KR100375260B1 - 글루카곤수용체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 글루카곤 수용체를 암호화하는 DNA 절편을 포함하는 분리된 DNA 분자를 제공한다. 또한, 글루카곤 수용체를 암호화하는 제1 DNA 절편, 및 이에 작동적으로 연결된, 상기 제1 DNA 절편의 발현에 필요한 부가적 DNA 절편을 포함하는 DNA 작제물, 및 이러한 DNA 작제물을 함유하는 숙주세포가 제공된다. 본 발명은 또한, (a) 재조합 글루카곤 수용체로의 특정 화합물의 결합 및 특정 반응 경로(response pathway)를 통한 관련된 반응을 허용하기에 충분한 조건 및 시간하에, 상기 화합물을, 글루카곤 효능제 존재하에 상기 반응 경로와 연계된 상기 재조합 글루카곤 수용체에 노출시키는 단계; 및
(b) 글루카곤 효능제 단독에 의한 반응 경로의 자극에 대해, 글루카곤 수용체로의 상기 화합물의 결합으로부터 야기되는 반응 경로의 자극 감소를 검출하여, 이로부터 글루카곤 길항제의 존재를 측정하는 단계들을 포함하여, 글루카곤 길항제의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.

Description

글루카곤 수용체{Glucagon receptors}
글루카곤은 췌장 소도(islet)의 α 세포에 의해 생성되는 29개 아미노산 호르몬이다. 글루카곤은 인슐린-길항작용 호르몬으로서 작용하여, 사람을 포함하여 많은 동물에 있어서 글루코스 수준을 정상적으로 유지시키는데 관련이 있다. 특히, 인슐린은 혈중 글루코스 수준을 신속하게 감소시키는 것으로 공지되어 있는 반면, 글루카곤은 혈중 글루코스 수준의 상승에 관여함으로써 이들 효과를 상쇄시킨다.
글루카곤과 인슐린의 상호작용은 체내 글루코스 수준 유지에 매우 중요하다. 글루카곤 또는 인슐린의 불균형은 진성 당뇨병 및 당뇨병 케토아시도시스와 같은 몇몇 질환의 원인으로 여겨진다. 한 이론에 의하면, 진성 당뇨병의 과혈당 상태는 글루코스 이용 저하(under-utilization)(감소된 인슐린에 기인)에 의해서뿐 아니라 글루카곤의 상승된 농도에 기인한 글루코스의 과잉생성에 의해서 초래될 수도 있다[참조: Uinger, "Diabetes and the alpha cell," Diabetes 25:136-151, 1976; Unger and Orci, "The essential role of glucagon in the pathogenesis of diabetes mellitus," Lancet 1:14-16, 1975].
글루카곤 연구의 중요한 요소이자, 진성 당뇨병과 같은 질환에 있어 글루카곤의 작용 부위는 글루카곤 수용체이며, 이는 글루카곤과 결합시 세포에 시그날을 전달시켜 당원분해(글리코겐 가수분해), 및 당질신생(글루코스 합성)을 촉발시키게 된다.
현재, 글루카곤의 효과는 부분적으로 사이클릭 아데노신 모노포스페이트(cAMP)의 세포내 수준 상승에 의해 매개되는 것으로 간주된다. 특히, 세포 수용체로의 글루카곤 결합은 아데닐레이트 사이클라제를 활성화시켜 cAMP를 생성시키고, 이로써 세포내 cAMP 수준이 향상된다. 이와 같은 cAMP의 세포내 수준 상승은 당원 분해 및 당질신생을 야기시켜 간에 의한 글루코스 생성이 증가하게 된다[Unson et al., "Biological Activities of des-His-[Glu9] Glucagon Amide, a Glucagon Antagonist, "Peptides 10:1171-1177, 1989],
하지만, 당원분해 및 당질신생의 자극에 대한 추가의 경로 또한 제시되었다. 특히, 글루카곤은, G-단백질을 통해 포스포리파제 C에 커플링된 간세포막 수용체에 결합하는 것으로 보고되었다. 자극시, 이 단백질은 포스파티딜이노시톨 4,5 비포스페이트의 분해를 야기시켜 제2 메신저인 노시톨 트리포스페이트 및 1,2 디아실글리세롤을 생성시킨다[참조: Wakelam et al., "Activation of two signal-transduction systems in hepatocytes by giucagon" Narure 323:68-71, 1986: Unson et al., Peprides 10:1171-1177, 1989, and Pittner and Fain. Biochem. J. 277:371-378, 1991]. 글루카곤에 의한 이노시톨 인지질 대사의 자극이 추가의 경로이며, 이를 통해 글루카곤이 당원분해 및 당질신생을 자극할 수 있다.
본 발명은 글루카곤 수용체(들)를 기술하며, 추가로 기타 관련된 이점을 기술한다.
발명의 요약
본 발명의 하나의 양태내에는, 글루카곤 수용체를 암호화하는 분리된 DNA 분자가 제공된다. 본원에서 사용된 용어 "분리된 DNA 분자"란 분리되거나, 떨어져서 단독으로 위치하거나, 기타 성분과 분리되어 있는 DNA 분자 또는 서열을 의미한다. 예를 들면, DNA 분자는, 이것이 게놈내에서 천연적으로 결합되어 있는 기타 염색체 서열을 포함한 다른 DNA 분자와 분리되어 있는 경우, 특히 다른 구조 유전자가 제거된 경우, 분리된 것이다. 분리된 DNA 분자는 이에 천연적으로 연결되어 있는 5' 및 3' 비해독 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 하나의 양태내에서, 글루카곤 수용체는 래트 및 사람 글루카곤 수용체로 이루어진 그룹중에서 선택된다. 또 다른 양태내에서, 당해 DNA 분자는 서열확인번호 14의 뉴클레오타이드 145 내지 1599의 서열을 포함한다. 또 다른 양태내에서, 당해 DNA 분자는 서열확인번호 15의 1번 아미노산 메티오닌으로부터 485번 아미노산 트레오닌까지의 아미노산 서열을 포함하는 글루카곤 수용체를 암호화한다. 또 다른 양태내에서, 당해 DNA 분자는 서열 확인번호 24의 뉴클레오타이드 53 내지 1486의 서열을 포함한다. 또 다른 양태에 있어, 당해 DNA 분자는 서열확인번호 25의 1번 아미노산 메티오닌으로부터 477번 아미노산 페닐알라닌까지의 아미노산 서열을 포함하는 글루카곤 수용체를 암호화한다. 또한, 글루카곤 수용체를 암호화하는 제1 DNA 절편 및 이에 작동적으로 연결된DNA 절편 발현에 필요한 부가적 DNA 절편을 포함하는 DNA 작제물, 이러한 작제물을 함유하는 숙주세포 및 글루카곤 수용체를 암호화 하는 DNA 절편의 발현을 촉진하는 조건하에서 숙주 세포를 배양시킴을 포함하여, 글루카곤 수용체를 생산하는 방법이 제공된다.
또 다른 본 발명의 양태내에서, 분리된 글루카곤 수용체 펩타이드가 제공된다. 하나의 양태내에서, 서열확인번호 15의 28번 아미노산 글루타민으로부터 142번 아미노산 티로신까지의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 글루카곤 수용체 펩타이드가 제공된다.
또 다른 본 발명의 양태내에서, 글루카곤 수용체에 특이적으로 결합하는 분리된 항체가 제공된다. 한 양태에 있어, 항체는 모노클로날 항체이다. 추가 양태에 있어, 글루카곤의 글루카곤 수용체로의 결합을 차단시킬 수 있는 모노클로날 항체가 제공된다. 또한, 상기 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마도 제공된다.
또 다른 본 발명의 양태내에서,
(a) 재조합 글루카곤 수용체로의 화합물의 결합 및 특정 반응 경로(responsc pathway)를 통한 관련된 반응을 허용하기에 충분한 조건 및 시간하에, 상기 화합물을, 글루카곤 효능제의 존재하에 상기 반응 경로와 연계된 재조합 글루카곤 수용체에 노출시키는 단계, 및
(b) 글루카곤 효능제 단독에 의한 반응 경로의 자극에 비해, 상기 화합물이 글루카곤 수용체에 결합함으로써 야기되는 반응 경로의 자극이 감소됨을 탐지하여, 이로부터 글루카곤 길항제의 존재를 측정하는 단계들을 포함하여, 글루카곤 길항제의 존재를 탐지하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다양한 양태내에서, 반응 경로는 막-결합된 아데닐레이트 사이클라제 반응 경로이고, 탐지 단계는 막-결합된 아데닐레이트 사이클라제 반응 경로에 의한 사이클릭 AMP 생성 감소를 측정함을 포함한다. 본 발명의 또 다른 양태내에서, 반응 경로는 루시퍼라제 리포터 시스템을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태내에서, 프로브는 12개 이상의 뉴클레오타이드로 제공되며, 이 프로브는 글루카곤 수용체를 암호화하는 핵산과 하이브리드화할 수 있다.
본 발명의 상기 및 기타 양태는 하기 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참조하여 명백해질 것이다. 또한, 다양한 참조문헌이 하기에 기술되어 보다 상세한 특정 방법 또는 조성물(예, 플라스미드등)을 기술하므로, 이의 전체가 참조로서 인용되고 있다.
도면의 간단한 설명
제1도는 대표적인 글루카곤 수용체 구조를 나타낸다.
사용된 약어는 하기와 같다:
점선내에 위치하는, EATD는 세포외 아미노-말단 도메인이고; CM은 세포막이고; 큰 점선내에 위치하는 ED는 주효체 도메인이고; 1ID는 제1 세포내 루프 도메인이고; 2ID는 제2 세포내 루프 도메인이며; 3ID는 제3 세포내 루프 도메인이고; C-ID는 카복시-말단 세포내 도메인이며; 1ELD는 제1 세포외 루프 도메인이고; 2ELD는 제2 세포외 루프 도메인이며; 3ELD는 제3 세포외 루프 도메인이고; TMD1은 제1막통과(transmembrane) 도메인이며; TMD2는 제2 막통과 도메인이고; TMD3은 제3 막통과 도메인 이며; TMD4는 제4 막통과 도메인이고; TMD5는 제5 막통과 도메인이며; TMD6는 제6 막통과 도메인이고; TMD7은 제7 막통과 도메인이다.
제2도는 래트 글루카곤 수용체의 소수성을 나타내는 그래프이다.
제3도는 글루카곤 수용체에 대한125I-글루카곤 결합을 나타내는 그래프이다.
제4도는 글루카곤 수용체에 대한 겉보기 Kd의 스캐차드(Scatchard) 분석을 나타내는 그래프이다.
제5도는 래트의 글루카곤 수용체의 아미노산 서열로서, 막통과 도메인을 윗줄그었다.
본 발명은 일반적으로 세포 표면 수용체, 보다 특정하게는 글루카곤 수용체에 관한 것이다.
상기에서, 본 발명은 글루카곤 수용체를 암호화하는 분리된 DNA 분자를 제공한다. 이의 천연 구조에 있어, 글루카곤 수용체는 세포외 아미노 말단 도메인 및 몇몇 보다 작은 외부 및 내부 도메인으로 이루어진 막 결합된 단백질로서 존재하는 것으로 간주된다(제1도). 본 발명의 맥락상, "글루카곤 수용체"는 이러한 단백질 및 실질적으로 유사한 유도체를 의미한다. 유도체는, 보존된 아미노산 치환체 및/또는 아미노산의 경미한 부가, 치환 또는 결실을 지닌 유전자 조작된 변이체, 및 대립형질 변이체를 포함한다. 본 발명의 글루카곤 수용체는 글루카곤과 결합하여 글루카곤에 의해 제공되는 시그날을 세포로 전달시킬 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 글루카곤 수용체는 Kd값이 100nm 이하, 보다 바람직하게는 50nM이하, 가장 바람직하게는 33nM 이하의 글루카곤과 결합할 수 있다. 글루카곤 수용체에 의한 글루카곤 결합을 측정하는데 사용될 수 있는 대표적 검정법이 하기 실시예 3 및 6에 보다 상세하게 기술되어 있다.
전형적으로 시그날 전달은 반응 경로가, 일반적으로 (항상은 아님) 막-결합된 수용체와 직접 연계된 외부 자극에 의해 활성화되는 경우 발생한다. 반응 경로는 통상 반응 세포주로부터의 세포외 매트릭스 분비, 호르몬 분비, 화학주성, 분화 또는 반응 세포의 세포분열의 개시 또는 억제와 같은 세포 반응을 유도한다. 본원중 반응 경로에 대한 수용체의 연계는 반응 경로의 직접적 활성화 또는, G단백질 같은 제2 메신저를 통해 시그날을 전달시켜 세포 반응 경로를 활성화시킴을 의미한다.
글루카곤 수용체에 의한 다양한 세포반응 경로, 예를 들면 아데닐레이트 사이클라제 반응경로 및 세포내 칼슘 반응 경로를 사용하여 글루카곤 결합 시그날을 세포로 전달시킬 수 있다. 아데닐레이트 사이클라제 활성을 측정하기 위한 검정은 당해분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들면 문헌[참조: Lin et al., Biochemistry 14. 1559-1563, 1975]에 기술되어 있다. 또한 본 발명에 의하면, 세포내 칼슘 농도를 기준으로 함은[참조: Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem. 260: 3440-3450, 1985] 물론, 루시퍼라제 리포터 시스템[하기 상세히 기술]의 사용을 통해 글루카곤 수용체의 생물학적 활성을 측정한다. 또한, 이노시톨 트리포스페이트 경로를 통해 발생하는 생물학적 반응은 하기 문헌에 기술된 바와 같이 이노시톨 포스페이트 대사를 측정함으로써 평가될 수 있다[참조: Subers and Nathanson (J. Mol CellCardiol 20:131-140, 1988) or Pittner and Fain (Biochem. J. 277:371-378, 1991)].
본원의 맥락상, 글루카곤 수용체가 시그날을 세포로 전달시키기 위하여 모든반응 경로가 반드시 존재할 필요는 없음을 주시해야 한다. 또한, 예를 들면, 세포내 칼슘 수준 증가와 같은 특정 세포 반응은 cAMP 또는 이노시톨 포스페이트 시그날 부재하에 글루카곤의 이의 수용체로의 결합에 의해 촉발될 수 있다.
글루카곤 수용체 cDNA 클론의 분리
상기된 바와 같이, 본 발명은 글루카곤 수용체를 암호화하는 분리된 DNA 분자를 제공한다. 즉, 글루카곤 수용체를 암호화하는 게놈 또는 cDNA 분자는 하기 및 실시예중 기술된 방법에 따라 세포 및 조직으로부터 제조되는 라이브러리로부터 수득할 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 세포 및 조직은 사람, 원숭이, 소, 돼지, 말, 개, 래트 및 마우스를 포함한 다양한 포유동물로부터 수득할 수 있다. 사용될 수 있는 바람직한 세포 및 조직은 지방성 세포, 신장, 췌장, 심장 및 간을 포함한다.
