JP6594437B2 - 顕微鏡および顕微鏡観察方法 - Google Patents

Description

本発明は、顕微鏡および顕微鏡観察方法に関する。

焦点外蛍光の共焦点ピンホール内への漏れ込みにより、試料の深部の観察が困難になるのを防止するために、複数のピンホールを持つ分離部材と複数の光検出器とによって焦点蛍光と焦点外蛍光とを弁別する顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照）。

特開２００５−２７４５９１号公報

特許文献１の顕微鏡は、異なる光束に対して異なる検出器で焦点蛍光と焦点外蛍光とを検出しているため、焦点外蛍光を精度よく検出することが困難であり、光検出器により検出された蛍光に含まれる焦点外蛍光を除去することが困難である。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、試料から発せられた焦点外蛍光を精度よく検出し、検出された蛍光から焦点外蛍光を除去して鮮明な蛍光画像を取得することができる顕微鏡および顕微鏡観察方法を提供することを目的としている。

本発明の一態様は、光源からの励起光を走査するスキャナと、該スキャナにより走査される励起光を試料に集光する一方、各走査位置で試料において発生した蛍光を集光する対物光学系と、該対物光学系により集光された前記蛍光の一部分を通過させ他の部分を遮断する遮光部材と、該遮光部材を通過した前記蛍光を検出する検出器と、前記遮光部材における開口位置と前記試料における前記対物光学系の焦点との位置関係を、前記試料から前記検出器までの光路において、前記焦点から発せられる焦点蛍光が前記遮光部材を通過する光学的に共役な位置関係と、前記焦点蛍光が前記遮光部材を通過しない光学的に非共役な位置関係とに設定し、設定された２種類の位置関係において前記遮光部材をそれぞれ通過した蛍光を、異なる時刻に前記検出器に検出させる設定部と、前記検出器により異なる時刻に取得された蛍光信号の差分を演算する演算部とを備える顕微鏡である。

本態様によれば、光源からの励起光がスキャナにより走査され、対物光学系によって試料に集光されることにより、試料における励起光の集光点において蛍光物質が励起されて蛍光が発生する。発生した蛍光は対物光学系によって集光された後に遮光部材を通過した部分が検出器により検出され、検出された蛍光の強度と走査位置とを対応づけることにより蛍光画像が生成される。

この場合において、設定部の作動により、検出器の前段に設けられた遮光部材における開口位置と試料における対物光学系の焦点との位置関係が光学的に共役な位置関係となる場合には、焦点蛍光および焦点外蛍光が検出器により検出される。また、切替部の作動により、遮光部材と試料における対物光学系の焦点との位置関係が光学的に非共役な位置関係となる場合には、焦点蛍光は遮光部材を通過できずに焦点外蛍光のみが検出器により検出される。これらの蛍光は、設定部により、時間的に分離されて異なる時刻に同一の検出器により検出させられる。そして、演算部によりこれら蛍光信号の差分が演算されることにより、焦点外蛍光が除去された焦点蛍光を得ることができ、鮮明な蛍光画像を取得することができる。

上記態様においては、前記設定部が、前記遮光部材と該遮光部材に入射する前記試料からの蛍光光束との位置を相対的に移動させてもよい。
このようにすることで、遮光部材における開口位置と試料における対物光学系の焦点との位置関係として、光学的に共役な位置関係と光学的に非共役な位置関係とを簡易に設定することができる。ここで、蛍光光束の位置とは蛍光光束の光軸に交差する方向の位置および蛍光光束の光軸に沿う方向の位置の両方を含む。

また、上記態様においては、前記設定部が、前記遮光部材と該遮光部材に入射する前記蛍光光束との位置を、該蛍光光束の光軸に交差する方向に相対的に移動させてもよい。
このようにすることで、遮光部材における開口位置に蛍光光束の焦点位置を一致させたときには、遮光部材における開口位置と、試料における励起光の集光点との位置関係を光学的に共役な位置関係とすることができる。一方、遮光部材における開口位置に対して蛍光光束の焦点位置を光軸に交差する方向にずらして配置したときには、遮光部材における開口位置と、試料における励起光の集光点との位置関係を光学的に非共役な位置関係とすることができる。

また、上記態様においては、前記光源が前記励起光を任意の繰り返し波形で発振させ、前記設定部が、前記対物光学系により集光された前記蛍光を光路長の異なる複数の光路に分岐して、前記遮光部材の異なる位置に入射させる空間光学系を備えていてもよい。

