JP4894161B2

JP4894161B2 - 共焦点顕微鏡

Info

Publication number: JP4894161B2
Application number: JP2005137590A
Authority: JP
Inventors: 知子氏家; 友也埜田
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 2005-05-10
Filing date: 2005-05-10
Publication date: 2012-03-14
Anticipated expiration: 2025-05-10
Also published as: US20070014001A1; JP2006317544A; US7369309B2; DE102006019952A1

Description

本発明は、試料の共焦点観察を行う共焦点顕微鏡に関する。

共焦点顕微鏡では、試料の１点に照明光を集光して、その１点から発生した光の強度をセンサで測定し、試料上で測定点を２次元走査しながら同様の動作を繰り返す。このため、試料の高分解能な像強度分布を得ることができ、共焦点観察が可能となる。また、共焦点観察を効率よく行うために、例えばニッポウディスクなどを用いて、多点走査方式とすることが提案されている（例えば特許文献１を参照）。この場合、隣り合う測定点の間隔は、それぞれの測定点から発生した光がセンサ上で混じり合わないように（つまり共焦点効果が保たれるように）、ニッポウディスクのピンホール間隔に応じて設定される。
特開平９−３２５２７９号公報

しかし、上記の多点走査方式では、ニッポウディスクにおけるピンホールの開口率が低く、光源側からの光のうちピンホールを通過したわずかな光のみを照明光として試料側へ導くため、光の利用効率が低かった。
本発明の目的は、光の利用効率を向上させることができる共焦点顕微鏡を提供することにある。

本発明の共焦点顕微鏡は、試料の注目点と該注目点の近傍に位置する１つ以上の非注目点との各々に照明光を集光し、前記注目点と前記非注目点とを同時に照明する照明手段と、前記照明手段によって照明されたときに前記注目点から発生する光と前記非注目点から発生する光のうち、前記注目点と共役な受光部に入射する光を区別せずに受光し、該光の強度に応じた受光信号を出力する受光手段と、前記照明手段を制御して前記非注目点の数を変更し、その変更前後における前記受光手段から出力される前記受光信号を順に取り込む制御手段と、前記制御手段によって取り込まれた複数の前記受光信号を前記注目点から発生する光の強度および前記注目点と前記非注目点との位置関係に応じて重み付けられた各非注目点からの光の強度の和で表した条件式から、前記注目点から発生する光の強度を求め、これに応じた共焦点信号を生成する生成手段とを備えたものである。

さらに、前記生成手段は、前記共焦点信号を生成すると共に、前記条件式から前記非注目点から発生する光の強度を求め、これに応じた非共焦点信号を生成し、かつ、前記共焦点信号と前記非共焦点信号との差分信号を生成することが好ましい。

本発明の共焦点顕微鏡によれば、光の利用効率を向上させることができる。

以下、図面を用いて本発明の実施形態を詳細に説明する。
（第１実施形態）
第１実施形態の共焦点顕微鏡１０は、図１に示す通り、照明系(１１〜１６)と、結像系(１３〜１７)と、光検出器１８と、制御部１９とで構成される。照明系(１１〜１６)は、光源１１と、コンデンサレンズ１２と、ダイクロイックミラー１３と、ミラー素子１４と、レンズ１５,１６とで構成される。結像系(１３〜１７)は、上記のレンズ１５,１６とミラー素子１４とダイクロイックミラー１３と、さらにレンズ１７とで構成される。

ミラー素子１４は、２次元配列された多数の微小ミラー４Ａを有し（図２も参照）、それぞれの傾き角を高速に調整可能である（例えばＤＭＤ；Digital Micromirror Device）。光検出器１８は、例えばＣＣＤなどの撮像素子であり、２次元配列された多数の受光部８Ａを有する（図２）。各々の受光部８Ａは、例えば撮像素子の１つ以上の画素からなる。ミラー素子１４と光検出器１８は互いに共役な面に配置され、かつ、試料面２０とも共役に配置されている。

