DE102005046753A1

DE102005046753A1 - Mikroskopierverfahren und Mikroskop

Info

Publication number: DE102005046753A1
Application number: DE102005046753A
Authority: DE
Inventors: Ralf Dipl.-Phys. Wolleschensky; Michael Dr. Kempe
Original assignee: Carl Zeiss Jena GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2005-09-29
Filing date: 2005-09-29
Publication date: 2007-04-12
Also published as: US20090128898A1; WO2007036303A1; JP2009510498A; EP1929351A1; JP5214448B2; US7728270B2

Abstract

Es wird bereitgestellt ein Mikroskopierverfahren zum Erzeugen eines Bildes eines in einer vorbestimmten Tiefe einer zu untersuchenden Probe liegenden Bildfeldes, mit mehreren Beleuchtungsschriften, in den jeweils ein Teil des Bildfeldes mit einem fokussierten Beleuchtungsstrahlenbündel beleuchtet wird, das aufgrund einer Wechselwirkung mit der Probe die Erzeugung von Probenstrahlung bewirkt, Detektionsschritten, in denen die erzeugte Probenstrahlung detektiert wird, und einem Auswerteschritt, in dem auf Basis der detektierten Probenstrahlung das Bild erzeugt wird, wobei während jeden Beleuchtungsschritts ein erster und ein zweiter Detektionsschritt durchgeführt werden, wobei im ersten Detektionsschritt im Fokus sowie außerhalb des Fokus erzeugte Probenstrahlung und im zweiten Detektionsschritt ein geringerer Anteil der im Fokus erzeugten Probenstrahlung als im ersten Detektionsschritt sowie außerhalb des Fokus erzeugte Probenstrahlung detektiert wird und wobei im Auswerteschritt die im zweiten Detektionsschritt detektierte Probenstrahlung genutzt wird, um bei der im ersten Detektionsschritt detektierten Probenstrahlung den außerfokalen Anteil zu verringern.

Description

Die Erfindung betrifft ein Mikroskopierverfahren zum Erzeugen eines Bildes eines in einer vorbestimmten Tiefe einer zu untersuchenden Probe liegenden Bildfeldes, mit mehreren Beleuchtungsschritten, in denen jeweils ein Teil des Bildfeldes mit einem fokussierten Beleuchtungsstrahlenbündel beleuchtet wird, das aufgrund einer Wechselwirkung mit der Probe die Erzeugung von Probenstrahlung bewirkt, Detektionsschritten, in denen die erzeugte Probenstrahlung detektiert wird, und einem Auswerteschritt, in dem auf Basis der detektierten Probenstrahlung das Bild erzeugt wird. Ferner betrifft die Erfindung ein Mikroskop zum Erzeugen eines Bildes eines in einer vorbestimmten Tiefe einer zu untersuchenden Probe liegenden Bildfeldes, mit einem Beleuchtungsmodul, das in mehreren Beleuchtungsschritten das Bildfeld beleuchtet, wobei in jedem Beleuchtungsschritt jeweils ein Teil des Bildfeldes mit einem fokussierten Beleuchtungsstrahlenbündel beleuchtet wird, das aufgrund einer Wechselwirkung mit der Probe die Erzeugung von Probenstrahlung bewirkt, einem Detektionsmodul, das erzeugte Probenstrahlung detektiert, und einem Auswertemodul, das auf der Basis der detektierten Probenstrahlung das Bild erzeugt.
Um die gewünschte konfokale Tiefendiskriminierung zu erreichen, damit das Bild des in einer vorbestimmten Tiefe der zu untersuchenden Probe liegenden Bildfeldes erzeugt werden kann, wird bei der Laser-Scanning-Mikroskopie eine Blende eingesetzt, die unerwünschtes Probenlicht abschattet.