このようにすることで、光源から射出された明滅する励起光が試料に集光されることにより、試料において発生した明滅する蛍光が対物光学系によって集光され、空間光学系に入射される。空間光学系に入射された蛍光は、光路長の異なる複数の光路に分岐された後に、遮光部材の異なる位置に入射される。

これにより、長い光路により時間的な遅れを与えることで、遮光部材に到達する時刻を時間的に異ならせ、かつ、遮光部材における開口位置と試料における集光点とが光学的に共役な位置関係となる状態と、光学的に非共役な位置関係となる状態とを切り替えることができる。すなわち、試料において同時刻に発生した焦点蛍光と焦点外蛍光とを用いて焦点蛍光をさらに精度よく検出することができる。

また、上記態様においては、前記光源が前記励起光を任意の繰り返し波形で発振させ、前記設定部が、前記蛍光光束をその光軸に交差する方向に移動させる光束移動部を備えていてもよい。
このようにすることで、光束移動部の作動により蛍光光束を光軸に交差する方向に移動させて、遮光部材の異なる位置に蛍光を時間的に異ならせて入射させることができる。

また、上記態様においては、前記光束移動部が、偏向角度を変更可能な偏向素子であってもよい。
このようにすることで、偏向素子の作動により、偏向素子による蛍光光束の偏向角度を変化させて、蛍光光束を光軸に交差する方向に容易に移動させることができる。

また、上記態様においては、前記光束移動部が、音響光学素子または電気光学素子であってもよい。
このようにすることで、音響光学素子または電気光学素子に加える電圧を切り替えることで、蛍光光束の射出角度を変化させ、蛍光光束を光軸に交差する方向に容易に移動させることができる。

また、上記態様においては、前記遮光部材が、前記蛍光光束の光軸に交差する方向に配列された複数のピンホールを備え、かつ、該ピンホールの配列方向に移動可能に設けられていてもよい。
このようにすることで、蛍光光束を移動させることなく、遮光部材をピンホールの配列方向に移動させて、蛍光の結像位置がピンホールに一致する光学的に共役な位置関係と、蛍光の結像位置がピンホールからずれた光学的に非共役な位置関係とを容易に切り替えることができる。

また、上記態様においては、前記設定部が、前記遮光部材と該遮光部材に入射する前記蛍光光束の結像位置とを、該蛍光光束の光軸方向に相対的に移動させてもよい。
このようにすることで、遮光部材における開口位置に蛍光光束の結像位置を一致させたときには、遮光部材における開口位置と、試料における励起光の集光点との位置関係を光学的に共役な位置関係とすることができる。一方、遮光部材における開口位置に対して蛍光光束の結像位置を光軸方向にずらして配置したときには、遮光部材における開口位置と、試料における励起光の集光点との位置関係を光学的に非共役な位置関係とすることができる。

また、上記態様においては、前記光源が前記励起光を任意の繰り返し波形で発振させ、前記設定部が、前記対物光学系により集光された前記蛍光を光路長の異なる複数の光路に分岐して、前記蛍光光束の結像位置を異ならせる空間光学系を備えていてもよい。
このようにすることで、空間光学系に入射されることにより異なる光路に分岐された蛍光は光路長の違いにより時間的な相違を付与されるとともに、光路を通過する間に焦点位置を異ならされて遮光部材に入射させられる。一方の光路を通過した蛍光の結像位置が遮光部材の開口位置に一致しているときには、光学的に共役な位置関係となる。他方の光路を通過した蛍光の結像位置が遮光部材に対して光軸方向にずれているときには、光学的に非共役な位置関係となる。

また、上記態様においては、前記設定部が前記蛍光光束の結像位置を変更可能な音響光学レンズであってもよい。
このようにすることで、音響光学レンズに加える電圧を切り替えることで、蛍光光束の焦点位置を光軸方向に容易に移動させることができる。

また、上記態様においては、前記光源が前記励起光を任意の繰り返し波形で発振させ、前記設定部が、前記対物光学系により集光された前記蛍光を入射させる長さの異なる複数の光ファイバを備え、前記遮光部材が、各前記光ファイバへの前記蛍光の入射端を前記試料からの蛍光光束の光軸に交差する方向に並べて配置することにより構成されていてもよい。

このようにすることで、試料において発生した明滅する蛍光が、対物光学系によって集光され、試料における励起光の集光点と光学的に共役な位置に入射端が配置されている光ファイバによって焦点蛍光および焦点外蛍光が伝播され、光学的に非共役な位置に入射端が配置されている光ファイバによって焦点外蛍光が伝播される。長さの異なる光ファイバを伝播したこれらの蛍光は、長さの違いによる遅れによって、異なる時刻に検出器によって検出される。これにより、異なる光ファイバを伝播した蛍光を同一の検出器によって別々に検出することができ、焦点蛍光を精度よく分離抽出して鮮明な画像を取得することができる。

