BRPI0611599A2

BRPI0611599A2 - método para purificar uma protéina de ligação a beta, e, proteìna de ligação a beta

Info

Publication number: BRPI0611599A2
Application number: BRPI0611599-3A
Authority: BR
Inventors: Ranganathan Godavarti; Timothy Iskra
Original assignee: Elan Pharma Int Ltd; Wyeth Corp
Priority date: 2005-06-17
Filing date: 2006-06-16
Publication date: 2011-02-22
Also published as: BRPI0611600A2; IL187683A; AR053632A1; MA29609B1; CR9582A; MX2007015952A; WO2006138553A2; KR101247836B1; NO20076056L; EP1896506B1; JP2008543881A; WO2006138737A2; AU2006259298A1; NI200700329A; NZ565044A; TW200840821A; US20070082367A1; KR101307614B1; CA2611816A1; EA200800083A1

Abstract

MéTODO PARA PURIFICAR UMA PROTEìNA DE LIGAçãO A BETA, E, PROTEìNA DE LIGAçãO A BETA. O presente pedido fornece métodos de purificar proteínas de ligação A<225> tendo uma região Fc, por exemplo, anticorpos anti-A<225> ou fusões de anticorpos, adsorvendo a proteína de ligação A<225> a um agente de ligação Fc, tal como, por exemplo, Proteína A ou Proteína G, seguido por uma lavagem com um tampão de sal de cátion divalente para remover impurezas e subsequente recuperação da proteína de ligação A<225> adsorvida. O presente pedido também retrata métodos de eluir a proteína de ligação A<225>purificada assim como a incorporação dos métodos dentro de uma série de purificação. Kits compreendendo componentes para realizar os métodos e instruções para uso também são fornecidos.

Description

"MÉTODO PARA PURIFICAR UMA PROTEÍNA DE LIGAÇÃO A BETA,PROTEÍNA DE LIGAÇÃO A BETA, E, KIT"

PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica prioridade para pedido de patenteprovisória Norte-Americano "METHODS OF PURIFYING Fc REGIONCONTAINING PROTEINS", depositado em 17 de Junho de 2005 tendo umnúmero de série 60/691821. O conteúdo inteiro deste pedido é incorporadoneste lugar.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Mal de Alzheimer ("AD") é uma desordem neurodegenerativacaracterizada pela ocorrência de placas amilóides, emaranhadosneurofibrilares e perda neuronal significante. Proteína β-Amilóide (tambémreferida como o peptídeo Αβ), o principal componente de placas senis, foiimplicada na patogênese de Mal de Alzheimer (Selkoe (1989) Cell 58:611-612; Hardy (1997) Trends Neurosci. 20:154-159). Foi mostrado que β-amilóide é tanto diretamente tóxica para neurônios cultivados (Lorenzo andYankner (1996) Ann. NY Acad. Sei. 777:89-95) como indiretamente tóxicaatravés de vários mediadores (Koh et al. (1990) Brain Research 533:315-320;Mattson et al. (1992) J. Neurosciences 12:376389). Adicionalmente, modelosin vivo, incluindo o camundongo PDAPP e um modelo de rato ligaram β-amilóide a déficits de aprendizagem, função cognitiva alterada, e inibição depotenciação de longo prazo de hipocampo (Chen et al. (2000) Nature408:975-985; Walsh et al. (2002) Nature 416:535-539). Portanto, uma grandequantidade de interesse foi focada em terapias que alteram os níveis de β-amilóide para reduzir potencialmente a severidade ou mesmo anular a doençapor si só.

Uma estratégia de tratamento AD que recentemente emergiuem resposta a estudos bem sucedidos em modelos experimentais decamundongo PDAPP e rato, é aquela de imunização passiva de indivíduospara fornecer imunoglobulinas tal como anticorpos específicos para β-amilóide. (Veja e.g., Bard et al. (2000) Nat. Med. 6:916-919 e Bard et al.(2003) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 100:2023-2028). Recentemente, tambémfoi mostrado que redução de Abeta por imunização passiva protege contra aperda progressiva de degeneração sináptica em um modelo de camundongotransgênico de Mal de Alzheimer. (Buttini et al. (2005) J. Neurosei. 25:9096-101).

Avanços recentes em tecnologia recombinante sãoresponsáveis pela produção de anticorpos contra virtualmente qualquer alvo,por exemplo, células cancerosas, bactérias, e vírus. Tipicamente, umanticorpo é produzido usando uma linhagem celular que foi modificada paraexpressar o anticorpo em níveis altos. A linhagem celular modificada ésubseqüentemente crescida em uma cultura que compreende uma misturacomplexa de açúcares, aminoácidos, e fatores de crescimento, assim comovárias proteínas, incluindo por exemplo, proteínas séricas. Entretanto,separação de anticorpos completos de subprodutos celulares e componentesde cultura até uma pureza suficiente para uso em pesquisa ou comoterapêuticos propõe um desafio formidável. A purificação das moléculas deanticorpos é especialmente crítica se os anticorpos são para serem usadoscomo uma droga para administração a humanos.

Esquemas (ou séries) tradicionais de purificação de anticorpofreqüentemente compreendem uma etapa de cromatografia que explora umacapacidade da molécula de anticorpo de se ligar preferencialmente e ou serretida pela fase sólida (ou fase sólida funcionalizada) de uma coluna decromatografia comparada com a ligação ou retenção de várias impurezas.Esquemas foram propostos ou realizados para purificar anticorpos queprimeiro ligam proteínas contendo região CH2/ CH3 a Proteína A imobilizadaem uma fase sólida, seguido por remoção de impurezas ligadas à fase sólidalavando a fase sólida com um solvente de eletrólito hidrofóbico ea. subseqüente recuperação das proteínas contendo região CH2/ CH3 da fasesólida. Entretanto, estes esquemas são limitados pois as condições usadas paraligar preferencialmente as proteínas contendo região CH2/ CH3 tambémsustentam ligação de impurezas (e.g., anticorpos com regiões CH2/CH3incompletas). No desenvolvimento de terapêuticos humanos, tais impurezassão altamente indesejáveis.

Por conseguinte, existe uma necessidade por melhoras napurificação de proteínas ou polipeptídeos tendo regiões constantes, emparticular, proteínas tendo regiões Fc (e.g., anticorpos), produzidas em culturacelular.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção retrata métodos de purificar proteínas deligação Αβ, em particular, anticorpos de ligação Αβ. Os métodos da invençãosão especialmente adequados para purificação de proteínas (e.g., anticorpos)desenvolvidas para administração a humanos. Em particular, a invençãoretrata a purificação de proteínas tendo regiões constantes, em particular,proteínas tendo regiões Fc (e.g., anticorpos), produzidas em cultura celular.

Em vários aspectos, a presente invenção retrata métodos paraseparar uma proteína de ligação Αβ tendo uma região Fc, tal como umaanticorpo anti-Αβ, a partir de um líquido fonte compreendendo a proteína euma ou mais impurezas. Nos métodos da invenção, a proteína de ligação Αβ éadsorvida a um agente de ligação Fc e então o agente de ligação Fc é lavadocom uma solução tampão contendo um sal de cátion divalente para removeruma ou mais impurezas. A proteína é então recuperada do agente de ligaçãoFc em uma solução de eluição. Os métodos da invenção são particularmenteúteis para remover impurezas tal como espécies variantes de transleitura deíntron (IRT), em espécies ligadas sob dissulfeto (UDB) e/ou espéciesvariantes de baixo peso molecular (LMW). Os métodos da invenção tambémsão efetivos para remover impurezas tal como proteínas de célula hospedeira(HCP) e DNA.

Os métodos da presente invenção compreendem uma ou maisetapas de separação cromatográfica e em adição podem compreender uma oumais etapas de filtração. As etapas de separação cromatográfica podem sercontínuas ou descontínuas (e.g., uma abordagem em batelada), ou umacombinação de ambas. Em várias formas de realização, os métodoscompreendem uma ou mais etapas de filtração, por exemplo, para removervírus, concentrar e tamponar a solução contendo a proteína alvo, e pararemover contaminantes microbianos.

Em várias formas de realização, o anticorpo anti-Αβ é umanticorpo murino, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou umanticorpo humano. Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-Αβ éum anticorpo que se liga especificamente a epítopo dentro de resíduos 1-7, 1-5, 3-7, 3-6, 13-28, 15-24, 16-24, 16-21, 19-22, 33-40, 33-42 de Αβ.Anticorpos anti-Αβ exemplares se ligam especificamente a um epítopo dentrode resíduos 1-10 de Αβ, tal como, por exemplo, dentro de resíduos 1-7, 1-5, 3-7, ou 3-6 de Αβ. Outros anticorpos anti-Αβ exemplares se ligamespecificamente a um epítopo dentro de resíduos 13-28 de Αβ, tal como, porexemplo, dentro de resíduos 16-21 ou 19-22 de Αβ. Outros anticorpos anti-Αβainda exemplares se ligam especificamente a um epítopo C terminal de Αβ talcomo, por exemplo, 33-40 ou 33-42 de Αβ. Em algumas formas de realização,o anticorpo anti-Αβ se liga a um epítopo descontínuo que inclui resíduosdentro de 1-7 e dentro de 13-28 de Αβ. Outras formas de realizaçãodescrevem fragmentos Fab, Fab'(2) ou Fv de anticorpos anti-Αβ. Em algumastais formas de realização, o anticorpo é anticorpo biespecífico ou umanticorpo feito pelo processo descrito em Publicação de Patente InternacionalNo. W003/070760.

Em uma forma de realização preferida, o anticorpo é umanticorpo anti-Αβ humanizado, e em certas formas de realização, é umanticorpo anti-Αβ selecionado a partir do grupo consistindo de 3D6, 10D5,12B4, 12A11, 15C11 e 266. O isotipo do anticorpo pode ser IgM, IgGl, IgG2,IgG3, IgG4 ou qualquer outro isotipo farmaceuticamente aceitável. Emformas de realização preferidas, o isotipo é IgGl humana ou IgG4 humana.

Em várias formas de realização, a proteína de ligação Αβ éproduzida recombinantemente. Em várias formas de realização, a proteína deligação Αβ é produzida recombinantemente em uma célula de Ovário deHamster Chinês (CHO).

Em várias formas de realização, a uma ou mais impurezascompreendem uma ou mais de uma proteína de célula hospedeira, um DNAde célula hospedeira, uma proteína de cultura celular, uma espécie indesejadada proteína de ligação Αβ, e misturas destes. Por exemplo, em várias formasde realização, a espécie indesejada da proteína de ligação Αβ compreendeuma ou mais das cadeias de anticorpos ou fragmentos destas tendo seqüênciade transleitura de íntron, uma ou mais cadeias de anticorpos ou fragmentosdestas tendo uma ligação dissulfeto imprópria, um meio-anticorpo oufragmento deste, um dímero de cadeia leve ou fragmento deste, e um dímerode cadeia pesada ou fragmento deste.

Em um aspecto, os métodos da presente invenção purificamuma proteína de ligação Αβ, preferivelmente um anticorpo anti-Αβ, a partir deum líquido fonte compreendendo a proteína e uma ou mais impurezasprimeiro adsorvendo a proteína a um agente de ligação Fc, seguido porlavagem do agente de ligação Fc com uma solução tampão contendo um salde cátion divalente para remover uma ou mais impurezas, e recuperandosubseqüentemente a proteína do agente de ligação Fe. Em várias formas derealização, as etapas de adsorver a proteína a um agente de ligação Fc e lavaro agente de ligação Fc com uma solução tampão contendo um sal de cátiondivalente, são realizadas em temperatura no intervalo entre cerca de 2°C acerca de 24°C. Em várias formas de realização, a etapa de recuperar aproteína do agente de ligação Fc compreende eluir a proteína usando umtampão de eluição tendo um pH no intervalo de cerca de 2,0 a cerca de 6,5.

Em várias formas de realização, o agente de ligação de regiãoFc compreende uma ou mais de Proteína A e Proteína G. Em uma forma derealização preferida, o agente de ligação Fc é imobilizado em uma fase sólida.Esta fase sólida pode compreender, por exemplo, uma ou mais de umamicroesfera, uma matriz de agarose, sílica, e misturas destas.

O sal de cátion divalente presente no tampão que é usado paralavar o agente de ligação Fc pode compreender, por exemplo, um salcaotrópico. Sais de cátions divalentes adequados para preparação da soluçãode tampão de lavagem incluem, mas não são limitados a, cloreto de magnésio,cloreto de cálcio, cloreto de níquel e misturas destes. Em várias formas derealização, sais de cátions divalentes adequados para preparação da soluçãode tampão de lavagem incluem, mas não são limitados a, sais de tiocianato(SCN), perclorato (CIO4), nitrato (N03), cloreto, e brometo de cátionsdivalentes de grupo II (e.g., magnésio, cálcio, bário, etc.), cátions divalentesde metal de transição (e.g., cobre, níquel, manganês, etc.), e combinaçõesdestes sais.

Em várias formas de realização, a solução tampão contendo osal de cátion divalente tem um valor de pH no intervalo entre cerca de 4 acerca de 9, e em algumas formas de realização, entre cerca de 4 a cerca de 8,entre cerca de 4,5 a cerca de 7,5 ou entre cerca de 6 a cerca de 8. Valores eintervalos incluídos e/ou intermediários dentro de intervalos apresentadosneste lugar também são pretendidos para estar dentro do escopo da presenteinvenção. Por exemplo, o sal de cátion divalente tem um valor de pH entrecerca de 7,1 a cerca de 7,9, entre cerca de 7,2 a cerca de 7,9, entre cerca de7,3 a cerca de 7,7, entre cerca de 7,4 a cerca de 7,6, entre cerca de 4 a cerca de5, entre cerca de 5 a cerca de 6, entre cerca de 6 a cerca de 7, ou entre cercade 8 a cerca de 9.Além disso, intervalos tendo valores relatados neste lugarcomo um limite superior ou inferior são pretendidos para estar dentro doescopo da presente invenção. Por exemplo, o sal de cátion divalente tem umpH de pelo menos cerca de (ou cerca de) 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, ou 8.

Em várias formas de realização, a solução tampão tem umaconcentração de sal de cátion divalente no intervalo entre cerca de 0,1 Macerca de 5 M, e em algumas formas de realização entre cerca de 0,5 M a cercade 3M, entre cerca de 1,0 M a cerca de 3 M ou entre cerca de 0,6 M a cerca de2,5 M. Por exemplo, o tampão de cátion divalente pode compreender pelomenos cerca de 0,6 M de CaCl 2, ou pelo menos cerca de 2M de MgCl2 oupelo menos cerca de 2M de CaCl2. Valores e intervalos incluídos e/ouintermediários dentro de intervalos apresentados neste lugar também sãopretendidos para estar dentro do escopo da presente invenção. Por exemplo, asolução tampão tem uma concentração de sal de cátion divalente entre cercade 0,5 M a cerca de 0,75 M, entre cerca de 0,5 M a cerca de 0,8 M, entrecerca de 0,5 M a cerca de 0,9 M, entre cerca de 0,5 M a 1,0 M, entre cerca de0,5 M a 2 M, entre cerca de 1,5 M a cerca de 2,0 M, entre cerca de 1,5 M acerca de 2,5 M, entre cerca de 1,5 M a cerca de 3,0 M, ou entre cerca de 2,5M a cerca de 3 M.

Além disso, intervalos tendo valores relatados neste lugarcomo um limite superior ou inferior são pretendidos para estar dentro doescopo da presente invenção. Por exemplo, a solução tampão tem umaconcentração de sal de cátion divalente de pelo menos cerca de (ou cerca de)0,6 M, 1 M, 1,5 M, 2 M, 2,5 M, ou 3 M. Em várias formas de realização, asolução tampão contendo um sal de cátion divalente tem uma temperatura nointervalo entre cerca de 2°C a cerca de 24°C.

Em várias formas de realização, a etapa de recuperar oanticorpo do agente de ligação Fc compreende eluir o anticorpo usando umtampão de eluição tendo um pH no intervalo de cerca de 2,0 a cerca de 6,5,preferivelmente no intervalo de cerca de 2,0 a cerca de 4,0, maispreferivelmente no intervalo de cerca de 2,5 a cerca de 3,5. Valores eintervalos incluídos e/ou intermediários dentro de intervalos apresentadosneste lugar também são pretendidos para estar dentro do escopo da presenteinvenção. Por exemplo, o tampão de eluição tem um pH de entre cerca de 2 acerca de 3 ou entre cerca de 3 a cerca de 4.

Além disso, intervalos tendo valores relatados neste lugarcomo um limite superior ou inferior são pretendidos para estar dentro doescopo da presente invenção. Por exemplo, o tampão de eluição tem um pHde pelo menos cerca de (ou cerca de) 2, 2,5, 3, 3,5 ou 4.

Em várias formas de realização, as proteínas recuperadaspodem ser sujeitas a etapas de purificação adicionais ou antes de, ou depoisde, a etapa de cromatografia de agente de ligação Fe. Por exemplo, etapas depurificação adicionais exemplares incluem, mas não são limitadas a:cromatografia de troca aniônica, cromatografia de troca catiônica,cromatografia de afinidade de metal imobilizado, cromatografia de interaçãohidrofóbica (HIC), cromatografia de hidroxiapatita, diálise, cromatografia deafinidade, precipitação com sulfato de amônio, precipitação com etanol,HPLC de fase reversa (RP-HPLC), cromatofocagem, ultrafiltração,diafiltração, microfiltração, e filtração em gel. Em várias formas derealização, a etapa de cromatografia de agente de ligação Fc é seguido poruma cromatografia de troca aniônica e uma etapa de HIC. Em várias formasde realização, as etapas de cromatografia são adicionalmente seguidas poruma etapa de filtração de vírus, uma etapa de ultrafiltração/diafiltração, e/ouuma etapa de filtração de contaminante microbiano.

Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos parapurificar uma proteína de ligação Αβ, preferivelmente um anticorpo anti-Αβ,a partir de uma solução contendo impureza destes. Em várias formas derealização, os métodos compreendem primeiro adsorver a proteína a umagente de ligação Fc, seguido por lavagem do agente de ligação Fc com umasolução tampão contendo um sal de cátion divalente para remover uma oumais impurezas, e recuperando subseqüentemente a proteína do agente deligação Fc para produzir uma primeira combinação de eluente.

Em várias formas de realização, o processo de purificaçãocontinua com sujeição da primeira combinação de eluente a cromatografia detroca iônica colocando em contato uma resina de troca iônica com a primeiracombinação de eluente de forma que a proteína alvo não adsorve à resina erecuperando a proteína alvo de fluxo para produzir uma segunda combinaçãode eluente. Em várias formas de realização, a etapa de cromatografia de trocaiônica compreende adicionalmente lavar a resina de troca iônica com umasolução de lavagem tamponada para recuperar pelo menos uma porção dequalquer proteína alvo adsorvida.

Em várias formas de realização, o processo de purificaçãocontinua com sujeição da segunda combinação de eluente a cromatografia deinteração hidrofóbica adsorvendo a proteína alvo a uma resina de interaçãohidrofóbica (e.g., uma fase sólida funcionalizada com ligantes hidrofóbicos),lavando a resina de interação hidrofóbica com uma solução de lavagemtamponada com uma força iônica que substancialmente não elui a proteínaalvo e recuperando a proteína alvo purificada (tipicamente usando um tampãode eluição com uma força iônica baixa suficiente para remover do absorventea proteína alvo da resina de interação hidrofóbica).

Em formas de realização preferidas dos vários aspectos dasinvenções, o agente de ligação Fc é imobilizado em uma fase sólida, que épreferivelmente equilibrada com um tampão adequado antes de colocar emcontato com o líquido fonte. A fase sólida é preferivelmente uma colunacompreendendo agarose imobilizando o agente de ligação Fe. Em váriasformas de realização, a coluna é revestida com um reagente, tal como glicerol,para diminuir ou prevenir aderência não específica à coluna.Em várias formas de realização, as proteínas purificadas pelosmétodos da presente invenção podem ser formuladas em um carreadorfarmaceuticamente aceitável e usadas para vários usos diagnósticos,terapêuticos ou outros conhecidos para tais moléculas.

Em vários aspectos, a presente invenção fornece métodos parapurificar uma proteína de ligação Αβ, preferivelmente um anticorpo anti-Αβ,a partir de uma solução contendo a proteína e variantes de transleitura deíntron (MT) desta. Em aspectos apresentados, métodos da presente invençãosão usados para reduzir os níveis de uma ou mais espécies variantes detransleitura de íntron em uma preparação de proteína, por exemplo, em umapreparação de anticorpo. Em várias formas de realização, a proteínarecuperada do agente de ligação Fc tem um nível de variantes de transleiturade íntron que é pelo menos 5 vezes menor do que o nível de variantes detransleitura de íntron no líquido fonte, e em algumas formas de realizaçãopelo menos 10 vezes menor do que o nível de variantes de transleitura deíntron no líquido fonte. Em várias formas de realização, as variantes detransleitura de íntron compreendem menos do que cerca de 1,0%, 0,8%, 0,5%,0,2% ou 0,1% das espécies de dita proteína na solução contendo dita proteínarecuperada do agente de ligação Fc.

Em vários aspectos, a presente invenção fornece métodos parapurificar uma proteína de ligação Αβ, preferivelmente um anticorpo anti-Αβ,a partir de uma solução contendo a proteína e variantes de baixo pesomolecular (LMW) desta. Em aspectos apresentados, métodos da presenteinvenção são usados para reduzir os níveis de uma ou mais espécies variantesde baixo peso molecular em uma preparação de proteína, tal como umapreparação de anticorpo. Em várias formas de realização, a proteínarecuperada do agente de ligação Fc tem um nível de variantes de baixo pesomolecular que é pelo menos 5 vezes menor do que o nível de variantes debaixo peso molecular no líquido fonte, e em algumas formas de realizaçãopelo menos 10 vezes menor do que o nível de variantes de baixo pesomolecular no líquido fonte. Em várias formas de realização, as variantes debaixo peso molecular compreendem menos do que cerca de 1,0%, 0,8%,0,5%, 0,2% ou 0,1% das espécies de dita proteína na solução contendo ditaproteína recuperada do agente de ligação Fc.