Es ist ferner bekannt, daß zur Erzielung von konfokaler Tiefendiskriminierung im Weitfeld bzw. bei partieller Beleuchtung des Bildfeldes (z. B. einer Linienbeleuchtung) eine Strukturierung bzw. Intensitätsmodulation) der Beleuchtung eingesetzt werden kann. Durch eine Phasenverschiebung der strukturierten Beleuchtung kann dann ein tiefendiskriminierter optischer Schnitt berechnet und so das gewünschte Bild des Objekts erzeugt werden. Wie beispielsweise in M.A.A. Neil et al. „Method of obtaining optical sectioning by using structured light in a conventional microscope" Optics Letters 22(24) 1997, 1905–1907 beschrieben ist, kann dies mit drei Phasenbildern bei 0°, 120° und 240° erreicht werden.

Zur Strukturierung der Beleuchtung werden entweder Gitter im Beleuchtungsstrahlengang, die Interferenz von kohärenten Teilstrahlen oder der Einsatz von diffraktiven optischen Elementen vorgeschlagen. Nachteilig ist die dadurch bedingte Inflexibilität und der erhöhte Aufwand, da bei einem Wechsel des Objektivs des Lasermikroskops im allgemeinen auch ein Wechsel der Strukturierung erforderlich ist. Dazu muß dann in der Regel ein anderes Gitter vorgesehen werden, die Interferenz der kohärenten Teilstrahlen geändert werden oder ein anderes diffraktives optisches Element eingesetzt werden.

Ausgehend hiervon ist es Aufgabe der Erfindung, ein Mikroskopierverfahren und ein Mikroskop der eingangs genannten Art derart weiterzubilden, daß die Erzeugung tiefendiskriminierter optischer Schnitte einfach möglich ist, ohne physikalische Blenden zum Abschatten außerfokaler Probenstrahlung vorsehen zu müssen.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe bei einem Mikroskopierverfahren der eingangs genannten Art dadurch gelöst, daß während jedem Beleuchtungsschritt ein erster und ein zweiter Detektionsschritt durchgeführt werden, wobei im ersten Detektionsschritt im Fokus sowie außerhalb des Fokus erzeugte Probenstrahlung und im zweiten Detektionsschritt ein geringerer Anteil der im Fokus erzeugten Probenstrahlung als im ersten Detektionsschritt sowie außerhalb des Fokus erzeugte Probenstrahlung detektiert wird, und daß im Auswerteschritt die im zweiten Detektionsschritt detektierte Probenstrahlung genutzt wird, um bei der im ersten Detektionsschritt detektierten Probenstrahlung den außerfokalen Anteil zu verringern.

Es wird somit die aufgrund der Fokussierung vorliegende räumliche Begrenztheit der Beleuchtung innerhalb des Bildfeldes dazu genutzt, im ersten und zweiten Detektionsschritt bei im wesentlichen gleicher Probenstrahlung, die außerhalb des Fokus erzeugt wird, unterschiedliche Anteile der im Fokus erzeugten Probenstrahlung zu detektieren. Dies wird dann im Auswerteschritt vorteilhaft dazu genutzt, den außerfokalen Anteil der im ersten Detektionsschritt detektierten Probenstrahlung zu reduzieren.

Somit kann mit geringem Aufwand ein tiefendiskriminierter Schnitt erzeugt werden, ohne eine physikalische Blende zum Abschatten der außerfokalen Probenstrahlung vorsehen zu müssen.

Da ein Vorsehen einer physikalischen Blende nicht notwendig ist und da aufgrund der Fokussierung eine räumliche Begrenztheit der Beleuchtung gegeben ist, gewinnt man detektionsseitig einen räumlichen Freiheitsgrad. Wenn das Beleuchtungsstrahlenbündel z. B. punktförmig fokussiert wird, kann man die detektierte Probenstrahlung spektral aufspalten und mittels z. B. einem Liniendetektor spektral aufgelöst detektieren. Der zusätzliche Freiheitsgrad (bzw. die zusätzliche räumliche Koordinate) kann somit dazu genutzt werden, in den Detektionsschritten spektral zu detektieren und gleichzeitig die gewünschte tiefendiskriminierte Erzeugung des Bildes des Bildfeldes zu realisieren.