본 발명의 한 양태에 있어, 본원중 기술된 방법을 사용하여 래트 글루카곤 수용체를 분리하여 클로닝할 수 있다. 즉, 폴리(A)+RNA를 스프라그 도울리 래트로부터 분리하여, 문헌[Houamed et al., Science 252: 1318-1321, 1991]에 기술된 바와 같이 cDNA 합성을 위한 주형으로 사용하여 완전 길이의 cDNA를 생성시킨다. 그런다음, 약 1 x 106개 클론을 함유하는 라이브러리를 800bp 이상의 cDNA를 직접 클로닝하여 포유동물 세포 발현 플라스미드내에 작제한다. 이어서, 각각 5,000개 클론을 함유하는 풀(pool)로부터 제조된 플라스미드 DNA를 COS-7 세포내로 형질감염시키고, 선별하여, 현미경 슬라이드 상에서 성장시킨다. 형질감염된 세포를125I-글루카곤과 결합시키고 72시간 후에 에멀젼 방사선사진법으로 분석한다[참조: McMahan et al., EMBO J. 10: 2821-2832, 1991]. 단일 클론이 분리될때까지 포지티브 풀을 연속적으로 분해시킨다. 이 클론 으로부터 수득된 플라스미드 pLJ4는 예상 분자량이 54,962 달톤인 485개 아미노산 단백질을 암호화하는 약 2.0kb 삽입체를 함유한다(참조: 서열확인번호 15).
본 발명의 하나의 양태내에서, 본 방법은 사람 글루카곤 수용체를 분리하고 클로닝한다. 본원중 제공된 문헌에 제시된 다양한 기술을 사용할 수 있다. 예를 들면, 폴리머라제 연쇄 반응("PCR")을 사용하여 글루카곤 수용체를 암호화하는 서열을 증폭시키고(실시예 4), 사람 글루카곤 수용체를 암호화하는 서열을 함유하는 라이브러리를 동정한 후 수용체를 클로닝한다(실시예 5). 사람 글루카곤 수용체 클로닝을 위한 특히 바람직한 전략은 하기 실시예 4 및 5에 설명되어 있다. 달리, 사람 cDNA를 함유하는 발현 라이브러리를 실시예1에 기술된 바와 같이 적합한 RNA 공급원으로부터 제조하고, 실시예 3에 기술된 바와 같이 작용성 사람 글루카곤 수용체를 발현하는 클론에 대해 스크리닝한다.
재조합 글루카곤 수용체의 제조
본 발명은 글루카곤 수용체를 암호화하는 제1 DNA 절편 및 이에 작동적으로연결된 이의 발현에 필요한 부가적 DNA 절편을 포함하는 DNA 작제물을 함유하는 숙주 세포를 배양하여 재조합 글루카곤 수용체를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 주시된 바와 같이, 본 발명의 맥락내에서, "글루카곤 수용체"는 실질적으로 유사한 이의 유도체를 포함하는 것으로 인지된다. 또한, 글루카곤 수용체는 본원중 기술된 DNA 서열과 실질적으로 유사한 DNA 서열에 의해 암호화될 수 있다. 본원중 사용된 DNA 서열은 하기를 충족하는 경우 "실질적으로 유사한"것으로 간주된다: (a) DNA 서열이 천연 글루카곤 수용체 유전자의 암호 영역으로부터 유래되는 경우(예를 들면, 하기 서열의 대립형질 변이체를 포함); (b) DNA 서열이 높거나 낮은 엄격한 조건하에 본 발명의 DNA 서열과 하이브리드화할 수 있는 경우[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989]; 또는 (c) DNA 서열이 (a) 또는 (b)에서 정의한 DNA 서열에 대한 유전 암호에 따른 축퇴물(degenerate)인 경우.
변이체 글루카곤 수용체의 발현을 위해 작제되는 뉴클레오타이드 서열중의 돌연변이로 인해 암호화 서열의 판독 프레임이 변형되지는 않을 것이다. 또한, 돌연변이로 인해, 하이브리드화하여 루프 또는 헤어핀과 같이 수용체 mRNA의 해독을 방해하는 2차 mRNA 구조를 생성시킬 수 있는 상보성 영역이 생성되지 않을 것이다. 돌연변이 부위는 예정될 수 있으나, 반드시 돌연변이 특성 자체가 예정되는 것은 아니다. 예를 들면, 주어진 부위에서 돌연변이체의 최적 특성을 위해 선별하기 위해, 랜덤 돌연변이 유발을 표적 코돈에서 수행하고 발현된 글루카곤 수용체 돌연변이체를 생물학적 활성에 대해 스크리닝한다.
돌연변이는, 천연 서열의 단편에 결합시킬 수 있는 제한 부위가 플랭킹된 돌연변이체 서열을 함유하는 올리고뉴클레오타이드를 합성함으로써, 특정 부위에 도입될 수 있다. 연결후, 수득된 재작제된 서열은 목적하는 아미노산 삽입, 치환 또는 결실 유도체를 암호화한다.
다른 방편으로, 올리고뉴클레오타이드-지시된 부위-특이적 돌연변이 유발 방법을 사용하여, 필요한 치환, 결실 또는 삽입에 따라 변형된 특정 코돈을 갖는 변형된 유전자를 수득한다. 상기 변형을 이루는 실시 방법이 하기 문헌에 기술되어 있다[참조: Walder et al., (Gene 42:133, 1986); Bauer et al. (Gene 37:73, 1985); Craik (Bio Techniques, January 1985, 12-19); Smith et al. (Generic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981); and Sambook et al. (supra)].
또한, 글루카곤 수용체의 1차 아미노산 구조는, 글리코실 그룹, 지질, 인산염, 아세틸그룹 같은 기타 화학적 잔기 또는 기타 단백질 또는 폴리펩타이드와 함께 공유 또는 집합 결합체를 형성함으로써 변형될 수 있다. 추가의 양태에 있어, 글루카곤 수용체는 글루카곤 수용체의 정제 또는 동정을 용이하게 하는 기타 펩타이드와 융합될 수 있다. 예를 들면, 글루카곤 수용체는 FLAG 폴리펩타이드 서열과의 융합 단백질로서 제조될 수 있다[참조: U.S Patent No. 4,851,341; see also Hopp et al., Bio/Technology 6:1204, 1988]. FLAG 폴리펩타이드 서열은 고도로 항원성이고 특이적 모노클로날 항체에 의한 결합을 위한 에피토프를 제공하여, 발현된 재조합 단백질의 신속한 정제를 허용한다. 이러한 서열은 또한 소 점막 엔테로키나제에 의해 Asp-Lys쌍 이후에 바로 존재하는 잔기에서 특이적으로 절단된다.
상기한 바와 같이 천연 또는 변이체 글루카곤 수용체의 뉴클레오타이드 서열 모두 또는 일부를 포함하는 다수의 DNA 작제물은 편리함의 관점으로 제조될 수 있다. 본 발명의 맥락상, DNA 작제물은 사람에 의해 변형되어 전체로서 천연적으로는 존재하지 않는 방식으로 조합되고 병렬된 DNA 절편을 함유하는 DNA 분자 또는 이들 분자의 클론(일본쇄 또는 이본쇄)을 의미하는 것으로 인지된다. 본 발명의 DNA 작제물은 제1 DNA 절편의 발현에 필요한 부가적 DNA 절편이 작동적으로 연결된, 글루카곤 수용체를 암호화하는 제1 DNA 절편을 포함한다. 본 발명의 맥락상, 부가적 DNA 절편은 통상, 프로모터 및 전사 터미네이터를 포함하고, 추가로 인핸서 및 기타 성분을 포함할 수 있다.
또한, 발현 벡터로서도 공지된 DNA 작제물은 목적하는 폴리펩타이드 분비를 유도하는데 필요한 DNA 절편을 함유할 수 있다. 이러한 DNA 절편은 하나 이상의 분비성 시그날 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 분비성 시그날은 글루카곤 분비성 시그날(프리-프로서열), α인자 시그날 서열(프리-프로서열; Kurjan and Herskowitz, Cell 30:933-943, 1982; Kurjan et al., U.S.Patent No. 4,546,082; Brake, EP 116,201), PHO5 시그날 서열(Beck et al., WO 86/00637), BAR1 분비성 시그날 서열(MacKay et al., U.S.Patent No. 4,613,572; MacKay, WO 87/002670), SUC2 시그날 서열(Carlson et al., MoL Cell Biol 3:439-447, 1983), α-1-안티트립신 시그날 서열 (Kurachi et al., Proc. NatL Acad Sci USA 78:6826-6830, 1981), α-2 플라스민 억제제 시그날 서열(Tone et al., J. Biochem.(Tokyo)102:1033-1042, 1987), 조직 플라스미노겐 활성자 시그날 서열(Pennica et al., Narure 301:214-221, 1983), 이. 콜라이 PhoA 시그날 서열(Yuan et al., J. BioL Chem. 265:13528-13552, 1990) 또는 예를 들면, Oliver에 의해 검토된 특정 세균 시그날 서열[Ann Rev. MicrobioL 39:615-649, 1985]을 포함한다. 달리, 분비성 시그날 서열은 하기 von Heinje(Eur. J. Biochem. 133:17-21, 1983; J. MoL BioL 184:99-105, 1985; Nuc. Acids Res. 14:4683-4690, 1986)]가 완성한 법칙에 따라 합성될 수 있다.
분비성 시그날 서열은 단독으로 사용되거나 조합될 수 있다. 예를 들면, 제 1 분비성 시그날 서열은 베리어의 제3 도메인을 암호화하는 서열과 조합하여 사용할 수 있다[Barrier, 본원중 참조로 인용된 U.S.Patent No. 5,037,243]. 베리어의 제3 도메인을 암호화하는 서열은 DNA 절편에 대해 목적하는 DNA 서열의 적절한 판독 프레임 3' 또는 5'으로, 또한 분비성 시그날 서열 및 목적하는 DNA 절편 모두와 적절한 판독 프레임으로 위치할 수 있다.
발현을 위하여, 글루카곤 수용체를 암호화하는 DNA 분자를 적절한 DNA 작제물내로 삽입하고, 다시 이를 사용하여 발현에 적합한 숙주세포를 형질전환시키거나 형질감염시킨다. 본 발명의 실시에 사용되는 숙주 세포에는 포유동물, 조류, 식물, 곤충, 세균 및 진균 세포가 포함된다. 바람직한 진핵세포에는 배양된 포유동물 세포주(예: 설치류 또는 사람 세포주) 및 효모종(예: 사카로마이세스종, 특히 에스.세레비지에, 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces)종 또는 클루이베로마이세스(Kluyveromycess) 종) 또는 사상체 진균[예:아스퍼질러스(Aspergillus)종, 뉴로스포라(Neurospora)종]을 포함한 진균 세포를 포함한다. 효모 사카로마이세스 세레비지에 균주가 특히 바람직하다. 다양한 진핵 및 원핵 숙주세포내 에서 재조합 단백질을 생산하는 방법은 당해 분야에 통상적으로 공지되어 있다[참조: "Gene Expresslon Technology," Methods in Enrymology, Vol. 185, Goeddel (ed.), Academic Press, San Diego, Calif, 1990; see also, "Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, "Methods in Enrymology, Guthrie and Fink eds.) Academic Press, San Diego, Calif., 1991)]. 일반적으로, 숙주 세포는 관심 대상인 단백질을 고수준으로 생산시키는 이의 능력 또는 단백질의 생물학적 활성에 필요한 프로세싱 단계를 일부라도 수행할 수 있는 이의 능력을 기초로 선택된다. 이러한 방식으로, 숙주 세포내로 형질감염 되어져야 하는 클로닝된 DNA 서열의 수는 최소화될 수 있고 생물학적 활성 단백질의 총 수율은 최대화될 수 있다.
본 발명에 사용하기에 적합한 효모 벡터에는 YRp7 (Struhl et al., Proc. NatL Acad ScL USA 76:1035-1039, 1978), YEp13(Broach et al., Gene 8:121-133, 1979), POT 벡터(Kawasaki et al., U.S.Patent No. 4,931,373, 본원중 참조로 인용), pJDB249 및 pJDB219(Beggs, Nature 275:104-108, 1978) 및 이의 유도체가 포함된다. 이러한 벡터는 통상 선별 마커를 포함하는데, 이들은 형질전환체가 선별되도록 존재하는 표현형 검정에 있어 우성 표현형을 나타내는 유전자중 하나일 수 있다. 바람직한 선별 마커는, 숙주 세포 영양요구성을 보충하거나, 항생제 내성을 제공하거나 세포가 특정 탄소원을 이용가능하게 하는 것들로, (Broach et al.,ibid), URA3 (Botstein et al., Gene 8:17, 1979), HIS3 (Struhl et al., ibid) 또는 POT1 (Kawasaki et al., ibid)이 포함된다. 또 다른 적합한 선별 마커는, 효모 세포 상에서 클로람페니콜 내성을 부여하는 CAT 유전자이다.
효모내에서 사용하기 바람직한 프로모터는 효모 당분해 유전자(Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:12073-12080, 1980; Alber and Kawasaki J. Mol. Appl Genet. 1:419-434, 1982; Kawasaki, U.S. Patent No. 4,599,311)또는 알콜 데하이드로게나제 유전자(Young et al., in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals, Hollaender et al.,(eds.), p. 355, Plenum, New York 1982; Ammerer, Meth Enzymol 101: 192-201, 1983)로부터의 프로모터를 포함한다. 이와 관련하여, 특히 바람직한 프로모터는 TPI1 프로모터(Kawasaki, U.S.Patent No. 4,599,311, 1986) 및 ADH2-4c프로모터(Russell et al., Nature 304:652-654, 1983, Irani and Kilgore, U.S.Patent Application Serial No. 07/784,653, 본원중 참조로 인용됨)이다. 발현 단위는 또한 전사 터미네이터를 포함할 수 있다. 바람직한 전사 터미네이터는 TPI1 터미네이터[상기, Alber and Kawasala]이다.
효모 이외에, 본 발명의 단백질은 사상체 진균, 즉 진균 아스퍼질러스 균주 내에서 발현될 수 있다[Mcknight et al., 본원중 참조로 인용된 U.S.Patent No. 4,935,349]. 유용한 프로모터의 예로 아스퍼질러스 니듈라스(Aspergillus nidulans) 해당 유전자로부터 유도된 ADH3 프로모터[Mcknijht et al., EMBO J. 4:2093-2099, 1985] 및 tpiA 프로모터를 포함한다. 적합한 터미네이터의 예는 ADH3터미네이터이다[Mcknight et al., 상기, 1985]. 이러한 성분을 이용하는 발현 단위를, 아스퍼질러스의 염색체 DNA내로 삽입될 수 있는 벡터내로 클로닝한다.
진균의 형질전환 기술은 문헌중에 공지되어 있고 하기 문헌에 기술되어 있다[Beggs (ibid.), Hinnen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929-1933, 1978), Yelton et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1740-1747, 1984), 및 Russell (Narure 301:167-169, 1983)]. 숙주세포의 유전형은 발현 벡터상에 존재하는 선별 마커에 의해 보충되는 유전적 결함을 일반적으로 지닌다. 특정 숙주 및 선별 마커의 선택은 당해 분야의 기술 수준내에 부합된다. 효모내에서 이종 단백질의 생산을 최적화하기 위하여, 숙주 균주는 효모 pep4돌연변이(Jones, Genetics 85:23-33, 1977)와 같은 돌연변이를 함유하여, 단백질분해 활성을 감소시키는 것이 바람직하다.