Em vários aspectos, a presente invenção fornece métodos parapurificar uma proteína de ligação Αβ, preferivelmente um anticorpo anti-Αβ,a partir de uma solução contendo a proteína e variantes ligadas sob dissulfeto(UDB) em. Em aspectos apresentados, métodos da presente invenção sãousados para reduzir os níveis de uma ou mais espécies de variante ligada sobdissulfeto em uma preparação de proteína, tal como uma preparação deanticorpo. Em várias formas de realização, a proteína recuperada do agente deligação Fc tem um nível de variantes ligadas sob dissulfeto que é pelo menos5 vezes menor do que o nível de variantes ligadas sob dissulfeto no líquidofonte, e em algumas formas de realização pelo menos 10 vezes menor do queo nível de variantes ligadas sob dissulfeto no líquido fonte. Em várias formasde realização, as variantes ligadas sob dissulfeto compreendem menos do quecerca de 20%, 15%, 10%, 5%, 2% ou 1% das espécies de dita proteína nasolução contendo dita proteína recuperada do agente de ligação Fc.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma proteínade ligação Αβ, preferivelmente um anticorpo anti-Αβ, purificado de acordocom qualquer dos métodos que compreendem pelo menos as etapas deprimeiro adsorver a proteína a um agente de ligação Fc, seguido por lavagemdo agente de ligação Fc com uma solução tampão contendo um sal de cátiondivalente para remover uma ou mais impurezas, e recuperandosubseqüentemente a proteína do agente de ligação Fe. Em várias formas derealização, o anticorpo anti-Αβ é um anticorpo anti-Αβ humanizadoselecionado a partir do grupo consistindo de 3D6, 10D5, 12B4, 12A11,15C11 e 266.. Em várias formas de realização, o anticorpo anti-Αβ é umanticorpo anti-Αβ humanizado selecionado a partir do grupo consistindo de3D6, 10D5, 12B4, e 12A11.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um sistemaadequado para realizar qualquer dos métodos que compreendem pelo menosas etapas de primeiro adsorver a proteína de ligação Αβ que tem uma regiãoFc, tal como um anticorpo anti-Αβ, a um agente de ligação Fc, seguido porlavagem do agente de ligação Fc com uma solução tampão contendo um salde cátion divalente para remover uma ou mais impurezas, e recuperandosubseqüentemente a proteína do agente de ligação Fc.

Em outro aspectos, a presente invenção fornece uma série depurificação para realizar qualquer dos métodos que compreendem pelo menosas etapas de primeiro adsorver a proteína de ligação Αβ, preferivelmente umanticorpo anti-Αβ, a um agente de ligação Fc, seguido por lavagem do agentede ligação Fc com uma solução tampão contendo um sal de cátion divalentepara remover uma ou mais impurezas, e recuperando subseqüentemente aproteína do agente de ligação Fc.

A presente invenção também retrata, em vários aspectos, kitspara uso para realizar um ou mais dos métodos da presente invenção. Emvárias formas de realização, o kit compreende pelo menos um reagente einstruções para uso do kit. Por exemplo, um kit pode compreender um oumais reagentes tal como um agente de ligação Fc, um sal de cátion divalente ereagentes para a preparação de solução de lavagem de tampão contendo umsal de cátion divalente, junto com instruções para uso do kit, e.g, parapurificar uma proteína de ligação Αβ, e.g., anticorpo anti-Αβ.

BREVE DESCRIÇÃO DAS ILUSTRAÇÕES

Figure 1 mostra as seqüências de aminoácidos completas dascadeias leves e pesadas de anticorpo anti-Αβ 3D6 humanizado versão 2(hu3D6.v2), SEQ ID NOl e SEQ ID NO:2, respectivamente. Regiõesdeterminantes de complementaridade de cadeia leve (CDR), i.e., CDRl,CDR2, e CDR3 estão, respectivamente, em posições de resíduos 24-39, 55-61, e 94102 (quadro superior). Regiões determinantes de complementaridadede cadeia pesada (CDR), i.e., CDRl, CDR2, e CDR3 estão, respectivamente,em posições de resíduos 40-44, 50-65, e 99-108 (quadro inferior). Ligaçõesdissulfeto intramoleculares previstas são ilustradas por conexões dos resíduosde cisteína envolvidos. Cisteínas que são esperadas formarem ligaçõesdissulfeto intermoleculares são sublinhadas e a conectividade indicada. O sítioconsenso de glicosilação N-Iigada da cadeia pesada de anticorpo é indicadoem itálico em posições de resíduos 299-301 (quadro inferior). A lisina Cterminal de cadeia pesada prevista é mostrada em parênteses.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Antes de descrever adicionalmente a invenção, pode ser útilpara a compreensão desta apresentar definições de certos termos a seremusados neste lugar. As definições apresentadas neste lugar foram agrupadaspara facilidade de referência apenas e não como forma de limitação.

Definições Relacionadas a Proteínas

A presente invenção retrata métodos de purificar Proteínas deligação Αβ, em particular, anticorpos de ligação Αβ. Em particular, ainvenção retrata a purificação de proteínas tendo regiões constantes, emparticular, proteínas tendo regiões Fc (e.g., anticorpos), produzidas em culturacelular. Em vários aspectos, a presente invenção fornece métodos parapurificar uma proteína de ligação Αβ que contém uma região Fc, tal como umanticorpo anti-Αβ, a partir de uma solução contendo a proteína e uma ou maisvariantes de leitura desta, tal como, por exemplo, variantes de transleitura deíntron. Em aspectos apresentados, métodos da presente invenção são usadospara reduzir os níveis de uma ou mais espécies de variante de transleitura deíntron (IRT) em uma preparação de proteína, por exemplo, em umapreparação de anticorpo. Os termos "variante de transleitura de íntron," e"espécie de variante de transleitura de íntron" são usados permutavelmenteneste lugar e se referem ao produto de um processo onde, na síntese daproteína de ligação Αβ, alongamento de cadeia de polipeptídeos é terminadaantes de transcrição de uma região de codificação por um códon de parada noíntron antes da região de codificação. O resultado é uma variante da proteínade interesse (i.e., uma variante de transleitura de íntron) com um ou maisdomínios incompletos ou ausentes. Tais íntrons podem conter mais do que umcódon de parada resultando na possibilidade de produzir diversas variantes detransleitura de íntron diferentes.

O termo "variante ligada sob dissulfeto" (ou "UDB") se referea qualquer espécie onde pelo menos uma ligação dissulfeto está faltando. Aligação dissulfeto ausente pode ser ou uma ligação dissulfeto intercadeia ouuma ligação dissulfeto intracadeia ou uma combinação das duas.

O termo "espécie de baixo peso molecular" ou espécie "LMW"se refere a variantes da proteína de ligação Αβ, e.g., anticorpo anti-Αβ,incluindo uma espécie de proteína que consiste de cadeia pesada livre, cadeialeve livre, espécie de IRT, meia molécula, e três-quartos de molécula, oumisturas destas.

Proteína A é uma proteína de parede celular de cerca de 42 kDencontrada na maioria das linhagens de Staphylococcus aureas que se ligacom alta afinidade (cerca de 10" Ma IgG humana) à região Fc de anticorpos.Como usado neste lugar, o termo "Proteína A" abrange Proteína A recuperadade uma fonte nativa desta, Proteína A produzida sinteticamente (e.g., porsíntese peptídica, por técnicas recombinantes, etc.), e variantes destas queretêm a capacidade de se ligar a proteínas que têm uma região CH2/ CH3.

Proteína G é uma proteína de parede celular de estreptococosdo grupo G. Proteína G é um receptor de Fc tipo III que se liga com altaafinidade à região Fc de anticorpos, em particular, anticorpos IgG. Comousado neste lugar, o termo "Proteína G" abrange Proteína G recuperada deuma fonte nativa desta, Proteína G produzida sinteticamente (e.g., por síntesepeptídica, por técnicas recombinantes, etc.), e variantes destas, que retêm acapacidade de se ligar a proteínas que têm uma região Fc.

Os termos "proteína β-amilóide", "Peptídeo β-amilóide", "β-amilóide", "Αβ" e "peptídeo Αβ" são usados permutavelmente neste lugar.

O termo "proteína de ligação Αβ" como usado neste lugar épretendido para se referir a uma proteína capaz de se ligar especificamente apeptídeo(s) Αβ ou a epítopo(s) dentro de dito peptídeo(s) Αβ, ou tendo umaafinidade de ligação considerável para A. Em formas de realizaçãoexemplares, a proteína de ligação Αβ contém uma região Fc de forma que elapode se ligar a um agente de ligação Fc de acordo com os métodos dainvenção.

O termo "anticorpo" ou "imunoglobulina" (usadospermutavelmente neste lugar) se refere a uma proteína de ligação a antígenotendo uma estrutura básica de quatro cadeias de polipeptídeos consistindo deduas cadeias pesadas e duas leves, ditas cadeias sendo estabilizadas, porexemplo, por ligações dissulfeto intercadeias, que tem a capacidade de seligar especificamente a antígeno. Tanto cadeias pesadas como leves sãoenoveladas em domínios. O termo "anticorpo" ou "imunoglobulina" incluianticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimentocompleto), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo,anticorpos biespecíficos), anticorpos quiméricos, anticorpos CDR-enxertados,anticorpos humanizados, anticorpos humanos, e anticorpos de cadeia única(scFvs). O termo "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpomonoclonal", como usado neste lugar, se refere a uma população demoléculas de anticorpo que contêm apenas uma espécie de um sítio de ligaçãode antígeno capaz de reconhecer e se ligar a um epítopo particular de umantígeno alvo, por exemplo, um(uns) epítopo(s) de Αβ. A composição deanticorpo monoclonal assim tipicamente apresenta uma única especificidadede ligação e afinidade para um antígeno alvo particular com o qual elaimunoreage. Anticorpos não humanos podem ser "humanizados" por técnicasdescritas, por exemplo, em Patente Norte-Americana No. 5.225.539. Em ummétodo, as CDRs não humanas são inseridas em uma seqüência de arcabouçode anticorpo humano ou anticorpo consenso. Mudanças adicionais podem serintroduzidas no arcabouço de anticorpo para modular afinidade ouimunogenicidade.

O termo "anticorpo anti-Αβ" é pretendido para se referir a umanticorpo tendo especificidade de ligação para um peptídeo Αβ de umaproteína precursora de amilóide humano (APP). Peptídeo Αβ também éconhecido na técnica como peptídeo beta amilóide. Peptídeo Αβ é umfragmento interno de aproximadamente 4 kD de 39-43 aminoácidos de APP(Αβ39, Αβ40, Αβ41, Αβ42 e Αβ43, respectivamente). O termo "anticorpo anti-Αβ" é pretendido para abranger anticorpos tendo especificidade de ligaçãopara qualquer destas formas de peptídeo Αβ. Anticorpos anti-Αβ específicosde interesse incluem, mas não são limitados a, 3D6, 10D5, 12B4, 12A11,15C11 e 266, e versões humanizadas destes. Anticorpos anti-Αβ exemplaressão descritos em Pedido de Patente Norte-Americana No. de Série10/010.942, depositado em 6 de Dezembro de 2001 (Publicação de PatenteNorte-Americana No. 20030165496A1; veja também Publicação de PCT No.WO 2002/4623 7A2); Pedido de Patente Norte-Americana No. de Série10/388.389, depositado em 12 de Março de 2003 (Publicação de PatenteNorte-Americana No. 20040087777A1; veja também Publicação de PCT No.WO 2004/080419A2); Pedido de Patente Norte-Americana No. de Série10/388.214, depositado em 12 de Março de 2003 (Publicação de PatenteNorte-Americana No. 20040082762Al; veja também Publicação de PCT No.WO 2003/077858A2); Pedido de Patente Norte-Americana No. de Série10/858,855, depositado em 1 de Junho de 2004 (Publicação de Patente Norte-Americana No. 20050118651 Al; veja também Publicação de PCT No. WO2004/108895A2); e Pedido de Patente Norte-Americana No. de Série11/304.986, depositado em 15 de Dezembro de 2005; veja tambémPCT/US05/45515); os conteúdos inteiros de todos os quais são pelo presenteincorporados por referência.

Anticorpos anti-Αβ exemplares adicionais são descritos emPedido de Patente Norte-Americana No. de Série 10/226.435, depositado em26 de Fevereiro de 2001 (Publicação de Patente Norte-Americana No.20040043418A1; veja também Publicação de PCT No. W001/062801A2),Pedido de Patente Norte-Americana No. de Série 10/487.322, depositado em14 de Agosto de 2002 (Publicação de Patente Norte-Americana No.20040192898A1; veja também Publicação de PCT No. W003/016466A2);Pedido de Patente Norte-Americana No. de Série 10/476.265, depositado em26 de Abril de 2002 (Publicação de Patente Norte-Americana No.20050090648A1; veja também Publicação de PCT No. W002/088306A2);Pedido de Patente Norte-Americana No. de Série 10/497.475, depositado em26 de Abril de 2002; (Publicação de Patente Norte-Americana No.20050142131A1; veja também Publicação de PCT No. W002/088307A2); ePedido de Patente Norte-Americana No. de Série 10/505.313, depositado em20 de Fevereiro de 2003; (Publicação de Patente Norte-Americana No.20050169925; veja também Publicação de PCT No. W003/070760A2).

O termo "fragmento de anticorpo" se refere a uma parte ouporção de um anticorpo ou cadeia de anticorpo compreendendo menosresíduos de aminoácidos do que um anticorpo intacto ou completo ou cadeiade anticorpo. Fragmentos podem ser obtidos através de tratamento químico ouenzimático de um anticorpo intacto ou completo ou cadeia de anticorpo.

Fragmentos também podem ser obtidos por meios recombinantes. Fragmentosexemplares incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fabc e/ou Fv. Métodospara a construção de fragmentos Fab são descritos, por exemplo, Huse, et al.(1989) Science 246:1275 1281. Outros fragmentos de anticorpos podem serproduzidos por técnicas conhecidas na técnica incluindo, mas não limitadas a:(i) um fragmento F(ab')2 produzido por digestão com pepsina de umamolécula de anticorpo; (ii) um fragmento Fab gerado reduzindo as pontesdissulfeto de um fragmento F(ab')2; (iii) um fragmento Fab' gerado pelotratamento da molécula de anticorpo com papaína e um agente redutor e (iv)fragmentos Fv. O termo "fragmento de ligação a antígeno" se refere a umfragmento de polipeptídeo de uma imunoglobulina ou anticorpo que se liga aantígeno ou compete com o anticorpo intacto do qual eles foram derivadospor ligação de antígeno específico.

O termo "domínio" se refere a uma região globular de umpolipeptídeo de cadeia pesada ou leve compreendendo alças peptídicas (e.g.,compreendendo 3 a 4 alças peptídicas) estabilizadas, por exemplo, por folha βpregueada e/ou ligação dissulfeto intracadeia. Domínios são adicionalmentereferidos neste lugar como "constantes" ou "variáveis", baseado na ausênciarelativa de variação de seqüência dentro dos domínios de membros de váriasclasses no caso de um domínio "constante", ou a variação significante dentrodos domínios de membros de várias classes no caso de um domínio"variável". Domínios "constantes" na cadeia leve são referidospermutavelmente como "regiões constantes de cadeia leve", "domíniosconstantes de cadeia leve", regiões "CL" ou domínios "CL"). Domínios"constantes" na cadeia pesada são referidos permutavelmente como "regiõesconstantes de cadeia pesada", "domínios constantes de cadeia pesada", regiões"CH" ou domínios "CH"). Domínios "variáveis" na cadeia leve são referidospermutavelmente como "regiões variáveis de cadeia leve", "domíniosvariáveis de cadeia leve", regiões "VL" ou domínios "VL"). Domínios"variáveis" na cadeia pesada são referidos permutavelmente como "regiõesvariáveis de cadeia pesada", "domínios variáveis de cadeia pesada", regiões"VH" ou domínios "VH").

O termo "região" também pode se referir a uma parte ouporção de uma cadeia de anticorpo ou domínio de cadeia de anticorpo (porexemplo, uma parte ou porção de uma cadeia pesada ou leve ou uma parte ouporção de um domínio constante ou variável, como definido neste lugar),assim como partes ou porções mais descontínuas de ditas cadeias oudomínios. Por exemplo, cadeias leves e pesadas ou e domínios variáveis decadeia leve ou pesada incluem "regiões determinantes de complementaridade"ou "CDRs" intercaladas entre "regiões de arcabouço" ou "FRs", comodefinido neste lugar.

O termo "conformação" se refere à estrutura terciária de umaproteína ou polipeptídeo, tal como, por exemplo, um anticorpo, cadeia deanticorpo, domínio ou região desta. Por exemplo, a frase "conformação decadeia leve (ou pesada)" se refere à estrutura terciária de uma região variávelde cadeia leve (ou pesada), e a frase "conformação de anticorpo" ou"conformação de fragmento de anticorpo" se refere à estrutura terciária de umanticorpo ou fragmento deste.

O termo "ligação específica" de um anticorpo significa que oanticorpo exibe afinidade considerável para um antígeno ou epítopo particulare, geralmente, não exibe reatividade cruzada significante. Em formas derealização exemplares, o anticorpo não exibe nenhuma reatividade cruzada(por exemplo, não reage cruzadamente com peptídeos não Αβ ou comepítopos distantes ou distantes em Αβ. Ligação "considerável" ou preferidainclui ligação com uma afinidade de pelo menos le, IO"7, IO"8, IO"9 M, ou 10"M. Afinidades maiores do que Ie M, preferivelmente maiores do que Ie M sãomais preferidas. Valores intermediários daqueles apresentados neste lugartambém são pretendidos para estar dentro do escopo da presente invenção euma afinidade de ligação preferida pode ser indicada como um intervalo deafinidades, por exemplo, IO"6 a IO"10 M, preferivelmente IO"7 a IO4, maispreferivelmente 10" a 10"ιυ M. Um anticorpo que "não exibe reatividadecruzada significante" é um que não irá se ligar consideravelmente a umaentidade indesejável (por exemplo, uma proteína, polipeptídeo, ou peptídeoindesejável). Por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente a Αβ iráse ligar consideravelmente a Αβ mas não irá reagir significantemente comproteínas ou peptídeos não Αβ (por exemplo, proteínas ou peptídeos não Αβincluídos em placas). Um anticorpo específico para um epítopo particular, porexemplo, não irá significantemente reagir cruzadamente com epítoposdistantes ou diferentes na mesma proteína ou peptídeo. Ligação específicapode ser determinada de acordo com qualquer maneira reconhecida na técnicapara determinar tal ligação. Preferivelmente, ligação específica é determinadade acordo com análise de Scatchard e/ou ensaios de ligação competitiva.

Imunoglobulinas ou anticorpos outros do que "biespecíficos"ou "bifuncionais", uma imunoglobulina ou anticorpo é entendido como tendocada um de seus sítios de ligação idênticos. Um "biespecífico" ou "anticorpobifuncional" é um anticorpo híbrido artificial tendo dois pares diferentes decadeia pesada/leve e dois diferentes sítios de ligação. Anticorpos biespecíficospodem ser produzidos por uma variedade de métodos incluindo fusão dehibridomas ou ligação de fragmentos Fab'. Veja, por exemplo, Songsivilai &Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al, J.Immunol. 148, 1547-1553 (1992).

Um "antígeno" é uma molécula (por exemplo, uma proteína,polipeptídeo, peptídeo, carboidrato, ou molécula pequena) contendo umdeterminante antigênico ao qual um anticorpo se liga especificamente.

O termo "epítopo" ou "determinante antigênico" se refere a umsítio em um antígeno ao qual uma imunoglobulina ou anticorpo (ou fragmentode ligação a antígeno deste) se liga especificamente. Epítopos podem serformados tanto a partir de aminoácidos contíguos como aminoácidos nãocontíguos justapostos por enovelamento terciário de uma proteína. Epítoposformados a partir de aminoácidos contíguos são tipicamente retidos emexposição a solventes desnaturantes, ao passo que epítopos formados porenovelamento terciário são tipicamente perdidos em tratamento com solventesdesnaturantes. Um epítopo tipicamente inclui pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos em uma conformação espacialexclusiva. Métodos de determinar conformação espacial de epítopos incluem,por exemplo, cristalografia por raios-X e ressonância magnética nuclearbidimensional. Veja, por exemplo, Epitope Mapping Protocols ín Methods inMoleeularBiology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996).

Em adição aos anticorpos anti-Αβ descritos acima, outrasproteínas de ligação Αβ incluem proteínas de fusão de anticorpos. Os termos"proteína de fusão de anticorpo" e "fusão de anticorpo" se referem a umaproteína de fusão incluindo todo ou uma porção de um anticorpo fundido apelo menos uma porção de proteína não anticorpo ou polipeptídeo. Fusãogeralmente é realizada por engenharia genética do gene codificando ditaproteína. Proteínas de fusão de anticorpos exemplares adicionais incluem aporção de ligação de receptor celular de um anticorpo (incluindo a região Fc)fundido a toda ou uma porção de outra proteína biológica solúvel ou celular,por exemplo um receptor (celular ou solúvel) ou porção deste, uma citocinaou porção desta, uma enzima ou porção desta, etc. Em particular, umaproteína de fusão de anticorpo da invenção que pode compreender a região Fcde um anticorpo fundido a uma porção de proteína não anticorpo oupolipeptídeo que é capaz de se ligar a Αβ.

O termo "agente de ligação Fc" se refere a uma molécula que écapaz de se ligar à região Fc de um anticorpo (e.g., um anticorpo IgG)incluindo, mas não limitado a, uma proteína de complemento, um receptor deFc ou uma proteína bacteriana derivada, tal como Proteína A ou Proteína G,que tem alta afinidade para a região Fc de um anticorpo.

O termo "região Fc" se refere a uma região C terminal de umanticorpo IgG, em particular, a região C terminal da(s) cadeia(s) pesada(s) dedito anticorpo IgG. Embora os limites da região Fc de uma cadeia pesada deIgG possam variar levemente, uma região Fc tipicamente é definida comoabrangendo de cerca de resíduo de aminoácido Cys226 ao término carboxil deuma(s) cadeia(s) pesada(s) de IgG.

Definições Relacionadas à Cromatografia

O termo "líquido fonte", como usado neste lugar, se refere aum líquido contendo pelo menos uma substância alvo que é procurada paraser purificada a partir de outras substâncias também presentes. Líquidos fontepodem, por exemplo, ser soluções aquosas, sistemas de solventes orgânicos,ou misturas ou soluções de solventes aquosos/orgânicos. Os líquidos fonte sãofreqüentemente misturas ou soluções complexas contendo muitas moléculasbiológicas (tal como proteínas, anticorpos, hormônios, e vírus), moléculapequenas (tal como sais, açúcares, lipídios, etc.) e mesmo matéria particulada.

Embora um líquido fonte típico de origem biológica possa começar comouma solução ou suspensão aquosa, ele também pode conter solventesorgânicos usados em etapas de separação anteriores tal como precipitações,extrações de solvente, e os semelhantes. Exemplos de líquidos fonte quepodem conter substâncias biológicas valiosas receptivas para a purificaçãopor várias formas de realização da presente invenção incluem, mas não sãolimitados a, um sobrenadante de cultura de um biorreator, uma suspensãocelular homogeneizada, plasma, frações de plasma, e leite.

O termo "substância alvo" ou "proteína alvo" ou "anticorpoalvo" se refere neste lugar a uma ou mais proteínas de ligação Αβ desejadas,e.g., anticorpos anti-Αβ, para serem purificados a partir do líquido fonte. Asubstância alvo pode estar presente no líquido fonte como uma suspensão ouem solução.