また、上記態様においては、前記演算部が、前記設定部により設定された２種類の位置関係において前記検出器により取得された蛍光信号により生成された２種類の画像の差分を演算してもよい。
また、上記態様においては、前記演算部が、前記設定部により設定された２種類の位置関係において前記検出器により取得された蛍光信号の差分を画素毎に演算してもよい。
このようにすることで、画素毎に短い時間差で取得された蛍光信号の差分を演算するので、動きの速い被写体に対してもブレの少ない鮮明な画像を取得することができる。

また、本発明の他の態様は、スキャナにより走査された励起光を対物光学系によって試料に集光し、各走査位置で試料において発生した蛍光を対物光学系によって集光し、遮光部材を通過した蛍光を検出器により検出する顕微鏡観察方法であって、前記遮光部材における開口位置と前記試料における前記対物光学系の焦点との位置関係が、該焦点から発せられる焦点蛍光が前記遮光部材を通過する光学的に共役な位置関係に配置された状態で前記検出器により蛍光を検出する第１のステップと、前記遮光部材における前記開口位置と前記試料における前記対物光学系の焦点との位置関係が、前記焦点蛍光が前記遮光部材を通過しない光学的に非共役な位置関係に配置された状態で前記検出器により前記第１のステップとは異なる時刻に蛍光を検出する第２のステップと、前記第１のステップにおいて前記検出器により検出された蛍光信号から前記第２のステップにおいて前記検出器により検出された蛍光信号を減算する第３のステップとを含む顕微鏡観察方法である。

本発明によれば、試料から発せられた焦点外蛍光を精度よく検出し、検出された蛍光から焦点外蛍光を除去して鮮明な蛍光画像を取得することができるという効果を奏する。

本発明の第１の実施形態に係る顕微鏡を示す全体構成図である。 図１の顕微鏡の試料から発せられ、設定部により設定された２種類の蛍光の内の一方の蛍光パターンの一例を示す図である。 図１の顕微鏡の試料から発せられ、設定部により設定された２種類の蛍光の内の他方の蛍光パターンの一例を示す図である。 図１の顕微鏡の第１の変形例を示す全体構成図である。 図１の顕微鏡の第２の変形例を示す全体構成図である。 図４Ａの顕微鏡のピンホールを有するディスクを示す平面図である。 図１の顕微鏡の第３の変形例を示す全体構成図である。 本発明の第２の実施形態に係る顕微鏡を示す全体構成図である。 図６の顕微鏡の変形例を示す全体構成図である。 本発明の第３の実施形態に係る顕微鏡を示す全体構成図である。 図８の顕微鏡の第１の変形例を示す全体構成図である、 図８の顕微鏡の第２の変形例を示す全体構成図である。

本発明の第１の実施形態に係る顕微鏡１および顕微鏡観察方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡１は、図１に示されるように、レーザ光源（光源）２からの励起光を試料Ａに照射して、試料Ａにおいて発生した蛍光を検出する顕微鏡本体４と、該顕微鏡本体４において検出された蛍光を用いて演算により画像を生成する演算部５と、該演算部５により生成された画像を表示するモニタ６とを備えている。

顕微鏡本体４は、レーザ光源２からの励起光を２次元的に走査するスキャナ７と、該スキャナ７により走査された励起光を試料Ａに照射し、試料Ａからの蛍光を集光する対物レンズ（対物光学系）８と、該対物レンズ８により集光され、スキャナ７を経由して戻る蛍光を励起光の光路から分岐するダイクロイックミラー９と、該ダイクロイックミラー９によって分岐された蛍光を２種類に切り替える切替部（設定部）３と、該切替部３により切り替えられた蛍光をそれぞれ集光する結像レンズ１０と、対物レンズ８の焦点位置と光学的に共役な位置に配置されたピンホール（遮光部材）１１と、該ピンホール１１を通過した蛍光を検出する光検出器（検出器）１２とを備えている。

スキャナ７は、例えば、非平行な軸線回りに揺動可能な２枚のガルバノミラー（図示略）を近接配置してなる近接ガルバノミラーである。光検出器１２は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）である。

レーザ光源２は、励起光を連続的に射出する光源である。
切替部３は、図１に示されるように、ダイクロイックミラー９と結像レンズ１０との間に配置され、揺動角度を変化させる可動ミラー（偏向素子、光束移動部）１３と、該可動ミラー１３を駆動する周波数を決定する周波数発振器１４とを備えている。

