JP3464796B2 - 副甲状腺ホルモンのレセプターとそれをコードしているｄｎａ - Google Patents

副甲状腺ホルモンのレセプターとそれをコードしているｄｎａ

Info

Publication number
JP3464796B2
JP3464796B2 JP51003592A JP51003592A JP3464796B2 JP 3464796 B2 JP3464796 B2 JP 3464796B2 JP 51003592 A JP51003592 A JP 51003592A JP 51003592 A JP51003592 A JP 51003592A JP 3464796 B2 JP3464796 B2 JP 3464796B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
parathyroid hormone
dna
receptor
hormone receptor
pth
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP51003592A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH06506598A (ja
Inventor
ギノ ブイ セグレ
ヘンリー エム クロネンベルグ
アブダルバディ アボウサムラ
ハラルド ジャプナー
ジョーン テー ジュニア ポッツ
アーネスティーナ シパニ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
General Hospital Corp
Original Assignee
General Hospital Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=24736412&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP3464796(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by General Hospital Corp filed Critical General Hospital Corp
Publication of JPH06506598A publication Critical patent/JPH06506598A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3464796B2 publication Critical patent/JP3464796B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/12—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis
    • A61P3/14—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis for calcium homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/10—Drugs for disorders of the endocrine system of the posterior pituitary hormones, e.g. oxytocin, ADH
    • A61P5/12—Drugs for disorders of the endocrine system of the posterior pituitary hormones, e.g. oxytocin, ADH for decreasing, blocking or antagonising the activity of the posterior pituitary hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/18—Drugs for disorders of the endocrine system of the parathyroid hormones
    • A61P5/20—Drugs for disorders of the endocrine system of the parathyroid hormones for decreasing, blocking or antagonising the activity of PTH
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/635—Parathyroid hormone, i.e. parathormone; Parathyroid hormone-related peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C07K14/721—Steroid/thyroid hormone superfamily, e.g. GR, EcR, androgen receptor, oestrogen receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2869—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against hormone receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G01N33/78—Thyroid gland hormones, e.g. T3, T4, TBH, TBG or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/84—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving inorganic compounds or pH
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/30—Bird
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G01N2800/046—Thyroid disorders

