая молекулу белка, которая состоит из свободной тяжелой цепи, свободной легкой цепи, молекулу IRT, половину молекулы и три четверти молекулы, а также их смеси.
Белок А представляет собой белок клеточной стенки массой около 42 кДа, обнаруженный в большинстве штаммов Staphylococcus aureas, который с высокой аффинностью связывает область Fc антител (около 10-8 М для IgG человека). В настоящем описании термин "Белок А" охватывает Белок А, выделенный из природного источника. Белок А, полученный путем синтеза (например, путем синтеза пептидов или по технологии рекомбинантной ДНК и т.д.), а также его варианты, которые сохраняют способность связывать белки, обладающие областью СН2/СН3.
Белок G - это белок клеточной стенки стрептококков группы G. Белок G представляет собой рецептор к Fc III типа, который с высокой аффинностью связывает область Fc антител, в частности антител класса IgG. В настоящем описании термин "Белок G" охватывает Белок G, выделенный из природного источника, Белок G, полученный путем синтеза (например, путем синтеза пептидов или по технологии рекомбинантной ДНК и т.д.), а также его варианты, которые сохраняют способность связывать белки, обладающие областью Fc.
Термин "антитело" или "иммуноглобулин" (которые в настоящем описании являются взаимозаменяемыми) относится к антигенсвязывающему белку, обладающему базовой структурой из четырех цепей полипептидов, включающей две тяжелые и две легкие цепи, где указанные цепи стабилизированы, например, межмолекулярной дисульфидной связью, который обладает способностью специфическим образом связывать антиген. И тяжелая, и легкая цепи упакованы (сложены) с образованием доменов.
Термин "домен" относится к глобулярной области тяжелой или легкой цепи полипептида, содержащего пептидные петли (например, содержащего от 3 до 4 пептидных петель), стабилизированный, например, посредством β-складчатого листа и/или дисульфидными связями в пределах одной цепи. Далее в настоящей заявке домены относят к «константным» или «вариабельным» на основании сравнительного отсутствия вариаций последовательности в пределах домена в случае «константного» домена или существенных различий в пределах домена в случае «вариабельного» домена. "Константные" домены легкой цепи могут называться "константными областями легкой цепи", "константными доменами легкой цепи", областями "CL" или доменами "CL", причем все указанные термины равнозначны. "Константные" домены тяжелой цепи могут называться "константными областями тяжелой цепи", "константными доменами тяжелой цепи", областями "СИ" или доменами "СН", причем все указанные термины равнозначны. "Вариабельные" домены легкой цепи могут называться "вариабельными областями легкой цепи", "вариабельными доменами легкой цепи", областями "VL" или доменами "VL", причем все указанные термины равнозначны. "Вариабельные" домены тяжелой цепи могут называться "вариабельными областями тяжелой цепи", "вариабельными доменами тяжелой цепи", областями "VH" или доменами "VH", причем все указанные термины равнозначны.
Термин "фрагмент" относится к части или участку белка антитела или цепи антитела, которые содержат меньше остатков аминокислот, чем интактные или полные антитело или цепь антитела. Фрагменты можно получить посредством обработки интактного или полного антитела или цепи антитела химическим веществом или ферментом. Фрагменты можно также получить рекомбинантными средствами. Примеры фрагментов включают фрагменты Fab, Fab′, F(ab′)2, Fabc и/или Fv. Термин "антигенсвязывающий фрагмент" относится к фрагменту полипептида иммуноглобулина или антитела, который связывает антиген или конкурирует за специфическое связывание антигена с интактным антителом, из которого он был получен.
Термины "гибридный белок, содержащий антитело" или "слитая конструкция, содержащая антитело" относится к рекомбинантному белку, который содержит целое антитело или его часть, присоединенные к по меньшей мере одному участку белка или полипептида, не являющемуся антителом. Присоединение (слияние) обычно осуществляют посредством генно-инженерных манипуляций с геном, кодирующим указанный белок. Дополнительные примеры гибридных белков, содержащих антитело, включают участок антитела, связывающий клеточный рецептор (включая область Fc), присоединенный к другому цельному растворимому или клеточному биологическому белку или его части, например к рецептору (клеточному или растворимому или его части, цитокину или его части ферменту или его части, и т.д). Такие гибридные антитела, содержащие антитело, которые содержат область Fc антитела, присоединенную к другому белку, называют также гибридными белками, содержащими Fc.
Термин "вещество, связывающее Fc," относится к молекуле, которая способна связывать область Fc антитела (например, антитела класса IgG), включая, без ограничения, белок комплемента, рецептор к Fc или белок бактериального происхождения, такой как Белок А или Белок G, которые обладают высокой аффинностью к области Fc антитела.
Термин "область Fc" относится к С-концевой области антитела класса IgG, в частности к С-концевой области тяжелой цепи (цепей) указанного антитела класса IgG. Хотя границы области Fc тяжелой цепи IgG могут слегка варьировать, область Fc обычно определяют как область, простирающуюся от приблизительно остатка аминокислоты Cys226 до карбоксильного конца тяжелой цепи (цепей) IgG.
Определения, связанные с хроматографией
Термин "исходная жидкость" в настоящем описании относится к жидкости, содержащей по меньшей мере одно целевое вещество, которое необходимо очистить от других веществ, также находящихся в данной жидкости. Исходная жидкость может представлять собой, например, водный раствор, систему органических растворителей или смесь водных/органических растворителей или растворов. Исходные жидкости часто являются сложными смесями или растворами, содержащими много биологических молекул (таких, как белки, антитела, гормоны и вирусы), низкомолекулярных молекул (таких, как соли, сахара, жиры, и т.д.) и даже твердые частицы. Хотя типичная исходная жидкость биологического происхождения может изначально представлять собой водный раствор или суспензию, она может также содержать органические растворители, которые применяли на предшествующих этапах выделения, таких как осаждение растворителя, экстракция и т.п. Примеры исходных жидкостей, которые могут содержать ценные биологические вещества, поддающиеся очистке различными вариантами реализации настоящего изобретения, включают, без ограничения, супернатант культуры из биореактора, суспензию гомогенизированных клеток, плазму, фракции плазмы и молоко.
Термин "целевое вещество" или "целевой белок" относится в настоящем описании к одному или более желательным белкам, содержащим область Fc, которые следует очистить от исходной жидкости. Целевое вещество может присутствовать в исходной жидкости в форме суспензии или раствора.
Термин "примеси" относится к материалам в исходной жидкости, которые отличаются от целевого вещества (веществ) и которые желательно исключить из конечного продукта, содержащего целевое вещество (вещества). Типичные примеси включают нуклеиновые кислоты, белки (включая молекулы, являющиеся вариантами прочтения интронов, вариантами с низкой молекулярной массой и вариантами с пониженным содержанием дисульфидных связей), пептиды, эндотоксины, вирусы и низкомолекулярные молекулы.
В настоящем описании термин "твердая фаза" относится к неводной матрице, с которой целевое вещество взаимодействует в процессе очистки или на которой может быть закреплено вещество, связывающее Fc. Подходящие материалы твердой фазы включают, без ограничения, стекло, кремний (например, силикагель), полисахариды (например, полисахаридная матрица), такие как агароза и целлюлоза, органические полимеры, такие как сополимеры полиакриламида, метилметакрилата и полистирол-дивинилбензола, такие как смола Amberlite™ (можно приобрести в Rohm & Haas Chemical Co., Филадельфия, Пенсильвания, США). Твердую фазу можно выбрать из любой группы смол, обычно относимых к аффинным, ионообменным и ионофиксирующим смолам. Твердая фаза может представлять собой, например, колонку для очистки, дисперсную фазу или дискретные частицы либо комбинацию перечисленного. Твердая фаза может быть пористой или не пористой, сжимаемой или несжимаемой. В различных вариантах реализации твердая фаза представляет собой полимерную матрицу либо частицы или гранулы из агарозы. В различных вариантах реализации твердая фаза может быть покрыта каким-либо реагентом (таким, как глицерин), например, для предотвращения неспецифического налипания примесей на твердую фазу. Единственное требование к твердой фазе: она должна обладать химическим свойством или обладать присоединенным лигандом, которые обеспечивают фиксацию вещества, связывающего Fc, на поверхности твердой фазы. Предпочтительные материалы для твердой фазы могут быть физически и химически приспособленными к условиям, применяемым в процессе очистки, включая работу насоса и проточную фильтрацию, а также к температуре, рН и другим характеристикам применяемых жидкостей.
"Аффинный лиганд" относится к элементу, который селективно или предпочтительно связывает компонент исходной жидкости посредством специфического взаимодействия с сайтом связывания указанного компонента. В настоящем изобретении аффинный лиганд (например, вещество, связывающее Fc) обычно иммобилизован на твердой фазе, например на смоле. Примеры аффинных лигандов, которые можно связать с подложкой (смолой), чтобы получить смолу для хроматографии, которую можно применять в способах согласно настоящему изобретению, включают, без ограничения, Белок А, Белок G и их аналоги, которые специфичным образом связывают область Fc белка. Способы связывания аффинных лигандов с материалами твердой подложки хорошо известны в области очистки. См., например, Affinity Separations: A Practical Approach (Practical Approach Series), Paul Matejtschuk (Editor), Irl Pr: 1997; и Affinity Chromatography, Herbert Schott, Marcel Dekker, New York: 1997.
Термин "смола для аффинной хроматографии" или "аффинная смола" относится к смоле для хроматографии, которая содержит твердую фазу или субстрат, на поверхности которых закреплен аффинный лиганд.
Термин "смола для ионообменной хроматографии" или "ионообменная смола" относится к твердой подложке, к которой ковалентно присоединен лиганд, несущий положительный или отрицательный заряд, и которая, следовательно, содержит свободные противоионы для обмена с ионами в растворе, с которым контактирует ионообменная смола.
Термин "катионообменные смолы" относится к ионообменной смоле, к которой ковалентно присоединены отрицательно заряженные лиганды и которая, следовательно, содержит свободные катионы для замены на катионы в растворе, с которым эта смола контактирует. В данной области известны разнообразные смолы, например смолы, в которых ковалентно связанные группы представляют собой карбоксилат или сульфонат. Коммерчески доступные смолы включают CMC-cellulose (карбоксиметилцеллюлоза), SP-Sephadex™ и Fast S-Sepharose™ (две последние можно приобрести в Pharmacia).
Термин "анионообменные смолы" относится к ионообменной смоле, к которой ковалентно присоединены положительно заряженные группы, такие как группы четвертичного амина. Коммерчески доступные анионообменные смолы включают DEAE cellulose (диэтиламиноэтилцеллюлоза), ТМАЕ (триметиламиноэтил), QAE Sephadex™ и Fast Q Sepharose™ (две последние можно приобрести в Pharmacia).
В настоящем описании термин "хаотропная соль" относится к соли, которая содержит один или более ионных компонентов, которые относятся к низшим членам лиотропного ряда и способны проникать в гидратную оболочку белка и связываться непосредственно с его поверхностью. Это нарушает гидратную ассоциацию, способствуя солюбилизации белка. Примеры хаотропных солей включают, без ограничения, соли элементов II группы с галогенами (например, хлорид кальция, хлорид магния, хлорид бария, бромид кальция, бромид магния, бромид бария, йодид кальция, йодид магния, йодид бария).
Примеры подходящих солей бивалентных катионов включают, без ограничения, соли Mn2+, Ni2+ или Cu2+, Mg2+, Са2+ и Ва2+ с тиоцианатом (SCN-), перхлоратом (ClO4 -), нитратом (NO3 -), хлором (Cl-) и бромом (Br-), а также их комбинации.
В некоторых вариантах реализации соли бивалентных катионов содержат бивалентный катион (например, Mg2+, Са2+, Ni2+ или Ba2+). Предпочтительными хаотропными солями для применения в предложенных процессах являются MgCl2, NiCl2 и CaCl2. После этапа промывки солью бивалентного катиона целевой белок элюируют из матрицы для аффинной хроматографии.
"Буфер" представляет собой вещество, которое, присутствуя в растворе, увеличивает количество соли или щелочи, которое необходимо добавить, чтобы изменить значение рН на одну единицу. Буферный раствор противостоит изменениям рН благодаря действию входящих в него компонентов, представляющих собой конъюгат кислоты и основания. Буферные растворы для применения с биологическими компонентами обычно способны поддерживать постоянную концентрацию ионов водорода, что обеспечивает нахождение рН раствора в физиологических пределах. Термин "физиологический рН" относится к рН крови млекопитающих (т.е. 7,38 или приблизительно 7,4). Таким образом, физиологический диапазон рН составляет приблизительно от 7,2 до 7,6. Стандартные компоненты буфера включают, без ограничения, органические и неорганические соли, кислоты и основания. Примеры буферов для применения в очистке биологических молекул (например, молекул белка) включают буферы на основе цвиттер-ионов или «буферы Гуда», см., например, Good et al. (1966) Biochemistry 5:467 и Good and Izawa (1972) Methods Enzymol. 24:62. Примеры буферов включают, без ограничения, TES, MES, PIPES, HEPES, MOPS, MOPSO, TRICINE и BICINE.
Термин "уравновешивающий буфер" в настоящем описании относится к буферу, который применяют для подготовки реагента, связывающего Fc, твердой фазы или обоих к загрузке исходной жидкости, содержащей целевой белок. Уравновешивающий буфер предпочтительно является изотоническим и обычно имеет рН в диапазоне от приблизительно 6 до приблизительно 8. "Буфер загрузки" представляет собой буфер для загрузки исходной жидкости, содержащей белок, содержащей область Fc, и примеси, на твердую фазу, на которой иммобилизовано вещество, связывающее Fc. Часто уравновешивающий буфер и буфер для загрузки - это одно и то же. "Буфер элюции" применяют для того, чтобы элюировать белок, содержащий область Fc, из иммобилизованного вещества, связывающего Fc. Предпочтительно, буфер элюции имеет низкий рН, благодаря которому он нарушает взаимодействие между веществом, связывающим Fc, и представляющим интерес белком. Предпочтительно, рН буфера элюции с низким рН лежит в диапазоне от приблизительно 2 до приблизительно 5, наиболее предпочтительно - в диапазоне от приблизительно 3 до приблизительно 4. Примеры буферов, которые будут удерживать рН в этих пределах, включают глициновый, фосфатный, ацетатный, цитратный и аммониевый буферы, а также комбинации перечисленных буферов. Предпочтительными из этих буферов являются цитратный и ацетатный буферы, наиболее предпочтительным - натрий-цитратный или натрий-ацетатный буферы. Подразумевается, что другие буферы элюции включают буферы с высоким рН (например, буферы, имеющие рН, равный 9 или более) или буферы, содержащие соединение или композицию, такие как MgCl2 (2 мМ), для элюирования представляющего интерес белка.
Термины "промывочная жидкость" или "промывочный буфер" (буфер для промывки) в настоящем описании относятся к жидкости, которую применяют для удаления примесей из смолы для хроматографии, с которой связано целевое вещество. Можно последовательно применять более одной промывочных жидкостей, например несколько промывочных жидкостей, обладающих различными характеристиками, такими как рН, проводимость, концентрация растворителя и т.д., которые обеспечивают диссоциацию и удаление различных типов примесей, неспецифически связанных со смолой для хроматографии.
"Буфер для элюции" или "элюционный буфер" в настоящем описании относится к жидкости, которую применяют для того, чтобы осуществить диссоциацию целевого вещества от смолы для хроматографии после промывки одной или несколькими жидкостями. Действие жидкости для элюции приводит к диссоциации целевого вещества, не вызывая при этом необратимой денатурации. Стандартные жидкости для элюции хорошо известны в области хроматографии и могут содержать более высокие концентрации солей, свободных аффинных лигандов или их аналогов, либо свободных аффинных лигандов или их аналогов, либо других веществ, которые ускоряют диссоциацию целевого вещества и смолы для хроматографии. Термин "условия элюции" относится к технологическим условиям, действию которых подвергают смолу для хроматографии, связанную с целевым веществом, при которых происходит диссоциация целевого вещества и смолы для хроматографии, такие как приведение связанной с целевым веществом смолы для хроматографии в контакт с жидкостью для элюции и буфером для элюции с целью вызвать диссоциацию.
Термин "очищающая жидкость" или "очищающий буфер" относится в настоящем описании к жидкости, которую применяют для промывки смолы для хроматографии после завершения реакции очистки. Очищающая жидкость может содержать детергент, вещество, инактивирующее вирусы, либо соли в сравнительно высоких концентрациях, и может иметь рН, более высокий или более низкий, чем жидкости, применяемые в процессе очистки. Ее назначение - очистка смолы для хроматографии от примесей, чтобы сделать ее пригодной для повторного использования. Обычные очищающие жидкости хорошо известны в области хроматографии.
Термин "жидкость для хранения" или "буфер для хранения" в настоящем описании относится к жидкости, в которой смолу для хроматографии суспендируют между применениями. Жидкости для хранения в дополнение к буферизирующим ионам могут содержать также бактерицидные вещества или другие консерванты. Такие жидкости для хранения хорошо известны в области хроматографии.
В различных аспектах настоящего изобретения предложены способы очистки белка, содержащего область Fc, от исходной жидкости, содержащей данный белок и одну или более примесей, путем адсорбирования белка на веществе, связывающем Fc, с последующей промывкой вещества, связывающего Fc, буферным раствором, содержащим соль бивалентного катиона, с целью удаления одной или более примесей и последующим выделением белка из вещества, связывающего Fc. Подходящие вещества, связывающие Fc, включают, без ограничения, Белок А и Белок G.