O termo "impurezas" se refere a materiais no líquido fonte quesão diferentes da(s) substância(s) alvo e são desejavelmente excluídos do(s)produto(s) final(finais) de substância alvo. Impurezas típicas incluem ácidosnucléicos, proteínas (incluindo espécies de transleitura de íntron, espécie debaixo peso molecular e espécies ligadas sob dissulfeto), peptídeos,endotoxinas, vírus e moléculas pequenas.

O termo "subproduto" inclui produtos indesejados, quedepreciam, ou diminuem a proporção de proteína terapêutica da invenção.

O termo "espécies de alto peso molecular" se refere acomplexos protéicos que têm um peso molecular que é maior do que daproteína desejada da invenção. No caso de um anticorpo, por exemplo, umanticorpo IgG, tais agregados são maiores do que cerca de 150 kD.

O termo "espécie de baixo peso molecular" se refere aproteínas, por exemplo, produtos de degradação, que têm um peso molecularque é menor do que da proteína desejada da invenção. No caso de umanticorpo, por exemplo, um anticorpo IgG, tais produtos de degradação sãomenores do que cerca de 150 kD.

Como usado neste lugar, o termo "fase sólida" se refere a umamatriz não aquosa com a qual uma substância alvo interage durantepurificação ou com a qual um agente de ligação Fc pode aderir. Materiais defase sólida adequados incluem, mas não são limitados a, vidro, sílica (e.g., gelde sílica), polissacarídeos (e.g., uma matriz de polissacarídeo) tal comoagarose e celulose, polímeros orgânicos tal como poliacrilamida,metilmetacrilato, e copolímeros de poliestirenodivinilbenzeno tal como porexemplo resina de Amberlite™, (comercialmente disponível a partir de Rohm& Haas Chemical Co., Philadelphia, Pa.). A fase sólida pode ser selecionada apartir de qualquer dos grupos de resinas comumente descritas como resinas deafinidade, de troca iônica e captura iônica. A fase sólida pode ser, porexemplo, uma coluna de purificação, uma fase descontínua de partículasdescontínuas, ou uma combinação destas. A fase sólida pode ser de caráterporoso ou não poroso, e pode ser compressível ou incompressível. Em váriasformas de realização, a fase sólida é uma matriz polimérica ou uma partículaou microesfera de agarose. Em várias formas de realização, a fase sólida podeser revestida com um reagente (tal como glicerol), por exemplo, para preveniraderência não específica de impurezas à fase sólida. Uma fase sólida deligação Fc necessita possuir apenas um produto químico ou um liganteassociado que irá permitir que agente de ligação Fc seja aderido à superfícieda fase sólida. Materiais de fase sólida preferidos serão fisicamente equimicamente resilientes para as condições empregadas no processo depurificação incluindo extração e filtração de fluxo cruzado, e temperaturas,pH, e outros aspectos dos líquidos empregados.

"Ligante de afinidade" se refere a uma unidade que se ligaseletivamente ou preferencialmente a um componente do líquido fonte atravésde uma interação específica com um sítio de ligação do componente. Napresente invenção, o ligante de afinidade (e.g., um agente de ligação Fc)tipicamente é imobilizado para a fase sólida tal como uma resina. Exemplosde ligantes de afinidade que podem ser ligados ao suporte de resina parafornecer resinas de cromatografia úteis no processo da presente invençãoincluem, mas não são limitados a, Proteína A, Proteína G, e seus análogos,que se ligam seletivamente a uma região Fc de proteína. Métodos de ligarligante de afinidades a materiais de suporte sólido são bem conhecidos natécnica de purificação. Veja, e.g., os textos de referência Affinity Separations:A Practical Approach (Practical Approach Series), Paul Matejtschuk (Editor),Irl Pr: 1997; e Affinity Chromatography, Herbert Schott, Mareei Dekker, NewYork: 1997.

"Resina de cromatografia de afinidade" ou "resina deafinidade" se refere a uma resina de cromatografia que compreende uma fasesólida ou substrato com ligantes de afinidade ligados a suas superfícies.

"Resina de cromatografia de troca iônica" ou "resina de trocaiônica" se refere a um suporte sólido ao qual são covalentemente ligadosligantes que carregam uma carga positiva ou negativa, e que assim temcontraíons livres disponíveis para troca com íons em uma solução com a quala resina de troca iônica é colocada em contato."Resinas de troca catiônica" se referem a uma resina de trocaiônica com ligantes negativamente carregados ligados covalentemente, e queassim tem cátions livres para troca com cátions em uma solução com a qual aresina é colocada em contato. Uma ampla variedade de resinas de trocacatiônica é conhecida na técnica, por exemplo, aquelas caracterizadas pelofato de que os grupos ligados covalentemente são carboxilato ou sulfonato.Resinas de troca catiônica comercialmente disponíveis incluem celuloseCMC, SP-Sephadex™, e Fast S-Sepharose™ (as últimas duas sendocomercialmente disponíveis a partir de Pharmacia).

"Resinas de troca aniônica" se referem a uma resina de trocaiônica com grupos positivamente carregados ligados covalentemente, talcomo grupos amino quaternários. Resinas de troca aniônica comercialmentedisponíveis incluem celulose DEAE, TMAE, QAE Sephadex™, e Fast QSepharose™ (as últimas duas sendo comercialmente disponíveis a partir dePharmacia).

Como usado neste lugar, o termo "sal caotrópico" se refere aum sal que compreende um ou mais componentes iônicos que são fracos nasérie liotrópica que são capazes de penetrar camadas de hidratação de proteínae se ligar diretamente a suas superfícies. Isto interrompe associação co-hidrativa, favorecendo solubilização de proteína. Exemplos de saiscaotrópicos incluem, mas não são limitados a, sais de haletos dos elementosde Grupo II (e.g., cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, cloreto de bário,brometo de cálcio, brometo de magnésio, brometo de bário, iodeto de cálcio,iodeto de magnésio, iodeto de bário).

Exemplos de sais de cátions divalentes adequados incluem,mas não são limitados a, sais de Mn2+ Ni2+ ou Cu2+ , Mg2+ , Ca2+ e Ba2+ comtiocianato (SCN), perclorato (Cl04), nitrato (NO3"), cloreto (cr), e brometo(Br); e combinações destes.

Em certas formas de realização, o sal de cátion divalentecompreende um cátion divalente (e.g., Mg2+, Ca2+, Ni2+ ou Ba2+). Saiscaotrópicos preferidos para uso nos processos retratados são MgCl2, NiCl2 eCaCl2. Depois da etapa de lavagem de sal de cátion divalente, a proteína alvoé eluída da matriz de cromatografia de afinidade.

Um "tampão" é uma substância que, por sua presença emsolução, aumenta a quantidade de ácido ou álcali que deve ser adicionada paracausar mudança unitária em pH. Uma solução tamponada resiste a mudançasem pH pela ação de seus componentes conjugados de ácido-base. Soluçõestamponadas para uso com reagentes biológicos geralmente são capazes demanter uma concentração constante de íons de hidrogênio de forma que o pHda solução está dentro de um intervalo fisiológico. O termo "pH fisiológico"se refere ao pH de sangue de mamífero (i.e., 7,38, ou cerca de 7,4). Assim umintervalo de pH fisiológico é de cerca de 7,2 a 7,6. Componentes tradicionaisde tampão incluem, mas não são limitados a, sais orgânicos e inorgânicos,ácidos e bases. Tampões exemplares para uso em purificação de moléculasbiológicas (e.g., moléculas de proteínas) incluem os Tampões zwitteriônicosou de "Good", veja e.g., Good et al. (1966) Biochemistry 5:467 e Good andIzawa (1972) Methods Enzymol. 24:62. Tampões exemplares incluem masnão são limitados a TES, MES, PIPES, HEPES, MOPS, MOPSO, TRICINE eBICINE.

O "tampão de equilíbrio" neste lugar é um tampão usado parapreparar o reagente de ligação Fc, fase sólida, ou ambos, para carregamentodo líquido fonte contendo a proteína alvo. O tampão de equilíbriopreferivelmente é isotônico e comumente tem um pH no intervalo de cerca de6 a cerca de 8. O "tampão de carregamento" é um tampão usado para carregaro líquido fonte contendo a proteína de ligação Αβ, e.g, anticorpo anti-Αβ, eimpurezas na fase sólida com a qual o agente de ligação Fc é imobilizado.Freqüentemente, os tampões de equilíbrio e de carregamento são os mesmos.

O "tampão de eluição" é usado para eluir a proteína de ligação Αβ do agentede ligação Fc imobilizado. Preferivelmente o tampão de eluição tem um pHbaixo e com isso rompe interações entre o agente de ligação Fc e a proteína deinteresse. Preferivelmente, o tampão de eluição com pH baixo tem um pH nointervalo de cerca de 2 a cerca de 5, mais preferivelmente no intervalo decerca de 3 a cerca de 4. Exemplos de tampões que irão controlar o pH dentrodeste intervalo incluem tampões de glicina, fosfato, acetato, citrato e amônio,assim como combinações destes. Os tais tampões preferidos são tampões decitrato e acetato, mais preferivelmente tampões de citrato de sódio ou acetatode sódio. Outros tampões de eluição são contemplados incluindo tampõescom pH alto (e.g., aqueles tendo um pH de 9 ou mais) ou tampõescompreendendo um composto ou composição tal como MgCl2 (2 mM) paraeluir a proteína de interesse.

"Líquido de lavagem" ou "tampão de lavagem" como usadoneste lugar se referem todos neste lugar ao líquido usado para levar emboraimpurezas da resina de cromatografia a qual é ligada a substância alvo. Maisdo que um líquido de lavagem pode ser empregado seqüencialmente, e.g.,com os líquidos de lavagem sucessivos tendo propriedades variadas tal comopH, condutividade, concentração de solvente, etc., projetadas para dissociar eremover tipos variados de impurezas que não são especificamente associadoscom a resina de cromatografia.

"Líquido de eluição" ou "tampão de eluição" se refere nestelugar ao líquido que é usado para dissociar a substância alvo da resina decromatografia depois dela ter sido lavada com um ou mais líquidos delavagem. O líquido de eluição atua para dissociar a substância alvo semdesnaturá-la irreversivelmente. Líquidos de eluição típicos são bemconhecidos na técnica de cromatografia e podem ter concentrações superioresde sais, ligantes livres de afinidade ou análogos, ou outras substâncias quepromovem dissociação da substância alvo da resina de cromatografia.

"Condições de eluição" se referem a condições de processo impostas em umaresina de cromatografia ligada à substância alvo que dissocia a substânciaalvo da resina de cromatografia, tal como colocar em contato a resina decromatografia ligada à substância alvo com um líquido de eluição ou tampãode eluição para produzir tal dissociação.

"Líquido de limpeza" ou "tampão de limpeza" se refere nestelugar ao líquido que é usado para lavar a resina de cromatografia depois daconclusão do processo de purificação. O líquido de limpeza pode conter umdetergente, um agente inativador de vírus, ou concentrações relativamentealtas de sais, e pode ter um pH maior ou menor do que os líquidos usadosdurante o processo de purificação. Seu propósito é descontaminar a resina decromatografia para torná-la pronta para reuso. Líquidos de limpeza típicos sãobem conhecidos na técnica de cromatografia.

"Líquido de armazenamento" ou "tampão de armazenamento"se refere neste lugar ao líquido no qual a resina de cromatografia é suspensaentre usos. Líquidos de armazenamento, em adição a íons tamponantes,também podem conter microbicidas ou outros conservantes. Tais líquidos dearmazenamento são bem conhecidos na técnica de cromatografia.

Em vários aspectos, a presente invenção retrata métodos parapurificar uma proteína de ligação Αβ, preferivelmente um anticorpo anti-Αβ,a partir de um líquido fonte compreendendo a proteína e uma ou maisimpurezas adsorvendo a proteína a um agente de ligação Fc, seguido porlavagem do agente de ligação Fc com uma solução tampão contendo um salde cátion divalente para remover uma ou mais impurezas, e recuperandosubseqüentemente a proteína do agente de ligação Fc. Agentes de ligação Fcadequados incluem, mas não são limitados a, Proteína A e Proteína G.

A presente invenção retrata processos para a purificação deproteínaS de ligação Αβ, em particular anticorpos anti-Αβ. Processos depurificação exemplares incluem uma etapa de cromatografia de afinidade. Aetapa de cromatografia de afinidade pode ser contínua, descontínua, ou umacombinação de ambas. Por exemplo, a etapa de cromatografia de afinidadepode ser realizada como um processo descontínuo, tal como, por exemplo, umprocesso em batelada. Cromatografia de afinidade é o processo de adsorçãobioseletiva e subseqüente recuperação de um composto alvo de um liganteimobilizado. Este processo leva em conta a purificação altamente específica eeficiente do composto alvo. O processo requer a utilização de um liganteapropriadamente seletivo (e.g., agente de ligação Fc) que irá se ligar aocomposto alvo (e.g., anticorpo anti-Αβ) geralmente com uma constante dedissociação no intervalo de 10" a 10" , embora permitindo recuperação emcondições brandas. O ligante geralmente é imobilizado em uma matriz decontas e porosa que pode estar na forma de um meio de empacotamento decoluna ou adsorção em batelada.

Um agente de ligação preferido é Proteína A. Proteína A seliga à região Fc de imunoglobulinas. Proteína A consiste de seis regiões, cincodas quais se ligam a IgG. Ela se liga com alta afinidade a IgGi, IgG2 e IgG4humanas, assim como IgG2a, IgG2b e IgG3 de camundongo. Proteína A se ligacom afinidade moderada a IgD, IgM, IgA e IgE humanas assim como IgGj decamundongo. Como um ligante de afinidade, proteína A é imobilizada a umamatriz de forma que estas regiões estão livres para se ligar. Uma molécula deproteína A imobilizada pode se ligar a pelo menos duas moléculas de IgG.Versões nativas e recombinantes de proteína A compartilham especificidadesimilar para a região Fc de IgG. Proteína A recombinante (rProteína A) podeser manipulada para incluir, por exemplo, uma cisteína C terminal, e pode serimobilizada através de acoplamento de tioéster a uma matriz de fase sólida.Tal acoplamento resulta em capacidade de ligação estimulada da proteína A.

Um agente de ligação alternativo é Proteína G. Proteína G éespecífica para IgG, ligação com alta afinidade para IgGi, IgG2, IgG3 e IgG4humanas, assim como IgGi e IgG3 de camundongo. Proteína G PLUS temafinidade moderada para IgG4 humana e IgG2a, IgG2b e IgG3 decamundongo. Proteína G recombinante (r ProteínaG) pode ser manipuladapara deletar a região de ligação de albumina da proteína nativa. Proteína Grecombinante contém duas regiões de ligação Fc.

Um agente de ligação alternativo é Proteína A/G. Proteína A/Gé uma proteína geneticamente modificada que combina os perfis de ligação deIgG tanto de Proteína A como Proteína G. Ela é um produto de fusão de genesecretado a partir de uma forma não patogênica de Bacillus. Proteína A/Gcontém quarto domínios de ligação Fc de Proteína A e dois de Proteína G.Proteína A/G não é tão dependente de pH como Proteína A, mas de outramaneira tem as propriedades aditivas de Proteína AeG.

Proteína A/G se liga a todas as subclasses de IgG humana,particularmente adequada para purificação de anticorpos IgG policlonais oumonoclonais cujas subclasses não foram determinadas. Em adição, ela se ligaa IgA, IgE, IgM e (em um menor grau) IgD. Proteína A/G' também se ligabem a todas as subclasses de IgG de camundongo, particularmente adequadapara purificação de anticorpos monoclonais de camundongo de subclasses deIgG, sem interferência de IgA, IgM e albumina no soro murino. (Veja e.g.,Sikkema. (1989) Amer. Biotech. Lab 7, 42.) Subclasses individuais demonoclonais de camundongos podem ter uma afinidade mais forte pelaProteína A/G quimérica do que ou por Proteína A ou Proteína G. (Veja e.g.,Eliasson et al. (1988) J Biol. Chem. 263,4323-4327.)

Na presente invenção, o agente de ligação Fc imobilizado(e.g., Proteína A) é lavado com uma solução de sal de cátion divalente pararemover impurezas. Em particular, foi verificado que impurezas indesejáveisproduzidas como um resultado de tecnologias de expressão de anticorporecombinante podem ser removidas usando uma etapa de lavagem de sal decátion divalente.

Os métodos da presente invenção podem opcionalmenteincluir etapas de purificação subseqüentes à cromatografia de afinidade eetapa de lavagem de cátion divalente. Etapas de purificação subseqüentespodem incluir uma etapa de cromatografia de troca iônica e/ou uma etapa decromatografia de interação hidrofóbica (HIC). Etapas de cromatografiasubseqüentes podem ser contínuas, descontínuas (e.g., tal como um processoem batelada), ou uma combinação de ambas. Cromatografia de troca iônicasepara moléculas baseado em diferenças entre a carga geral das proteínas. Aproteína alvo deve ter uma carga contrária àquela do grupo funcionalacoplado à resina a fim de se ligar. Por exemplo, anticorpos, que geralmentetêm uma carga geral positiva, irão se ligar bem a trocadores de cátions, quecontêm grupos funcionais negativamente carregados. Devido ao fato destainteração ser iônica, ligação deve ocorrer em condições iônicas fracas.Eluição é atingida aumentando a força iônica para romper a interação iônica,ou mudando o pH da proteína. Ao passo que cromatografia de troca iônica sebaseia nas cargas de proteínas para as isolar, cromatografia de interaçãohidrofóbica usa as propriedades hidrofóbicas de algumas proteínas. Gruposhidrofóbicos na proteína se ligam a grupos hidrofílicos na coluna. Quantomais hidrofóbica uma proteína é, mais forte é sua ligação à coluna. A etapa deHIC remove, por exemplo, impurezas derivadas de célula hospedeira (e.g.,DNA e outras espécies relacionadas a produtos de alto e baixo pesomolecular). Etapas de purificação adicionais podem incluir etapas de remoçãode vírus assim como etapas de ultrafiltração e/ou diafiltração, como descritoneste lugar.

Em várias formas de realização, a região Fc contendo proteínaé um anticorpo ou uma proteína de fusão de anticorpo tendo uma região Fcque se liga a um receptor de Fc do agente de ligação Fe. O uso da soluçãotampão contendo um sal de cátion divalente para levar o agente de ligação Fcé responsável por maior remoção de impurezas, tal como, por exemplo,variantes de leitura e fragmentos contendo região constante (incluindoespécies de LMW e UDB), da proteína de interesse (e.g., a substância alvo nolíquido fonte).

Os métodos da presente invenção compreendem uma ou maisetapas de separação cromatográfica e em adição podem compreender uma oumais etapas de filtração para separar uma proteína de ligação Αβ ("a proteínaalvo") de impurezas em um líquido fonte.

Por exemplo, o líquido fonte pode ser filtrado, centrifugado oude outra maneira processado para remover fragmentos particulados e ossemelhantes antes de colocar em contato o líquido fonte com o agente deligação Fe. Por exemplo, usando técnicas recombinantes, proteínas podem serproduzidas intracelularmente, no espaço periplasmático, ou secretadasdiretamente no meio de cultura. Se a proteína é produzida intracelularmente,os fragmentos particulados, ou células hospedeiras ou fragmentos lisados,podem ser removidos, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração. Ondea proteína é secretada no meio, as células hospedeiras recombinantes podemser separadas do meio de cultura celular, por exemplo, por filtração por fluxotangencial.

Em várias formas de realização, o líquido fonte contendo aproteína alvo é colocado em contato com um agente de ligação Fc(preferivelmente imobilizado em uma fase sólida e equilibrado com umtampão adequado) de forma que a proteína alvo adsorve para o agente deligação Fc (e.g., um agente de ligação Fc imobilizado). O líquido fonte écolocado em contato com o agente de ligação Fc (e.g., um agente de ligaçãoFc imobilizado) em um tampão de carregamento que pode ser o mesmo que otampão de equilíbrio. Na medida em que o líquido fonte contendo impurezapassa através fase sólida, a proteína alvo é adsorvida ao agente de ligação Fc evárias outras impurezas (tal como proteínas de célula hospedeira, onde aproteína alvo é produzida em uma célula hospedeira recombinante, ou outrasimpurezas derivadas de processo) passam por ou se ligam nãoespecificamente à fase sólida. Em várias formas de realização, o agente deligação Fc é Proteína A, e o tampão de equilíbrio pode ser 20 mM de Tris,0,15 M de NaC 1, pH 7,5. Outros tampões de equilíbrio adequados incluem,por exemplo, BIS, HEPES, etc., em concentrações fisiológicas, por exemplo,concentração no intervalo entre cerca de 0,5 mM e cerca de 100 mM (e.g., 10mM, 20 mM, 50 mM, etc.), e concentrações salinas fisiológicas (e.g., cerca de0,15 mM de NaC 1), e em pH de 5,0-9,0.

A fase sólida é preferivelmente uma microesfera ou partículade agarose (e.g., Sepharose) para imobilizar o agente de ligação Fe. Em váriasformas de realização, a coluna é revestida com um reagente, tal como glicerol,para diminuir ou prevenir aderência não específica à coluna. Em váriasformas de realização, o agente de ligação Fc é Proteína A. A coluna nnpProteína A Sepharose™ Fast Flow (FF), comercialmente disponível a partirde Amersham Biosciences, é um exemplo de uma coluna de Proteína Aadequada para uso nas metodologias retratadas.

O agente de ligação Fc é então lavado com uma solução delavagem tamponada contendo um sal de cátion divalente para removerespécies variantes de proteínas ligadas à fase sólida ou agente de ligação Fc.Em particular, foi verificado que o uso de uma etapa de lavagem de sal decátion divalente pode remover uma quantidade significante de impurezasindesejáveis. Especificamente, foi verificado que variantes de transleitura deíntron, variantes de baixo peso molecular e variantes ligadas sob dissulfeto deum anticorpo anti-Αβ podem ser removidas usando uma lavagem de sal decátion divalente. Além disso, proteínas de célula hospedeira (HCP) e DNAtambém podem ser removidos usando a lavagem de sal de cátion divalente.Em várias formas de realização, o sal de cátion divalente na solução delavagem contém um sal caotrópico. Exemplos de sais caotrópicos adequadosincluem, mas não são limitados a, cloreto de cálcio (CaCl2), cloreto de níquel(NiCl2) e cloreto de magnésio (MgCl2). Embora um único sal de cátiondivalente possa estar presente na solução de lavagem, em várias formas derealização, dois ou mais sais de cátion divalente podem ser usados.