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 ここに記載する研究の助成金は一部アメリカ合衆国政
府によって提供されたものであり、同政府は本発明に対
し一定の権利を保有する。
本発明は内分泌レセプターに関する。
ホルモン作用発現の重要な段階は、ホルモンと標的細
胞の原形質膜表面上にあるレセプターとの相互作用であ
る。ホルモン−レセプター複合体の形成によって、細胞
外シグナルを細胞内に導入して種々の生物学的反応を顕
現化することが可能となる。例えば、濾胞刺激ホルモン
（FSH）、黄体形成ホルモン（LH）、甲状腺刺激ホルモ
ン（TSH）、及び絨毛性性腺刺激ホルモン（CG）のよう
なホルモンの、その細胞表面レセプターへの結合はレセ
プターの高次構造の変化を誘発し、その結果、レセプタ
ーと導入分子、即ち、その一成分が（GS）である刺激性
グアニンヌクレオチド（GTP）結合蛋白質との連携が起
こる。この連携はアデニル酸シクラーゼを刺激し、次い
で蛋白質のリン酸化、ステロイドの合成と分泌、及びイ
オンフラックスの調節のような他の細胞の過程を刺激す
る。アルギニンバソプレッシン（AV）、アンギオテンシ
ンII、及びノルエピネフリンを含む他のホルモンの、そ
の細胞表面レセプターへの結合の結果、（GP）のような
別のタイプのGTP結合蛋白質成分の活性化をもたらし、
次いで酵素ホスホリパーゼＣの活性を刺激する。ホスホ
リパーゼＣによる加水分解の生成物は、細胞内カルシウ
ムの動員と蛋白質のリン酸化を含む細胞内現象の複雑な
カスケードを引き起こす。
副甲状腺ホルモン（PTH）はカルシウムの恒常性の主
要な調節物質であり、その重要な標的細胞は骨と腎臓に
存在する。カルシウム濃度の調節は、胃腸、筋肉、神
経、神経筋、及び心臓血管などの系の正常な機能のため
に必要である。PTHの合成と分泌は、主として血漿のカ
ルシウムレベルによって制御される：低レベルでホルモ
ンの合成と分泌の両方を刺激し、高レベルは抑制する。
次いでPTHは、直接的または間接的に、３つのカルシウ
ム交換部位、即ち、腸、骨、及び腎臓におけるカルシウ
ムの血中への流入を促進することによって血漿カルシウ
ムレベルを維持する。PTHは腎臓における活性型ビタミ
ンＤの生合成を助成することによってカルシウムの胃腸
からの正味の吸収に寄与する。PTHは造骨細胞を阻害
し、また、間接的に、骨吸収細胞である破骨細胞の分化
を促進することによって骨からのカルシウム再吸収を促
進する。このホルモンは、また、腎臓に対する少なくと
も３つの効果：尿細管のカルシウム再吸収の刺激、リン
酸クリアランスの向上、及び活性型ビタミンＤの合成を
完結する酵素量の増大促進を仲介する。PTHによるレセ
プター仲介のホスホリパーゼＣの活性化も報告されては
いるが（Hruska et al.,J.Clin.Invest 79:230,198
7）、PTHはこれらの効果を主としてレセプター仲介によ
るアデニル酸シクラーゼの活性化を通じて発揮する。
カルシウム恒常性の崩壊は多くの臨床的障害（例え
ば、重症な骨の疾患、貧血、腎障害、潰瘍、筋障害、及
び神経障害）を引き起こすことがあり、普通は、副甲状
腺ホルモンのレベルの変化を起こすような状態に起因す
るものである。高カルシウム血症は血漿カルシウムレベ
ルの上昇を特徴とする症状である。それは、しばしば、
副甲状腺の病変（例えば、腺腫、増殖、または癌腫）の
結果としてPTHの生産過剰が起こる一次性副甲状腺機能
亢進症に関連している。もう一つのタイプの高カルシウ
ム血症、悪性の体液性高カルシウム血症（HHM）はもっ
とも普通の腫瘍の症候群である。それは大抵の場合、腫
瘍（鱗状、腎臓、卵巣または膀胱の癌種）によるPTHと
アミノ酸相同性を共有する新しいクラスの蛋白質ホルモ
ンの生成に起因するようである。これらのPTH関連蛋白
質（PTHrP）は一見、PTHの腎臓と筋肉に対する作用のあ
るものを模倣し、これらの組織におけるPTHレセプター
と相互作用すると信じられている。PTHrPは、通常、ケ
ラチノサイト、脳、下垂体、副甲状腺、副腎皮質、髄
質、胎児の肝臓、造骨細胞様細胞、及び授乳期の乳腺を
含む多くの組織に少量見出だされる。多くのHHM悪性腫
瘍において、PTHrPは循環系に高レベルで見出だされ、H
HM関連の高カルシウムレベルを生じる。
発明の概要 本発明は脊椎動物の細胞のレセプター、望むべくは、
副甲状腺ホルモンレセプターをコードしているDNA配列
からなる分離されたDNAを特徴とする。このレセプター
は、図３に示されているアミノ酸配列（配列番号:3）に
対し少なくとも30％（望ましいのは少なくとも50％、更
に望ましいのは少なくとも60％、そして最も望ましいの
は少なくとも75％）同一のアミノ酸配列を持つものであ
る：即ち、２つのアミノ酸配列間で（標準の方法を用い
て）最近似部位を求める場合、前者の配列のアミノ酸殘
基の少なくとも30％が後者の配列のアミノ酸殘基と同一
ということである。“分離された”とは、このDNAが、
本発明のDNAが由来する（何であれ）生物に本来あるゲ
ノム内で、本発明のDNAをコードしている遺伝子に直接
隣接している遺伝子のコーディング配列を全く持たない
ということを意味する。分離されたDNAは一本鎖、また
は２本鎖でもよく、また、ゲノムDNA、cDNA、組換えハ
イブリッドDNA、あるいは合成DNAでもよい。それは自然
に存在する細胞のレセプター（例えば、PTHレセプタ
ー）をコードしているDNA配列と同一かも知れず、ある
いは、このような配列とは、１つあるいはそれ以上のヌ
クレオチドの欠落、付加、または、置換によって異なる
かも知れない。本発明の一本鎖DNAは、一般に少なくと
も８ヌクレオチドの長さを持ち（望ましいのは、少なく
とも18ヌクレオチドの長さ、そして更に望ましいのは30
ヌクレオチドの長さ）、遺伝子あるいはcDNAの全長に及
ぶこともある。これらはハイブリッド形成プローブとし
て用いるため、検出され易いように標識されていること
が望ましく、また、アンチセンスのこともあり得る。出
来れば、この分離されたDNAは高度緊縮条件下に、図１
（配列番号:1）、図２（配列番号:2）、図３（配列番
号:3）、あるいは図６（配列番号:4）に示されているDN
A配列の全体、あるいは一部とハイブリッドを形成する
ことが望ましい。“高度緊縮”とは、例えばヒト腎臓の
PTHレセプターcDNAの分離のための以下に記載されてい
るような条件を意味する（Current Protocols in Mo
lecular Biology,John Wiley ＆ Sons,New York,1
989も参照のこと、ここには引用して組み込まれてい
る）。最も望ましいのは動物が哺乳類（オッポサム、ラ
ットあるいははヒト）であり、DNA配列が図１（配列番
号:1）、図２（配列番号:2）、図３（配列番号:3）、あ
るいは図６（配列番号:4）に示されているアミノ酸配列
を本質的にすべてコードしており、あるいはAmerican
Type Culture Collection（ATCC）に寄託され、ATCC
受託番号68570あるいは68571と名付けられているプラス
ミドの１つのコーディング配列によってコードされてい
ることである。本発明のDNAは、この発明の細胞レセプ
ター（例えば、副甲状腺ホルモンレセプター）、あるい
はそのレセプターの断片をコードするDNA配列を含むあ
るベクター［それは精製票品（例えば、ライブラリーを
形成するベクターの混合物から分離されたあるベクタ
ー）として提供されるかも知れない］に、及びそのベク
ター（あるいは上記の分離されたDNA）を含む細胞、ま
たは本質的に相同な細胞集団（例えば、原核細胞、ある
いは哺乳動物細胞のような真核細胞）に組み込まれるこ
ともあり得る。“本質的に相同”とは、少なくとも99％
の細胞が本発明のベクター（あるいは、場合によっては
分離されたDNA）を含むことを意味する。望ましいの
は、このベクター（例えば、R15B）が副甲状腺ホルモン
レセプターの発現を（例えば、ベクターを移入され、あ
るいはベクターで形質転換された細胞に）指示する能力
を持つことである。
別の観点から見ると、本発明は、細胞レセプターをコ
ードしている組換えDNA分子の発現によって生成される
細胞レセプター、望むべくは副甲状腺ホルモンレセプタ
ー（あるいはその本質的に精製された標品）を特徴とす
る。“本質的に精製された標品”とは、それが自然状態
下で結合している蛋白質や脂質を実質的には含まない標
品のことである。
関連した観点からは、本発明は、自然状態下に存在す
るこの発明の細胞レセプターの断片を含むポリペプチド
を特徴とする。望ましいのは、このポリペプチドが、副
甲状腺ホルモンあるいは副甲状腺ホルモン関連蛋白質と
結合する能力を持つ自然状態下に存在する副甲状腺ホル
モンレセプターの断片を含むことである。好適な実施態
様では、この断片は少なくとも６つのアミノ酸の長さ
で、以下のグループから選ばれた配列を持つ： （ａ）TNETREREVFDRLGMIYTVG;（配列番号:5） （ｂ）YLYSGFTLDEAERLTEEEL;（配列番号:6） （ｃ）VTFFLYFLATNYYWILVEG;（配列番号:7） （ｄ）Ｙ−RATLANTGCWDLSSGHKKWIIQVP;（配列番号:8） （ｅ）PYTEYSGTLWQIQMHYEM;（配列番号:9） （ｆ）DDVFTKEEQIFLLHRAQA;（配列番号:10） （ｇ）FFRLHCTRNY;（配列番号:11） （ｈ）EKKYLWGFTL;（配列番号:12） （ｉ）VLATKLRETNAGRCDTRQQYRKLLK;（配列番号:13）あ
るいは （ｊ）断片（即ち、少なくとも６殘基の長さを持つが、
全体よりは短い部分）あるいは（ａ）−（ｊ）の類似体
（アナログ）で、副甲状腺ホルモン、あるいは副甲状腺
ホルモン関連蛋白質［ここで“類似体（アナログ;analo
g）”とは、それが類似体であるペプチドと少なくとも5
0％（そして望ましいのは少なくとも70％）同等の配列
を持つペプチドを指す］を結合する能力を持つもの。出
来れば、本発明のポリペプチドは組換えDNA分子の発現
によって生成されるか、または合成品（即ち、生物学的
よりも化学的な手段によって組み立てられた）であるこ
とが望ましい。本発明はこのようなポリペプチドを生成
する方法を提供し、この方法には、本発明の細胞レセプ
ター、あるいはレセプターの断片をコードしている分離
されたDNAを含む細胞を提供すること、及びこの細胞
を、分離されたDNAからポリペプチドの発現を可能にす
るような条件下で培養することが含まれる。
本発明は、また、この発明の細胞レセプター（出来れ
ばヒトのPTHレセプターのような副甲状腺ホルモンレセ
プター）と免疫複合体を形成する能力のある抗体（単ク
ローン性または多クローン性）及び抗体の精製標品を特
徴とする。このような抗体は、抗原として（１）本発明
の細胞のレセプターの断片を含むポリペプチド、あるい
は（２）細胞表面上に存在する本発明の細胞レセプター
を用いることによって生成される。この抗体は、出来れ
ば、本発明の細胞レセプターの活性（即ち、レセプター
にそのリガンドが結合する時、レセプターによって本来
引き起こされるカスケード反応の一部を構成するもの）
を中和（即ち、部分的に、または完全に阻害する）する
能力を持つことが望ましい。好適な実施態様において、
本発明の抗体は副甲状腺ホルモンレセプターと免疫複合
体を形成する能力を持ち、PTHレセプターの生物学的活
性（即ち、アデニル酸シクラーゼの活性化、あるいはホ
スホリパーゼＣの刺激）を中和することが出来る。
また本発明には、製剤上許容出来る担体中に、（ａ）
本発明の細胞レセプター、（ｂ）本発明の細胞レセプタ
ーの断片を持つポリペプチド、あるいは（ｃ）本発明の
細胞レセプターに対する抗体を含む治療混合物が包含さ
れる。これらの治療混合物は、本発明の細胞レセプター
のリガンドによる過剰刺激を特徴とする種々の疾病を処
置する手段を提供する。好適な実施態様において、本発
明のポリペプチドにはPTHレセプター、PTHレセプターの
断片、及びPTHレセプターと免疫複合体を形成する抗体
が含まれる。これらのポリペプチド及び抗体は、PTHあ
るいはPTHrPに関連する高カルシウム血症の症例を、こ
れとは関連のないものと識別するための診断用薬として
有用である。
本発明の核酸プローブは、遺伝子工学の一般研究者
が、細胞レセプター同族体、あるいは本発明の細胞レセ
プターに関連した、いかなる動物由来にせよ、その細胞
レセプターを同定し、クローン化することを可能にし、
本発明の配列の有用性を拡大する。
本発明の他の特徴と利点は、以下の好適な実施態様の
説明と請求の範囲から明らかになるであろう。
発明の詳細な説明 先ず、図の簡単な説明をする。
図 図１はオポッサムの腎臓のPTH/PTHrPレセプタークロ
ーン、OK−Ｈをコードしている核酸とアミノ酸の配列の
表示である（配列番号:1）。
図２はオポッサムの腎臓のPTH/PTHrPレセプタークロ
ーン、OK−Ｏをコードしている核酸とアミノ酸の配列の
表示である（配列番号:2）。
図３はラットの骨のPTH/PTHrPレセプターのクロー
ン、R15Bをコードしている核酸とアミノ酸の配列の表示
である（配列番号:3）。
図４はクローンOK−Ｏ及びR15BからのcDNAにコードさ
れている推定アミノ酸配列の比較である。
図５はOK−Ｏ、OK−ＨとR15Bの推定アミノ酸配列を配
列相同性に従って並べて比較したものである。
図６はヒトのPTH/PTHrPレセプターをコードしている
核酸とアミノ酸配列の表示である（配列番号:4）。
図７はラットの骨のPTH/PTHrPレセプターのcDNA、ヒ
トのゲノムDNAクローン及びヒトのPTH/PTHrPレセプター
をコードしている２つのcDNAクローンの略図である。
図８はヒトの腎臓のPTH/PTHrPレセプターの推定アミ
ノ酸配列の疎水性プロットである。予測される貫膜ドメ
インＩ〜VIIが示されている;A、Ｂ、Ｃは追加の疎水性
部位を示す。
図９はOK−Ｈを移入したCOS細胞へのPTHrPの結合を示
すグラフである。
図10はOK−Ｈを移入したCOS細胞におけるNlePTHによ
る細胞内遊離カルシウムの刺激を示すグラフである。
図11はOK−Ｏを移入したCOS細胞へのPTHrPの結合を示
すグラフである。
図12はOK−Ｏを移入したCOS細胞におけるNlePTHによ
る細胞内遊離カルシウムの刺激を示すグラフである。
図13はR15Bを移入したCOS細胞へのPTHrPの結合を示す
グラフである。
図14はR15Bを移入したCOS細胞におけるNlePTHによる
細胞内遊離カルシウムの刺激を示すグラフである。
図15はOK−Ｈ、OK−Ｏ、あるいはR15Bを移入したCOS
細胞におけるNlePTHによるイノシトールリン酸代謝の刺
激を示すグラフである。
図16はCDM−８、OK−H,R15Bを移入したCOS細胞におけ
るNlePTHによるサイクリックAMP刺激を示すグラフであ
る。
図17はヒトの腎臓（ＡとＣ）及びラットの骨（Ｂと
Ｄ）のPTH/PTHrPレセプターを一過性に発現しているCOS
細胞への125I−標識PTH（１−34）（ＡとＢ）及び125I
−標識PTHrP（１−36）（ＣとＤ）の結合を示すグラフ
である。競合するリガンドには、PTH（１−34）
（□）、PTHrP（１−36）（＊）、PTH（３−34）
（■）、PTH（７−34）（＋）が含まれる。データは特
異的結合のパーセントとして示され、少なくとも３つの
独立した実験の平均値±標準偏差を表すものである。
図18はヒトの腎臓のレセプターを一過性に発現してい
るCOS細胞における細胞内cAMPの蓄積刺激を示すグラフ
である。データは平均値±標準偏差を示し、少なくとも
３つの独立した実験を表すものである。
図19はヒトの腎臓（Ａ）とSaOS−２細胞（Ｂ）から作
られた総RNA（〜10μg/レーン）のノーザンブロット分
析の表示である。ブロットはヒト腎臓のPTH/PTHrPレセ
プターをコードしている完全長のcDNAとハイブリッドを
形成した。28Sと18SのリボソームRNAバンドの位置が示
されている。
図28はヒトのゲノムDNAをSst I、Hind III及びXho I
（〜10μg/レーン）で消化したもののサザーンブロット
分析を示す。ブロットはヒトの腎臓のPTH/PTHrPレセプ
ターをコードしている完全長のcDNAとハイブリッドを形
成した。
図21はR15Bによってコードされているラットの骨のPT
H/PTHrPレセプターの細胞膜における配置提案の略図で
ある。
材料と方法 一般：［Nle8,18,Tyr34］bPTH（１−34）アミド（PTH
（１−34））、［Nle8,18,Tyr34］bPTH（３−34）アミ
ド（PTH（３−34））及び［Nle8,18,Tyr34］bPTH（７−
34）アミド（PTH（７−34））はBachem Fine Chemica
ls,Torrance,CAから購入した；［Tyr36］PTHrP（１−3
6）アミド（PTHrP（１−36））は記載（Keutman et a
l.,Endocrinology 117:1230,1985）されているように,
Applied Biosystems Synthesizer 420Aを用いて合成
した。ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）、EDTA/ト
リプシン及びゲンタマイシンはGIBCO（Grand Island,N
Y）から；牛胎児血清（FBS）はHiclone Laboratory,Lo
gan,UTから入手した。ヒト腎臓の総RNAはスエーデン、
ウプサラ、大学病院のPer Hellmann氏によって提供さ
れた。オリゴヌクレオチドプライマーはApplied Biosy
stems 380B DNA Synthesizerを用いて合成した。制
限酵素類、クレノウ酵素、T4ポリヌクレオチドキナーゼ
とT4DNAリガーゼは、New England Biolabs,Beverly,M
Aから購入した。子牛アルカリホスファターゼは、Boehr
inger Mannheim,ドイツから購入した。すべての他の試
薬は入手可能の最高純度のものであった。
細胞 使用された細胞には、COS細胞、OK細胞、SaOS−２細
胞、CHO細胞、AtT20細胞、LLC−PK1細胞及びUMR−106細
胞が含まれ、Americann Type Culture Collection
（Rockland,Maryland）、受託番号、夫々、CRL1650、CR
L6551、HTB85、CCL61、CCL89、CL101及びCRL1161を含む
種々の供給源から入手した。ROS17/2及びROS 17/2.8は
Gideon Rodan博士（Merck Laboratories,West Poin
t,PA）を含むいくつかの供給源から入手した。MC−3T3
細胞はマウスの骨細胞から誘導されるが、滋野長平博士
（医化学、医学部、京都大学、京都、日本）を含む種々
の供給源からも入手出来る。
すべての細胞は湿度95％の空気、CO25％を含む気相で
培養され、牛胎児血清（M.A.Bioproducts,Walkerville,
MD）を５％、あるいは、10％添加したハムＦ−12培地、
あるいはDMEM培地（Grand Island Biological Co.）
で単層培養として維持された。培地は３乃至４日ごとに
交換され、細胞は２乃至３週ごとに標準の方法を用い、
トリプシン処理によって継代培養された。
クローニング ラット及びオポッサムのPTH/PTHrPレセプターをコー
ドしているcDNAクローンの分離： 総RNAは、最初にラットの骨肉腫（ROS）細胞（ROS 1
7/2.8）とオポッサムの腎臓（OK）細胞から、グアニジ
ンイソチオシアネートを用いる標準法（Ullrich et a
l.,Science 196:1313,1977;Chirgwin et al.,Bioche
mistry 24:5294,1979）と塩化セシウム密度勾配遠心法