진균 세포 이외에, 배양된 포유동물 세포를 본 발명내에서 숙주 세포로서 사용할 수 있다. 본원중 사용하기 위한 바람직한 배양된 포유동물 세포에는 COS-1(ATCC No. CRL 1650), COS-7(ATCC No. CRL 1651), BHK(ATCC No. CRL 1632), 및 293(ATCC No. CRL 1573; Graham et al., J. Gen Virol 36:59-72, 1977) 세포주가 포함된다. 바람직한 BHK 세포주는 BHK 570 세포주(아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션에 기탁번호 CRL 10314로 기탁됨)이다. 또한, 하기의 것을 포함한 기타 다수의 포유동물 세포주가 본 발명에서 사용될 수 있다:
래트 Hep I(ATCC No. CRL 1600), 래트 Hep II(ATCC No. CRL 1548), TCMK(ATCC No.CCL 139), 사람 폐(ATCC No. CCL 75.1), 사람 간종양(ATCC No, HTB-52), Hep G2(ATCC No. HB 8065), 마우스 간(ATCC No. CCL 29.1), NCTC 1469(ATCC No. CCL 9.1), SP2/O-Ag14(ATCC No. 1581), HIT-T15(ATCC No. CRL 1777), 및 RINm 5AHT2B(Orskov and Nielson, FEBS 229(1): 175-178, 1988).
본 발명을 수행하는데 사용하기 위한 포유동물 발현벡터는 클로닝된 유전자 또는 cDNA의 전사를 지시할 수 있는 프로모터를 포함한다. 바람직한 프로모터에는 바이러스 프로모터 및 세포 프로모터가 포함된다. 바이러스 프로모터는 초기 사이토메갈로바이러스 프로모터(Boshhart et al.,Cell 41:521-530, 1985) 및 SV40 프로모터(Subramani et al., MoL Cell BioL 1:854-864, 1981)가 포함된다. 세포 프로모터에는 마우스 메탈로티오네인-1 프로모터(Palmiter et al., U.S.Patent No. 4,579,821), 마우스 Vk프로모터(Bergman et al., Proc. NatL Acad Sci USA 81:7041-7045, 1983; Grant et al., Nuc. Acids Res. 15:5496,1987) 및 마우스 VH프로모터 (Loh et al., Cell 33:85-93, 1983)가 포함된다. 특히 바람직한 프로모터는 아데노바이러스 2로부터의 주요 후기 프로모터이다(Kaufman and Sharp, Mol.Cell.Biol. 2:1304-13199, 1982). 이러한 발현 벡터는 또한 프로모터 하부 및 목적하는 펩타이드 또는 단백질을 암호화 DNA 서열 상부에 위치한 일련의 DNA 스플라이스 부위를 함유할 수 있다. 바람직한 RNA 스플라이스 부위는 아데노바이러스 및/또는 면역글로불린 유전자로부터 수득될 수 있다. 발현 벡터내에는 목적하는 암호 서열 하부에 위치한 폴리아데닐화 시그날이 있다. 적합한 폴리아데닐화 시그날에는 SV40으로부터의 초기 또는 후기 폴리아데닐화 시그날(Kaufman and Sharp, 상기), 아데노바이러스 5E1B 영역 및 사람 성장 호르몬 유전자 터미네이터로부터의 폴리아데닐화 시그날(DeNoto et al., Nuc. Acids Res.9:3719-3730, 1981)을 포함한다. 발현 벡터는 프로모터와 RNA 스플라이스 부위 사이에 위치한, 아데노바이러스 2 삼부체 리더와 같은 비암호화 바이러스 리더 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 벡터는 또한 SV 40 인핸서 및 마우스 μ인핸서(Gillies, Cell 33:717-728, 1983)와 같은 인핸서 서열을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 또한 아데노바이러스 VA RNA를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 적합한 벡터는 시판된다(예: Stratagene, La Jolla, CA).
클로닝된 DNA 서열은, 예를 들면 인산 칼슘-매개된 형질감염(Wigler et al., Cell 14:725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981; Graham and Van der Eb, Virology 52:456, 1973), 전기천공(Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982), 또는 DEAE-덱스트란 매개된 형질감염(Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987) 모두 본원중 참조로 인용됨)에 의해 배양된 포유동물 세포내로 도입될 수 있다. 안정하게 통합된 클로닝된 DNA를 지닌 세포를 동정하기 위하여, 통상 선별 마커를 목적하는 유전자 또는 cDNA와 함께 세포내로 도입한다. 배양된 포유동물 세포내에서 사용하기 위한 바람직한 선별 마커에는, 네오마이신, 하이드로마이신 및 메토트렉세이트 같은 약물에 대해 내성을 부여하는 유전자가 포함된다. 선별 마커는 증폭가능한 선별 마커일 수 있다. 바람직한 증폭가능한 선별 마커는 DHFR 유전자 및 네오마이신 내성 유전자이다. 선별 마커는 틸리에 의해 검토되었다(Thilly, Mammalian Cell Technolcgg, Butterworth Publishers, Stoneham, MA, 본원중 참조로 인용). 선별 마커의 선택은 당해 분야의 통상적 기술 수준내에 잘 부합된다.
선별 마커는 글루카곤 수용체 서열과 동시에 별개의 벡터로 세포내로 도입될 수 있거나, 동일 벡터로 도입될 수 있다. 동일 벡터로 도입되는 경우, 선별 마커 및 글루카곤 수용체 서열은 상이한 프로모터 또는 동일 프로모터 조절하에 있게되는데, 후자 배열은 2개의 시스트론(cistron) 메세지를 생성시킨다. 이러한 유형의 작제물은 당해 분야에 공지되어 있다(예, Levinson and Simonsen, U.S.Patent No. 4,713,339) "운반 DNA"로서 공지된 부가적 DNA를 혼합물에 가해 세포내로 도입시키는 것이 유리할 수도 있다.
형질감염된 포유동물 세포를 통상 1 내지 2일의 기간동안 성장시켜, 목적하는 DNA 서열(들)의 발현을 개시한다. 그런 다음, 약물 선별을 적용시켜 적합한 양식으로 선별 마커를 발현하는 세포 성장에 대해 선별한다. 증폭성 선별 마커로 형질감염시킨 세포의 경우 약물 농도를 점차적으로 증가시켜 클로닝된 서열의 증가된 복제수에 대해 선별하여, 발현 수준을 증가시킨다. 도입된 서열을 발현하는 세포를 선별하고 목적하는 형태 또는 수준의 목적하는 단백질 생산에 대해 스크리닝한다. 그런 다음, 이들 기준을 충족시키는 세포를 클로닝하고 생산을 위해 증량시킨다.
본 발명을 수행하는데 사용하기 위한 바람직한 원핵 숙주 세포는 에스케리챠 콜라이 세균주이지만, 바실러스 및 기타 속 또한 유용하다. 이들 숙주를 형질전환하고 이에 클로닝된 외래 DNA 서열을 발현시키는 기술이 당해 분야에 널리 공지되어 있다[Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982. 본원중 참조로 인용; or Sambrook et al., supra]. 세균 숙주내에서 클로닝된 DNA 서열을 발현시키는데 사용되는 벡터는 통상 항생제 내성 유전자 같은 선별 마커 및 숙주 세포내에서 작용하는 프로모터를 함유한다. 적절한 프로모터에는 trp(Nichols and Yanofsky, Meth Enzymol 101:155-164, 1983), lac(Casadaban et al., J. Bacteriol 143:971-980, 1980), 및 파지 (Queen J. Mol Appl Genet. 2:1-10, 1983) 프로모터 시스템이 포함된다. 세균 형질전환에 유용한 플라스미드에는, pBR322(Bolivar et al., Gene2:95-113, 1977), pUC 플라스미드 (Messing, Meth Enzymol 101:20-78, 1983; Vieira and Messing, Gene 19:259-268, 1982), pCQV2(Queen, ibid), 및 이의 유도체가 포함된다. 플라스미드는 바이러스 및 세균 성분을 함유할 수 있다.
본원중 제공된 교시에 의해, 본 발명의 글루카곤 수용체를 암호화하는 발현 벡터를 식물, 조류 및 곤충 세포에 도입하는 방법 및 프로모터, 터미네이터는 당해 분야의 숙련가에게 있어 명백하다. 곤충 세포내에서 이종 DNA 서열 발현을 위한 벡터로서 바큘로바이러스의 사용이 문헌[Atkinson et al.(Pestic. Sci.28:215-224, 1990)]에 검토되었다. 또한, 식물세포내에서 유전자를 발현시키기 위한 벡터로서 아그로박테리움 리조제네스(Agrobacterium rhizogenes)의 사용이 문헌[Sinkar et al.(J. Biosci.(Bangalore) 11:47-58, 1987]에 검토되었다.
본 발명의 DNA 작제물을 함유하는 숙주세포를 배양하여 글루카곤 수용체를암호화하는 DNA 절편을 발현시킨다. 표준 방법에 따라, 세포를 선택된 숙주세포의 성장에 필요한 영양소를 함유하는 배양 배지내에서 배양시킨다. 다양한 적합한 배지가 당해분야에 공지되어 있고 통상, 탄소원, 질소원, 필수 아미노산, 비타민 및 무기염과 기타 성분, 즉 특정 숙주 세포에 의해 요구될 수 있는 성장인자 또는 혈청을 포함한다. 성장 배지는 통상, DNA 작제물로 공동-형질감염된 선별 마커 또는 DNA 작제물 상의 선별 마커에 의해 보충되는 필수 영양소의 결핍 또는 약물 선별에 의해, DNA 작제물(들)을 함유하는 세포를 선별한다.
예를 들면, 효모 세포에 대한 적합한 성장 조건은, 질소원으로 비-아미노산 질소원 또는 효모 추출물, 무기염, 비타민 및 필수아미노산 보충물을 포함하는 화학적으로 조절된 배지내에서 4 내지 37˚C, 특히 30˚C에서 배양시킴을 포함한다. 배지의 pH는2이상 8이하이다. 바람직하게는 pH 5 내지 6에서 유지된다. 적합한 pH 유지 방법은, 완충 및 일정 pH 조절을 포함한다. pH 조절에 바람직한 제제에는 수산화나트륨이 포함된다. 바람직한 완충제에는 석신산 및 비스-트리스(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)가 포함된다. 효모 숙주 세포가 이종 단백질을 과글리코실화하는 경향이 있기 때문에, 본 발명의 글루카곤 수용체를, 아스파라긴-연결된 글리코실화에 필요한 유전자에 결함이 있는 효모 세포내에서 발현시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 세포를 바람직하게는 삼투 안정화제를 함유하는 배지내에서 성장시킨다. 바람직한 삼투 안정화제는 0.1M 내지 1.5M, 바람직하게는 0.5M 내지 1.0M의 농도로 배지 내로 보충되는 소르비톨이다. 배양된 포유동물 세포는 일반적으로 시판되는 혈청-함유 또는 혈청-비함유 배지 내에서 배양된다. 사용된 특정 세포주에 적합한 배지 및 성장 조건 선별은 당해 분야의 통상적 기술내에 부합된다.
글루카곤 수용체는 또한 사람이외의 형질전환된(transgenic) 동물, 특히 형질전환된 온혈 동물내에서 발현될 수 있다. 마우스, 래트, 토끼, 양 및 돼지를 포함한 형질전환된 동물을 생성시키는 방법이 문헌[Hammer et al.,(Nature 315:680-683, 1985), Palmiter et al. (Science 222:809-814, 1983), Brinster et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4438-4442, 1985), Palmiter and Brinster (Cell 41:343-345, 1985) 및 U.S. Patent No. 4,736,866, 본원중 참조로 인용]에 기재되어 있다. 요약하면, 적절히 위치한 발현 조절 서열과 함께 발현되어질 DNA 서열을 포함한 발현단위를 수정란의 전구핵내로 도입한다. DNA의 도입은 미세주입에 의해 일반적으로 수행된다. 주입된 DNA의 통합은 조직 샘플, 특히 꼬리 조직의 샘플로부터의 DNA 블롯 분석에 의해 검출한다. 도입된 DNA는 동물의 자손에게 전해질 수 있도록 동물의 생식 라인으로 통합되어짐이 일반적으로 바람직하다.
본 발명의 바람직한 양태내에서, 마우스 같은 형질전환된 동물은 글루카곤 수용체 서열을 파괴시키는 돌연변이를 표적화함으로써 발생된다[Mansour et al., "Disruption of the protooncogene int-2 in mouse embvro-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes, "Narure 336:348-352, 1988]. 이러한 동물은 대사중 글루카곤 수용체 역할을 연구하기 위한 모델로서 쉽게 사용될 수 있다.
글루카곤 수용체 펩타이드
상기한 바와 같이, 본 발명은 글루카곤 수용체 펩타이드를 제공한다. 본 발명의 맥락상, 글루카곤 수용체 펩타이드는 상기한 글루카곤 수용체 또는 이의 유도체 일부를 포함하며, 막통과 도메인을 함유하지 않고, 10개 이상의 아미노산으로 이루어진다고 이해될 수 있다. 요약하면, 글루카곤 수용체 및 추정적 막통과 도메인 구조는 예를 들면 P/C 진(Gene) 또는 인텔리제네틱스 슈트(Intelligenetics Suite, Intelligenetics, Mt. View.CA)의 소수성 플롯 함수를 사용하여 또는 문헌[Kyte and Doolittle, J. Mol. Bicl. 157:105-132, 1982]의 방법에 따라 1차 해독 산물로부터 예상될 수 있다. 래트 글루카곤 수용체의 소수성 플롯은 제2도에 그래프로 도시되어 있다. 그래프 도식에 집착하고자 함은 아니지만, 소수성 분석을 기초로 하면, 글루카곤 수용체는 제1도의 일반적 구조를 갖는 것으로 여겨진다. 특히, 이들 수용체는 각각 막통과 도메인에 의해 분리된, 세포외 아미노-말단 도메인, 3개의 세포외 루프 도메인 및 4개의 세포내 루프 도메인을 포함하는 것으로 여겨진다.
본 발명의 하나의 양태내에서, 글루카곤 수용체의 세포외 아미노-말단 도메인을 포함하는 분리된 글루카곤 수용체 펩타이드가 제공된다. 바람직한 양태내에서, 서열확인번호 15의 28번 아미노산 글루타민에서 142번 아미노산 티로신까지의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 글루카곤 수용체 펩타이드가 제공된다. 또한 글루카곤 수용체의 세포외 및 세포내 루프 도메인으로부터 선택될 수 있는 기타 분리된 글루카곤 수용체 펩타이드가 제공된다(제1도 및 제5도). 하나의 양태에 있어, 글루카곤 수용체 펩타이드는, 1ID(서열확인번호 15, 169번 아미노산 리신 내지 178번 아미노산 히스티딘), 1ELD (서열확인번호 15, 203번 아미노산 티로신 내지 231번 아미노산 이소루이신), 2ID(서열확인번호 15, 259번 아미노산 페닐알라닌 내지 266번 아미노산 세린), 2ELD(서열확인번호 15, 293번 아미노산 발린 내지 307번 아미노산 이소루이신), 3ID (서열확인번호 15, 334번 아미노산 루이신 내지 345번 아미노산 리신) 및 3ELD(서열확인번호 15, 371번 아미노산 아스파르트산 내지 380번 아미노산 세린)로 이루어진 그룹중에서 선택된다.
본 발명의 글루카곤 수용체 펩타이드를 상기 재조합 기술을 사용하거나 합성 방법을 사용하여 생산하여, 하기한 바와 같이 추가로 정제할 수 있다.
글루카곤 수용체 펩타이드의 정제
분리된 글루카곤 수용체 펩타이드는, 본 발명의 재조합 해독 산물을 생산하는 적합한 숙주/벡터 시스템을 배양함으로써 제조될 수 있다. 그런 다음 이러한 세포주로부터의 상층액을, 글루카곤 수용체 펩타이드를 분리시키는 다양한 정제 방법으로 처리할 수 있다. 예를 들면, 상층액을 먼저 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 단위와 같은 시판되는 단백질 농축 여과기를 사용하여 농축시킬 수 있다. 농축 후, 농축물을, 적합한 지지체에 결합된 항-글루카곤 수용체 항체 또는 글루카곤과 같은 적합한 정제 매트릭스로 적용시킬 수 있다. 다른 방편으로, 음이온 또는 양이온 교환 수지를 사용하여 수용체 또는 펩타이드를 정제시킬 수 있다. 최종적으로, 하나 이상의 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 단계를 사용하여, 글루카곤 수용체 펩타이드를 추가로 정제할 수 있다.