Da keine die außerfokale Probenstrahlung abschattende Blende notwendig ist, kann eine größere Detektionseffizienz erreicht werden, da sehr viel mehr Probenlicht (im Vergleich zu einem Verfahren mit Pinhole-Blende) detektiert und für die Auswertung genutzt werden kann.

Insbesondere kann im zweiten Detektionsschritt keinerlei der im Fokus erzeugten Probenstrahlung und somit nur außerhalb des Fokus erzeugte Probenstrahlung detektiert werden. Der Anteil der im Fokus erzeugten Probenstrahlung, der im zweiten Detektionsschritt detektiert wird, beträgt somit null.

Die beiden Detektionsschritte können während zumindest einem Beleuchtungsschritt gleichzeitig durchgeführt werden. Damit läßt sich die Meßzeit möglichst gering halten.

Alternativ ist es auch möglich, daß beide Detektionsschritte während zumindest einem Beleuchtungsschritt zeitlich nacheinander durchgeführt werden. In diesem Fall kann man für beide Beleuchtungsschritte einen einzeigen Detektor einsetzten.

Insbesondere wird im ersten Detektionsschritt die aus einem ersten Abschnitt der Probenoberfläche und im zweiten Detektionsschritt die aus einem zweiten Abschnitt der Probenfläche austretende Probenstrahlung detektiert, wobei beide Abschnitte aneinander grenzen oder der zweite Abschnitt den ersten Abschnitt nur teilweise überdeckt. Die beiden Abschnitte können unmittelbar aneinandergrenzen (sich berühren) oder aber auch voneinander beabstandet sein. Ferner kann man im ersten Detektionsschritt der Fokusbereich im Bildfeld auf einen Detektor abbilden, während im zweiten Detektionsschritt eine benachbarte Fläche im Bildfeld detektiert wird.

Im Auswerteschritt kann das im zweiten Detektionsschritt detektierte Signal vom im ersten Detektionsschritt detektierten Signal subtrahiert werden. Natürlich kann dabei eine relative Gewichtung der beiden Signale zueinander berücksichtigt werden.

Insbesondere können die Beleuchtungsschritte, die Detektionsschritte und der Auswerteschritt für mehrere Bildfelder in unterschiedlichen vorbestimmten Tiefen der Probe durchgeführt werden, um somit mehrere tiefendiskriminierte Schnittbilder der Probe erzeugen zu können.

Daraus können dann mit bekannten Verfahren auch dreidimensionale Probenbilder erzeugt werden.

Bei dem Verfahren kann das Beleuchtungsstrahlenbündel (bevorzugt beugungsbegrenzt) punkt- oder linienförmig fokussiert werden.

Die Aufgabe wird ferner bei einem Mikroskop der eingangs genannten Art dadurch gelöst, daß während jedem Beleuchtungsschritt das Detektionsmodul einen ersten und einen zweiten Detektionsschritt durchführt, wobei im ersten Detektionsschritt im Fokus sowie außerhalb des Fokus erzeugte Probenstrahlung und im zweiten Detektionsschritt ein geringerer Anteil der im Fokus erzeugten Probenstrahlung als im ersten Detektionsschritt sowie außerhalb des Fokus erzeugte Probenstrahlung detektiert wird, und daß das Auswertemodul die im zweiten Detektionsschritt detektierte Probenstrahlung nutzt, um bei der im ersten Detektionschritt detektierten Probenstrahlung den außerfokalen Anteil zu verringern.

Durch diese Art der Detektion kann auf eine physikalische Blende zum Abschatten der außerfokalen Probenstrahlung verzichtet werden, da die durch die räumliche Begrenztheit des im Bildfeld fokussierten Beleuchtungsstrahlenbündels vorliegende örtliche Modulation der Beleuchtung mittels den beiden Detektionsschritten ausgenutzt wird, um unterschiedliche Anteile der im Fokus erzeugten Probenstrahlung zu detektieren. Insbesondere kann im zweiten Detektionsschritt nur außerhalb des Fokus erzeugte Probenstrahlung detektiert werden. Der Anteil der im Fokus erzeugten Probenstrahlung, der im zweiten Detektionsschritt detektiert wird, beträgt dann null.

