JP2009282112A - 共焦点顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】試料の観察の応用範囲を維持してコンパクト化およびコストダウンを図る。
【解決手段】共焦点顕微鏡１は、光源１１と、拡散板１２と、コリメータレンズ１３と、偏光板１４と、偏光ビームスプリッタ１５と、結像レンズ１６と、λ／４波長板１７と、対物レンズ１８と、光空間変調器２０と、ＣＣＤカメラ２９とを備える。光空間変調器２０は、ＬＣＯＳからなり、複数の画素を配置した鏡面状のシリコンチップと表面のガラス層との間に液晶を挟み込んで構成され、シリコンチップの裏側に各画素を駆動させるための駆動回路が埋め込まれた構造からなる。光空間変調器２０により、オン制御中の画素からの光だけが伝達されて試料１９の測定面に空間光パターンを投影することができ、この測定面からの反射光を直接ＣＣＤカメラ２９で撮像することができる。
【選択図】図１

Description

本発明は、共焦点顕微鏡に関し、特に構成を簡略化して高速サンプリングすることができる共焦点顕微鏡に関する。

従来より、共焦点顕微鏡は、試料上の収束光点をスキャンして、試料からの蛍光や反射光などの戻り光を結像させて画像を得ることによって試料を観察するために用いられている。この共焦点顕微鏡は、例えば生物関連やバイオテクノロジー関連などの技術分野においては生きた細胞の形態観察や生理反応観察などに用いられ、例えば半導体関連などの技術分野においては集積回路の表面観察などに用いられている。また、共焦点顕微鏡は、特にＺ軸上（深さ方向）の分解能が極めて高いため、これら以外の用途でも多用されてきている。

このような共焦点顕微鏡としては、代表的なものとして、例えばニポウディスク方式を採用したもの、ガルバノメータミラーを採用したもの、ＤＭＤ（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｍｉｃｒｏｍｉｒｒｏｒ Ｄｅｖｉｃｅ）方式を採用したものが知られている。ニポウディスク方式は、複数の小孔（ピンホール）の開いたディスクを機械的に回転させて、試料上に生成されるピンホールの像をスキャンするものであり、ガルバノメータミラーを採用した方式は、光源から照射されたレーザ光を点状に絞り、この点の像を扇形に回転振動するミラーで振って、試料上に生成される輝点によりレーザスキャンするものである。また、ＤＭＤ方式は、微小ミラーの傾斜を制御してミラーに反射した光を試料上にスキャンするものである。

そして、これらの複数の方式を採用して、試料の領域を選択的に照明して観察するようにした共焦点顕微鏡も知られている。この共焦点顕微鏡は、例えば光源からの照射光が集光レンズと回転式フィルタを介してＤＭＤに入射し、ＤＭＤでオン制御された微小ミラー領域に照射した光のみが第２のニポウディスクのマイクロレンズに入射する。マイクロレンズを通過した光は第１のニポウディスクのピンホールに結像され、対物レンズによって試料の選択された領域に結像する。この試料の選択された領域から発せられる蛍光などの反射光は入射光路を逆向してダイクロイックミラーによって反射され結像レンズにより２次元光検出器に結像される構成となっている（例えば、特許文献１参照）。

特開２００６−２２０８１８号公報

上記特許文献１記載の共焦点顕微鏡は、光の利用効率を高めつつＤＭＤを用いて試料の領域を選択的に照明して観察することができるので、ケージド試薬の広い応用や複数の微小領域で順次光解除刺激を行って細胞内応答を観察することができる構成とされている。しかしながら、ニポウディスク方式とＤＭＤ方式とを採用するため、装置構成が複雑化するとともにテレセントリック光学系で光学設計を単純化してコンパクトに共焦点顕微鏡を構築することができず、コストダウンを図りにくいという問題がある。

そこで、本発明は、このような問題を解決するものであって、試料の観察の応用範囲を維持してコンパクト化およびコストダウンを図ることができる共焦点顕微鏡を提供することを目的とする。

本発明に係る共焦点顕微鏡は、試料面をレーザ光で走査してその焦点面の光により試料を観察する共焦点顕微鏡であって、前記レーザ光を照射する光源と、前記光源からのレーザ光を複数のビームスポットを構成する画素ごとにそれぞれ偏光方向を回転させて反射可能なＬＣＯＳからなる光空間変調器と、前記光空間変調器により反射され前記試料面に投影された複数のスポット光から前記焦点面の反射光を読み取る撮像素子と、前記光空間変調器および前記撮像素子を制御する制御手段とを備えたことを特徴とする。