본 발명의 맥락상, 글루카곤 수용체 펩타이드는, SDS-폴리아크릴아미드 겔 분석 이후 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue)로 염색한 후 단일 밴드가 검출되는 경우 "분리" 또는 정제된 것으로 간주한다.
글루카곤 수용체에 대한 항체
본 발명의 하나의 양태내에서, 유도체를 포함한 글루카곤 수용체 및 상기한 글루카곤 수용체 펩타이드와 같은 이들 단백질의 단편 또는 일부를 사용하여 글루카곤 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하는데 사용한다. 본 발명의 맥락상, 용어 "항체"는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, F(ab')2및 Fab 단편과 같은 이의 단편은 물론, 재조합적으로 생성된 결합 파트너를 포함한다 이들 결합 파트너는 특이적 결합 모노클로날 항체를 암호화하는 유전자로부터의 가변 영역을 통합한다. 항체는 107M-1이상의 Ka값으로 글루카곤 수용체와 결합하는 경우 특이적으로 결합한다고 정의된다. 모노클로날 항체 또는 결합 파트너의 친화성은 당해 분야의 통상의 숙련가에 의해 쉽게 결정될 수 있다[Scatchard, Ann. N.Y.Acad. Sci. 51:660-672, 1949].
폴리클로날 항체는 말, 소, 염소, 양, 개, 닭, 토끼, 마우스 또는 래트와 같은 다양한 온혈 동물로부터 당해 분야의 숙련가에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 즉, 글루카곤 수용체를 복강내, 근육내, 점안 또는 피하내 주사로 주입하여 동물을 면역시킬 수 있다. 글루카곤 수용체 또는 글루카곤 수용체 펩타이드의 면역원성은 프로인트(Freund) 완전 또는 불완전 보조제와 같은 보조제를 사용하여 증가시킬 수있다. 수회 부스터 면역화한 후, 소량의 혈청 샘플을 수집하여 글루카곤 수용체에 대한 반응성에 대해 시험한다. 다양한 검정을 사용하여, 글루카곤 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 검출한다. 검정 실시예가 문헌[Anribodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988.]에 상세히 기술되어 있다. 이러한 검정의 대표적 실시예에는 역류 면역 전기영동(CIEP), 방사면역검정, 방사면역침전법, 효소-결합된 면역 흡착 검정(ELISA), 도트블롯 검정, 억제 또는 경쟁 검정 및 샌드위치 검정이 포함된다[U.S. Patent Nos. 4,376,110 and 4,486,530; see also Antioodies: A Laboratory Manual, supra]. 특히 바람직한 폴리클로날 항혈청은 백그라운드보다 3배 이상 더 큰 시그날을 생성시킬 것이다. 동물의 역가가 글루카곤 수용체에 대한 반응성 측면에서 안정기(plateau) 상태에 달하면, 보다 대량의 폴리클로날 항혈청은 매주 동물을 출혈시키거나, 사혈시킴으로써 용이하게 수득될 수 있다.
모노클로날 항체는 또한 널리 공지된 기술을 사용하여 쉽게 생성시킬 수 있다[U.S. Patent Nos. RE 32,011, 4,902,614, 4,543,439, and 4,411,993; see also Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn, and Bechtol (eds.), 1980, and Antibodies; A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988]. 즉, 한 양태에 있어, 래트 또는 마우스와 같은 대상 동물에, 글루카곤 수용체에 대한 면역 반응을 생성시키기에 적합한 형태의 글루카곤 수용체를 주사한다. 적합한 형태의 대표적 예로, 글루카곤 수용체 또는 글루카곤 수용체 서열을 기본으로 하는 펩타이드를 발현하는 세포가 포함된다. 추가로, 수용체 또는 수용체 펩타이드를 오브알부민 또는 삿갓 모시조개 헤모시아닌(KLH)과 같은 또다른 단백질과 커플링시키거나, 프로인트 완전 또는 불완전 보조제와 같은 보조제의 사용을 통해, 생성된 면역 반응을 향상시키는 많은 기술이 당해 분야에 공지되어 있다. 초기 면역화는 복강내, 근육내, 접안 또는 피하 경로를 통해서 이루어질 수 있다.
초기 면역화 1주 내지 3주 사이에 동물을 또 다른 부스터 면역으로 재면역화 시킬 수 있다. 그 후 동물을 시험 출혈시키고, 상기 검정을 사용하여 글루카곤 수용체로의 결합에 대해 혈청 시험한다. 추가 면역화는 또한 글루카곤 수용체에 대한 동물 반응성이 안정기에 이를때까지 성취할 수 있다. 이후 동물을 글루카곤 수용체 또는 글루카곤 수용체 펩타이드로 최종 부스트하고, 3 내지 4일후 희생시킨다. 이때, 비장 및 림프절을 회수하고, 메쉬 스크린을 통해 기관을 통과시키거나, 세포를 둘러싸는 비장 또는 림프절 막을 파괴시킴으로써 단일 세포 현탁액으로 분쇄한다. 한 양태내에서, 적혈구 세포를 저장성 용액 부가후 즉시 등장성을 회복시켜 연속 용해시킨다.
또 다른 양태에 있어, 모노클로날 항체의 제조에 적합한 세포는 시험관내 면역화 기술을 사용하여 수득한다. 요약하면, 동물을 희생시켜, 비장 및 림프절 세포를 상기한 바와 같이 제거한다. 단일 세포 현탁액을 제조하고, 세포를 상기 면역 반응 생성에 적합한 형태의 글루카곤 수용체를 함유하는 배양물에 넣는다. 이어서, 림프구를 회수하여 하기와 같이 융합한다.
시험관내 면역화를 통해 또는 상기한 바와 같이 면역화된 동물로부터 수득한 세포를 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스와 (EBV)(Glasky and Reading, Hybridoma 8(4): 377-389, 1989) 같은 바이러스로 형질감염시켜 불멸화한다(Glasky and Reading, Hybridoma 8(4):377-389, 1989). 달리는, 바람직한 양태내에서, 회수된 비장 및/또는 림프절 세포 현탁액을 적합한 골수종 세포와 융합하여, 모노클로날 항체를 분비하는 "하이브리도마"를 생성시킨다. 적합한 골수종 세포주는 바람직하게는 항체의 작제 또는 발현에 있어 불완전하며, 또한 면역화된 동물로부터의 세포와 공통 유전자형이다. 다수의 이같은 골수종 세포주가 당해분야에 널리 공지되어 있고, 메릴랜드, 록크빌 소재 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)과 같은 공급처로부터 수득될 수 있다(Catalogue of Cell Lines & Hybridomas, 6th ed., ATCC, 1988). 대표적인 골수종 세포주에는 하기가 포함된다. 사람의 경우, UC 729-6(ATCC No. CRL 8061), MC/CAR-Z2(ATCC No. CRL 8147), 및 SKO-007(ATCC No. CRL 8033); 마우스의 경우, SP2/O-Ag14(ATCC No. CRL 1581) 및 P3X63Ag8 (ATCC No. TIB 9); 래트의 경우, Y3-Ag1.2.3(ATCC No. CRL 1631), 및 YB2/O(ATCC No. CRL 1662). 특히 바람직한 융합주에는 하기가 포함된다: NS-1(ATCC No. TIB 18) 및 P3X63-Ag 8.653 (ATCC No. CRL 1580)(이들은, 마우스, 래트 또는 사람 세포주와의 융합을 위해 사용될 수 있다). 골수종 세포주와 면역화된 동물로부터의 세포간 융합은 폴리에틸렌 글리콜(PEG) (Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988)의 사용 또는 전기융합(Zimmerman and Vienken J. Memorane Biol 67:165-182, 1982)을 포함한 다양한 방법으로 성취될 수있다.
융합후, 세포를 RPMI 1640 또는 DMEM(둘베코 변형된 이글 배지)(JRH Biosciences, Lenexa, Kan.)와 같은 적합한 배지를 함유하는 배양 평판내로 넣는다. 배지는 또한 태송아지 혈청 (FBS 즉 Hyclone, Logan, Utah, 또는 JRH Biosciences), 면역화에 사용된 동종의 유아 동물로부터 회수한 흉선세포 또는 배지를 고화시키기 위한 한천과 같은 부가 성분을 함유할 수 있다. 추가로, 배지는 융합된 비장 및 골수종 세포의 성장을 선택적으로 허용하는 제제를 함유해야 한다. 특히 HAT(하이포크산틴, 아미놉테린 및 티미딘)(Sigma Chemical Co., St. Louis, Missoun)의 사용이 바람직하다. 약 7일후, 생성된 융합 세포 또는 하이브리도마를 스크리닝하여 글루카곤 수용체를 인지하는 항체의 존재를 측정할 수 있다. 수회 클론 희석 및 재검정 이후, 글루카곤 수용체에 결합하는 항체 생산 하이브리도마를 분리할 수 있다.
또 다른 기술을 사용하여 모노클로날 항체를 또한 작제할 수 있다[William D. Huse et al., "Generation of a Large Combinational. Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lamda" Science 246: 1275-1281, December 1989; L. Sastry et al., "Cloning of the Immunological Repertoire in Escherichia coli for Generation of Monoclonal Catalytic Antibodies: Construction of a Heavy Chain Variable Region-Specific cDNA Library," Proc. Natl Acad. Sci. USA 86:5728-5732, August 1989 Michelle Alting-Mees et al., "Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative toHybridomas," Strategies in Molecular Biology 3:1-9, January 1990; 상기 문헌은 Stratacyte, La Jolla California에서 입수가능한 시판 시스템을 기술하며, 이들은 재조합 기술을 통해 항체 생산을 가능케 한다]. 요약하면, mRNA를 B세포 집단에서 분리하고, λIMMUNOZAP(H) 및 λIMMUNOZAP(L) 벡터내에 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 cDNA 발현 라이브러리를 생성시키는데 사용한다. 이들 벡터를 개별적으로 스크리닝하거나 공동-발현시켜 Fab 단편 또는 항체를 생성시킨다(Huse et al., 상기; Sastry et al., 상기). 포지티브 플라크를 연속적으로, 이. 콜라이로부터의 모노클로날 항체 단편을 고수준으로 발현시키는 비-용해성 플라스미드로 전환시킨다.
유사하게, 결합 파트너는 또한 특이적으로 결합하는 항체를 암호화하는 유전자 가변 영역을 통합하는 재조합 DNA 기술을 사용하여 작제할 수 있다. 이들 단백질 작제는 당해 분야의 통상의 숙련가에 의해 용이하게 성취될 수 있다(본원에 제공된 문헌: James W. Larrick et al., "Polymerase Chain Reaction Using Mixed Primers: Cloning of Human Monoclonal Antibody Variable Region Genes From Single Hybridoma Cells," Biotechnology 7:934-938, September 1989; Riechmann et al., "Reshaping Human Antibodies for Therapy," Narure 332:323-327, 1988; Roberts et al., "Generation of an Antibody With Enhanced Affinity and Specificity for its Antigen by Protein Engineering," Narure 328:731-734, 1987; Verhoeven et al., "Reshapin Human Antibodies: Grafting an Antilysozyme Activity," Science 239:1534-1536, 1988; Chaudhary et al., "A Recombinant Immunotoxin Consisting of Two Antibody Variable Domains Fused to PseudomonasExotoxin," Nature 339:394-397, 1989; see also, U.S. Patent No. 5,132,405 entitled "Biosynthetic Antibody Binding Sites"). 요약하면, 하나의 양태에 있어, 글루카곤 수용체-특이적 항원 결합 도메인을 암호화하는 DNA 절편은, 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 증폭되고, 사람 항체를 생산하는 세포의 게놈내로 직접 삽입된다[Verhoeyen et al. 상기; Reichmann et al. 상기]. 이 기술은 특이적으로 결합하는 마우스 또는 래트 모노클로날 항체의 항원-결합 부위를 사람 항체로 옮기는 것을 허용한다. 이러한 항체는 이들이 래트 또는 마우스 항체에서와 같이 항원성이지 않기때문에 사람에서 치료적 용도로 바람직하다.
다른 방편으로, 항원-결합부위(가변 영역)는 또 다른 완전히 상이한 단백질에 연결하거나 이에 삽입하면[상기, Chaudhary et at.,], 항체의 항원-결합 부위 및 완전히 상이한 단백질의 작용 활성을 갖는 신규 단백질이 생성된다. 당해 분야의 통상의 숙련가는, 항체의 항원-결합 부위 또는 항체의 글루카곤 수용체 결합 도메인이 항체의 가변 영역내에서 발견됨을 이해할 것이다. 추가로, 포유동물 글루카곤 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 가변 영역의 보다 작은 부위를 암호화하는 DNA 서열을 본 발명의 범위내에서 사용할 수 있다. 이들 부위를, 하기 검정을 사용하여 글루카곤 수용체에 대한 결합 특이성에 대해 쉽게 시험할 수 있다.
바람직한 양태내에서, 목적하는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마로 부터의 가변영역을 암호화하는 유전자를 가변 영역에 대한 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 증폭시킨다. 이들 프라이머는 당해 분야의 통상의 숙련가에의해 합성되거나 시판 공급처로부터 구입할 수 있다. 스트라타사이트(Stratacytc, La Jolla, Calif)는, VHa, VHb, VHc, VHd, CH1, VL및 CL영역에 대한 프라이머를 포함하여, 마우스 및 사람 가변 영역에 대한 프라이머를 판매한다. 이들 프라이머를 사용하여 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 증폭시킨후, 각각 IMMUNOZAP*(H) 또는 IMMUNOZAP*(L) (Stratacyte)와 같은 벡터로 삽입시킬 수 있다. 그런 다음, 이들 벡터를 발현을 위한 이. 콜라이내로 도입할 수 있다. 이들 기술을 사용하여, VH및 VL도메인 융합물을 함유하는 일본쇄 단백질을 다량으로 생산할 수 있다[Bird et al., Science 242: 423-426, 1988].
또 다른 양태에 있어, 결합 파트너를 발현 벡터내에서 독소와 같은 또 다른 단백질과 융합시킨다. 따라서, 결합 파트너에 의해 결합되는 세포는 독소의 통합에 의해 사멸된다[Chaudhary et al., 상기].
적합한 항체 또는 결합 파트너를 수득하는 경우, 이들은 당해 분야의 통상의 숙련가에게 널리 공지된 다수의 기술에 의해 분리 또는 정제된다[Antibodies: A Laboratory Manual, 상기]. 적합한 기술에는 펩타이드 또는 단백질 친화성 컬럼, HPLC 또는 RP-HPLC, 단백질 A 또는 G 컬럼상에서의 정제 또는 임의의 이들 기술의 조합도 포함된다. 본 발명의 범위내에서, 항체 또는 결합 파트너를 정의하는 것으로 사용된 용어 "분리된" 이란 "다른 혈액 성분이 실질적으로 함유되지 않음"을 의미한다.