（Gilsen et al.,Biochemistry 13:2633,1974）によ
って分離された。次いでポリＡ＋RNAs（mRNAs）は、Avi
vとLeder（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69:14087,1972）
の方法により、総RNAsをオリゴdTカラム（Pharmacia,Pi
scataway,NJ）を通した後回収された。ROS 17/2.8m R
NAからのcDNAライブラリーは、ポリＡ＋RNAからGubler
とHoffman（Gene（Amst.）25:263,1983）の方法を用い
て作られた。オリゴdTをプライマーとする、及びランダ
ムプライマーをプライマーとするcDNAは、夫々、ポリＡ
＋ROS 17/2.8及びOK細胞のmRNAから合成された（Aviv
とLeder,前記）。cDNAはBst X1リンカー（Invitrogen,S
an Diego,CA）に連結され、５−20％の酢酸カリウム密
度勾配遠心（３時間、55,000xg）によってサイズ選別が
行われた。サイズ選別されたcDNAは、次いで、非自己ア
ニーリングBst X1制限部位を用いてプラスミドベクタ
ー、pcDNA I（Invitrogen）に挿入された。その結果得
られたプラスミドライブラリーは、次に、より大きなヘ
ルパープラスミド、p3を持つE.coli（MC1061/P3、Invit
rogen）を形質転換するのに用いられた。p3プラスミド
は、２つの遺伝子にアンバ−変異を持ち、アンピシリン
及びテトラサイクリン耐性をコードしている。アンピシ
リン及びテトラサイクリンを用いると、p3とpcDNA Ｉ
内に含まれているtRNAサプレッサー遺伝子の両方を持つ
細胞のみが成長することが出来た。変異した細菌は、次
いで密集状態まで培養され、プラスミドcDNAは標準技法
（例えば、Ausebel et al.,Current Protocols in
Molecular Biology、John Wiley Sons,New Yor
k、1989を参照のこと）により分離された。これらDNA
は、次いでDEAE−デキストラン溶液に取り込まれ、予め
“サイドフラスコ”（Nunc、デンマーク）中で75％の密
集度にまで培養されたアフリカミドリザルの腎臓（CO
S）細胞に移入するのに用いられた。
ROSあるいはOK細胞の機能的に完全な副甲状腺ホルモ
ン／副甲状腺ホルモン関連蛋白質（PTH/PTHrP）のレセ
プターを発現する能力のあるプラスミドを含むCOS細胞
のスクリーニングは、Gearingらの方法（EMBO J.８:36
76,1989）に従い、これにサイドフラスコ中でのDEAE−
デキストラン移入を含むいくらかの変法を加えて行っ
た。移入して48時間後、細胞は既述の方法（Yamamoto
et al.,Endocrinology 122:1028,1988）を用い、ただ
し例外として、インキュベーションの時間と温度は、夫
々、２時間と室温に変更して、125I−標識［Tyr36］PTH
rP（１−36）アミドとの結合能を検査された。洗浄後、
細胞は1.25％のグルタールアルデヒドで固定され、１％
のゼラチンで洗浄された。サイドフラスコの先を折った
後、残りの顕微鏡用スライドをNTB−２写真用乳液（Eas
tman Kodak,Rochester,NY）に浸した。４℃で３−４日
間反応後、スライドは現像、固定され、そして0.03％の
トルエンブルーで染色された。各スライドのスクリーニ
ングは光学顕微鏡（オリンパス）下で行われた。ROS細
胞からのプラスミド−DNAの１プール及びOK細胞からの
プラスミド−DNAの２プール、（10,000個の独立クロー
ン）から、夫々、PTH/PTHrPレセプターを発現している
３−４個の移入されたCOS細胞が得られた。これらのプ
ールは後に再分割された。サブプールはCOS細胞に移入
するのに用いられ、そして個々のクローンは、放射性リ
ガンドを結合することの出来るレセプター蛋白質を発現
たことが確認された。
ヒトのPTH/PTHrPレセプターをエンコードするcDNAとゲ
ノムDNAクローンの分離 ラムダGT10中のヒト腎臓のオリゴdTをプライマーとす
るcDNAライブラリー（1.7x106独立クローン）及びEMBL3
（Sp6/T7）（Clontech,Palo Alto,CA）中のヒト胎盤DN
Aのゲノムライブラリー（2.5x106独立クローン）は、32
P−標識（ランダムプライマーをプライマーとする標識
キット、ベーリンガー、マンハイム、ドイツ）されたBa
mH I/Not I1.8kbの制限酵素断片で、ラットの骨のPTH/P
THrPレセプターをコーディング配列の大部分をコードし
ているものとのプラークハイブリッド形成法（Sambrook
et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manua
l,2版、108−113頁、ColdSpring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor,NY、1989）によってスクリーニ
ングされた（図３）。ニトロセルロースフィルターは、
50％ホルムアミド、4xクエン酸ナトリウム生理食塩水
（SSC;1xSSC:300mMNaCl,30mMクエン酸ナトリウム、pH7.
0）、2xデンハルト溶液、10％硫酸デキストラン、100μ
g/mlのサケ***DNA（最終濃度）を含む前ハイブリッド
形成溶液中、42℃で４時間インキュベートした。ハイブ
リッド形成は、同じ溶液中で42℃で18−24時間行われ
た。フィルターは、2xSSC/0.1％SDSで室温で30分間、次
いで、1xSSC/0.1％SDSで45℃で30分間洗浄した。フイル
ムは、増強スクリーンを用い、−80℃で18−24時間、露
出した。
各ライブラリーから、約百万個のクローンがスクリー
ニングされた。陽性のクローンはプラーク法で精製さ
れ、ラムダファージDNAが分離された（Sambrook et a
l.,上記）。クローン化された挿入断片は、ファージDNA
から、制限酵素エンドヌクレアーゼHind IIおよびEcoR
I（ラムダGT10ライブラリー）、あるいはXho IおよびSs
t I（EMBL3ライブラリー）を用いて取り出され、次いで
適当な脱リン酸化された制限酵素部位を用いてpcDNA I
（Invitrogen,San Diego,CA）中にサブクローンされ
た。CsCl2（密度勾配）で精製されたサブクローンの配
列決定は、Sangerら（Biochem.74:5463、1977）の方法
に従い、ジデオキシ ターミネーション法（Sequenase
バージョン ２ sequencing キット、United Stat
es Biochemical Corporation,Cleaveland,OH）によっ
て行われた。
逆転写とポリメラーゼ連鎖反応（PCR） ３μｇのヒト腎臓由来のポリ（Ａ）＋RNA（Clontech,
Palo Alto,CA）を73.5μｌの水の中で100℃で30秒イン
キュベートし、氷冷して反応を静め、20μｌの50xRT緩
衝液（1xRT緩衝液:40mMトリス塩酸、pH8.2、40mMKCl、
6.6mMMgCl2、10mMジチオトレイトールと各5mMのデオキ
シヌクレオシド三リン酸（dNTP））、２μｌ（４単位）
のRNasin（Promega Biotec,Madison,WI）、１μｌ（80
pmol/μｌ）のヒトcDNAプライマーH12（５′−AGATGAGG
CTGTGCAGGT−３′；配列番号:14）と80単位のトリ骨髄
芽球炎ウイルスの逆転写酵素（Life Sciences,St.Pert
ersburg,FL）に加えた。反応混合物を42℃で40分間イン
キュベートした。次いで、10分の１容の最初の鎖を合成
する反応混合物は、PCRにより、3mMMgSO4、200μＭのdN
TP、２単位のVentポリメラーゼ（New England Biola
b,Beverly,MA）と各２μＭの正方向と逆方向のプライマ
ー（PCRの条件：変性、１分間、94℃；アニーリング、
１分間、50℃；延長、72℃で３分間;40サイクル）を含
む最終容量100μｌの中で増幅された。
２つの独立したPCRは、以下の２つの異なった正方向
のプライマーを用いて行われた:i）２つの以前にクロー
ン化されたPTH/PTHrPレセプター Ｇ CC （上述）コーディング末端に基づく変性プライマーRK−
１（５′−GGAATTCCATGGGAGCGGCCCGGAT−３′；配列番
号:15）、及び、ii）ヒトゲノムクローンHPG1の５′−
非コーディング領域に基づくプライマーRK−２（５′−
CGGGATCCCGCGGCCCTAGGCGGT−３′；配列番号:16）。両P
CR反応はヒトのPTH/PTHrPレセプターのコーディング領
域の713〜731番目のヌクレオチドを現す逆プライマーH2
6（５′−AGTATAGCGTCCTTGACGA−３′）を用いた（図
４）。PCRの生成物はクレノー酵素により末端を平滑に
され、EcoR Vで切断されて、脱リン酸されたpcDNA Iに
クローン化された。
ノーザンブロット分析：総RNAはSaOS−２細胞及びヒ
ト腎臓からグアニジウムチオシアネート法（Chirgwin
et al.,Biochem.18:5294,1979）によって抽出された。
ノーザンブロット分析のため、〜10μｇの総RNAが1.5％
/37％ホルムアルデヒドゲル上での電気泳動にかけら
れ、ニトロセルロースフィルター（Schleicher and S
chuell,Keene,NH）にブロットされた。ハイブリッド形
成条件はファージライブラリースクリーニングの条件と
同じであった（上記参照）。フィルターは、0.5xSSC/0.
1％SDSの最終洗浄条件で30分間、60℃で洗浄し、オート
ラジオグラフィーのために露出した。
サザンブロット分析：ヒトゲノムDNAはSDS/プロテイ
ナーゼＫ法（Gross−Bellard et al.,Eur.J.Biochem.
36:32,1973）を用いて生成された。サザーン分析のた
め、〜10μｇのDNAがSst I、Pvu II及びXho Iによって
消化され、0.8％アガロースゲル上の電気泳動にかけら
れ、ニトロセルロース膜（Schleicher and Schull,Ke
ene,NH）にブロットされた。ハイブリッド形成条件はフ
ァージライブラリースクリーニングの条件と同じであっ
た（上記参照）。フィルターは、0.5xSSC/0.1％SDSの最
終洗浄条件で30分間、55℃で洗浄し、オートラジオグラ
フィーのために露出した。
機能分析 COS細胞に発現されたクローン化レセプターの機能的
諸性質を特徴づける試験には以下のものが含まれた： Ｉ）PTHとPTHrPの断片及び類似体の結合、 II）PTHとPTHrPの断片及び類似体によるサイクリックAM
P蓄積の刺激、 III）PTHとPTHrPの断片及び類似体による細胞内の遊離
カルシウムの増大、及び IV）PTHとPTHrPの断片及び類似体によるイノシトールリ
ン酸代謝の活性化。方法論は次の通りである： ラジオレセプターアッセイ ［Nle8,Nle18,Tyr34］bPTH−（１−34）アミド（NleP
TH）及び［Tyr36］PTHrP（１−36）アミド（PTHrP）はN
a125I（担体なし、New England Nuclear,Boston,MA）
により既報（Segre et al.,J.Biol.Chem.254:6980,19
79）に従ってヨード化され、逆相HPLCによって精製され
た。簡略に述べると、標識されたペプチドは0.1％のト
リフルオロ酢酸（TFA）に溶かされ、C18Sep−pakカート
リッジ（Waters Associates,Inc.,Milford,MA）にかけ
られ、0.1％TFA中60％アセトニトリル溶液によって溶出
された。凍結乾燥後、ラジオリガンドは、次いで、C18
−μBondapakカラム（3.9mmx30cm。Waters Associate
s）にかけられ、0.1％TFA中30−50％のアセトニトリル
の直線密度勾配を用い、2ml/分の流速で30分かけて溶出
した。ラジオリガンドは、２つのピークに分かれて溶出
した；最初のピークは約38％のアセトニトリルのところ
で溶出し、より高い総結合と特異的結合を示したので、
この研究に用いられた。比活性は500±75mCi/mgで、こ
れは平均のヨード−ペプチド比１に相当する。
COS−７細胞は15cmのプレートで、DMEM、10％の熱不
活性化FBS、10mg/Lゲンタマイシン中、80−90％の密集
度まで培養された。DEAE/デキストラン法（Sambrook e
t al.,上記）により１−２μｇのプラスミドDNAを移入
した24時間後、細胞をトリプシン処理し、多穴プラスチ
ック皿（直径16あるいは35mm、Costar,Cambridge,MA）
に、細胞濃度5x104細胞/cm2で再分配した。細胞数は移
入後わずかに増加したのみであった。更に培養を48時間
続けた後、ラジオレセプターアッセイが行われた。培養
培地は、研究開始直前、50mMトリス−塩酸（pH7.7）、1
00mMNaCl、2mMCaCl2、5mMKCl、0.5％熱変性牛胎児血清
（GICBO）、５％熱変性ウマ血清（KC Biological In
c.,Lenexa,KS）を含む緩衝液と交換された。特に指示の
ない限り、研究は、細胞をこの緩衝液中、15℃、４時
間、4x105cpm/ml（9.6x10-11M）の125I−標識のNlePTH
あるいはPTHrPとインキュベートして行われた。
インキュベーションは、緩衝液を吸引除去し、粘着性
細胞を含む培養皿を0.9％NaCl溶液で繰り返し（３
回）、15秒間にわたって洗浄することによって終焉させ
た。細胞に結合した放射能は、各ウエルに連続（３回）
1NNaOH（200μｌ）を加えることによって回収された。
室温で30分後、このNaOHはガラス管に移された。二回
目、三回目の1NNaOH（200μｌ）による抽出を、一回目
のものと合わせ、総放射能はγ−スペクトロメター（Pa
ckard Instruments,Downers Grove,IL）で測定され
た。細胞を含まぬ培養皿へのトレイサーの付着は、たと
え容器が培養培地とプレインキュベーションされても、
無視出来る程度であった（加えられた総カウントの0.2
％以下）。
cAMP蓄積の測定 細胞内cAMPの蓄積は既述（Abou−Samra et al.,J.B
iol.Chem.262:1129,1986）のようにして測定された。24
穴プレート内の細胞を0.1％BSAと2mMIBMXを含む培地で
洗浄した。次いで、細胞はPTHまたはPTHrPと15分間、37
℃でインキュベートした。上清を除き、細胞は直ちにプ
レート全体をドライアイス粉末中に置くことによって凍
結した。細胞内cAMPは1mlの50mMHCl中で細胞を融かすこ
とによって抽出され、抗cAMP抗体（例、Sigma,St.Loui
s,MO）を用い、特異的ラジオイムノアッセイによって分
析された。cAMPの代わりにトレーサーとして用いられた
cAMP類似体（２′−Ｏ−モノサクシニル−アデノシン
３′:5′−サイクリックモノリン酸トシルメチルエステ
ル、Sigmaより購入）は、クロラミンＴ法によりヨウ素
化された。遊離のヨウ素は、ヨウ素化されたcAMP類似体
をC18Sep−pakカートリッジ（Waters,Milford,MA）に吸
着することによって除去した。
dH2Oで洗浄後、ヨウ化cAMP類似体はSep−pakカートリッ
ジから40％アセトニトリル（ACN）と0.1％トリフルオロ
酢酸（TFA）によって溶出された。ヨウ化cAMP類似体は
凍結乾燥され、1mlの0.1％TFAにもどし、C18逆相FPLCカ
ラム（Waters）に注入された。カラムを0.10％ACNの１
％TFA溶液で平衡化し、0.1％TFA中、10−30％ACNの密度
勾配で溶出した。この操作によりモノヨウ化cAMP類似体
を、非ヨウ化cAMP類似体から分離することが可能とな
る。トレーサーは−20℃で保存する時は、４ケ月までは
安定である。アッセイに用いられた標準品、アデノシン
３′,5′りん酸はSigmaから購入した。試料（１−10μ
ｌのHCl抽出液）あるいは標準品（0.04−100fmol/チュ
ーブ）を50mM酢酸ナトリウム（pH5.5）で希釈し、トリ
エチルアミンと無水酢酸の混合物（容量比 2:1）10μ
ｌでアセチル化した。アセチル化後、cAMP抗血清を、PB
S（pH7.4）、5mMEDTA及び１％正常ウサギ血清中に作ら
れた原液（1:4000）から加えた。トレーサーは、0.1％B
SAを含むPBS（pH7.4）で希釈して加えられた（20,000cp
m/チューブ）。アッセイは４℃で一晩インキュベートし
た。結合したトレーサーは100μｌのヤギの抗ウサギ抗
血清（1:20、PBS中）及び1mlの７％ポリエチレングリコ
ール（分子量5000−6000）を加えて沈殿させ、2000rpm
で30分間、４℃で遠心した。上清を除き、結合した放射
能をγ−カウンター（Micromedic）で測定した。標準曲
線はMicromedicから提供された４−パラメーターRIAプ
ログラムを用いて算定した。典型的な例では、アッセイ
感度は0.1fmol/チューブで、トレーサーの50％を置換す
る標準濃度は5fmol/チューブである。
cAMP蓄積をアッセイする別法では、PTH/PTHrPレセプ
ターcDNAを移入されたCOS細胞は、プラスチックポリス
マンによって、10mMトリス−塩酸（pH7.5）、0.2mMMgC
l、0.5mMエチレングリコールビス（２−アミノエチル）
N,N′−四酢酸（EGTA）（Sigma）と1mMジチオトレイト
ール（Sigma）を含む溶液中に集められる。細胞は緊密
に合ったダウンスホモジェナイザーの20ストロークでホ
モジェナイズし、13,000xgで15分間４℃で遠心する（Ep
pendorf,5412型,Brinkmann Instruments,Inc.,Westbur
g,NY）。原形質膜を含むペレットはダウンスホモジェナ
イザーで数ストロークにより同じ緩衝液に再度懸濁し、
更に同緩衝液で希釈して蛋白質濃度を、Lowryらの方法
（Lowry et al.,J.Biol.Chem.193:265,1951）で測定
して約1.2mg/mlとする。約30μｇ（25μｌ）の膜を、種
々の濃度のホルモン、または媒体のみと10分間、37℃
（最終容量、100μｌ）で、50mMトリス−塩酸（pH7.
5）、0.8MATP、4x106cpm［α−32P］ATP（New England
Nuclear,Boston,MA）、9mMテオフィリン、4.2mMMgC
l2、26mMKCl、0.12％BSA、及び5mMクレアチンりん酸（S
chwartz/Mann Division,Becton−Dickensen ＆ Co.,
Orangeburg,NY）とクレアチンホスホキナーゼ（Schwart
s/Mann）を含むATP再生系とインキュベートする。イン
キュベーションは、膜懸濁液を加えることによって開始
され、100μｌの20mMcAMP、約50,000cmpの［3H］cAMPと
80mMATPを含む溶液を加えることによって終了させる。
反応混合物を煮沸し、生成された［32P］cAMPはイオン
交換カラム（Dowex 50 Ｗ−X4,Biorad Lab,Richmon
d,CA）とアルミナ（Sigma）上の連続カラムクロマトグ
ラフィーによって精製される。［32P］cAMPはβ−シン
チレーションカウンター（Packard Instrument Co.）
で、［32P］cAMPの回収に対する補正をして測定され
る。
細胞内遊離カルシウムの測定 PTH/PTHrPレセプターcDNAを移入された細胞の細胞内
カルシウムレベルの測定は、Fura−２ AM（Fura−２の
アセトメトキシエステル、Molecular Probes Inc.,Eu