上記構成によれば、複数のビームスポットを構成する光空間変調器がＬＣＯＳからなるため、従来のニポウディスクやＤＭＤなどの複雑な装置構成を不要としつつも試料の観察の応用範囲を維持してコンパクト化およびコストダウンを図ることができる。

また、本発明に係る共焦点顕微鏡において、前記光空間変調器により反射され前記試料面に投影された複数のスポット光からの反射光を画素ごとにそれぞれ偏光方向を回転させて反射するＬＣＯＳからなるピンホールアレイをさらに備え、前記制御手段は、前記ピンホールアレイをさらに制御する構成としてもよい。

また、本発明に係る共焦点顕微鏡において、前記制御手段は、前記光空間変調器の前記複数のビームスポットの位置、配列、および数の少なくとも一つを変化させる構成とされていてもよい。

また、本発明に係る共焦点顕微鏡において、前記制御手段は、前記ピンホールアレイの前記複数のピンホールの位置、配列、および数の少なくとも一つを変化させる構成とされていてもよい。

以上のように本発明によれば、試料の観察の応用範囲を維持してコンパクト化およびコストダウンを図ることができる共焦点顕微鏡を提供することができる。

次に、本発明に係る共焦点顕微鏡の実施形態について図面に基づいて説明する。

図１は、本発明の一実施形態に係る共焦点顕微鏡の例を示す構成図である。また、図２および図３は、同共焦点顕微鏡の動作原理を説明するための説明図である。

図１に示すように、共焦点顕微鏡１は、例えば光源１１と、拡散板１２と、コリメータレンズ１３と、偏光板１４と、偏光ビームスプリッタ１５と、結像レンズ１６と、λ／４波長板１７と、対物レンズ１８と、光空間変調器２０と、ＣＣＤカメラ２９とを備えて構成されている。

光源１１は、レーザダイオードなどにより構成され、試料１９に照射される励起光であるレーザ光を出力する。拡散板１２およびコリメータレンズ１３は、光源１１からのレーザ光を平行光にする。偏光板１４は、拡散板１２およびコリメータレンズ１３を通過したレーザ光を一つの方向に振動する直線偏光に変える。

偏光ビームスプリッタ１５は、偏光板１４を通して入射した光をその偏光成分により分離し、光空間変調器２０に対してＰ偏光成分を透過させるとともにＳ偏光成分を反射させる。光空間変調器２０は、例えば反射型液晶素子（Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｒｙｓｔａｌ ｏｎ Ｓｉｌｉｃｏｎ：ＬＣＯＳ）からなり、複数の画素を配置した鏡面状のシリコンチップと表面のガラス層との間に液晶を挟み込んで構成されており、シリコンチップの裏側に各画素を駆動させるための駆動回路が埋め込まれた構造からなる。

この光空間変調器２０は、コンピュータなどの図示しない制御手段に接続されており、オン制御中においては偏光ビームスプリッタ１５により反射されたＳ偏光成分の光の偏光方向を各画素ごとに回転させて反射させることができる機能を備えている。この光空間変調器２０における各偏光の回転角量（位相変調量）は、制御手段によって各画素ごとに個々に制御される。

したがって、光空間変調器２０の表面２０ａにおいては、複数のビームスポット２０ｂを生成することができ、点配列の面方向（水平・垂直方向）走査パターンの複数のスポット光を生成することができる。なお、複数のビームスポット２０ｂの位置、配列、および数のうちの少なくとも一つは、制御手段の制御によって変化させることが可能である。このように、本例の共焦点顕微鏡１では、複数のビームスポット２０ｂをＬＣＯＳからなる光空間変調器２０によって生成することができるので、従来のニポウディスク方式やＤＭＤ方式の共焦点顕微鏡と比べて、ニポウディスクを回転させるための機械的要素やＤＭＤ固有の微小ミラー角度の配置制御的要素に基づく誤差がなく、走査精度を向上させることが可能となる。

この光空間変調器２０によって生成された複数のスポット光を構成する反射光は、偏光ビームスプリッタ１５を透過して結像レンズ１６およびλ／４波長板１７を介して偏光方位が９０度回転され、対物レンズ１８により試料１９の測定面に結像される。