Настоящее изобретение обеспечивает способ очистки белков, содержащих область Fc, например антител. Примеры способов очистки включают этап аффинной хроматографии. Этап аффинной хроматографии может быть непрерывным, дискретным или представлять собой их комбинацию. Например, этап аффинной хроматографии можно осуществлять в форме дискретного процесса, такого как, например, периодический процесс. Аффинная хроматография представляет собой способ биоселективной адсорбции и последующего выделения целевого соединения из иммобилизованного лиганда. Этот процесс обеспечивает высоко селективную и специфичную очистку целевого соединения. Для данного процесса необходимо применение подходящего селективного лиганда (например, вещества, связывающего Fc), который будет связывать целевое соединение (например, белок, содержащий область Fc), обычно с константой диссоциации в диапазоне от 10-4 до 10-8, одновременно обеспечивая выделение в мягких условиях. Лиганд обычно иммобилизован на гранулированной и пористой матрице, которая может представлять собой наполнитель колонки или среду для периодической адсорбции.
Предпочтительным связывающим агентом является Белок А. Белок А связывает область Fc иммуноглобулинов. Белок А состоит из шести областей, пять из которых связывают IgG. Он с высокой аффинностью связывает IgG1, IgG2 и IgG4 человека, а также IgG2a, IgG2b и IgG3 мыши. Белок А с умеренной аффинностью связывает IgD, IgM, IgA и IgE человека, а также IgG1. В качестве аффинного лиганда Белок А иммобилизуют на матрице таким образом, чтобы эти области оставались свободными для связывания. Одна молекула иммобилизованного Белка А может связать по меньшей мере две молекулы IgG. Нативный и рекомбинантный варианты Белка А обладают близкой специфичностью к области Fc иммуноглобулина IgG. Рекомбинантный Белок A (rProtein А, рБелок А) можно сконструировать таким образом, чтобы он включал, например, С-концевой цистеин и чтобы его можно было иммобилизовать на твердофазной матрице посредством присоединения тиоэфирной связью. Такое присоединение приводит к увеличению связывающей способности белка А.
Альтернативное связывающее вещество - Белок G. Белок G специфичен в отношении IgG, он с высокой аффинностью связывает IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, a также IgG1, IgG3 мыши. Белок G PLUS обладает умеренной аффинностью в отношении IgG4 человека и IgG2a, IgG2b и IgG3 мыши. Рекомбинантный белок G (rProtein G, рБелок G) можно сконструировать таким образом, чтобы он не содержал альбуминсвязывающей области, присутствующей в нативном белке. Рекомбинантный Белок G содержит две области, связывающие Fc.
Еще одно альтернативное связывающее вещество - Белок A/G. Белок A/G представляет собой полученный методами генетической инженерии белок, в котором сочетаются профили связывания с IgG и Белка А, и Белка G. Этот белок является продуктом слияния генов, который секретирует непатогенный вид Bacillus. Белок A/G содержит четыре домена, связывающих Fc, из Белка А и два - из Белка G. Белок A/G не так зависим от рН, как белок А, но, наоборот, обладает аддитивными свойствами белков А и G.
Белок A/G связывает все подклассы IgG человека и особенно подходит для очистки поликлональных и моноклональных антител класса IgG, подкласс которых не определен. Кроме того, он связывает IgA, IgE, IgM и (в меньшей степени) IgD. Белок A/G также хорошо связывает все подклассы IgG мыши и особенно подходит для очистки моноклональных антител мыши подклассов IgG без влияния со стороны IgA, IgM и сывороточного альбумина мыши (см., например, Sikkema. (1989) Amer. Biotech. Lab 7, 42). Отдельные подклассы моноклональных антител мыши могут обладать более высокой аффинностью по отношению к химерному Белку A/G, чем отдельно к Белку А или Белку G (см., например, Eliasson et al. (1988) J. Biol. Chem. 263, 4323-4327).
В настоящем изобретении иммобилизованное вещество, связывающее Fc (например, Белок А), промывают раствором соли бивалентного катиона, чтобы удалить примеси. В частности, было обнаружено, что нежелательные примеси, являющиеся результатом методик экспрессии рекомбинантного антитела, можно удалить при помощи этапа промывки солью двухвалентного катиона.
Способы согласно настоящему изобретению могут включать этапы очистки, следующие за аффинной хроматографией и промывкой с применением бивалентного катиона. Последующие этапы очистки могут включать этап ионообменной хроматографии и/или этап хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC). Последующие этапы хроматографии могут быть непрерывными, дискретными (например, такими, как периодический процесс) или представлять собой комбинацию непрерывного и дискретного процесса. Ионообменная хроматография обеспечивает разделение молекул по разнице в общем заряде белков. Чтобы связаться, целевой белок должен иметь заряд, противоположный заряду функциональных групп, присоединенных к смоле. Например, антитела, которые обычно имеют положительный общий заряд, будут хорошо связываться с катионообменными носителями, которые имеют отрицательно заряженные функциональные группы. Поскольку такое взаимодействие является ионным, связывание должно происходить в низкоионной среде. Элюирование осуществляют путем увеличения ионной силы раствора, что позволяет нарушить ионные взаимодействия, либо путем изменения рН белка.
Разделение белков путем ионообменной хроматографии основано на зарядах белков, а в хроматографии гидрофобных взаимодействий задействованы гидрофобные свойства некоторых белков. Гидрофобные группы белка связываются с гидрофильными группами на колонке. Чем более гидрофобным является белок, тем сильнее его связывание с колонкой. На этапе HIC происходит удаление, например, примесей из клеток-хозяев (например, ДНК и других связанных с продуктом высоко- и низкомолекулярных молекул). Дополнительные этапы очистки могут включать удаление вирусов, а также этапы ультрафильтрации и/или диафильтрации, описанные в настоящей заявке.
В различных вариантах реализации белок, содержащий область Fc, представляет собой антитело или гибридный белок, содержащий антитело, имеющий область Fc, который связывается с рецептором Fc вещества, связывающего Fc. Применение буферного раствора, содержащего соль бивалентного катиона для промывки вещества, связывающего Fc, обеспечивает лучшее удаление примесей, таких как, например, варианты прочитывания и фрагменты, содержащие константные области (включая виды молекул LMW и UDB) представляющего интерес белка (например, целевое вещество в исходной жидкости).
Способы согласно настоящему изобретению включают один или более этапов разделения путем хроматографии и дополнительно включают один или более этапов фильтрации для отделения белка, имеющего область Fc ("целевого белка") от примесей в исходной жидкости.
Например, исходную жидкость можно фильтровать, центрифугировать или обрабатывать иным образом, чтобы удалить осадок в виде частиц и т.п. перед тем, как привести исходную жидкость в контакт с веществом, связывающим Fc. Например, используя технологии рекомбинантной ДНК, можно получать белки внутри клетки, в периплазматическом пространстве, или добиться непосредственной секреции в культуральную среду. В случае получения белка внутри клетки клетки-хозяева или их лизированные фрагменты можно удалить, например, путем центрифугирования или ультрафильтрации. В случае секретирования белка в среду клетки-хозяева можно отделить от культуральной среды, например, путем фильтрации в продольном потоке.
В различных вариантах реализации исходную жидкость, содержащую целевой белок, приводят в контакт с веществом, связывающим Fc (предпочтительно, иммобилизованным на твердой фазе и уравновешенный подходящим буфером), чтобы целевой белок адсорбировался на веществе, связывающем Fc (например, на иммобилизованном веществе, связывающем Fc). Исходную жидкость приводят в контакт с веществом, связывающим Fc (например, с иммобилизованным на твердой фазу веществе, связывающем Fc), в загрузочном буфере, который может быть таким же, как и уравновешивающий буфер. По мере протекания содержащей примеси исходной жидкости через твердую фазу целевой белок адсорбируется на веществе, связывающем Fc, а различные другие примеси (такие, как белки клеток-хозяев, если получение белка происходит в рекомбинантных клетках, или другие примеси, связанные с процессом) вытекают или связываются с твердой фазой неспецифическим образом. В различных вариантах реализации вещество, связывающее Fc, представляет собой Белок А, а выравнивающий буфер может представлять собой 20 мМ Tris, содержащий 0,15 М NaCl, с рН 7,5. Другие подходящие выравнивающие буферы включают, например, BIS, HEPES и т.д. в физиологических концентрациях, например в концентрациях в диапазоне от приблизительно 0,5 мМ до приблизительно 100 мМ (например, 10 мМ, 20 мМ, 50 мМ и т.д.), и с физиологическими концентрациями солей (например, 5 приблизительно 0,15 мМ NaCl), и при рН в пределах 5,0-9,0.
Твердая фаза предпочтительно представляет собой гранулы или частицы из агарозы (например, сефарозу (Sepharose)) для иммобилизации вещества, связывающего Fc. В различных вариантах реализации колонку покрывают каким-либо реагентом, например глицерином, для снижения или предотвращения неспецифического связывания с колонкой. В различных вариантах реализации вещество, связывающее Fc, представляет собой Белок А. Примером колонки с Белком А, которая подходит для реализации предложенных методик, является Колонка rmp Protein A Sepharose™ Fast Flow (FF), которую можно приобрести в Amersham Biosciences.
Вещество, связывающее Fc, затем промывают буферным промывочным раствором, содержащим соль бивалентного катиона, чтобы удалить различные виды вариантов белка, связавшиеся с веществом, связывающим Fc. В частности, было обнаружено, что этап промывки солью бивалентного катиона позволяет удалить значительное количество нежелательных примесей. Конкретно, было обнаружено, что варианты прочтения интронов, низкомолекулярные варианты и варианты с пониженным содержанием дисульфидных связей целевого белка можно удалить при помощи промывки солью бивалентного катиона. Более того, промывка солью бивалентного катиона позволяет также удалить белки клеток-хозяев (БКХ, НСР) и ДНК клеток-хозяев. В различных вариантах реализации соль бивалентного катиона в жидкости для промывки представляет собой хаотропную соль. Примеры подходящих хаотропных солей включают, без ограничения, хлорид кальция (CaCl2), хлорид никеля (NiCl2) и хлорид магния (MgCl2). Хотя промывочный раствор может содержать только одну соль бивалентного катиона, в различных вариантах реализации возможно применение двух или более солей бивалентных катионов.
В различных вариантах реализации в дополнение в промывочному раствору, содержащему соль бивалентного катиона, применяют другие промывочные растворы. Например, в различных вариантах реализации применяют раствор, представляющий собой 20-50 мМ Tris с 0,75-2,0 М NaCl и рН 5,0-9,0 и/или 10 мМ Tris с рН 7,5 для промывки вещества, связывающего Fc, до, после либо и до и после промывки вещества, связывающего Fc, промывочным раствором, содержащим соль бивалентного катиона.
В различных вариантах реализации соль бивалентного катиона добавляют предпочтительно в концентрации от приблизительно 0,5 М до приблизительно 2,5 М к рН-буферному раствору, рН которого находится в диапазоне от приблизительно 5 до приблизительно 9, а предпочтительно - в диапазоне от приблизительно 7 до приблизительно 8. Предпочтительные концентрации соли бивалентного катиона включают, без ограничения, 0,6 М, 2,0 М и 2,5 М. Подходящие для этой цели буферы включают, без ограничения, буфер Tris или ацетатный буфер в концентрациях от 20 до 50 мМ.
После этапа (этапов) промывки целевой белок выделяют из вещества, связывающего Fc. Этого обычно добиваются путем использования подходящего буфера для элюции. Целевой белок можно, например, элюировать из колонки, используя буфер для элюции, имеющий низкий рН, например в диапазоне от приблизительно 2 до приблизительно 6,5, а предпочтительно - в диапазоне от приблизительно 2,5 до приблизительно 3,5.
В различных вариантах реализации целевой белок, полученный таким образом, можно объединить с фармацевтически приемлемым носителем и применять в различных диагностических и терапевтических целях, а также в других целях, известных для таких молекул.
В различных вариантах реализации препарат элюированного целевого белка после этапа хроматографии с веществом, связывающим Fc, можно подвергнуть дополнительным этапам очистки. Например, примеры дополнительных этапов очистки включают, без ограничения: анионообменную хроматографию, хроматографию гидрофобного взаимодействия (HIC), гидроксиапатитную хроматографию, диализ, аффинную хроматографию, осаждение сульфатом аммония, осаждение этанолом, обращенно-фазовую ВЭЖХ (ОФ-ВЭЖХ), хроматофокусирование, ультрафильтрацию, диафильтрацию, микрофильтрацию и гель-фильтрацию. В различных вариантах за этапом хроматографии на веществе, связывающем Fc, следуют этап анионообменной хроматографии и хроматографии гидрофобного взаимодействия. В различных вариантах реализации за этапом хроматографии следует также этап фильтрации вирусов, этап ультрафильтрации/диафильтрации и/или этап фильтрации микробных контаминантов. В различных вариантах реализации эти дополнительные этапы очистки можно проводить до этапа хроматографии на веществе, связывающем Fc. В различных аспектах способы, описанные в настоящей заявке, включают очистку белка, содержащего область Fc, от примесей путем хроматографии с Белком А.
В различных вариантах реализации первым этапом способов очистки белка, содержащего область Fc (целевого белка), является адсорбция целевого белка на веществе, связывающем Fc, содержащем Белок А, иммобилизованный на твердой фазе, с последующей промывкой вещества, связывающего Fc, буферным раствором, содержащим соль бивалентного катиона, с целью удаления одной или более примесей из белка А и последующим выделением целевого белка из Белка А, которое дает первый объединенный элюент.
В различных вариантах реализации процесс очистки продолжают, подвергая первый объединенный элюент анионообменной хроматографии путем приведения анионообменной смолы в контакт с первым объединенным элюентом, в результате чего примеси адсорбируются на смоле, а целевой белок на смоле не адсорбируется. Таким образом, целевой белок можно выделять из жидкости, вытекающей из колонки, и получать второй объединенный элюент. В различных вариантах реализации этап анионообменной хроматографии дополнительно включает промывку анионообменной смолы буферным раствором для промывки с выделением по меньшей мере части адсорбированного целевого белка, которую затем можно добавить ко второму объединенному элюенту. В качестве альтернативы, объединенный элюент можно привести в контакт с анионообменной смолой таким образом, чтобы антитело адсорбировалось, позволяя примесям вытекать из колонки с последующими необязательными промывкой и элюированием адсорбированного антитела.
В различных вариантах реализации процесс очистки продолжают, подвергая второй объединенный элюент хроматографии гидрофобного взаимодействия, в ходе которой целевой белок адсорбируют на смоле, способной к гидрофобным взаимодействиям (например, на твердой фазе, функционализированной гидрофобными лигандами), промывают гидрофобную смолу буферным промывочным раствором с ионной силой, которая не способствует существенному элюированию целевого белка, и выделют очищенный целевой белок (обычно при помощи буфера для элюции, ионная сила которого достаточно низка, чтобы обеспечить десорбцию целевого белка из гидрофобной смолы) с получением третьего объединенного элюента. В качестве альтернативы, второй объединенный элюент можно привести в контакт с колонкой для HIC таким образом, чтобы целевой белок не адсорбировался, выделить вытекающий целевой белок и получить, таким образом, третий объединенный элюент.
В различных вариантах реализации процесс очистки включает один или более этапов фильтрации, позволяющих, например, удалить вирусы, произвести концентрирование и буферизацию раствора, содержащего целевой белок, а также удалить микробные контаминанты.
В различных вариантах реализации настоящее изобретение обеспечивает способы очистки белка, содержащего область Fc, от исходной жидкости, содержащей указанный белок и одну или более примесей, где примеси содержат один или более вариантов IRT. В одном варианте реализации способы обеспечивают снижение уровней IRT-вариантов в от приблизительно 2 до приблизительно 20 раз по сравнению с уровнями в исходной жидкости. В предпочтительном случае уровни вариантов снижаются по меньшей мере в 5 раз, а более предпочтительно снижение уровней IRT-вариантов в по меньшей мере 10 раз. Например, можно снизить уровень IRT в исходной жидкости (исходном образце) с 3-5% IRT-вариантов антитела (в процентах от общего содержания разновидностей в исходной жидкости) до от 0,3 до приблизительно 0,5%. В различных вариантах реализациисодержание разновидностей, представляющих собой IRT-варианты, снижается до: менее чем 1%, менее чем 0,8%, менее чем 0,5%, менее чем 0,3%, менее чем 0,2% и/или менее чем 0,1%. В предпочтительном случае в результате очистки исходной жидкости для приготовления белка содержание IRT-вариантов снижается до: менее чем 1%, менее чем 0,8%, менее чем 0,5%, менее чем 0,3%, менее чем 0,2% и/или менее чем 0,1%, выраженных в форме процентной долиот общего содержания разновидностей в исходной жидкости.
В различных вариантах реализации настоящее изобретение обеспечивает способы очистки белка, содержащего область Fc, от исходной жидкости, содержащей указанный белок и одну или более примесей, где примеси включают один или более LMW-вариантов. В одном варианте реализации указанные способы обеспечивают снижение уровней LMW-вариантов в от приблизительно 2 до приблизительно 20 раз по сравнению с уровнями в исходной жидкости. В предпочтительном случае уровни вариантов LMW снижаются по меньшей мере в 5 раз, а более предпочтительно снижение уровней LMW-вариантов в по меньшей мере 10 раз.
Например, можно снизить содержание UDB-вариантов антитела в исходной жидкости (исходном образце) с приблизительно 20% UDB-вариантов антитела (в процентах от общего содержания разновидностей в исходной жидкости) до от приблизительно 10% до приблизительно 2%.