Em várias formas de realização, soluções de lavagem emadição ao sal de cátion divalente contendo solução de lavagem são usadaspara remover impurezas. Por exemplo, em várias formas de realização umasolução de 20 a 50 mM de Tris, 0,75 a 2,0 M de NaC 1, pH 5,0-9,0, e/ou umasolução de 10 mM de Tris, pH 7,5 são usadas para lavar o agente de ligaçãoFc antes de, depois de, ou tanto antes como depois de, lavar agente de ligaçãoFc com o sal de cátion divalente contendo solução de lavagem.

Em várias formas de realização, o sal de cátion divalentepreferivelmente é adicionado em uma concentração entre cerca de 0,5 M ecerca de 2,5 M a uma solução com pH tamponado tendo um pH no intervalode cerca de 5 a cerca de 9, e preferivelmente um pH no intervalo de cerca de 7a cerca de 8. Concentrações preferidas do sal de cátion divalente incluem, masnão são limitadas a, 0,6 M, 2,0 M e 2,5 M. Tampões adequados para estepropósito incluem, mas não são limitados a, tampões Tris ou acetato em umaconcentração de 20 a 50 mM.

Seguindo a(s) etapa(s) de lavagem, a proteína alvo érecuperada do agente de ligação Fc. Isto normalmente é atingido usando umtampão de eluição adequado. A proteína alvo pode, por exemplo, ser eluída dacoluna usando um tampão de eluição tendo um pH baixo, e.g., no intervalo decerca de 2 a cerca de 6,5, e preferivelmente no intervalo de cerca de 2,5 acerca de 3,5.

Em várias formas de realização, a proteína alvo assimrecuperada pode ser formulada em um carreador farmaceuticamente aceitávele usada para vários usos diagnósticos, terapêuticos ou outros conhecidos paratais moléculas.

Em várias formas de realização, a preparação de proteína alvoeluída pode ser sujeita a etapas de purificação adicionais depois da etapa decromatografia de agente de ligação Fe. Por exemplo, etapas de purificaçãoadicionais exemplares incluem, mas não são limitadas a: cromatografia detroca aniônica, cromatografia de troca catiônica, cromatografia de interaçãohidrofóbica (HIC), cromatografia de hidroxiapatita, diálise, cromatografia deafinidade (incluindo cromatografia de afinidade de metal imobilizado),cromatografia de exclusão por tamanho (SEC), precipitação com sulfato deamônio, precipitação com etanol, HPLC de fase reversa (RP-HPLC),cromatofocagem, ultrafiltração, diafiltração, e filtração em gel. Em váriasformas de realização, a etapa de cromatografia de agente de ligação Fc éseguida por uma cromatografia de troca aniônica e uma etapa de HIC. Emvárias formas de realização, as etapas de cromatografia são adicionalmenteseguidas por uma etapa de filtração de vírus, uma etapa deultrafiltração/diafiltração, e uma etapa de filtração de contaminantemicrobiano. Em várias formas de realização, estas etapas de purificaçãoadicionais põem ser conduzidas antes da etapa de cromatografia de agente deligação Fc.

Em várias formas de realização, métodos para purificação deuma proteína de ligação Αβ, preferivelmente uma anticorpo anti-Αβ,começam com adsorção da proteína alvo a um agente de ligação Fccompreendendo Proteína A imobilizada em uma fase sólida, seguido porlavagem do agente de ligação Fc com uma solução tampão contendo um salde cátion divalente para remover uma ou mais impurezas, e recuperandosubseqüentemente a proteína da Proteína A para produzir uma primeiracombinação de eluente.

Em várias formas de realização, o processo de purificaçãocontinua com sujeição da primeira combinação de eluente a cromatografia detroca aniônica colocando em contato uma resina de troca aniônica com aprimeira combinação de eluente de forma que impurezas adsorvem à resina,enquanto a proteína alvo não adsorve à resina. Assim, a proteína alvo pode serrecuperada do fluxo para produzir uma segunda combinação de eluente. Emvárias formas de realização, a etapa de cromatografia de troca aniônicacompreende adicionalmente lavar a resina de troca aniônica com uma soluçãode lavagem tamponada para recuperar pelo menos uma porção da proteínaalvo adsorvida, que então seria combinada com a segunda combinação deeluente. Alternativamente, a primeira combinação de eluente pode sercolocada em contato com a resina de troca aniônica de uma maneira tal que oanticorpo adsorve, permitindo que quaisquer impurezas fluam, opcionalmenteseguido por lavagem e eluição do anticorpo adsorvido.

Em várias formas de realização, o processo de purificaçãocontinua com sujeição da segunda combinação de eluente a HIC adsorvendo aproteína alvo a uma resina de interação hidrofóbica (e.g., uma fase sólidafuncionalizada com ligantes hidrofóbicos), lavagem da resina de interaçãohidrofóbica com uma solução de lavagem tamponada com uma força iônicaque substancialmente não elui a proteína alvo, e recuperando a proteína alvo(tipicamente usando um tampão de eluição com uma força iônica baixasuficiente para remover do absorvente a proteína alvo da resina de interaçãohidrofóbica) em uma terceira combinação de eluente. Alternativamente, asegunda combinação de eluente pode ser colocada em contato com a colunade HIC de uma maneira tal que a proteína alvo não adsorve, recuperando aproteína alvo de fluxo como uma terceira combinação de eluente.

Em várias formas de realização, o processo de purificaçãoinclui uma ou mais etapas de filtração, por exemplo, para remover vírus,concentrar e tamponar a solução contendo a proteína alvo, e para removercontaminantes microbianos.

Em várias formas de realização, a presente invenção fornecemétodos para a purificação de uma proteína de ligação Αβ, preferivelmenteum anticorpo anti-Αβ, a partir de um líquido fonte compreendendo a proteínae uma ou mais impurezas onde as impurezas compreendem uma ou maisvariantes IRT. Em uma forma de realização, os métodos sustentam umaredução de cerca de umas 2 a cerca de umas 20 vezes em níveis de variantesIRT daqueles no líquido fonte. Preferivelmente, níveis de variantes IRT sãoreduzidos em pelo menos 5 vezes, e mais preferivelmente níveis de variantesIRT são reduzidos em pelo menos 10 vezes. Por exemplo, em um líquidofonte (amostra inicial) tendo cerca de 3-5% de variantes de anticorpo IRT(como uma porcentagem de espécies totais no líquido fonte) espéciesvariantes de anticorpo IRT podem ser reduzidas a cerca de 0,3 a cerca de0,5%. Em várias formas de realização, espécies variantes IRT são reduzidaspara: menos do que 1%, menos do que 0,8%, menos do que 0,5%, menos doque 0,3%, menos do que 0,2%, e/ou menos do que 0,1%. Preferivelmente, napurificação de um líquido fonte para a preparação de uma proteína, variantesIRT são reduzidas para: menos do que 1%, menos do que 0,8%, menos do que0,5%, menos do que 0,3%, menos do que 0,2%, e/ou menos do que 0,1%como uma porcentagem de espécies totais no líquido fonte.

Em várias formas de realização, a presente invenção fornecemétodos para a purificação de uma proteína de ligação Αβ, preferivelmenteum anticorpo anti-Αβ, a partir de um líquido fonte compreendendo a proteínae uma ou mais impurezas onde as impurezas compreendem uma ou maisvariantes LMW. Em uma forma de realização, os métodos sustentam umaredução de cerca de umas 2 a cerca de umas 20 vezes em níveis de variantesLMW daqueles no líquido fonte. Preferivelmente, níveis de variantes LMWsão reduzidos em pelo menos 5 vezes, e mais preferivelmente níveis devariantes LMW são reduzidos em pelo menos 10 vezes. Por exemplo, em umlíquido fonte (amostra inicial) tendo cerca de 3-5% de variantes de anticorpoLMW (como uma porcentagem de espécies totais no líquido fonte) espéciesvariantes de anticorpo LMW podem ser reduzidas a cerca de 0,3 a cerca de0,5%. Em várias formas de realização, espécies variantes LMW são reduzidaspara: menos do que 1%, menos do que 0,8%, menos do que 0,5%, menos doque 0,3%, menos do que 0,2%, e/ou menos do que 0,1%. Preferivelmente, napurificação de um líquido fonte para a preparação de uma proteína, variantesLMW são reduzidas para: menos do que 1%, menos do que 0,8%, menos doque 0,5%, menos do que 0,3%, menos do que 0,2%, e/ou menos do que 0,1%como uma porcentagem de espécies totais no líquido fonte.

Em várias formas de realização, a presente invenção fornecemétodos para a purificação de uma proteína de ligação Αβ, preferivelmenteum anticorpo anti-Αβ, a partir de um líquido fonte compreendendo a proteínae uma ou mais impurezas onde as impurezas compreendem uma ou maisvariantes UDB. Em uma forma de realização, os métodos sustentam umaredução de cerca de umas 2 a cerca de umas 20 vezes em níveis de variantesUDB daqueles no líquido fonte. Preferivelmente, níveis de variantes UDB sãoreduzidos em pelo menos 5 vezes, e mais preferivelmente níveis de variantesUDB são reduzidos em pelo menos 10 vezes.

Por exemplo, em um líquido fonte (amostra inicial) tendocerca de 20% de variantes de anticorpo UDB (como uma porcentagem deespécies totais no líquido fonte) espécies variantes de anticorpo UDB podemser reduzidas a cerca de 10% a cerca de 2%. Em várias formas de realização,espécies variantes UDB são reduzidas para: menos do que 20%, menos doque 15%, menos do que 10%, menos do que 5%, menos do que 2%, ou menosdo que 1%. Preferivelmente, na purificação de um líquido fonte para apreparação de uma proteína, variantes UDB são reduzidas para: menos do que20%, menos do que 15%, menos do que 10%, menos do que 5%, menos doque 2%, ou menos do que 1% como uma porcentagem de espécies totais nolíquido fonte.

Também, por exemplo, em um líquido fonte (amostra inicial)tendo cerca de 3-5% de variantes de anticorpo UDB (como uma porcentagemde espécies totais no líquido fonte) espécies variantes de anticorpo UDBpodem ser reduzidas a cerca de 0,3 a cerca de 0,5%. Em várias formas derealização, espécies variantes UDB são reduzidas para: menos do que 1%,menos do que 0,8%, menos do que 0,5%, menos do que 0,3%, menos do que0,2%, e/ou menos do que 0,1%. Preferivelmente, na purificação de um líquidofonte para a preparação de uma proteína, variantes UDB são reduzidas para:menos do que 1%, menos do que 0,8%, menos do que 0,5%, menos do que0,3%, menos do que 0,2%, e/ou menos do que 0,1% como uma porcentagemde espécies totais no líquido fonte.

Proteínas de Ligação de Αβ para uso nos Métodos de Purificação daInvenção

As proteínas de ligação Αβ, e.g, anticorpos anti-Αβ, a serempurificadas de acordo com a invenção como descrito neste lugar, podem serpreparadas usando técnicas que são bem estabelecidas na técnica e incluem,por exemplo, técnicas sintéticas (tal como técnicas recombinantes e síntese depeptídeos ou uma combinação destas técnicas), ou podem ser isoladas de umafonte endógena da proteína. Em várias formas de realização, o anticorpo podeser, por exemplo, uma preparação de anticorpo policlonal, um anticorpomonoclonal, um anticorpo recombinante, um anticorpo quimérico, umanticorpo humanizado ou um anticorpo humano. Técnicas para a produção deanticorpos são descritas adicionalmente abaixo. Em outras formas derealização, a proteína de ligação Αβ pode ser uma proteína de fusão deanticorpo que compreende uma região Fc de anticorpo fundida a uma porçãode uma proteína ou polipeptídeo que é capaz de se ligar a Αβ. Preparação deproteínas de fusão de anticorpos também é descrita adicionalmente abaixo.

Anticorpos policlonais

Anticorpos policlonais podem ser preparados imunizando umsujeito adequado com um imunogene. O título de anticorpo no sujeitoimunizado pode ser monitorado ao longo do tempo por técnicas padrão, talcomo um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) usando antígenoalvo imobilizado. Se desejado, as moléculas de anticorpo dirigidas contra oantígeno alvo podem ser isoladas do mamífero (por exemplo, do sangue) eadicionalmente purificadas por técnicas bem conhecidas, tal comocromatografia de proteína A Sefarose para obter o anticorpo, por exemplo,fração de IgG. Em um momento apropriado depois de imunização, porexemplo, quando os títulos de anticorpo anti-antígeno são os maiores, célulasprodutoras de anticorpos podem ser obtidas do sujeito e usadas para prepararanticorpos monoclonais por técnicas padrão, tal como a técnica de hibridomadescrita originalmente por Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497)(veja também, Brown et al. (1981) J. Immunol. 127:539-46; Brown et al.(1980). 1 Biol. Chem.255:4980-83; Yeh et al. (1976) Proc. Natl. Acad. Sei.USA 76:2927-31; e Yeh et al. (1982) Int. J. Câncer 29:269-75). Para apreparação de anticorpos policlonais quiméricos, veja Buechler et al. PatenteNorte-Americana No. 6.420.113.

Anticorpos monoclonais

Qualquer dos muitos protocolos bem conhecidos usados parafundir linfócitos e linhagens celulares imortalizadas pode ser aplicado para opropósito de gerar um anticorpo monoclonal (veja, por exemplo, G. Galfre etal. (1977) Nature 266:55052; Gefler et al. Somatic Cell Genet., citado acima;Lerner, Yale J. Biol. Med., citado acima; Kenneth, Monoclonal Antibodies,citado acimaj. Além disso, o trabalhador habitualmente versado irá perceberque existem muitas variações de tais métodos que também poderiam ser úteis.

Tipicamente, a linhagem celular imortal (por exemplo, uma linhagem celularde mieloma) é derivada da mesma espécie de mamífero que os linfócitos. Porexemplo, hibridomas murinos podem ser feitos fundindo linfócitos de umcamundongo imunizado com uma preparação imunogênica da presenteinvenção com uma linhagem celular imortalizada de camundongo. Linhagenscelulares imortais preferidas são linhagens celulares de mieloma decamundongo que são sensíveis a meio de cultura contendo hipoxantina,aminopterina e timidina ("meio HAT"). Qualquer das diversas linhagenscelulares de mieloma pode ser usada como um parceiro de fusão de acordocom técnicas padrão, por exemplo, as linhagens de mieloma P3-NSl/l-Ag4-l,P3-x63-Ag8.653 ou Sp2/0-Agl4. Estas linhagens de mieloma estãodisponíveis a partir de ATCC. Tipicamente, células de mieloma decamundongo sensíveis a HAT são fundidas a esplenócitos de camundongousando polietilenoglicol ("PEG"). Células de hibridoma resultando da fusãosão então selecionadas usando meio HAT, que mata células de mieloma nãofundidas e fundidas improdutivamente (esplenócitos não fundidos morremdepois de diversos dias porque eles não são transformados). Células dehibridoma produzindo um anticorpo monoclonal da invenção são detectadastriando os sobrenadantes de culturas de hibridoma para anticorpos que seligam a um antígeno alvo usando um ensaio ELISA padrão.Anticorpos Recombinantes

Alternativa para preparar hibridomas secretando anticorpomonoclonal, um anticorpo monoclonal pode ser identificado e isolado triandouma biblioteca recombinante de imunoglobulina combinatória (por exemplo,uma biblioteca de apresentação em fago de anticorpo) com um antígeno alvopara com isso isolar membros de biblioteca de imunoglobulina que se ligamao antígeno alvo. Kits para gerar e triar bibliotecas de apresentação em fagoestão disponíveis comercialmente (por exemplo, o Reeombinant PhageAntibody System de Pharmacia, No. de Catálogo 27-9400-01; e o SurfZAP™Phage Display Kit de Stratagene, No. de Catálogo 240612). Adicionalmente,exemplos de métodos e reagentes particularmente receptivos para uso paragerar e triar biblioteca de apresentação de anticorpo podem ser encontradosem, por exemplo, Ladner et al. Patente Norte-Americana No. 5,223,409;Kang et al. Publicação Internacional do PCT No. WO 92/18619; Dower et al.Publicação Internacional do PCT No. WO 91/17271; Winter et al. PublicaçãoInternacional do PCT WO 92/20791; Markland et al. Publicação Internacionaldo PCT No. WO 92/15679; Breitling et al. Publicação Internacional do PCTWO 93/01288; McCafferty et al. Publicação Internacional do PCT No. WO92/01047; Garrard et al Publicação Internacional do PCT No. WO 92/09690;Ladner et al. Publicação Internacional do PCT No. WO 90/02809; Fuchs etal. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod.Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths etal. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992).l Mol. Biol. 226:889-896; Clarkson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) Proc.Natl. Acad. Sei. USA 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc. Acid Res. 19:4133-4137;Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:7978-7982; e McCaffertyet al. Nature (1990) 348:552-554.

Anticorpos Quiméricos e Humanizados

Adicionalmente, anticorpos recombinantes, tal comoanticorpos monoclonais quiméricos e humanizados, compreendendo tantoporções humanas como não humanas, que podem ser feitos usando técnicaspadrão de DNA recombinante, estão dentro do escopo da invenção.

O termo "imunoglobulina humanizada" ou "anticorpohumanizado" se refere a uma imunoglobulina ou anticorpo que inclui pelomenos uma cadeia humanizada imunoglobulina ou de anticorpo (i.e., pelomenos uma cadeia humanizada leve ou pesada). O termo "cadeia deimunoglobulina humanizada" ou "cadeia de anticorpo humanizado" (i.e., uma"cadeia leve de imunoglobulina humanizada" ou "cadeia pesada deimunoglobulina humanizada") se refere a uma cadeia de imunoglobulina oude anticorpo (i.e., uma cadeia leve ou pesada, respectivamente) tendo umaregião variável que inclui uma região de arcabouço variável substancialmentede uma imunoglobulina ou anticorpo humano e regiões determinantes decomplementaridade (CDRs) (por exemplo, pelo menos uma CDR,preferivelmente duas CDRs, mais preferivelmente três CDRs)substancialmente de uma imunoglobulina ou anticorpo não humano, e incluiadicionalmente regiões constantes (por exemplo, pelo menos uma regiãoconstante ou porção desta, no caso de uma cadeia leve, e três regiõesconstantes no caso de uma cadeia pesada). O termo "região variávelhumanizada" (por exemplo, "região variável humanizada de cadeia leve" ou"região variável humanizada de cadeia pesada") se refere a uma regiãovariável que inclui uma região de arcabouço variável substancialmente deuma imunoglobulina ou anticorpo humano e regiões determinantes decomplementaridade (CDRs) substancialmente de uma imunoglobulina ouanticorpo não humano.

A frase "substancialmente de uma imunoglobulina ouanticorpo humano" ou "substancialmente humano" significa que, quandoalinhada com uma imunoglobulina humana ou seqüência amino de anticorpopara propósitos de comparação, a região compartilha pelo menos 80-90%, 90-95%, ou 95-99% de identidade (i.e., identidade de seqüência local) com oarcabouço humano ou seqüência de região constante, por exemplo, sendoresponsável por substituições conservativas, substituições de seqüênciaconsenso, substituições de linhagem germinativa, mutações reversas, e ossemelhantes. A introdução de substituições conservativas, substituições deseqüência consenso, substituições de linhagem germinativa, mutaçõesreversas, e os semelhantes, é freqüentemente referida como "otimização" deum anticorpo ou cadeia humanizada. A frase "substancialmente de umaimunoglobulina ou anticorpo não humano" ou "substancialmente nãohumano" significa ter uma seqüência de imunoglobulina ou anticorpo pelomenos 80-95%, preferivelmente pelo menos 90-95%, mais preferivelmente,96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica àquela de um organismo não humano, porexemplo, um mamífero não humano.

Por conseguinte, todas as regiões ou resíduos de umaimunoglobulina ou anticorpo humanizado, ou de uma cadeia humanizada deimunoglobulina ou de anticorpo, exceto as CDRs, são substancialmenteidênticas às regiões ou resíduos correspondentes de uma ou mais seqüênciasde imunoglobulina humana nativa. O termo "região correspondente" ou"resíduo correspondente" se refere a uma região ou resíduo em uma segundaseqüência de aminoácidos ou nucleotídeos que ocupa a mesma (i.e.,equivalente) posição que uma região ou resíduo em uma primeira seqüênciade aminoácidos ou nucleotídeos, quando a primeira e segunda seqüência estãootimamente alinhadas para propósitos de comparação.

O termo "identidade significante" significa que duasseqüências de polipeptídeos, quando otimamente alinhadas, tal como pelosprogramas GAP ou BESTFIT usando pesos de lacuna padrão, compartilhampelo menos 50-60% de identidade de seqüência, preferivelmente pelo menos60-70% de identidade de seqüência, mais preferivelmente pelo menos 70-80%de identidade de seqüência, mais preferivelmente pelo menos 80-90% deidentidade de seqüência, ainda mais preferivelmente pelo menos 90-95% deidentidade de seqüência, e ainda mais preferivelmente pelo menos 95% deidentidade de seqüência ou mais (por exemplo, 99% de identidade deseqüência ou mais). O termo "identidade substancial" significa que duasseqüências de polipeptídeos, quando otimamente alinhadas, tal como pelosprogramas GAP ou BESTFIT usando pesos de lacuna padrão, compartilhampelo menos 80-90% de identidade de seqüência, preferivelmente pelo menos90-95% de identidade de seqüência, e mais preferivelmente pelo menos 95%de identidade de seqüência ou mais (por exemplo, 99% de identidade deseqüência ou mais). Para comparação de seqüências, tipicamente umaseqüência atua como uma seqüência de referência, com a qual seqüências deteste são comparadas. Ao usar um algoritmo de comparação de seqüências,seqüências de teste e de referência são inseridas em um computador,coordenadas de subseqüências são designadas, se necessário, e parâmetros deprograma de algoritmo de seqüência são designados. O algoritmo decomparação de seqüências então calcula a identidade de seqüência percentualpara a(s) seqüência(s) de teste em relação à seqüência de referência, baseadonos parâmetros de programa designados.

Alinhamento ótimo de seqüências para comparação pode serconduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith &Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento dehomologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pelométodo de busca por similaridade de Pearson & Lipman, Proc. NatΊ Acad.Sei. USA 85:2444 (1988), por implementações computadorizadas destesalgoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Pacote de AplicativoComputacional de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575Science Dr., Madison, WI), ou por inspeção visual (Veja geralmente Ausubelet al.} Current Protocols in Molecular Biology). Um exemplo de algoritmoque é adequado para determinar identidade de seqüência percentual esimilaridade de seqüência é o algoritmo BLAST, que é descrito em Altschulet al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990). Aplicativo computacional para realizaranálises BLAST está publicamente disponível através do National Center forBiotechnology Information (publicamente acessível através do servidor darede mundial de computadores de National Institutes of Health NCBI).

Tipicamente, parâmetros padrão de programa podem ser usados para realizara comparação de seqüências, embora parâmetros personalizados tambémpossam ser usados. Para seqüências de aminoácidos, o programa BLASTP usacomo padrão um comprimento de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de10, e a matriz de pontuação BLOSUM62 (veja Henikoff & Henikoff, Proc.Natl. Acad. Sei. USA 89:10915 (1989)).