図２には、ミラー素子１４の各々の微小ミラー４Ａに対応させて光検出器１８の各々の受光部８Ａを示した。さらに、微小ミラー４Ａの２次元配列（受光部８Ａの２次元配列）に対応させて、試料面２０を多数の微小領域２Ａに分割して示した。各々の微小領域２Ａは、各々の微小ミラー４Ａと共役であり、各々の受光部８Ａとも共役である。図２では、微小領域２Ａと微小ミラー４Ａと受光部８Ａの大きさが同じであるように示したが、実際の大きさはレンズ１５〜１７の焦点距離などに起因して必ずしも一致するとは限らない。

光源１１からの光は、コンデンサレンズ１２とダイクロイックミラー１３とを経た後、ミラー素子１４の多数の微小ミラー４Ａを一様に照明する。多数の微小ミラー４Ａのうち一部は照明用の傾き角に設定され（以下「オン状態の微小ミラー４Ａ」）、残りは照明用の傾き角とは異なる非照明用の傾き角に設定されている（以下「オフ状態の微小ミラー４Ａ」）。微小ミラー４Ａのオン/オフの切り替えは、制御部１９からの制御信号に基づいて高速に行われる。

多数の微小ミラー４Ａのうちオン状態の微小ミラー４Ａでは、ダイクロイックミラー１３からの光を反射してレンズ１５の方へ導く。そして、この光はレンズ１５,１６を経た後、照明光として試料面２０に入射する。試料面２０における照明光の入射位置は、多数の微小領域２Ａのうち、ミラー素子１４におけるオン状態の微小ミラー４Ａと共役な微小領域２Ａとなる。微小領域２Ａに入射した照明光は、それぞれ、その中の１点に集光される。なお、オフ状態の微小ミラー４Ａで反射した光は、試料面２０に到達しない。

試料面２０のうち照明光が入射した微小領域２Ａでは、照明光によって蛍光物質が励起され、蛍光物質から蛍光が発生する。この蛍光は、レンズ１６,１５を経た後、ミラー素子１４のオン状態の微小ミラー４Ａに入射し、そこで反射してダイクロイックミラー１３の方へ導かれ、ダイクロイックミラー１３とレンズ１７を介して光検出器１８に入射する。光検出器１８における蛍光の入射位置は、多数の受光部８Ａのうち、ミラー素子１４のオン状態の微小ミラー４Ａと共役な受光部８Ａとなる。

このように、第１実施形態の共焦点顕微鏡１０では、試料面２０の多数の微小領域２Ａのうち、ミラー素子１４のオン状態の微小ミラー４Ａと共役な微小領域２Ａを照明して、その微小領域２Ａから発生した蛍光をオン状態の微小ミラー４Ａで反射して光検出器１８に導き、オン状態の微小ミラー４Ａと共役な受光部８Ａで検出する。このため、微小ミラー４Ａのオン/オフを切り替えることによって、任意の照明パターンによる蛍光を検出することができる。

試料面２０に例えば図３(ａ)の照明パターンを形成した場合、試料面２０では、一定の間隔Ｄ１だけ離れた複数の微小領域２Ａの各々で照明される。図３(ａ)では白抜き領域が照明された微小領域２Ａ、ハッチング領域が照明されなかった微小領域２Ａに対応する。そして、照明された微小領域２Ａ（以下「注目点２Ａ」）からの蛍光は、各々の注目点２Ａに共役な受光部８Ａで検出される。このとき、隣り合う注目点２Ａの間隔Ｄ１を共焦点効果が保たれるように設定し、その注目点２Ａを試料面２０で２次元走査すれば、試料面２０の高分解能な像強度分布を得ることができ、共焦点観察が可能となる。

以下の説明では、共焦点効果が保たれる間隔Ｄ１を、各々の微小領域２Ａどうしの間隔Ｄ２の例えば２倍とする。また、その間隔Ｄ１(＝Ｄ２×２)だけ離れた複数の注目点２Ａの各々と、これに隣接する８個の微小領域２Ａとを総じて、ユニット２１（図３(ｂ)）という。各々のユニット２１は、３×３配列で合計９個の微小領域２Ａを含み、その中心が注目点２Ａとなっている。図３(ｂ)にはユニット２１内の９個の微小領域２Ａに便宜的に番号「１」〜「９」を付与した。