可動ミラー１３は、周波数発振器１４により発振される周波数に同期して、ダイクロイックミラー９によって励起光の光路から分岐された蛍光の結像レンズ１０への入射角度を交互に切り替えるようになっている。図中符号１５はミラーである。

これにより、試料Ａにおける励起光の集光点において連続的に発生した蛍光は、結像レンズ１０に、入射角度の異なる２種類の蛍光として、交互に入射させられるようになっている。すなわち、結像レンズ１０に入射してくる２種類の蛍光は、図２Ａ、図２Ｂに示されるように、反転したタイミングを有する矩形波状に形成されるようになっている。

図２Ａに示される一方の蛍光は、結像レンズ１０によりピンホール１１に一致する位置に焦点を結び、図２Ｂに示される他方の蛍光は、結像レンズ１０によりピンホール１１に対して、ずれた位置に焦点を結ぶようになっている。これにより、図２Ａの状態では、試料Ａにおける励起光の集光点とピンホール１１とが光学的に共役な位置関係となっており、図２Ｂの状態では、試料Ａにおける励起光の集光点とピンホール１１とが光学的に非共役な位置関係となっている。蛍光の結像レンズ１０への入射角度の切替周波数は、各画素位置において２種類の蛍光を少なくとも１回明滅させることができる周波数に設定されている。

すなわち、試料Ａに励起光を照射することにより発生した蛍光は、対物レンズ８によって集光された後に、切替部３を構成する可動ミラー１３によって異なる２つの角度に交互に偏向され、交互に異なる時刻に光検出器１２により検出されるようになっている。
演算部５は、同一の画素位置において、光検出器１２により検出された、２種類の蛍光の強度の差分を算出するようになっている。演算部５は、例えば、ロックインアンプ（図示略）を備えた電気回路によって構成されている。

ロックインアンプは、周波数発振器１４により発生された周波数に同期して光検出器１２から出力された２種類の蛍光信号の差分をハードウェア的に算出するようになっている。
そして、演算部５は、画素毎に算出された差分とスキャナ７による走査位置とを対応づけて記憶することにより、画像を生成するようになっている。

このように構成された本実施形態に係る顕微鏡１を用いた顕微鏡観察方法について以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡１を用いて試料Ａの蛍光観察を行うには、顕微鏡本体４のステージ（図示略）に試料Ａを配置して、対物レンズ８の焦点位置を試料Ａに一致するように調節した状態で、レーザ光源２から連続した励起光を発生させる。

そして、周波数発振器１４によって発振された所定の周波数に従って、切替部３において可動ミラー１３の角度を変化させる。
レーザ光源２から発せられた励起光は、ダイクロイックミラー９を通過してスキャナ７により２次元的に走査され、対物レンズ８によって試料Ａに集光される。試料Ａにおける励起光の照射により発生した蛍光の一部は対物レンズ８によって集光されて、スキャナ７を介して戻る途中でダイクロイックミラー９によって励起光の光路から分岐され、切替部３に入射される。

切替部３は可動ミラー１３の角度を交互に切り替えているので、図２Ａ、図２Ｂに示されるように、反転したタイミングを有する矩形波状の２種類の蛍光に分離される。
その結果、一方の蛍光は、ピンホール１１に一致する位置に集光されるので、ピンホール１１を通過した部分が光検出器１２により検出される（第１のステップ）。

この場合において、試料Ａに励起光が照射されると、励起光は対物レンズ８の焦点位置に至る経路の途中においても試料Ａを通過することにより蛍光物質を励起するので、蛍光は対物レンズ８の焦点位置のみならず該焦点位置に至る経路の途中においても発生する。特に、試料Ａが散乱物質からなる場合には、励起光の散乱により蛍光が焦点位置以外の部位において蛍光が発生し易い。

また、特に、高精細な観察を行うために試料Ａに入射される励起光のＮＡを増大させると、焦点位置に至るまでに励起光が通過する領域が増えるため、焦点位置以外の部位で発生する蛍光が増大する。また、同様に深部観察時にも励起光が通過する領域が増加するため焦点外蛍光が増加する。さらに深部観察には散乱の影響を補償するために励起光を強める必要があり焦点外蛍光の影響が特に顕著である。

試料Ａにおいて発生した蛍光の内、対物レンズ８の焦点位置から発生した蛍光は、光学的に共役な位置に配置されているピンホール１１を容易に通過するので光検出器１２により信号光として検出されるが、焦点位置以外の部位から発生した蛍光は試料Ａにより散乱され、その一部がピンホール１１を通過して光検出器１２によりノイズとして検出されてしまう。したがって、一方の蛍光には、対物レンズ８の焦点位置において発生した、信号として取得すべき蛍光（焦点蛍光）と、他の部位において発生した、信号として取得すべきでない蛍光（焦点外蛍光）とが含まれている。