본 발명의 항체 및 결합 파트너는 많은 용도를 갖는다. 예를 들면, 항체는유동 혈구계에서 글루카곤 수용체-함유 세포를 분류하거나 글루카곤 수용체-함유 조직을 조직 화학적으로 염색하는데 사용될 수 있다. 즉, 세포상에서 글루카곤 수용체를 검출하기 위하여, 세포를 글루카곤 수용체와 특이적으로 결합하는 표지된 모노클로날 항체와 함께 배양한 후 결합 항체의 존재를 검출한다. 이들 단계는 비결합 항체 제거를 위한 세척과 같은 부가 단계로 성취될 수 있다. 본원에 사용하기 적합한 표지에는 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC), 피코에리트린(PE), 호스 래디쉬 퍼옥시다제(HRP), 및 콜로이드상 골드가 있으며, 이는 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 유동 혈구계에서 사용하기에 특히 바람직한 것은 FITC로, 이는 켈트캄프의 방법["Conjugation of Fluorescein Isothiocyanate to Antibodies, I. Experiments on the Conditions of Conjugation," Immunology 18:865:873, 1970. (See also Keltkamp, "Conjugation of Fluorescein Isothiocyanate to Antibodies. II. A Reproducible Method," Immunology 18:875-881, 1970; and Goding, "Conjugation of Antibodies with Fluorochromes: Modification to the Standard Methods," J. Immunol. Methods 13:215-226, 1970.)]에 따라 정제된 항체에 결합될 수 있다. 조직화학적 염색을 위하여, 바람직한 HRP은 나칸(Nakane) 및 카와오이(Kawaoi)의 방법["Peroxidase-Labeled Antibody: A New Method of Conjugation" J. Histochem. Cytochem. 22:1084-1091, 1974; see also, Tijssen and Kurstak, "Highly Efficient and Simple Methods for Preparation of Peroxidase and Active Peroxidas Antibody Conjugates for Enzyme Immunoassays," Anal. Biochem. 136;451-457, 1984]에 따라 정제된 항체에 결합될 수 있다.
또한, 정제된 항체 또는 결합 파트너는 또한 치료학적으로 사용되어 시험관내 또는 생체내에서 글루카곤의 글루카곤 수용체로의 결합을 차단시킬 수 있다. 즉, 차단 항체는, 글루카곤 수용체 에피토프에 결합하여, 글루카곤이 수용체에 결합하는 것을 방지하거나, 글루카곤이 시그날을 전달하는 것을 방지하는 항체이다. 상기 주시한 바와 같이, 다양한 검정을 사용하여, 글루카곤 수용체로의 글루카곤 결합을 차단 또는 억제하는 항체를 검출할 수 있는데, 특히 상기 주시한 억제 및 경쟁 검정을 포함한다. 한 양태에 있어, 모노클로날 항체(상기한 바와 같이 제조)를, 글루카곤 부재시 및 다양한 농도의 글루카곤 존재시 글루카곤 수용체로의 결합에 대해 검정한다. 차단 항체 또는 결합 파트너는, 예를 들면 글루카곤 수용체와 결합하며, 글루카곤 존재시 글루카곤 수용체에 대한 글루카곤의 결합을 차단 또는 억제하는 것으로서 확인된다.
치료학적으로 사용될 수 있는 항체 또는 결합 파트너는, 항체 또는 결합 파트너 및 생리학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 치료학적 조성물중에서 제공됨이 바람직하다. 적합한 담체 또는 희석제는 중성 완충 염수 또는 식염수를 포함하고, 또한 추가로 완충제와 같은 부형제 또는 안정화제, 글루코스, 슈크로스 또는 덱스트로스와 같은 당, EDTA 같은 킬레이트제 및 다양한 방부제를 포함할 수 있다.
글루카곤 길항제
상기한 바와 같이, 본 발명은 글루카곤 길항제를 검측하는 방법을 제공한다. 본 발명의 내용중, 길항제는 수용체에 결합할 수 있으나, 세포내 반응 경로를 자극하지 않거나, 이의 자극을 감소시키지 않는 분자를 언급하는 것으로 이해된다. 특히, 글루카곤 길항제는 일반적으로 글루카곤 수용체에 결합함으로써, 세포내 반응 경로의 자극을 감소시키는 능력에 의해 확인된다.
본 발명의 한가지 양태에서는, (a) 재조합 글루카곤 수용체로의 화합물의 결합 및 특정 반응 경로(response pathway)를 통한 관련된 반응을 허용하기에 충분한 조건 및 시간하에, 상기 화합물을, 글루카곤 효능제의 존재하에 상기 반응 경로와 연계된 상기 재조합 글루카곤 수용체에 노출시키는 단계, 및 (b) 글루카곤 효능제 단독에 의한 반응 경로의 자극에 비해, 상기 화합물이 글루카곤 수용체에 결합함으로써 야기되는 반응 경로의 자극이 감소됨을 탐지하여, 이로부터 글루카곤 길항제의 존재를 측정하는 단계들을 포함하여, 글루카곤 길항제의 존재를 탐지하는 방법이 제공된다. 본 발명의 내용중, 글루카곤 효능제는 글루카곤 수용체에 결합할 수 있는 분자(글루카곤 자체를 포함) 를 포함하며, 세포내에서 반응 경로를 자극한다.
상기 방법을 이용하여 다양한 화합물을 선별할 수 있다. 대표적인 예에는 상술한 차단 항체, 글루카곤 수용체 펩타이드 및 글루카곤 동족체(펩타이드 및 비 - 펩타이드 리간드 모두를 포함)가 포함된다. 예를 들어, 미합중국 특허원 제 07/741,931호는 이와 같은 동족체를 암호화하는 DNA 서열의 풀(pool)을 사용하여 다수의 글루카곤 동족체를 생산하는 방법을 제공한다. 글루카곤 동족체를 암호화 하는 DNA 서열의 이와 같은 풀은, 글루카곤을 암호화하는 DNA 서열의 포화 돌연변이 유발 (참조: Little, Gene 88: 113-115, 1990; Hambers et al., Gene 88: 143-151, 19889), 분획-지시된 돌연변이 유발(참조: Shortle et al., Boc. Natl. Acad.Sci. USA 77:5375-5379, 1980), 의도적인 뉴클레오타이드 착오혼입(forced nucleotide misincorporation; Liao and Wise Gene 88:107-111, 1990), 또는 무작위적 돌연변이화된 올리고뉴클레오타이드의 사용(참조: Hutchison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:710-714, 1986)에 의해서 생성될 수 있다. 글루카곤 동족체를 발현하는 개개의 형질전환체는 상술한 바와 같이 클로닝되거나 폴링(pooling)될 수 있다.
화합물의 재조합 글루카곤 수용체로의 결합 및 특정 경로를 통한 관련된 반응을 허용하기에 충분한 조건 및 시간하에, 상기 화합물을, 글루카곤 효능제의 존재하에 재조합 글루카곤 수용체에 노출시킨다. 본 발명에 이용되는 것으로서, 수용체에 글루카곤 길항제가 결합하기에 충분한 조건 및 시간은 당해 수용체의 공급원에 따라 변할 수 있으나, 결합에 적합한 조건은, 일반적으로 0 내지 2M NaCl, 바람직하게는 0 내지 0.9M NaCl, 특히 바람직하게는 0.1M NaCl을 포함하고 pH가 5 내지 9, 바람직하게는 6.8 내지 8의 범위내인 완충액중 4℃ 내지 55℃이다. 결합 및 반응을 위한 충분한 시간은 일반적으로 노출후 5 내지 15분이다.
일단, 화합물이 수용체에 결합하기에 충분한 조건 및 시간하에, 상기 화합물을 글루카곤 효능제의 존재하에 재조합 글루카곤 수용체에 노출시킨 경우, 상기 화합물이 재조합 글루카곤 수용체에 대해서 글루카곤 효능제와 경쟁한다면, 반응경로의 자극에 있어서의 감소가 탐지될 수 있다. 본 발명의 한가지 양태로서, 반응 경로는 막-결합된 아데닐레이트 사이클라제 반응 경로이며, 당해 탐지 단계에는, 글루카곤 효능제가 단독으로 존재하는 경우의 사이클릭 AMP 생산에 비해, 막-결합된아데닐레이트 사이클라제 반응 경로에 의한 cAMP 생산이 감소됨을 측정함이 포함된다. 본 발명의 목적을 위해서는, 반응 경로의 자극에 있어서의 감소가 데스-His'-글루카곤과 관련된 감소와 상응하거나 더 큰 것이 바람직하다. 아데닐레이트 사이클라제 활성 검정을 예를 들면, 린(Lin) 등의 방법(참조: Biochem. 14:1559-1563, 1975), 및 실시예의 방법을 이용함으로써 수행할 수 있다. 이 방법은 천연 글루카곤과 비교한 cAMP의 자극 수준을 측정하며, 일반적으로 방사선 표지된 ATP 존재하에, 생물학적으로 활성인 재조합 글루카곤 수용체를 발현하는 세포 제제를 글루카곤 및 시험 화합물의 혼합물에 대해 노출시킴을 포함한다.
달리는, cAMP 생산을, 살로몬(Salomon) 등의 방법(참조: Anal. Biochem. 58:541-548, 1976) 또는 크리쉬나(Krishan) 등의 방법(참조: J. Pharmacel. Exp. Ther. 163:379, 1968)을 포함하는, 당해분야에 잘 공지되어 있는 방법, 또는 바람직하게는 시판 키트(예: Scintillation Proximity Assay Kit; Amersham Corporation 제조원)를 사용하여 용이하게 측정할 수 있다. 키트(Scintillation Proximity Assay Kit)는 요오드화-cAMP 를 항-cAMP 항체와 경쟁시킴으로써 cAMP의 생산을 측정한다. 이와 같은 검정에서 생물학적 활성인 ED50(50% 반응을 위한 유효 용량)이 1nM 이하, 더욱 바람직하게는 0.7nM 이하, 가장 바람직하게는 0.25nM 이하인 글루카곤 수용체가 특히 바람직하다.
본 발명의 추가의 양태에서, 반응 경로는 루시퍼라제 리포터 시스템(luciferase reporter system)을 포함한다. 요약 하면, 루시퍼라제는 루시페린에 의한 광자의 방출을 촉매함으로써 루시페린의 존재하에서의 발현을 용이하게검출할 수 있는 효소이다(참조: Alam and Cook, Anal. Biochem. 188:245-254, 1990). 더욱 상세히 후술하는 바와 같이, 본 발명의 특히 바람직한 양태에서는 루시퍼라제 cDNA에 작동적으로 연결된, 프로엔케팔린 사이클릭 AMP 반응 성분과 같은 사이클릭 AMP 반응 성분을 포함하는 DNA 작제물이 제공된다. 루시퍼라제 cDNA를 포함하는 DNA 작제물은 숙주 세포내로 안전하게 형질감염된다. 다음, 숙주 세포를, 글루카곤 수용체의 발현에 필요한 부가적 DNA 절편에 작동적으로 연결된 글루카곤 수용체를 암호화하는 제1 DNA 절편을 함유하는 제2 DNA 작제물로 형질감염시킨다. 글루카곤 수용체 효능제의 결합시, 상승된 cAMP 수준은 루시퍼라제의 발현을 유도한다. 루시퍼라제는 루시페린에 노출되며, 루시퍼라제에 의한 루시페린의 산화동안 방출된 광자가 측정된다.
본 발명의 다른 양태에서, 반응 경로의 활성화는 유리 칼슘의 세포내 농도를 증가시킨다. 예를 들면, 칼슘 플루오르 퀸 Z법(참조: calciam fluor QuinZ method; Charest et al의 S. Biol. Chem. 259:8769-8773, 1983), 또는 애쿠오린 광 단백질법(참조: aequorin photoprotein method; Nakajima-shimade의 Proc. Natl. Sci. USA 88:6878-6882, 1991)과 같은 다양한 검정을 수행하여 세포내 유리 칼슘의 농도를 측정할 수 있다. 특히 바람직한 방법은 실시예 6에서 상세히 후술될 세포 내 칼슘 광영상화법(intracelluar calcium photoimaging method)이다. 요약하면, 한가지 양태내에서, 세포를, 플라스미드를 발현하는 글루카곤 수용체로 형질전환시키고 정상적인 배양 조건하에서 3일간 생장시킨다. 생장 배지를 제거한후 10μM 푸라-2 AM(참조: Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem. 260:3440-3450, 1985)을 함유하는용액으로 교체시킨다. 다음 이 세포를 암실에서 30분간 배양하고 세정한 후, 30 내지 120분간 다시 배양한다. 광영상화는 수은 아이크램프가 장착된 니콘 다이아포트 도립 형광 현미경(Nikon Diaphot inverted fluorescence microscope)으로 수행될 수 있다. 우선 세포를 60초 이상 모니터링하여 기준선을 확립한후 글루카곤을 함유하는 완충액으로 자극한다. 상을 통상적으로 자극후 3분 이상동안 기록한다. 소프트웨어(Inovision; Research Friangle Park. N. C 제조원)를 이용하여 상을 진행시키고 정량한다.
상술한 바와 같이 검출된 글루카곤 길항제를 코이(Coy) 등이 기술한 바와 같은 이온-교환 및 분배 크로마토그래피(참조: peptides Stracture and Function. Pierce Chemical Company, Rockford II., pp.369-372, 1983), 역상 크로마토그래피(참조: Andrew and Merrifield. Ear. J. Biochem. 164:585-590, 1987) 또는 HPLC (참조: Kofod et al., Int. J. Peptile Botein Res. 32:436-440, 1988)로써 정제할 수 있다. 추가의 정제는 통상적인 화학 정제법(예: 액체 크로마토그래피, 농도구배 원심부터 및 겔 전기영동)에 의해 달성될 수 있다. 단백질 정제법은 당해분야에 공지되어 있으며(참조: Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, NY, 1982) 본원에 기술한 재조합 글루카곤 길항제의 정제에 적용시킬 수 있다. 달리, 글루카곤 길항제는 바라니 및 메리필드(Barany and Merrifield)의 고체-상 방법(참조: The Peptides, Vol. 2A, Gross and Meienhofer, eds., Academic Press, NY, pp.1-284, 1979) 또는 자동화된 펩타이드 합성기를 사용하여 합성할 수 있다.
균질성이 약 50% 이상인 실질적으로 순수한 재조합 글루카곤 길항제가 바람직하며, 특히 약제학적 용도를 위해서는 균질성이 약 70% 내지 80% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 균질성이 95% 내지 99% 이상인 것이 가장 바람직하다. 정제되거나 목적한 균질성이 이루어진후, 글루카곤 길항제를 치료학적으로 사용할 수 있다. 일반적으로, 길항제는 비경구적 또는 주입으로 투여할 수 있다. 통상적으로, 길항제는 유리 염기 또는 산염으로서 존재한다. 적합한 염은 약제학적으로 허용성이어야 한다. 대표적인 예에는 금속염, 알칼리 및 알칼린 토 금속염(예: 칼륨 또는 나트륨염)이 포함된다. 다른 약제학적으로 허용되는 염에는 시트르산, 숙신산, 락트산, 염산 및 브롬산이 포함된다. 비경구용 조성물은 pH 5.6 내지 7.4인 등장 수용액으로 제형화될 수 있다. 적합한 등장 용액은 염화나트륨, 덱스트로즈, 붕산, 나트륨 타르트레이트 및 프로필렌글리콜 용액을 포함할 수 있다. 길항제의 치료학적 용량은 동일한 조성물 또는 분리된 조성물로 인슐린과 함께 동시에 투여될 수 있다.