gene,OR）を負荷した細胞を用いて行われた。方法論の
詳細は以下の通りである： COS細胞を塗布したカバーガラスを、Fura−２ AMを
負荷し、以下のものを含む（mM濃度）緩衝液中でインキ
ュベートした:HEPES（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピ
ペラジン−Ｎ′−［２−エタンスルホン酸］）,20;CaCl
2,1;KCl,5;NaCl,145;MgSO4,0.5;NaHCO3,25;K2HPO4,1.4;
グルコース,10;およびFura−２ AM（１−［２−（５′
−カルボキシオキサゾール−２′−イル）６−アミノベ
ンゾフラン−５−オキシ］−２−（２′−アミノ−５′
−メチルフェノキシ）エタン−N,N,N′,N′−四酢酸ペ
ンタアセトキシメチルエステル）,0.5;37℃でpH7.4、95
％空気と５％CO2とを45分間通した。Fura−２ AMを負
荷した細胞は、次いで、以下のものを含む（mM濃度で）
修正クレブス・ヘンゼライト（KH）緩衝液で洗浄した:H
EPES、20;CaCl2,1;KCl,5;NaCl,145;MgSO4、0.5;Na2HP
O4,1;グルコース、5;pH7.4。エステルの開裂が起きたこ
とをチェックするために、Fura−２ AMインキュベーシ
ョン後、時間を変えて励起スペクトルを測定した。イン
キュベーション開始後５分で、励起スペクトルは約360n
mにピークがあり、Fura−２ AMの不完全な加水分解を
反映していたが、30分を越えると、励起スペクトルはFu
ra−２の特徴である約345nmにピークがあった。
個々の細胞の蛍光を測定するために、カバーガラスを
顕微鏡の組織チャンバー（Biophysica Technologies,I
nc.,MD）に置いた。チャンバーは、シリコンラバーシー
ルを持つテフロン製の浅い、傾斜のついたコンパートメ
ントからなっていた。カバーガラスはチャンバーの底の
役割をした。カバーガラスを所定の場所に密着させるシ
リコンラバーには、ヒーター／クーラーリングが封じ込
められていた。温度はヒーターに０−7.4ボルトを加え
ることによって、22℃〜37℃の間で変動させた。温度を
特定しない限り、実験は37℃で施行された。チャンバー
は倒立顕微鏡（Zeiss IM−35,Thornwood,NY）の載物台
に載せた。Fura−２の蛍光のために、コンデンサー（Ph
oton Technologies Intenational（PTI） Inc.,NJ）
の焦点におかれた75ワットのキセノンアーク灯で励起さ
れた。鏡板が透過光分割器と交番する回転チョッパーに
よって交番される回析格子単色光分光器が、波長選定に
使用された。単色光分光器の出力は結集されて一本の共
通の光路を形成し、調節可能な虹彩を通して発光源のハ
ウジングを励起した。次いで、光は石英レンズを、そし
て100倍のニコン蛍光対物レンズを通して二色性の鏡を
通過した。光量子計算PMT装置による検出が光の出力測
定に使用された。データの分析は、MS−DOS操作系を用
いるIBM互換性AT/286コンピュータにPTIソフトウエアを
使用して行った。データは圧縮二者択一性形式に保存、
操作された。
細胞内のカルシウム濃度は次式に従って計算された：
［Ca2+］ｉ＝Kd（Ｒ−Rmin）／（Rmax−Ｒ）Ｂ、ここ
で、Ｒは340と380nmにおける細胞の蛍光の比であり;Rma
xとRminは、夫々、飽和量のカルシウムと実際上ゼロの
カルシウムの存在下の、Fura−２の340と380nm励起波長
における蛍光強度の比であり;Bは380nmにおけるゼロカ
ルシウム存在下のFura−２の蛍光の、飽和量のカルシウ
ム存在下の蛍光に対する比であり;KdはFura−２のカル
シウムに対する解離常数である。Rmaxを測定するため
に、実験の終末にイオノマイシンをFura−２を負荷した
細胞に加えて細胞外（1mM）と細胞内環境の間のCa2+を
平衡化した。次いで、Rminを計算するために、1mMのEGT
Aを細胞浸液に加えた。異なった温度では異なった解離
常数が用いられた:34−37℃においては224nM、及び24−
27℃においては135nMである。
イノシトールりん酸の測定 PTH/PTHrPレセプターを移入されたCOS細胞におけるイ
ノシトールりん酸の代謝レベルは既報の方法を用いて測
定された（Bonventre et al.,J.Biol.Chem.265:4934,
1990）。
結果 分子的性質 ２つの個別のクローン（OK−Ｈ及びOK−Ｏ）は、とも
にOK細胞のcDNAライブラリーから分離されたが、およそ
２キロベースの長さを持っていた。これらのクローンの
決定されたヌクレオチド配列と予想されるアミノ酸配列
は、夫々、図１（配列番号:1）及び図２（配列番号:2）
に示されている。ROS細胞のcDNAライブラリーから分離
されたR15Bクローンは、およそ４キロベースの長さであ
った。ラットの骨のPTH/PTHrPレセプターの決定された
ヌクレオチド配列と予想されるアミノ酸配列は図３（配
列番号:3）に示されている。
３つのcDNAクローンは、イニシエーターメチオニンと
して有望な候補者と予想されるメチオニン残基をコード
しているコドンを持つという範疇によって完全な長さの
ものと思われる。これらメチオニンコドンの後ろには、
“シグナル−ペプチド”配列であることを示唆する性質
を持つアミノ酸配列（DNAから演繹して）が続く。３つ
のレセプターcDNAはすべて、Ｇ−蛋白質関連のレセプタ
ーに典型的なモデル、推定の７回−貫膜モデルへの“適
合”を可能にする位置に終止コドンを持つ。最も重要な
ことは、３つのクローン化されたレセプターが、すべ
て、リガンドと結合して活性化された時、細胞内のエフ
ェクターを活性化する能力を有することである。これら
の諸性質は、分離された３つのクローンすべてが、完全
長のcDNAをエンコードすることを示唆する。
図４は、OK−Ｏ及びROS 15BからのcDNAによってコー
ドされているアミノ酸配列間の高度の相同性を示す。こ
れら２つのレセプター間には、全体で87％の相同性があ
り、77.8％のアミノ酸の一致がある。このアミノ酸の長
い範囲にわたっての高度の一致は、PTHレセプターのア
ミノ酸配列が進化の上で高度に保持されていることを証
明している。これは、OK−ＯとR15B両者からのデータを
ヒトを含む他の動物種に外挿することを可能にする。
図５は、３つのクローン化されたcDNAすべての推定ア
ミノ酸配列を配列相同性に従って一線に整列させたもの
である。OK−Ｈ配列はOK−ＯとＣ−末端尾部を除き同一
である。ここでOK−Ｏ配列は全部で585アミノ酸残基を
持つが、OK−Ｈ配列は515アミノ酸で止まっている。こ
れは、OK−Ｏ配列と比べてOK−Ｈ配列に欠けているただ
１個のヌクレオチド（Ｇ）に起因し、前者におけるフレ
ームシフトと早期の終止コドンの原因となっている。OK
−ＯとOK−Ｈが２つの別個の遺伝子の産物か、あるいは
実験室の人為産物かは不明である。
Ｇ蛋白質に共役したレセプターのいくつかは、イント
ロン無しの遺伝子によってコードされている（Kobilka
et al.,Nature 329:75,1987;Kobilka et al.,J.B
iol.Chem.262:7321,1987;Heckert et al.,Mol.Endocr
inol.,6:70,1992;Kobilka et al.,Science 238:650,
1987;Bonner et al.,Science 237:527,1987;Sunahar
a et al.,Nature 347:80,1990）。ヒトのPTH/PTHrP
レセプターcDNAを単離するために、ヒトcDNAライブラリ
ーとヒトゲノムライブラリーの両者を、ラットの骨のPT
H/PTHrPレセプターのコーディング領域の大部分を代表
するプローブ（BamH I/Not I）を用いてスクリーニング
した（図３）。ヒト腎臓のcDNAライブラリーのスクリー
ニングの結果、クローンHK−１が分離されるに至った
（図６）［配列番号:4］。ラムダGT10の２つのEcoR Iク
ローニングサイトの１つが、ライブラリー構成の結果、
除去されたことが判明したので、cDNA挿入断片及び37kb
（左）ラムダアームの〜250bpを含むHind III/EcoR Iフ
ァージ断片をpcDNA Iの相当する制限部位にサブクロー
ニングした。DNA配列決定の結果、クローン化されたcDN
Aは、３′コーディング領域の〜1000bpと、Ａの多い
３′−末端を含む３′非コーディング領域の〜200bpを
含むことが判明した。Xho I部位に対する５′側コーデ
ィング領域は、次いでライブラリーを再スクリーニング
するのに使用され、クローンHK−２の分離を導いたが、
これは、pcDNA Iへのサブスクリーニング後、コーディ
ング領域の〜1400bpを含むことが判明した。ライブラリ
ーの第三のスクリーニングに対しては、HK−２のPvu II
/Pst Iが用いられた；分離されたクローンHK−３はHK−
２と同一であることが判明した。
ゲノムライブラリーのスクリーニング（〜106pfu）の
結果、４つの独立したクローンが分離された。これらの
クローンの制限酵素消化断片のサザーンブロット分析を
正常ゲノムDNAのそれとの比較した結果、１つの15kbの
ゲノムクローン、HPG1（また、HG4Aとも呼ばれる）は、
Sst Iで消化された正常のヒトゲノムDNAからの、ハイブ
リッドを形成するDNA種と同じサイズのSst I/Sst I断片
を含むことが判明した（下記参照）。Sst I/Sst I断片
を構成するハイブリッドを形成する2.3kbのSst I/Sst I
DNA断片と、〜8kbXho I断片は、共にpcDNA Iにサブク
ローニングされた。さらにSst I/Sst I DNA断片のサザ
ーンブロット分析の結果、ある〜1000bpのBamH I/Sst I
断片がヒトのPTH/PTHrPレセプターの一部をコードして
おり、これが、後に、推定のシグナルペプチドと〜1000
bpのイントロンによって中断されている５′−非コーデ
ィング領域をコードしているエキソンを代表しているこ
とが判明した（図７）。
コーディング領域の残る〜450ヌクレオチドを分離す
るために、ヒト腎臓からのポリ（Ａ）＋RNAをH12でプラ
イミングの後、逆転写した（図７）。一本鎖合成後、２
つの独立したPCRを以下の２つの別個の正方向プライマ
ーを用いて行った:i）２つの以前にクローン化されたPT
H/PTHrPレセプター、OK−ＯとR15Bの５′−コーディン
グ末端に基づく変性プライマーRK−1,及び、ii）HPG1の
５′−非コーディング領域に基づくプライマーRK−２で
ある。Ｈ−26が両反応の逆プライマーとして用いられ
た。サザーンブロットおよび制限地図分析によって、ヒ
トのPTH/PTHrPレセプターをコードしている増幅されたD
NAの予想されたサイズが確認された。ヒトのPTH/PTHrP
の５′−末端をコードしている平滑末端のPCR生成物
は、脱リン酸されたEcoR V部位を用いてpcDNA Iにクロ
ーン化された。各PCRクローンの配列分析によって、そ
れらの５′ヌクレオチドの違いは正方向プライマーの配
列の違いによることが確認されたが、それ以外は同一の
配列であることが明らかとなった。ヒトのPTH/PTHrPレ
セプターcDNAの両鎖のヌクレオチド配列決定により、59
3アミノ酸残基を持つ蛋白質をコードしている開放読取
り枠が明らかとなった（図６、配列番号:4）。
完全長のヒト腎臓のPTH/PTHrPレセプターcDNA、HKrK
は、PCRクローン＃２とKH−２のBamH I/Pvu II断片を用
いて構成された。ヒトのPTH/PTHrPレセプターをコード
している完全長のcDNAを用いて、ヒト腎臓とSaOS−２細
胞からの総RNA（〜10μg/レーン）のノーザンブロット
分析の結果、〜2.5kbの１つの主要なハイブリッドを形
成するDNA種が明かにされた（図19）。正常のヒトゲノ
ムDNAのXho I消化物は、同じ完全長のcDNA（図20）でプ
ローブされると、１つの主要な約5.5kbのハイブリッド
を形成する種と、弱くハイブリッドを形成する４と8kb
の２つのDNA種が現れた。これらのデータは、ヒトのPTH
/PTHrPレセプターが単一の遺伝子の産物であることを示
唆している。完全長のクローンは、次いで、機能的及び
生物学的諸性質検討のため、上述の方法によりCOS細胞
に一過性に発現された。
ヒトのレセプターのオッポサム腎臓のPTH/PTHrPレセ
プター及びラット骨のPTH/PTHrPレセプターとの比較に
より、夫々、81％と91％のアミノ酸配列の同一性が明ら
かになり、結果として非常に類似した疎水性プロットを
示した（図８）。すべての細胞外システインは、推定シ
グナルペプチドにおける２つのシステイン残基を含め
て、すべての可能性のある細胞外のＮ−グルコシル化部
位のように、保存されている。ヒトの腎臓とラットの骨
のPTH/PTHrPの間で同一でないアミノ酸のいくつかは、
ヒトとオポッサムのレセプターの間では保存されている
ことが判明した。これらの保存されているアミノ酸残基
は、51位のArgからLeu、58位のArgからTrp、262位のArg
からHis、358位のAspからHis、422位のIleからThr、及
び、427位のThrからLeuである。
生物学的諸性質の検討 オポッサムとラットのPTH/PTHrPレセプターの生物学
的性質の機能的特性の検討は一過性に移入されたCOS細
胞において、放射性リガンドとして125I−PTHrPと125I
−NlePTHの両方を用いるラヂオレセプターアッセイ法に
より、また、リガンドによるcAMPの蓄積、細胞内遊離カ
ルシウムの増加、及びイノシトールりん酸代謝の促進を
測定するバイオアッセイにより、上記の方法によって行
われた。
図９はOK−Ｈを発現しているCOS細胞が、125I−PTHrP
を結合することを示している。これらのデータは、ま
た、無傷のPTH（１−34）、またはアミノ末端で短縮さ
れている（即ち、３−34及び７−34類似体、これらは８
位と18位にメチオニンの代わりにNle置換を、そして34
位のフェニルアラニンの代わりにチロシン置換を持って
いる）PTH類似体が結合の競合阻害剤として用いられた
場合、PTHrPの結合が阻害されることを示している。同
様に、OK−Ｈを発現しているCOS細胞への125I−NlePTH
の結合は、PTHrPあるいはPTHrP断片が競合阻害剤として
用いられた時、阻害された。これらのデータは、PTHとP
THrPは共にOK−Ｈによってコードされているレセプター
に結合することを示唆している。
図10は、OK−Ｈを発現しているCOS細胞が、NlePTHに
暴露されると細胞内の遊離カルシウムの濃度を増大する
が、OK−ＯあるいはR15Bレセプターを発現し（図12と図
14）、NlePTHで刺激されているCOS細胞と比べると、増
加は程度が低いか（平均＝39nm）、あるいは全く無いこ
とを示している。OK−ＯあるいはR15Bを発現しているCO
S細胞とは異なり、OK−Ｈ細胞を発現しているCOS細胞は
NlePTHで刺激された時、イノシトールりん酸の代謝の増
加は検出されない（図15）。
図11はOK−Ｏを発現しているCOS細胞が、125I−PTHrP
を結合することを示している。これらのデータは、ま
た、PTHrPの結合が、無傷のPTH（１−34）、またはアミ
ノ末端で短縮されている（即ち、３−34及び７−34類似
体、これらは８位と18位にメチオニンの代わりにNle置
換を、そして34位にフェニルアラニンの代わりにチロシ
ン置換を持つ）PTH類似体が結合の競合阻害剤として用
いられた場合、阻害されることを示している。同様に、
OK−Ｈを発現しているCOS細胞への125I−NlePTHの結合
は、PTHrPあるいはPTHrP断片が競合阻害剤として用いら
れた時、阻害された。これらのデータは、PTHとPTHrPが
共にOK−Ｏによってコードされているレセプターに結合
することを示唆している。
図12はOK−Ｏを発現しているCOS細胞が、NlePTHとPTH
rPによる刺激後、細胞内の遊離カルシウム濃度及びイノ
シトールりん酸の代謝速度を増大することを示している
（図15）。
図13はR15Bを発現しているCOS細胞が、125I−PTHrPを
結合することを示している。これらのデータは、また、
PTHrPの結合が、無傷のPTH（１−34）、またはアミノ末
端で短縮されている（即ち、３−34及び７−34類似体、
これらは８位と18位にメチオニンの代わりにNle置換
を、そして34位にフェニルアラニンの代わりにチロシン
置換を持つ）PTH類似体が結合の競合阻害剤として用い
られた場合、阻害されることを示している。同様に、OK
−Ｈを発現しているCOS細胞への125I−NlePTHの結合
は、PTHrPあるいはPTHrP断片が競合阻害剤として用いら
れた時、阻害された。これらのデータは、PTHとPTHrPが
共にR15Bによってコードされているレセプターに結合す
ることを示唆している。
図14は、R15Bを発現しているCOS細胞が、OK−Ｏを発
現しているCOS細胞が刺激された場合と同程度に細胞内
カルシウム濃度を増大することを示している。
図15は、R15BあるいはOK−Ｏを発現しているCOS細胞
が、NlePTHあるいはPTHrPによる細胞の刺激後、イノシ
トール三りん酸（IP3）とイノシトール二りん酸（IP2）
蓄積の急速な増加によって証明されるように、フォスフ
ァチジルイノシトールの加水分解速度を増大することを
示している。逆に、OK−Ｈを発現しているCOS細胞は、N
lePTH、あるいはPTHrPによる刺激後も、イノシトール三
りん酸とイノシトール二りん酸の蓄積にいかなる増加も
検出出来なかった。これらのデータは、R15BとOK−Ｏに
よってコードされているPTHレセプターはホスホリパー
ゼＣに、恐らくGPを介して共役していることを示唆す
る。OK−ＯとOK−Ｈの間の唯一の違いはＣ末端尾部にあ
るので、これらのデータはOK−ＯとR15Bによってコード
されているPTHレセプターのＣ末端はホスホリパーゼＣ
の活性化に関与していることを強く示唆する。
図16は、R15BとOK−Ｈを発現しているCOS細胞が、Nle
PTHによる刺激後、cAMP蓄積を増大することを示してい
る。同様の結果は、OK−Ｏを発現しているCOS細胞にお
いても得られた。cDM18ベクターのみを移入されたCOS細
胞ではcAMP刺激は認められなかった。これらのデータ
は、アデニル酸シクラーゼに共役しているPTHレセプタ
ーは、レセプターのＣ末端の細胞質側の完全長の尾部を
必要としないことを示唆している。これらのデータは、
OK及びROS細胞のcDNAライブラリーの双方からクローン
化された３つのPTH/PTHrPレセプターのすべてが、両ペ
プチドのアミノ末端リガンドを同等に結合することを示
唆している。リガンドによるこれらすべてのレセプター
の活性化は、アデニル酸シクラーゼを、恐らくはグアニ
ンヌクレオチド結合蛋白質（Ｇ−蛋白質）の１つの活性
化を通じて、刺激する（細胞内cAMPの増加によって測定
されるように）。Ｇ−蛋白質は、三量体ペプチド構造を
持ち、そのうち、サブユニットの１つ、アルファーは、
夫々、別個であるが、他の２つ、ベーターとガンマは同
一か、または相同性が高い。これらＧ−蛋白質の１つ、
（Gs）はＧ−アルファー“刺激性”（Ｇ−アルファー
ｓ）を含み、これはアデニル酸シクラーゼの活性化に関
与する。
リガンドのOK−Ｈへではなく、OK−ＯとR15Bへの結合
もまた、細胞内の遊離カルシウムを増加してイノシトー
ルりん酸の代謝を刺激する。これらの性質は、OK−Ｏと
R15Bレセプターのリガンドによる活性化は、共に第二の
細胞内エフェクター、ホスホリパーゼＣの刺激をもたら
すことを強く示唆している。これら活性化されたレセプ
ターとホスホリパーゼＣとの共役機構は、Gsとは全く異
なるＧ−蛋白質であるらしい。対照的に、カルボキシ末