また、他方の蛍光に含まれる焦点蛍光は、ピンホール１１に対してずれた位置に集光させられる。このため、焦点蛍光はピンホール１１を通過することができずに遮断される一方、焦点位置以外の部位から発生した焦点外蛍光の一部は試料Ａにより散乱され、第１のステップと同様に同じピンホール１１を通過して光検出器１２により検出される（第２のステップ）。

したがって、ピンホール１１を通過した他方の蛍光には、対物レンズ８の焦点位置以外の部位において発生した焦点外蛍光のみが含まれている。
そして、演算部５において、これらの２種類の蛍光の差分が演算される（第３のステップ）。これにより、対物レンズ８の焦点位置以外の部位において発生した、信号として取得すべきでない焦点外蛍光が除去された蛍光を取得することができる。

２種類の励起光が照射されることにより蛍光が発生する範囲は厳密には一致していないが、多くの部分において一致しているため、また同じピンホール１１および光検出器１２を用いて検出を行っていることにより、そのまま減算しても大部分の焦点外蛍光を除去することができる。特に、励起光のＮＡを大きくして高精細な観察を行う場合には、蛍光発生範囲の重複率が増大するので、さらに効果的に焦点外蛍光を除去することができる。

このように本実施形態に係る顕微鏡１によれば、対物レンズ８の焦点位置において発生した蛍光を高いＳ／Ｎ比で検出することができ、ノイズの少ない鮮明な画像を取得することができるという利点がある。特に、励起光のＮＡが大きな高精細の観察時、および、試料Ａが強い散乱物質であって焦点外蛍光が発生し易い場合に効果が高い。

また、本実施形態においては、画素毎に極めて短い時間差で取得した２種類の蛍光の差分を演算しているので、高速に移動する試料Ａであってもブレの少ない蛍光画像を取得することができるという利点がある。

なお、本実施形態においては、遮光部材としてピンホール１１を例示したが、これに代えて、対物レンズ８の焦点位置と光学的に共役な位置に配置されたときに焦点蛍光を通過させ、非共役な位置に配置されたときに焦点蛍光を遮断する任意の遮光部材を採用してもよい。他の遮光部材としてはマイクロミラーデバイスや空間光変調器が挙げられる。

また、本実施形態においては、切替部３を構成する偏向素子として可動ミラー１３を例示したが、図３に示されるように、音響光学偏向器（音響光学素子、光束移動部）１６や電気光学偏向器（電気光学素子、光束移動部）１７などのデバイスを使用することもできる。これらのデバイス１６，１７も、周波数発振器１４によって発振された所定の周波数に従って入力する電圧を切り替えることにより、可動ミラー１３と同様に入力電圧に同期して蛍光光束の結像レンズ１０への入射角度を変化させることができる。これらのデバイス１６，１７によれば、可動ミラー１３のような可動部分を含まないため、コンパクトかつ長寿命に構成することができる。

また、本実施形態においては、固定された遮光部材１１に対して入射する蛍光光束の入射位置を時間的に切り替えることとしたが、これに代えて、蛍光光束を固定しておき、遮光部材１８を蛍光光束の光軸に交差する方向に移動させることにしてもよい。
すなわち、遮光部材１８として、図４Ｂに示されるように、周方向に間隔をあけて配列された複数のピンホール１９を有する円板状のディスクを採用し、図４Ａに示されるように、モータ２０によってディスク１８を中心軸回りに回転させることにしてもよい。

このようにすることで、結像レンズ１０による蛍光の集光位置をディスク１８に一致させておき、モータ２０によってディスク１８を回転させることにより、蛍光の光軸にピンホール１９が一致する状態と一致しない状態とを交互に繰り返すことができる。すなわち、蛍光の光軸にいずれかのピンホール１９が一致した状態で、試料Ａにおける励起光の集光点とピンホール１９とが光学的に共役な位置関係となり、蛍光の光軸に対していずれのピンホール１９も一致していない状態で、試料Ａにおける励起光の集光点とピンホール１９とが光学的に非共役な位置関係となる。

これにより、光学的に共役な位置関係と光学的に非共役な位置関係とを時間的に交互に形成し、焦点蛍光を精度よく検出するための２種類の蛍光を同一の光検出器１２によって、順次検出することができる。また、ディスク１８を高速に回転させることにより、２つの位置関係をより高速に切り替えることができるという利点がある。