図３(ｂ)の照明パターンのように、ユニット２１内の「５」の注目点２Ａのみが照明された場合、隣り合う注目点２Ａから発生した蛍光は、各々の注目点２Ａに共役な隣り合う受光部８Ａにそれぞれ入射し、互いに混じり合うことはない。このため、一方の受光部８Ａから出力される信号は、一方の注目点２Ａから発生する蛍光の強度に応じた共焦点信号となる。また、他方の受光部８Ａから出力される信号は、他方の注目点２Ａから発生する蛍光の強度に応じた共焦点信号となる。

これに対し、例えば図４(ａ)の照明パターンのように、ユニット２１内の「５」の注目点２Ａだけでなく、その近傍の「１」「９」の微小領域２Ａ（以下「非注目点２Ａ」）も同時に照明された場合には、事情が異なる。ユニット２１内の注目点２Ａと非注目点２Ａとの間隔は共焦点効果が保たれない狭い間隔であり、注目点２Ａに共役な受光部８Ａには、注目点２Ａから発生した蛍光だけでなく、非注目点２Ａから発生した各々の蛍光の一部（漏れ光）も入射する。

そして、注目点２Ａに共役な受光部８Ａでは、注目点２Ａからの蛍光と非注目点２Ａからの漏れ光とを区別せずに受光し、その光の強度に応じた受光信号を出力する。この場合の受光信号は、注目点２Ａからの蛍光の強度に応じた共焦点信号と、非注目点２Ａからの漏れ光の強度に応じた非共焦点信号との和となる。したがって、受光信号そのものを用いても、試料面２０の高分解能な像強度分布を得ることはできない。

しかし、例えば図４(ｂ)の照明パターンを用いて同様の受光信号を取り込み、図４(ａ)の照明パターンを用いて取り込んだ受光信号と組み合わせて所定の信号処理を行うことにより、受光信号から非共焦点信号を減算して、共焦点信号のみを抽出することができる。このため、信号処理で抽出された共焦点信号を用いることにより、試料面２０の高分解能な像強度分布を得ることができる。

また、信号処理の際には、受光信号に含まれる非共焦点信号の大きさを次のように仮定する。つまり、図５の照明パターンのように、ユニット２１内の「５」の注目点２Ａ以外の全ての微小領域２Ａ（「１」〜「４」「６」〜「９」の非注目点２Ａ）が同時に照明された場合を想定し、このとき注目点２Ａに共役な受光部８Ａから出力される受光信号の大きさを“ｂ”とする。この受光信号（大きさｂ）は、ユニット２１内の「１」〜「４」「６」〜「９」の非注目点２Ａからの漏れ光の合計強度に応じた非共焦点信号である。なお、ユニット２１外からの漏れ光が混入することは無いと考えられる。

さらに、説明を簡単にするため、各々の非注目点２Ａから受光信号への寄与は等しいとする。この場合、「１」〜「４」「６」〜「９」の非注目点２Ａの各々に起因する非共焦点信号の大きさは互いに等しく、平均的な“(１/８)ｂ”となる。また、図３(ｂ)の照明パターンのようにユニット２１内の「５」の注目点２Ａのみが照明された場合の受光信号の大きさを“ａ”とする。この受光信号（大きさａ）は、注目点２Ａからの蛍光の強度に応じた共焦点信号に等しい。

ユニット２１内の注目点２Ａに起因する共焦点信号の大きさａと、各々の非注目点２Ａに起因する非共焦点信号の大きさ(１/８)ｂとを用いる場合、図４(ａ)の照明パターンのように「５」の注目点２Ａと「１」「９」の２個の非注目点２Ａとが同時に照明されたときの受光信号の大きさＳ１は、次の式(１)で表すことができる。
Ｓ１＝ａ＋(１/８)ｂ×２ …(１)
次に、図４(ｂ)の照明パターンの場合を説明する。図４(ｂ)の照明パターンでは、ユニット２１内の「５」の注目点２Ａと、その近傍の「２」「４」「６」「８」の４個の非注目点２Ａとを同時に照明している。この場合、注目点２Ａに共役な受光部８Ａから出力される受光信号の大きさＳ２は、次の式(２)で表すことができる。