端で切り詰められている活性化されたOK−Ｈレセプター
は、活性化された時のその性質が、ホスホリパーゼＣを
活性化しないか、あるいはホスホリパーゼＣを効果のな
い活性化をすることを示唆する。
PTH/PTHrPレセプターのカルボキシ末端尾部の生化学
的役割は、鋳型としてR15Bを、そして481位に終止コド
ンを挿入された上流プライマーとを用いる標準PRC技法
により、カルボキシ末端短縮ラットレセプターR480を構
成することによって、さらに検討された。簡略に述べる
と、上流プライマーはラットcDNA配列（図3;配列番号:3
を見よ）の1494−1513番のヌクレオチドに基づく合成オ
リゴヌクレオチドで、これに終止コドンとXba Iクロー
ニング部位が加えられたものであった。30回のPCRサイ
クルが行われ、各サイクルは変性92℃、１分；アニーリ
ング60℃、１分；延長72℃１分からなっていた。生成物
はNsi IとXba Iによって切断され、ゲル電気泳動によっ
て精製された。R15Bは、Xba IとNsi Iによって順次消化
され、精製されたPCR生成物は、次いで、Xba I−Nsi I
で切断されたR15Bベクターに連結された。その結果出来
たプラスミド、R480は細菌中で増幅され、配列が決定さ
れた。
R480は、591アミノ酸残基を持つレセプター中のもの
と同一な480のアミノ酸をコードしている。この短縮cDN
AはCOS−７（一過性発現）とCHO細胞（安定発現）に発
現された。短縮レセプター、R480と自然型レセプター、
RBを発現しているCOS−７とCHO細胞は共にPTH（１−3
4）を同等の親和性を持って結合する。活性化される
と、R480は、正常型レセプターと同様にCOS−７とCHO細
胞におけるcAMP蓄積を刺激した。正常型レセプターとは
対照的に、R480はPTHで刺激された時、COS−７細胞、あ
るいはCHO細胞にも［Ca2+］イオンの増加を仲介しなか
った。これらのデータは、PTH/PTHrPレセプターによる
ホスホリパーゼＣとアデニル酸シクラーゼの活性化に対
する分子的要求性はお互いに異なっていることを示唆
し、PTH/PTHrPレセプターのカルボキシ末端尾部のホス
ホリパーゼＣとの、しかしアデニル酸シクラーゼとでは
ない、共役における主要な役割を指摘している。勿論、
活性化されたPTH/PTHrPレセプターが追加のＧ−蛋白質
および／または細胞内のエフェクター分子を活性化する
可能性もまたある。
クローン化されたヒトのPTH/PTHrPレセプターを移入
されたCOS−７細胞の分析によって、放射標識PTH（１−
34）とPTHrP（１−36）（〜200,000cpm）が発現された
レセプターに、R15B（特異的結合：夫々、8.1＋3.5％と
7.1＋4.1％）を発現しているCOS−７細胞に対して観察
されたのと同様の効率（特異的結合：夫々、10.1±3.7
％と7.6±6.0％）で結合することが明らかとなった。発
現されたヒトPTH/PTHrPレセプターは、ラット骨のレセ
プターよりも２倍高い見掛けのKdでPTH（１−34）と結
合した：〜5nM対〜10nM（図17）。しかしながら、それ
らの高度のアミノ酸相同性にも拘らず、２つのレセプタ
ーはPTH（３−34）とPTH（７−34）に対する親和性に著
しい差異を表した。PTHrP（１−36）はヒトのPTH/PTHrP
レセプターに対し、ラットのレセプターに対するよりも
２から４倍低い親和性を示した（HKrKに対する〜35nM対
R15Bに対する〜10nM）。このことはPTHrP（１−36）が
ラジオリガンドとして用いられた時の方が、さらに著明
であった。PTH（３−34）及びPTH（７−34）に対する親
和性は、発現されたHKrKの方がR15Bよりも７から35倍も
高かった（PTH（３−34）に対して、夫々、〜7nM対〜45
nM;PTH（７−34）に対して、夫々、〜60nM対〜2000n
M）。いずれかのレセプターを発現しているCOS細胞にお
いて、PTH（１−34）とPTHrP（１−36）は共に細胞内の
遊離カルシウムとcAMPの蓄積を同程度に刺激した（図1
8）。
PTH/PTHrPレセプターの関係 ヒトのPTH/PTHrPレセプターのアミノ酸配列は、ラッ
ト、真獣類動物からの骨PTH/PTHrPレセプターと比べ
て、非常に高度の保存を示すが、オポッサム、有袋動物
のPTH/PTHrPレセプターとの配列の相同性はそれほど著
明ではない。オポッサムの腎臓及びラットの骨のレセプ
ターのように、ヒトの腎臓のレセプターは、PTHまたはP
THrPで刺激された時、細胞内のcAMPと遊離のカルシウム
の増加を誘引する。ヒトのPTH/PTHrPレセプターとオポ
ッサム及びラットの同族体間の高度の相同性にも拘ら
ず、一過性に発現されたヒトのレセプターは、ラットの
骨のレセプターとは異なった機能的特徴を持っている。
これには、PTH（１−34）に対するやや高い親和性とPTH
rP（１−36）に対する著しく低い親和性が含まれる。よ
り高い親和性はPTH（３−34）と特にPTH（７−34）に対
して認められ、そのヒトのレセプターに対する親和性ラ
ット骨レセプターと比較して約35倍も高かった。これら
の発見は、PTH/PTHrP類自体の将来の開発に重要な意味
を持つかも知れない、それは種得異的な組織は、インビ
トロでアンタゴニスト（とアゴニスト）の有効性検査に
対する適当な組織であることを予言するからである。
PTH/PTHrPレセプターの他のレセプターに対する関係 PTHとPTHrPレセプターの生化学的諸性質は、これらが
Ｇ−蛋白質連携の膜レセプターとして知られている膜レ
セプター分子群のメンバーであることを示唆している。
よく調べられているＧ−蛋白質レセプターの構造的特徴
は、それらがすべて、数個の連続した疎水性アミノ酸か
らなる少なくとも７つの領域を持ち、これらの領域の各
々が原形質膜を貫通するのに十分な長さのものであるこ
とである。
Ｇ−蛋白質連繋の膜レセプターの１つのサブファミリ
ー、糖ペプチドレセプターサブファミリーと呼ばれるも
のには、糖ペプチドホルモン（甲状腺刺激ホルモン、黄
体形成ホルモン、濾胞刺激ホルモン、及び絨毛性性腺刺
激ホルモン）によって結合され、活性化されるレセプタ
ーが含まれる。これらのレセプターは、すべて以下のよ
うな特徴がある：（１）リガンド結合ドメインの一部ま
たはすべてを含むと思われる広範な推定アミノ末端細胞
外ドメイン（300アミノ酸残基よりも大）を持ち、
（２）著しいアミノ酸相同性を、殊に、７つの推定貫膜
ドメインに示すことである。もう１つのサブファミリ
ー、アドレナリン作動性／ムスカリン作動性サブファミ
リーと呼ばれるものには、カテコールアミン、神経筋伝
達物質、及びレチノールのような小分子のリガンドによ
って活性化されるレセプターが含まれる。これらのレセ
プターは、すべて、特に７つの推定貫膜ドメインにおけ
る著しいアミノ酸相同性に加えて、比較的短い（25−75
アミノ酸）推定アミノ末端細胞外ドメインが特徴であ
る。これらのレセプターのリガンドによる活性化には、
多数の貫膜ドメインの内の少なくとも幾つかが関与する
と思われ、レセプターのアミノ末端部が関与するとは思
われない。
ラットのPTH/PTHrPレセプター（図３）の推定アミノ
酸配列から推論され得るいくつかの構造的特徴は、PTH/
PTHrPが１つのＧ−蛋白質連繋のレセプターであること
を示唆している。アミノ末端は、１つの疎水性ドメイン
及び３つの連続したロイシン残基を含むシグナルペプチ
ドの特性を示す。この20−28アミノ酸残基からなるアミ
ノ酸範囲は、他の糖蛋白質レセプターの細胞外ドメイン
に先行するアミノ末端のように、リーダー配列として役
立つのかも知れない。また、推定貫膜ドメインを代表す
る７つの疎水性部分の集団がある（図19）。
オポッサムの腎臓、ラットの骨、及びヒト腎臓のPTH/
PTHrPレセプターの予想されるアミノ酸配列は、これら
がＧ−蛋白質連繋のレセプターサブファミリーのいずれ
にもうまく当て嵌まらないことを示唆している。ラット
及びヒトのPTH/PTHrPレセプターの糖ペプチドレセプタ
ー及びアドレナリン作動性／ムスカリン作動性サブファ
ミリーとの全般的相同性はおよそ10から20％であるが、
貫膜ドメイン内の相同性はこれより幾分高い。後のこと
は、これらの領域に出て来る疎水性アミノ酸のすべては
限られているので、当然のことと予想される。20％相同
性は、これらサブファミリーの夫々のメンバーとして一
般に受け入れられているレセプター間で見出だされる相
同性よりも遥かに低い。加えて、これらの配列には、限
られた領域にさえ、強い相同性（即ち、正確に合ってい
るうアミノ酸配列）として特徴付けられるようなものを
持つ部分は全く存在しない。
新たに特性が解明されたセクレチン及びカルシトニン
レセプターとの最近の比較（Ishihara et al.,EMBO
J.10:1635,1991;Lin et al.,Science 254:1022,199
1）によって、これらのレセプターとPTH/PTHrPレセプタ
ーの間には30から40％の同一性のあることが判明してい
る。PTH/PTHrPレセプターはカルシトニンレセプターよ
り100個以上アミノ酸が長いけれども、オポッサム腎臓
のPTH/PTHrPレセプター（配列番号:2）とブタ腎臓のカ
ルシトニンレセプター（GenBank 受託番号 M74420）
のアミノ酸配列の間には〜32％の一致がある。推定貫膜
ドメインVIIの18アミノ酸のうち17の範囲は同一であ
る。また、４つのＮ−連結グルコシル化部位のうち２
つ、及び８つの細胞外システインとして可能性のあるも
ののうち７つの位置が保存されている。２つのレセプタ
ー間の主要な差異は、それらのNH2−末端とCOOH−末端
のドメインにあると思われる。ラットのセクレチンレセ
プター（GenBank 受託番号 X59132）とヒトのPTH/PTH
rPレセプターのアミノ酸配列の比較により、推定貫膜ド
メインVIIの25のアミノ酸のうち21の範囲が一致してい
て、これら２つのレセプター間には43％の相同性のある
ことが示唆されている。PTH/PTHrP、カルシトニン、及
びセクレチンのレセプター間の類似性は、こいれらが７
回膜貫通のＧ蛋白質に共役してアデニル酸シクラーゼを
活性化するレセプターの新しいファミリーを代表するこ
とを示唆している。これらレセプターのアミノ酸配列が
与えられれば、この道の専門家はこれらの配列を比較
し、一致して核酸プローブ設計に役立つ領域を求め、こ
のファミリーに属する他のレセプターの確認と分離に用
いることが出来るであろう。
クローンの寄託 特許手続きの目的のための微生物寄託についての国際
的承認に関するブダペスト条約の約条の下に、cDNA発現
プラスイミドR15B、OK−Ｏ及びOK−H;ファージHPG1;及
びヒトのクローンの一部を含むプラスミド（名称8A6）
が、American Type Culture Collection（ATCC）に
寄託され、そこでは、夫々の受託番号ATCC No.68571,6
8572,68573,40998,及び68570を付けられている。申請者
の指定代理人、The General Hospital Corporation
は、ATCCがこの寄託の永続性と、もし、特許が許可され
た場合には、その容易な分譲を提供する寄託所であるこ
とを申し立てる。このように寄託物質の分譲に関するす
べての制限は、特許の許可と共に改変されることなく撤
去される。物質は特許申請の未決期間中は、37 CFR
1.14及び35 U.S.C.122の下、コミッショナーによって
資格ありと決定された者に分譲される。寄託された物質
はあらゆる必要な注意を払って維持され、寄託されたプ
ラスミドの試料提供に対する最も新しい要請後少なくと
も５年間、そして、いかなる場合でも、寄託の日付後、
少なくとも30年の期間、あるいは特許の実行期間、いず
れか長い方の期間、生存状態で、汚染されないように保
存を継続する。申請者の指定代理人は、もし、寄託物の
状態のために、要請があっても寄託所が試料を提供出来
ないならば、寄託物を取り替える責任のあることを認め
る。
ポリペプチド 本発明によれば、ポリペプチドには、図１−３及び６
に夫々、示されているオポッサム、ラット及びヒトの副
甲状腺ホルモンレセプター、及びいかなる他の自然界に
存在するレセプターにせよ、これらのレセプターをクロ
ーン化して発現するのに用いられたものに類似の方法に
より、あるいは、ここに記述されている配列の１つの全
体または１部をプローブとして利用する方法によって生
成され得るものを含む。さらに、副甲状腺ホルモン、ま
たは副甲状腺ホルモン関連蛋白質に対する結合能のある
PTHレセプターの類似体あるいは断片も本発明の範囲内
にある。
興味ある特異なレセプター類似体には、同類アミノ酸
置換によってのみ異なる、例えば、同じクラスの他の代
わりに１アミノ酸の置換（例えば、グリシンの代わりに
バリン；リジンの代わりにアルギニン、等）、あるい
は、１つ、またはそれ以上の非同類アミノ酸の置換、欠
失、また副甲状腺ホルモン、または副甲状腺ホルモン関
連蛋白質に結合するレセプターの能力を破壊しない位置
にされた挿入によってのみ異なるアミノ酸配列を持つ完
全長、あるいは部分長のレセプター蛋白質が含まれる。
特に、関心のある特異なレセプター断片には、これら
に限られるわけではないが、レセプターの部分で、一次
アミノ酸配列からChou−Fasman法（例えば、Chou and
Fasman,Ann.Rev.Biochem.47:251,1978参照）のような
疎水性／親水性計算法を用いて細胞外であると推定され
たものが含まれる。親水性ドメイン、特に少なくとも10
個のアミノ酸からなる疎水性区間（参照、貫膜ドメイ
ン）は、細胞外ドメインの有力な候補者として現れて来
る。図21は、１つのPTHレセプターの細胞外、細胞内及
び貫膜ドメインの予測される配置を図示している。
特定のPTHレセプター断片の例には、R15Bクローンの
推定アミノ酸配列に由来する以下ののアミノ酸配列（標
準の一文字記号で示されている）が含まれている： 細胞外ドメイン： RP−1:TNETREREVFDRLGMIYTVG（配列番号:5） RP−2:YLYSGFTLDEAERLTEEEL（配列番号:6） RP−3:VTFFLYFLATNYYWILVEG（配列番号:7） RP−4:Y−RATLANTGCWDLSSGHKKWIIQVP（配列番号:8） RP−5:PYTEYSGTLWQIQMHYEM（配列番号:9） RP−6:DDVFTKEEQIFLLHRAQA（配列番号:10） 細胞内ドメイン： RPi−7:FFRLHCTRNY（配列番号:11） RPi−8:EKKYLWGFTL（配列番号:12） RPi−9:VLATKLRETNAGRCDTRQQYRKLLK（配列番号:13） これらの断片はKeutmannらの方法（Ednocrinology 11
7:1230,1984）によって合成され、HPLCによって精製さ
れた。
ポリペプチドの発現 本発明によるポリペプチドは、本発明の細胞レセプタ
ーの一部または全体をコードしている配列を持つ組換え
核酸から、なにか適切な発現系、例えば、適当な宿主細
胞（原核あるいは真核）の、適当な発現伝達体（例、pc
DNA I）内の組換え核酸による突然変異を用いて、発現
することにより生成することが可能である。正確にいか
なる細胞を用いるかは、本発明にとって重要ではない。
しかし本発明のポリペプチドがPTH/PTHrPレセプターの
全体または一部を含む場合には、以下の宿主細胞細胞が
好適である:COS細胞、LLC−PK1細胞、OK細胞、AtT20細
胞、及びCHO細胞。移入の方法及び発現伝達体の選択は
選ばれた宿主系に依存する。哺乳類細胞の移入の方法
は、例えば、Ausubel et al.（Current Protocols
in Molecular Biology,John Willey ＆ Sons,New
York,1989）に記載されており、発現伝達体は、例え
ば、Cloning Vectors:A Laboratory Manual（P.H.Po
uwels et al.,1985,補遺、1987）に論じられているも
のから選んでもよい。安定に移入された細胞は、レセプ
ターDNAを宿主細胞の染色体に組み込むことによって作
ることが出来る。適当なDNAは、pcDNA,pcDNA I−Neo、
あるいは他の適切なプラスミドに挿入され、次いで、細
胞は，このプラスミドにより、psV−２−Neo、あるいは
psV−２−DHFRとの共同移入をして、あるいはしない
で、標準電気が孔、りん酸カルシウム、あるいはDEAE/
デキストラン技法によって移入される。移入された細胞
の選択は、累進的に上昇するレベルのG418（Geneticin,
GIBCO）、そしてもし必要ならば、メトトレキサートを
使用して行われる。
本発明のポリペプチドをコードしているDNA配列は、
また原核宿主細胞にも発現することが出来る。細胞のレ
セプター、あるいはレセプター断片をコードしているDN
Aは、原核細胞宿主における発現をもたらすことの出来
る制御シグナルに作動可能に連結されたベクター上を運
ばれる。もし希望ならば、コーディング配列は、その
５′−末端に、発現された蛋白質の宿主細胞の周辺腔へ
の分泌をもたらし、それによって蛋白質の回収とその後
の精製を容易にすることの出来る既知のシグナル配列を
なにかコードしている配列を含むもとも出来る。最も頻
繁に用いられる原核細胞は種々のE.coliの株である。し
かし、他の微生物の株もまた使用してよい。プラスミド
ベクターは、複製起点、選択可能のマーカー、及び宿主
微生物に適合する株に由来する制御配列を含むものが用
いられる。例えば、E.coliは、pBR322、これはBoliver
et al.（Gene 2:95,1977）によって、３つの自然界
に存在するプラスミド、そにうち２つはSalmonellaの株
から、１つはE.coliから分離されたものであるが、に由
来する断片を用いて構成されたプラスミドであるが、そ
の誘導体を用いて変異させることが出来る。pBR322は、
アンピシリン及びテトラサイクリン耐性由来の遺伝子を
含み、そのため、希望する発現ベクターの構築におい
て、保持され、あるいは破壊され得る多数の選択可能な
マーカーを提供する。一般に用いられる原核細胞の制御
配列（また、“調節因子”とも呼ばれる）は、ここで
は、随意的にオペレーター、リボソーム結合部位配列と
共に、転写開始のためのプロモーターを含むものと定義
される。蛋白質の発現を指令するために一般に用いられ
るプロモーターには、ラムダー由来のPLプロモーター及
びＮ−遺伝子リボソーム結合部位（Simatake et al.,
Nature 292:128,1981）ばかりでなく、β−ラクタマー
ゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトース（lac）（Chang et
al.,Nature 198:1056,1977）及びトリプトファン（T
rp）プロモーター系（Goeddel et al.,Nucl,Acids R
es.８:4057,1980）も含まれる。
本発明の細胞レセプター蛋白質は、以下のような性質
を持っているので、細胞内に発現すると、それは細胞膜
へ、部分的には膜を貫通して移動し、その結果、その一
部は膜に埋め込まれて止まり、一部は細胞外に伸展し、
一部は細胞内に止まる。このような埋め込まれた細胞レ
セプターを持つ形質転換された細胞は、それ自身、本発
明の方法の中で用いられてもよく、あるいは、レセプタ
ー蛋白質は膜から抽出され、精製されることも可能であ
る。
無傷の蛋白質を細胞膜に繋ぎ止める責任を負う蛋白質
の疎水性部分を欠くペプチド断片は、発現しても、膜に
埋め込まれることは期待されない。これらが細胞内に止
まるか、あるいは細胞外培地に分泌されるかは、分泌を
促進する機構（例えば、シグナルペプチド）が含まれて
いるか、否かによる。もし、分泌されれば、本発明のポ