また、本実施形態においては、蛍光光束とピンホール１１とを蛍光光束の光軸に交差する方向に相対的に移動させる場合について説明したが、これに代えて、図５に示されるように、蛍光光束とピンホール１１とを蛍光光束の光軸に沿う方向に相対的に移動させることにしてもよい。

すなわち、図５に示す例では、音響光学偏向器１６あるいは電気光学偏向器１７に代えて、音響光学レンズ（設定部）２１を採用している。音響光学レンズ２１は、入力される電圧に応じて、屈折力を変化させるレンズであり、周波数発振器１４による周波数に同期して屈折力を切り替えることにより、結像レンズ１０による蛍光の結像位置をピンホール１１に一致する位置とピンホール１１から光軸方向にずれた位置とで切り替えることができる。
これにより、蛍光の結像位置をピンホール１１に一致させた光学的に共役な位置関係と、蛍光の結像位置をピンホール１１から光軸方向にずらした光学的に非共役な位置関係とを容易に切り替えることができる。

次に、本発明の第２の実施形態に係る顕微鏡２２について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態の説明において、第１の実施形態に係る顕微鏡１と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。

本実施形態に係る顕微鏡２２は、レーザ光源２が周波数発振器１４により設定された周波数で明滅するパルス状の励起光を射出する点、および、切替部（設定部）２３の構成において第１の実施形態と相違している。
レーザ光源２は、周波数発振器１４が発生した所定の周波数で励起光を図２Ａに示されるような繰り返し波形で発振させるようになっている。レーザ光源２の周波数は、各画素位置において少なくとも１周期繰り返される周波数である。
切替部２３は、ダイクロイックミラー９と結像レンズ１０との間に配置された空間光学系である。

空間光学系２３は、図６に示されるように、ダイクロイックミラー９により励起光の光路から分岐された蛍光を２つの光路に分岐する第１の偏光ビームスプリッタ２４と、２つの光路を通過してきた蛍光を合波する第２の偏光ビームスプリッタ２５とを備えている。
図６に示す例では、第１の偏光ビームスプリッタ２４により第１の光路に分岐された蛍光は、そのまま第２の偏光ビームスプリッタ２５に入射され、第２の光路に分岐された蛍光は、２枚の光路形成用のミラー２６によって第１の光路より長い光路を経て第２の偏光ビームスプリッタ２５に入射されるようになっている。

また、第１の光路を経由して第２の偏光ビームスプリッタ２５から射出される蛍光と、第２の光路を経由して第２の偏光ビームスプリッタ２５から射出される蛍光の射出角度が異なるようにミラー２６の角度が設定されている。
これにより、例えば、第１の光路を経由した蛍光は結像レンズ１０によってピンホール１１に一致する位置に焦点を結び、第２の光路を経由した蛍光はピンホール１１からずれた位置に焦点を結ぶようになっている。さらに、第２の光路を経由した蛍光は、光路長の相違により、第１の光路を経由した蛍光よりも時間的に遅れてピンホール１１に到達するようになっている。

すなわち、第１の光路を経由した蛍光に対しては、試料Ａにおける励起光の集光点とピンホール１１とは光学的に共役な位置関係となっており、第２の光路を経由した蛍光に対しては光学的に非共役な位置関係となっている。そして、光路長の相違による遅れによって、光学的に共役な位置関係での蛍光の検出と、光学的に非共役な位置関係での蛍光の検出とが時間的にずれて行われる。

したがって、本実施形態によっても、第１の実施形態に係る顕微鏡１と同様にして、同一の光検出器１２によって２種類の蛍光を別々に検出し、その差分を演算することにより、焦点外蛍光を除去した鮮明な画像を生成することができるという利点がある。

なお、本実施形態においては、光路形成用のミラー２６の角度調節により、２種類の蛍光の結像位置を蛍光光束の光軸に交差する方向にずらすこととしたが、これに代えて、図７に示されるように、空間光学系２３内にいずれかの光路にレンズ２７を配置することにより、２種類の蛍光の結像位置を蛍光光束の光軸に沿う方向にずらすことにしてもよい。

また、本実施形態においては、２つの偏光ビームスプリッタ２４，２５により蛍光を分岐および合波する例を示したが、これに代えて、ハーフミラーのような無偏光のビームスプリッタを用いてもよい。
また、レーザ光源２が、図２Ａに示されるような矩形波状の励起光を発生させることとしたが、これに代えて、正弦波状等の任意の繰り返し形状を有し、位相の異なる励起光を発生させることにしてもよい。