Preferivelmente, posições de resíduos que não são idênticosdiferem por substituições de aminoácidos conservativas. Para propósitos declassificar substituições de aminoácidos como conservativas ou nãoconservativas, aminoácidos são agrupados como segue: Grupo I (cadeiaslaterais hidrofóbicas): leu, met, ala, vai, leu, ile; Grupo II (cadeias lateraishidrofílicas neutras): cys, ser, thr; Grupo III (cadeias laterais ácidas): asp, glu;Grupo IV (cadeias laterais básicas): asn, gln, his, lys, arg; Grupo V (resíduosinfluenciando orientação de cadeia): gly, pro; e Grupo VI (cadeias lateraisaromáticas): trp, tyr, phe. Substituições conservativas envolvem substituiçõesentre aminoácidos na mesma classe. Substituições não conservativasconstituem trocar um membro de uma destas classes por um membro deoutra.

Preferivelmente, imunoglobulinas ou anticorpos humanizadosse ligam a antígeno com uma afinidade que está dentro de um fator de três,quatro, ou cinco daquela do anticorpo não humanizado correspondente. Porexemplo, se o anticorpo não humanizado tem uma afinidade de ligação de IeM, anticorpos humanizados irão ter uma afinidade de ligação de pelo menos 3χ 10m8M, 4 χ IO"8 M, 5 χ IO"8 M, ou Ie M. Uma cadeia de imunoglobulina édita para "ligação direta de antígeno" quando ela confere em umaimunoglobulina ou anticorpo intacto (ou fragmento de ligação a antígenodeste) uma propriedade de ligação ou afinidade de ligação específica. Umamutação (por exemplo, uma mutação reversa) é dita afetar substancialmente acapacidade de uma cadeia pesada ou leve de direcionar ligação de antígeno seela afeta (por exemplo, diminui) a afinidade de ligação de umaimunoglobulina ou anticorpo intacto (ou fragmento de ligação a antígenodeste) compreendendo dita cadeia por pelo menos uma ordem de magnitudecomparada com aquela do anticorpo (ou fragmento de ligação a antígenodeste) compreendendo uma cadeia equivalente carecendo de dita mutação.Uma mutação "não afeta substancialmente (por exemplo, diminui) acapacidade de uma cadeia de direcionar ligação de antígeno" se ela afeta (porexemplo, diminui) a afinidade de ligação de uma imunoglobulina ouanticorpo intacto (ou fragmento de ligação a antígeno deste) compreendendodita cadeia por apenas um fator de dois, três, ou quatro daquele do anticorpo(ou fragmento de ligação a antígeno deste) compreendendo uma cadeiaequivalente carecendo de dita mutação.O termo "imunoglobulina quimérica" ou anticorpo se refere auma imunoglobulina ou anticorpo cujas regiões variáveis derivam de umaprimeira espécie e cujas regiões constantes derivam de uma segunda espécie.Imunoglobulinas ou anticorpos quiméricos podem ser construídos, porexemplo por engenharia genética, a partir de segmentos de genes deimunoglobulinas pertencentes a diferentes espécies. Os termos"imunoglobulina humanizada" ou "anticorpo humanizado" não sãopretendidos para abranger imunoglobulinas ou anticorpos quiméricos, comodefinido abaixo. Embora imunoglobulinas ou anticorpos humanizados sejamquiméricos na sua construção (i.e., compreendem regiões de mais do que umaespécie de proteína), eles incluem características adicionais (i.e., regiõesvariáveis compreendendo resíduos de CDR de doador e resíduos de arcabouçode aceptor) não encontradas em imunoglobulinas ou anticorpos quiméricos,como definido neste lugar.

Tais anticorpos monoclonais quiméricos e humanizadospodem ser produzidos por técnicas de DNA recombinante conhecidas natécnica, por exemplo usando métodos descritos em Robinson et al. PedidoInternacional No. PCT/US86/02269; Akira, et ai. Pedido de Patente Europeu184.187; Taniguchi, M., Pedido de Patente Europeu 171.496; Morrison et al.Pedido de Patente Europeu 173.494; Neuberger et al. PublicaçãoInternacional do PCT No. WO 86/01533; Cabilly et al. Patente Norte-Americana No. 4.816.567; Cabilly et al. Pedido de Patente Europeu 125.023;Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl.Acad. Sei. USA 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526;Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:214-218; Nishimura et al.(1987) Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; eShaw et al. (1988) J. Natl. Câncer Inst. 80:1553-1559); Morrison, S. L.(1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; WinterPatente Norte-Americana 5.225.539; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525;Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; e Beidler et al. (1988) J. Immunol.141:4053-4060.

Anticorpos Humanos para Animais Transgênicos e Apresentação em Faso

Alternativamente, agora é possível produzir animaistransgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, sob imunização,de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência deprodução endógena de imunoglobulina. Por exemplo, foi descrito que adeleção homozigota do gene de região de união (Jh) de cadeia pesada deanticorpo em camundongos mutantes quiméricos e de linhagem germinativaresulta em inibição completa de produção endógena de anticorpo.

Transferência do arranjo de gene de imunoglobulina de linhagem germinativahumana em tais em camundongos mutantes de linhagem germinativa resultana produção de anticorpos humanos sob desafio de antígeno. Veja, porexemplo, Patente Norte-Americana Nos. 6.150.584; 6.114.598; e 5.770.429.

Anticorpos completamente humanos também podem serderivados de bibliotecas de apresentação de fagos (Hoogenboom et al., J.Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581597 (1991)).

Anticorpos policlonais quiméricos também podem ser obtidos a partir debibliotecas de apresentação de fagos (Buechler et al. Patente Norte-Americana No. 6.420.113).

Anticorpos biespecíficos e Conjugados de Anticorpos

Anticorpos biespecíficos (BsAbs) são anticorpos que têmespecificidades de ligação para pelo menos dois epítopos diferentes. Taisanticorpos podem ser derivados de anticorpos de comprimento completo oufragmentos de anticorpos (por exemplo anticorpos biespecíficos F(ab)'2).

Métodos para fazer anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica.Produção tradicional de anticorpos biespecíficos de comprimento completo ébaseada na co-expressão de dois pares de cadeia pesada-cadeia leve deimunoglobulina, onde as duas cadeias têm especificidades diferentes(Millstein et ai, Nature, 305:537-539 (1983)). Por causa da classificaçãoaleatória de cadeias pesadas e leves de imunoglobulina, estes hibridomas(quadromas) produzem uma mistura potencial de diferentes moléculas deanticorpo (veja, WO 93/08829 e em Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)).

Anticorpos biespecíficos também incluem anticorposreticulados ou "heteroconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos noheteroconjugado pode ser acoplado a avidina, o outro a biotina ou outra cargaútil. Anticorpos heteroconjugados podem ser feitos usando quaisquer métodosde reticulação convenientes. Agentes de reticulação adequados são bemconhecidos na técnica, e são descritos em Patente Norte-Americana No.4.676.980, junto com diversas técnicas de reticulação.

Em ainda outra forma de realização, o anticorpo pode serconjugado, quimicamente ou geneticamente, a uma carga útil tal como umaunidade reativa, detectável, ou funcional, por exemplo, uma imunotoxina paraproduzir um conjugado de anticorpos. Tais cargas úteis incluem, por exemplo,imunotoxinas, quimioterápicos, e radioisótopos, todos os quais são bemconhecidos na técnica.

Proteínas de Fusão de Anticorpo

Uma proteína de ligação Αβ tendo uma região Fc como usadona invenção pode ser uma proteína de fusão que contém pelo menos a porçãoFc de um anticorpo fundido a uma proteína não anticorpo ou polipeptídeo queé capaz de se ligar a Αβ. Assim, é criada uma proteína de fusão solúvel que écapaz de se ligar a Αβ e que tem funções relacionadas a Fc (tal comoestabilidade no soro, ligação de receptor de Fc e os semelhantes). Proteínas defusão de anticorpo (também referidas na técnica como proteínas de fusão deFc ou proteínas de fusão de Ig) podem ser preparadas usando técnicas padrãode DNA recombinante e foram descritas na técnica, veja por exemplo PatenteNorte-Americana No. 5.116.964, Patente Norte-Americana No. 5.225.538,Patente Norte-Americana No. 5.336.603 e Patente Norte-Americana No.5.428.130, todas por Capon et al.

Anticorpos Anti Αβ

Geralmente, os anticorpos da presente invenção incluem umavariedade de anticorpos para tratar doenças amiloidogênicas, em particular,Mal de Alzheimer, direcionando peptídeo Αβ.

Os termos "anticorpo Αβ", "anticorpo anti-Αβ" e "anti-Αβ" sãousados permutavelmente neste lugar para se referir a um anticorpo que se ligaa um ou mais epítopos ou determinantes antigênicos da proteína precursora deamilóide (APP) humana, proteína Αβ, ou ambas. Epítopos ou determinantesantigênicos exemplares podem ser encontrados dentro de APP, nas sãopreferivelmente encontrados dentro do peptídeo Αβ de APP. Existemmúltiplas isoformas de APP, por exemplo APP695, APP751 e APP770.

Aminoácidos dentro de APP são determinados números de acordo com aseqüência da isoforma APP77g (veja por exemplo, No. de Acesso de GenBankP05067). Exemplos de isotipos específicos de APP que são atualmenteconhecidos por existirem em humanos são o polipeptídeo de 695 aminoácidosdescrito por Kang et. al. (1987) Nature 325:733-736 que é designado como oAPP "normal"; o polipeptídeo de 751 aminoácidos descrito por Ponte et al.(1988) Nature 331:525-527 (1988) e Tanzi et al. (1988) Nature 331:528-530;e o polipeptídeo de 770 aminoácidos descrito por Kitaguchi et. al. (1988)Nature 331:530-532. Como um resultado de processamento proteolítico deAPP por diferentes enzimas secretase in vivo ou in situ, Αβ é encontrado tantoem uma "forma curta", 40 aminoácidos de comprimento, como uma "formalonga", variando de 42-43 aminoácidos de comprimento. A forma curta, AP40,consiste de resíduos 672-711 de APP. A forma longa, por exemplo, Ar342 ouAP43, consiste de resíduos 672-713 ou 672-714, respectivamente. Parte dodomínio hidrofóbico de APP é encontrada na extremidade carboxi de Αβ, epode responder pela capacidade de Αβ de agregar, particularmente no caso daforma longa. Peptídeo Αβ pode ser encontrado em, ou purificado a partir de,fluidos corporais de humanos e outros mamíferos, por exemplo fluidocerebroespinhal, incluindo tanto indivíduos normais como indivíduossofrendo de desordens amiloidogênicas.

Os termos "proteína β-amilóide", "peptídeo β-amilóide", "β-amilóide", "Αβ" e "peptídeo Αβ" são usados permutavelmente neste lugar.Peptídeo Αβ (por exemplo, Αβ39, Αβ40, Αβ41, Αβ42 e Αβ43) é umfragmento interno de ~4-kDa de 39-43 aminoácidos de APP. Αβ40, porexemplo, consiste de resíduos 672-711 de APP e Αβ42 consiste de resíduos672-713 de APP. Peptídeos Αβ incluem peptídeos resultando de clivagem porsecretase de APP e peptídeos sintéticos tendo a mesma ou essencialmente amesma seqüência que os produtos de clivagem. Peptídeos Αβ podem serderivados de uma variedade de fontes, por exemplo, tecidos, linhagenscelulares, ou fluidos corporais (por exemplo soros ou fluido cerebroespinhal).Por exemplo, um Αβ pode ser derivado de células expressando APP tal comocélulas de ovário de hamster Chinês (CHO) estavelmente transfectadas comapp7í7v-.f, como descrito, por exemplo, em Walsh et al, (2002), Nature, 416, pp535-539. Uma preparação de Αβ pode ser derivada de fontes teciduais usandométodos previamente descritos (veja, por exemplo, Johnson-Wood et al.,(1997), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:1550). Alternativamente, peptídeos Αβpodem ser sintetizados usando métodos que são bem conhecidos por aquelesna técnica. Veja, por exemplo, Fields et al, Synthetic Peptides: A User'sGuide, ed. Grant, W.H. Freeman & Co., New York, NY, 1992, ρ 77). Porisso, peptídeos podem ser sintetizados usando as técnicas automatizadas deMerrifield de síntese de fase sólida com o grupo α-amino protegido ou porproduto químico t-Boc ou F-moc usando aminoácidos com cadeia lateralprotegida em, por exemplo, um Sintetizador de Peptídeos de AppliedBiosystems Modelo 43 OA ou 431. Antígenos de peptídeos mais longos podemser sintetizados usando técnicas bem conhecidas de DNA recombinante. Porexemplo, um polinucleotídeo codificando o peptídeo ou peptídeo de fusãopode ser sintetizado ou molecularmente clonado e inserido em um vetor deexpressão adequado para a transfecção e expressão heteróloga por uma célulahospedeira adequada. Peptídeo Αβ também se refere a seqüênciasrelacionadas de Αβ que resultam de mutações na região de Αβ do genenormal.

Epítopos ou determinantes antigênicos exemplares aos quaisum anticorpo Αβ se liga podem ser encontrados dentro da proteína humanaprecursora de amilóide (APP), mas são preferivelmente encontrados dentro dopeptídeo Αβ de APP. Epítopos ou determinantes antigênicos exemplaresdentro de Αβ são localizados dentro do término N, região central, ou términoC de Αβ. Um "epítopo N terminal", é um epítopo ou determinante antigênicolocalizado dentro de ou incluindo o término N do peptídeo Αβ. Epítopos Nterminais exemplares incluem resíduos dentro de aminoácidos 1-10 ou 1-12de Αβ, preferivelmente de resíduos 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 2-6, 27, 3-6, ou 3-7de Αβ42. Outros epítopos N terminais exemplares começam em resíduos 1-3e terminam em resíduos 7-11 de Αβ. Epítopos N terminais exemplaresadicionais incluem resíduos 2-4, 5, 6, 7 ou 8 de Αβ, resíduos 3-5, 6, 7, 8 ou 9de Αβ, ou resíduos 4-7, 8, 9 ou 10 de Αβ42. "Epítopos centrais" são epítoposou determinantes antigênicos compreendendo resíduos localizados dentro daporção central ou mediana do peptídeo Αβ. Epítopos centrais exemplaresincluem resíduos dentro de aminoácidos 13-28 de Αβ, preferivelmente deresíduos 14-27, 15-26, 16-25, 17-24, 18-23, ou 19-22 de Αβ. Outros epítoposcentrais exemplares incluem resíduos dentro de aminoácidos 16-24, 16-23,16-22, 16-21, 18-21, 19-21, 19-22, 19-23, ou 19-24 de Αβ. Epítopos oudeterminantes antigênicos "C terminais" estão localizados dentro de ouincluindo o término C do peptídeo Αβ e incluem resíduos dentro deaminoácidos 33-40, 33-41, ou 33-42 de Αβ. "Epítopos C terminais" sãoepítopos ou determinantes antigênicos compreendendo resíduos localizadosdentro do término C do peptídeo Αβ (por exemplo, dentro de cerca deaminoácidos 30-40 ou 30-42 de Αβ. Epítopos ou determinantes antigênicos Cterminais exemplares adicionais incluem resíduos 33-40 ou 33-42 de Αβ.

Quando um anticorpo é dito se ligar a um epítopo dentro deresíduos especificados, tal como Αβ 3-7, isto significa que o anticorpo se ligaespecificamente a um polipeptídeo contendo os resíduos especificados (i.e.,Αβ 3-7 neste um exemplo). Um tal anticorpo não necessariamente entre emcontato com cada resíduo dentro de Αβ 3-7. Assim como nem todasubstituição ou deleção de aminoácido dentro de Αβ 3-7 necessariamenteafeta significantemente afinidade de ligação. Em várias formas de realização,um anticorpo Αβ é extremidade específico. Como usado neste lugar, o termo"extremidade específico" se refere a um anticorpo que se liga especificamenteaos resíduos N terminais ou C terminais de um peptídeo Αβ mas que nãoreconhece os mesmos resíduos quando presentes em espécies maiores de Αβcompreendendo os resíduos ou em APP. Em várias formas de realização, umanticorpo Αβ é "término C específico." Como usado neste lugar, o termo"término C específico" significa que o anticorpo reconhece especificamenteum término C livre de um peptídeo Αβ. Exemplos de anticorpos Αβ términoC específicos incluem aqueles que: reconhecem um peptídeo Αβ terminandoem resíduo 40 mas não reconhecem um peptídeo Αβ terminando em resíduo41, 42, e/ou 43; reconhecem um peptídeo Αβ terminando em resíduo 42 masnão reconhecem um peptídeo Αβ terminando em resíduo 40, 41, e/ou 43; etc.

Em uma forma de realização, o anticorpo Αβ pode ser umanticorpo 3D6 ou variante deste, ou um anticorpo 10D5 ou variante deste,ambos os quais são descritos em Publicação de Patente Norte-Americana No.20030165496A1, Publicação de Patente Norte-Americana No.20040087777A1, Publicação de Patente Internacional No. W002/46237A3 ePublicação de Patente Internacional No. W004/080419A2. Descrição deanticorpos 3D6 e 10D5 também podem ser encontradas, por exemplo, emPublicação de Patente Internacional No. W002/088306A2 e Publicação dePatente Internacional No. W002/088307A2. Anticorpos 3D6 adicionais sãodescritos em Pedido de Patente Norte-Americana No. 11/303.478 e PedidoInternacional No. PCT/US05/45614. 3D6 é um anticorpo monoclonal (mAb)que se liga especificamente a um epítopo N terminal localizado no peptídeoβ-amilóide humano, especificamente, resíduos 1-5. Por comparação, 10D5 éum mAb que se liga especificamente a um epítopo N terminal localizado nopeptídeo β-amilóide humano, especificamente, resíduos 3-6. Uma linhagemcelular produzindo o anticorpo monoclonal 3D6 (RB96 3D6.32.2.4) foidepositada com a American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA20108, USA em 8 de Abril de 2003 sob os termos do Tratado de Budapeste etem o número de depósito PTA-5130. Uma linhagem celular produzindo oanticorpo monoclonal 10D5 (RB44 10D5.19.21) foi depositada com a ATCCem 8 de Abril de 2003 sob os termos do Tratado de Budapeste e tem onúmero de depósito PTA-5129.

Anticorpos 3D6 variantes exemplares são aqueles tendo, porexemplo, uma cadeia leve humanizada compreendendo seqüências deaminoácidos de região variável apresentadas como SEQ ID NO:3 ou SEQ IDNO:5 e uma cadeia pesada humanizada compreendendo seqüências deaminoácidos de região variável apresentadas como SEQ ID NO:4 ou SEQ IDNO:6. Outros anticorpos 3D6 variantes exemplares são aqueles tendo, porexemplo, uma seqüência de aminoácidos de cadeia leve humanizadaapresentada como SEQ ID NO:7 e uma seqüência de aminoácidos de cadeiapesada humanizada apresentada como SEQ ID NO:8.

Anticorpos 10D5 variantes exemplares são aqueles tendo, porexemplo, uma cadeia leve humanizada compreendendo seqüências deaminoácidos de região variável apresentadas como SEQ ID NO:9 ou SEQ IDNO: 11 e uma cadeia pesada humanizada compreendendo seqüências deaminoácidos de região variável apresentadas como SEQ ID NO: 10 ou SEQID NO: 12. Outros anticorpos 10D5 variantes exemplares são aqueles tendo,por exemplo, uma seqüência de aminoácidos de cadeia leve humanizadaapresentada como SEQ ID NO: 13 e uma seqüência de aminoácidos de cadeiapesada humanizada apresentadas como SEQ ID NO: 14. Tais anticorposvariantes são adicionalmente descritos em W002/088307A2.

Em outra forma de realização, o anticorpo pode ser umanticorpo 12B4 ou variante deste, como descrito em Publicação de PatenteNorte-Americana No. 20040082762A1 e Publicação de Patente InternacionalNo. W003/077858A2. 12B4 é um mAb que se liga especificamente a umepítopo N terminal localizado no peptídeo β-amilóide humano,especificamente, resíduos 3-7.

Anticorpos 12B4 variantes exemplares são aqueles tendo, porexemplo, uma cadeia leve humanizada (ou cadeia leve) compreendendoseqüências de aminoácidos de região variável apresentadas como SEQ IDNO: 15 ou SEQ ID NO: 17 e uma cadeia pesada humanizada compreendendoseqüências de aminoácidos de região variável apresentadas como SEQ IDNO: 16, SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 19.

Em ainda outra forma de realização, o anticorpo pode ser umanticorpo 12A11 ou a variante deste, como descrito em Publicação de PatenteNorte-Americana No. 20050118651 Al, Pedido de Patente Norte-AmericanaNo. de Série 11/303.478, Publicação de Patente Internacional No.W004/108895A2, e Pedido de Patente Internacional No. de SériePCT/US05/45614. 12A11 é um mAb que se liga especificamente a umepítopo N terminal localizado no peptídeo β-amilóide humano,especificamente, resíduos 3-7. Uma linhagem celular produzindo o anticorpomonoclonal 12A11 foi depositada com a ATCC em 13 de Dezembro de 2005sob os termos do Tratado de Budapeste e tem o número de depósito PTA-7271.

Anticorpos 12A11 variantes exemplares são aqueles tendo, porexemplo, uma cadeia leve humanizada compreendendo a seqüência deaminoácidos de região variável apresentada como SEQ ED N0:20 e umacadeia pesada humanizada compreendendo seqüências de aminoácidos deregião variável apresentadas como SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ IDNO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID N0:30, SEQ ID NO:31, SEQ IDNO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID N0:40, ou SEQ IDNO:41.

Em ainda outra forma de realização, o anticorpo pode ser umanticorpo 6C6, ou uma variante deste, como descrito em Pedido de PatenteNorte-Americana No. 11/305.899 e Pedido Internacional No.PCT/US05/45860. 6C6 é um mAb que se liga especificamente a um epítopoN terminal localizado no peptídeo β-amilóide humano, especificamente,resíduos 3-7. Uma linhagem celular produzindo o anticorpo 6C6 foidepositada em 1 de Novembro de 2005, com a ATCC sob os termos doTratado de Budapeste e número de acesso determinado PTA-7200.

Em ainda outra forma de realização, o anticorpo pode ser umanticorpo 2H3 como descrito em Pedido de Patente Norte-Americana No.11/305.899 e Pedido Internacional No. PCT/US05/45860. 2H3 é um mAb quese liga especificamente a um epítopo N terminal localizado no peptídeo β-amilóide humano, especificamente, resíduos 2-7.

