JP2006317544A - 共焦点顕微鏡 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 試料の注目点「5」と該注目点の近傍に位置する非注目点「1」「9」との各々に照明光を集光し、注目点と非注目点とを同時に照明する手段と、注目点から発生する光と非注目点から発生する光のうち、注目点と共役な受光部に入射する光を区別せずに受光し、該光の強度に応じた受光信号を出力する手段と、非注目点の数を変更し、その変更前後における受光信号を順に取り込む手段と、取り込まれた複数の受光信号と変更された前記非注目点の数との関係に基づいて、注目点から発生する光の強度に応じた共焦点信号を生成する生成手段とを備える。
【選択図】 図4
Description
本発明の目的は、光の利用効率を向上させることができる共焦点顕微鏡を提供することにある。
(第1実施形態)
第1実施形態の共焦点顕微鏡10は、図1に示す通り、照明系(11〜16)と、結像系(13〜17)と、光検出器18と、制御部19とで構成される。照明系(11〜16)は、光源11と、コンデンサレンズ12と、ダイクロイックミラー13と、ミラー素子14と、レンズ15,16とで構成される。結像系(13〜17)は、上記のレンズ15,16とミラー素子14とダイクロイックミラー13と、さらにレンズ17とで構成される。
S1=a+(1/8)b×2 …(1)
次に、図4(b)の照明パターンの場合を説明する。図4(b)の照明パターンでは、ユニット21内の「5」の注目点2Aと、その近傍の「2」「4」「6」「8」の4個の非注目点2Aとを同時に照明している。この場合、注目点2Aに共役な受光部8Aから出力される受光信号の大きさS2は、次の式(2)で表すことができる。
本実施形態の共焦点顕微鏡10では、例えば、制御部19がミラー素子14を制御して、図4(a)の照明パターンを試料面20に形成したときに、ユニット21内の「5」の注目点2Aと共役な受光部8Aから出力される受光信号(大きさS1)を取り込み、その後、非注目点2Aの数を変更して(2個→4個)、図4(b)の照明パターンを試料面20に形成したときに、ユニット21内の「5」の注目点2Aと共役な受光部8Aから出力される受光信号(大きさS2)を取り込む。
なお、ミラー素子14のオン/オフを切り替えて、注目点2Aを試料面20で2次元走査する際の手順としては、次のように簡略化することができる。図6(a)に示す試料面20の「9」の微小領域2Aを注目点2Aとして「5」「1」の微小領域2Aを非注目点2Aとするユニット22の照明パターンは、「5」の微小領域2Aを中心とするユニット21に置き換えると、図6(c)に示すようになり、図4(a)に示すユニット21の照明パターンと同じであることが分かる。
ただし、図6(b)に示す試料面20の「9」の微小領域2Aを注目点2Aとして「3」「6」「7」「8」の微小領域2Aを非注目点2Aとするユニット22の照明パターンは、「5」の微小領域2Aを中心とするユニット21に置き換えると、図6(d)に示すようになり、図4(b)に示すユニット21の照明パターンとは異なっている。このため、注目点2Aの上下左右に位置する4個の微小領域2Aを非注目点2Aとする場合は、図4(b),図6(b),図8に示す9通りの照明パターンを順に試料面20に形成することが必要となる。
例えば、「5」を注目点2Aとし、「1」〜「4」「6」〜「9」を非注目点2Aとする場合、番号「N」の非注目点2Aに起因する非共焦点信号の大きさを“KN×b”とし、係数KNの総和(=ΣKN)が“1”になるように設定すればよい。
(第2実施形態)
ここでは、非注目点2Aの数が同じで配置が異なる複数の照明パターン(図9,図10)について説明する。
S3=S1(1)+S1(2)+S1(3)+S1(4)
=a×4+(1/8)b×8=4a+b …(3)
また、図10に示す6通りの照明パターンは、何れもユニット21内の「5」の微小領域2Aを注目点2Aとし、その近傍の4個の微小領域2Aを非注目点2Aとしている。非注目点2Aの配置は各照明パターンごとに異なるが、これら6通りの照明パターンを順に試料面20に形成することで、注目点2Aの近傍の8個の微小領域2A(「1」〜「4」「6」〜「9」)を順に3回ずつ照明することができる。
S4=S2(1)+S2(2)+S2(3)+S2(4)+S2(5)+S2(6)
=a×6+(1/8)b×24=6a+3b …(4)
第2実施形態では、ユニット21内における注目点2A以外への照明状態(非注目点2Aの数)が異なるときの受光信号(大きさS3,S4)を順に求めると、一方の受光信号(大きさS3)と非注目点2Aの数(2個)との関係を表している上記の式(3)と、他方の受光信号(大きさS4)と非注目点2Aの数(4個)との関係を表している上記の式(4)とを連立させ、注目点2Aからの蛍光の強度に応じた共焦点信号(大きさa)を生成する。