В различных вариантах реализации количество разновидностей, представляющих собой варианты UDB, снижается до: менее чем 20%, менее чем 15%, менее чем 10%, менее чем 5%, менее чем 2% или менее чем 1%. Предпочтительно, при очистке исходной жидкости для приготовления белка количество вариантов UDB снижается до: менее чем 20%, менее чем 15%, менее чем 10%, менее чем 5%, менее чем 2% или менее чем 1% выраженных в форме процентной долиот общего содержания разновидностей в исходной жидкости.
Например, можно снизить уровень LMW в исходной жидкости (исходном образце) с 3-5% LMW-вариантов антитела (в процентах от общего содержания разновидностей в исходной жидкости) до от 0,3 до приблизительно 0,5%.
В различных вариантах реализации количество разновидностей, представляющих собой LMW-варианты, снижается до: менее чем 1%, менее чем 0,8%, менее чем 0,5%, менее чем 0,3%, менее чем 0,2% и/или менее чем 0,1%. В предпочтительном случае в результате очистки исходной жидкости для приготовления белка содержание LMW-вариантов снижается до: менее чем 1%, менее чем 0,8%, менее чем 0,5%, менее чем 0,3%, менее чем 0,2% и/или менее чем 0,1%, выраженных в форме процентной доли от общего содержания разновидностей в исходной жидкости.
В различных вариантах реализации настоящего изобретения предложены способы очистки белка, содержащего область Fc, от исходной жидкости, содержащей указанный белок и одну или более примесей, которые включают один или более UDB-вариантов. В одном способе реализации указанные способы обеспечивают снижение уровней UDB-вариантов в от приблизительно 2 до приблизительно 20 раз по сравнению с уровнями в исходной жидкости. В предпочтительном случае уровни UDB-вариантов снижаются по меньшей мере в 5 раз, а более предпочтительно снижение уровней UDB-вариантов в по меньшей мере 10 раз.
Например, можно снизить содержание UDB-вариантов антитела в исходной жидкости (исходном образце), содержащей приблизительно 20% UDB-вариантов антитела (в процентах от общего содержания разновидностей в исходной жидкости), до от приблизительно 10% до приблизительно 2%. В различных вариантах реализации количество разновидностей, представляющих собой UDB-варианты, снижается до: менее чем 20%, менее чем 15%, менее чем 10%, менее чем 5%, менее чем 2% или менее чем 1%. Предпочтительно, при очистке исходной жидкости для приготовления белка количество UDB-вариантов снижается до: менее чем 20%, менее чем 15%, менее чем 10%, менее чем 5%, менее чем 2% или менее чем 1%, выраженных в форме процентной доли от общего содержания разновидностей в исходной жидкости.
Также, например, можно снизить уровень UDB в исходной жидкости (исходном образце) с 3-5% UDB-вариантов антитела (в процентах от общего содержания разновидностей в исходной жидкости) до от 0,3 до приблизительно 0,5%. В различных вариантах реализации количество разновидностей, представляющих собой UDB-варианты, снижается до: менее чем 1%, менее чем 0,8%, менее чем 0,5%, менее чем 0,3%, менее чем 0,2% и/или менее чем 0,1%. В предпочтительном случае при очистке исходной жидкости для приготовления белка количество UDB-вариантов снижается до: менее чем 1%, менее чем 0,8%, менее чем 0,5%, менее чем 0,3%, менее чем 0,2% и/или менее чем 0,1%, выраженных в форме процентной доли от общего содержания разновидностей в исходной жидкости.
Белки для применения в методах очистки согласно настоящему изобретению
Белки, содержащие область Fc, для очистки способами согласно настоящему изобретению получают с помощью традиционных методик данной области, которые включают, например, методы синтеза (такие, как технологии рекомбинантных ДНК и синтез пептидов или комбинация указанных технологий) или, возможно, выделяют из источника эндогенного белка. В некоторых вариантах реализации белок, содержащий область Fc, представляет собой антигенсвязывающий полипептид, а более предпочтительно - антитело. Антитело может представлять собой, например, препарат поликлональных антител, моноклональное антитело, рекомбинантное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или антитело человека. Методы получения антигенсвязывающих полипептидов и, в частности, антител описаны ниже. В качестве альтернативы, белок, содержащий область Fc, может быть получен путем модификаци из антитела, такого как биспецифическое антитело, конъюгированное антитело или гибридный белок, содержащий антитело (например, гибридный белок, содержащий Fc). Методы получения таких модифицированных форм антител и гибридных белков, содержащих антитело, также описаны ниже.
Поликлональные антитела
Поликлональные антитела можно получить путем иммунизации подходящего субъекта иммуногеном. Динамику титра антитела в организме иммунизированного субъекта можно отслеживать стандартными методами, например путем твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) с применением иммобилизованного целевого антигена. При желании, молекулы антител против целевого антигена можно выделить из организма млекопитающего (например, из крови) и подвергнуть дополнительной очистке хорошо известными методами, такими как хроматография на сефарозе с белком А, чтобы получить, например, антитело фракции IgG. Через подходящее время после иммунизации, например когда титры антител будут максимальными, можно выделить антителопродуцирующие клетки из организма субъекта и использовать их для получения моноклональных антител стандартными методами, такими как метод гибридом, который впервые был описан в Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495-497 (см. также Brown et al. (1981) J. Immunol. 127: 539-46; Brown et al. (1980) J. Biol. Chem. 255: 4980-83; Yeh et al. (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 2927-31; и Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29: 269-75). Информацию о получении химерных поликлональных антител можно найти, например, в Buechler et al. Патент США № 6,420,113.
Моноклональные антитела
Для наработки моноклональных антител можно применять любые протоколы сливания лимфоцитов и клеток иммортализованных линий (см., например, G. Galfre et al. (1977) Nature 266:55052; Gefter et al. Somatic Cell Genet., cited supra; Lerner, Yale J. Biol. Med., цитировавшаяся выше; Kenneth, Monoclonal Antibodies, цитировавшаяся выше). Более того, для среднего специалиста в данной области очевидно, что существует множество вариантов таких способов, которые также могут быть полезны. Обычно бессмертные линии клеток (например, линия клеток миеломы) получают из тех же видов млекопитающих, что и лимфоциты. Например, гибридомы мыши можно получить путем слияния лимфоцитов, полученных из мышей, иммунизированных иммуногенным препаратом согласно настоящему изобретению, с иммортализованной линией клеток мыши. Предпочтительными бессмертными линиями клеток являются линии клеток миеломы мыши, чувствительные к культуральной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин ("среда HAT").
В качестве партнера для слияния в стандартных методиках можно применять любое число линий клеток миеломы, например линии клеток миеломы P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 или Sp2/O-Ag14. Эти линии клеток можно получить в Американской коллекции типовых культур (АТСС). Обычно чувствительные к HAT клетки миеломы мыши сливают со спленоцитами мышей при помощи полиэтиленгликоля ("ПЭГ"). Затем клетки гибридомы, полученные в результате такого слияния, подвергают селекции при помощи среды ВАТ, которая убивает неслившиеся или непродуктивно слившиеся клетки миеломы (через несколько дней неслившиеся спленоциты погибают, поскольку они не подвергаются трансформации). Клетки гибридомы, продуцирующие моноклональное тело согласно настоящему изобретению, обнаруживают путем скрининга надосадосадочных жидкостей культур гибридом на антитела, которые связывают целевой антиген, стандартным методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).
Рекомбинантные антитела
В качестве альтернативы получению гибридом, секретирующих моноклональные антитела, можно идентифицировать и выделить моноклональное антитело путем скрининга комбинационной библиотеки рекомбинантных иммуноглобулинов (например, библиотеки фагового дисплея антител) с целевым антигеном, чтобы выделить те члены библиотеки, которые связывают целевой антиген. Наборы для получения и скрининга библиотек фагового дисплея имеются в продаже (например, система Recombinant Phage Antibody System производства Pharmacia, № по каталогу 27-9400-01; и SurfZAP™ Phage Display Kit производства Stratagene, № по каталогу 240612). Дополнительные примеры методов и реагентов, особенно подходящих для получения и скрининга библитоек фагового дисплея, можно найти, например, в Ladner et al. U.S. Patent № 5,223,409; Kang et al. Международная публикация РСТ № WO 92/18619; Dower et al. Международная публикация РСТ № WO 91/17271; Winter et al. Международная публикация РСТ № WO 92/20791; Markland et al. Международная публикация РСТ № WO 92/15679; Breitling et al. Международная публикация РСТ № WO 93/01288; McCafferty et al. Международная публикация РСТ № WO 92/01047; Garrard et al. Международная публикация РСТ № WO 92/09690; Ladner et al. Международная публикация РСТ № WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81-85; Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12: 725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226: 889-896; Clarkson et al. (1991) Nature 352: 624-628; Gram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc. Acid Res. 19: 4133-4137; Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982; и McCafferty et al. Nature (1990) 348: 552-554.
Химерные и гуманизированные антитела
Кроме того, в объем изобретения входят рекомбинантные антитела, такие как химерные и гуманизированные антитела, включающие одновременно части, принадлежащие человеку, а также части, принадлежащие другим видам, которые можно получить при помощи стандартных технологий рекомбинантной ДНК.
Термин "гуманизированный иммуноглобулин" или "гуманизированное антитело" относится к иммуноглобулину или антителу, которые включают по меньшей мере одну цепь гуманизированного иммуноглобулина или антитела (т.е. по меньшей мере одну гуманизированную легкую или тяжелую цепь). Термин "гуманизированная цепь иммуноглобулина" или "гуманизированная цепь антитела" (т.е. "гуманизированная легкая цепь иммуноглобулина" или "гуманизированная тяжелая цепь иммуноглобулина") относится к цепи иммуноглобулина или антитела (т.е. к легкой или тяжелой цепи соответственно), вариабельная область которой включает вариабельный каркасный участок в основном из иммуноглобулина или антитела человека и гипервариабельные участки (участки, определяющие комплементарность, CDR) (например, по меньшей мере один CDR, предпочтительно два CDR, более предпочтительно - три CDR), в основном из иммуноглобулина и антитела, не принадлежащих человеку, и дополнительно содержит константные области (например, по меньшей мере одну константную область или ее часть в случае легкой цепи и три константных области в случае тяжелой цепи). Термин "гуманизированная вариабельная область" (например, "гуманизированная вариабельная область легкой цепи" или "гуманизированная вариабельная область тяжелой цепи") относится к вариабельной области, которая включает вариабельную каркасную область в основном из иммуноглобулина или антитела человека и гипервариабельные участки (CDR) в основном из иммуноглобулина или антитела, не принадлежащих человеку.
Фраза "в основном из иммуноглобулина или антитела человека" или "в основном принадлежащий человеку" означает, что при выравнивании с последовательностью аминокислот иммуноглобулина или антитела человека в целях сравнения данная область демонстрирует по меньшей мере 80-90%, 90-95% или 95-99% идентичность (т.е. локальную идентичность последовательности) с последовательностью каркасной или константной области человека с учетом, например, консервативных замен, замен консенсусной последовательности, замен зародышевых линий, обратных мутаций и т.п. Введение консервативных замен, замен консенсусной последовательности, замен зародышевой линии, обратных мутаций и т.п. часто называют "оптимизацией" гуманизированного антитела или цепи. Фраза "в основном из иммуноглобулина или антитела, не принадлежащего человеку," или "в основном, не принадлежащий человеку" означает, что иммуноглобулин или антитело обладает последовательностью, по меньшей мере на 80-95%, предпочтительно, по меньшей мере на 90-95%, более предпочтительно, на 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности организма, не являющегося человеком, например млекопитающего, не являющегося человеком.
Соответственно, все области или остатки гуманизированного иммуноглобулина или антитела, либо гуманизированной цепи иммуноглобулина или антитела за исключением CDR в основном идентичны соответствующим областям или остаткам одной или более последовательностей нативного иммуноглобулина человека. Термин "соответвтвующая область" или "соответствующий участок" относятся к области или остатку на второй последовательности аминокислот или нуклеотидов, который при выравнивании первой и второй последовательностей в целях сравнения занимает то же (т.е. эквивалентное) положение, что и область или остаток на первой последовательности аминокислот или нуклеотидов.
Термин "значительная идентичность" означает, что две последовательности полипептидов при оптимальном выравнивании, например, при помощи программ GAP
или BESTFIT с использованием заданных по умолчанию весов пробелов обладают по меньшей мере 50-60% идентичностью последовательности 60-70%, более предпочтительно по меньшей мере 70-80% идентичностью последовательности, более предпочтительно по меньшей мере 80-90% идентичностью последовательности, и даже более предпочтительно по меньшей мере 90-95% идентичностью последовательности, и даже еще более предпочтительно 95% или большей идентичностью последовательности (например, 99% или большей идентичностью последовательности). Термин "значительная идентичность" означает, что две последовательности полипептидов при оптимальном выравнивании, например, при помощи программ GAP или BESTFIT с использованием заданных по умолчанию весов пробелов обладают по меньшей мере 80-90% идентичностью последовательности, предпочтительно, по меньшей мере 90-95% идентичностью последовательности и более предпочтительно 95% или большей идентичностью последовательности (например, 99% или большей идентичностью последовательности). При сравнении последовательностей одна последовательность обычно выступает в качестве эталонной последовательности, с которой сравнивают исследуемую последовательность. При использовании алгоритма сравнения последовательностей исследуемую и эталонную последовательности вводят в компьютер, при необходимости назначают координаты подпоследовательностей и задают параметры программы, реализующей алгоритм. Затем алгоритм сравнения последовательностей рассчитывает процентную идентичность последовательностей для исследуемой последовательности (последовательностей) по отношению к эталонной последовательности на основании заданных параметров программы.
Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно выполнить, например, по алгоритму локальной гомологии Смита и Ватермана (Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)), по алгоритму гомологичного выравнивания Нидлмана и Вюнша (Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)), методом поиска подобий Пирсона и Липмана (Pearson & Lipman, Proc. Nat'I. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)), или при помощи компьютерных реализации этих алгоритмов. (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в программном продукте Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI (Висконсин, США)), либо путем визуального осмотра (см., в основном, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology). Одним из примеров алгоритма, подходящего для вычисления процентной идентичности последовательностей и подобия последовательностей, является алгоритм BLAST, который описан в Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990). ПО для выполнения анализа по алгоритму BLAST доступно для общего использования в Национальном центре биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information, общедоступное ПО Интернет-сервера Национальных институтов здоровья NCBl). Обычно для выполнения сравнения последовательностей можно использовать заданные по умолчанию параметры, хотя можно также использовать и индивидуально настроеннные параметры. Для сравнения последовательностей аминокислот в программе BLASTP по умолчанию задаются следующие параметры: длина слова (W) равна 3, ожидание (Е) равно 10, и матрица баллов BLOSUM62 (см. Henikoff&Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)).
Предпочтительно, чтобы положения остатков, которые не являются идентичными, различались консервативной заменой аминокислот. В целях классификации замен аминокислот на консервативные и неконсервативные аминокислоты делят на следующие группы: Группа I (гидрофобные боковые цепи): лейцин, метионин, аланин, валин, лейцин, изолейцин; Группа II (нейтральные гидрофильные боковые цепи): цистеин, серии, треонин; Группа III (кислотные боковые цепи): аспарагиновая кислота, глютаминовая кислота; Группа IV (основные боковые цепи): аспарагин, глютамин, гистидин, лизин, аргинин; Группа V (остатки, влияющие на ориентацию цепи): глицин, пролин; и Группа VI (ароматические боковые цепи): триптофан, тирозин, фенилаланин. Консервативные замены включают замены аминокислот на аминокислоты того же класса. Неконсервативные замены заключаются в замене члена одного из этих классов на член другого класса.
Предпочтительно, гуманизированные иммуноглобулины или антитела связывают антиген с аффинностью в пределах аффинности негуманизированного антитела, умноженной на коэффициент три, четыре или пять. Например, если негуманизированное антитело обладает аффинностью, равной 10-9 М, гуманизированные антитела будут обладать аффинностью связывания, равной по меньшей мере 3×10-8 М, 4×10-8 М, 5×10-8 М или 10-9 М. Говорят, что цепь иммуноглобулина "направляет связывание антигена", если она придает интактному иммоноглобулину или антителу (или его фрагменту, связывающему антиген) свойство специфичного связывания или аффинность связывания. Говорят, что мутация (например, обратная мутация) существенно влияет на способность тяжелой или легкой цепи направлять связывание антигена, если изменяет (например, снижает) аффинность связывания интактного иммуноглобулина или антитела (или его фрагмента, связывающего антиген), содержащего указанную боковую цепь, по меньшей мере на один порядок величины по сравнению с аффинностью антитела (или его фрагмента, связывающего антиген), содержащего эквивалентную цепь, в которой указанная мутация отсутствует. Мутация "не оказывает существенного влияния (например, снижения) на способность цепи направлять связывание антитела", если если она изменяет (например, снижает) аффинность связывания интактного иммуноглобулина или антитела (или его фрагмента, связывающего антиген), содержащего указанную цепь, только с коэффициентом два, три или четыре по сравнению с антителом (или его фрагментом, связывающим антиген), содержащим эквивалентную цепь без указанной мутации.
Термин "химерный иммуноглобулин" или антитело относится к иммуноглобулину или антителу, вариабельные области которых получены из одного вида, а константные области - из другого вида. Химерные иммуноглобулины или антитела можно получить, например, методами генетической инженерии, из сегментов генов иммуноглобулинов, принадлежащих разным видам. Не предполагается, что термины "гуманизированный иммуноглобулин" или "гуманизированное антитело" включают химерные иммуноглобулины или антитела, описанные выше. Хотя гуманизированные иммуноглобулины или антитела являются химерными по своему строению (т.е. включают области из более чем одного вида белка), они включают дополнительные элементы (т.е. вариабельные области, включающие остатки донорных CDR и остатки акцепторного каркаса), не обнаруживаемые в химерных иммуноглобулинах или антителах, определенных в настоящей заявке.