そして、試料１９の測定面からの戻り光は、再び対物レンズ１８、λ／４波長板１７および結像レンズ１６を通って偏光方位が９０度回転された後、偏光ビームスプリッタ１５によってＣＣＤカメラ２９に向けて直接反射され、このＣＣＤカメラ２９の撮像面に結像される。

このような構成の共焦点顕微鏡１によれば、光空間変調器２０によって、オン制御中の画素からの光だけが伝達されて試料１９の測定面に複数のスポット光を投影することができ、この測定面からの反射光を直接ＣＣＤカメラ２９で撮像することができる。また、光空間変調器２０によって、オン制御する画素を変化させて複数のビームスポット２０ｂの位置を変化させることにより、測定面全体のすべての画素にスポット光を投影することができる。このため、従来のニポウディスクやＤＭＤなどの構成部品を不要として共焦点顕微鏡１をコンパクトに構成することができ、コストダウンを図りつつ共焦点画像の取得を可能とすることができる。

すなわち、例えば従来のＤＭＤ方式を採用する共焦点顕微鏡では、ＤＭＤの各マイクロミラーがオンとオフとで例えば±１０°傾くものでは、オフのマイクロミラーにより反射された光は光軸と４０°の角度で反射するため、オフのマイクロミラーから反射する光がオンのマイクロミラーの光に干渉しないようにして、ＣＣＤ素子、ＤＭＤおよび対物レンズの中心を、光軸上に配置してコンパクトに構成することは困難である。また、両側テレセントリック光学系の構成も容易ではない。

これに対し、本例の共焦点顕微鏡１では、オフの画素により反射される光はＳ偏光成分のままであり、再び偏光ビームスプリッタ１５により反射されるためオン制御中の画素の光に干渉しない構造を実現し、テレセントリック光学系の構築が容易で、光学設計を単純化することができる。

また、例えば正方形のＤＭＤにおける画素サイズは一般に１５μｍ程度であるのに対し、ＬＣＯＳからなる光空間変調器２０を採用した本例の共焦点顕微鏡１では、画素サイズをさらに小さくすることが可能となる。このため、共焦点顕微鏡１をニポウディスク方式やＤＭＤ方式の共焦点顕微鏡に比べて非常にコンパクトに構成し、コストダウンを図ることが可能となる。

ここで、共焦点顕微鏡の動作原理は、図２に示すように、光源４１からの光を集光レンズ４２を介して集束し、ピンホール４３およびビームスプリッタ４４を透過させて対物レンズ４５を通して試料４９に照射し、その反射光を対物レンズ４５を通してビームスプリッタ４４により反射し、ピンホール４６を介してＣＣＤカメラ４７に結像させることにより画像を取得するものである。

このような原理で測定する試料４９の表面全体を面方向に走査を行うと、図２（ｂ）および図３（ａ）に示すように、合焦しているときはビームスポット３１ａの形状が小さく、図３（ｂ）に示すようにピンホール後の光強度が高いこととなる。一方、図２（ａ）や図２（ｃ）および図３（ａ）に示すように、合焦していないときはビームスポット３１ｂの形状が大きく、図３（ｂ）に示すようにピンホール後の光強度が低いこととなる。すなわち、合焦していないときの反射光は、ほとんどがピンホールでカットされることになり、合焦位置のみの情報がＣＣＤカメラ４７で得られる。

（光強度と輝度、最大輝度の使い方）
このことを利用して、試料４９と対物レンズ４５との距離を変化させ、一つの焦点面から他方まで走査するＺ軸上の走査を行っている間に試料４９の表面全体を面方向に走査して、各画素ごとに、最大輝度が得られたＺ軸上の位置情報を保存して、各画素の焦点位置を分析することで試料４９の高さ位置を導き出すことが可能となる。現在主流の共焦点顕微鏡では、画像の取得速度を上げるために、単一の点光源ではなく複数の点光源で試料４９の表面全体を走査して、画像を高速、かつ高分解能で取得することができる。