ユニット21内の「1」〜「9」の微小領域2Aに関わる受光信号(大きさS3)は、図9,図11に示す12通りの照明パターンを用いて効率よく求めることができる。また、「1」〜「9」の微小領域2Aに関わる受光信号(大きさS4)は、図10,図12に示す11通りの照明パターンを用いて効率よく求めることができる。
また、第2実施形態でも、試料面20において共焦点効果が保たれる間隔D1(=D2×2)で配列された複数の注目点2A、および、各々の注目点2Aに対して共焦点効果が保たれない狭い間隔で配列された非注目点2Aを同時に照明するため、光源11からの光の利用効率が向上する。
E={(12/23)・[3/9]+(1/23)・[4/9]+(10/23)・[5/9]}×〔10/23〕
=0.189 …(5)
括弧[ ]内の数値の分子(3,4,5)は照明された微小領域2Aの数、括弧( )内の数値の分子(12,1,10)は照明された微小領域2Aの数ごとの照明パターンの数、括弧〔 〕内の数値の分子(10)は共焦点信号を生成するために計算に使用した照明パターンの数を表している。
E’={(9/9)・[1/9]}×〔1/9〕
=0.0123 …(6)
上記の数値計算からも分かるように、第2実施形態では、光源11からの光の利用効率が格段に向上する。その結果、S/N比が向上し、良好な共焦点観察が可能となる。
(第3実施形態)
制御部19において上記の式(1),(2)の連立(または式(3),(4)の連立)により共焦点信号(大きさa)を生成する際に、非共焦点信号(大きさb)も生成する。非共焦点信号(大きさb)は、注目点2A以外の全ての微小領域2A(例えば図5に示す「1」〜「4」「6」〜「9」の8個の非注目点2A)からの漏れ光の合計強度に応じた信号である。
一方、図14(d)の照明パターンのように「5」の注目点2Aの近傍に位置する「2」「8」の非注目点2Aが同時に照明され、注目点2Aが光軸上に位置するとき(図14(e),(f)参照)、注目点2Aと共役な受光部8Aから出力される受光信号は、非共焦点信号(大きさb)となる。また、試料面20の内部における照明領域は、図14(e)のような形になる。
差分処理の効果を定量的に示すため、差分信号(a−b)に応じた像強度分布の光学伝達関数を図15(a)に示す。また、比較のために、共焦点信号(大きさa)に応じた像強度分布の光学伝達関数を図15(b)に示す。図15の横軸は、光軸方向の周波数Nz[1/μm]を表す。縦軸は光学伝達関数(OTF)である。
(変形例)
なお、上記した実施形態では、2個の非注目点2Aを含む照明パターンと、4個の非注目点2Aを含む照明パターンとを用いる例を説明したが、本発明はこれに限定されない。非注目点2Aの数を1つ以上とし、非注目点2Aの数が異なる2種類以上の照明パターンを用いる場合に、本発明を適用できる。また、非注目点2Aの数が異なる複数の照明パターンのうち1つにおいて、非注目点2Aへの照明を遮断してもよい。さらに、非注目点2Aの数が異なる3種類以上の照明パターンを用いる場合には、最小自乗法で連立方程式を解くことが好ましい。この場合、データ量が多いため、精度が向上する。
11 光源
12 コンデンサレンズ
13 ダイクロイックミラー
14 ミラー素子
4A 微小ミラー
15,16,17 レンズ
18 光検出器
8A 受光部
19 制御部
20 試料面
2A 微小領域(注目点,非注目点)
Claims (2)
- 試料の注目点と該注目点の近傍に位置する1つ以上の非注目点との各々に照明光を集光し、前記注目点と前記非注目点とを同時に照明する照明手段と、
前記照明手段によって照明されたときに前記注目点から発生する光と前記非注目点から発生する光のうち、前記注目点と共役な受光部に入射する光を区別せずに受光し、該光の強度に応じた受光信号を出力する受光手段と、
前記照明手段を制御して前記非注目点の数を変更し、その変更前後における前記受光手段から出力される前記受光信号を順に取り込む制御手段と、
前記制御手段によって取り込まれた複数の前記受光信号と変更された前記非注目点の数との関係に基づいて、前記注目点から発生する光の強度に応じた共焦点信号を生成する生成手段とを備えた
ことを特徴とする共焦点顕微鏡。 - 請求項1に記載の共焦点顕微鏡において、
前記生成手段は、前記共焦点信号を生成すると共に、前記非注目点から発生する光の強度に応じた非共焦点信号を生成し、かつ、前記共焦点信号と前記非共焦点信号との差分信号を生成する
ことを特徴とする共焦点顕微鏡。
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