Ferner kann man in den beiden Detektionsschritten die Probenstrahlung spektral aufgelöst detektieren. Dabei wird ausgenutzt, daß keine physikalische Blende zur Abschattung des außerfokalen Anteils der Probenstrahlung notwendig ist und daß durch die räumliche Begrenztheit des fokussierten Beleuchtungsstrahlenbündels detektionsseitig ein weiterer Freiheitsgrad vorliegt. So kann bei einem punktförmig fokussierten Beleuchtungsstrahlenbündel die Probenstrahlung spektral aufgespalten und mittels einem Liniendetektor spektral detektiert werden. Die spektrale Aufspaltung erfolgt in Richtung der Erstreckungsrichtung des Liniendetektors. Natürlich kann als Liniendetektor z. B. auch nur eine Zeile oder eine Spalte eines ortsauflösenden Flächendetektors eingesetzt werden. Wenn das Beleuchtungsstrahlenbündel linienförmig fokussiert wird, wird ein Flächendetektor eingesetzt, wobei hier die spektrale Aufspaltung bevorzugt quer zur Erstreckungsrichtung des linienförmigen Fokus erfolgt. Die spektrale Aufspaltung kann mit jedem geeigneten Optikelement (mit geeigneter Dispersion) durchgeführt werden, z. B. mittels einem Prisma oder einem Beugungsgitter. Das Detektionsmodul kann somit eine Optik zur spektralen Aufspaltung der Probenstrahlung sowie zumindest einen die spektral aufgespaltene Probenstrahlung spektral aufgelöst detektierenden Detektor aufweisen.

Das Detektionsmodul kann zwei Detektoren umfassen, wodurch eine gleichzeitige Durchführung der beiden Detektionsschritte über beide Detektoren möglich ist. Alternativ kann das Detektionsmodul auch einen einzigen Detektor aufweisen, so daß beide Dektionsschritte zeitlich nacheinander durchgeführt werden.

Im ersten Detektionsschritt kann die aus einem ersten Abschnitt der Probenoberfläche und im zweiten Detektionsschritt die aus einem zweiten Abschnitt der Probenoberfläche austretende Probenstrahlung detektiert werden, wobei die beiden Abschnitte der Probenoberfläche aneinandergrenzen (direkt oder voneinander beabstandet sein) oder der zweite Abschnitt den ersten Abschnitt nur teilweise überdeckt.

Ferner kann das Detektionsmodul derart ausgebildet sein, daß der Fokusbereich im Bildfeld im ersten Detektionsschritt auf einen Detektor abgebildet wird und im zweiten Detektionsschritt eine zum Fokusbereich benachbarte Fläche des Bildfeldes auf einen Detektor des Detektionsmoduls abgebildet wird.

Das Auswertemodul kann das im zweiten Detektionsschritt detektierte Signal vom im ersten Detektionsschritt detektieren Signal subtrahieren, wobei eine Gewichtung der beiden Signale zueinander möglich ist. Damit wird in einfacher Art und Weise der außerfokale Anteil im detektierten Signal des ersten Detektionsschrittes reduziert.

Das Beleuchtungsmodul kann ein Scannermodul aufweisen, das das Beleuchtungsstrahlenbündel so ablenkt, daß das gesamte Bildfeld beleuchtet wird.

Ferner kann das Beleuchtungsmodul das Beleuchtungsstrahlenbündel als punkt- oder linienförmig fokussiertes Beleuchtungsstrahlenbündel auf das Bildfeld richten.