図４は、本例の共焦点顕微鏡１の光空間変調器２０による空間光パターンを説明するための説明図である。光空間変調器２０の複数のビームスポット２０ｂは、例えば点配列の面方向走査パターンの一例として構築されている。図４に示すように、光空間変調器２０の画素を、隣接した光空間変調器２０の画素によるビームスポットが、合焦していないときの大きな形状のビームスポットでもＣＣＤカメラ４７の画素に重なって入射しないようにして、同時に複数の画素をオン制御し、オン制御する画素を順次変化（例えば、図中ａ→ｐのように）させることですべての画素をオンにすることができる（試料４９の表面全体を面方向に走査することができる）。

図４に示した例では、例えば光空間変調器２０において１６回のオン制御を変化させることにより、すべての画素をオンにすることができる。また、この場合には、ＣＣＤカメラ４７による１６枚の画像を取得して、各画像のスポットサイズと輝度から合焦状態を求める処理を行って、試料４９の高さの関係を導き出すことが可能となる。

このように、本実施形態に係る共焦点顕微鏡１によれば、様々な試料を確実かつ正確に観察することができるので、従来のニポウディスク方式やＤＭＤ方式の共焦点顕微鏡と比べて観察の応用範囲を維持し（すなわち、観察に関して高い汎用性を備え）つつ、コンパクトな構成を採用することが可能となる。

図５は、同共焦点顕微鏡の光空間変調器を説明するための説明図である。図５（ａ）に示すように、共焦点顕微鏡１の光空間変調器２０は、表面２０ａから見て複数の画素２１を備えて構成され、各画素２１ごとに入射光の位相を変更することができ、同図（ｂ）に示すように、フレキシブルプリント基板２２およびコネクタ２３などを介して制御手段が搭載された基板などに接続されている。

この光空間変調器２０は、同図（ｃ）に示すように、入射光および反射光の光路に配置された偏光ビームスプリッタ１５などの偏光子とともに用いられ、光源１１からの光を、オン制御中の画素２１ａにおいては偏光ビームスプリッタ１５を透過するように反射し、オフ制御中の画素２１ｂにおいては偏光ビームスプリッタ１５により反射されるように反射することで、任意の空間光パターンを生成することができる。

図６は、本発明の他の実施形態に係る共焦点顕微鏡の例を示す構成図である。なお、以降において、既に説明した部分と重複する箇所については同一の符号を付して説明を省略する。図６に示すように、この共焦点顕微鏡１Ａは、上述した共焦点顕微鏡１とは、ＣＣＤカメラ２９にて合焦していないときの光を排除するためのピンホールアレイ２０Ｂを備え、試料１９の共焦点画像をリアルタイムに取得するために適した構成となっている点が相違している。

ピンホールアレイ２０Ｂは、上述した光空間変調器２０と同様にＬＣＯＳからなり、複数の画素を配置した鏡面状のシリコンチップと表面２０Ｂａのガラス層との間に液晶を挟み込んで構成されており、シリコンチップの裏側に各画素２０Ｂｂを駆動させるための駆動回路が埋め込まれ、図示しない制御手段に接続されていて、光空間変調器２０と同期して、光空間変調器２０のオン制御中の画素に対応した位置の画素がオンするように制御されている。

このピンホールアレイ２０Ｂは、オン制御中においては偏光ビームスプリッタ２７を透過した試料１９からのＰ偏光成分の反射光の偏光方向を回転させてＳ偏光の光にして、偏光ビームスプリッタ２７を反射させ結像レンズ２８を介してＣＣＤカメラ２９に結像させる。オフの画素により反射される光はＰ偏光成分のままであり、再び偏光ビームスプリッタ１５により透過されるためＣＣＤカメラ２９へは入射しない。したがって、ピンホールアレイ２０Ｂの表面においては合焦しているときはビームスポットの形状が小さいため、ピンホールアレイ２０ＢをなすＬＣＯＳの小さい画素サイズであってもビームスポットのすべてをＣＣＤカメラ２９に高い光強度で結像させることができる。一方、合焦していないときは、ビームスポットの形状が大きいためＬＣＯＳのオン制御中の画素、および隣接したオフの画素にも光が当たるが、オン制御中の画素によりビームスポットの中心部分のみがＣＣＤカメラ２９に結像されるため光強度が低いこととなる。すなわち、合焦していないときの反射光は、ほとんどがピンホールアレイ２０Ｂでカットされることになり、合焦位置のみの情報がＣＣＤカメラ２９で得られる。