글루카곤 수용체 프로브의 진단 용도
본 발명의 다른 양태에서, 프로브 및 프라이머는 글루카곤 수용체를 검출하기 위해 제공된다. 본 발명의 한 양태에서, 프로브는 글루카곤 수용체 DNA 또는 RNA에 하이브리드화 할 수 있는 것이 제공된다. 본 발명의 목적을 위해서, 높거나 낮은 엄격한 조건하에서 프로브가 하이브리드할 경우 이 프로브는 글루카곤 수용체 DNA에 "하이브리드화 할 수 있는"것이다(참조: Sambrook et al., 상기 참조). 바람직하게는 프로브를 사용하여, 6xSSC, 1x 덴하르트(Den hardts), (참조: Sambrook et al., 상기 참조), 0.1% SDS 존재하 65℃에서 적합한 뉴클레오타이드 서열에 하이브리드화 시키고, 1회 이상 세척하여 2xSSC, 1x 덴하르트, 0.1% SDS 존재하 65℃에서 과량의 프로브를 제거할 수 있다. 프로브 서열은 바람직하게는 글루카곤 수용체 서열에 하이브리드화되나, 세크레틴, 칼시토닌 또는 파라티로이드 호르몬 수용체 서열에는 하이브리드화되지 않도록 설계된다.
본 발명의 프로브는 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산 (RNA)으로 이루어질 수 있으며, 길이가 약 12 뉴클레오타이드, 일반적으로는 14 내지 18개 뉴클레오타이드로 작고 가능하게는 글루카곤 수용체의 전체 서열의 크기와 같이 클 수 있다. 프로브 크기의 선택은 어느 정도 프로브의 용도에 따른다. 예를 들어, 개개인에서 글루카곤 수용체의 다양한 다형(polymorphic) 형태의 존재를 측정하기 위해서는, 글루카곤 수용체 암호화 서열의 실질적인 전체 길이를 포함하는 프로브가 바람직하다. 글루카곤 수용체 프로브를 이용하여 글루카곤 수용체 유전자에 연결된 다형을 동정할 수 있다[참조: Weber, Genomics 7:524-530, 1990; 및 Weber and May, Amer, J. Hum, Gen. 44:388-396, 1989). 이와 같은 다형은 당뇨병과 같은 유전질환과 관련이 있다.
프로브는 당해분야에 잘 공지된 기술로 작제 및 표지할 수 있다. 예를 들어, 12개 염기의 짧은 프로브는 합성적으로 제조될 수 있다. 1.5kb 미만의 약 75개 염기의 긴 프로브는 바람직하게는 예를 들면,32P-dCTP, 디곡시게닌-dUTP 또는 바이오틴-dATP와 같은 표지된 전구체의 존재하에서 PCR 증폭에 의해 제조된다. 1.5kb 이상의 프로브는 일반적으로 세포를 관련 프로브를 함유하는 플라스미드로 형질감염시키고, 형질감염된 세포를 다량으로 생장시키며, 형질감염된 세포로부터 관련 서열을 정제함으로써 가장 용이하게 증폭된다(참조: Sambrook et al., 상기 참조).
프로브는 예를 들면, 방사성 마커, 형광성 마커, 효소적 마커, 및 색원성 마커를 포함하는 다양한 마커로 표지할 수 있다.32P의 사용이 특정 프로브를 표시 또는 표지하는데 있어서 바람직하다.
본 발명의 프로브는 또한 샘플내 글루카곤 수용체 mRNA 또는 DNA의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 그러나, 글루카곤 수용체가 한정된 수로만 존재하거나, 단지 제한된 수로 존재하는 선택된 돌연변이체 서열을 검출하고자 할 경우, 또는 선택된 온혈동물로부터 글루카곤 수용체를 클로닝하고자 할 경우, 관련 서열에 더욱 용이하게 검출되거나 수득될 수 있도록 관련 서열을 증폭하는 것이 바람직하다.
다양한 방법을 이용하여 선별된 서열을 증폭시킬 수 있는데, 이러한 방법에는 예를 들면, RNA 증폭(참조: Lizardi et al., Bio/Technology 6:1197-1202, 1988; Kramer et al., Nature 339:401-402, 1989; Lomeli et al., Clinical Chem. 35(9): 1826-1831, 1989; U.S. Patent No. 4,786,600), 및 폴리머라제 연쇄 반응("PCR")(참조: U.S. Petent Nos. 4,683,195, 4,683,302, 및 4,800,159)을 사용한 DNA 증폭이 포함된다(참조: 전달 가능한 연결(scissile linkage)의 사용을 포함하는 다른 검출/증폭 시스템이 기술되어 있는 U.S. Patent Nos. 4,876,187, 및 5,011,769).
특히 바람직한 양태에서, PCR 증폭을 이용하여 글루카곤 수용체 DNA를 검출 또는 수득할 수 있다. 요약하면, 하기에 더 상세히 기술하는 바와 같이, DNA 샘플을 95℃에서 변성시켜 일본쇄 DNA를 생성시킨다. 후술하는 특이적 프라이머는 37℃ 내지 70℃에서 프라이머내 AT/GC의 비에 따라, 어닐링된다. 이 프라이머를 72 ℃에서 Tag 폴리머라제로 연장시켜 주형에 대응하는 쇄를 생성시킨다. 이 단계는 1회 주기이며, 이를 반복하여 선택된 서열을 증폭시킬 수 있다.
선별된 서열의 증폭용 프라이머는 매우 특이적이며 표적 서열과 안정한 이본 쇄 서열을 형성하는 서열들로부터 선택하여야 한다. 프라이머는 또한 특히 3' 말단에서 비-상보성이어야 하며, 이들끼리 또는 다른 프라이머와 이량체를 형성해서는 안되고, 제2 구조물 또는 DNA의 다른 영역과 2차 구조를 형성해서도 안된다. 일반적으로, 약 18 내지 20개 뉴클레오타이드의 프라이머가 바람직하며, 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 용이하게 합성할 수 있다. 특히 바람직한 프라이머는 하기 표 1에 설정되어 있으며 변성된 올리고뉴클레오타이드 ZC4715 및 ZC4701(서열확인번호: 9 및 8) 및 올리고뉴클레오타이드 ZC4758 및 ZC4778(서열확인번호: 10 및 11)을 포함한다:
글루카곤 수용체 뉴클레오타이드 서열의 추가 용도
본 발명의 또 다른 양태로서, 글루카곤 수용체(또는 돌연변이체 글루카곤 수용체)가 과 발현되거나 글루카곤 수용체가 전혀 발현되지 않는 경우의 질병을 치료하는데 이용할 수 있는 바이러스 벡터가 제공된다. 요약하면, 본 발명의 한 양태에서는, 안티센스 글루카곤 수용체 RNA의 생산을 지시하여 글루카곤 수용체의 과발현, 또는 돌연변이체 글루카곤 수용체의 발현을 방해하는 바이러스 벡터가 제공된다. 다른 양태에서는 글루카곤 수용체 cDNA의 발현을 지시하는 바이러스 벡터가 제공된다. 본 발명에 사용하기 적합한 바이러스 벡터에 다른것 중에서도 재조합 백시니아(Vaccinia) 벡터(U.S. Patent Nos, 4,603,122 및 4,769,330), 재조합 폭스(pox) 바이러스 벡터(PCT Publication No. WO 89/01973), 및 바람직하게는 재조합 레트로바이러스 벡터("Recombinant Retroviruses with Amphotropic and Ecoptropic Host Ranges," PCT Publication No. WO 90/028-6; "Retroviral Packaging Cell Lines and Processes of Using Same, "PCT Publication NO. WO 89/07150; and "Antisense RNA for Treatment of Retroviral Disease States, "PCT Publication No. WO/03451)가 포함된다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 바이러스 벡터는, 글루카곤 수용체가 과발현되거나, 돌연변이체 글루카곤 수용체가 발현되거나, 또는 글루카곤 수용체가 전혀 발현되지 않는 질환 상태의 치료시 이용할 수 있다.
하기 실시예는 제한이 아닌 예시를 통해 제공된다.
실시예 1
cDNA의 합성 및 cDNA 라이브러리의 제조
A. 래트 간 cDNA 합성
30g의 암컷 스팔라그-다울리 래트(Simonsen Labs, Gilroy, CA)로부터의 간을 제거하고 즉시 액체 질소에 둔다. 구아니딘 이소티오시아네이트(참조: Chirgwin etal., Biochemistry 18:52-94, 1979) 및 CsCl 원심분리를 사용하여 간 조직으로부터 RNA를 제조한다. 폴리(A)+RNA를 올리고 d(T) 셀룰로즈 크로마토그래피(참조: Auir 및 Leder, Proc. Natl. Acad. sci. USA 69:1408-1412, 1972)를 사용하여 폴리(A)+RNA를 분리한다.
제1 쇄 cDNA를 폴리 σ(T)-선택된 간 폴리(A)+RNA로부터 2회 합성한다. 간 폴리(A)+RNA 10μg을 함유하는 용액 10μl를 20pmole/μl의 제1 쇄 프라이머 ZC3747(서열확인 번호: 7) 2μl 및 디에틸피로카보네이트-처리된 물 4μl와 혼합한다. 이 혼합물을 65℃에서 4분간 가열하고 빙상에서 급냉으로 냉각한다.
제1 쇄 cDNA 합성은 5X SUPERSCRIPT 완충액(GIBCO BRL, Gaithersburg, Md.) 8μl, 100mM 디티오트레이틀 4μl 및 각각의 dATP, dGTP, dTTP 및 5-메틸-dCTP 10mM을 함유하는 데옥시 뉴클레오타이드 트리포스페이트 용액(Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, N.J.) 2.0μl를 RNA-프라이머 혼합물에 첨가하여 개시한다. 반응 혼합물을 42℃에서 3분간 배양한다. 배양후, 200u/μl SUPERSCRIPT 역 전사효소(GIBCO BRL) 6.0μl를 가한다. 제1 쇄 합성 효율을,32P-αdCTP 10μCi를 반응 혼합물의 10μl 분취량에 첨가하여 분석하여 반응산물을 표지시켜, 대응 반응에서 분석한다. 제1 쇄 반응 혼합물을 45℃에서 45분간 배양하고 50℃에서 15분간 배양한다. 이 반응은 물을 최종 용량이 100μl가 되도록 가한 후 페놀/클로로포름(1:1) 추출 2회 및 클로로포름/이소아밀 알콜(24:1) 추출 1회로써 종결시킨다.혼입되지 않은 뉴클레오 타이드는 글리코겐 담체 60 μg, 2.5M 암모늄 아세테이트 및 2.5l 에탄올의 존재하에 cDNA를 2회 침전시킴으로써 각각의 반응물로 부터 제거한다. 표지되지 않은 cDNA를 50μl 물에 재현탁하여 제2 쇄 합성에 사용한다. 제1 쇄 cDNA의 길이는 물 20μl 중에 표지된 cDNA를 재현탁시키고 아가로즈 겔 전기영동에 의해 cDNA 크기를 측정함으로써 산정된다.
제2 쇄 합성을, DNA 헤어핀 형성(hairpin formation)을 초래하는 제2 쇄 합성의 제1 쇄 프라이밍을 증진시키는 조건하에서 제1 쇄 합성으로부터의 RNA-DNA 하이브리드상에서 수행한다. 반응 혼합물을 5X 폴리머라제 I 완충액[100mM 트리스, pH 7.4, 500mM KCl, 20mM MgCl2, 50mM(NH4)2SO4] 20.0μl, 100mM 디티오트레이톨 4.0 μl, 각각의 데옥시뉴클레오 타이드 트리포스페이트 10mM을 함유하는 용액 1.0μl, β-NAD 3.0μl, 3U/μl 이. 콜라이 DNA 리가제(NBL Enzymes Ltd., Cramlington, Northumbria, England) 15.0μl, 10U/μl 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I(GIBCO BRL) 5.0μl 및 표지되지 않은 제1 쇄 DNA 50.0μl를 함유하도록 제조한다. 제2 쇄 합성의 분취량 10μl가 10μCi의32P-αdCTP의 첨가에 의해 표지된 일련 반응물을 사용하여 제2 쇄 합성 효율을 모니터링한다. 이 반응 혼합물을 실온에서 4분간 배양한 후 각각의 반응 혼합물에 2U/μl RNase H(GIBCO BRL) 1.5μl를 가한다. 이 반응물을 15℃에서 2시간 동안 배양한 후 실온에서 15분간 배양한다. 반응은 500mM EDTA에 이어 연속적으로 상술한 바와 같이 페놀/클로로포름 및 클로로포름/이소아밀알콜 추출에 의해 각각 종결된다. 각각의 반응물로부터의 DNA를 에탄올 및 2.5M 암모늄 아세테이트의 존재하에 침전시킨다. 표지되지 않은 반응물로부터의 DNA를 물 50μl에 재현탁시킨다. 표지된 DNA를 재현탁시켜 상술한 바와 같이 전기영동시킨다.
헤어핀 구조내 일본쇄 DNA를 뭉빈 뉴클레아제(mung bean nuclease)를 사용하여 분해한다. 이 반응 혼합물은 뭉빈 뉴클레아제 완충액(Mung Bean Nuclease Buffer: Stratagene Cloning Systems, La Jolla, Calit) 10μl, 200mM 디티오트 레이트를 4μl, 물 34μl, 제2 쇄 cDNA 50μl, 및 스트라타겐 MB 희석 완충액(Stratagene Cloning Systems)중 뭉빈 뉴클레아제(Promega Corp., Madison, Wis.) 의 1:10 희석액 2μl를 함유한다. 이 반응물을 37℃에서 15분간 배양하고 트리스-HCl 20μl(pH 8.0)을 가한후 연속하여 상술한 바와 같이 종결시킨다. 이어 추출물, DNA를 에탄올 침전시키고 물에 재현탁시킨다.
재현탁된 cDNA를 T4 DNA 폴리머라제로 평활-말단화한다. 물 192μl 중에 재현탁된 cDNA를 5X T4 DNA 폴리머라제 완충액 (250mM 트리스-HCl, pH 8.0, 250mM KCl, 25mM MgCl2) 50μl, 100mM 디티오트레이톨 3μl, 각각의 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트 10mM을 함유하는 용액 3μl 및 6.7U/μl T4 DNA 폴리머라제(Pharmacoa LKB Biotechnology Inc.) 2μl와 혼합한다. 15℃에서 30분간 배양한 후, 반응을 500mM EDTA 2μl를 첨가한 후 상술한 바와 같이 페놀/클로로포름 및 클로로 포름/이소아밀알콜 연속 추출로 종결시킨다. 이 DNA를 에탄올 침전시키고 물 30μl에 재현탁시킨다.32P-dCTP의 혼입을 기준으로 할 때 , cDNA 수율은 10μg의 출발 mRNA 주형으로부터 4μg인 것으로 평가된다.