Die Erfindung wird nachfolgend beispielshalber anhand der beigefügten Zeichnungen noch näher erläutert. Es zeigen:
1 eine schematische Ansicht des erfindungsgemäßen Mikroskops;
2 eine vergrößerte Darstellung des Detektionsmoduls von 1;
3 eine Querschnittsansicht der zu untersuchenden Probe;
4 eine Draufsicht auf die Detektoren von 2;
5 eine Abwandlung der Detektoren von 4;
6 eine alternative Ausführungsform des Dektionsmoduls von 1, und
7 und 8 eine weitere alternative Ausführungsform des Detektionsmoduls von 1.
Bei der in 1 gezeigten Ausführungsform ist das Mikroskop als Laser-Scanning-Mikroskop ausgebildet, das ein Lichtquellenmodul 1, ein Scanmodul 2, ein Objektiv 3, ein Aufnahmemodul 4 sowie ein Auswertemodul 5 umfaßt.
Das Lichtquellemodul 1, das einen Laser 8 und eine Strahlformoptik 9 aufweist, erzeugt einen Laserstrahl LS1, der über einen zwischen dem Lichtquellemodul 1 und dem Scanmodul 2 geschalteten Strahlteiler 6 zum Scanmodul 2 gelenkt wird, das den Strahl LS1 so über die Probe 7 ablenkt, das ein Bildfeld innerhalb der Probe vollständig beleuchtet wird. Der Laserstrahl LS1 wird dabei mittels des Objektivs 3 in die Probe 7 fokussiert, und zwar in die Tiefe des Bildfeldes, von dem ein Bild erzeugt werden soll (optischer Schnitt).
Bei der hier beschriebenen Ausführungsbeispiel wird der Laserstrahl LS1 punkförmig (bevorzugt beugungsbegrenzt) fokussiert, so daß das Scanmodul 2 den Laserstrahl LS1 in zwei unabhängige Richtungen voneinander ablenkt, um somit das gesamte Bildfeld innerhalb der Probe 7 mit dem fokussierten Laserstrahl LS1 überstreichen zu können.
Aufgrund der Wechselwirkung des Laserstrahls LS1 mit der Probe wird Probenstrahlung LS2 erzeugt, die über das Objektiv 3 auf das Scanmodul 2 trifft, das die von der Probe 7 kommende Probenstrahlung LS2 descannt, so daß die Probenstrahlung LS2 hinter dem Scanmodul 2 als ruhendes Strahlenbündel LS2 vorliegt. Der Strahlteiler 6 ist so ausgebildet, daß er die Probenstrahlung LS2 transmittiert, so daß diese auf das Detektionsmodul 4 trifft.
Die erzeugte Probenstrahlung kann z. B. Fluoreszenzlicht, Lumineszenzlicht, reflektiertes, transmittiertes und/oder gestreutes Licht sein.
Wie in 2 schematisch dargestellt ist, umfaßt das Detektionsmodul 4 eine Detektionsoptik 11 sowie einen ersten und zweiten Detektor D1, D2, deren Signale dem Auswertemodul 5 zugeführt werden. Auf den Detektor D1 wird der Fokusbereich des Bildfeldes (also der Bereich, in dem der Laserstrahl LS1 fokussiert) abgebildet, während auf den Detektor D2 ein dazu benachbarter Bereich abgebildet wird.