Em ainda outra forma de realização, o anticorpo pode ser umanticorpo 3A3 como descrito em Pedido de Patente Norte-Americana No.11/305.899 e Pedido Internacional No. PCT/US05/45860. 3A3 é um mAb quese liga especificamente a um epítopo N terminal localizado no peptídeo β-amilóide humano, especificamente, resíduos 3-7.

Linhagens celulares produzindo os anticorpos 2H3 e 3A3,tendo os números de acesso de ATCC PTA-7267 e PTA-7269respectivamente, foram depositadas em 13 de Dezembro de 2005 sob ostermos do Tratado de Budapeste.

Em ainda outra forma de realização, o anticorpo pode ser umanticorpo 15C11 ou variante deste, como descrito em um Pedido de PatenteNorte-Americana No. 11/304.986 e Pedido de Patente Internacional No.PCT/US05/45515 intitulada "Anticorpos humanizados que ReconhecemPeptídeo Beta Amilóide." 15C11 é um mAb que se liga especificamente a umepítopo central localizado no peptídeo β-amilóide humano, especificamente,resíduos 19-22. Uma linhagem celular produzindo o anticorpo monoclonal15C11 foi depositada com a ATCC em 13 de Dezembro de 2005 sob ostermos do Tratado de Budapeste e tem o número de depósito PTA-7270.

Em ainda outra forma de realização, o anticorpo pode ser umanticorpo 266 como descrito em Publicação de Patente Norte-Americana No.20050249725Al, e Publicação de Patente Internacional No. WOO1/62801A2.266 é um mAb que se liga especificamente a um epítopo central localizado nopeptídeo β-amilóide humano, especificamente, resíduos 16-24. Uma linhagemcelular produzindo o anticorpo monoclonal 266 foi depositada com a ATCCem 20 de Julho de 2004 sob os termos do Tratado de Budapeste e tem onúmero de depósito PTA-6123.

Anticorpos 266 variantes exemplares são aqueles tendo, porexemplo, uma cadeia leve humanizada compreendendo seqüências deaminoácidos de região variável apresentadas como SEQ ID NO:42 ou SEQID NO:44 e uma cadeia pesada humanizada compreendendo seqüências deaminoácidos de região variável apresentada como SEQ ID NO:43 ou SEQ IDNO:45. Outros anticorpos 266 variantes exemplares são aqueles tendo, porexemplo, uma seqüência de aminoácidos de cadeia leve humanizadaapresentada como SEQ ID NO:46 e uma seqüência de aminoácidos de cadeiapesada humanizada apresentada como SEQ ID NO:47. Tais anticorposvariantes são adicionalmente descritos em Publicação de Patente Norte-Americana No. 20050249725Al, e Publicação de Patente Internacional No.WOO1/62801A2.

Em ainda outra forma de realização, o anticorpo pode ser umanticorpo 2B1, ou uma variante deste, como descrito em um Pedido dePatente Norte-Americana No. 11/305.899 e Pedido de Patente InternacionalNo. PCT/US05/45860 intitulada "Anticorpos Αβ para Uso para MelhorarCognição". 2B 1 é um mAb que se liga especificamente a um epítopo centrallocalizado no peptídeo β-amilóide humano, especificamente, resíduos 19-23.

Em ainda outra forma de realização, o anticorpo pode ser umanticorpo 1C2, ou uma variante deste, como descrito em um Pedido dePatente Norte-Americana No. 11/305.899 e Pedido de Patente InternacionalNo. PCT/US05/45860 intitulado "Anticorpos Αβ para Uso para MelhorarCognição". 1C2 é um mAb que se liga especificamente a um epítopo centrallocalizado no peptídeo β-amilóide humano, especificamente, resíduos 16-23.

Em ainda outra forma de realização, o anticorpo pode ser umanticorpo 9G8, ou uma variante deste, como descrito em Pedido de PatenteNorte-Americana No. 11/304.986 e Pedido de Patente Internacional No.PCT/US05/45515. 9G8 é um mAb que se liga especificamente a um epítopocentral localizado no peptídeo β-amilóide humano, especificamente, resíduos16-21.

Linhagens celulares produzindo os anticorpos 2B1, 1C2 e 9G8foram depositadas em 1 de Novembro de 2005, com a ATCC sob os termosdo Tratado de Budapeste e foram determinados números de acesso PTA-7202, PTA-7199 e PTA-7201, respectivamente.

Anticorpos que se ligam especificamente a epítopos Cterminais localizados em peptídeo β-amilóide humano, para uso na presenteinvenção incluem, mas não são limitados a, 369.2B, como descrito em PatenteNorte-Americana No. 5.786.180, intitulada "Anticorpo monoclonal 369.2Bespecífico para peptídeoB A4." Descrição adicional de anticorpos para uso napresente invenção pode ser encontrada em, por exemplo, Bussiere et ai., (Am.J. Pathol. 165(3):987-95 (2004)) Bard et al. (PNAS 100(4):2023-8 (2003)),Kajkowski et al. (J. Biol. Chem. 276(22): 18748-56 (2001)), Games et al.(Ann. NY Acad. Sei. 920:274-84 (2000)), Bard et al. (Nat. Med. 6(8):916-9(2000)), e em Pedido de Patente Internacional No. W003015691A2 intitulado"Efetuar rápida melhora de cognição em um sujeito tendo Mal de Alzheimer,síndrome de Down, angiopatia amilóide cerebral, ou comprometimentocognitivo leve, compreende administrar anticorpo anti-A beta". Descriçãoadicional de fragmentos de anticorpos para uso na presente invenção pode serencontrada em, por exemplo, Bales et al. (Resumo P4-396, página S587,apresentado em Sessão de Pôster P4: Therapeutics and TherapeuticStrategies-Therapeutic Strategies, Amyloid-Based) e Zameer et al. (ResumoP4-420, página 5593, apresentado em Sessão de Pôster P4: Therapeutics andTherapeutic Strategies-Therapeutic Strategies, Amyloid-Based).

Anticorpos para uso na presente invenção podem serproduzidos recombinantemente ou sinteticamente. Por exemplo, o anticorpopode ser produzido por um processo recombinante de cultura celular, usando,por exemplo, células CHO, células NIH 3T3, células PER.C6®, células NSO,células VERO, fibroblastos de embrião de pinto, ou células BHK. Em adição,anticorpos com modificações secundárias que retêm a propriedade funcionalprimária de se ligar a peptídeo Αβ são contemplados pela presente invenção.

Em uma forma de realização particular, o anticorpo é um anticorpo 3D6humanizado de peptídeo anti Αβ que se liga seletivamente a peptídeo Αβ.

Mais especificamente, o anticorpo 3D6 humanizado de peptídeo anti Αβ éprojetado para se ligar especificamente a um epítopo NH2 terminal, porexemplo, resíduos de aminoácidos 1-5, localizados no peptídeo 1-40 ou 1-42β-amilóide humano encontrado em depósitos de placa no cérebro (porexemplo, em pacientes sofrendo de Mal de Alzheimer).

Um anticorpo humanizado de peptídeo anti Αβ exemplar é3D6 humanizado versão 2 (h3D6v2). As seqüências de aminoácidoscompletas das cadeias leves e pesadas de h3D6v2 previstas a partir dasseqüências de DNA dos vetores de expressão correspondentes são mostradasem Figura 1 (onde os resíduos são numerados começando com o término NH2de cadeias leves e pesadas como resíduo número 1) e em SEQ ID NO: 1 eSEQ ID NO:2, respectivamente. O ultimo resíduo de aminoácido codificadopela seqüência de DNA de cadeia pesada, Lys449, não foi observado na formamadura, secretada de h3D6v2 e, sem querer se ater a qualquer teoriaparticular, é presumivelmente removido durante processamento intracelularpor proteases celulares de CHO. Portanto, o término COOH da cadeia pesadade h3D6v2 é opcionalmente Gly448. Processamento de lisina COOH terminalfoi observado em anticorpos recombinantes e derivados de plasma e nãoparece causar impacto na sua função (Harris (1995) J. Chromatogr. A.705:129-134). h3D6v2 purificado é modificado pós-traducionalmente poradição de glicanas N-Iigados à porção Fc de cadeia pesada, que é conhecidopor conter um único sítio consenso de N-glicosilação. O sítio de N-glicosilação apresenta três estruturas principais de oligossacarídeos neutrosbi-particulados complexos comumente observadas no sítio de N-glicosilaçãoanálogo de proteínas IgG de mamíferos.

Outro anticorpo humanizado de peptídeo anti Αβ exemplar é3D6 humanizado versão 1 (hu3D6vl) tendo a seqüência apresentada emFigura 1 mas para uma substituição D^Yem posição 1 da cadeia leve, umasubstituição S—> A em posição 75 da cadeia pesada (posição 74 pornumeração de Kabat), uma substituição T-+ S em posição 78 da cadeiapesada (posição 77 por numeração de Kabat), e uma substituição V-+ L emposição 93 da cadeia pesada (posição 89 por numeração de Kabat),

Vários aspectos e formas de realização da presente invençãosão adicionalmente descritos pelos seguintes Exemplos. Os Exemplos sãooferecidos como forma de ilustração e não como forma de limitação.EXEMPLOS

Os seguintes exemplos são oferecidos para propósitosilustrativos apenas.

Exemplos são fornecidos usando dois diferentes anticorposmonoclonais anti-Αβ. Seis experimentos separados são descritosrepresentando cada uma combinação de anticorpo e remoção de impureza.

Materiais e Métodos

Em geral, a prática da presente invenção emprega, a menosque de outra maneira indicado, técnicas convencionais de química, biologiamolecular, tecnologia de DNA recombinante, imunologia (especialmente,e.g.; tecnologia de imunoglobulina), e técnicas padrão em eletroforese. Veja,e.g., Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring HarborLaboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods inMolecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering:A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., IrlPr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., C.S.H.L. Press,Pub. (1999); Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al.,John Wiley & Sons (1992). Bousse et al., Protein Sizing on a Microchip,Anal.Chem. 73, 1207-1212 (2001); Knapp et al., Commercialized andEmerging Lab-on-a-Chip Applications; In: Proceedings of the,uTAS 2001Symposium, Ramsey, J.M. & van den Berg, A., 7-10 (2001); e Mhatre et al.,Strategies for locating disulfide bonds in a monoclonal antibody via massspectrometry, Rapid Commun.Mass Spectrom, 13 (24) 2503-2510 (1999).

Produção de Anticorpo Alvo

O anticorpo alvo pode ser produzido, e.g., usando umalinhagem recombinante de células de mamífero crescidas em cultura emsuspensão. Meio condicionado contendo o anticorpo de interesse é gerado emum biorreator de produção. O produto resultante pode ser coletado eclarificado com qualquer etapa de clarificação apropriada tal como, porexemplo, ou microfiltração e filtração de 0,22 μτη ou centrifugação, oufiltração com esponja e filtração de 0,22 μπι.

Purificação de Anticorpo alvo

A purificação dos anticorpos monoclonais alvo exemplificadosneste lugar (AAB ou 12A11) consiste de captura da molécula alvo emcromatografia de afinidade de proteína A. Isto pode consistir de rmp ProteínaA Sepharose™ Fast Flow, Proteína A Sepharose™ Fast Flow, ou Proteína AMabSelect. A resina é então lavada como descrito para cada um dosexperimentos e o produto eluído e testado para níveis de impurezas.

Análise de Anticorpo Alvo

HPLC de fase reversa (RP-HPLC) foi usada para quantificar aquantidade de IRT presente nas amostras de anticorpo monoclonal AAB.Cromatografia de exclusão por tamanho (SEC-HPLC) foi usada paradeterminar a porcentagem de proteína monomérica (IgG monomérica),espécies de alto peso molecular (HMW), e baixo peso molecular (LMW).

Análise SEC-HPLC desnaturante foi realizada para determinar a quantidaderelativa de espécies ligadas sob dissulfeto (UDB) em amostras. Os níveis deHCP nas amostras de teste foram determinados usando um ensaioimunoabsorvente ligado à enzima (ELISA).

Ensaios Analíticos: IRT & UDB

HPLC de Fase Reversa (Análise AABIRT)

A RP-HPLC foi conduzida como segue. Redução de dissulfetode cada amostra foi realizada por incubação a 40 0C por 60 min na presençade 2,5 mM de DTT. Alquilação foi realizada por incubação em temperaturaambiente na presença de 5,5 mM de ácido iodoacético. Seguindo redução ealquilação, todas as amostras foram dissipadas com 5 μΐ de 1 M DTT. Olimite de quantificação para este ensaio é 0,5%. Aproximadamente 40 μg decada amostra reduzida alquilada foi injetado, em uma coluna POROS Rl/HRP-HPLC e corrido por 70 min nas seguintes condições:Coluna: Poros Rl/H RP-HPLC Temp de Coluna: 50 °C;

Fase Móvel A: 0,1% de TFA (w/v) em água;

Fase Móvel B: 0,1% de TFA (w/v) em 95% de acetonitrila;

Vazão: l,0mL/min

Detecção: 217 nm

Tempo de Corrida: 70 minutos

Injeção: Triplicata de 40 cada

Os tempos de gradientes foram listados em TABELA 1.

Tabela 1: Tempos de gradientes para método RP-HPLC

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dSEC-HPLC (.Análise AAB UDB)

SEC-HPLC desnaturante foi conduzida como segue. O pré-tratamento de amostras para o ensaio SEC desnaturante envolve uma misturade reagente/amostra em concentrações finais de 200 μg/mL de proteína, 3 Mde Guanidina HC1, e 100 mM de Tris, em um pH de 7,4. As amostras foramaquecidas a 80°C por 20 minutos enquanto misturando através de inversão.Para este ensaio, dois controles são empregados para permitir umagrupamento de níveis de UDB. Referências internas com níveis baixos elatos de UDB foram usadas como controles.

Condições Cromatográficas/de Ensaio foram como segue:

Coluna: Tosoh BioSep G3000 SWxl

Temp. de Coluna: Ambiente

Fase Móvel: 3 M de Guanidina HC1, 25 mM de NaPO4, pH 6,8

Gradiente: Isocrático Vazão: 0,5 mL/min Detecção: 280 nmTempo de Corrida: 50 minutosInjeção: Triplicata 50 μί (10 μg)

EXEMPLO 1: Comparação de Tampões de lavagem para remoção de IRT

Neste exemplo, uma solução impura contendo o anticorpomonoclonal anti-Αβ AAB foi purificada por adsorção em uma coluna deProteína A seguido por uma primeira lavagem com um tampão de lavagemcontendo ou CaCl 2, MgCl 2, NaCl ou propilenoglicol.

A cultura contendo o anticorpo monoclonal foi purificada emuma escala pequena usando uma coluna rmp Proteína A Sepharose™ FF (8,9mL) conectada a um sistema de cromatografia GE Healthcare AKTA FPLC c.

Para todas as etapas de cromatografia rmp Proteína A Sepharose™ FFdescrita em experimento 1, as seguintes condições foram usadas. (Exceçõessão observadas nas descrições experimentais individuais).

Dimensões de coluna -1,0 cm χ 11,4 cmVazão operacional - 150 cm/hr

Equilíbrio 1- 20 mM de Tris, 150 mM de NaCl, pH 7,5 (5volumes de coluna)

Descarga - 20 mM de Tris, 150 mM de NaC 1, pH 7,5 (1volume de coluna)

Lavagem 1 - Variável (Veja Tabela 2) exceto para corrida #1,que não teve lavagem 1

Lavagem 2-20 mM de Tris, 1,0 M de NaC 1, pH 7,5 (5volumes de coluna)

Lavagem 3-10 mM de Tris, 75 mM de NaC 1, pH 7,5 (7volumes de coluna)

Eluição - 50 mM de Glicina, 75 mM de NaC 1, pH 3,1 (6volumes de coluna)

Escoamento 1- 20 mM de Citrato de sódio, pH 2,7 (5 volumesde coluna)Escoamento 2 - 6 M de Guanidina HCl (2 volumes de coluna)

Lavagem de escoamento - 20 mM de Tris, 150 mM de NaC 1,

pH 7,5 (5 volumes de coluna)

Armazenamento - 16% de Etanol (5 volumes de coluna)

Temperatura de Corrida: 2-8°C

As corridas de coluna rmp Proteína A Sepahrose™ FF foramequilibradas com 5 volumes de coluna de 20 mM de Tris, 150 mM de NaC 1,pH 7,5. A coluna foi carregada em aproximadamente 10 mg de produto/mLde resina. Carregamento seguido por uma descarga de 1 volume de colunacom tampão de equilíbrio e 5 volumes de coluna de solução de lavagem 1.Todas as soluções de Lavagem 1 testadas são descritas em Tabela 2. Lavagem1 foi incluída em todas as corridas exceto para corrida #1. Lavagem 1 foiseguida por 5 volumes de coluna de 20 mM de Tris, 1,0 M de NaC 1, pH 7,5 e7 volumes de coluna de 10 mM de Tris, 75 mM de NaC 1, pH 7,5. O anticorpomonoclonal foi eluído da coluna com 50 mM de Glicina, 75 mM de NaC 1, pH3,1. A combinação de produtos foi então neutralizada para 7,9-8,1 com 2 Mde Tris pH 8,5. As colunas foram então escoadas, lavadas e armazenadas.

Tabela 2 lista os níveis das espécies IRT & LMW presentes nas combinaçõesde produtos das várias corridas. Lavagens com cloreto de magnésio e cloretode cálcio reduziram níveis de espécies IRT e LMW.

Tabela 2: Valores de IRT e LMW para Vários Tampões de Lavagem 1

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Os resultados mostraram que as lavagens com cloreto demagnésio e cloreto de cálcio reduziram níveis de espécies IRT e LMW, aopasso que as lavagens com Cloreto de Sódio e propilenoglicol não reduziramespécies IRT ou LMW.

EXEMPLO 2: Cromatografia de Proteína A com Lavagem com CaC 1? pararemoção de IRT

Neste exemplo, uma purificação de anticorpo de maior escalafoi realizada usando cromatografia de Proteína A com uma lavagem comCaCl 2 para remover espécies IRT.

A cultura contendo o anticorpo monoclonal foi purificada emescala piloto usando uma coluna de Proteína A MabSelect (2,4 L) conectada aum sistema de cromatografia Millipore K-Prime 400. As duas corridas deMabSelect foram realizadas como descrito abaixo.

Dimensões de coluna - 13 cm χ 18 cm

Vazão operacional - 150 cm/hr, 300 cm/hr

Equilíbrio 1 - 20 mM de Tris, 150 mM de NaC 1, pH 7,5 (5volumes de coluna)

Descarga - 20 mM de Tris, 150 mM de NaC 1, pH 7,5 (2volumes de coluna)

Lavagem 1 - 50 mM de Tris, 2 M de CaCl2, pH 7,5 paracorrida #1 e nenhuma lavagem 1 para corrida #2

Lavagem 2-20 mM de Tris, 1,0 M de NaC 1, pH 7,5 (5volumes de coluna)

Lavagem 3-10 mM de Tris, 75 mM de NaC 1, pH 7,5 (5volumes de coluna)

Eluição - 50 mM de Glicina, 25 mM de NaC 1, pH 3,1 (6volumes de coluna)

Escoamento 1- 50 mM de Glicina, 0,5 M de NaC 1, pH 2,7 (5volumes de coluna)

Escoamento 2 - 6 M de Guanidina HCl (2 volumes de coluna)Lavagem de escoamento - 20 mM de Tris, 150 mM de NaC 1,

pH 7,5 (5 volumes de coluna)Armazenamento - 16% de Etanol (5 volumes de coluna)

Temperatura de corrida: 2-8°C

A coluna de Proteína A MabSelect foi equilibrada com 5volumes de coluna de 20 mM de Tris, 150 mM de NaC 1, pH 7,5. As colunasforam então carregadas em aproximadamente 10 mg de produto/mL de resina.

Isto foi seguido por uma descarga de 2 volumes de coluna com tampão deequilíbrio e 5 volumes de coluna de solução de lavagem 1. Esta solução delavagem 1 consistiu de 50 mM de Tris, 2,0 M de CaCl2, pH 7,5 para corrida1, enquanto que ela foi deixada de fora inteiramente para corrida 2. Lavagem1 foi então seguida por 5 volumes de coluna de 50 mM de Tris, 1,0 M deNaC 1, pH 7,5 e 5 volumes de coluna de 10 mM de Tris, 75 mM de NaC 1, pH7,5. O anticorpo monoclonal foi eluído da coluna de Proteína A MabSelectcom 50 mM de Glicina, 25 mM de NaC 1, pH 3,1. A combinação de produtosfoi então neutralizada para 7,8-8,2 com 2 M de Tris pH 8,5. As colunas foramentão escoadas, lavadas e armazenadas. Os resultados são mostrados emTabela 3.

Tabela 3: % de níveis de IRT em corridas em escala piloto com e semlavagem com cloreto de cálcio

<table>table see original document page 68</column></row><table>

Os resultados mostraram que a lavagem com cloreto de cálcioem escala piloto removeu IRT da combinação de produtos.

EXEMPLO 3: Remoção de DNA

Neste exemplo, a capacidade de uma lavagem com CaCl2 deremover DNA de célula hospedeira de uma preparação contendo o anticorpomonoclonal AAB foi avaliada.

A cultura contendo o anticorpo monoclonal foi purificada emsequena escala usando uma coluna de Proteína A MabSelect (19 mL)conectada a um sistema de cromatografia GE Healthcare AKTA FPLC. Astrês corridas de MabSelect foram realizadas como descrito abaixo.Dimensões de coluna - 1,1 cm χ 20 cmVazão operacional - 300 cm/hr

Equilíbrio 1- 20 mM de Tris, 150 mM de NaCl, pH 7,5 (5volumes de coluna)

Descarga - 20 mM de Tris, 150 mM de NaC 1, pH 7,5 (2volumes de coluna)

Lavagem 1-50 mM de Tris, 2,0 M de CaCl2, pH 7,5 (5volumes de coluna) (Corridas 2 e 3 apenas)

Lavagem 2-20 mM de Tris, 1,0 M de NaC 1, pH 7,5 (5volumes de coluna) (Corridas 1 e 3 apenas)

Lavagem 3-10 mM de Tris, 75 mM de NaC 1, pH 7,5 (7volumes de coluna) Eluição - 50 mM de Glicina, 75 mM de NaC 1, pH 3,0 (6volumes de coluna)

Escoamento - 50 mM de Glicina, 0,5 M de NaC 1, pH 2,7 (5volumes de coluna)

Lavagem de escoamento - 20 mM de Tris, 150 mM de NaC 1,pH 7,5 (5 volumes de coluna) Armazenamento - 16% de Etanol (5 volumesde coluna)

Temperatura de corrida: 18-24°C

As corridas de coluna de Proteína A MabSelect foramequilibradas com 5 volumes de coluna de 20 mM de Tris, 150 mM de NaC 1,pH 7,5. As colunas foram então carregadas em uma carga deaproximadamente 40 mg de produto/mL de resina. Isto foi seguido por umadescarga de 2 volumes de coluna com tampão de equilíbrio. Para corridas 2 e3, esta etapa foi seguida por 5 volumes de coluna de solução de Lavagem 1.Para corridas 1 e 3, 5 volumes de coluna de solução de Lavagem 2 foramusados. Todas as 3 corridas empregaram 7 volumes de coluna de solução deLavagem 3. O anticorpo monoclonal foi eluído for a da coluna de Proteína AMabSelect com 50 mM de Glicina, 75 mM de NaC 1, pH 3,0. A combinaçãode produtos foi então neutralizada para 7,5-8,0 com 2 M de Tris pH 8,5. Ascolunas foram então escoadas, lavadas e armazenadas. Os resultados sãomostrados em Tabela 4.