Такие химерные и гуманизированные моноклональные антитела можно получить при помощи известных в данной области технологий рекомбинантной ДНК, например, методами, описанными в Robinson et al., Международная заявка № PCT/US86/02269; Akira et al., Европейская заявка на патент 184,187; Taniguchi M., Европейская заявка на патент 171,496; Morrison et al. Европейская заявка на патент 173,494; Neuberger et al. Международная публикация РСТ № WO 86/01533; Cabilly et al. Патент США №4,816,567; Cabilly et al. Европейская завка на патент 125,023; Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139: 3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218; Nishimura et al. (1987) Cane. Res. 47: 999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314: 446-449; и Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559); Morrison S.L. (1985) Science 229: 1202-1207; Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; Winter Патент США 5,225,539; Jones et al. (1986) Nature 321: 552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; и Beidler et al. (1988). J. Immunol. 141: 4053-4060.
Антитела человека, полученные из трансгенных животных и фагового дисплея
В качестве альтернативы, в настоящее время возможно получать трансгенных животных (например, мышей), которые после иммунизации могут продуцировать полный набор антител человека при отсутствии продукции эндогенных иммуноглобулинов. Например, было описано, что гомозиготные делеции гена шарнирной области тяжелой цепи антигена (JH) в химерных или мутантных мышах зародышевой линии приводят к полному ингибированию продукции эндогенного антитела. Перенос набора генов зародышевой линии иммуноглобулинов человека в 5 таких мутантных мышей зародышевой линии приводит к продуцированию антител человека после сенсибилизации антигеном. См., например, патенты США под номерами 6,150,584, 6,114,598 и 5,770,429.
Полностью человеческие антитела можно получить из библиотек фагового дисплея (Hoogenboom et al., J. Mol. BioL, 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)). Химерные поликлональные антитела можно также получить из библиотек фагового дисплея (Buechler et al., Патент США №6,420,113).
Биспецифические антитела и конъюгаты антител
Биспецифические антитела (BsAb) - это антитела, которые обладают специфичностью к по меньшей мере двум различным эпитопам. Такие антитела можно получить из полноразмерных антител или фрагментов антител (например, биспецифические антитела F(ab)′2). Способы получения биспецифических антител известны в данной области. Традиционное получение полноразмерных антител основано на одновременной экспрессии двух пар тяжелая цепь-легкая цепь, где две цепи обладают разными специфичностями (Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1983)). Благодаря случайному набору тяжелых и легких цепей иммуноглобулина эти гибридомы (квадромы) продуцируют возможную смесь различных молекул антител (см., WO 93/08829 и в Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991)).
Биспецифические антитела также включают также поперечно-сшитые антитела или "гетероконъюгаты" антител (гетероконъюгированные антитела). Например, одно из антител в гетероконъюгате может быть соединено с авидином, другое - с биотином или другим полезным элементом. Гетероконъюгаты антител могут быть получены любыми традиционными методами поперечной сшивки. Подходящие реагенты для поперечного сшивания хорошо известны в данной области и описаны в патенте США № 4,676,980, как и ряд методик поперечной сшивки.
В еще одном варианте реализации антитело может быть конъюгировано, химическим или генетическим способом, с каким-либо полезным элементом, таким как реактивный, детектиуемый или функциональный фрагмент, например, с иммунотоксином, в результате чего образуется конъюгат антитела. Такие полезные элементы включают, например, иммунотоксины, агенты химиотерапии и радиоизотопы, каждый из которых хорошо известен в данной области.
Гибридные белки, содержащие антитело
Белок, содержащий область Fc, применяемый в данном изобретении, может представлять собой гибридный белок, который содержит по меньшей мере часть Fc антитела, присоединенную к белку или полипептиду, не являющемуся антителу. Например, область Fc можно присоединить к лиганду рецептора таким образом, чтобы образовался растворимый гибридный белок, который может связывать данный рецептор и обладает связанными с Fc функциями (такими, как стабильность в сыворотке, связывание с рецептором Fc и т.п.). В качестве альтернативы область Fc можно присоединить к внеклеточному домену рецептора таким образом, чтобы образовался растворимый гибридный белок, способный связывать лиганд этого рецептора (и, таким образом, конкурировать с нативным рецептором) и обладает связанными с Fc функциями. Неограничивающий пример такого гибридного белка Fc представляет собой этанерцепт (Embrel®), который содержит внеклеточный лигандсвязывающий домен рецептора ФНОα человека, присоединенный к фрагменту Fc иммуноглобулина IgG1 человека. Гибридные белки антитела (которые в данной области называют также гибридными белками Fc или гибридными белками Ig) можно получить при помощи стандартных технологий рекомбинантной ДНК, они также описаны в данной области, см., например Патент США № 5,116,964, Патент США № 5,225,538, Патент США № 5,336,603 и Патент США № 5,428,130, каждый из которых выданы Capon et al.
AHTH-IL-13 антитела
В предпочтительном способе реализации белок, содержащий область Fc, который можно очистить согласно настоящему изобретению, представляет собой анти-IL-13 антитело. Анти-IL-13 антитела описаны в предварительных заявках на патент США под номерами 60/578,473 (подана 9 июня 2004) и 60/581,375, (подана 22 июня 2004), каждая из которых озаглавлена "Antibodies against human IL-13 and uses thereoF" (Антитела к IL-13 человека и способы их применения). Содержание этих заявок включено в настоящую заявку посредством ссылки. Предпочтительное анти-IL-13 антитело может также называться в настоящей заявке "IMA".
Антитела, которые способны связывать, нейтрализовать и/или ингибировать один или более связанных с IL-13 видов активности, в частности сигнальную активность IL-13, полезны в лечении опосредуемых IL-13 заболеваний, таких как аллергическая астма и связанные с астмой патологии, такие как фиброзы, эозинофилия и продуцирование слизи.
Вещества, связывающие IL-13, которые являются антагонистами IL-13, включая антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают IL-13, в частности IL-13 человека, с высокой эффективностью и специфичностью. Антитела и их антигенсвязывающие фрагменты согласно настоящему описанию также называются "анти-IL-13 антителами" и "их фрагментами" соответственно. В одном варианте реализации анти-IL-13 антитело или его фрагмент снижает, нейтрализует и/или противодействует по меньшей мере одному виду активности, связанной с IL-13. Например, анти-IL-13 антитело или его фрагмент может связывать IL-13, например эпитоп IL-13, и нарушать взаимодействие, например связывание, между IL-13 и комплексом рецептора к IL-13 ("IL-13R"), например комплексом, содержащим рецептор IL-13 ("IL-13Rα1") и альфа-цепь рецептора к интерлейкину-4 ("IL-4Rα"), или его субъединицу (например, отдельно IL-13Rα1 или IL-4Rα). Таким образом, описанные в настоящей заявке антитела или их фрагменты можно применять для нарушения (например, чтобы ингибировать, блокировать или другим образом снижать) взаимодействия, например связывания между IL-13 и комплексом рецептора IL-13 или его субъединицы и, следовательно, нарушения образования сигнального комплекса.
Другие предпочтительные белки, содержащие область Fc
В другом предпочтительном варианте реализации белок, содержащий область Fc, для очистки согласно настоящему изобретению представляет собой анти-Аβ антитело. Анти-Аβ антитела описаны в Публикации РСТ № WO 2002/46237 и Публикации США № 20050118651, каждая из которых имеет название "Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide" (Гуманизированные антитела, которые распознают бета-амилоидный пептид). Содержание этих заявок включено в настоящую заявку посредством ссылки. Предпочтительные анти-Аβ антитела в настоящем описании называются "ААВ" либо "12А11".
Другие предпочтительные белки, содержащие область Fc, включают антитела, одобренные для применения в качестве терапевтических средств для людей. Такие антитела включают антитела, которые связывают антигены клеток опухолей, антитела, которые связывают какой-либо цитокин, антитела, которые связывают рецептор к цитокину, и антитела, которые связывают один из белков адгезии. Соответственно, в различных вариантах реализации белок, содержащий область Fc, может представлять собой антитело или гибридный белок, содержащий Fc, которые связывают антиген, выбранный из группы, состоящей из CD3 (например, ОКТ3), CD52 (например, alemtuzumab (алемтузумаб); Campath®), VEGF (например, bevacizumab (бевацизумаб); Avastin®), EGFR - рецептор эпидермального фактора роста (например, cetuximab (цетуксимаб); Erbitux®), CD33 (например, gemtuzumab (гемтузумаб); Mylotarg®), CD20 (например, rituximab (ретуксимаб); Rituxan®; tositumomab (тозитумомаб); Bexxar®; ibritumomab (ибритумомаб); Zevalin®), HER-2 (например, trastuzumab (трастузумаб); Herceptin®), ФНОα (например, adalimumab (адалимумаб); Humira®, infliximab (инфликсимаб); Remicade®; etanercept (этанерцепт); Embrel®), CD25 (например, daclizumab (даклзумаб); Zenapax®; basiliximab (базиликсимаб); Simulect®), PCB (например, palivizumab (павилизумаб); Synagis®), IgE (например, omalizumab (омализумаб); Xolair®), gp IIb/IIIa (например, abciximab (абциксимаб); Reopro®), CD11a (например, efalizumab (эфализумаб); Raptiva®) и интегрин α4 (например, natalizumab (натализумаб); Tysabri®).
Очевидно, что все описанные выше молекулы полипептидов, отдельно или в комбинации, подходят для получения белков, содержащих область Fc, согласно настоящему изобретению.
Различные аспекты и варианты реализации настоящего изобретения ниже описаны при помощи следующих примеров. Данные примеры приведены только для иллюстрации, а не в качестве ограничения.
ПРИМЕРЫ
Нижеследующие примеры приведены только в иллюстративных целях. В примерах использованы три различных моноклональных антитела (обозначенные ААВ, 12А11 и IMA). Описано восемь независимых экспериментов, каждый из которых представляет комбинацию антитела и удаления примесей.
Материалы и методы
В целом, реализация настоящего изобретения включает, если не указано другое, обычные методики химии, молекулярной биологии, технологии рекомбинантной ДНК, иммунологии (в частности, например, технологии иммуноглобулинов) и стандартные методики электрофореза. См., например, Sambrook, Fritsch, Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., C.S.H.L. Press, Pub. (1999); Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992). Bousse et al., Protein Sizing on a Microchip, Anal. Chem. 73, 1207-1212 (2001); Knapp et al., Commercialized and Emerging Lab-on-a-Chip Applications; In: Proceedings of the µTAS 2001 Symposium, Ramsey, J.M. & van den Berg, A., 7-10 (2001); и Mhatre et al., Strategies for locating disulfide bonds in a monoclonal antibody via mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom, 13 (24) 2503-2510 (1999).
Получение целевого белка
Целевые белки, содержащие Fc, можно получить стандартными методами экспрессии, например с помощью линий рекомбинантных клеток, выращенных в суспензионной культуре. Кондиционированная среда, содержащая представляющий интерес белок, содержащий Fc, получают в промышленном биореакторе. Полученный в результате продукт собирают и очищают при помощи этапа очистки любым подходящим методом, таким как, например, один из следующего: микрофильтрация и микрофильтрация через фильтр с отверстиями 0,22 мкм или центрифугирование, фильтрация через т.н. фильтрующий слой с фильтрация через фильтр с отверстиями 0,22.
Очистка целевого белка
Приведенный здесь пример очистки моноклональных антител (ААВ, 12А11 и IMA) состоит в захвате целевой молекулы белка методом хроматографии с белком А. Для этого можно применять колонку rmp Protein A Sepharose™ Fast Flow, Protein A Sepharose™ Fast Flow или MabSelect Protein А. Смолу затем промывают, следуя описанию для каждого эксперимента, продукт элюируют и определяют уровень чистоты.
Анализ целевого белка
Для определения количества IRT в образцах моноклональных FFD применяли обращенно-фазовую ВЭЖХ (ОФ-ВЭЖХ), а для определения уровней IRT для моноклонального тела IMA применяли ВЭЖХ с белком А. Для определения процентного содержания мономерного белка (мономерный IgG), высокомолекулярных (HMW) и низкомолекулярных (LMV) разновидностей использовали гель-фильтрацию (гель-ВЭЖХ). Для определения относительного количества разновидностей с пониженным содержанием дисульфидных связей (UDB) в образце применяли гель-ВЭЖХ в денатурирующих условиях. Уровни НСР в анализируемом образце определяли путем твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).
Аналитические тесты: IRT и UDB
Обращенно-фазовая ВЭЖХ (Анализ IRT в ААВ IRT)
ОФ-ВЭЖХ проводили следующим образом. Путем инкубации при 40°С в течение 60 мин в присутствии 2,5 мМ DTT (дитиотреитол) осуществляли восстановление дисульфидных групп. Путем инкубирования при комнатной температуре в присутствии 5,5 мМ йодоуксусной кислоты осуществляли алкилирование. После восстановления и алкилирования образцы гасили 5 мклитрами 1 М DTT. Предел количественного определения для этого анализа составляет 0,5%. Приблизительно 40 мкг каждого восстановленного, алкилированного образца нагружали на колонку для ОФ-ВЭЖХ POROS R1/H и анализировали в течение 70 мин в следующих условиях:
Колонка: Poros R1/H для ОФ-ВЭЖХ
Температура колонки: 50°С;
Подвижная фаза А: 0,1% TFA (трифторуксусная кислота, масс./об.) в воде;
Подвижная фаза В: 0,1% TFA (масс./об.) в 95% ацетонитриле;
Расход: 1.0 мл/мин
Детекция: 217 нм
Время анализа: 70 минут
Вводимые пробы: Трипликаты по 40 мг каждый
Продолжительности градиентов приведены в Таблице 1:
Таблица 1 | ||
Продолжительности градиентов для метода ОФ-ВЭЖХ | ||
Продолжительность градиента | %А | %В |
0-1 | 95 | 5 |
2 | 70 | 30 |
54 | 60 | 40 |
55.1-70 | 95 | 5 |
ВЭЖХ с белком А (Анализ IRT в IMA)
ВЭЖХ с белком А проводили следующим образом. Пробы общим объемом 100 мкг на пробу вводили в колонку POROS Pro А при комнатной температуре и проводили анализ в течение 35 минут в следующих условиях:
Колонка: Poros Pro A 4.6×50 мм
Температура колонки: окружающей среды
Подвижная фаза А: 50 мМ формат аммония, рН 6,0
Подвижная фаза В: 10 мМ формат аммония, 0,8% муравьиная кислота
Расход: 2.0 мл/мин
Детектирование: 280 нм
Время анализа: 35 минут
Вводимые пробы: Трипликаты по 100 мкг каждый
Продолжительности градиентов приведены в Таблице 2.
Таблица 2 | ||
Продолжительности градиентов для клолонки с белком А | ||
Продолжительность градиента | %А | %В |
0-5 | 100 | 0 |
25-30 | 55 | 45 |
30,5-35 | 100 | 0 |
Гель-ВЭЖХ в денатурирующих условиях (Анализ UDB в ААВ)
Гель-ВЭЖХ в денатурирующих условиях проводили следующим образом. Для предварительной обработки образцов для анализа методом гель-хроматографии (SEC) используют смесь реагент/образец с конечными концентрациями, равными 200 мкг/мл белка, 3 М хлорида гуанидина и 100 мМ Tris с рН 7,4. Образцы прогревали при 80°С в течение 20 минут, одновременно перемешивая переворачиванием. В этом тесте применяли два контроля, которые позволяли определить пределы уровней UDB. В качестве контролей применяли внутренние стандарты с высоким и низким уровнями UDB. Условия хроматографии/теста были следующими:
Колонка: Tosoh BioSep G 3000 SWxl
Температура колонки: Окружающей среды
Подвижная фаза: 3 М гидрохлорид гуанидина, 25 мМ NaPO4, рН 6,8
Градиент: Изократический
Расход: 0.5 мл/мин
Детектирование: 280 нм
Время анализа: 50 минут
Вводимые пробы: Триплакаты по 50 мкл (10 мкг)
ПРИМЕР 1: Сравнение промывочных буферов для удаления IRT (ААВ)
В этом примере неочищенный раствор, содержащий антитело ААВ, очищали путем адсорбции на колонке с Белком А, после которой следовала первая промывка промывочным буфером, содержащим либо CaCl2, MgCl2, NaCl, либо пропиленгликоль.
Небольшие количества культуральной среды, содержащей антитело, очищали на колонке rmp Protein A Sepharose™ FF (8,9 мл), соединенной с хроматографической системой ÄКТА FPLC производства GE Healthcare. Для всех этапов хроматографии на колонке rmp Protein A Sepharose™ FF, описанной в эксперименте 1, использовали следующие условия (исключения указаны в описании каждого эксперимента).