Ｓ２＝ａ＋(１/８)ｂ×４ …(２)
本実施形態の共焦点顕微鏡１０では、例えば、制御部１９がミラー素子１４を制御して、図４(ａ)の照明パターンを試料面２０に形成したときに、ユニット２１内の「５」の注目点２Ａと共役な受光部８Ａから出力される受光信号（大きさＳ１）を取り込み、その後、非注目点２Ａの数を変更して（２個→４個）、図４(ｂ)の照明パターンを試料面２０に形成したときに、ユニット２１内の「５」の注目点２Ａと共役な受光部８Ａから出力される受光信号（大きさＳ２）を取り込む。

このようにして、ユニット２１内における注目点２Ａ以外への照明状態（非注目点２Ａの数）が異なるときの受光信号（大きさＳ１,Ｓ２）を順に取り込むと、制御部１９では、一方の受光信号（大きさＳ１）と非注目点２Ａの数（２個）との関係を表している上記の式(１)と、他方の受光信号（大きさＳ２）と非注目点２Ａの数（４個）との関係を表している上記の式(２)とを連立させ、注目点２Ａからの蛍光の強度に応じた共焦点信号（大きさａ）を生成する。

図４(ａ),(ｂ)に示す２種類の照明パターンを用いて生成した共焦点信号（大きさａ）は、ユニット２１内の「５」の注目点２Ａに関わる信号であり、図３(ｂ)の照明パターンによる受光信号に相当する。同様に、その他の例えば「９」の微小領域２Ａを注目点２Ａとし、これを中心とするユニット２２を考え、図６(ａ),(ｂ)に示す２種類の照明パターンを用いて「９」の注目点２Ａに関わる共焦点信号（大きさａ）を生成する。

残りの「１」〜「４」「６」〜「８」の微小領域２Ａでも同様に、順に注目点２Ａとして設定し、２種類の照明パターン（非注目点２Ａの数が異なる）を用いて、各々の注目点２Ａに関わる共焦点信号（大きさａ）を生成する。このように注目点２Ａを試料面２０で２次元走査することにより、試料面２０の高分解能な像強度分布を得ることができ、共焦点観察が可能となる。

また、本実施形態の共焦点顕微鏡１０では、試料面２０において共焦点効果が保たれる間隔Ｄ１（＝Ｄ２×２）で配列された複数の注目点２Ａを照明すると共に、各々の注目点２Ａに対して共焦点効果が保たれない狭い間隔で配列された非注目点２Ａをも同時に照明するため、従来のニッポウディスクを用いた共焦点顕微鏡１０と比較して、光源１１からの光の利用効率が向上する。

さらに、本実施形態の共焦点顕微鏡１０では、光源１１からの照明光を試料面２０の方へ導く光路と、試料面２０からの蛍光を光検出器１８の方へ導く光路とにおいて、複数の微小ミラー４Ａを有するミラー素子１４（図２）を兼用するため、装置の簡素化を図ることができる。
なお、ミラー素子１４のオン/オフを切り替えて、注目点２Ａを試料面２０で２次元走査する際の手順としては、次のように簡略化することができる。図６(ａ)に示す試料面２０の「９」の微小領域２Ａを注目点２Ａとして「５」「１」の微小領域２Ａを非注目点２Ａとするユニット２２の照明パターンは、「５」の微小領域２Ａを中心とするユニット２１に置き換えると、図６(ｃ)に示すようになり、図４(ａ)に示すユニット２１の照明パターンと同じであることが分かる。

このため、図４(ａ)に示すユニット２１の照明パターンを試料面２０に形成したときに、ユニット２１内の「５」「９」と共役な各々の受光部８Ａから受光信号（大きさＳ１）を取り込むことにより、図６(ａ)に示すユニット２２の照明パターンの形成を省略することができる。また、図４(ａ)の照明パターンを形成したときに、ユニット２１内の「１」と共役な受光部８Ａからも受光信号（大きさＳ１）を取り込むことが好ましい。

図４(ａ)の照明パターンを形成したときに、ユニット２１内の照明された微小領域２Ａ（「１」「５」「９」）に共役な各々の受光部８Ａから受光信号（大きさＳ１）を取り込み、各々の微小領域２Ａを注目点２Ａとして共焦点信号（大きさａ）を生成する場合に、その受光信号（大きさＳ１）を用いればよい。例えば「１」の微小領域２Ａに共役な受光部８Ａからの受光信号（大きさＳ１）は、「１」を注目点２Ａとして共焦点信号（大きさａ）を生成する場合に用いられる。