Dies wird in Verbindung mit 3 noch näher erläutert. 3 zeigt einen Querschnitt durch die zu untersuchende Probe 7, wobei die Strahltaille 12 des Beleuchtungsstrahlenbündels LS1 dargestellt ist. Zwischen den gestrichelt eingezeichneten waagrechten Linien L1 und L2 liegt der darzustellende Tiefenbereich (Bildfeld) der Probe 7. In diesem Bereich ist der Laserstrahl LS1 fokussiert. Dies erkennt man daran, daß die Strahltaille 12 in diesem Bereich den geringsten Durchmesser aufweist.
Durch die Abbildung des Fokusbereiches auf den Detektor D1 gelangt auf den Detektor die im schräg schraffierten Bereich B1 erzeugte Probenstrahlung. Man erkennt, daß neben der gewünschten konfokalen Probenstrahlung aus dem Abschnitt des Bereichs B1 zwischen den gestrichelten Linien L1 und L2 noch die außerfokale Probenstrahlung gelangt, die oberhalb und unterhalb der Linie L1 und L2 im Bereich B1 erzeugt wird.
Auf den Detektor D2 gelangt die in dem waagrecht schraffierten Bereich B2 erzeugte Probenstrahlung. Da mit dem Detektor D2 nur ein Bereich neben dem Fokusbereich detektiert wird, trifft auf den Detektor D2 nur die Probenstrahlung, die außerhalb des fokalen Bereiches (zwischen L1 und L2) vom Strahl LS1 innerhalb des Bereiches B2 erzeugt wird. Bei dem hier beschriebenen Beispiel sieht der Detektor D2 somit nur außerhalb des Fokus erzeugte Probenstrahlung LS2.
In 4 ist zur Verdeutlichung die detektorseitige Beleuchtungsverteilung im Fokus dargestellt. Der fokussierte Laserstrahl LS1 wird nur auf den Detektor D1 abgebildet (Kreis F1), so daß der Detektor D2 keine konfokalen Signale aufnimmt.
Wenn man annimmt, daß die beiden Detektoren D1 und D2 ungefähr die gleiche Fläche und Empfindlichkeit haben, kann man für das konfokale Signal Sc und das nicht konfokale Signal Snc folgendes angeben: Sc = S1 – n·S2 und Snc = S1 + n·S2 – Sc = 2·n·S2wobei S1 und S2 die Signale der Detektoren D1 und D2 sind. Die Konstante n kann man empirisch z. B. aus der Minimierung des Untergrundsignals während der Messung bestimmen. Typische Werte für n betragen 1 bis 1, 3.
Es hat sich gezeigt, daß insbesondere bei dicken Proben die genaue Lage und die Schärfe der Trennlinie zwischen beiden Detektoren mit Bezug zum beugungsbegrenzten Fokusspot aus dem Fokalbereich nicht wesentlich ist.
Es ist im allgemeinen zweckmäßig, die Detektoren so anzuordnen, daß die Grenze zwischen beiden Detektoren D1 und D2 ca. 1 bis 2 Airy-Unit-Radien vom Zentrum der Spotverteilung aus dem Fokus auf dem Detektor D1 entfernt liegt. Die Airy-Unit wird objektseitig als 1 AU = 1,22 λ/NA definiert, wobei λ die Vakuumwellenlänge des Beleuchtungsstrahlenbündels LS1 und NA die numerische Apertur des Objektivs 3 ist. Auch eine Beabstandung der beiden Bereiche B1 und B2, wie dies in 3 zur vereinfachten graphischen Darstellung dargestellt ist, von beispielsweise kleiner 1AU zwischen beiden Detektoren D1 und D2 (beispielsweise durch einen Steg) stellt kein Problem dar.