リペプチドは培地から収穫することが出来る。もし、そ
うでなければ、細胞は解体して、所期のポリペプチドは
細胞の全内容から分離しなければならない。発現される
可能性のあるポリペプチドの特殊例は、限界はないが、
以下のものが含まれる： １）図３に示されるようなラットの骨のPTH/PTHrPレセ
プターの、推定リーダー配列を含む、アミノ酸１−192
からなるアミノ末端部分。
２）図３に示されるようなラットの骨のPTH/PTHrPレセ
プターの、推定リーダー配列を除外した、アミノ酸27−
192からなるアミノ酸末端部分。
３）図３に示されるようなラットの骨の完全長のPTH/PT
HrPレセプター。
４）PR−１（上記のような）。
５）PR−２（上記のような）。
本発明のポリペプチドは、アフィニティクロマトグラ
フィーを用いて容易に精製することが出来る。これらの
ポリペプチドの抗体、あるいはレセプター特異的リガン
ド（例、PTH/PTHrPレセプターに対するホルモンPTHとPT
HrP）は、セファロース ４ CNBr−活性化セファロー
ス（Pharmacia）のような固相支持体に共有結合し、本
発明のポリペプチドをなんらかの混入物質から分離する
のに用いてもよい。一般的には、1mgのリガンドあるい
は抗体がCNBrで活性化されたセファロースと４℃で17−
20時間（振盪下）インキュベートされる。セファロース
は、1Mトリス塩酸（pH8）で洗浄して過剰の活性部位を
ブロックする。セファロース−PTH、セファロースPTHr
P、あるいはセファロース−抗体は、次いで、粗ポリペ
プチドとりん酸緩衝食塩液（pH7.4）中、４℃で２時間
インキュベートされる（振盪下）。セファロースは、次
いで、一般的にはカラムに充填され、入念にPBSで洗浄
され（一般的にはカラム容の10倍）、水で希釈した塩酸
（pH1.85）で溶出される。溶出液は、次いで、凍結乾燥
により濃縮され、その純度は、例えば、逆層HPLCで検査
される。
抗細胞レセプター抗体 本発明の細胞レセプターあるいはレセプター断片は、
専門家にはよく知られているなにか通常の方法によっ
て、ポリクローナル抗体を産生する方法、及びモノクロ
ーナル抗体を産出する方法を含め、抗体を産生するのに
用いることが出来る。例えば、PTHレセプターの推定ア
ミノ酸配列は、他のＧ蛋白質連鎖レセプターに見出ださ
れる領域に類似した細胞外と細胞内と思われる領域（図
21を見よ）を点々配置した数個の貫膜（即ち、疎水性）
ドメインを持つと思われる蛋白質構造を示している。こ
の情報は、レセプター蛋白質の、細胞外に露出している
見込みがあり、従ってin vivoで抗体に提示されるであ
ろう領域の選択を手引きするために用いることが出来
る。このような領域の１つ、あるいはさらに多くを表現
する短いペプチドを合成し（例えば、化学的に、あるい
は組換えDNA技法により）、ポリクローナル、あるいは
モノクローナル抗体を産生するために動物（例えば、ウ
サギ、あるいはマウス）を免疫するのに用いることが出
来る。例えば、上記のPTH/PTHrPレセプターのペプチド
のあるもの（RP−１、RP−５、及びRP−６）は、標準の
技法を用いて化学的に合成され、以下の手順によりウサ
ギにポリクローナル抗体を産生するのに用いられた： 完全フロイントアジュバントで乳化された所定のペプ
チドの標品をウサギに皮内に注射する。追加免疫は、不
完全あるいは完全アジュバントで、１月間隔で注射され
る。
抗体価は２つの方法のいずれかを用いて評価される。
第一に、抗体を１％正常ウサギ血清で連続希釈し、125I
−標識PTH/PTHrPレセプター断片と常法（例えば、Segre
et al.,上記）により24時間、４℃でインキュベーシ
ョンする。結合した125I−標識PTH/PTHrPレセプター断
片は、非結合のものから、100μｌの第二抗体（抗ウサ
ギIgG、Sigma）を20倍に希釈したもの及び1mlの５％ポ
リエチレングリコールを加え、次いで、2000rpmで30
分、４℃で遠心することによって分離される。上清を除
去し、ペレットをγカウンターで、放射活性の分析をす
る。第二の方法では、自然型の（例えば、ROS 17/2.
8、OK、SaOS−２細胞）あるいは組換え（R15B、OK−Ｏ
あるいはOK−Ｈを移入されたCOS細胞あるいはCHO細胞）
PTH/PTYHrPレセプターを発現している細胞系が、連続希
釈された抗体と４℃、20℃、あるいは37℃で１−４時間
インキュベートされる。細胞をPBSで（３回）洗浄し、
125I−標識（NEM、Dupont）あるいはFITC−標識（Sigm
a）の第二抗体と２時間、４℃でインキュベートする。
洗浄後（PBSで３回）、細胞0.1MNaOHで溶解してγカウ
ンターで測定されるか（もし、125I−標識の第二抗体が
用いられた時）、あるいは１％パラフォルムアルデヒド
で固定し、蛍光顕微鏡法で検査された（もし、FITC−標
識の第二抗体が用いられた時）。
抗体を生成するもう１つの方法は、抗原として細胞
（例えば、レセプターをコードしているDNAを移入され
たCOA細胞のような哺乳類の細胞）の表面に発現されて
いる本発明の無傷の細胞レセプター蛋白質を利用する。
このような細胞は、常法、例えば、DEAE−デキストラン
移入法により、細胞レセプターの高度の発現をコード
し、且つ、指令することの出来るベクターを用いて生成
することが出来る。例えば、PTH/PTHrPレセプターに特
異的なモノクローナル抗体は以下の手順で生成される。
ラットの組換えPTHレセプターを細胞表面に高度に発
現している無傷のCOS細胞をBalb−ｃマウス（Charles
River Laboratories,Willmington,MA）の腹腔内（IP）
に注射する。マウスは４週ごとにIP注射により追加免疫
を受け、融合の３日前に、静脈内（IV）追加免疫により
超免疫される。このマウスから脾臓細胞を分離し、ミエ
ローマ細胞と常法により融合する。ハイブリドーマは、
標準のヒポキサンチン／アミノプテリン／チミン（HA
T）培地で常法に従って選別される。PTHレセプターを認
識する抗体を分泌するハイブリドーマは、最初、細胞あ
たりPTHレセプターのコピーを元来豊富に発現する細胞
系（POS17/2.8あるいはOK細胞）で、標準の免疫的技法
を用いてスクリーニングして確認される。PTHレセプタ
ーに結合することの出来る抗体を生成するこれらのハイ
ブリドーマは培養して、サブクローニングされる。次い
でモノクローナル抗体の性質を新たに検討するために、
ラヂオレセプター及びcAMP刺激アッセイを用いる二次ス
クリーニングを行うことが出来る（以下参照）。
PTHレセプターアンタゴニスト及びアゴニストのスクリ
ーニング 本発明のポリペプチド及び抗体ならびに他の化合物
は、PTH競合性、及びアンタゴニスト的あるいはアゴニ
スト的な性質について、ここに記載のアッセイを用いて
スクリーニングすることが出来る。
一例をあげると、無傷の細胞上のPTHレセプターを認
識するこれらの抗体は、PTHあるいはPTHrPとPTH/PTHrP
レセプターへの結合に対し競合する能力についてスクリ
ーニングされる。細胞表面にPTHレセプターを発現して
いる細胞は、125I−PTH類似体である125I−NlePTHある
いは125I−PTHrPと、試料のポリクローナルあるいはモ
ノクローナル抗体の存在下、４時間、15℃でインキュベ
ートされる。使用される抗体は、粗抗血清、細胞培地、
あるいは腹水由来のものか、あるいは精製された形のも
のである。インキュベーション後、細胞は結合緩衝液
（例えば、生理食塩水）で洗浄、融解され、ガンマ−カ
ウンターを用いて放射活性を定量分析される。PTHレセ
プターへのPTH類似体の結合を低減する抗体は、競合
的、低減しないものは非競合的と分類される。
抗体及びポリペプチドを含め、化合物は、それらのア
ゴニストあるいはアンタゴニストとしての性質につき、
上記のcAMP蓄積、細胞内カルシウム、及び／あるいはイ
ノシトールりん酸のアッセイを用いてスクリーニングす
ることが出来る。細胞表面上にPTHレセプターを発現し
ている細胞は、PTH、PTHレセプター抗体、あるいは両者
を組み合わせたものと、2mMIBMX（３−イソブチル−１
−メチル−キサンチン、Sigma,St.Louis,MO）の存在
下、５−60分間、37℃でインキュベートされる。サイク
リックAMPの蓄積は、上述のように、特異的ラジオイム
ノアッセイによって測定される。PTHレセプターへの結
合に対してPTHと競合し、且つ、PTHのcAMP蓄積に対する
効果を阻害する化合物は、競合的PTHアンタゴニストと
見做される。反対に、PTHレセプターへのPTHの結合と競
合しないが、なお、PTHによるcAMP蓄積促進を阻害する
（恐らくは、レセプター活性化部位を妨害することによ
り）化合物は、非競合的アンタゴニストと見做される。
PTHレセプターへの結合に対しPTHと競合し、PTHの存在
あるいは非存在下にcAMPの蓄積を刺激する化合物は競合
的アゴニストである。PTHレセプターへの結合に対してP
THと競合しないが、PTHの存在あるいは非存在下に、な
お、cAMP蓄積を刺激する能力があるか、あるいはPTH単
独によって観察されるよりも高い蓄積を刺激する化合物
は、非競合的アゴニストと見做される。
使用例 本発明のポリペプチド、抗体、及び他の化合物は、本
発明の細胞レセプターとその特異的リガンド間の相互作
用に関連すると特徴づけられるような疾病の診断、分
類、予後、及び／あるいは処置に有用である。例えば、
高カルシウム血症及び低カルシウム血症のいくつかの型
は、PTH及びPTHrPとPTH/PTHrPレセプター（複数）間の
相互作用に関連している。高カルシウム血症は、血清の
カルシウムレベルに異常な上昇のある状態である；それ
は、しばしば、副甲状腺機能亢進症、骨粗鬆症、乳腺、
肺、及び前立腺の癌腫、食道の頭部及び頚部の類表皮
癌、多発性骨髄腫、及び副腎腫を含む他の病気に関連し
ている。低カルシウム血症は、血清カルシウムレベルが
異常に低い状態であり、例えば、甲状腺手術後に起こる
有効PTHの不足から生じることがある。
初めの例では、本発明の化合物は、診断薬の製造に用
いられ、これらは、高カルシウム血症を診断し、種々の
高カルシウム状態を区別する、即ち、PTHあるいはPTHrP
によって媒介される高カルシウム血症（例えば、副甲状
腺機能亢進症及び悪性の体液性高カルシウム血症）を、
これらの因子を含まぬ病気（例えば、骨に直接接触して
いる悪性腫瘍の存在によって媒介される局所的骨軟化
症、及び破骨細胞活性化因子（インターロイキン）、リ
ンホトキシン、カルシトリオール、タイプＥプロスタグ
ランディン、及びビタミンＤ様ステロールのような体液
性因子の増大によって媒介されるいくつかの希少型悪性
腫瘍関連の高カルシウム血症）から区別するために用い
られる。
診断の１つの方法においては、血清の総カルシウム及
び／あるいはイオン化されたカルシウムのレベルは、本
発明のPTHあるいはPTHrPアンタゴニストの投与の前後に
常法によって測定される。PTHあるいはPTHrP関連の高カ
ルシウム血症は、本発明のアンタゴニストの投与後の血
清カルシウムレベルの低下として検出することが出来
る。対照的に、PTHあるいはPTHrP以外の因子によって媒
介される高カルシウム血症状態に対しては、血清カルシ
ウムレベルはアンタゴニストの投与後でさえ、不変のま
まの筈である。
本発明の他の診断的応用として、PTHあるいはPTHrPに
関連する癌、例えば、悪性の体液性高カルシウム血症に
関連する癌、を診断するために、及び、癌治療の間、PT
HあるいはPTHrPのレベルを監視するために、生物的試料
中のPTHあるいはPTHrPのレベルの測定が可能でなる。こ
の方法には、本発明の組換え副甲状腺ホルモンレセプタ
ーの、組織試料に存在するPTHあるいはPTHrPへの結合
を、ここに記述されている結合アッセイを用いて、測定
することが含まれている。結合のレベルは、直接測定す
ることも出来る（例えば、放射標識をしたPTHレセプタ
ーを用い、内在性PTHに結合する放射能をアッセイする
ことによって）。代わりに、試料（例えば、組織切片）
へのPTHレセプターの結合は、組織切片をPTHレセプター
に特異的な抗体で、標準の免疫技法（Clin et al.,Hy
bridoma ５:339,1986）を用い染色して追跡することが
出来る。
第三の診断的アプローチでは、細胞系を（Ausubel e
t al.,Current Protocols in Molecular Biology,
Wiley Publishers,New York,1987に記載されている方
法により）適当なプロモーターに連結されたPTHレセプ
ター遺伝子で安定に移入することが出来る。代わりに、
PTH/PTHrPレセプターは、真核のベクター、即ち、pcDNA
Iから発現され、そして変異DHFR遺伝子を共移入して、
メトトレキサート選択（Simonsen et al.,Proc.Natl.
Acad.Sci.,80:2495−2499、1983）を経てさらに遺伝子
の増幅を可能にすることが出来る。遺伝子のこのような
高度の発現によって、PTHあるいはPTHrPに超感受性であ
る不滅の細胞系が生成される。このような細胞は、PTH
あるいはPTHrPの血液レベルを検出するための特に有用
な手段を提供する。このような細胞系は、上昇したPTH
あるいはPTHrPレベルを伴う状態（例えば、上記の状
態）、あるいは、PTHあるいはPTHrPの異常に低いレベル
を伴う状態（例えば、上記の状態）の診断に用いること
が出来る。このような細胞系は、また、高カルシウム血
症あるいは低カルシウム血症の治療の間に、夫々、PTH
あるいはPTHrPレベルの退行あるいは増昇の監視に有用
である。
高カルシウム血症の疑いのある患者は、本発明の化合
物を用いて治療してもよい。症状は突如として現れるこ
とがあり、逆転しなければ致命的なこともあり得るので
早急な介入が重要である。１つの応用において、血清カ
ルシウムレベルは、PTHあるいはPTHrPのアンタゴニスト
を含む、即座の治療の１コースで安定化する。この様な
アンタゴニストには、PTHレセプター媒介による細胞の
活性化に介入することが決定されている（ここに記述の
アッセイにより）本発明の化合物が含まれる。アンタゴ
ニストを投与するために、適当な抗体あるいはペプチド
は、一般に、生理食塩水のような適当な担体中に調剤す
ることんいよって薬剤の製造に用いられ、PTHレセプタ
ーへのPTHあるいはPTHrPの結合に対し適切な競合を提供
する用量で、静脈内注射される（例えば、血清カルシウ
ムレベルを10mg/dl以下に下げるのに十分な用量）。代
表的な用量は、一日当たり、体重1kgにつき、抗体ある
いはペプチド、1ngから10mgである。治療は、許容カル
シウムレベル（即ち、レベルは10.1mg/dl以下）の長期
維持のため、必要な時は反復してもよい。これは、高カ
ルシウム血症の切っ掛けとなる、根底にある病状の緊急
処置に必要かも知れない、あるいは、それは、例えば、
骨粗鬆症のような病状の長期にわたる処置に用いてもよ
い。
他の応用において、本発明の方法に従ってアゴニスト
であると特徴付けづけられている本発明の化合物は、治
療上、例えば、副甲状腺の部分的あるいは完全な外科的
除去からおこる低カルシウム血症の処置に用いられる。
アゴニストは、適当な担体（例えば、生理食塩水）中で
調剤され、血清のカルシウムを許容レベル（即ち、およ
そ8mg/dl）までの上昇をもたらす用量で、出来れば静脈
内投与されるのが望ましい。有用な用量範囲は、１日、
体重1kg当たり、アゴニスト1ngから10mgである。適切な
血清カルシウムレベルを維持するために必要な場合、処
置を繰り返すことも出来る。長期の処置は、副甲状腺切
除を受けた患者に必要なことがある。
本発明の核酸もまた治療のために用いることが出来
る。PTHレセプターmRNA（あるいはPTHレセプターmRNAに
アンチセンスであるRNAを表現する核酸構成）にアンチ
センスであるオリゴヌクレオチドは、抗癌治療として用
いられることもある。このアプローチは、例えば、PTH
レセプター、PTHあるいはPTHrPの量あるいは活性を増大
するゲノムの再配列あるいは増幅から生じる高カルシウ
ム血症に対して有用である。この方法には、in vivo
で、アンチセンスオリゴヌクレオチドを癌細胞に挿入す
ることが含まれている。アンチセンス鎖は、内在性PTH
レセプターmRNAとハイブリッドを形成して、蛋白質の翻
訳を妨害し、それによって、この様な細胞におけるPTH
レセプターの生成を低下させ、PTH/PTHrP関連の腫瘍増
殖を抑制する。アンチセンスの設計及び宿主細胞への挿
入方法は、例えば、Weinberg et al.,U.S.特許番号4,
740,463に記載されており、ここでは引用して組み込ま
れている。本発明のOK−H,OK−Ｏ及びR15BPTH/PTHrPレ
セプターの生化学的特徴の検討は、PTHのそのレセプタ
ーとの相互作用によって引き起こされることが現在知ら
れている２つの伝達経路は別個のものであり、分別され
るかも知れないことを示している。これらレセプターの
予想アミノ酸配列は、イノシトールりん酸代謝を検出可
能な程度に活性化するようには見えないOK−Ｈは、OK−
ＯあるいはR15Bよりも70アミノ酸分短いことを示唆して
いる。本発明の配列とここに開示されている情報を用い
て、いかなる動物種からのPTH/PTHrPレセプター遺伝子
にせよ、これをクローン化、次いで改変して（例えば、
部位特異的変異誘発により）、ホスホリパーゼＣを活性
化しないPTH/PTHrPレセプターを生成することが出来
る。このことは、骨の再吸収及び骨の造成も含め、PTH
によって仲介される種々の作用を分別する可能性を示す
ものであり、骨粗鬆症のような骨の疾病の治療に対して
大きな重要性を持つ。
PTHレセプターをコードしている本発明の核酸は、ま
た、選択された組織特異的プロモーター及び／あるいは
エンハンサーに連鎖し、その結果生じたハイブリッド遺
伝子を、常法により（例えば、Leder et al.,U.S.特
許番号4,736,866に記述され、ここには参照して組み込
まれているような）、初期の分化段階にある動物の胚
（例えば、受精した卵母細胞）に導入して形質転換した
動物を作り出し、選択した組織（例えば、骨のオステオ
カルシンプロモーター）にPTHレセプターを高レベルで
発現することが出来る。この様なプロモーターは、形質
転換動物におけるPTHレセプターの組織特異的発現を指
令するために用いられる。利用されるPTHレセプターの
型は、用いられる動物種のものに類似のPTHレセプター
をコードしている型、あるいは、それは、別種のPTHレ
セプター類自体をコードすることも出来る。１つの特例
において、形質転換されたニワトリが、ニワトリの輸卵
管に高レベルの発現を指令するプロモーターからPTHレ
セプターを発現するように工作された。このような動物
は、高いカルシウム含量と、従ってより固い殻を持つ卵
を産むことが期待される。
他の実施態様 他の実施態様は、以下の特許請求の範囲内にある。例
えば、本発明の核酸には、トリ、あるいは有袋類、げっ
歯類、またはヒトのような哺乳類を含むいかなる脊椎動
物種にせよ、これらから本来分離された遺伝子、あるい
はcDNAあるいはRNAを包含する。オポッサム、ラット、
及びヒトのような多様な動物種からのPTHレセプターに
対して証明された高度の相同性は、ここに開示されたPT
Hレセプターの分離方法が、多様な動物種からの関連し
た細胞レセプターの分離に広く応用されることを示唆し
ている。
DNA及びアミノ酸配列のコンピュータ寄託 （１）一般情報 （ｉ）申請者 Segre,Gino V. Kornenberg,Henry M. Abou−Samra,Abudul−Badi Juppner,Harald Potts,John T.,Jr. Schipani,Ermestina （ii）発明の名称：副甲状腺ホルモンレセプター及び