Tabela 4: Remoção de DNA com lavagem com cloreto de cálcio.

<table>table see original document page 70</column></row><table>

Os resultados mostraram que a adição de 50 mM de Tris, 2,0

M de cloreto de cálcio, pH 7,5, forneceu redução 10 vezes maior de DNAcomparado com usar NaCl na solução de lavagem.

EXEMPLO 4: Remoção de Proteína de Célula Hospedeira

Neste exemplo, um segundo anticorpo monoclonal anti-Αβ,12A11, foi usado em corridas de purificação nas quais várias condições delavagem foram testadas para a capacidade de remover proteínas de célulahospedeira (HCP).

Uma triagem de alto rendimento (HTS) em um formato deplaca de filtro de 96 poços foi realizada para identificar as melhores condiçõesde lavagem para remoção de impurezas tal como HCP para a etapa deMabSelect. Esta triagem variou os excipientes de lavagem, concentração deexcipiente, e pH para determinar seu efeito em impurezas relacionadas aprocesso tal como HCP.

A resina MabSelect foi equilibrada usando 5 mM de Tris, 10 mM de NaC 1, pH 7,3 e carregada com produto em uma coluna. A resina foientão desempacotada, misturada e 50 μΙ. de resina foi distribuído a cada poçode uma placa de filtro de 96 poços. A resina em cada poço foi equilibrada emsolução de 5 mM de Tris, 10 mM de NaC 1, pH 7,3, e então lavada com cadauma das várias soluções de lavagem de excipiente em 3 estágios, cada umusando 300 μΐ, de tampão de lavagem. Depois da lavagem de excipiente, umasegunda lavagem com tampão de 5 mM de Tris, 10 mM de NaCl, pH 7,3 foirealizada em 4 estágios de 300 μΐ. cada. O produto foi então eluído da resinaem 3 estágios de 300 μι cada. Estágios de eluição 1 e 2 foram combinados etestados para níveis de HCP.

Volume de Resina - 50 \ih

Excipientes de Lavagem - Cloreto de Sódio, Cloreto de cálcio,Cloreto de magnésio,

Concentrações de Excipiente - 100, 250, 500, 1000, 1500, e2000 mM

pH de Excipiente - 6,0 & 7,5

Tampões de eluição - 25 mM de Hepes, 10 mM de NaC 1, pH3,0, 25 mM de Hepes, 100 mM de NaCl, pH 3,0, 50 mM de Glicina, 10 mMde NaCl,pH 3,0, 50 mM de Glicina, 100 mM de NaCl, pH 3,0 e 100 mMde Arginina, 10 mM de NaC 1, pH 3,0, 100

mM de Arginina, 100 mM de NaC 1, pH 3,0Temperatura de corrida: 18-24°C

Os resultados são mostrados em Tabela 5 e Tabela 6.

Tabela 5: Valores de HCP para resina MabSelect lavada com Cloreto deSódio,cloreto de cálcio, ou cloreto de magnésio em pH 6,0

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Tabela 6: Valores de HCP para resina MabSelect lavada comCloreto de Sódio, cloreto de cálcio, ou cloreto de magnésio em pH 7,5.

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Os resultados mostraram que tanto cloreto de cálcio comocloreto de magnésio reduziram o nível de HCP na combinação de pico deMabSelect comparados com Cloreto de Sódio em pH 6,0 (Tabela 5) e pH 7,5(Tabela 6).

EXEMPLO 5: Remoção de espécies ligadas sob dissulfeto (UDB)

Neste exemplo, a capacidade da lavagem com CaCl 2 deremover espécies ligadas sob dissulfeto (UDB) foi avaliada.

Duas corridas em rmp Proteína A Sepharose™ FF foramrealizadas essencialmente como descrito em exemplo 1.

Dimensões de coluna - 1,0 cm χ 11,4 cmVazão operacional - 150 cm/hr

Equilíbrio 1 - 20 mM de Tris, 150 mM de NaC 1, pH 7,5 (5volumes de coluna)

Descarga - 20 mM de Tris, 150 mM de NaC 1, pH 7,5 (1volume de coluna)

Lavagem 1 - 50 mM de Acetato, 2,0 M de CaCl2, pH 5,0 paraCorrida 1; Nenhum para Corrida 2

Lavagem 2-20 mM de Tris, 1,0 M de NaC 1, pH 7,5 (5volumes de coluna) Lavagem 3-10 mM de Tris, 75 mM de NaC 1, pH 7,5 (7volumes de coluna) Eluição- 50 mM de Glicina, 75 mM de NaC 1, pH 3,1 (6volumes de coluna)Escoamento 1- 20 mM de Citrato de sódio, pH 2,7 (5 volumesde coluna)

Escoamento 2 - 6 M de Guanidina HCl (2 volumes de coluna)

Lavagem de escoamento - 20 mM de Tris, 150 mM de NaC 1,

pH 7,5 (5 volumes de coluna)

Armazenamento - 16% de Etanol (5 volumes de coluna)

Temperatura de corrida: 2-8°C

As colunas de rmp Proteína A Sepharose FF foramequilibradas com 5 volumes de coluna de 20 mM de Tris, 150 mM de NaC 1,pH 7,5. As colunas foram então carregadas em uma carga deaproximadamente 10 mg de produto/mL de resina. Isto foi seguido por umadescarga de 1 volume de coluna com tampão de equilíbrio e então 5 volumesde coluna de solução de lavagem 1. Esta solução de lavagem 1 consistiu de 50mM de Acetato, 2,0 M de CaCl2, pH 5,0 para corrida 1, enquanto que ela foideixada inteiramente fora para corrida 2. Lavagem 1 foi então seguida por 5volumes de coluna de 20 mM de Tris, 1,0 M de NaC 1, pH 7,5 e 7 volumes decoluna de 10 mM de Tris, 75 mM de NaC 1, pH 7,5. O anticorpo monoclonalfoi eluído fora da coluna rmp Proteína A Sepharose™ FF com 50 mM deGlicina, 75 mM de NaC 1, pH 3,1. A combinação de produtos foi entãoneutralizada para 7,8-8,2 com 2 M de Tris pH 8,5. As colunas foram entãoescoadas, lavadas e armazenadas. Os resultados são mostrados em Tabela 7.

Tabela 7: % UDB para amostras lavadas com e sem cálcio.

<table>table see original document page 73</column></row><table>

Uma redução de 2 vezes em níveis de UDB foi observada paraa corrida que teve a lavagem adicional com 50 mM de Acetato, 2,0 M deCaCl2, pH 5,0.

EXEMPLO 6: Remoção de HCP e IRT com Lavagens com Outro Sal deCátion Divalente

Neste exemplo, a capacidade de lavagens contendo ou MnCl2ou NiCl 2 de remover impurezas de uma preparação contendo o anticorpomonoclonal anti-Αβ AAB foi avaliada.

Duas corridas foram realizadas para avaliar o efeito delavagens contendo outros sais catiônicos divalentes tal como MnCl2 e NiCl2.

Duas corridas de controle também foram realizadas- uma usando umalavagem com 50 mM de Tris, 1,0 M de NaC 1, pH 7,5 (nenhuma remoção deIRT ou HCP esperada) e outra usando uma lavagem com 50 mM de Tris, 2,0M de CaCl2, pH 7,5.

A cultura contendo o anticorpo monoclonal foi purificada empequena escala usando uma coluna de Proteína A MabSelect (9 mL)conectada a um sistema de cromatografia GE Healthcare AKTA FPLC. Ascorridas de MabSelect foram realizadas como descrito abaixo. Como descritoabaixo, todos os parâmetros operacionais foram idênticos para as quatrocorridas exceto para Lavagem 1, que foi variável (Tabela 8).

Dimensões de coluna - 1,0 cm χ 11,5 cm (9 mL)Vazão operacional - 300 cm/hr (Equilíbrio, Lavagem 2,Eluição, Regeneração, Armazenamento)

Vazão operacional - 230 cm/hr (Carga, Descarga, Lavagem 1)

Equilíbrio 1- 50 mM de Tris, 150 mM de NaC 1, pH 7,5 (5,0volumes de coluna)

Lavagem 1 - Variável (Veja Tabela 8 para composição)Lavagem 2-50 mM de Tris, 10 mM de NaCl, pH 7,5 (5volumes de coluna)

Eluição - 50 mM de Glicina, 10 mM de NaC 1, pH 3,0 (3volumes de coluna)

Regeneração - 50 mM de NaOH, 0,5 M de Na2SO4 (5 volumesde coluna)Armazenamento - 16% de Etanol, 50 mM de Tris, 150 mM deNaC 1, pH 7,5 (5 volumes de coluna)

Temperatura de corrida: 18-24°C

A coluna de Proteína A MabSelect foi equilibrada com 5volumes de coluna de 50 mM de Tris, 150 mM de NaC 1, pH 7,5. A coluna foicarregada em aproximadamente 40 mg de produto/mL de resina. A cargaremanescente foi descarregada da coluna com 5 volumes de coluna de 50 mMde Tris, 150 mM de NaC 1, pH 7,5. A coluna foi então lavada com uma dassoluções descritas em Tabela 11. Antes de eluição a coluna foi lavada com 5volumes de coluna de 50 mM de Tris, 10 mM de NaC 1, pH 7,5. O produto foieluído da coluna de Proteína A MabSelect com 50 mM de Glicina, 10 mM deNaC 1, pH 3,0. A combinação de produtos foi então neutralizada para pH 8,0com 2 M de Tris pH 9,0. A coluna foi escoada com 5 volumes de coluna de50 mM de NaOH, 0,5 M de Na2SCM então armazenada com 5 volumes decoluna de 16% de etanol, 50 mM de Tris, 150 mM de NaC 1, pH 7,5. Osresultados são mostrados em Tabela 8 (remoção de HCP) e Tabela 9 (remoçãode IRT).

Tabela 8: Remoção de HCP com várias soluções de lavagem

<table>table see original document page 75</column></row><table>

* pH 5,0 foi escolhido devido à solubilidade de MnCl2 e NiC 12

Tabela 9: Remoção de IRT com várias soluções de lavagem

<table>table see original document page 75</column></row><table>

pH 5,0 foi escolhido devido à solubilidade de MnCh e NÍC12

Tabela 8 mostra que o nível de HCPs presente em corridas queforam lavadas com soluções contendo cátions divalentes tiveram 1,5-3,5vezes menos HCPs do que o controle (Lavagem com 1,0 M de NaC 1). Tabela9 mostra que as corridas que contiveram as lavagens com soluções de saiscatiônicos divalentes também forneceram > 3,5 vezes remoção de IRTcomparadas com a corrida com uma solução de lavagem contendo 1,0 M deNaC 1. Assim, estes resultados demonstram que lavagens salinas com outroscátions divalentes (e.g., com MnCl2 ou NiCl2), diferente do que CaCl2,também foram efetivas para remover impurezas.

Equivalentes Aqueles versados na técnica irão reconhecer, ouser capazes de determinar usando não mais do que experimentação de rotina,muitos equivalentes das formas de realização específicas da invençãodescritas neste lugar. Tais equivalentes são pretendidos para serem abrangidospelas reivindicações seguintes.LISTAGEM DAS SEOUENCIAS

<110> Neuralab Limited, et al.

<120> MÉTODOS DE PURIFICAR ANTICORPOS ΑΝΤΙ A BETA

<130> ELN-053PC

<150> 60/691,821

<151> 2005-06-17

<160> 47

<170> PatentIn versão 3.3<210> 1<211> 219<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Construção sintética<4 00> 1

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly15 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 2<211> 449<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Construção Sintética<400> 2

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Val Arg Tyr Asp His Tyr Ser Gly Ser Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly435 440 445

Lys

<210> 3<211> 113<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Anticorpo humanizado sintético<220>

<221> M0D_RES<222> (1)<223> Asp ou Tyr<220>

<221> M0D_RES<222> (7)<223> Ser ou Thr<220>

<221> MOD RES<222> (10)<223> Ser ou Thr<220>

<221> MOD_RES<222> (15)

<223> Leu, lie, ou Val<220>

<221> MOD_RES<222> (50)<223> Arg ou Lys<220>

<221> MOD_RES<222> (88)<223> Val ou Leu<220>

<221> M0D_RES<222> (109)<223> Val ou Leu<400> 3

Xaa Val Val Met Thr Gln Xaa Pro Leu Xaa Leu Pro Val Thr Xaa Gly1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser 20 Ile Ser Cys Lys Ser 25 Ser Gln Ser Leu Leu 30 Asp SerAsp Gly Lys 35 Thr Tyr Leu Asn Trp 40 Leu Gln Gln Arg Pro 45 Gly Gln SerPro Xaa 50 Arg Leu Ile Tyr Leu 55 Val Ser Lys Leu Asp 60 Ser Gly Val ProAsp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala 85 Glu Asp Xaa Gly Val 90 Tyr Tyr Cys Trp Gln 95 GlyThr His Phe Pro 100 Arg Thr Phe Gly Gly 105 Gly Thr Lys Xaa Glu 110 Ile Lys

Arg

<210> 4<211> 119<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<221> M0D_RES<222> (3)

<223> Gln, Lys, ou Arg<220>

<221> M0D_RES<222> (78)<223> Ser ou Thr<220>

<221> M0D_RES<222> (87)<223> Arg ou Lys<220>

<221> M0D_RES<222> (88)

<223> Ala, Ser, ou Thr<220>

<221> M0D_RES<222> (114)

<223> Leu, Thr, lie, ou Val<400> 4

Glu Val Xaa Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Gly Ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Asn TyrGly Met Ser 35 Trp Val Arg Gln Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp ValAla Ser 50 Ile Arg Ser Gly Gly 55 Gly Arg Thr Tyr Tyr 60 Ser Asp Asn ValLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Xaa Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser 85 Leu Xaa Xaa Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 CysVal Arg Tyr Asp 100 His Tyr Ser Gly Ser 105 Ser Asp Tyr Trp Gly 110 Gln GlyThr Xaa Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 5<211> 113<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Anticorpo humanizado sintético<400> 5

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser 20 Ile Ser Cys Lys Ser 25 Ser Gln Ser Leu Leu 30 Asp SerAsp Gly Lys 35 Thr Tyr Leu Asn Trp 40 Leu Gln Gln Arg Pro 45 Gly Gln SerPro Arg 50 Arg Leu Ile Tyr Leu 55 Val Ser Lys Leu Asp 60 Ser Gly Val ProAsp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala 85 Glu Asp Val Gly Val 90 Tyr Tyr Cys Trp Gln 95 GlyThr His Phe Pro 100 Arg Thr Phe Gly Gln 105 Gly Thr Lys Val Glu 110 Ile Lys

Arg

<210> 6<211> 119<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Anticorpo humanizado sintético<400> 6

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Gly Ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Asn TyrGly Met Ser 35 Trp Val Arg Gln Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp ValAla Ser 50 Ile Arg Ser Gly Gly 55 Gly Arg Thr Tyr Tyr 60 Ser Asp Asn ValLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 CysVal Arg Tyr Asp 100 His Tyr Ser Gly Ser 105 Ser Asp Tyr Trp Gly 110 Gln GlyThr Leu Val 115 Thr Val Ser Ser <210> 7

<211> 219<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Anticorpo humanizado sintético<400> 7

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser 20 Ile Ser Cys Lys Ser 25 Ser Gln Ser Leu Leu 30 Asp SerAsp Gly Lys 35 Thr Tyr Leu Asn Trp 40 Leu Gln Gln Arg Pro 45 Gly Gln SerPro Arg 50 Arg Leu Ile Tyr Leu 55 Val Ser Lys Leu Asp 60 Ser Gly Val ProAsp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Gln Ala 85 Glu Asp Val Gly Val 90 Tyr Tyr Cys Trp Gln 95 GlyThr His Phe Pro 100 Arg Thr Phe Gly Gly 105 Gly Thr Lys Val Glu 110 Ile LysArg Thr Val 115 Ala Ala Pro Ser Val 120 Phe Ile Phe Pro Pro 125 Ser Asp GluGln Leu 130 Lys Ser Gly Thr Ala 135 Ser Val Val Cys Leu 140 Leu Asn Asn PheTyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln145 150 155 160Ser Gly Asn Ser Gln 165 Glu Ser Val Thr Glu 170 Gln Asp Ser Lys Asp 175 SerThr Tyr Ser Leu 180 Ser Ser Thr Leu Thr 185 Leu Ser Lys Ala Asp 190 Tyr GluLys His Lys 195 Val Tyr Ala Cys Glu 200 Val Thr His Gln Gly 205 Leu Ser SerPro Val 210 Thr Lys Ser Phe Asn 215 Arg Gly Glu Cys

<210> 8<211> 449<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Anticorpo humanizado sintético<400> 8

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Tyr Asp His Tyr Ser Gly Ser Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp145 150 155 160Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly435 440 445

Lys

<210> 9<211> 113<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<221> M0D_RES<222> (3)<223> Val ou Leu<220>

<221> M0D_RES<222> (7)<223> Ser ou Thr<220>

<221> M0D_RES<222> (14)<223> Thr ou Ser<220>

<221> MOD_RES<222> (17)

<223> Gln, Asp, ou Asn<220>

<221> M0D_RES<222> (30)<223> Ile ou Val<220>

<221> MOD RES<222> (50)<223> Arg ou Lys<220>

<221> MOD_RES<222> (88)<223> Val ou Leu<220>

<221> M0D_RES<222> (105)<223> Gly ou Ala<220>

<221> M0D_RES<222> (109)<223> Val ou Leu<400> 9Asp Val1

Xaa Pro

Asn Gly

Pro Xaa50

Asp Arg65

Ser Arg

Ser His

Arg

<210> 1<211> 1<212> P<213> Seqüência Artificial<220>

<221> M0D_RES<222> (1)<223> Gln ou Glu<220>

<221> M0D_RES<222> (2)<223> Val ou Ala<220>

<221> M0D_RES<222> (64)

<223> Ser ou Thr<220>

<221> M0D_RES<222> (77)<223> Lys ou Arg<220>

<221> M0D_RES<222> (78)<223> Ser ou Thr<220>

<221> M0D_RES<222> (83)<223> Thr ou Ser

Xaa Met Thr5

Ala Ser Ile20

Asn Thr Tyr35

Leu Leu IlePhe Ser GlyVal Glu Ala85

Val Pro Leu100

Gln Xaa Pro

Ser Cys Arg

Leu Glu Trp40

Tyr Lys Val55

Ser Gly Ser70

Glu Asp XaaThr Phe Gly

Leu Ser10

Ser Ser25

Tyr LeuSer AsnGly ThrGly Val90

Xaa Gly105

Leu Pro Val

Gln Asn Ile

Gln Lys Pro45

Arg Phe Ser60

Asp Phe Thr75

Tyr Tyr CysThr Lys Xaa

Xaa Leu Gly15

Xaa His Ser30

Gly Gln Ser

Gly Val Pro

Leu Lys Ile80

Phe Gln Gly95

Glu Ile Lys110

0

23RT<220>

<221> MOD_RES<222> (84)

<223> Met, lie, ou Leu<220>

<221> MOD_RES<222> (86)

<223> Asn, Ser, ou Thr<220>

<221> MOD_RES<222> (87)

<223> Met, Vai, ou Leu<220>

<221> MOD_RES<222> (118)<223> Leu ou Ser<4 00> 10

Xaa Xaa Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu15 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Xaa

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Xaa Xaa Gln Val65 70 75 80

Val Leu Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Val Arg Arg Pro Ile Thr Pro Val Leu Val Asp Ala Met Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser115 120

<210> 11<211> 113<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Anticorpo humanizado sintético<4 00> 11

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Ile His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 110

Arg

<210> 12<211> 123<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Anticorpo humanizado sintético<4 00> 12Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu1 5 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val65 70 75 80

Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Val Arg Arg Pro Ile Thr Pro Val Leu Val Asp Ala Met Asp Tyr

100 105 110

Trp Gln Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120

<210> 13<211> 219<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Anticorpo humanizado sintético<4 00> 13

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser 20 Ile Ser Cys Arg Ser 25 Ser Gln Asn Ile Ile 30 His SerAsn Gly Asn 35 Thr Tyr Leu Glu Trp 40 Tyr Leu Gln Lys Pro 45 Gly Gln SerPro Arg 50 Leu Leu Ile Tyr Lys 55 Val Ser Asn Arg Phe 60 Ser Gly Val ProAsp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala 85 Glu Asp Val Gly Val 90 Tyr Tyr Cys Phe Gln 95 GlySer His Val Pro 100 Leu Thr Phe Gly Gly 105 Gly Thr Lys Val Glu 110 Ile LysArg Thr Val 115 Ala Ala Pro Ser Val 120 Phe Ile Phe Pro Pro 125 Ser Asp GluGln Leu 130 Lys Ser Gly Thr Ala 135 Ser Val Val Cys Leu 140 Leu Asn Asn PheTyr Pro Arg Gly Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln145 150 155 160Ser Gly Asn Ser Gln 165 Glu Ser Val Thr Glu 170 Gln Asp Ser Lys Asp 175 SerTyr Tyr Ser Leu 180 Ser Ser Thr Leu Thr 185 Leu Ser Lys Ala Asp 190 Tyr GluLys His Lys 195 Val Tyr Ala Cys Glu 200 Val Thr His Gln Gly 205 Leu Ser SerPro Val 210 Thr Lys Ser Phe Asn 215 Arg Gly Glu Cys

<210> 14<211> 453<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Anticorpo humanizado sintético<4 00> 14

Glu Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu15 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val65 70 75 80

Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Val Arg Arg Pro Ile Thr Pro Val Leu Val Asp Ala Met Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

210 215 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Gln Asn Asn Tyr Lys Thr Tyr385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Pro Gly Lys

450<210> 15<211> 132<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<221> SINAL<222> (1)..(20)<220>

<221> mat_peptideo<222> (21)..(132)<400> 15

Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser-20 -15 -10 -5

Gly Ser Ser Gly Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro

-11 5 10

Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn

15 20 25

Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys

30 35 40

Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe45 50 55 60

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

65 70 75

Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr

80 85 90

Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys

95 100 105

Leu Glu Ile Lys110<210> 16<211> 142<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<221> SINAL<222> (1)..(19)<220>