Размеры колонки - 1.0 см × 11.4 см
Рабочий расход - 150 см/ч
Раствор для уравновешивания 1 - 20 мМ Tris, 150 мМ NaCl, рН 7,5 (5 объемов колонки)
Смыв - 20 мМ Tris, 150 мМ NaCl, рН 7,5 (1 объем колонки)
Раствор для промывки 1 - Переменный (см. Таблицу 3) за исключением прогона #1, в котором отсутствует Раствор для Промывки 1
Раствор для промывки 2 - 20 мМ Tris, 1,0 М NaCl, pH 7,5 (объемов колонки)
Раствор для промывки 3 - 10 мМ Tris, 75 мМ NaCl, pH 7,5 (7 объемов колонки)
Жидкость для элюции - 50 мМ глицин, 75 мМ NaCl, pH 3,1 (6 объемов колонки)
Фракция 1 - 20 мМ цитрат натрия, pH 2,7 (5 объемов колонки)
Фракция 2 - 6 М гуанидин HCl (2 объемов колонки)
Жидкость для очистки - 20 мМ Tris, 150 мМ NaCl, pH 7,5 (5 объемов колонки)
Жидкость для хранения - 16% Этанол (5 объемов колонки)
Температура анализа: 2-8°С
Колонку rmp Protein A Sepahrose™ FF уравновешивали 5 объемами колонки 20 мМ Tris, 150 мМ NaCl, pH 7,5. В колонку загружали приблизительно 10 мг продукта/мл смолы. После загрузки колонку промывали 1 объемом колонки буферного раствора для уравновешивания и 5 объемами колонки раствора для промывки 1. Все протестированные растворы для промывки 1 описаны в Таблице 3. Раствор для промывки 1 использовали во всех прогонах за исключением прогона #1. После раствора для промывки 1 колонку промывали 5 объемами колонки 20 мМ Tris, 1,0 М NaCl, pH 7,5 и 7 объемами колонки 10 мМ Tris, 75 мМ NaCl, pH 7,5. Моноклональное тело элюировали из колонки смесью 50 мМ глицина, 75 мМ NaCl, pH 3,1. Затем объединенный продукт нейтрализовали до значения 7,9-8,1 2 М раствором Tris с pH 8,5. Затем колонки очищали, промывали и хранили. В Таблице 3 перечислены уровни разновидностей IRT и LMW, присутствующих в объединенных продуктах разных прогонов.
Таблица 3 | |||
Значения IRT и LMW для различных буферных растворов для Промывки 1 | |||
Прогон # | Условия | % LMW | % IRT |
1 | Контроль (Без Промывки 1) | 4,4 | 2,5 |
2 | 20% пропиленгликоля, рН 7,5 | 4,7 | 2,5 |
3 | 50 мМ Tris, 2,0 М хлорид магния, рН 7,5 | 1,6 | 1,5 |
4 | 50 мМ Tris, 2,5 М хлорид магния, рН 7,5 | 1,5 | 1,3 |
5 | 50 мМ Acetate, 2,0 М хлорид магния, рН 4,5 | 0,9 | 0,8 |
6 | 50 мМ Tris, 4,0 М хлорид натрия, рН 7,5 | 4,4 | 2,5 |
7 | 50 мМ Tris, 2,0 М хлорид кальция, рН 7,5 | 1,8 | 1,4 |
8 | 50 мМ Tris, 2,5 М хлорид кальция, рН 7,5 | 0,8 | 0,8 |
Результаты показали, что промывки с хлоридом магния и хлоридом кальция снижают уровни IRT и LMW, а промывки с хлоридом натрия и пропиленгликолем не снижают уровни IRT и LMW.
ПРИМЕР 2: Хроматография с Белком А с использованием промывки с CaCl2 для удаления IRT
В этом примере проводили очистку большего количества антитела путем хроматографии с белком А с применением промывки с CaCl2 для удаления IRT.
Экспериментальное количество культуры, содержащей моноклональное антитело, очищали на колонке с Белком A MabSelect Protein A (2,4 L), присоединенной к хроматографической системе Millipore K-Prime 400. Два прогона на MabSelect осуществляли, как описано ниже.
Размеры колонки - 13 см × 18 см
Рабочий расход - 150 см/ч, 300 см/ч
Раствор для уравновешивания 1 - 20 мМ Tris, 150 мМ NaCl, pH 7,5 (5 объемов колонки)
Смыв - 20 мМ Tris, 150 мМ NaCl, рН 7,5 (2 объемов колонки)
Раствор для промывки 1 - 50 мМ Tris, 2 М CaCl, рН 7,5 для прогона #1 и без Промывки 1 для прогона #2
Раствор для промывки 2 - 20 мМ Tris, 1,0 М NaCl, рН 7,5 (5 объемов колонки)
Раствор для промывки 3 - 10 мМ Tris, 75 мМ NaCl, рН 7,5 (5 объемов колонки)
Жидкость для элюции - 50 мМ глицина, 25 мМ NaCl, рН 3,1 (6 объемов колонки)
Жидкость для очистки 1 - 50 мМ глицина, 0,5 М NaCl, рН 2,7 (5 объемов колонки)
Жидкость для очистки 2 - 6 М гуанидина HCl (2 объема колонки)
Промывка для удаления содержимого - 20 мМ Tris, 150 мМ NaCl, рН 7,5 (5 объемов колонки)
Хранение - 16% этанола (5 объемов колонки)
Температура прогона: 2-8°С
Колонку MabSelect Protein А уравновешивали 5 объемами колонки 20 мМ раствора Tris, 150 мМ NaCl с рН 7,5. Затем на колонку загружали приблизительно 10 мг продукта/мл смолы. За этим следовала промывка 2 объемами колонки буферного Раствора для уравновешивания и 5 объемами колонки Раствора для Промывки 1. Этот раствор представлял собой раствор для Промывки 1, состоящий из 50 мМ Tris, 2,0 М CaCl2 и имеющий рН 7,5 для прогона 1, для прогона 2 его полностью исключали. За промывкой 1 следовала промывка 5 объемами колонки смесью 50 мМ Tris, 1,0 М NaCl с рН 7,5 и 5 объемами колонки смеси 10 мМ Tris, 75 мМ NaCl с рН 7,5. Моноклональное антитело элюировали из колонки MabSelect Protein А смесью с 50 мМ глицина, 25 мМ NaCl, рН 3,1, затем объединенные продукты нейтрализовали до значения 7,8-8,2 раствором с 2 М Tris и рН 8,5. Затем колонки очищали, промывали и хранили. Результаты показаны в Таблице 4.
Таблица 4 | ||
% Уровни IRT в прогонах с экспериментальными с промывкой хлоридом кальция и без нее | ||
Прогон # | Буферный Раствор для Промывки 1 | % IRT |
1 | 50 мМ Tris, 2 М CaCl2, рН 7,5 | 0,8 |
2 | Контроль (Нет) | 1,9 |
Результаты показывают, что при экспериментальных количествах промывка хлоридом кальция приводила к удалению IRT из объединенных продуктов.
Пример 3: Удаление IRT (IMA)
В этом примере для очистки небольших количеств с применением промывки CaCl2 применяли моноклональное антитело, отличное от описанного в примере 1 (IMA).
Небольшое количество культуры, содержащей другое моноклональное антитело (IMA), очищали на колонке с Белком A MabSelect Protein A (17,3 мл), присоединенной к хроматографической системе АКТА Explorer производства GE Healthcare. Прогон осуществляли следующим образом.
Размеры колонки - 1.1 см × 18.2 см (17.3 мл)
Рабочий расход - 300 см/ч
Раствор для уравновешивания 1 - 20 мМ Tris, 150 мМ NaCl, pH 7,5 (5.1 объемов колонки)
Раствор для промывки 1 - 20 мМ Tris, 1 M NaCl, pH 7,5 (5 объемов колонки)
Раствор для промывки 2 - 50 мМ ацетата натрия, 0,6 M CaCl2, pH 5,0 (5 объемов колонки)
Раствор для промывки 3 - 50 мМ Tris, 5 мМ NaCl, pH 7,5 (3 объемов колонки) Раствор для промывки 4 - 10 мМ Tris, 5 мМ NaCl, pH 7,5 (5 объемов колонки)
Жидкость для элюции - 50 мМ глицина, 5 мМ NaCl, pH 3,0 (5 объемов колонки)
Жидкость для очистки - 6 М гуанидина HCl (5 объемов колонки)
Жидкость для очистки - 20 мМ Tris, 150 мМ NaCl, pH 7,5 (6 объемов колонки)
Жидкость для хранения - 16% Этанол (5 объемов колонки)
Температура прогона: 18-24°С
Колонку MabSelect protein А уравновешивали 5 объемами колонки раствора с 20 мМ Tris, 1 M NaCl и pH 7,5. На колонку загружали приблизительно 45 мг продукта/мл смолы. Затем колонку промывали следующим образом: 5 объемов колонки раствора с 20 мМ Tris, 1,0 М NaCl, pH 7,5, 5 объемами колонки раствор с 50 мМ ацетата натрия, 0,6 М CaCl2, pH 5.0, 3 объемами колонки раствора с 50 мМ Tris, 5 мМ NaCl, pH 7,5 и 5 объемами колонки раствора с 10 мМ Tris, 5 мМ NaCl, pH 7,5. Продукт из колонки MabSelect с белком А элюировали раствором, содержащим 50 мМ глицина, 5 мМ NaCl с pH 3,0. Объединенные продукты затем нейтрализовали до 7,7 раствором с 2 М Tris и pH 8,0. Затем из колонку очищали, промывали и хранили. Результаты показаны в Таблице 5, в которой приведены уровни разновидностей IRT в загрузке и пике.
Таблица 5 | |
% IRT в загрузке и пике в прогоне с промывкой CaCl2 | |
% IRT в загрузке | % IRT в пике |
5,8 | 1,1 |
Результаты показывают, что промывка 0,6 М CaCl2 обеспечила 5-кратное снижение уровня IRT.
ПРИМЕР 4: Удаление белков клеток-хозяев (IMA)
В этом примере исследовали способность промывочной жидкости с In CaCl2 удалять белок клеток-хозяев (НСР) из препарата, содержащего моноклональное антитело IMA.
Небольшое количество культуры, содержащей другое моноклональное антитело (IMA), очищали на колонке с Белком A MabSelect Protein A (19 мл), присоединенной к хроматографической системе ÄКТА FPLC производства GE Healthcare. Два прогона на 20 MabSelect осуществляли, как описано ниже.
Размеры колонки - 1.1 см × 20.0 см (19 мл)
Рабочий расход - 300 см/ч
Раствор для уравновешивания 1 - 20 мМ Tris, 150 мМ NaCl, pH 7,5 (5,0 объемов колонки)
Раствор для промывки 1 - 20 мМ Tris, 1 М NaCl, pH 7,5 (5 объемов колонки)
Раствор для промывки 2 - 50 мМ Sodium Acetate, 0,6 М CaCl2, pH 5,0 (5 объемов колонки; только для прогона 2)
Раствор для промывки 3 - 50 мМ Tris, 5 мМ NaCl, pH 7,5 (2 объемов колонки)
Раствор для промывки 4 - 10 мМ Tris, 5 мМ NaCl, pH 7,5 (5 объемов колонки)
Элюция - 50 мМ Глицин, 5 мМ NaCl, pH 3.0 (5 объемов колонки)
Жидкость для очистки - 6 М Гуанидин HCl (5 объемов колонки)
Жидкость для очистки - 20 мМ Tris, 150 мМ NaCl, pH 7,5 (6 объемов колонки)
Хранение - 16% Этанол (5 объемов колонки)
Температура прогона: 18-24°С
Колонку MabSelect с белком А уравновешивали объемами колонки 20 мМ Tris, 150 мМ NaCl с pH 7,5. На колонку загружали приблизительно 45 мг продукта/мл смолы. Затем колонку промывали 5 объемами колонки 20 мМ Tris, 1,0 М NaCl, pH 7,5; для прогона 2 применяли дополнительную промывку 5 объемами колонки 50 мМ ацетата натрия, 0,6 М CaCl2, pH 5,0. Перед элюцией колонку также промывали 5 объемами колонки 50 мМ Tris, 5 мМ NaCl, pH 7,5 и 5 объемами колонки 10 мМ Tris, 5 мМ NaCl, pH 7,5. Продукт элюировали с колонки MabSelect с белком А составом: 50 мМ Глицин, 5 мМ NaCl, pH 3,0. Затем объединенный продукт нейтрализовали до pH 7,7 2 М буфером Tris с pH 8,0. Затем колонку очищали, промывали и хранили. Результаты показаны в Таблице 6, в который приведены уровни видов НСР в контрольном прогоне и в прогонах с использованием CaCl2.
Таблица 6 | ||
Удаление НСР с промывкой CaCl2 и без нее | ||
Прогон # | Параметры Раствора для Промывки 2 Condition | НСР (РРМ) |
1 | Нет (Контроль) | 6,124 |
2 | 50 мМ Ацетат натрия, 0,6 М CaCl2, pH 5,0 | 2,295 |
Результаты показывают, что промывка CaCl2 обеспечивала в 3 раза большее удаление НСР по сравнению с контрольным прогоном.
ПРИМЕР 5: Удаление ДНК (ААВ)
В этом примере исследовали способность промывки CaCl2 удалять ДНК клеток-хозяев из препарата, содержащего моноклональное антитело ААВ. Небольшое количество культуры, содержащей другое моноклональное антитело (IMA), очищали на колонке с Белком A MabSelect Protein A (19 мл), присоединенной к хроматографической системе ÄКТА FPLC производства GE Healthcare. Два прогона на MabSelect осуществляли, как описано ниже.
Размеры колонки - 1.1 см × 20 см
Рабочий расход - 300 см/ч
Раствор для уравновешивания 1 - 20 мМ Tris, 150 мМ NaCl, pH 7,5 (5 объемов колонки)
Смыв - 20 мМ Tris, 150 мМ NaCl, pH 7,5 (2 объемов колонки)
Раствор для Промывки 1 - 50 мМ Tris, 2.0 М CaCl2, pH 7,5 (5 объемов колонки) (только прогоны 2 и 3)
Раствор для Промывки 2 - 20 мМ Tris, 1,0 М NaCl, pH 7,5 (5 объемов колонки) (только прогоны 1 и 3)
Раствор для Промывки 3 - 10 мМ Tris, 75 мМ NaCl, pH 7,5 (7 объемов колонки)
Элюция - 50 мМ Глицин, 75 мМ NaCl, pH 3,0 (6 объемов колонки)
Жидкость для очистки - 50 мМ глицин, 0.5 М NaCl, pH 2.7 (5 объемов колонки)
Жидкость для очистки - 20 мМ Tris, 150 мМ NaCl, pH 7,5 (5 объемов колонки)
Хранение - 16% Этанол (5 объемов колонки)
Температура прогона: 18-24°С
Колонку MabSelect с Белком А уравновешивали 5 объемами колонки состава 20 мМ Tris, 150 мМ NaCl с pH 7,5. Затем на колонку нагружали приблизительно 40 продукта/мл смолы. За этим следовал смыв 2 объемами колонки буферного раствора для уравновешивания. В случае прогонов 2 и 3 за этим этапом следовала промывка 5 объемами колонки Раствора для Промывки 1. В случае прогонов 1 и 3 применяли 5 объемов колонки раствора для промывки 2. Во всех 3 прогонах применяли 7 объемов колонки раствора для промывки 3. Моноклональное антитело элюировали с колонки MabSelect с белком А с использованием состава 50 мМ глицин, 75 мМ NaCl, pH 3,0. Затем объединенный продукт нейтрализовали до 7,5-8,0 2 М буфером Tris с pH 8.5. Затем колонки очищали, промывали и хранили. Результаты показаны в Таблице 7.
Таблица 7 | ||||
Удаление ДНК промывкой с хлоридом кальция | ||||
Прогон # | Раствор для Промывки 1 | Раствор для Промывки 2 | ДНК (нг/мл) | ДНК (ppm) |
1 | Нет (контроль) | 20 мМ Tris, 1 М NaCl, pH 7,5 | 3,6 | 0,37 |
2 | 50 мМ Tris, 2 М CaCl2, рН 7,5 | Нет | 0,9 | 0,09 |
3 | 50 мМ Tris, 2 М CaCl2, рН 7,5 | 20 мМ Tris, 1 М NaCl, рН 7,5 | 0,3 | 0,03 |
Результаты показали, что добавление 50 мМ Tris, 2,0 М хлорида кальция (рН 7,5) обеспечивало в 10 раз большее снижение количеств ДНК, чем промывка с применением NaCl.
ПРИМЕР 6: Удаление белка клеток-хозяев (БКХ, НСР) (12А11)
В этом примере для прогонов этапа, в которых исследовали способность различных условий промывки удалять БКХ, применяли третье моноклональное антитело, 12А11.
Осуществляли высокопроизводительный скрининг (HTS) в формате 96-луночных фильтровальных планшетов с целью выявить наилучшие условия промывки для удаления таких примесей, как НСР, на этапе MabSelect. В этом скрининге варьировали носители промывки, концентрации носители и рН с целью определить их влияние на процесс, связанный с такими примесями, как НСР.
Смолу MabSelect уравновешивали при помощи 5 мМ Tris, содержащего 10 мМ NaCl, с рН 7,3 и нагружали колонку продуктом. Затем смолу извлекали, перемешивали и помещали по 50 мкг смолы в каждую из 96 лунок фильтрационного планшета. Смолу в каждой лунке тщательно уравновешивали в растворе 5 мМ Tris, 10 мМ NaCl (рН 7,3), а затем промывали каждую из них буферами для промывки, содержащими различные наполнители. Промывки проводили в 3 стадии с использованием 300 мкл промывочного буфера. После промывки носителем проводили 4 стадии второй промывки, на каждой из которых использовали 300 мкл буфера 5 мМ Tris, 10 мМ NaCl, рН 7,3. Затем продкт элюировали со смолы, используя 3 стадии элюции по 300 мкл. Элюаты со стадий 1 и 2 объединяли и анализировали на уровень БКХ.