図７は、上述した図４における点配列の面方向走査パターンにより、平面状の試料を傾斜させて共焦点顕微鏡で測定したときのＣＣＤカメラで撮像した画像を示したもので、図７（ｂ）は図１に示した本発明の一実施形態に係る共焦点顕微鏡１で撮像した画像を表し、図７（ｃ）は図６に示した本発明の他の実施形態に係る共焦点顕微鏡１Ａで撮像した画像を表したものである。図７（ｃ）に表す画像では、隣接した画素へのクロストークが生じないため、図４に示した例では、光空間変調器２０において１６回のオン制御を変化させることにより、すべての画素をオンにすることができ、図２に示したＣＣＤカメラ４７による１６枚の画像を取得して、試料４９の高さの関係を導き出すようにしたが、原理的には、ＣＣＤカメラ４７の１枚の画像取得の時間内に１６回のオン制御を変化させて、全画素をオン制御し１枚の画像として取得することも可能であり、この場合は第１回目の制御を行ったところを表している。また、例えば、光空間変調器２０において４回のオン制御を変化させることにより、すべての画素をオンにするようにして、ＣＣＤカメラ４７による４枚の画像取得により試料４９の高さの関係を導き出すことができる。あるいは、図１に示した本発明の一実施形態の場合の画素を例に表した場合、ＣＣＤカメラ２９の１枚の画像取得の時間内に、光空間変調器２０において４回のオン制御を変化させて、すべての画素をオンにするようにすることで試料１９の表面全体を走査して試料１９の高さの関係を導き出すために１枚の画像取得で済ませられる。これにより、試料１９の画像を正確にリアルタイムでＣＣＤカメラ２９に結像することができるようになる。

以上述べたように、本発明の実施形態に係る共焦点顕微鏡１，１Ａでは、ニポウディスクやＤＭＤの代わりに、既存の半導体製造インフラを利用して生産可能なＬＣＯＳからなる光空間変調器２０やピンホールアレイ２０Ｂを用いることができるので、共焦点顕微鏡をコンパクトに構成してコストダウンを図ることができる。

本発明の一実施形態に係る共焦点顕微鏡の例を示す構成図である。 同共焦点顕微鏡の動作原理を説明するための説明図である。 同共焦点顕微鏡の動作原理を説明するための説明図である。 光空間変調器による空間光パターンを説明するための説明図である。 同共焦点顕微鏡の光空間変調器を説明するための説明図である。 本発明の他の実施形態に係る共焦点顕微鏡の例を示す構成図である。 本発明の一実施形態および他の実施形態に係る共焦点顕微鏡のＣＣＤカメラで撮像した画像を説明するための説明図である。

符号の説明

１，１Ａ…共焦点顕微鏡、１１…光源、１２…拡散板、１３…コリメータレンズ、１４…偏光板、１５，２７…偏光ビームスプリッタ、１６，２８…結像レンズ、１７…λ／４波長板、１８…対物レンズ、１９…試料、２０…光空間変調器、２０Ｂ…ピンホールアレイ。

Claims (4)

1. 試料面をレーザ光で走査してその焦点面の光により試料を観察する共焦点顕微鏡であって、
   前記レーザ光を照射する光源と、
   前記光源からのレーザ光を複数のビームスポットを構成する画素ごとにそれぞれ偏光方向を回転させて反射可能なＬＣＯＳからなる光空間変調器と、
   前記光空間変調器により反射され前記試料面に投影された複数のスポット光から前記焦点面の反射光を読み取る撮像素子と、
   前記光空間変調器および前記撮像素子を制御する制御手段とを備えた
   ことを特徴とする共焦点顕微鏡。
2. 前記光空間変調器により反射され前記試料面に投影された複数のスポット光からの反射光を画素ごとにそれぞれ偏光方向を回転させて反射するＬＣＯＳからなるピンホールアレイをさらに備え、
   前記制御手段は、前記ピンホールアレイをさらに制御することを特徴とする請求項１記載の共焦点顕微鏡。
3. 前記制御手段は、前記光空間変調器の前記複数のビームスポットの位置、配列、および数の少なくとも一つを変化させることを特徴とする請求項１または２記載の共焦点顕微鏡。
4. 前記制御手段は、前記ピンホールアレイの前記複数のピンホールの位置、配列、および数の少なくとも一つを変化させることを特徴とする請求項２または３記載の共焦点顕微鏡。

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