同様に、図７(ａ)の照明パターンのように、ユニット２１内の「２」「６」「７」の微小領域２Ａを照明する場合は、これらの微小領域２Ａに共役な各々の受光部８Ａから受光信号（大きさＳ１）を取り込み、「２」「６」「７」を注目点２Ａとして共焦点信号（大きさａ）を生成する場合に、その受光信号（大きさＳ１）を用いればよい。図７(ｂ)の照明パターンの場合は、「３」「４」「８」を注目点２Ａとして共焦点信号（大きさａ）を生成する場合に、その受光信号（大きさＳ１）を用いればよい。

このように、注目点２Ａに対して図中左上と図中右下の２個の微小領域２Ａを非注目点２Ａとする場合には、図４(ａ),図７(ａ),(ｂ)に示す３通りの照明パターンを順に試料面２０に形成するだけで、ユニット２１内の全て（「１」〜「９」）の微小領域２Ａに関わる受光信号（大きさＳ１）を効率よく取り込むことができる。
ただし、図６(ｂ)に示す試料面２０の「９」の微小領域２Ａを注目点２Ａとして「３」「６」「７」「８」の微小領域２Ａを非注目点２Ａとするユニット２２の照明パターンは、「５」の微小領域２Ａを中心とするユニット２１に置き換えると、図６(ｄ)に示すようになり、図４(ｂ)に示すユニット２１の照明パターンとは異なっている。このため、注目点２Ａの上下左右に位置する４個の微小領域２Ａを非注目点２Ａとする場合は、図４(ｂ),図６(ｂ),図８に示す９通りの照明パターンを順に試料面２０に形成することが必要となる。

なお、上記した第１実施形態では、注目点２Ａの近傍に位置する８個の非注目点２Ａの各々から受光信号への寄与（つまり非共焦点信号の大きさ）が等しい場合を例に説明したが、本発明はこれに限定されない。注目点２Ａと非注目点２Ａとの位置関係に応じて重み付けを行い、非共焦点信号の大きさを異ならせる場合にも、本発明を適用できる。
例えば、「５」を注目点２Ａとし、「１」〜「４」「６」〜「９」を非注目点２Ａとする場合、番号「Ｎ」の非注目点２Ａに起因する非共焦点信号の大きさを“Ｋ_N×ｂ”とし、係数Ｋ_Nの総和（＝ΣＫ_N）が“１”になるように設定すればよい。
（第２実施形態）
ここでは、非注目点２Ａの数が同じで配置が異なる複数の照明パターン（図９,図１０）について説明する。

図９に示す４通りの照明パターンは、何れもユニット２１内の「５」の微小領域２Ａを注目点２Ａとし、その近傍の２個の微小領域２Ａを非注目点２Ａとしている。非注目点２Ａの配置は各照明パターンごとに異なるが、これらの４通りの照明パターンを順に試料面２０に形成することで、注目点２Ａの近傍の８個の微小領域２Ａ（「１」〜「４」「６」〜「９」）を順に１回ずつ照明することができる。

この場合、図９の各照明パターンによって「５」の注目点２Ａと共役な受光部８Ａから出力される受光信号（大きさＳ１(1)〜Ｓ１(4)）を順に取り込み、これらの総和Ｓ３を最終的な受光信号として求めると、次の式(３)により表すことができる。
Ｓ３＝Ｓ１(1)＋Ｓ１(2)＋Ｓ１(3)＋Ｓ１(4)
＝ａ×４＋(１/８)ｂ×８＝４ａ＋ｂ …(３)
また、図１０に示す６通りの照明パターンは、何れもユニット２１内の「５」の微小領域２Ａを注目点２Ａとし、その近傍の４個の微小領域２Ａを非注目点２Ａとしている。非注目点２Ａの配置は各照明パターンごとに異なるが、これら６通りの照明パターンを順に試料面２０に形成することで、注目点２Ａの近傍の８個の微小領域２Ａ（「１」〜「４」「６」〜「９」）を順に３回ずつ照明することができる。