次に、本発明の第３の実施形態に係る顕微鏡２８について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態の説明において、上述した第２の実施形態に係る顕微鏡２２と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。

本実施形態に係る顕微鏡２８は、設定部２９および遮光部材３０の構成において第２の実施形態に係る顕微鏡２２と相違している。
すなわち、本実施形態において、設定部２９は、図８に示されるように、結像レンズ１０と光検出器１２との間に配置された長さの異なる２本の光ファイバ（設定部）３１，３２によって構成されている。また、遮光部材３０は、２本の光ファイバ３１，３２の一端（入射端）３１ａ，３２ａによって構成されている。

第１の光ファイバ３１の一端３１ａは、結像レンズ１０による蛍光の結像位置に一致する位置に配置されている。一方、第２の光ファイバ３２の一端３２ａは、結像レンズ１０による蛍光の結像位置に対して、蛍光光束の光軸に交差する方向にずれた位置に配置されている。
２本の光ファイバ３１，３２の他端は、それぞれ伝播してきた蛍光を同一の光検出器１２に入射させることができる位置に配置されている。

このように構成された本実施形態に係る顕微鏡２８によれば、第１の光ファイバ３１の一端３１ａが結像レンズ１０による蛍光の結像位置に一致する位置に配置されているので、第１の光ファイバ３１の入射端３１ａと試料Ａにおける励起光の集光点とが光学的に共役な位置となっている。一方、第２の光ファイバ３２の入射端３２ａと試料Ａにおける励起光の集光点とが光学的に非共役な位置となっている。

２本の光ファイバ３１，３２の長さが異ならされることにより、長い方の第２の光ファイバ３２を伝播させられた蛍光は、第１の光ファイバ３１を伝播させられた蛍光よりも時間的に遅れて光検出器１２により検出される。
すなわち、本実施形態によれば、可動ミラー１３や音響光学偏向器１６あるいは空間光学系２３のような大がかりな切替部を用いることなく、固定された、長さの異なる２本の光ファイバ３１，３２によってコンパクトかつ安価に設定部２９を構成することができるという利点がある。光ファイバ３１，３２としてはカップリング効率の高いマルチモードファイバを用いることが好ましいが、これに限定されるものではない。

また、本実施形態においては、長さの異なる２本の光ファイバ３１，３２を用いることとしたが、これに代えて、図９に示されるように、長さの異なる３本以上の光ファイバ（設定部）３１，３２，３３を用い、その内の２本以上については光学的に非共役な位置関係で別々に蛍光を取得して平均することにしてもよい。平均することにより非共役な位置関係で取得された蛍光のノイズを低減することができる。

また、図１０に示されるように、３本以上の光ファイバ３１，３２，３３を用い、共役な位置関係で蛍光を検出する１本の光ファイバ３１と他の２本以上の光ファイバ３２，３３との長さを異ならせることとして、光学的に非共役な位置関係で２本以上の光ファイバ３２，３３によって伝播した蛍光を同時に取得して平均することにしてもよい。この場合、遮光部材３０は、３本の光ファイバ３１，３２，３３の一端（入射端）３１ａ，３２ａ，３３ａによって構成されている。

また、上記各実施形態においては、光検出器１２により取得された蛍光の差分を画素毎に演算することとしたが、画像毎に演算してもよい。
また、演算部５においては、ロックインアンプによってハードウェア的に減算することとしたが、これに代えて、演算部５をコンピュータにより構成し、信号処理等のソフトウェアを用いて差分を演算してもよい。

また、第１の実施形態および第２の実施形態においても、第３の実施形態の変形例と同様にして、複数の光学的に非共役な位置関係において蛍光を取得して平均することにしてもよい。

１，２２，２８ 顕微鏡
２ レーザ光源（光源）
３ 切替部（設定部）
５ 演算部
７ スキャナ
８ 対物レンズ（対物光学系）
１１ ピンホール（遮光部材）
１２ 光検出器（検出器）
１３ 可動ミラー（偏向素子、光束移動部）
１６ 音響光学偏向器（音響光学素子、光束移動部）
１７ 電気光学偏向器（電気光学素子、光束移動部）
１８ ディスク（遮光部材）
１９ ピンホール
２１ 音響光学レンズ（設定部）
２３ 空間光学系（設定部、切替部）
３０ 遮光部材
３１，３２，３３ 光ファイバ（設定部）
Ａ 試料

Claims (15)