In 5 sind die Detektoren D1 und D2 für den Fall dargestellt, daß nicht eine punktförmige Fokussierung vorliegt, sondern eine linienförmige Fokussierung. In gleicher Weise wird der linienförmige Fokus (Ellipse F2) dann auf den Detektor D1 abgebildet, wie in 5 dargestellt ist. Natürlich ist dann das Scanmodul 2 entsprechend angepaßt, so daß unter Umständen (wenn die Linie so lang ist, daß sie das gesamte Bildfeld in Linienrichtung abdeckt) nur eine Ablenkung quer zur Erstreckungsrichtung des linienförmigen Fokus notwendig ist.
Für die Steuerung des Mikroskops und die Durchführung der beschriebenen Schritte weist das Mikroskop eine Steuereinheit 10 auf.
Natürlich ist man nicht auf eine punkt- oder linienförmige Fokussierung beschränkt. Wesentlich ist, daß die Fokussierung zumindest in einer Richtung im Bildfeld eine örtliche Begrenzung aufweist, wobei diese Begrenzung bevorzugt möglichst scharf ist. Die Steilheit der Begrenzung sollte bevorzugt zumindest einer Raumfrequenz bei der halben Grenzfrequenz des Objektivs 3 entsprechen.
In 6 ist eine alternative Ausbildung des Detektionsmoduls 4 gezeigt. Hier weist das Detektionsmodul 4 einen Strahlteiler 13 auf, der beispielsweise je die Hälfte des einfallenden Probenlichtes LS2 reflektiert und transmittiert und somit in zwei Detektionsarme aufspaltet. Bei dem nach rechts laufenden Detektionsarm in 6 ist sowohl der fokale Anteil LS2c als auch der außerfokale Anteil LS2nc eingezeichnet, wobei in dem nach oben laufenden Detektionsarm zur Vereinfachung nur noch der konfokale Anteil LS2c dargestellt ist. Aufgrund der örtlichen Anordnung der Detektoren D1, D2 in den Detektionsarmen trifft auf den Detektor D2 nur der außerfokale Anteil LS2nc, während auf den Detektor D1 der fokale Anteil LS2c trifft.
In 7 und 8 ist eine Ausführungsform des Detektionsmodul 4 gezeigt, bei der nur ein einziger Detektor D1 vorgesehen ist. Zwischen der Detektionsoptik 10 und dem Detektor D1 ist eine drehbare Glasplatte 14 angeordnet, die je nach Drehstellung dafür sorgt, daß entweder der fokale Anteil LS2c oder der außerfokale Anteil LS2nc auf die aktive Fläche des Detektors 1 trifft.
Wenn das Beleuchtungsstrahlenbündel bzw. der fokussierte Laserstrahl LS1 punktförmig fokussiert wird, wie in Verbindung mit 1 beschrieben wurde, können die Liniendetektoren von 5 zur spektral aufgelösten Detektion genutzt werden. Dazu muß die detektierte Probenstrahlung nur spektral in Richtung der Erstreckungsrichtung des Liniendetektors aufgespalten werden, bevor sie auf die Liniendetektoren D1, D2 trifft.
Entsprechendes gilt, wenn der Laserstrahl LS1 linienförmig fokussiert wird. Dann ist mindestens ein ortsauflösender flächiger Detektor notwendig, wobei z. B. in Spaltenrichtung ortsaufgelöst der Linienfokus und in Zeilenrichtung der in diese Richtung spektral aufgelöste Linienfokus spektral aufgelöst detektiert wird.