この場合、図１０の各照明パターンによって「５」の注目点２Ａと共役な受光部８Ａから出力される受光信号（大きさＳ２(1)〜Ｓ２(6)）を順に取り込み、これらの総和Ｓ４を最終的な受光信号として求めると、次の式(４)により表すことができる。
Ｓ４＝Ｓ２(1)＋Ｓ２(2)＋Ｓ２(3)＋Ｓ２(4)＋Ｓ２(5)＋Ｓ２(6)
＝ａ×６＋(１/８)ｂ×２４＝６ａ＋３ｂ …(４)
第２実施形態では、ユニット２１内における注目点２Ａ以外への照明状態（非注目点２Ａの数）が異なるときの受光信号（大きさＳ３,Ｓ４）を順に求めると、一方の受光信号（大きさＳ３）と非注目点２Ａの数（２個）との関係を表している上記の式(３)と、他方の受光信号（大きさＳ４）と非注目点２Ａの数（４個）との関係を表している上記の式(４)とを連立させ、注目点２Ａからの蛍光の強度に応じた共焦点信号（大きさａ）を生成する。

上記の式(３),(４)から分かるように、非共焦点信号の項は、共に、「５」の注目点２Ａ以外の全ての微小領域２Ａ（図５の「１」〜「４」「６」〜「９」の非注目点２Ａ）からの漏れ光の合計強度に応じた非共焦点信号（大きさｂ）の整数倍となっている。このため、注目点２Ａと非注目点２Ａとの位置関係に応じて受光信号への寄与が相違する場合でも、その相違の影響を受けることなく、注目点２Ａに関わる共焦点信号（大きさａ）を再現性よく生成することができる。

図９,図１０に示す１０種類の照明パターンを用いて生成した共焦点信号（大きさａ）は、ユニット２１内の「５」の注目点２Ａに関わる信号である。残りの「１」〜「４」「６」〜「９」の微小領域２Ａでも同様に、順に注目点２Ａとして設定し、１０種類の照明パターン（非注目点２Ａの数が異なる）を用いて、各々の注目点２Ａに関わる共焦点信号（大きさａ）を生成すればよい。

ただし、この場合にも、図４(ａ),図５(ａ)の照明パターンの比較を例に説明した通り、共有できる照明パターンが存在している。したがって、図９,図１０に示す１０種類の照明パターンの他に、図１１,図１２に示す１３種類の照明パターンを順に形成すれば、全ての必要な照明パターンを網羅したことになる。
ユニット２１内の「１」〜「９」の微小領域２Ａに関わる受光信号（大きさＳ３）は、図９,図１１に示す１２通りの照明パターンを用いて効率よく求めることができる。また、「１」〜「９」の微小領域２Ａに関わる受光信号（大きさＳ４）は、図１０,図１２に示す１１通りの照明パターンを用いて効率よく求めることができる。

このように、第２実施形態では、非注目点２Ａの数が同じで配置が異なる複数の照明パターン（図９,図１０など）を用いて試料面２０で注目点２Ａを２次元走査するため、試料面２０の高分解能な像強度分布を再現性よく得ることができる。
また、第２実施形態でも、試料面２０において共焦点効果が保たれる間隔Ｄ１（＝Ｄ２×２）で配列された複数の注目点２Ａ、および、各々の注目点２Ａに対して共焦点効果が保たれない狭い間隔で配列された非注目点２Ａを同時に照明するため、光源１１からの光の利用効率が向上する。

この場合の光の利用効率Ｅは、全ての照明パターン（２３種類）を順に形成するために掛かる時間も考慮して平均値を求めると、次の式(５)のようになる。
Ｅ＝｛(12/23)・[3/9]＋(1/23)・[4/9]＋(10/23)・[5/9]｝×〔10/23〕
＝0.189 …(５)
括弧[ ]内の数値の分子（3,4,5）は照明された微小領域２Ａの数、括弧( )内の数値の分子（12,1,10）は照明された微小領域２Ａの数ごとの照明パターンの数、括弧〔〕内の数値の分子（10）は共焦点信号を生成するために計算に使用した照明パターンの数を表している。