B. 래트 간 cDNA 라이브러리의 제조
EcoRI 어댑터(Invitrogen, San Diego, Calif)를 상기 제조한 cDNA에 가하여 포유동물 발현 벡터내로의 cDNA의 클로닝을 용이하게 한다. cDNA 10μl 분취량 및 800pmole의 어댑터(12μl)를 10X 리가제 완충액(Stratagene Cloning Systems) 4.0μl, 10mM ATD 4.0μl, 물 6.0μl 및 T4 리가제 16단위(4.0μl; Stratagene Cloning Systems)와 혼합한다. 이 반응물을 16시간 동안 4℃에서 15℃로 온도로 상승시키면서 배양한다. 물 185μl, REACT 2 완충액(GIBCO BRL) 25μl를 가한 후, 65℃에서 30 내지 60분간 배양하여 반응을 종결시킨다. 배양후, 상술한 바와 같이 반응물을 페놀/클로로포름 추출한 후, 클로로포름/이소아밀알콜 추출 및 에탄올 침전에 의해 추출한다. 원심분리에 이어서, DNA 펠렛을 70% 에탄올로 세척하고 공기 건조시킨다. 이 펠렛을 물 180μl 중에 재현탁시킨다.
cDNA를 양방향으로 포유동물 발현 벡터내로 삽입시키는 것을 용이하게 하기 위해, 이 cDNA를 Xho I으로 분해하여, 5' Eco RI 점착성 말단 및 3' Xho I 점착성 말단을 지닌 cDNA를 생성시킨다. 이 cDNA 3' 말단에서의 Xho I 제한 부위를 ZC3747 프라이머(서열 확인번호: 7)를 통해 도입한다. 제한분해를 페놀/클로로포름 및 클로로포름/이소아밀알콜추출에 의해 종결시킨다. cDNA를 에탄올 침전시키고, 수득되는 펠렛을 70% 에탄올로 세척하여 공기-건조시킨다. 펠렛을 1 x 로오딩 완충액(10mM 포스페이트 완충액, pH 8.8, 5% 글리세롤, 0.125% 브롬페놀 블루) 중에 재현탁시킨다.
재현탁된 cDNA를 65℃로 10분간 가열하고, 빙상에서 냉각시킨 후 크기 마커로서 BRL 1kb 래더(GIBOC BRL) 및 파마시아 100bp 래더(Pharmacia LKB Biotechnology Inc.)를 사용하여 0.9% 저 융점 아가로즈 겔(Seaplaque, GTG Low Melt Agarose, FMC Corp., Rockland, Me.)상에서 전기영동한다. 오염물인 어댑터 및 부산물 단편(크기 800bp 이하)을 겔로부터 절제한다. 전극을 바꾸고 원래의 레인 근처에 농축될 때까지 cDNA를 전기영동한다. 농축된 DNA를 함유하는 겔의 영역을 절제하여 원심분리 튜브내에 두고, 겔 조각의 대략적인 용량을 측정한다. 겔 조각 용량의 1/2에 상당하는 TE 분취량을 튜브에 가하고 65℃에서 15분간 가열하여 아가로즈를 용융시킨다. 샘플을 42℃로 평형화한 후, 대략 5 단위의 β-아가라제 I(New England Biolabs, Beverly, Mass)를 가한다. 샘플을 90분간 배양하여 아가로즈를 분해한다. 배양후 3M 나트륨 아세테이트 0.1X 용량을 샘플에 가하고, 이 혼합물을 빙상에서 15분간 배양한다. 배양후, 샘플을 14,000xg로 15분간 4℃에서 원심분리하여 분해되지 않은 아가로즈를 제거한다. 상층액중의 cDNA를 에탄올 침전시킨다. 이 cDNA 펠렛을 70% 에탄올로 세척, 공기 건조하고 물 10μl 중에 재현탁시킨다.
수득되는 cDNA를 이. 콜라이 벡터 pZCEP, pCDNA1의 유도체(Invitrogen)(이중 M13 복제 기점 및 SupF 선별 마커는 pUC 18로부터의 β-락타마제 카세트로 교체된다)내로 클로닝시킨다. Eco RI 및 Xho I으로 분해하여 선형화시킨, 플라스미드 pZCEP를 Eco RI-Xho I cDNA와 연결시킨다. 수득되는 플라스미드를 이. 콜라이 균주 DH 10B ELECTROMAX 세포(GIBCO BRL)내로 전기천공으로 도입시킨다.
C. 사람 소도 세포 cDNA의 합성
매치된 수여자를 구할 수 없는 장기 이식 공여자로부터 수득된 사람 췌장에서 소도 세포를 분리한다. 냉 UW 용액(Du Pont, Boston, Mass)으로 원 위치(in situ) 관류한 후, 각각의 췌장을 조심스럽게 절제하여, 췌장관을 캐뉼라화하고, 콜라게나제 4mg/ml 용액(Type V, Sigma, St. Louis. Mo)을 일정속도로 처음에는 4℃, 이후 39℃로 주입시킨다. 선(gland)을 잘게 찢어 분리하고, 유리된 단편을 원심분리로써 세척하며 구경이 감소되는 침을 통해 연마한 후, 불연속 피콜 밀도 원심분리 (discontinuous Ficoll density centrifagation; Warnock, Diabetes 35(supplc); 136-139, 1989)로 정제한다. 상부 경계 부위로부터 수거된 물질을 수집하고 디티아존 염색에 의해 소도 순도를 측정한 후 계산한다. 라이브러리 작제에 사용된 소도의 순도는 65% 이상인 반면, 노던 블롯에 사용된 소도의 순도는 40% 이상이다. 평균 소도 직경은 175μm이다. 추가로, 분리된 소도는, 다량의 글루코즈 또는 이소부틸메틸크산틴(IBMX)으로 관류시킨 제1 및 제2상 인슐린 분비 작용 모두를 나타낸다.
FASTTRACK mRNA 분리 키트(Invitrogen)을 사용하여 업자 지침에 따라 폴리(A)+RNA를 분리한다. 요약하면, 30,000 정제된 소도를 용해 완충액 중에서 빠르게 용해시키고, 구경이 감소되는 침으로 균질화시키며, 프로테인아제 K 및 RNasin 존재하에 분해한 후, 폴리(A)+RNA를 올리고-d(T) 셀룰로즈 크로마토그래피에 의해 선별한다. 용출된 분획의 농도 및 순도를 OD260/280에서 측정한다.
사람 소도로부터 폴리(A)+RNA 약 2.5μg을, 업자 지침에 따라 LIBRARIAN RII, cDNA 라이브러리 작제 시스템(Invitrogen) 및 DH10B ELECTROMAX 이. 콜라이 세포(GIBCO BRL)를 이용하여, cDNA 라이브러리의 작제에 사용한다. 요약하면, 사람 소도로부터 분리된, 약 2.5μg의 폴리(A)+RNA를 이본쇄 cDNA로 전환시킨후 BstXI 비-회문 링커(Invitrogen)를 첨가한다. cDNA를 크기 분획화하고, 반응하지 않은 링커는 아가로즈 겔 전기영동 및 전기용출로 제거한다. 600bp 보다 큰 상보성 DNA쇄를 선별한다.
실시예 2
폴리머라제 연쇄 반응 증폭에 의한 래트 글루카곤 수용체 cDNA의 분리
세크레틴 유전자 군의 일원중 고 보존 영역에 상응하는 축퇴성 올리고뉴클레오타이드(ZC 4715 및 ZC4701; 각각 서열확인 번호: 9 및 8)를 사용하면서, 글루카곤 수용체 서열의 증폭용 주형으로서 래트 간 cDNA를 사용한다. 반응물 50μl중에 주형 cDNA(실시예 1A) 5ng; 각각의 올리고뉴클레오타이드 ZC4715 (서열확인번호: 9) 및 ZC4701(서열확인번호: 8) 100pmoles; 0.25mM의 각각의 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트(Cetus, Emeryville, CA); 프로메가 10x 완충액(Promega Corp) 1x; 및 1.25 단위의 태크 폴리머라제(Promega)를 함유하도록 한다. PCR 반응을 40주기(95℃에서 1분, 42℃에서 1분 및 72℃에서 2분)로 수행한 후 72℃에서 7분간 배양한다.
650bp PCR 산물을 겔 전기영동에 의해 분리하고 pCR 1000 (StratageneCloning Systems)와 연결시킨다. 수득되는 플라스미드를 사용하여 이. 콜라이 XL-1 세포를 형질전환시킨다. 플라스미드 DNA를 선별된 형질전환체로부터 제조하여, GB/pCR1000으로 지정하고, 서열분석한다(서열확인번호: 14). 클론의 서열 분석은, 삽입체가 세크레틴 수용체와 관련된 폴리펩타이드를 암호화한다는 것을 보여준다.
실시예 3
완전한 길이의 래트 글루카곤 수용체 cDNA의 클로닝
글루카곤 결합 검정중 실시예 1B에 기술된 라이브러리를 스크리닝 하여 완전한 길이의 래트 글루카곤 수용체 cDNA를 수득한다. 라이브러리를 플레이팅하여 백만개의 독립된 클론을 수득한다. 각각의 평판으로부터의 형질전환체 클론을 LB-Amp(Sambrook et al., 상기 참조) 10ml내로 스크래핑한다. 세포를 회전시키고 배지를 버린다. 세포 펠렛을 LB-Amp 4ml, 15% 글리세롤 중에 재현탁시키고, 4개의 분취량 1ℓ를 -80℃에서 저장한다. 제1 글리세롤 스톡을 연마하고 5000 콜로니/평판의 100개 풀을 플레이팅한다. 콜로니를 생장시킨후, 각각의 평판을 LB-amp 10ml 내로 스크래핑한다. 각각의 풀로부터의 세포 분취량을 플라스미드 DNA 제조시 사용하기 위해 제거한다. 나머지 세포 혼합물의 최종 농도를 15% 글리세롤이 되도록 하고, 분취한 후 -80℃로 동결시킨다. 플라스미드 DNA를 세포의 각각의 풀로부터 제조하고, DNA를 업자의 지침에 따라서 RNAse(Baehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.)로 분해한다. RNAse 반응을 페놀/클로로포름/이소아밀알콜(24:24:1) 추출에 의해 종결시키고, DNA를 에탄올 침전시킨다.
각각의 풀로부터의 플라스미드 DNA를 COS-7 세포(ATCC CRL 1651)내로 형질감염시키고, 형질전환체를125I-글루카곤 결합 검정에 의해 글루카곤 수용체의 존재에 대해 스크리닝한다. 요약하면, 형질감염 하루전 약 2 x 105COS-7 세포를 사람 피브로넥틴(표 1) 10μg/ml가 도포되어 있는 멸균된 단일 챔버 슬라이드(Nunc AS, Rockilde, Denumark)상에서 실온으로 30분간 플레이팅하고 인산염 완충된 염수(PBS, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.)로 세척한다. 실질적으로 맥마한(McMahan) 등이 기술한 방법 (참조: EMBO J. 10:2821-2832, 1991; 전체 내용을 본원에서 참조로 인용)을 사용하면서, 각각의 풀로부터의 플라스미드 DNA 2μg을 사용하여 개개의 챔버 슬라이드상에 생장시킨 세포를 형질감염시킨다. 형질감염시킨 후, 세포를 5% CO2중에서 37℃로 72시간 동안 생장시킨다.
표 1
사람 피브로넥틴
동결건조시킨 분말을 완충액에 용해시킨다. 황산암모늄을 25% 농도가 되도록 가하고 이 용액을 2시간 동안 4℃에서 침전시킨다. 피브로넥틴을 Bench Top 원심분리기(Beckman Instraments, Inc., Irvine, Calif)로 1,000rpm에서 15분간 원심 분리하여 펠렛화한다. 상층액을 버리고 펠렛을 10ml의 NaPO4완충액(상기) 중에 용해시킨다.
최종 용량 16.9ml의 피브로넥틴을 1ℓ의 NaPO4완충액(상술)에 대해 밤새 투석한다. 투석된 물질을 1mM NaPO4, pH 7.4로 3배 희석하여 1mM NaPO4, pH 7.4, 100mM NaCL 용액을 생성시킨다. 이후 피브로넥틴을 증류수로 2배 희석한다. 섬유질의, 불용성 침전을 유리봉으로 제거한다.
피브로넥틴을, 10mM 트리스, pH 8.1, 50mM NaCl 3ℓ로 평형화시킨 DEAE FF 세파로즈 컬럼(Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, N, J.) 50ml를 사용하여 FPLC로 처리한다. 컬럼을 10mM 트리스, pH 8.1, 50mM NaCL로 기준선 샘플이 생성될 때까지 세척하고, 피브로넥틴을 염 구배를 사용하여 10mM 트리스, pH 8.1, 300mM NaCl로 용출시킨다. 단편을 수집하고, 분획의 분취량을 아크릴아미드 겔상에서 전기영동하며, 겔을 쿠마시 블루 염색 및 웨스턴 블롯팅으로 분석한다. 피크 분획을 수집하고 10mM CAPS (3-(사이클로 헥실아민)-1-프로판-설폰산, Sigma) pH 11.0, 10mM CaCl2, 150mM NaCl에 대해 투석한다. 이 용액을 -80℃에 저장한다.
125I-글루카곤 결합 검정용 형질전환체를 제조하기 위해, 소비한 배지를 세포로부터 흡입하여, 세포를 냉(4℃) PBS로 3회 세척한다. 최종 세척후, 세포를 결합 배지(표 2)로 피복하고 10분간 실온에서 배양한다. 배지를 0.5nM125I-글루카곤(Amersham 수용체용, 비활성 2000 Ci/mmole; Amersham)을 함유하는 결합 배지 0.5ml로 교체한다. 세포를 30℃에서 1시간 동안 진동시킨다. 배지를 세포로부터 흡입하고, 글루카곤이 없는 냉(4℃) 결합배지를 가하고, 세포를 5분간 실온에서 배양한다. 배지를 세포로부터 흡입하고, 세포를 냉(4℃) PBS로 3회 세척한다. 최종 세척후, 세포를 PBS중 2.5% 글루타르 알데히드 1ml로 실온에서 20분간 고정시킨다. 글루타르 알데히드를 제거하고, 세포를 PBS로 3회 세정한다. 슬라이드를 1시간 동안 실온에서 공기 건조시키고, 업자 지침에 따라 액체 사진 유액(Eastman Kodak Co., Rochester, N. Y.)에 침지시킨 후 암실에서 실온으로 30분 이상 건조시킨다. 다음 슬라이드를 차광 상자내에서 72시간 동안 4℃로 플레이팅한다. 글루카곤을 결합시킬 수 있는 세포를 밝은 조도 영역하에 2.5X 확대하여 검출한다. 1개의 풀, 즉 #57을, 글루카곤을 결합시킬 수 있는 세포가 함유된 것으로서 동정한다.
표 2
결합배지
1M 중탄산나트륨
중탄산나트륨을 마개로 막은 100ml의 분도기(graduate)에 가한다. 용액을 고체가 용해될 때까지 혼합한다. 증류수를 100ml가 되도록 가한다. 용액을 다시 혼합하고 마개로 막은 병에서 4℃로 저장한다.
배지
증류수 ℓ당 1M 중탄산나트륨 1ml를 가한다. 4ℓ를 미리 밤새 냉각시킨 용액으로 제조하거나 냉 증류수로 제조한다.
69% 슈크로즈 용액
69gm 슈크로즈
슈크로즈를 가열하면서 증류수 31ml에 용해시킨다. 용액의 농도를 굴절계로 측정한다. 고체 슈크로즈 또는 물을 필요한 만큼 가하여 69+/-0.5%의 농도로 조정한다.
42.3% 슈크로즈 용액
42gm 슈크로즈
슈크로즈를 가열하면서 증류수 57ml에 용해시킨다. 용액의 농도를 굴절계로 측정한다. 69% 슈크로즈 용액 또는 물을 필요한 만큼 가하여 42.3+/-1%의 농도로 조정한다.
2x 결합 완충액
100mM HEPES, pH 7.3
300mM NaCl
2mM EDTA
2% 소혈청 알부민
1.6mg/ml 바시트라신
영상화 완충액
140mM NaCl
10mM HEPES
5.6mM 글루코즈
5mM KCl
1mM MgSO4
1mM CaCl2.new
Fura-2 AM 용액
50mg Fura-2 AM(분자 프로브)
50ml DMSO
5ml 상 완충액
푸라-2 AM 50mg을 DMSO 50ml중에 용해시킨다. 고체를 용해시킨후, 용액을 영상화 완충액 5ml와 혼합한다.