Объем смолы - 50 мкл
Наполнители раствора для промывки - хлорид натрия, хлорид кальция, хлорид магния
Концентрации наполнителя - 100, 250, 500, 1000, 1500 и 2000 мМ
Н наполнителя- 6.0 & 7,5
Буферы для элюции - 25 мМ Hepes, 10 мМ NaCl, pH 3,0,
25 мМ Hepes, 100 мМ NaCl, pH 3,0,
50 мМ Глицин, 10 мМ NaCl, pH 3,0,
50 мМ Глицин, 100 мМ NaCl, pH 3,0 и
100 мМ Аргинин, 10 мМ NaCl, pH 3,0,
100 мМ Аргинин, 100 мМ NaCl, pH 3,0
Температура прогона: 18-24°С
Результаты показаны в Таблицах 8 и 9.
Таблица 8 | |||||||
Значения БКХ для смолы MabSelect, промытой хлоридом натрия, хлоридом кальция или хлоридом магния при pH 6,0 | |||||||
Буфер для Элюции | Концентраци я NaCl в р-ре для элюции (мМ) | Концентрация наполнителя в растворе для промывки (мМ) | Наполнитель раствора для промывки | ||||
NaCl | CaCl2 | MgCl2 | |||||
БКХ (ppm) | |||||||
50 мМ Глицин | 10 | 100 | 46,800 | 28,500 | 30,800 | ||
25 мМ HEPES | 250 | 35,300 | 17,900 | 22,000 | |||
100 мМ Аргинин | 500 | 40,900 | 17,700 | 18,400 | |||
50 мМ Глицин | 1000 | 34,300 | 12,600 | 14,200 | |||
25 мМ HEPES | 1500 | 37,000 | 7,800 | 10,700 | |||
100 мМ Аргинин | 2000 | 43,900 | 5,800 | 9,300 |
Таблица 9 | |||||||
Значения БКХ для смолы MabSelect, промытой хлоридом натрия, хлоридом кальция или хлоридом магния при рН 7,5 | |||||||
Буфер для Элюции | Концентр ация NaCl в р-ре для элюции (мМ) | Концентрация наполнителя в растворе для промывки (мМ) | Нполнитель раствора для промывки | ||||
NaCl | CaCl2 | MgCl2 | |||||
БКХ (ppm) | |||||||
50 мМ Глицин | 100 | 100 | 27,900 | 17,900 | 21,800 | ||
25 мМ HEPES | 250 | 24,700 | 16,600 | 18,200 | |||
100 мМ Аргинин | 500 | 26,500 | 14,000 | 17,300 | |||
50 мМ Глицин | 1000 | 30,100 | 14,500 | 17,700 | |||
25 мМ HEPES | 1500 | 35,300 | 12,000 | 12,500 | |||
100 мМ Аргинин | 2000 | 41,700 | 8,200 | 11,700 |
Результаты показывают, что и хлорид кальция, и хлорид магния снижают уровень БКХ в пиковом пуле MabSelect по сравнению с хлоридом натрия при рН 6,0 (Таблица 8) и рН 7,5 (Таблица 9). Снижение наблюдали при всех концентрациях наполнителей.
ПРИМЕР 7: Удаление разновидностей с пониженным содержанием дисульфидных связей (UDB)
В этом примере исследовали способность промывки CaCl2 удалять виды молекул с пониженным содержанием дисульфидных связей (UDB).
Два прогона с rmp Protein A Sepharose™ FF проводили, в целом, как описано в примере 1.
Размеры колонки - 1,0 см × 11,4 см
Рабочий расход - 150 см/ч
Раствор для уравновешивания 1 - 20 мМ Tris, 150 мМ NaCl, рН 7,5 (5 объемов колонки)
Смыв - 20 мМ Tris, 150 мМ NaCl, рН 7,5 (1 объем колонки)
Раствор для промывки 1 - 50 мМ Ацетат, 2.0 М CaCl2, рН 5,0, для прогона 1; для прогона 2 - нет
Раствор для промывки 2 - 20 мМ Tris, 1.0 М NaCl, рН 7,5 (5 объемов колонки)
Раствор для промывки 3 - 10 мМ Tris, 75 мМ NaCl, рН 7,5 (7 объемов колонки)
Жидкость для элюции - 50 мМ Глицин, 75 мМ NaCl, рН 3,1 (6 объемов колонки)
Жидкость для очистки 1 - 20 мМ цитрат натрия, рН 2,7 (5 объемов колонки)
Жидкость для очистки 2 - 6 М Гуанидин HCl (2 объема колонки)
Промывочная жидкость для очистки - 20 мМ Tris, 150 мМ NaCl, pH 7,5 (5 объемов колонки)
Жидкость для хранения - 16% Этанол (5 объемов колонки)
Температура прогона: 2-8°С
Колонки rmp Protein A Sepharose FF уравновешивали объемами колонки 20 мМ Tris, 150 мМ NaCl (рН 7,5). Затем на колонки загружали приблизительно 10 мг продукта/мл смолы. После этого следовал смыв 1 объемом колонки буферного раствора для уравновешивания, а затем промывка 5 объемами колонки раствора для Промывки 1. Указанный Раствор для Промывки 1 состоял из 50 мМ ацетата, 2,0 М CaCl2 (рН 5,0) для прогона 1, а для прогона 2 этот этап полностью опускали. После раствора для Промывки 1 применяли 5 объемов колонки 20 мМ Tris, 1,0 М NaCl (рН 7,5) и 7 объемов колонки 10 мМ Tris, 75 мМ NaCl (рН 7,5). Моноклональное антитело элюировали из колонки rmp Protein A Sepharose™ FF раствором: 50 мМ Глицин, 75 мМ NaCl (рН 3,1). Затем объединенный продукт нейтрализовали до 7,8-8,2 2 М буфером Tris с рН 8,5. Затем колонку очищали, промывали и хранили. Результаты показаны в Таблице 10.
Таблица 10 | ||
% UDB в образцах в кальциевой промывкой и без нее | ||
Прогон # | Образец | % UDB |
1 | 50 мМ Ацетат, 2,0 М CaCl2, рН 5.0 | 9,5 |
2 | Нет (Контроль) | 20,8 |
В прогоне с дополнительно промывкой с использованием 50 мМ Ацетата, 2,0 М CaCl2 (рН 5,0) наблюдали 2-кратное снижение уровней UDB.
ПРИМЕР 8: Удаление НСР и IRT промывками с применением других солей бивалентных катионов (ААВ)
В этом примере исследовали способность растворов для промывки, содержащих либо MnCl2, либо NiCl2, удалять примеси из препарата, содержащего моноклональное антитело ААВ.
Чтобы оценить влияние промывок с применением других солей бивалентных катионов, таких как MnCl2 и NiCl2, проводили две прогона. Также осуществляли два контрольных прогона - один с использованием промывки 50 мМ Tris, 1,0 М NaCl, pH 7,5 (не ожидалось удаления IRT или БКХ), а другой с использованием промывки 50 мМ Tris, 2,0 М CaCl2, pH 7,5.
Небольшое количество культуры, содержащей моноклональное антитело очищали на колонке с Белком A MabSelect Protein A (9 мл), присоединенной к хроматографической системе АКТА FPLC производства GE Healthcare. Прогоны на MabSelect осуществляли, как описано ниже. Как описано ниже, рабочие параметры были идентичными для всех четырех прогонов за исключением того, что состав Раствора для промывки 1 был переменным (Таблица 11).
Размеры колонки - 1,0 см × 11,5 см (9 мл)
Рабочий расход - 300 см/ч (Раствор для уравновешивания. Раствор для Промывки 2,
Растворы для элюции, восстановления, хранения)
Рабочий расход - 230 см/ч (Загрузка, Смыв, Раствор для Промывки 1)
Раствор для уравновешивания 1 - 50 мМ Tris, 150 мМ NaCl, pH 7,5 (5,0 объемов колонки)
Раствор для Промывки 1 - Переменный состав (Состав указан в Таблице 11)
Раствор для Промывки 2 - 50 мМ Tris, 10 мМ NaCl, pH 7,5 (5 объемов колонки)
Элюция - 50 мМ Глицин, 10 мМ NaCl, pH 3,0 (3 объемов колонки)
Восстановление - 50 мМ NaOH, 0,5 М Na2SO4 (5 объемов колонки)
Хранение - 16% Этанол, 50 мМ Tris, 150 мМ NaCl, pH 7,5 (5 объемов колонки)
Температура прогона: 18-24°С
Колонку MabSelect с Белком А уравновешивали 5 объемами колонки 50 мМ буфера Tris, 150 мМ NaCl (pH 7,5). На колонку загружали приблизительно 40 мг продукта/мл смолы. Избыток загрузки смывали из колонки 5 объемами колонки 50 мМ Tris, 150 мМ NaCl (pH 7,5). Затем колонку промывали одним из растоворов, описанных в Таблице 11. Перед элюированием колонку промывали 5 объемами колонки 50 мМ Tris, 10 мМ NaCl (pH 7,5). Продукт элюировали из колонки MabSelect с белком Protein A раствором, содержащим 50 мМ глицина, 10 мМ NaCl (pH 3,0). Объединенный продукт затем нейтрализовали до pH 8,0 2 М буфером Tris с pH 9,0. Затем колонку очищали 5 объемами колонки раствора, содержащего 50 мМ NaOH, 0,5 М Na2SO4, а затем хранили в 5 объемах колонки раствора, содержащего 16% этанола, 50 мМ Tris, 150 мМ NaCl (pH 7,5). Результаты показаны в Таблице 11 (удаление БКХ) и Таблице 12 (удаление IRT).
Таблица 11 | ||
Удаление БКХ различными растворами для промывки | ||
Прогон # | Параметры Раствора для Промывки 1 | НСР (РРМ) |
1 | 50 мМ Tris, 1.0 M NaCl, pH 7,5 | 17,600 |
2 | 50 мМ Ацетат натрия, 1,5 M MnCl2, pH 5.0* | 10,600 |
3 | 50 мМ Ацетат натрия, 1,5 M NiCl2, pH 5.0* | 4,700 |
4 | 50 мМ Tris, 2.0 M CaCl2, pH 7,5 | 6,500 |
* pH 5,0 выбрали из соображений растворимости MnCl2 и NiCl2 |
Таблица 12 | ||
Удаление IRT различными растворами для промывки | ||
Прогон # | Параметры Раствора для Промывки 1 | IRT (%) |
1 | 50 мМ Tris, 1,0 M NaCl, pH 7,5 | 2,78 |
2 | 50 мМ Ацетат натрия, 1,5 M MnCl2, pH 5.0* | 0,77 |
3 | 50 мМ Ацетата натрия, 1,5 M NiCl2, pH 5.0* | 0,47 |
4 | 50 мМ Tris, 2.0 M CaCl2, pH 7,5 | 0,87 |
*pH 5,0 выбрали из соображений растворимости МnСl2 и NiCl2 |
Таблица 11 демонстрирует, что уровни белков, присуствующие в прогонах, которые промывали растворами, содержащими соли бивалентных катионов, были в 1,5-3,5 раза ниже, чем в контроле (промывка 1,0 М NaCl). Таблица 12 демонстрирует, что прогоны, включавшие промывку растворами, содержащими соли бивалентных катионов, также обеспечивали удаление IRT > 3,5 раза по сравнению с прогнами, в которых использовали растворы для промывки, содержащие 1,0 М NaCl. Таким образом, эти результаты продемонстрировали, что промывки растворами, содержащими соли других бивалентных катионов (например, MnCl2 или NiCl2), отличающиеся от CaCl2, также эффективно удаляют примеси.
Эквиваленты
Специалисты в данной области легко увидят или смогут установить путем рутинных экспериментов многие эквиваленты конкретных вариантов реализации настоящего изобретения, описанных в данной заявке. Предполагается, что такие эквиваленты входят в область охвата прилагающейся формулы.
Claims (41)
1. Способ очистки белка, имеющего область Fc, от исходной жидкости, содержащей указанный белок и одну или более примесей, включающий следующие этапы:
адсорбция белка на веществе, связывающем Fc;
промывка вещества, связывающего Fc, буферным раствором, содержащим соль бивалентного катиона с целью удаления одной или более примесей, причем одна или более примесей выбраны из группы, состоящей из: разновидностей прочтения интронов (IRT), разновидностей с пониженным содержанием дисульфидных связей (UDB) и разновидностей с низкой молекулярной массой (LMW);
и выделение белка из вещества, связывающего Fc, в растворе для элюции.
адсорбция белка на веществе, связывающем Fc;
промывка вещества, связывающего Fc, буферным раствором, содержащим соль бивалентного катиона с целью удаления одной или более примесей, причем одна или более примесей выбраны из группы, состоящей из: разновидностей прочтения интронов (IRT), разновидностей с пониженным содержанием дисульфидных связей (UDB) и разновидностей с низкой молекулярной массой (LMW);
и выделение белка из вещества, связывающего Fc, в растворе для элюции.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что одна или более примесей представляют собой IRT.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что белок представляет собой антитело.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что антитело выбирают из группы, состоящей из: слитой конструкции, содержащей антитело, антитела мыши, химерного антитела, гуманизированного антитела и антитела человека.
5. Способ по п.3, отличающийся тем, что антитело представляет собой анти-IL-13 антитело.
6. Способ по п.3, отличающийся тем, что антитело связывает антиген, выбранный из группы, состоящей из: CD3, CD52, VEGF, EGFR, CD33, CD20, HER-2, ФНОα, CD25, RSV, IgE, gp IIb/IIIa, CD 11 а и интегрина α4.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что белок, содержащий область Fc, получают по технологии рекомбинантной ДНК.
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что белок, содержащий область Fc, получают по технологии рекомбинантной ДНК в клетке яичника китайского хомячка (СНО).
9. Способ по п.1, отличающийся тем, что вещество, связывающее Fc, содержит один или более из Белка А и Белка G.
10. Способ по п.1, отличающийся тем, что вещество, связывающее Fc, иммобилизовано на твердой фазе.
11. Способ по п.10, отличающийся тем, что твердая фаза содержит одно или более из следующего: гранула, гель, смола и частица.
12. Способ по п.1, отличающийся тем, что соль бивалентного катиона содержит хаотропную соль.
13. Способ по п.1, отличающийся тем, что соль бивалентного катиона выбирают из группы, состоящей из: CaCl2, MgCl2, NiCl2 и их смесей.
14. Способ по п.1, отличающийся тем, что буферный раствор, рН буферного раствора, содержащего соль бивалентного катиона, находится в диапазоне от приблизительно 4 до приблизительно 8.
15. Способ по п.1, отличающийся тем, что рН буферного раствора, содержащего соль бивалентного катиона, находится в диапазоне от приблизительно 7,3 до приблизительно 7,7.
16. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрация соли бивалентного катиона в буферном растворе находится в диапазоне от приблизительно 0,1 М до приблизительно 5 М.
17. Способ по п.16, отличающийся тем, что концентрация соли бивалентного катиона в буферном растворе находится в диапазоне от приблизительно 0,5 М до приблизительно 3 М.
18. Способ по п.17, отличающийся тем, что концентрация соли бивалентного катиона в буферном растворе находится в диапазоне от приблизительно 1,5 М до приблизительно 2,0 М.
19. Способ по п.1, отличающийся тем, что буферный раствор, содержащий соль бивалентного катиона, содержит по меньшей мере приблизительно 2 М MgCl2.
20. Способ по п.1, отличающийся тем, что буферный раствор, содержащий соль бивалентного катиона, содержит по меньшей мере приблизительно 2 М CaCl2.
21. Способ по п.1, отличающийся тем, что этапы адсорбции белка на веществе, связывающем Fc, и промывки вещества, связывающего Fc, проводят при температуре в диапазоне от приблизительно 2°С до приблизительно 24°С.
22. Способ по п.1, отличающийся тем, что одна или более примесей дополнительно включает одно или более из следующего: белок клетки-хозяина, ДНК клетки-хозяина, белок культуры клеток и их смеси.
23. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап выделения белка из вещества, связывающего Fc, включает элюирование белка при помощи буфера для элюции, рН которого находится в диапазоне от приблизительно 2,0 до приблизительно 6,5.
24. Способ по п.1, отличающийся тем, что способ включает дополнительно этап хроматографии, выбранный из группы, состоящей из: анионообменной хроматографии, катионообменной хроматографии, аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом и хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC).
25. Способ по п.1, отличающийся тем, что способ включает дополнительно этап очистки, выбранный из группы, состоящей из: гидроксиапатитной хроматографии, диализа, аффинной хроматографии, осаждения сульфатом аммония, осаждения этанолом, обращенно-фазовой ВЭЖХ (ОФ-ВЭЖХ) и хроматофокусирования.
26. Способ по п.1, отличающийся тем, что одна или более примесей включают один или более вариантов прочтения интронов белка, и уровень вариантов прочтения интронов в растворе для элюции, содержащем указанный белок по меньшей мере в 5 раз ниже, чем уровень вариантов прочтения интронов в исходной жидкости.
27. Способ по п.26, отличающийся тем, уровень вариантов прочтения интронов в растворе, содержащем белок, выделенный в растворе для элюции по меньшей мере в 10 раз ниже, чем уровень вариантов прочтения интронов в исходной жидкости.
28. Способ по п.1, отличающийся тем, что одна или более примесей включают один или более вариантов прочтения интронов белка, и варианты прочтения интронов в растворе для элюции составляют менее чем приблизительно 1% разновидностей указанного белка.
29. Способ по п.28, отличающийся тем, что варианты прочтения интронов в растворе для элюции составляют менее чем приблизительно 0,8% разновидностей указанного белка.
30. Способ по п.29, отличающийся тем, что варианты прочтения интронов в растворе для элюции составляют менее чем приблизительно 0,5% разновидностей указанного белка.