式(５)に示す光の利用効率と比較するために、従来と同様、共焦点効果が保たれる間隔Ｄ１（＝Ｄ２×２）の複数の注目点２Ａのみを照明した場合（図１３に示す９種類の照明パターンを用いる場合）の利用効率Ｅ’を求めた。その結果は次の式(６)のようになる。
Ｅ’＝｛(9/9)・[1/9]｝×〔1/9〕
＝0.0123 …(６)
上記の数値計算からも分かるように、第２実施形態では、光源１１からの光の利用効率が格段に向上する。その結果、良好な共焦点観察が可能となる。
（第３実施形態）
制御部１９において上記の式(１),(２)の連立（または式(３),(４)の連立）により共焦点信号（大きさａ）を生成する際に、非共焦点信号（大きさｂ）も生成する。非共焦点信号（大きさｂ）は、注目点２Ａ以外の全ての微小領域２Ａ（例えば図５に示す「１」〜「４」「６」〜「９」の８個の非注目点２Ａ）からの漏れ光の合計強度に応じた信号である。

そして、さらに、共焦点信号（大きさａ）と非共焦点信号（大きさｂ）との差分信号（ａ−ｂ）を生成して、試料面２０の像強度分布とする。差分信号（ａ−ｂ）は、試料面２０において共焦点信号（大きさａ）より狭い領域の情報を表すと考えられる。このため、差分信号（ａ−ｂ）に応じた試料面２０の像強度分布は、共焦点信号（大きさａ）に応じた像強度分布と比較して、より分解能が高い。この原理について定性的に説明する。

例えば図１４(ａ)の照明パターンのように「５」の注目点２Ａのみが照明され、注目点２Ａが光軸上に位置するとき（図１４(ｂ),(ｃ)参照）、注目点２Ａと共役な受光部８Ａから出力される受光信号は、共焦点信号（大きさａ）となる。また、試料面２０の内部における照明領域は、図１４(ｂ)のような形になる。
一方、図１４(ｄ)の照明パターンのように「５」の注目点２Ａの近傍に位置する「２」「８」の非注目点２Ａが同時に照明され、注目点２Ａが光軸上に位置するとき（図１４(ｅ),(ｆ)参照）、注目点２Ａと共役な受光部８Ａから出力される受光信号は、非共焦点信号（大きさｂ）となる。また、試料面２０の内部における照明領域は、図１４(ｅ)のような形になる。

そして、共焦点信号（大きさａ）と非共焦点信号（大きさｂ）との差分信号（ａ−ｂ）に含まれる試料面２０の情報は、図１４(ｇ),(ｈ)に示すハッチング部分に相当し、図１４(ｂ),(ｃ)と比較して狭い領域の情報であることが分かる。したがって、上記の差分処理を行うことにより、光軸方向および面内での分解能を向上させることができる。
差分処理の効果を定量的に示すため、差分信号（ａ−ｂ）に応じた像強度分布の光学伝達関数を図１５(ａ)に示す。また、比較のために、共焦点信号（大きさａ）に応じた像強度分布の光学伝達関数を図１５(ｂ)に示す。図１５の横軸は、光軸方向の周波数Ｎｚ[１/μｍ]を表す。縦軸は光学伝達関数（ＯＴＦ）である。

このシミュレーションでは、図１４(ｄ)〜(ｆ)における非共焦点信号を用いて差分処理を行った。波長は０.５５μｍとし、開口数は０.７５とし、倍率は４０倍とした。微小領域２Ａの大きさは、ユニット２１外からの漏れ光をほぼ無視できるように、２５μｍとした。図１５(ａ),(ｂ)の比較から分かるように、周波数Ｎｚが０.０から０.８までの範囲において、差分処理を行った場合の光学伝達関数（ａ）の方が大きな値を示し、差分処理を行わない場合（ｂ）と比較して良好な光学特性を示している。
（変形例）
なお、上記した実施形態では、２個の非注目点２Ａを含む照明パターンと、４個の非注目点２Ａを含む照明パターンとを用いる例を説明したが、本発明はこれに限定されない。非注目点２Ａの数を１つ以上とし、非注目点２Ａの数が異なる２種類以上の照明パターンを用いる場合に、本発明を適用できる。また、非注目点２Ａの数が異なる複数の照明パターンのうち１つにおいて、非注目点２Ａへの照明を遮断してもよい。さらに、非注目点２Ａの数が異なる３種類以上の照明パターンを用いる場合には、最小自乗法で連立方程式を解くことが好ましい。この場合、データ量が多いため、精度が向上する。