<221> mat_peptídeo<222> (20) .. (142)<4 00> 16

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp

-15 -10 -5

Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys

-11 5 10

Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu

15 20 25

Ser Thr Asn Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys30 35 40 45

Gly Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Glu Asp Lys Arg Tyr

50 55 60

Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys65 70 75

Thr Ala Ala Asp Thr Ala90

Tyr Asp Val Glu Asp Tyr105

Thr Val Ser Ser120<210> 17<211> 131<212> PRT

<213> Mus musculus<220>

<221> SINAL<222> (1)..(19)<220>

Asn Gln Val Ser Leu80

Val Tyr Tyr Cys Ala95

Phe Asp Tyr Trp Gly110

Lys Leu Ser Ser Val85

Arg Arg Arg Ile Ile100

Gln Gly Thr Thr Val115<221> mat_peptídeo<222> (20)..(131)<400> 17

Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala

-15 -10 -5

Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val

-11 5 10

Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile

15 20 25

Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro30 35 40 45

Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Th-r Asp Phe Thr

65 70 75

Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys

80 85 90

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu

95 100 105

Glu Leu Lys110<210> 18<211> 142<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<221> SINAL<222> (1)..(19)<220>

<221> mat_peptídeo<222> (20)..(142)<4 00> 18

Met Lys His Leu Trp -15 Phe Phe Leu Leu Leu -10 Val Ala Ala Pro Arg -5 TrpVal Leu Ser -1 Gln 1 Leu Gln Leu Gln 5 Glu Ser Gly Pro Gly 10 Leu Val LysPro Ser 15 Glu Thr Leu Ser Leu 20 Thr Cys Thr Phe Ser 25 Gly Phe Ser LeuSer Thr Asn Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys30 35 40 45Gly Leu Glu Trp Ile 50 Gly His Ile Tyr Trp 55 Asp Glu Asp Lys Arg 60 TyrAsn Pro Ser Leu 65 Lys Ser Arg Val Thr 70 Ile Ser Lys Asp Thr 75 Ser LysAsn Gln Phe 80 Ser Leu Lys Leu Ser 85 Ser Val Thr Ala Ala 90 Asp Thr AlaVal Tyr 95 Tyr Cys Ala Arg Arg 100 Arg Ile Ile Tyr Asp 105 Val Glu Asp TyrPhe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

110 115 120

<210> 19<211> 142<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<221> SINAL<222> (1)..(19)<220>

<221> mat_peptídeo<222> (20)..(142)<400> 19

Met Lys His Leu Trp -15 Phe Phe Leu Leu Leu -10 Val Ala Ala Pro Arg -5 TrpVal Leu Ser Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys-1 1 5 10 Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu15 20 25 Ser Thr Asn Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys30 35 40 45Gly Leu Glu Trp Leu 50 Gly His Ile Tyr Trp 55 Asp Glu Asp Lys Arg 60 TyrAsn Pro Ser Leu 65 Lys Ser Arg Val Thr 70 Ile Ser Lys Asp Thr 75 Ser LysAsn Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala80 85 90 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Arg Ile Ile Tyr Asp Val Glu Asp Tyr95 100 105 Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 110 115 120 <210> 20 <211> 112 <212> PRT <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição da : Seqüência Artificial: : Anticorpo humanizado s: <400> 20 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser 20 Ile Ser Cys Arg Ser 25 Ser Gln Ser Ile Val 30 His SerAsn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala 85 Glu Asp Val Gly Val 90 Tyr Tyr Cys Phe Gln 95 SerSer His Val Pro 100 Leu Thr Phe Gly Gln 105 Gly Thr Lys Leu Glu 110 Ile Lys<210> 21 <211> 120 <212> PRT <213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Anticorpo humanizado sintético<400> 21

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120

<210> 22<211> 120<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Anticorpo humanizado sintético<400> 22

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Phe Ser 25 Gly Phe Thr Leu Ser 30 Thr SerGly Met Ser 35 Val Gly Trp Ile Arg 40 Gln Ala Pro Gly Lys 45 Gly Leu GluTrp Val 50 Ala His Ile Trp Trp 55 Asp Asp Asp Lys Tyr 60 Tyr Asn Pro SerLeu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu65 70 75 80Tyr Leu Gln Met Asn 85 Ser Leu Arg Ala Glu 90 Asp Thr Ala Val Tyr 95 TyrCys Ala Arg Arg 100 Thr Thr Thr Ala Asp 105 Tyr Phe Ala Tyr Trp 110 Gly GlnGly Thr Thr 115 Val Thr Val Ser Ser 120

<210> 23<211> 120<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Anticorpo humanizado sintético<400> 23

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Phe Ser 25 Gly Phe Thr Leu Ser 30 Thr SerGly Met Ser 35 Val Gly Trp Ile Arg 40 Gln Ala Pro Gly Lys 45 Gly Leu GluTrp Val 50 Ala His Ile Trp Trp 55 Asp Asp Asp Lys Tyr 60 Tyr Asn Pro SerLeu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu65 70 75 80Tyr Leu Gln Met Asn 85 Ser Leu Arg Ala Glu 90 Asp Thr Ala Val Tyr 95 TyrCys Ala Arg Arg 100 Thr Thr Thr Ala Asp 105 Tyr Phe Ala Tyr Trp 110 Gly GlnGly Thr Thr 115 Val Thr Val Ser Ser 120

<210> 24<211> 120<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Anticorpo humanizado sintético<400> 24

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Val Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120

<210> 25<211> 120<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Anticorpo humanizado sintético<400> 25

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Phe Ser 25 Gly Phe Thr Leu Ser 30 Thr SerGly Met Ser 35 Val Gly Trp Ile Arg 40 Gln Ala Pro Gly Lys 45 Gly Leu GluTrp Leu 50 Ala His Ile Trp Trp 55 Asp Asp Asp Lys Tyr 60 Tyr Asn Pro SerLeu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu65 70 75 80Tyr Leu Gln Met Asn 85 Ser Leu Arg Ala Glu 90 Asp Thr Ala Val Tyr 95 TyrCys Ala Arg Arg 100 Thr Thr Thr Ala Asp 105 Tyr Phe Ala Tyr Trp 110 Gly GlnGly Thr Thr 115 Val Thr Val Ser Ser 120

<210> 26<211> 120<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Anticorpo humanizado sintético<400> 26

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Phe Ser 25 Gly Phe Thr Leu Ser 30 Thr SerGly Met Ser 35 Val Gly Trp Ile Arg 40 Gln Ala Pro Gly Lys 45 Gly Leu GluTrp Leu 50 Ala His Ile Trp Trp 55 Asp Asp Asp Lys Tyr 60 Tyr Asn Pro SerLeu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val65 70 75 80Tyr Leu Gln Met Asn 85 Ser Leu Arg Ala Glu 90 Asp Thr Ala Val Tyr 95 TyrCys Ala Arg Arg 100 Thr Thr Thr Ala Asp 105 Tyr Phe Ala Tyr Trp 110 Gly GlnGly Thr Thr 115 Val Thr Val Ser Ser 120

<210> 27<211> 120<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Anticorpo humanizado sintético<400> 27

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser20 25 30

Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Val Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120

<210> 28<211> 120<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Anticorpo humanizado sintético<400> 28

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120

<210> 29<211> 120<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Anticorpo humanizado sintético<400> 29

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu65 70 . 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120

<210> 30<211> 120<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Anticorpo humanizado sintético<400> 30

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Phe Ser 25 Gly Phe Thr Leu Ser 30 Thr SerGly Met Ser 35 Val Gly Trp Ile Arg 40 Gln Ala Pro Gly Lys 45 Gly Leu GluTrp Val 50 Ala His Ile Trp Trp 55 Asp Asp Asp Lys Tyr 60 Tyr Asn Pro SerLeu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val65 70 75 80Tyr Leu Gln Met Asn 85 Ser Leu Arg Ala Glu 90 Asp Thr Ala Val Tyr 95 TyrCys Ala Arg Arg 100 Thr Thr Thr Ala Asp 105 Tyr Phe Ala Tyr Trp 110 Gly GlnGly Thr Thr 115 Val Thr Val Ser Ser 120

<210> 31<211> 120<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Anticorpo humanizado sintético<400> 31

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg15 10 15

Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Phe Ser 25 Gly Phe Thr Leu Ser 30 Thr SerGly Met Ser 35 Val Gly Trp Ile Arg 40 Gln Ala Pro Gly Lys 45 Gly Leu GluTrp Leu 50 Ala His Ile Trp Trp 55 Asp Asp Asp Lys Tyr 60 Tyr Asn Pro SerLeu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val65 70 75 80Tyr Leu Gln Met Asn 85 Ser Leu Arg Ala Glu 90 Asp Thr Ala Val Tyr 95 TyrCys Ala Arg Arg 100 Thr Thr Thr Ala Asp 105 Tyr Phe Ala Tyr Trp 110 Gly GlnGly Thr Thr 115 Val Thr Val Ser Ser 120

<210> 32<211> 121<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Anticorpo humanizado sintético<400> 32

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg15 10 15

Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Phe Ser 25 Gly Phe Thr Leu Ser 30 Thr SerGly Met Ser 35 Val Gly Trp Ile Arg 40 Gln Ala Pro Gly Lys 45 Gly Leu GluTrp Leu 50 Ala His Ile Trp Trp 55 Asp Asp Asp Lys Tyr 60 Tyr Asn Pro SerLeu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu65 70 75 80Tyr Leu Gln Met Asn 85 Ser Leu Arg Ala Glu 90 Asp Thr Ala Val Tyr 95 TyrCys Ala Arg Arg 100 Thr Thr Thr Ala Asp 105 Tyr Phe Ala Tyr Trp 110 Gly GlnGly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Val115 120

<210> 33<211> 121<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Anticorpo humanizado sintético<400> 33

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Val Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Val

115 120

<210> 34<211> 120<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Anticorpo humanizado sintético<400> 34

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Val Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120

<210> 35<211> 120<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Anticorpo humanizado sintético<400> 35

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser50 55 60Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120

<210> 36<211> 120<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Anticorpo humanizado sintético<400> 36

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Val Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120

<210> 37<211> 120<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Anticorpo humanizado sintético<400> 37

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Val Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120

<210> 38<211> 120<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Anticorpo humanizado sintético<400> 38

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg15 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120

<210> 39<211> 120<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Anticorpo humanizado sintético<400> 39

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Val Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120

<210> 40<211> 120<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Anticorpo humanizado sintético<400> 40

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Met Ser Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120

<210> 41<211> 120<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Anticorpo humanizado sintético<400> 41

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120

<210> 42<211> 113<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<221> M0D_RES<222> (2)<223> Val ou Ile<220>

<221> M0D_RES<222> (7)<223> Ser ou Thr<220>

<221> M0D_RES<222> (14)<223> Thr ou Ser<220>

<221> M0D_RES<222> (15)<223> Leu ou Pro<220>

<221> M0D_RES<222> (30)<223> Ile ou Val<220>

<221> M0D_RES<222> (50)

<223> Arg, Gln, ou Lys<220>

<221> M0D_RES<222> (88)<223> Val ou Leu<220>

<221> M0D_RES<222> (105)<223> Gln ou Gly<220>

<221> M0D_RES<222> (108)<223> Lys ou Arg<220><221> MOD_RES<222> (109)<223> Val ou Leu<400> 42

Asp Xaa Val Met Thr Gln Xaa Pro Leu Ser Leu Pro Val Xaa Xaa Gly1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Xaa Tyr Ser

20 25 30

Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Xaa Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Xaa Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Xaa Gly Thr Xaa Xaa Glu Ile Lys100 105 110

Arg

<210> 43<211> 112<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<221> M0D_RES<222> (1)<223> Glu ou Gln<220>

<221> M0D_RES<222> (7)<223> Ser ou Leu

<220>

<221> M0D_RES<222> (46)

<223> Glu, Vai, Asp, ou Ser<220>

<221> M0D_RES<222> (63)<223> Thr ou Ser<220>

<221> M0D_RES<222> (75)

<223> Ala, Ser, Vai, ou Thr<220>

<221> M0D_RES<222> (76)<223> Lys ou Arg<220>

<221> M0D_RES<222> (89)<223> Glu ou Asp<220>

<221> M0D_RES<222> (107)<223> Leu ou Thr<400> 43Xaa Val Gln Leu Val Glu Xaa Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Arg TyrSer Met Ser 35 Trp Val Arg Gln Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Xaa Leu ValAla Gln 50 Ile Asn Ser Val Gly 55 Asn Ser Thr Tyr Tyr 60 Pro Asp Xaa ValLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Xaa Xaa Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Xaa Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser100 105 110

<210> 44<211> 113<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Anticorpo humanizado sintético<400> 44

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly15 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ile Tyr Ser

20 25 30

Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Thr Tyr Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 110

Arg

<210> 45<211> 112<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Anticorpo humanizado sintético<400> 45

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Arg TyrSer Met Ser 35 Trp Val Arg Gln Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Leu ValAla Gln 50 Ile Asn Ser Val Gly 55 Asn Ser Thr Tyr Tyr 60 Pro Asp Thr ValLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 CysAla Ser Gly Asp 100 Tyr Trp Gly Gln Gly 105 Thr Leu Val Thr Val 110 Ser Ser

<210> 46<211> 219<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220><223> Descrição da Seqüência Artificial: Anticorpo humanizado sintético<400> 46

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser 20 Ile Ser Cys Arg Ser 25 Ser Gln Ser Leu Ile 30 Tyr SerAsp Gly Asn 35 Ala Tyr Leu His Trp 40 Phe Leu Gln Lys Pro 45 Gly Gln SerPro Arg 50 Leu Leu Ile Tyr Lys 55 Val Ser Asn Arg Phe 60 Ser Gly Val ProAsp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala 85 Glu Asp Val Gly Val 90 Tyr Tyr Cys Ser Gln 95 SerThr His Val Pro 100 Trp Thr Phe Gly Gln 105 Gly Thr Lys Val Glu 110 Ile LysArg Thr Val 115 Ala Ala Pro Ser Val 120 Phe Ile Phe Pro Pro 125 Ser Asp GluGln Leu 130 Lys Ser Gly Thr Ala 135 Ser Val Val Cys Leu 140 Leu Asn Asn PheTyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln145 150 155 160Ser Gly Asn Ser Gln 165 Glu Ser Val Thr Glu 170 Gln Asp Ser Lys Asp 175 SerThr Tyr Ser Leu 180 Ser Ser Thr Leu Thr 185 Leu Ser Lys Ala Asp 190 Tyr GluLys His Lys 195 Val Tyr Ala Cys Glu 200 Val Thr His Gln Gly 205 Leu Ser SerPro Val 210 Thr Lys Ser Phe Asn 215 Arg Gly Glu Cys

<210> 47<211> 442<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Anticorpo humanizado sintético<400> 47

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Gln Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 115 120 125 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 130 135 140 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser145 150 155 160Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 165 170 175 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 180 185 190 Tyr Ile Cys 1 QR Asn Val Asn His Lys ?nn Pro Ser Asn Thr Lys OilR Val Asp Lys

195 200 205Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

210 215 220

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro225 230 235 240

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

245 250 255

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

260 265 270

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

275 280 285

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

290 295 300

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn305 310 315 320

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

325 330 335

.Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

340 345 350

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

355 360 365

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

370 375 380

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe385 390 395 400

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

405 410 415

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

420 425 430

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys435 440

Claims

1. Método para purificar uma proteína de ligação Αβ tendouma região Fc de um líquido fonte compreendendo a proteína e uma ou maisimpurezas, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:adsorver a proteína de ligação Αβ a um agente de ligação Fc;lavar o agente de ligação Fc com uma solução tampãocontendo CaCl2 em uma concentração de cerca de 0,5 M a cerca de 3 M parareduzir a uma ou mais impurezas; erecuperar a proteína de ligação Αβ do agente de ligação Fc emuma solução de eluição.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que dita uma ou mais impurezas são selecionadas a partir do grupoconsistindo de: espécies variantes de transleitura de íntron (IRT), espéciesligadas sob dissulfeto (UDB), espécies de alto peso molecular (HMW) eespécie de baixo peso molecular (LMW).

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que dita uma ou mais impurezas é uma IRT.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a proteína de ligação Αβ é um anticorpo.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelofato de que o anticorpo é selecionado a partir do grupo consistindo de: umafusão de anticorpo, um anticorpo murino, um anticorpo quimérico, umanticorpo humanizado, e um anticorpo humano.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a proteína de ligação Αβ é um anticorpo anti-Αβ humanizado.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelofato de que o anticorpo anti-Αβ humanizado é selecionado a partir do grupoconsistindo de: 3D6, 10D5, 12A11, 266, 15C11 e 12B4.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a proteína de ligação Αβ tendo uma região Fc é produzidarecombinantemente.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelofato de que a proteína de ligação Αβ tendo uma região Fc é produzidarecombinantemente em uma célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO).

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o agente de ligação Fc compreende uma ou mais de ProteínaA e Proteína G.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o agente de ligação Fc é imobilizado em uma fase sólida.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que a fase sólida compreende um ou mais de uma microesfera,um gel, uma resina, e uma partícula.

13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a solução tampão contendo o CaCl2 tem um valor de pH emum intervalo entre cerca de 4 a cerca de 8.

14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a solução tampão contendo o CaCk tem um valor de pH emum intervalo entre cerca de 7,3 a cerca de 7,7.

15. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a solução tampão tem uma concentração de CaCl2 em umintervalo entre cerca de 0,5 M a cerca de 3 M.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizadopelo fato de que a solução tampão tem uma concentração CaCl2 em umintervalo entre cerca de 0,5 M a cerca de 2 M.

17. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a solução tampão contendo CaCl2 compreende pelo menoscerca de 1,5 M a cerca de 2,5 M de CaCl2.

18. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a solução tampão contendo CaCl2 compreende cerca de 1,5M a cerca de 2 M de CaCl2.

19. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que as etapas de adsorver a proteína de ligação Αβ a um agentede ligação Fc e lavagem do agente de ligação Fc são realizadas em umatemperatura no intervalo entre cerca de 2°C a cerca de 24°C.

20. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a uma ou mais impurezas compreendem um ou mais de umaproteína de célula hospedeira, um DNA de célula hospedeira, uma proteína decultura celular, e misturas destes.

21. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a uma ou mais impurezas compreendem uma espécieindesejada da proteína tendo uma região Fc.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizadopelo fato de que a espécie indesejada da proteína de ligação Αβ compreendeuma ou mais das cadeias de anticorpos ou fragmentos destas tendo seqüênciade transleitura de íntron, uma ou mais cadeias de anticorpos ou fragmentosdestas tendo uma ligação dissulfeto imprópria, um meio-anticorpo oufragmento deste, um dímero de cadeia leve ou fragmento deste, e um dímerode cadeia pesada ou fragmento deste.

23. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a etapa de recuperar a proteína de ligação Αβ do agente deligação Fc compreende eluir a proteína usando um tampão de eluição tendoum pH em um intervalo de cerca de 2,0 a cerca de 6,5.

24. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o método compreende adicionalmente uma etapa decromatografía selecionada a partir do grupo consistindo de: cromatografia detroca aniônica, cromatografia de troca catiônica, cromatografia de afinidadede metal imobilizado e cromatografia de interação hidrofóbica (HIC).

25. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o método compreende uma etapa adicional de purificaçãoselecionada a partir do grupo consistindo de: cromatografia de hidroxiapatita,diálise, cromatografia de afinidade, precipitação com sulfato de amônio,precipitação com etanol, HPLC de fase reversa (RP-HPLC), ecromatofocagem.

26. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a uma ou mais impurezas compreendem uma ou maisvariantes de transleitura de íntron da proteína e a solução de eluição contendoa proteína tem um nível de variantes de transleitura de íntron que é pelomenos 5 vezes menor do que o nível de variantes de transleitura de íntron nolíquido fonte.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizadopelo fato de que uma solução contendo a proteína recuperada na solução deeluição tem um nível de variantes de transleitura de íntron que é pelo menos-10 vezes menor do que o nível de transleitura de íntron no líquido fonte.

28. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a uma ou mais impurezas compreendem uma ou maisvariantes de transleitura de íntron da proteína e as variantes de transleitura deíntron compreendem menos do que cerca de 1% de uma espécie de ditaproteína na solução de eluição.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizadopelo fato de que as variantes de transleitura de íntron compreendem menos doque cerca de 0,8%, menos do que cerca de 0,5% ou menos do que cerca de-0,2% de uma espécie de dita proteína na solução de eluição.

30. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a uma ou mais impurezas compreendem uma ou maisespécies de baixo peso molecular da proteína e as espécies de baixo pesomolecular compreendem menos do que cerca de 1% de uma espécie de ditaproteína na solução de eluição.

31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizadopelo fato de que as espécies de baixo peso molecular compreendem menos doque cerca de 0,8%, menos do que cerca de 0,5% ou menos do que cerca de-0,2% de uma espécie de dita proteína na solução de eluição.

32. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a uma ou mais impurezas compreendem uma ou maisvariantes ligadas sob dissulfeto da proteína e as variantes ligadas sobdissulfeto compreendem menos do que cerca de 15% de uma espécie de ditaproteína na solução de eluição.

33. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizadopelo fato de que as variantes ligadas sob dissulfeto compreendem menos doque cerca de 10%, menos do que cerca de 5% ou menos do que cerca de 2%de uma espécie de dita proteína na solução de eluição.

34. Proteína de ligação Αβ, caracterizada pelo fato de serpurificada segundo o método como definido na reivindicação 1.

35. Proteína de acordo com a reivindicação 34, caracterizadapelo fato de ser um anticorpo.

36. Proteína de acordo com a reivindicação 35, caracterizadapelo fato de que o anticorpo é o anticorpo 3D6 humanizado.

37. Proteína de acordo com a reivindicação 36, caracterizadapelo fato de que o anticorpo 3D6 humanizado compreende uma cadeia levecompreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 e uma cadeiapesada compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2.

38. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de ainda compreender lavar o agente de ligação Fc ligado à proteínade ligação Αβ com uma solução tampão contendo NaCl em uma concentraçãode pelo menos cerca de 10 mM após a lavagem com o CaC^.

39. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a uma ou mais impurezas compreende um ou mais espécievariante de transleitura de íntron, uma espécie ligada sob dissulfeto, espéciede baixo peso molecular, uma proteína de célula hospedeira, ou um DNA decélula hospedeira, e a uma ou mais impurezas é reduzida a um nível de pelomenos cerca de 2 vezes abaixo daquele presente no líquido fonte.

40. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que o anticorpo anti-Αβ humanizado é o anticorpo 3D6humanizado compreendendo uma cadeia leve compreendendo a seqüência deaminoácidos da SEQ ID NO: 1 e uma cadeia pesada compreendendo aseqüência de aminoácidos da SEQID NO: 2.

41. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizadopelo fato de que o anticorpo é do isotipo IgM, IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4.

42. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizadopelo fato de o anticorpo é do isotipo humano IgGl.