1. 光源からの励起光を走査するスキャナと、
   該スキャナにより走査される励起光を試料に集光する一方、各走査位置で試料において発生した蛍光を集光する対物光学系と、
   該対物光学系により集光された前記蛍光の一部分を通過させ他の部分を遮断する遮光部材と、
   該遮光部材を通過した前記蛍光を検出する検出器と、
   前記遮光部材における開口位置と前記試料における前記対物光学系の焦点との位置関係を、前記試料から前記検出器までの光路において、前記焦点から発せられる焦点蛍光が前記遮光部材を通過する光学的に共役な位置関係と、前記焦点蛍光が前記遮光部材を通過しない光学的に非共役な位置関係とに設定し、設定された２種類の位置関係において前記遮光部材をそれぞれ通過した蛍光を、異なる時刻に前記検出器に検出させる設定部と、
   前記検出器により異なる時刻に取得された蛍光信号の差分を演算する演算部とを備える顕微鏡。
2. 前記設定部が、前記遮光部材と該遮光部材に入射する前記試料からの蛍光光束との位置を相対的に移動させる請求項１記載の顕微鏡。
3. 前記設定部が、前記遮光部材と該遮光部材に入射する前記蛍光光束との位置を、該蛍光光束の光軸に交差する方向に相対的に移動させる請求項２に記載の顕微鏡。
4. 前記光源が前記励起光を任意の繰り返し波形で発振させ、
   前記設定部が、前記対物光学系により集光された前記蛍光を光路長の異なる複数の光路に分岐して、前記遮光部材の異なる位置に入射させる空間光学系を備える請求項３に記載の顕微鏡。
5. 前記光源が前記励起光を任意の繰り返し波形で発振させ、
   前記設定部が、前記蛍光光束をその光軸に交差する方向に移動させる光束移動部を備える請求項３に記載の顕微鏡。
6. 前記光束移動部が、偏向角度を変更可能な偏向素子である請求項５に記載の顕微鏡。
7. 前記光束移動部が、音響光学素子または電気光学素子である請求項５に記載の顕微鏡。
8. 前記遮光部材が、前記蛍光光束の光軸に交差する方向に配列された複数のピンホールを備え、かつ、該ピンホールの配列方向に移動可能に設けられている請求項３に記載の顕微鏡。
9. 前記設定部が、前記遮光部材と該遮光部材に入射する前記蛍光光束の結像位置とを、該蛍光光束の光軸方向に相対的に移動させる請求項２に記載の顕微鏡。
10. 前記光源が前記励起光を任意の繰り返し波形で発振させ、
    前記設定部が、前記対物光学系により集光された前記蛍光を光路長の異なる複数の光路に分岐して、前記蛍光光束の結像位置を異ならせる空間光学系を備える請求項９に記載の顕微鏡。
11. 前記設定部が前記蛍光光束の結像位置を変更可能な音響光学レンズである請求項９に記載の顕微鏡。
12. 前記光源が前記励起光を任意の繰り返し波形で発振させ、
    前記設定部が、前記対物光学系により集光された前記蛍光を入射させる長さの異なる複数の光ファイバを備え、
    前記遮光部材が、各前記光ファイバへの前記蛍光の入射端を前記試料からの蛍光光束の光軸に交差する方向に並べて配置することにより構成されている請求項１に記載の顕微鏡。
13. 前記演算部が、前記設定部により設定された２種類の位置関係において前記検出器により取得された蛍光信号により生成された２種類の画像の差分を演算する請求項１から請求項１２のいずれかに記載の顕微鏡。
14. 前記演算部が、前記設定部により設定された２種類の位置関係において前記検出器により取得された蛍光信号の差分を画素毎に演算する請求項１から請求項１２のいずれかに記載の顕微鏡。
15. スキャナにより走査された励起光を対物光学系によって試料に集光し、各走査位置で試料において発生した蛍光を対物光学系によって集光し、遮光部材を通過した蛍光を検出器により検出する顕微鏡観察方法であって、
    前記遮光部材における開口位置と前記試料における前記対物光学系の焦点との位置関係が、該焦点から発せられる焦点蛍光が前記遮光部材を通過する光学的に共役な位置関係に配置された状態で前記検出器により蛍光を検出する第１のステップと、
    前記遮光部材における前記開口位置と前記試料における前記対物光学系の焦点との位置関係が、前記焦点蛍光が前記遮光部材を通過しない光学的に非共役な位置関係に配置された状態で前記検出器により前記第１のステップとは異なる時刻に蛍光を検出する第２のステップと、
    前記第１のステップにおいて前記検出器により検出された蛍光信号から前記第２のステップにおいて前記検出器により検出された蛍光信号を減算する第３のステップとを含む顕微鏡観察方法。

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