また、上記した実施形態では、各々のユニット２１が３×３配列で合計９個の微小領域２Ａを含む例で説明したが、本発明はこれに限定されない。ユニット２１と微小領域２Ａの大きさは、受光信号に影響する照明領域の大きさから適切に決定することが好ましい。ユニット２１の配列は偶数×偶数でも構わないが、奇数×奇数（例えば５×５）の方が非注目点２Ａからの漏れ光の影響を等方的に考慮できるため好ましい。

さらに、上記した実施形態では、反射型の空間光変調素子（例えばミラー素子１４）を照明光路と受光光路とで兼用する例を説明したが、本発明はこれに限定されない。光透過性の試料面２０の共焦点観察を行う場合には、照明光路と受光光路との各々に同様の空間光変調素子を配置して同期制御すればよい。また、反射型の空間光変調素子の代わりに、透過型の空間光変調素子（例えば２次元配列された多数の液晶セルを有する透過光学素子など）を用いてもよい。

共焦点顕微鏡１０の全体構成を示す図である。微小ミラー４Ａと受光部８Ａと微小領域２Ａとの対応関係を説明する模式図である。注目点２Ａのみを照明する場合の照明パターンを説明する図である。注目点２Ａと２個の非注目点２Ａとを同時に照明する場合の照明パターン(ａ)、注目点２Ａと４個の非注目点２Ａとを同時に照明する場合の照明パターン(ｂ)を説明する図である。８個の非注目点２Ａを照明する場合の照明パターンを説明する図である。注目点２Ａの２次元走査を説明する図である。注目点２Ａと２個の非注目点２Ａとを同時に照明する場合の他の照明パターンを説明する図である。注目点２Ａと４個の非注目点２Ａとを同時に照明する場合の他の照明パターンを説明する図である。第２実施形態で使用する非注目点２Ａの数（２個）が同じで配置が異なる複数の照明パターンを説明する図である。第２実施形態で使用する非注目点２Ａの数（４個）が同じで配置が異なる複数の照明パターンを説明する図である。注目点２Ａと２個の非注目点２Ａとを同時に照明する場合の他の照明パターンを説明する図である。注目点２Ａと４個の非注目点２Ａとを同時に照明する場合の他の照明パターンを説明する図である。比較例の照明パターンを説明する図である。第３実施形態の差分処理を説明する図である。差分処理の効果を説明する図である。

符号の説明

１０共焦点顕微鏡
１１光源
１２コンデンサレンズ
１３ダイクロイックミラー
１４ミラー素子
４Ａ微小ミラー
１５，１６，１７レンズ
１８光検出器
８Ａ受光部
１９制御部
２０試料面
２Ａ微小領域（注目点，非注目点）

Claims

試料の注目点と該注目点の近傍に位置する１つ以上の非注目点との各々に照明光を集光し、前記注目点と前記非注目点とを同時に照明する照明手段と、
前記照明手段によって照明されたときに前記注目点から発生する光と前記非注目点から発生する光のうち、前記注目点と共役な受光部に入射する光を区別せずに受光し、該光の強度に応じた受光信号を出力する受光手段と、
前記照明手段を制御して前記非注目点の数を変更し、その変更前後における前記受光手段から出力される前記受光信号を順に取り込む制御手段と、
前記制御手段によって取り込まれた複数の前記受光信号を前記注目点から発生する光の強度および前記注目点と前記非注目点との位置関係に応じて重み付けられた各非注目点からの光の強度の和で表した条件式から、前記注目点から発生する光の強度を求め、これに応じた共焦点信号を生成する生成手段とを備えた
ことを特徴とする共焦点顕微鏡。
請求項１に記載の共焦点顕微鏡において、
前記生成手段は、前記共焦点信号を生成すると共に、前記条件式から前記非注目点から発生する光の強度を求め、これに応じた非共焦点信号を生成し、かつ、前記共焦点信号と前記非共焦点信号との差分信号を生成する
ことを特徴とする共焦点顕微鏡。