31. Способ по п.30, отличающийся тем, что варианты прочтения интронов в растворе для элюции составляют менее чем приблизительно 0,2% разновидностей указанного белка.
32. Способ по п.1, отличающийся тем, что одна или более примесей включают один или более разновидностей белка с низкой молекулярной массой, и разновидности с низкой молекулярной массой в растворе для элюции составляют менее чем приблизительно 1% разновидностей указанного белка.
33. Способ по п.32, отличающийся тем, что разновидности с низкой молекулярной массой в растворе для элюции составляют менее чем приблизительно 0,8% разновидностей указанного белка.
34. Способ по п.33, отличающийся тем, что разновидности с низкой молекулярной массой в растворе для элюции составляют менее чем приблизительно 0,5% разновидностей указанного белка.
35. Способ по п.34, отличающийся тем, что разновидности с низкой молекулярной массой в растворе для элюции составляют менее чем приблизительно 0,2% разновидностей указанного белка.
36. Способ по п.1, отличающийся тем, что одна или более примесей включают варианты белка с пониженным содержанием дисульфидных связей и варианты с пониженным содержанием дисульфидных связей в растворе для элюции составляют не менее чем приблизительно 15% разновидностей указанного белка.
37. Способ по п.36, отличающийся тем, что варианты с пониженным содержанием дисульфидных связей в растворе для элюции составляют менее чем приблизительно 10% разновидностей указанного белка.
38. Способ по п.37, отличающийся тем, что варианты с пониженным содержанием дисульфидных связей в растворе для элюции составляют менее чем приблизительно 5% разновидностей указанного белка.
39. Способ по п.38, отличающийся тем, что варианты с пониженным содержанием дисульфидных связей в растворе для элюции составляют менее чем приблизительно 2% разновидностей указанного белка.
40. Способ по любому из пп.1-18, 21-39, отличающийся тем, что соль бивалентного катиона представляет собой CaCl2.
41. Способ по любому из пп.1-18, 21-39, отличающийся тем, что белок, содержащий область Fc, очищают элюированием буфером элюции, рН которого лежит в диапазоне от 2,0 до 4,0.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US69182105P | 2005-06-17 | 2005-06-17 | |
US60/691,821 | 2005-06-17 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2007143162A RU2007143162A (ru) | 2009-08-10 |
RU2415865C2 true RU2415865C2 (ru) | 2011-04-10 |
Family
ID=37433887
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2007143162/10A RU2415865C2 (ru) | 2005-06-17 | 2006-06-16 | СПОСОБЫ ОЧИСТКИ БЕЛКОВ, СОДЕРЖАЩИХ ОБЛАСТЬ Fc |
Country Status (26)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US7820799B2 (ru) |
EP (3) | EP1896504B1 (ru) |
JP (2) | JP5270337B2 (ru) |
KR (2) | KR101247836B1 (ru) |
CN (3) | CN101365722A (ru) |
AR (2) | AR053632A1 (ru) |
AU (2) | AU2006259298B2 (ru) |
BR (2) | BRPI0611600B8 (ru) |
CA (2) | CA2611815A1 (ru) |
CR (2) | CR9582A (ru) |
EA (2) | EA015148B1 (ru) |
EC (1) | ECSP088086A (ru) |
ES (2) | ES2405079T3 (ru) |
HK (1) | HK1117174A1 (ru) |
IL (2) | IL187642A (ru) |
MA (1) | MA29609B1 (ru) |
MX (2) | MX2007015952A (ru) |
MY (1) | MY144484A (ru) |
NI (1) | NI200700329A (ru) |
NO (2) | NO20076082L (ru) |
NZ (1) | NZ565044A (ru) |
RU (1) | RU2415865C2 (ru) |
SG (1) | SG162806A1 (ru) |
TW (2) | TW200740839A (ru) |
WO (2) | WO2006138737A2 (ru) |
ZA (2) | ZA200710330B (ru) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2644680C1 (ru) * | 2011-06-08 | 2018-02-13 | Емд Миллипор Корпорэйшн | Хроматографические матрицы, содержащие новые лиганды на основе белка a staphylococcus aureus |
US9920112B2 (en) | 2008-08-11 | 2018-03-20 | Emd Millipore Corporation | Immunoglobulin-binding proteins with improved specificity |
US10072050B2 (en) | 2008-12-24 | 2018-09-11 | Emd Millipore Corporation | Caustic stable chromatography ligands |
Families Citing this family (97)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7790856B2 (en) * | 1998-04-07 | 2010-09-07 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
US7964192B1 (en) | 1997-12-02 | 2011-06-21 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Prevention and treatment of amyloidgenic disease |
US20080050367A1 (en) | 1998-04-07 | 2008-02-28 | Guriq Basi | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
US6787523B1 (en) * | 1997-12-02 | 2004-09-07 | Neuralab Limited | Prevention and treatment of amyloidogenic disease |
TWI239847B (en) * | 1997-12-02 | 2005-09-21 | Elan Pharm Inc | N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease |
US7700751B2 (en) | 2000-12-06 | 2010-04-20 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Humanized antibodies that recognize β-amyloid peptide |
MY139983A (en) * | 2002-03-12 | 2009-11-30 | Janssen Alzheimer Immunotherap | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
DE10303974A1 (de) | 2003-01-31 | 2004-08-05 | Abbott Gmbh & Co. Kg | Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung |
PL378571A1 (pl) * | 2003-02-01 | 2006-05-02 | Neuralab Limited | Czynna immunizacja dla wytworzenia przeciwciał przeciw rozpuszczalnemu A-ß |
PE20050627A1 (es) * | 2003-05-30 | 2005-08-10 | Wyeth Corp | Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido beta amiloideo |
EA200700751A1 (ru) * | 2004-10-05 | 2008-06-30 | Элан Фарма Интернэшнл Лимитед | Способы и композиции для улучшения продуцирования рекомбинантного белка |
NZ554520A (en) * | 2004-10-22 | 2010-03-26 | Amgen Inc | Methods for refolding of recombinant antibodies |
US8916165B2 (en) | 2004-12-15 | 2014-12-23 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Humanized Aβ antibodies for use in improving cognition |
GT200600031A (es) * | 2005-01-28 | 2006-08-29 | Formulacion anticuerpo anti a beta | |
EP1896504B1 (en) * | 2005-06-17 | 2012-11-21 | Wyeth LLC | Methods of purifying fc region containing antibodies |
PL2289909T3 (pl) | 2005-11-30 | 2015-04-30 | Abbvie Inc | Sposób przeszukiwania, proces oczyszczania niedyfundujących oligomerów Abeta, selektywne przeciwciała przeciw niedyfundującym oligomerom Abeta i sposób wytwarzania tych przeciwciał |
CN102898519B (zh) | 2005-11-30 | 2015-10-28 | Abbvie公司 | 抗淀粉样β蛋白的单克隆抗体及其用途 |
KR101505201B1 (ko) | 2005-12-12 | 2015-03-24 | 에이씨 이뮨 에스.에이. | 치료적 특성을 갖는 베타 1-42 특이적인 단일클론성 항체 |
US8784810B2 (en) * | 2006-04-18 | 2014-07-22 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Treatment of amyloidogenic diseases |
WO2010044803A1 (en) * | 2008-10-17 | 2010-04-22 | Elan Pharma International Limited | Treatment of amyloidogenic diseases |
CL2007002070A1 (es) * | 2006-07-14 | 2008-02-08 | Ac Immune S A Genentech Inc | Anticuerpo quimerico o humanizado, o fragmentos de ellos, que se adhieren especificamente a por lo menos un epitopo en la proteina beta-amiloide; molecula de acido nucleico que lo codifica; composicion que lo comprende; su uso para tratar enfermedade |
EA017733B1 (ru) * | 2006-08-28 | 2013-02-28 | Арес Трейдинг С.А. | СПОСОБ ОЧИСТКИ Fc-СЛИТЫХ БЕЛКОВ |
LT2061803T (lt) * | 2006-08-28 | 2019-11-25 | Ares Trading Sa | Fc turinčių baltymų gryninimo būdas |
BRPI0716762A2 (pt) | 2006-09-13 | 2013-09-24 | Abbott Lab | melhorias da cultura celular |
US8911964B2 (en) | 2006-09-13 | 2014-12-16 | Abbvie Inc. | Fed-batch method of making human anti-TNF-alpha antibody |
US8455626B2 (en) | 2006-11-30 | 2013-06-04 | Abbott Laboratories | Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies |
US20100311767A1 (en) * | 2007-02-27 | 2010-12-09 | Abbott Gmbh & Co. Kg | Method for the treatment of amyloidoses |
KR20100016661A (ko) * | 2007-04-18 | 2010-02-12 | 얀센 알츠하이머 이뮤노테라피 | 대뇌 아밀로이드 혈관병증의 예방 및 치료 |
US8003097B2 (en) * | 2007-04-18 | 2011-08-23 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Treatment of cerebral amyloid angiopathy |
JP2010528583A (ja) * | 2007-06-11 | 2010-08-26 | エーシー イミューン ソシエテ アノニム | アミロイドβに対するヒト化抗体 |
US8613923B2 (en) | 2007-06-12 | 2013-12-24 | Ac Immune S.A. | Monoclonal antibody |
US8048420B2 (en) * | 2007-06-12 | 2011-11-01 | Ac Immune S.A. | Monoclonal antibody |
EP2574345A1 (en) * | 2007-06-12 | 2013-04-03 | AC Immune S.A. | Humanized antibodies to amyloid beta |
PL2182983T3 (pl) | 2007-07-27 | 2014-10-31 | Janssen Alzheimer Immunotherap | Leczenie chorób amyloidowych z wykorzystaniem humanizowanych przeciwciał specyficznych względem Abeta |
BRPI0818621A8 (pt) * | 2007-10-05 | 2018-01-30 | Ac Immune Sa | composição farmacêutica, e, métodos para reduzir a carga da placa e a quantidade de placas na camada de célula de gânglio retinal de um indivíduo, para prevenir, tratar e/ou aliviar os efeitos de uma doença ocular, para diagnosticar uma doença ocular e uma predisposição a uma doença ocular, para monitorar doença ocular, para predizer responsividade de um paciente, e para reter ou diminuir pressão ocular nos olhos de um indivíduo |
WO2009048539A2 (en) | 2007-10-05 | 2009-04-16 | Genentech, Inc. | Monoclonal antibody |
EP2650308A3 (en) * | 2007-10-05 | 2014-11-12 | Genentech, Inc. | Use of anti-amyloid beta antibody in ocular diseases |
JO3076B1 (ar) * | 2007-10-17 | 2017-03-15 | Janssen Alzheimer Immunotherap | نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe |
PT2211904T (pt) | 2007-10-19 | 2016-11-02 | Seattle Genetics Inc | Agentes de ligação a cd19 e seus usos |
SI2215117T2 (en) * | 2007-10-30 | 2018-04-30 | Genentech, Inc. | Purification of the antibody by cation exchange chromatography |
WO2009064424A1 (en) * | 2007-11-13 | 2009-05-22 | Rational Affinity Devices, L.L.C. | Tunable affinity ligands for the separation and detection of target substances |
KR101247374B1 (ko) * | 2008-06-26 | 2013-03-26 | 한국생명공학연구원 | 면역글로불린 G의 Fc 부위에 선택적으로 결합하는 신규펩타이드 및 그의 제조방법 |
AU2009307728B2 (en) * | 2008-10-20 | 2014-12-11 | Abbvie Inc. | Antibodies that bind to IL-18 and methods of purifying the same |
EP2921501A1 (en) | 2008-10-20 | 2015-09-23 | Abbvie Inc. | Isolation and purification of antibodies using Protein A affinity chromatography |
KR101722423B1 (ko) | 2008-10-20 | 2017-04-18 | 애브비 인코포레이티드 | 항체 정제 동안의 바이러스 불활성화 |
JP6113404B2 (ja) | 2008-10-29 | 2017-04-12 | アブリンクス エン.ヴェー. | 単一ドメイン抗原結合分子の精製方法 |
EP4104821A1 (en) | 2008-10-29 | 2022-12-21 | Ablynx N.V. | Formulations of single domain antigen binding molecules |
US9067981B1 (en) | 2008-10-30 | 2015-06-30 | Janssen Sciences Ireland Uc | Hybrid amyloid-beta antibodies |
AU2009331897A1 (en) | 2008-12-22 | 2010-07-01 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Immunoglobulin purification |
US8268820B2 (en) * | 2009-03-26 | 2012-09-18 | Hoffmann-La Roche Inc. | 2,3-diaryl- or heteroaryl-substituted 1,1,1-trifluoro-2-hydroxypropyl compounds |
EP2424889B1 (en) * | 2009-04-30 | 2015-08-12 | Ablynx N.V. | Method for the production of domain antibodies |
CN108409829A (zh) * | 2009-09-01 | 2018-08-17 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 通过改进的a蛋白洗脱增强的蛋白质纯化 |
KR101632312B1 (ko) | 2009-11-03 | 2016-06-21 | 삼성전자주식회사 | 항체 불변 영역에 특이적으로 결합하는 융합 단백질, 그의 제조 방법 및 이를 이용한 항체 분리 방법 |
KR20120099154A (ko) * | 2009-12-31 | 2012-09-06 | 미리안트 코포레이션 | 암모늄 숙신산염을 함유하고 있는 발효 배지로부터의 숙신산의 정제 |
AU2011222991B2 (en) * | 2010-03-05 | 2015-07-16 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Selective enrichment of antibodies |
US9884904B2 (en) * | 2010-03-10 | 2018-02-06 | Hoffmann-La Roche Inc. | Method for purifying polypeptide solutions |
EP2558494B1 (en) | 2010-04-15 | 2018-05-23 | AbbVie Inc. | Amyloid-beta binding proteins |
NZ606357A (en) | 2010-07-30 | 2015-05-29 | Genentech Inc | Safe and functional humanized anti beta-amyloid antibody |
US9062101B2 (en) | 2010-08-14 | 2015-06-23 | AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG | Amyloid-beta binding proteins |
WO2012099576A1 (en) * | 2011-01-18 | 2012-07-26 | Baxter International Inc. | Measurement of anti-amyloid antibodies in human blood |
DK2691411T3 (da) * | 2011-03-29 | 2020-05-11 | Glaxosmithkline Llc | Buffersystem til proteinoprensning |
WO2013013193A1 (en) * | 2011-07-20 | 2013-01-24 | Zepteon, Incorporated | Polypeptide separation methods |
US9994610B2 (en) * | 2011-10-19 | 2018-06-12 | Roche Glycart Ag | Separation method for fucosylated antibodies |
US20150239991A1 (en) * | 2012-09-25 | 2015-08-27 | Glenmark Pharmaceuticals S.A. | Purification of hetero-dimeric immunoglobulins |
AR096713A1 (es) | 2013-06-25 | 2016-01-27 | Cadila Healthcare Ltd | Proceso de purificación para anticuerpos monoclonales |
KR20160029840A (ko) | 2013-07-05 | 2016-03-15 | 라보라토이레 프란카이즈 듀 프락티온네먼트 에트 데스 바이오테크놀로지스 | 친화성 크로마토그래피 매트릭스 |
NZ718144A (en) | 2013-09-13 | 2022-05-27 | Genentech Inc | Methods and compositions comprising purified recombinant polypeptides |
CA2950241A1 (en) * | 2014-06-02 | 2015-12-10 | Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies | Production of fc fragments |
JP6451118B2 (ja) * | 2014-07-17 | 2019-01-16 | 東ソー株式会社 | 抗体の分離方法 |
AR101262A1 (es) * | 2014-07-26 | 2016-12-07 | Regeneron Pharma | Plataforma de purificación para anticuerpos biespecíficos |
US11566082B2 (en) | 2014-11-17 | 2023-01-31 | Cytiva Bioprocess R&D Ab | Mutated immunoglobulin-binding polypeptides |
CN105175548B (zh) * | 2015-08-13 | 2019-02-05 | 齐鲁制药有限公司 | 重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法 |
CN107835819A (zh) * | 2015-08-21 | 2018-03-23 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 在亲和层析中减少宿主细胞蛋白的方法 |
WO2017032610A1 (en) * | 2015-08-21 | 2017-03-02 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Affinity chromatography purification with low conductivity wash buffer |
US11242518B2 (en) * | 2015-09-04 | 2022-02-08 | QIAGEN Sciences, LLP | Methods for co-isolation of nucleic acids and proteins |
GB201600154D0 (en) * | 2016-01-05 | 2016-02-17 | Bayer As | Isotope preparation method |
GB201600161D0 (en) * | 2016-01-05 | 2016-02-17 | Bayer As | Isotope purification method |
US10730908B2 (en) | 2016-05-11 | 2020-08-04 | Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab | Separation method |
CN109311949B (zh) | 2016-05-11 | 2022-09-16 | 思拓凡生物工艺研发有限公司 | 储存分离基质的方法 |
US10703774B2 (en) | 2016-09-30 | 2020-07-07 | Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab | Separation method |
US10654887B2 (en) | 2016-05-11 | 2020-05-19 | Ge Healthcare Bio-Process R&D Ab | Separation matrix |
ES2874974T3 (es) | 2016-05-11 | 2021-11-05 | Cytiva Bioprocess R & D Ab | Matriz de separación |
US10889615B2 (en) | 2016-05-11 | 2021-01-12 | Cytiva Bioprocess R&D Ab | Mutated immunoglobulin-binding polypeptides |
ES2909833T3 (es) | 2016-05-11 | 2022-05-10 | Cytiva Bioprocess R & D Ab | Método de limpieza y/o desinfección de una matriz de separación |
CN106519029B (zh) * | 2016-10-31 | 2020-03-17 | 山东泰邦生物制品有限公司 | 一种Aβ寡聚体抗体的制备工艺 |
US10941178B2 (en) * | 2017-03-17 | 2021-03-09 | Gilead Sciences, Inc. | Method of purifying an antibody |