これをコードしているDNA （iii）配列の数:3 （iv）通信住所 （Ａ）受信者 Fish ＆ Richardson （Ｂ）通り 225 Franklin Street （Ｃ）市 Boston （Ｄ）州 Massachusetts （Ｅ）国 U.S.A. （Ｆ）郵便番号 02110−2804 （ｖ）コンピュータの解読可能型 （Ａ）媒体タイプ:3.5"ディスケット、1.44メガビ
ット記憶容量 （Ｂ）コンピュータ:IBM PS/2 モデル 50Zある
いは55X （Ｃ）作動系:IBM P.C.DOS（バージョン3.30） （Ｄ）ソフトウエア：ワードパーフェクト（バージ
ョン 5.0） （vi）現在の申請データ： （Ａ）申請番号： （Ｂ）提出日時： （Ｃ）分類： （vii）以前の申請データ （Ａ）申請番号:07/681,702 （Ｂ）提出日時： （viii）代理人／代理事務所： （Ａ）姓名:Paul T.Clark （Ｂ）登録番号:30,162 （Ｃ）照会／証明書番号:00786/071001 （ix）遠距離通信情報： （Ａ）電話：（617）542−5070 （Ｂ）テレファックス：（617）542−8906 （Ｃ）テレックス:200154 （２）配列番号:1に対する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:1862 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （xi）配列 （２）配列番号:2に対する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:1863 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （xi）配列 （２）配列番号:3に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:2051 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （xi）配列 （２）配列番号:4に対する情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ:2010塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii）配列の種類:DNA （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：コード配列 （Ｂ）存在位置:28...1806 （xi）配列 請求されているものは以下の通りである：
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 7/08 Ｃ０７Ｋ 16/28 14/705 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 16/28 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/566 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 5/00 Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 アボウサムラ アブダルバディ アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 プレインビル フォー コロニアルウエ イ (72)発明者 ジャプナー ハラルド アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ボストン エイト ハリスストリート (72)発明者 ポッツ ジョーン テー ジュニア アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ウェストニュートン チェスナットスト リート129 (72)発明者 シパニ アーネスティーナ アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ボストン フォー ロングフェロープレ イス アプト1004 (56)参考文献 特開 昭64−13100（ＪＰ，Ａ) Ｃｈｏｎ，Ｄ．Ｖ．ｅｔ ａｌ，’Ｃ ａｌｃｉｕｍ ｒｅｇｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｏｎｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓ ｍ．Ｂａｓｉｃ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃ ａｌ ａｓｐｅｃｔｓ：ｈｏｒｍｏｎｅ ｓ ａｎｄ ｂｏｎｅ ｍｅｔａｂｏｌ ｉｓｍ’，ｐ．39−44 ＴＷＥＮＴＹ−ＳＥＶＥＮＴＨ ＡＮ ＮＵＡＬ ＭＥＥＴＩＮＧ ＯＦ ＴＨ Ｅ ＡＭＥＲＩＣＡＮ ＳＯＣＩＥＴＹ ＦＯＲ ＣＥＬＬ ＢＩＯＬＯＧＹ, Ｖｏｌ．105，Ｎｏ．４，Ｐｔ．２ （1987）ｐ15ａ−72 Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ254，（1991 年11月）ｐ．1024−1026 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．89，Ｎｏ．７ （1992年４月１日）ｐ．2732−2736 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C07K 7/08 C07K 14/705 C07K 16/28 C12P 21/00 - 21/08 C12Q 1/68 ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (35)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】脊椎動物の副甲状腺ホルモンレセプターを
    コードするDNAであって、以下（１）または（２）に記
    載のDNA。 （１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペ
    プチドをコードしているDNA。 （２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、前記
    副甲状腺ホルモンレセプターとして機能を保持し得る範
    囲で一つ以上のアミノ酸が欠失、置換、付加または挿入
    されたポリペプチドをコードしたDNA。
  2. 【請求項２】脊椎動物の副甲状腺ホルモンレセプターを
    コードするDNAであって、以下（１）または（２）に記
    載のDNA。 （１）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペ
    プチドをコードしているDNA。 （２）配列番号３に記載のアミノ酸配列において、前記
    副甲状腺ホルモンレセプターとして機能を保持し得る範
    囲で一つ以上のアミノ酸が欠失、置換、付加または挿入
    されたポリペプチドをコードしたDNA。
  3. 【請求項３】脊椎動物の副甲状腺ホルモンレセプターを
    コードするDNAであって、以下（１）または（２）に記
    載のDNA。 （１）配列番号４に記載されたアミノ酸配列からなるポ
    リペプチドをコードしたDNA。 （２）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、前記
    副甲状腺ホルモンレセプターとして機能を保持し得る範
    囲で一つ以上のアミノ酸が欠失、置換、付加または挿入
    されたポリペプチドをコードしたDNA。
  4. 【請求項４】脊椎動物の副甲状腺ホルモンレセプターを
    コードするDNAであって、以下（１）または（２）に記
    載のDNA。 （１）配列番号１に示されているDNA配列のうちのコー
    ド領域からなるDNA。 （２）配列番号１に記載のDNA配列のうちのコード領域
    と高度緊縮条件下でハイブリッドを形成し得るDNAであ
    って、該DNAによりコードされるポリペプチドが前記副
    甲状腺ホルモンレセプターとしての機能を有するDNA。
  5. 【請求項５】脊椎動物の副甲状腺ホルモンレセプターを
    コードするDNAであって、以下（１）または（２）に記
    載のDNA。 （１）配列番号３に記載のDNA配列のうちのコード領域
    からなるDNA。 （２）配列番号３に記載のDNA配列のうちのコード領域
    と高度緊縮条件下でハイブリッドを形成し得るDNAであ
    って、該DNAによりコードされるポリペプチドが前記副
    甲状腺ホルモンレセプターとしての機能を有するDNA。
  6. 【請求項６】脊椎動物の副甲状腺ホルモンレセプターを
    コードするDNAであって、以下（１）または（２）に記
    載のDNA。 （１）配列番号４に記載のDNA配列のうちコード領域か
    らなるDNA。 （２）配列番号４に記載のDNA配列のうちのコード領域
    と高度緊縮条件下でハイブリッドを形成し得るDNAであ
    って、該DNAによりコードされるポリペプチドが前記副
    甲状腺ホルモンレセプターとしての機能を有するDNA。
  7. 【請求項７】請求項１乃至６のいずれかに記載のDNAを
    保持したベクター。
  8. 【請求項８】請求項１乃至６のいずれかに記載のDNAま
    たは請求項７に記載のベクターを保持する細胞。
  9. 【請求項９】請求項８に記載されている細胞であって、
    前記細胞が、前記DNAまたはベクターから前記副甲状腺
    ホルモンレセプターを発現させる能力があることを特徴
    とする細胞。
  10. 【請求項１０】実質的に同質な細胞群であって、前記細
    胞群の各々が請求項１乃至６のいずれかに記載のDNAま
    たは請求項７に記載のベクターを保持することを特徴と
    する細胞群。
  11. 【請求項１１】副甲状腺ホルモンまたは副甲状腺ホルモ
    ン関連蛋白質と結合し得るポリペプチドをコードした請
    求項１乃至６のいずれかに記載のDNA。
  12. 【請求項１２】請求項１乃至６のいずれかに記載のDNA
    によりコードされた副甲状腺ホルモンレセプター。
  13. 【請求項１３】ポリペプチドを生成する方法であって、 副甲状腺ホルモンレセプターをコードした請求項１乃至
    ６のいずれかに記載のDNAを保持する細胞を調製する工
    程と前記DNAからポリペプチドを発現させ得る条件で前
    記細胞を培養する工程とを含む、ポリペプチド生成方
    法。
  14. 【請求項１４】副甲状腺ホルモンレセプター遺伝子また
    はcDNAの一部を含む一本鎖DNAであって、前記一部が少
    なくとも18ヌクレオチド長であり、前記副甲状腺ホルモ
    ンレセプター遺伝子またはcDNAが請求項１乃至６のいず
    れかに記載のDNAであることを特徴とする一本鎖DNA。
  15. 【請求項１５】請求項14に記載されている一本鎖DNAで
    あって、前記一部が副甲状腺ホルモンレセプターをコー
    ドした請求項１乃至６に記載のDNAの全長よりも短いこ
    とを特徴とする一本鎖DNA。
  16. 【請求項１６】請求項14または15に記載されている一本
    鎖DNAであって、前記DNAが検出可能に標識されているこ
    とを特徴とする一本鎖DNA。
  17. 【請求項１７】実質的に精製された、請求項12に記載さ
    れている副甲状腺ホルモンレセプター。
  18. 【請求項１８】請求項３に記載されているDNAの発現に
    よって生成され、実質的に精製された副甲状腺ホルモン
    レセプター。
  19. 【請求項１９】請求項12に記載されている副甲状腺ホル
    モンレセプターであって、ヒト副甲状腺レセプターであ
    ることを特徴とする副甲状腺ホルモンレセプター。
  20. 【請求項２０】薬学的に許容される担体中に、請求項１
    乃至６のいずれかに記載のDNAにコードされている副甲
    状腺ホルモンレセプターを含む高カルシウム血症治療用
    組成物。
  21. 【請求項２１】請求項１乃至６のいずれかに記載のDNA
    によりコードされたポリペプチドと免疫複合体を形成す
    ることができる抗体。
  22. 【請求項２２】請求項21に記載されている抗体と製剤上
    許容される担体とを含む高カルシウム血症治療用組成
    物。
  23. 【請求項２３】請求項20に記載の高カルシウム血症治療
    用組成物であって、哺乳動物の血液中のカルシウムレベ
    ルを低減させる効果的な投与量又は、副甲状腺ホルモン
    または副甲状腺ホルモン関連蛋白質による哺乳動物細胞
    の副甲状腺ホルモンレセプターの活性化を抑制し得る効
    果的な投与量に構成されていることを特徴とする、高カ
    ルシウム血症治療用組成物。
  24. 【請求項２４】請求項22に記載の高カルシウム血症治療
    用組成物であって、 哺乳動物の血液中のカルシウムレベルを低減させる効果
    的な投与量又は、副甲状腺ホルモン若しくは副甲状腺ホ
    ルモン関連蛋白質による哺乳動物細胞の副甲状腺ホルモ
    ンレセプターの活性化を抑制し得る効果的な投与量に構
    成されていることを特徴とする、高カルシウム血症治療
    用組成物。
  25. 【請求項２５】副甲状腺ホルモンレセプターへの結合に
    おいて副甲状腺ホルモンと競合する能力のある化合物を
    同定する方法であって、 （ａ）候補化合物の存在下及び非存在下のそれぞれにお
    いて、請求項12に記載されている副甲状腺ホルモンレセ
    プターを副甲状腺ホルモンと接触させる工程と、 （ｂ）前記候補化合物の存在下における前記ポリペプチ
    ドの副甲状腺ホルモンへの結合レベルを、前記候補化合
    物の非存在下における前記ポリペプチドの副甲状腺ホル
    モンへの結合レベルと比較する工程とを含み、 前記候補化合物の存在下における結合レベルが、候補化
    合物の非存在下における結合レベルよりも低い場合に、
    前記候補化合物が前記レセプターへの結合において前記
    副甲状腺ホルモンと競合する能力のあることが示される
    方法。
  26. 【請求項２６】副甲状腺ホルモンレセプターへの結合に
    おいて副甲状腺ホルモン関連蛋白質と競合する能力のあ
    る化合物を同定する方法であって、 （ａ）候補化合物の存在下又は非存在下で、請求項12に
    記載されている副甲状腺レセプターを副甲状腺ホルモン
    関連蛋白質と接触させる工程と、 （ｂ）前記候補化合物の存在下における前記ポリペプチ
    ドの副甲状腺ホルモン関連蛋白質への結合レベルを前記
    候補化合物の非存在下における前記ポリペプチドの副甲
    状腺ホルモン関連蛋白質への結合レベルと比較する工程
    とを含み、 前記候補化合物の存在下における結合レベルが、候補化
    合物の非存在下の結合レベルよりも低い場合に、前記候
    補化合物が前記レセプターへの結合において前記副甲状
    腺ホルモン関連蛋白質と競合する能力のあることが示さ
    れる方法。
  27. 【請求項２７】副甲状腺ホルモンレセプターへの結合に
    おいて、副甲状腺ホルモンと競合する能力のある化合物
    を同定する方法であって、 （ａ）候補化合物の存在下または非存在下で副甲状腺ホ
    ルモンを請求項９に記載されている細胞と混合する工程
    と、 （ｂ）前記候補化合物の存在下における前記副甲状腺ホ
    ルモンへの前記レセプターの結合レベルを、前記候補化
    合物の非存在下における前記副甲状腺ホルモンへの前記
    レセプターの結合レベルと比較する工程とを含み、 前記候補化合物の存在下における結合レベルが、候補化
    合物の非存在下における結合レベルよりも低い場合に前
    記候補化合物は前記レセプターへの結合において前記副
    甲状腺ホルモンと競合する能力のあることが示される方
    法。
  28. 【請求項２８】配列番号１乃至４のいずれかに記載のDN
    A配列のコード領域のDNA配列と相同なDNA配列を同定す
    る方法であって、 ゲノムまたはcDNAライブラリーを準備する工程と、 前記ライブラリーと請求項14に記載されている一本鎖DN
    Aとを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条
    件下で接触させる工程と、 前記ライブラリーから、前記一本鎖DNAとハイブリッド
    を形成しているクローンを同定する工程とを含み、 前記ハイブリッド形成が前記クローンの中に副甲状腺ホ
    ルモンレセプターをコードしたDNA配列と相同なDNA配列
    が存在することが示されることを特徴とする方法。
  29. 【請求項２９】請求項１乃至６のいずれかに記載のDNA
    配列を含む外来遺伝子を保持するトランスジェニック非
    ヒト脊椎動物。
  30. 【請求項３０】請求項17または18に記載の副甲状腺ホル
    モンレセプターであって、診断又は治療に使用されるこ
    とを特徴とする副甲状腺ホルモンレセプター。
  31. 【請求項３１】請求項21に記載されている抗体であっ
    て、治療及び診断に用いることを特徴とする抗体。
  32. 【請求項３２】請求項20に記載されている高カルシウム
    血症治療用組成物であって、 副甲状腺ホルモン若しくは副甲状腺ホルモン関連蛋白質
    による動物の副甲状腺ホルモンレセプターの活性化を阻
    害するための治療又は、動物の血中カルシウムレベルを
    低減するための治療に用いることを特徴とする、高カル
    シウム血症治療用組成物。
  33. 【請求項３３】請求項22に記載されている高カルシウム
    血症治療用組成物であって、 副甲状腺ホルモン若しくは副甲状腺ホルモン関連蛋白質
    による動物の副甲状腺ホルモンレセプターの活性化を阻
    害するための治療、又は、動物の血中カルシウムレベル
    を低減するための治療に用いることを特徴とする、高カ
    ルシウム血症治療用組成物。
  34. 【請求項３４】請求項17または18に記載されている副甲
    状腺ホルモンレセプターであって、 副甲状腺ホルモン若しくは副甲状腺ホルモン関連蛋白質
    による動物の副甲状腺ホルモンレセプターの活性化を阻
    害するための治療又は動物の血中カルシウムレベルを低
    減するための治療に用いる薬剤の製造に使用されること
    を特徴とする副甲状腺ホルモンレセプター。
  35. 【請求項３５】請求項21に記載されている抗体であっ
    て、副甲状腺ホルモンまたは副甲状腺ホルモン関連蛋白
    質による動物の副甲状腺ホルモンレセプターの活性化を
    阻害するための治療又は動物の血中カルシウムレベルを
    低減するための治療に用いる薬剤の製造に利用すること
    を特徴とする抗体。
JP51003592A 1991-04-05 1992-04-06 副甲状腺ホルモンのレセプターとそれをコードしているｄｎａ Expired - Lifetime JP3464796B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US68170291A 1991-04-05 1991-04-05
US681,702 1991-04-05
PCT/US1992/002821 WO1992017602A1 (en) 1991-04-05 1992-04-06 Parathyroid hormone receptor and dna encoding same