Claims

Mikroskopierverfahren zum Erzeugen eines Bildes eines in einer vorbestimmten Tiefe einer zu untersuchenden Probe liegenden Bildfeldes, mit mehreren Beleuchtungsschritten, in den jeweils ein Teil des Bildfeldes mit einem fokussierten Beleuchtungsstrahlenbündel beleuchtet wird, das aufgrund einer Wechselwirkung mit der Probe die Erzeugung von Probenstrahlung bewirkt, Detektionsschritten, in denen die erzeugte Probenstrahlung detektiert wird, und einem Auswerteschritt, in dem auf Basis der detektierten Probenstrahlung das Bild erzeugt wird, dadurch gekennzeichnet, daß während jedem Beleuchtungsschritt ein erster und ein zweiter Detektionsschritt durchgeführt werden, wobei im ersten Detektionsschritt im Fokus sowie außerhalb des Fokus erzeugte Probenstrahlung und im zweiten Detektionsschritt ein geringerer Anteil der im Fokus erzeugten Probenstrahlung als im ersten Detektionsschritt sowie außerhalb des Fokus erzeugte Probenstrahlung detektiert wird, und daß im Auswerteschritt die im zweiten Detektionsschritt detektierte Probenstrahlung genutzt wird, um bei der im ersten Detektionsschritt detektierten Probenstrahlung den außerfokalen Anteil zu verringern.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die beiden Detektionsschritte während zumindest einem Beleuchtungsschritt gleichzeitig durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die beiden Detektionsschritte während zumindest einem Beleuchtungsschritt zeitlich nacheinander durchgeführt werden.
Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem im ersten Detektionsschritt die aus einem ersten Abschnitt der Probenoberfläche auftretende Probenstrahlung und im zweiten Detektionsschritt die aus einem zweiten Abschnitt der Probenoberfläche austretende Probenstrahlung detektiert wird, wobei beide Abschnitte aneinandergrenzen oder der zweite Abschnitt den ersten Abschnitt nur teilweise überdeckt.
Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem im Auswerteschritt das im zweiten Detektionsschritt detektierte Signal vom im ersten Detektionsschritt detektierte Signal subtrahiert wird.
Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem die Beleuchtungsschritte, die beiden Detektionsschritte und der Auswerteschritt für mehrere Bildfelder in unterschiedlichen vorbestimmten Tiefen der Probe durchgeführt werden, um mehrere tiefendiskriminierte Schnittbilder der Probe zu erzeugen.
Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem das Beleuchtungsstrahlenbündel punkt- oder linienförmig fokussiert wird.
Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem in den beiden Detektionsschritten die Probenstrahlung spektral aufgelöst detektiert wird.
Mikroskop zum Erzeugen eines Bildes eines in einer vorbestimmten Tiefe einer zu untersuchenden Probe liegenden Bildfeldes, mit einem Beleuchtungsmodul, das in mehreren Beleuchtungsschritten das Bildfeld beleuchtet, wobei in jedem Beleuchtungsschritt jeweils ein Teil des Bildfeldes mit einem fokussierten Beleuchtungsstrahlenbündel beleuchtet wird, das aufgrund einer Wechselwirkung mit der Probe die Erzeugung von Probenstrahlung bewirkt, einem Detektionsmodul, das erzeugte Probenstrahlung detektiert, und einem Auswertemodul, das auf Basis der detektierten Probenstrahlung das Bild erzeugt, dadurch gekennzeichnet, daß während jedem Beleuchtungsschritt das Detektionsmodul einen ersten und einen zweiten Detektionsschritt durchführt, wobei im ersten Detektionsschritt im Fokus sowie außerhalb des Fokus erzeugte Probenstrahlung und im zweiten Detektionsschritt ein geringerer Anteil der im Fokus erzeugten Probenstrahlung als im ersten Detektionsschritt sowie außerhalb des Fokus erzeugte Probenstrahlung detektiert wird, und daß das Auswertemodul die im zweiten Detektionsschritt detektierte Probenstrahlung nutzt, um bei der im ersten Detektionsschritt detektierten Probenstrahlung den außerfokalen Anteil zu verringen.
Mikroskop nach Anspruch 9, bei dem das Detektionsmodul zwei Detektoren umfaßt, so daß eine gleichzeitige Durchführung der beiden Detektionsschritte möglich ist.
Mikroskop nach Anspruch 9, bei dem das Detektionsmodul für die beiden Detektionsschritte einen einzigen Detektor aufweist.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 9 bis 11, bei dem im ersten Detektionsschritt die aus einem ersten Abschnitt der Probenoberfläche und im zweiten Detektionsschritt die aus einem zweiten Abschnitt der Probenoberfläche austretende Probenstrahlung detektiert wird, wobei die beiden Abschnitte der Probenoberfläche aneinandergrenzen oder der zweite Abschnitt den ersten Abschnitt nur teilweise überdeckt.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 9 bis 12, bei dem das Auswertemodul das im zweiten Detektionsschritt detektierte Signal vom im ersten Detektionsschritt detektierten Signal subtrahiert.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 9 bis 13, bei dem das Beleuchtungsmodul ein Scannermodul aufweist, das das Beleuchtungsstrahlenbündel über das Bildfeld lenkt.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 9 bis 14, bei dem das Beleuchtungsmodul das Bildfeld mit einem punkt- oder linienförmig fokussierten Beleuchtungsstrahlenbündel beleuchtet.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 9 bis 15, bei dem in den beiden Detektionsschritten die Probenstrahlung spektral aufgelöst detektiert wird.