JP2018167260A (ja) * | 2017-03-29 | 2018-11-01 | 三菱ケミカル株式会社 | イオン交換体の保存方法、生理活性物質の精製装置及び生理活性物質の精製方法 |
EP3668985B1 (en) | 2017-08-17 | 2021-06-16 | Just-Evotec Biologics, Inc. | Method of purifying glycosylated protein from host cell galectins and other contaminants |
US11447547B1 (en) | 2017-12-13 | 2022-09-20 | Amgen Inc. | Method of antigen-binding protein production |
CN108048477A (zh) * | 2017-12-15 | 2018-05-18 | 南京理工大学 | 基于大肠杆菌表达***的制备多肽的方法 |
CN109929038B (zh) * | 2017-12-15 | 2020-10-09 | 山东博安生物技术有限公司 | Vegf捕获剂融合蛋白的纯化方法 |
US11155575B2 (en) | 2018-03-21 | 2021-10-26 | Waters Technologies Corporation | Non-antibody high-affinity-based sample preparation, sorbent, devices and methods |
US20220314142A1 (en) | 2019-07-01 | 2022-10-06 | Pfizer Inc. | Improvements to wash solutions for protein a chromatography in an antibody purification process |
CN112409477B (zh) * | 2019-08-21 | 2022-11-08 | 广东菲鹏生物有限公司 | IgM纯化方法 |
CN110724204B (zh) * | 2019-11-18 | 2021-10-22 | 广东菲鹏制药股份有限公司 | Fc融合蛋白的纯化方法 |
CN113968909A (zh) * | 2020-07-22 | 2022-01-25 | 信达生物制药(苏州)有限公司 | 一种双特异性抗体的纯化方法 |
CN116348487A (zh) | 2020-07-23 | 2023-06-27 | 欧萨尔普罗席纳有限公司 | 抗淀粉样β抗体 |
Family Cites Families (75)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4816567A (en) * | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
JPS6147500A (ja) | 1984-08-15 | 1986-03-07 | Res Dev Corp Of Japan | キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法 |
EP0173494A3 (en) | 1984-08-27 | 1987-11-25 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Chimeric receptors by dna splicing and expression |
GB8422238D0 (en) | 1984-09-03 | 1984-10-10 | Neuberger M S | Chimeric proteins |
JPS61134325A (ja) | 1984-12-04 | 1986-06-21 | Teijin Ltd | ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法 |
US4676980A (en) * | 1985-09-23 | 1987-06-30 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Target specific cross-linked heteroantibodies |
EP0247091B1 (en) | 1985-11-01 | 1993-09-29 | Xoma Corporation | Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use |
US5225539A (en) * | 1986-03-27 | 1993-07-06 | Medical Research Council | Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies |
US4801687A (en) * | 1986-10-27 | 1989-01-31 | Bioprobe International, Inc. | Monoclonal antibody purification process using protein A |
US4851341A (en) * | 1986-12-19 | 1989-07-25 | Immunex Corporation | Immunoaffinity purification system |
US5336603A (en) | 1987-10-02 | 1994-08-09 | Genentech, Inc. | CD4 adheson variants |
EP0768377A1 (en) | 1988-09-02 | 1997-04-16 | Protein Engineering Corporation | Generation and selection of recombinant varied binding proteins |
US5223409A (en) | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
US5225538A (en) | 1989-02-23 | 1993-07-06 | Genentech, Inc. | Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins |
US5116964A (en) * | 1989-02-23 | 1992-05-26 | Genentech, Inc. | Hybrid immunoglobulins |
EP0463151B1 (en) * | 1990-01-12 | 1996-06-12 | Cell Genesys, Inc. | Generation of xenogeneic antibodies |
US6150584A (en) * | 1990-01-12 | 2000-11-21 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
US5427908A (en) | 1990-05-01 | 1995-06-27 | Affymax Technologies N.V. | Recombinant library screening methods |
AU665190B2 (en) | 1990-07-10 | 1995-12-21 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing members of specific binding pairs |
GB9015198D0 (en) | 1990-07-10 | 1990-08-29 | Brien Caroline J O | Binding substance |
US5770429A (en) * | 1990-08-29 | 1998-06-23 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
US5112952A (en) * | 1990-09-28 | 1992-05-12 | Pierce Chemical Company | Composition and method for isolation and purification of Immunoglobulin M |
ES2113940T3 (es) | 1990-12-03 | 1998-05-16 | Genentech Inc | Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas. |
AU1545692A (en) | 1991-03-01 | 1992-10-06 | Protein Engineering Corporation | Process for the development of binding mini-proteins |
CA2108147C (en) | 1991-04-10 | 2009-01-06 | Angray Kang | Heterodimeric receptor libraries using phagemids |
DE4122599C2 (de) | 1991-07-08 | 1993-11-11 | Deutsches Krebsforsch | Phagemid zum Screenen von Antikörpern |
WO1993008829A1 (en) | 1991-11-04 | 1993-05-13 | The Regents Of The University Of California | Compositions that mediate killing of hiv-infected cells |
US5786180A (en) | 1995-02-14 | 1998-07-28 | Bayer Corporation | Monoclonal antibody 369.2B specific for β A4 peptide |
EP0985033A4 (en) * | 1997-04-04 | 2005-07-13 | Biosite Inc | POLYVALENT AND POLYCLONAL LIBRARIES |
US7588766B1 (en) * | 2000-05-26 | 2009-09-15 | Elan Pharma International Limited | Treatment of amyloidogenic disease |
TWI239847B (en) * | 1997-12-02 | 2005-09-21 | Elan Pharm Inc | N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease |
US20080050367A1 (en) * | 1998-04-07 | 2008-02-28 | Guriq Basi | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
US6743427B1 (en) * | 1997-12-02 | 2004-06-01 | Neuralab Limited | Prevention and treatment of amyloidogenic disease |
US6913745B1 (en) * | 1997-12-02 | 2005-07-05 | Neuralab Limited | Passive immunization of Alzheimer's disease |
US6750324B1 (en) * | 1997-12-02 | 2004-06-15 | Neuralab Limited | Humanized and chimeric N-terminal amyloid beta-antibodies |
US6787523B1 (en) * | 1997-12-02 | 2004-09-07 | Neuralab Limited | Prevention and treatment of amyloidogenic disease |
US7790856B2 (en) * | 1998-04-07 | 2010-09-07 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
US6761888B1 (en) * | 2000-05-26 | 2004-07-13 | Neuralab Limited | Passive immunization treatment of Alzheimer's disease |
US7964192B1 (en) * | 1997-12-02 | 2011-06-21 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Prevention and treatment of amyloidgenic disease |
US7179892B2 (en) | 2000-12-06 | 2007-02-20 | Neuralab Limited | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
US6710226B1 (en) * | 1997-12-02 | 2004-03-23 | Neuralab Limited | Transgenic mouse assay to determine the effect of Aβ antibodies and Aβ Fragments on alzheimer's disease characteristics |
US20050059802A1 (en) * | 1998-04-07 | 2005-03-17 | Neuralab Ltd | Prevention and treatment of amyloidogenic disease |
US6787637B1 (en) * | 1999-05-28 | 2004-09-07 | Neuralab Limited | N-Terminal amyloid-β antibodies |
AU4178601A (en) * | 2000-02-24 | 2001-09-03 | Univ Washington | Humanized antibodies that sequester abeta peptide |
US7700751B2 (en) | 2000-12-06 | 2010-04-20 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Humanized antibodies that recognize β-amyloid peptide |
TWI255272B (en) * | 2000-12-06 | 2006-05-21 | Guriq Basi | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
EP1385545B1 (en) | 2001-04-30 | 2009-01-07 | Eli Lilly And Company | Humanized antibodies recognizing the beta-amyloid peptide |
US7320790B2 (en) | 2001-04-30 | 2008-01-22 | Eli Lilly And Company | Humanized antibodies |
EP1519740A4 (en) | 2001-08-17 | 2005-11-09 | Lilly Co Eli | FASTER IMPROVEMENT OF COGNITION IN DISEASES ASSOCIATED WITH A-BETA |
CA2451998A1 (en) | 2001-08-17 | 2003-02-27 | Eli Lilly And Company | Anti-a.beta. antibodies |
ATE417858T1 (de) * | 2002-02-05 | 2009-01-15 | Genentech Inc | Proteinaufreinigung |
AR038568A1 (es) | 2002-02-20 | 2005-01-19 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos anti-a beta y su uso |
MY139983A (en) | 2002-03-12 | 2009-11-30 | Janssen Alzheimer Immunotherap | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
PL378571A1 (pl) * | 2003-02-01 | 2006-05-02 | Neuralab Limited | Czynna immunizacja dla wytworzenia przeciwciał przeciw rozpuszczalnemu A-ß |
US20040229330A1 (en) * | 2003-02-27 | 2004-11-18 | Bayer Pharmaceuticals Corporation | Integrated method for capture and purification of tagged proteins |
AU2004215653B2 (en) | 2003-02-28 | 2011-03-17 | Lonza Biologics Plc. | Antibody purification by protein A and ion exchange chromatography |
GB0304576D0 (en) * | 2003-02-28 | 2003-04-02 | Lonza Biologics Plc | Protein a chromatography |
PE20050627A1 (es) | 2003-05-30 | 2005-08-10 | Wyeth Corp | Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido beta amiloideo |
WO2005044856A2 (en) * | 2003-10-27 | 2005-05-19 | Wyeth | Removal of high molecular weight aggregates using hydroxyapatite chromatography |
UA93854C2 (ru) * | 2003-12-17 | 2011-03-25 | Вайет Ллк | Иммуногенный конъюгат и способ его получения |
CN1934127B (zh) * | 2003-12-17 | 2015-08-19 | 杨森阿尔茨海默氏症免疫治疗公司 | Αβ免疫原性肽载体-偶联物及其生产方法 |
WO2005077981A2 (en) * | 2003-12-22 | 2005-08-25 | Xencor, Inc. | Fc POLYPEPTIDES WITH NOVEL Fc LIGAND BINDING SITES |
JPWO2006006617A1 (ja) | 2004-07-14 | 2008-04-24 | アステラス製薬株式会社 | 中枢神経疾患発症後の機能障害の回復促進剤 |
EA200700751A1 (ru) * | 2004-10-05 | 2008-06-30 | Элан Фарма Интернэшнл Лимитед | Способы и композиции для улучшения продуцирования рекомбинантного белка |
US8916165B2 (en) * | 2004-12-15 | 2014-12-23 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Humanized Aβ antibodies for use in improving cognition |
PE20061401A1 (es) | 2004-12-15 | 2006-12-23 | Neuralab Ltd | ANTICUERPOS Aß PARA MEJORAR LA COGNICION |
US7625560B2 (en) * | 2004-12-15 | 2009-12-01 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
TW200638943A (en) * | 2005-01-28 | 2006-11-16 | Wyeth Corp | Stabilized liquid polypeptide formulations |
GT200600031A (es) * | 2005-01-28 | 2006-08-29 | Formulacion anticuerpo anti a beta | |
EP1896504B1 (en) | 2005-06-17 | 2012-11-21 | Wyeth LLC | Methods of purifying fc region containing antibodies |
KR20100016661A (ko) * | 2007-04-18 | 2010-02-12 | 얀센 알츠하이머 이뮤노테라피 | 대뇌 아밀로이드 혈관병증의 예방 및 치료 |
US8003097B2 (en) * | 2007-04-18 | 2011-08-23 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Treatment of cerebral amyloid angiopathy |
PL2182983T3 (pl) | 2007-07-27 | 2014-10-31 | Janssen Alzheimer Immunotherap | Leczenie chorób amyloidowych z wykorzystaniem humanizowanych przeciwciał specyficznych względem Abeta |
JO3076B1 (ar) * | 2007-10-17 | 2017-03-15 | Janssen Alzheimer Immunotherap | نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe |
IT1395574B1 (it) | 2009-09-14 | 2012-10-16 | Guala Dispensing Spa | Dispositivo di erogazione |
-
2006
- 2006-06-16 EP EP06784989A patent/EP1896504B1/en active Active
- 2006-06-16 EP EP11177582A patent/EP2388274A1/en not_active Withdrawn
- 2006-06-16 MX MX2007015952A patent/MX2007015952A/es active IP Right Grant
- 2006-06-16 CN CNA2006800216391A patent/CN101365722A/zh active Pending
- 2006-06-16 TW TW095121657A patent/TW200740839A/zh unknown
- 2006-06-16 KR KR1020087000127A patent/KR101247836B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2006-06-16 AU AU2006259298A patent/AU2006259298B2/en active Active
- 2006-06-16 WO PCT/US2006/024026 patent/WO2006138737A2/en active Application Filing
- 2006-06-16 ZA ZA200710330A patent/ZA200710330B/xx unknown
- 2006-06-16 TW TW095121622A patent/TWI372763B/zh not_active IP Right Cessation
- 2006-06-16 BR BRPI0611600A patent/BRPI0611600B8/pt active IP Right Grant
- 2006-06-16 CA CA002611815A patent/CA2611815A1/en not_active Abandoned
- 2006-06-16 BR BRPI0611599-3A patent/BRPI0611599A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2006-06-16 KR KR1020077030436A patent/KR101307614B1/ko active IP Right Grant
- 2006-06-16 ZA ZA200710331A patent/ZA200710331B/xx unknown
- 2006-06-16 MY MYPI20062873A patent/MY144484A/en unknown
- 2006-06-16 US US11/455,203 patent/US7820799B2/en active Active
- 2006-06-16 AU AU2006261185A patent/AU2006261185B2/en not_active Ceased
- 2006-06-16 CA CA2611816A patent/CA2611816C/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-06-16 US US11/454,772 patent/US7825223B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-06-16 EA EA200800083A patent/EA015148B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2006-06-16 EA EA201100177A patent/EA201100177A1/ru unknown
- 2006-06-16 CN CNA200680021590XA patent/CN101213211A/zh active Pending
- 2006-06-16 ES ES06784989T patent/ES2405079T3/es active Active
- 2006-06-16 CN CN201510211982.3A patent/CN104926938B/zh active Active
- 2006-06-16 AR ARP060102572A patent/AR053632A1/es not_active Application Discontinuation
- 2006-06-16 JP JP2008517226A patent/JP5270337B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2006-06-16 AR ARP060102573A patent/AR053633A1/es unknown
- 2006-06-16 NZ NZ565044A patent/NZ565044A/en not_active IP Right Cessation
- 2006-06-16 RU RU2007143162/10A patent/RU2415865C2/ru active
- 2006-06-16 MX MX2007015051A patent/MX2007015051A/es active IP Right Grant
- 2006-06-16 SG SG201004275-2A patent/SG162806A1/en unknown
- 2006-06-16 EP EP06785208A patent/EP1896506B1/en active Active
- 2006-06-16 ES ES06785208T patent/ES2402650T3/es active Active
- 2006-06-16 JP JP2008517138A patent/JP5150488B2/ja active Active
- 2006-06-16 WO PCT/US2006/023478 patent/WO2006138553A2/en active Application Filing
-
2007
- 2007-11-26 NO NO20076082A patent/NO20076082L/no not_active Application Discontinuation
- 2007-11-26 NO NO20076056A patent/NO20076056L/no not_active Application Discontinuation
- 2007-11-26 IL IL187642A patent/IL187642A/en active IP Right Grant
- 2007-11-27 IL IL187683A patent/IL187683A/en not_active IP Right Cessation
- 2007-12-07 CR CR9582A patent/CR9582A/es unknown
- 2007-12-07 CR CR9576A patent/CR9576A/es not_active Application Discontinuation
- 2007-12-17 NI NI200700329A patent/NI200700329A/es unknown
-
2008
- 2008-01-02 MA MA30537A patent/MA29609B1/fr unknown
- 2008-01-09 EC EC2008008086A patent/ECSP088086A/es unknown
- 2008-09-12 HK HK08110194.5A patent/HK1117174A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2010
- 2010-10-12 US US12/903,053 patent/US8440799B2/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
СКОУПС.Р. Методы очистки белков. М.: Мир, 1985, стр.91-196. * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9920112B2 (en) | 2008-08-11 | 2018-03-20 | Emd Millipore Corporation | Immunoglobulin-binding proteins with improved specificity |
US10072050B2 (en) | 2008-12-24 | 2018-09-11 | Emd Millipore Corporation | Caustic stable chromatography ligands |
US11084851B2 (en) | 2008-12-24 | 2021-08-10 | Emd Millipore Corporation | Caustic stable chromatography ligands |
RU2644680C1 (ru) * | 2011-06-08 | 2018-02-13 | Емд Миллипор Корпорэйшн | Хроматографические матрицы, содержащие новые лиганды на основе белка a staphylococcus aureus |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2415865C2 (ru) | СПОСОБЫ ОЧИСТКИ БЕЛКОВ, СОДЕРЖАЩИХ ОБЛАСТЬ Fc | |
TWI625335B (zh) | 純化抗體的方法 | |
JP2014223079A (ja) | 哺乳動物IgGと結合する単一ドメイン抗原結合タンパク質 | |
WO2017032610A1 (en) | Affinity chromatography purification with low conductivity wash buffer | |
WO2016191659A1 (en) | Affinity ligands and methods relating thereto | |
JPWO2019244961A1 (ja) | 変異vhh抗体を用いたアフィニティー担体 |