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2003170024A Division JP2004121225A (ja) 1991-04-05 2003-06-13 副甲状腺ホルモンのレセプターとそれをコードしているｄｎａ

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH06506598A JPH06506598A (ja) 1994-07-28
JP3464796B2 true JP3464796B2 (ja) 2003-11-10

Family

ID=24736412

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP51003592A Expired - Lifetime JP3464796B2 (ja) 1991-04-05 1992-04-06 副甲状腺ホルモンのレセプターとそれをコードしているｄｎａ
JP2003170024A Withdrawn JP2004121225A (ja) 1991-04-05 2003-06-13 副甲状腺ホルモンのレセプターとそれをコードしているｄｎａ
JP2009188644A Expired - Lifetime JP4790836B2 (ja) 1991-04-05 2009-08-17 副甲状腺ホルモンのレセプターとそれをコードしているｄｎａ

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2003170024A Withdrawn JP2004121225A (ja) 1991-04-05 2003-06-13 副甲状腺ホルモンのレセプターとそれをコードしているｄｎａ
JP2009188644A Expired - Lifetime JP4790836B2 (ja) 1991-04-05 2009-08-17 副甲状腺ホルモンのレセプターとそれをコードしているｄｎａ

Country Status (7)

Country Link
US (2) US5494806A (ja)
EP (2) EP0579758B1 (ja)
JP (3) JP3464796B2 (ja)
AT (1) ATE287898T1 (ja)
CA (1) CA2107569C (ja)
DE (1) DE69233472T2 (ja)
WO (1) WO1992017602A1 (ja)

Families Citing this family (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2107569C (en) * 1991-04-05 2011-08-02 Gino V. Segre Parathyroid hormone receptor and dna encoding same
US5261686A (en) * 1992-04-06 1993-11-16 Buckler Clive E Semi-recumbent
US5942496A (en) 1994-02-18 1999-08-24 The Regent Of The University Of Michigan Methods and compositions for multiple gene transfer into bone cells
US6551618B2 (en) 1994-03-15 2003-04-22 University Of Birmingham Compositions and methods for delivery of agents for neuronal regeneration and survival
CA2221116A1 (en) * 1995-06-05 1996-12-12 Human Genome Sciences, Inc. G-protein parathyroid hormone receptor hltdg74
US6030804A (en) * 1995-06-06 2000-02-29 Human Genome Sciences, Inc. Polynucleotides encoding G-protein parathyroid hormone receptor HLTDG74 polypeptides
US5660826A (en) * 1995-06-06 1997-08-26 The Regents Of The University Of California Therapeutic sepsis treatment using antagonists to PTHrP
WO1997039131A1 (en) * 1996-04-15 1997-10-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Soluble 7-transmembrane domain g-protein-coupled receptor compositions and methods
WO1998004591A1 (en) * 1996-07-31 1998-02-05 The General Hospital Corporation Novel parathyroid hormone-related peptide analogs
SK40599A3 (en) 1996-09-26 2000-06-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antibody against human parathormone related peptides
JP3459523B2 (ja) * 1996-10-02 2003-10-20 賢二 坂本 生理活性物質の製造方法
US7473537B1 (en) 1996-12-13 2009-01-06 Nps Pharmaceuticals, Inc. Cloned glucagon-like peptide-2 receptors
US8592553B2 (en) 1996-12-13 2013-11-26 Nps Pharmaceuticals, Inc. Cloned glucagon-like peptide-2 receptors
US6077949A (en) * 1996-12-13 2000-06-20 Allelix Biopharmaceuticals, Inc. Cloned glucagon-like peptide 2 receptors
SK155799A3 (en) 1997-05-15 2000-06-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Cachexia remedy
US6183974B1 (en) * 1997-07-31 2001-02-06 The General Hospital Corporation Screening assays for G protein coupled receptor agonists and antagonists
US6107287A (en) * 1997-09-25 2000-08-22 The Regents Of The University Of California Lunasin peptides
JP2002513570A (ja) * 1998-05-01 2002-05-14 インサイト・ファーマスーティカルズ・インコーポレイテッド ヒト受容体分子
EP1151156B1 (en) * 1998-09-04 2005-03-02 Aventis Pharmaceuticals Inc. Luciferase reporter bioassay of parathyroid hormone compounds
US6720153B1 (en) 1998-09-04 2004-04-13 Aventis Pharmaceuticals Inc. Luciferase reporter bioassay of parathyroid hormone compounds
US6495662B1 (en) * 1998-10-22 2002-12-17 The General Hospital Corporation Bioactive peptides and peptide derivatives of parathyroid hormone (PTH) and parathyroid hormone-related peptide (PTHrP)
AU4217299A (en) 1998-11-30 2000-06-19 General Hospital Corporation, The Pth1r and pth3r receptors, methods and uses thereof
EP1612263A1 (en) * 1998-12-31 2006-01-04 The General Hospital Corporation PTH receptor and screening assay utilizing the same
TWI255718B (en) * 1999-07-02 2006-06-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Ameliorative agent for low vasopressin concentration
WO2001002011A1 (fr) * 1999-07-02 2001-01-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha REMEDES CONTRE LES MALADIES CAUSEES PAR PTH OU PTHrP
HUP0202218A3 (en) * 1999-07-06 2005-01-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Remedies for drug-resistant hypercalcemia
AU7734800A (en) * 1999-09-29 2001-04-30 General Hospital Corporation, The Polypeptide derivatives of parathyroid hormone (pth)
DE10014690A1 (de) * 2000-03-24 2001-10-18 Franz Wolfgang M Verfahren zur Isolierung in vito differenzierter Körperzellen
US6756480B2 (en) * 2000-04-27 2004-06-29 Amgen Inc. Modulators of receptors for parathyroid hormone and parathyroid hormone-related protein
US20050124537A1 (en) * 2000-04-27 2005-06-09 Amgen Inc. Modulators of receptors for parathyroid hormone and parathyroid hormone-related protein
AU2001252618A1 (en) 2000-04-28 2001-11-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cell proliferation inhibitors
JP4837888B2 (ja) * 2001-07-23 2011-12-14 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション コンホメーションが拘束された副甲状腺ホルモン（ｐｔｈ）類似体
EP2383296B1 (en) 2002-11-29 2017-02-22 Rsr Limited Antibody for the thyrotropin receptor and uses thereof
WO2004073587A2 (en) * 2003-02-19 2004-09-02 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with parathyroid hormone receptor 1 (pthr1)
EP1610813A4 (en) * 2003-03-19 2009-07-01 Gen Hospital Corp PARATHYROIDAL HORMONES CONFORMALLY CONFORMALLY CONSTRAINED WITH PROPELLER STABILIZERS $ G (A)
WO2005009358A2 (en) * 2003-07-17 2005-02-03 The General Hospital Corporation Conformationally constrained parathyroid hormone (pth) analogs
EP2054077A4 (en) * 2006-08-04 2010-10-13 Gen Hospital Corp POLYPEPTIDE DERIVATIVES OF PARATHYROID HORMONE (PTH)
AU2008282805B2 (en) * 2007-08-01 2014-05-01 Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. Screening methods using G-protein coupled receptors and related compositions
BR112012028949B1 (pt) 2010-05-13 2020-11-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha polipeptídeo análogo do hormônio paratireoideo, seu uso e método de produção, bem como ácido nucleico, vetor de expressão, célula e composição farmacêutica
KR102581671B1 (ko) * 2014-06-18 2023-09-22 국립연구개발법인 고쿠리츠간켄큐센터 식도암의 검출 키트 또는 디바이스 및 검출 방법
US20190177687A1 (en) * 2016-06-23 2019-06-13 Tithon Biotech Inc. Cells expressing parathyroid hormone 1 receptor and uses thereof
CN107622184B (zh) * 2017-09-29 2020-01-21 中国科学院计算技术研究所 氨基酸可信度和修饰位点定位的评估方法
JP2021516222A (ja) 2018-03-16 2021-07-01 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 副甲状腺ホルモンポリペプチドコンジュゲートおよびその使用方法
IL284533B2 (en) * 2019-01-11 2024-02-01 Radius Health Inc Methods for detecting antibodies to neutralizing thyroid hormone (PTH) and thyroid hormone-related peptide (PTHRP) analog

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4740463A (en) * 1984-04-13 1988-04-26 Massachusetts Institute Of Technology Methods and artificial genes for antagonizing the function of an oncogene
US4736866A (en) * 1984-06-22 1988-04-12 President And Fellows Of Harvard College Transgenic non-human mammals
US5217896A (en) * 1988-12-30 1993-06-08 Oncogene Science, Inc. Monoclonal antibodies recognizing parathyroid hormone-like protein
CA2107569C (en) * 1991-04-05 2011-08-02 Gino V. Segre Parathyroid hormone receptor and dna encoding same
DE69322860T2 (de) * 1992-04-03 1999-07-01 Genentech Inc Antikörper gegen alpha v beta 3 integrin
US5660826A (en) * 1995-06-06 1997-08-26 The Regents Of The University Of California Therapeutic sepsis treatment using antagonists to PTHrP

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｃｈｏｎ，Ｄ．Ｖ．ｅｔ ａｌ，’Ｃａｌｃｉｕｍ ｒｅｇｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｏｎｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｂａｓｉｃ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ：ｈｏｒｍｏｎｅｓ ａｎｄ ｂｏｎｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ’，ｐ．３９−４４
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８９，Ｎｏ．７（１９９２年４月１日）ｐ．２７３２−２７３６
Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ２５４，（１９９１年１１月）ｐ．１０２４−１０２６
ＴＷＥＮＴＹ−ＳＥＶＥＮＴＨ ＡＮＮＵＡＬ ＭＥＥＴＩＮＧ ＯＦ ＴＨＥ ＡＭＥＲＩＣＡＮ ＳＯＣＩＥＴＹ ＦＯＲ ＣＥＬＬ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１０５，Ｎｏ．４，Ｐｔ．２（１９８７）ｐ１５ａ−７２

Also Published As

Publication number Publication date
JP2010004889A (ja) 2010-01-14
JPH06506598A (ja) 1994-07-28
EP0579758A1 (en) 1994-01-26
CA2107569A1 (en) 1992-10-06
ATE287898T1 (de) 2005-02-15
JP2004121225A (ja) 2004-04-22
JP4790836B2 (ja) 2011-10-12
DE69233472T2 (de) 2006-02-09
EP0579758B1 (en) 2005-01-26
EP0579758A4 (en) 1995-11-02
CA2107569C (en) 2011-08-02
US5840853A (en) 1998-11-24
WO1992017602A1 (en) 1992-10-15
EP1586641A3 (en) 2008-04-09
DE69233472D1 (de) 2005-03-03
EP1586641A2 (en) 2005-10-19
US5494806A (en) 1996-02-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3464796B2 (ja) 副甲状腺ホルモンのレセプターとそれをコードしているｄｎａ
US5886148A (en) Parathyroid hormone receptor
AU741041B2 (en) DNA encoding galanin GALR3 receptors and uses thereof
US7842453B2 (en) Methods of identifying modulators of ChemerinR polypeptides
US20090081729A1 (en) Compositions and Methods Comprising a Ligand of ChemerinR
JPH07503611A (ja) ソマトスタチン受容体
JP2002502589A (ja) ４５個のヒト分泌タンパク質
JP2002500008A (ja) 哺乳動物ｅｄｇ−５受容体相同体
JP2002512781A (ja) Ｇタンパク質共役型７ｔｍ受容体（ａｘｏｒ−１）
US6599718B1 (en) Growth hormone secretagogue related receptors and nucleic acids
JPH10327889A (ja) 新規ｇ−タンパク質結合レセプター（ｈｆｇａｎ７２ｙ）
JPH1156377A (ja) Ｇタンパク質共役型受容体ｈｆｉａｏ４１
US7132260B2 (en) DNA encoding parathyroid hormone receptor
KR100375260B1 (ko) 글루카곤수용체
US7150974B1 (en) Parathyroid hormone receptor binding method
JP2000083669A (ja) Ｃｘｃｒ４ケモカイン受容体のヒトスプライス変異体ｃｘｃｒ４ｂ
AU782848B2 (en) DNA encoding SNORF62 and SNORF72 receptors
US20070213510A1 (en) Compositions and methods comprising a ligand of ChemerinR
JP2002512016A (ja) Ｅｄｇファミリー遺伝子、ヒトｈ２１８
JPH1175866A (ja) マウスＦｒｉｚｚｌｅｄ−６ 遺伝子に類似したヒト７ＴＭ受容体
US20100267138A1 (en) Compositions and methods comprising a ligand of chemerinr
US7470772B2 (en) Antibody that specifically binds to Chemerin receptor ligand precursor
US20040248245A1 (en) Zinc activated ion channel
US20030139589A1 (en) G protein coupled receptor A4
CA2284857A1 (en) G protein coupled receptor a4

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080822

Year of fee payment: 5

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090822

Year of fee payment: 6

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100822

Year of fee payment: 7

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110822

Year of fee payment: 8

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110822

Year of fee payment: 8

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120822

Year of fee payment: 9

EXPY Cancellation because of completion of term
FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120822

Year of fee payment: 9