#57 풀로부터의 플라스미드 DNA 분취량을 올리고뉴클레오타이드 ZC4710 및 ZC4715(각각, 서열확인번호: 8 및 9)를 사용하여 PCR로 증폭시킨다. $57 풀로부터의 플라스미드 DNA 200ng 내지 400ng, 100 pMoles의 각각의 올리고뉴클레오 타이드 ZC4701 및 ZC4715(각각, 서열확인번호: 8 및 9); 50mM KCl: 10mM 트리스-HCl, pH 9.0(20℃), 1.5mM MgCl2; 0.01% 젤라틴; 0.1% 트리톤 X-100; 0.2mM의 각각의 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트(Pharmacia LKB Biotechnology Inc) 및 태크 폴리머라제(Promeag) 1단위를 함유하는 반응 혼합물 50μl를 제조한다. PCR 반응을 30주기(95℃에서 2분, 45℃에서 2분 및 72℃에서 2분) 동안 수행한 후 72℃에서 7분간 배양한다. 이 반응 혼합물을 4℃에서 저장한다. 겔 전기영동으로 PCR 산물을 분석하면, 실시예 2에 기술한 산물과 크기가 대략적으로 동일한, 700bp 밴드가 나타난다.
풀 #57로부터의 글리세롤 스톡을 연마하고, 500개 콜로니의 20개 평판을 플레이팅한다. 콜로니를 수집하고, 글리세롤 스톡 및 플라스미드 DNA를 상술한 바와 같이 제조한다. 폴리스미드 DNA를 COS-7 세포내로 형질감염시키고, 형질감염체를 상기한 글루카곤 결합 검정을 사용하여 선별한다. 하나의 풀, 즉 #57-18은 글루카곤을 결합시킬 수 있는 세포를 함유함으로써 동정된다.
풀 #57-18로부터의 플라스미드 DNA 분취량을 상술한 바와 같이 올리고뉴클레오타이드 ZC4701 및 ZC4715(각각, 서열확인번호: 8 및 9)를 사용하여 PCR로 증폭시킨다. 겔 전기영동으로 PCR 산물을 분석하면, 글루카곤 수용체 DNA 서열의 존재를 확증하는 700bp 밴드가 나타난다.
풀 #57-18로부터의 글리세롤 스톡을 연마하고 50개 콜로니의 6개 평판 및 20개 콜로니의 47개 평판을 플레이팅한다. 이 콜로니를 수집하고, 글리세롤 스톡 및 플라스미드 DNA를 상술한 바와 같이 제조한다. 플라스미드 DNA의 각각의 풀로부터의 분취량을 COS-7 세포내로 형질감염시키고, 상술한 글루카곤 결합 검정을 사용하여 형질감염체를 스크리닝한다. 또한, 플라스미드 DNA의 각각의 풀로부터의 분취량을 전술한 바와 같이 올리고뉴클레오타이드 ZC4701 및 ZC4715(각각, 서열확인번호: 8 및 9)를 사용하여 PCR로 증폭한다. 4개의 양성 풀(#57-18-16, #57-18-18, #57-18-36 및 #57-18- 48)이 글루카곤과 결합할 수 있는 세포를 함유함으로써 동정되며, PCR증폭에 의해 확증적인 700bp 밴드를 함유하는 것으로 나타났다.
cDNA를 분리하기 위해서, 2개의 150mm 평판을 #57-18 풀의 2,500 콜로니로 각각 플레이팅한다. 본원에서 참조로 인용한, 하나한(Hanahan)과메셀손(Meselson)(Gene 10:63, 1980) 및 삼부룩 (Sambrooc)등의 방법을 사용하여, 필터 리프트(Filter lift)를 제조한다. 상술한 올리고뉴클레오타이드 및 방법을 사용하여 #57 풀로부터의 플라스미드 DNA를 PCR 증폭시켜 하이브리드화 프로브를 수득한다. 저-융점 아가로즈 겔로부터 PCR 산물을 겔-정제하고 업자의 지침에 따라 MEGAPRIME 키트(Amersham, Arlington Heights, I11)를 사용하여 랜덤-프라이밍한다. 필터를 6x SSC, 5x 덴하르트, 5% SDS, 초음파 처리된 연어 정자 DNA 200μg/ml 및32p-표지된 PCR 단편 2x105cpm/ml을 함유하는 용액중에서 하이브리드화 한다. 필터를 65℃에서 밤새 하이브리드화한다. 과량의 표지를 65℃에서 2x SSC, 1% SDS로 3회 세척하여 제거한다. 필터를 4시간 동안 -80℃ 에서 2개의 스크린을 사용한 필름에 노출시킨다. 플라스미드 pLJ4를 함유하는 양성 클론을 동정하여 서열분석한다. 플라스미드 pLJ4는 1992년 8월 21일 수탁번호 제69056호하에 이. 콜라이 형질전환체로서 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852 소재)에 기탁되었다. 제한 엔도뉴클레아제 분석 및 서열분석에 의하면, pLJ4가 485개 아미노산의 단백질을 암호화하는 예상 분자량이 54,962달톤인 대략 2kb의 삽입체를 함유함을 알 수 있다. 이 핵산 서열 및 추론된 아미노산 서열은 서열확인번호 14 및 15에 나타낸다. 키트 (kyte) 및 둘리트(Doolittle)의 방법(참조: J. Mol. Biol. 157:105-132; 본원에서 참조로 인용)을 사용하는 수치료법 분석은 아미노-말단 시그날 서열에 상응하는 소수성 아미노산 및 7개의 막통과 도메인의 8개 클러스터(제2도)를 나타낸다. 또한, 추론된 아미노산 서열의 분석은 연장된 친수성 서열중에 위치한 4개의 잠재적인 N-연결된 글리코실화 부위의 존재 및 동일 영역에서 6개 시스테인의 존재를 나타낸다.
실시예 4
폴리머라제 연쇄 반응 증폭에 의한 사람 글루카곤 수용체 cDNA의 분리
사람 소도 세포 cDNA(실시예 1C)를, 축퇴성 올리고 뉴클레오타이드 ZC4715 및 ZC4701(각각, 서열확인번호: 9 및 8)을 사용하는 사람 글루카곤 수용체 서열의 증폭을 위한 주형으로서 사용한다. 반응물 50μl에는 주형 cDNA(실시예 1C) 5ng, 올리고뉴클레오타이드 ZC4715(서열확인번호: 9) 및 ZC4701 (서열확인번호: 8) 각각 100pmole; 각각의 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트(Cetus, Emeryville, Calif) 0.25mM; 프로메가 10x 완충액(Premega) 1x 및 1.25 단위의 태크 폴리머라제(Promega)를 함유하도록 한다. PCR 반응을 40주기(95° 에서 1분, 45℃에서 1분 및 72℃에서 2분) 동안 수행한 후, 72℃ 에서 7분간 배양한다.
겔 전기영동에 의해 대략 750bp PCR 산물을 분리한다. 분리된 PCR 산물의 1/10을, 아클로닝을 위해 PCR 산물의 3' 말단에 Bam HI 제한부위가 삽입되고 5' 말단에 Eco RI 제한 부위가 삽입되도록 설계된, 올리고뉴클레오타이드 ZC4758 및 ZC4778(서열확인번호: 10 및 11)을 사용하는 또 다른 PCR 반응을 위한 주형으로서 사용한다. 반응 혼합물 50μl를 상술한 바와 같이 제조한다. PCR 반응을 40주기(95˚에서 1분, 50℃에서 1분 및 72℃에서 30분) 동안 수행한 후, 72℃에서 7분간 배양한다.
사람 글루카곤 수용체 서열용의 형질전환체를 스크리닝하기 위해, 각각의 형질전환체 중에 존재하는 삽입체 DNA를, 보편적인 pUC 서열분석 프라이머로서 설계되고 PCR 산물 삽입체가 플랭킹된 pUC 서열에 프라이밍된 올리고뉴클레오타이드 ZC447 및 ZC976(서열확인번호: 1 및 2)을 사용하여 증폭시킨다. 48개의 형질 전환체를, 각각의 올리고뉴클레오타이드 20pmol; 각각의 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트(Cetus, Eoueryville, Calif.) 0.125mM; 프로메가 10x 완충액(Promega) 1x; 및 1.25 단위의 태그 폴리머라제(Promega)를 함유하는 반응 혼합물 25μl내로 집어 넣는다. PCR 반응을 30주기(95℃에서 1분, 45℃에서 1분 및 72℃에서 30분)간 수행한 후 72℃에서 7분간 배양한다.
PCR 산물을, Amersham MEGAPRIME 키트(Amersham)을 프로브로서 사용하여 랜덤 프라이밍으로 표지시킨 pLJ4의 Eco RI-Xho I 단편 1.9kb을 사용하여 서던 하이브리드화(참조: Southern, J. Mol. Biol. 98; 503, 1975; 및 Sambrook et al., ibid.; 본원에서 참조로 인용)로 연속적으로 분석한다. 하나의 클론 즉, G30은 완전한 길이의 래트 cDNA 프로브로 하이브리드화됨을 알 수 있다. G30의 뉴클레오타이드 서열은 서열확인번호: 16에 나타낸다.
실시예 5
완전한 길이의 사람 글루카곤 cDNA의 클로닝
사람 글루카곤 수용체를 암호화하는 서열을 함유한 라이브러리를 동정하기 위해, 일련의 라이브러리를 상술한 클론 G30으로부터의 서열을 함유하도록 설계된 올리고뉴클레오타이드 프라이머 ZC5433 및 ZC5432(각각, 서열확인번호: 13 및 12)를 사용하여 PCR로 스크리닝한다. 구입 및 제조된 사람 간, 소도 세포, HepGZ 세포, 뇌 및 태반으로 부터의 사람 게놈성 및 cDNA 라이브러리를 스크리닝한다(표 3). 개개의 PCR 반응물 50μl를, 표 4에 나타낸 용량의 라이브러리 각각으로부터의 DNA, ZC5433 및 ZC5432 (서열확인번호: 13 및 12) 각각 20pmole/μl, 각각의 데옥시리보 핵산 트리포스페이트 0.25mM, 10x 태크 I 완충액(Promega) 5μl, 15mM MgCl2, 증류수 19.5μl 및 5U/μl 태크 I 폴리머라제 (Promega) 0.5μl를 사용하여 제조한다. 또한, 양성 대조군으로서 pLJ4를 함유하고 음성 대조군으로서 DNA를 함유하는 반응물을 제조한다.
표 3
라이브러리 및 DNA 공급원
표 4
용량
PCR 반응을 30주기(94˚에서 1분, 50℃에서 1분 및 72℃에서 1분 30초) 동안 수행한 후 72℃에서 10분간 배양한다. PCR 산물을 아가로즈 겔 전기영동으로 연속하여 분석한다. NIH 간 라이브러리만이 pLJ4 양성 대조군을 사용하여 관측된 것과 동일한 크기의 320 내지 410bp 벤드를 생성시킨다.
로저 베르롤로티(Roger Bertolloti)(National Institutes of Health, Bethesda, Md.)로부터 입수한 플라스미드 pcD2 (Chen and Okayama, Mol. Cell. Bial. 7:2745-2752, 1987)내로 클로닝된 사람 간 라이브러리를 사용하여 사람 글루카곤 수용체를 암호화하는 완전한 길이의 cDNA 클론을 수득한다. 라이브러리를 플레이팅하여 백만개의 독립된 클론을 수득한다. 각각의 평판로부터의 형질전환체 콜로니를 LB-Amp(Sambrcok et al., ibid) 10ml내로 스크래핑한다. 세포를 회전시키고 배지를 버린다. 세포 펠렛을 LB-Amp 4ml, 15% 글리세롤 중에 재현탁시키고 4개의 1백만 분취량을 -80℃에 저장한다. 제1 글리세롤 스톡을 연마하고, 평판당 5000개 콜로니의 100개 풀을 플레이팅한다. 콜로니를 생장시킨 후, 각각의 평판을 LB-amp 10ml내로 스크래핑한다. 각각의 풀로부터 세포의 분취량을 플라스미드 DNA 제조시 사용하기 위해 제거한다. 나머지 세포 혼합물의 최종 농도가 15% 글리세롤이 되도록 하고, 분취한 후 -80℃로 동결시킨다. 플라스미드 DNA를 세포의 각각의 풀로부터 제조하고, 이 DNA를 업자의 지침에 따라 RNAse(Boehringer Mannheim, Indianapolis, In.)로 분해한다. RNAse 반응을 페놀/클로로포름/이소아밀알콜(24:24:1) 추출에 의해 종결시키고, DNA를 에탄올 침전시킨다.
각각의 풀로부터 재현탁된 플라스미드 DNA의 분취량을 10개의 그룹(예: 1-10, 11-20, 21-30, 31-40 등)으로 합한다. 이 플라스미드 DNA를 1:20으로 희석하고 각각의 풀로부터의 DNA 1μl를 상술한 반응 혼합물과 동일한 PCR 반응 혼합물 중에 사용한다. 반응 혼합물을 상기 설정한 조건하에 증폭시킨다. 아가로즈겔 전기영동에 의한 PCR 산물의 분석은 풀 31-40이 양성 대조군과 동일한 크기의 320-410bp 밴드를 함유함을 나타낸다.
원래의 풀 31 내지 40으로부터 제조된 플라스미드 DNA를 1:20으로 희석하고 각각의 풀 1μl를 상술한 바와 동일한 반응 혼합물 중에 사용한다. 상술한 조건을사용하여 반응 혼합물의 PCR 증폭을 수행한다. 아카로즈 겔 전기영동에 의한 PCR 산물의 분석은 풀 #40의 밴드 크기가 대략 310 내지 420bp 임을 나타낸다.
1:10으로 희석시킨 풀 #40 1μl의 아가로즈 겔 전기영동에 의해서 플라스미드 DNA의 농도는 대략 70ng/μl인 것으로 정량된다. #40 플라스미드 DNA의 70ng을, 2.3kV, 400Ω, 25μF로 전기천공하여 이. 콜라이 균주 DH10B 세포내로 도입하고 SOC 1ml 중에 재현탁시킨다(Sambrook et al., ibid). 이 세포를 10-2, 10-3및 10-4로 희석시킨다. 각각의 희석물 100μl를 4개의 평판상에 플레이팅한다. 콜로니의 수는 10-2희석물로 부터의 세포를 함유하는 4개의 평판의 경우 대략 10,000 콜로니/평판이고 10-3희석물로부터의 세포를 함유하는 4개의 평판의 경우 대략 1000콜로니/평판인 것으로 산정되었다. 이중 필터 리프트를 4개의 10-3평판 및 1개의 10-2평판으로부터 각각 제조하고 풀 #1 내지 풀 #5로 지정한다. 이증 셋트 각각으로부터 1개의 필터를 고체 배지상에 두고 콜로니가 형성될 때까지 생장시킨다. 이 콜로니를 스크래핑하여 PCR 증폭용 플라스미드 DNA를 제조하는데 사용한다. 또한, 10-2평판의 나머지 3개 평판을 스크래핑하고, 플라스미드 DNA를 세포로부터 제조한다.
나머지 필터를 65℃에서 12시간 동안 교반하면서 3x SSC + 0.5% SDS로 예비 세척하여 세균 파괴물을 제거한다. 필터를 울리치 완충액(Ullrich, EMBO J. 3:361-364, 1984) + 50% 포름아미드, 1% SDS 중에서 밤새 37℃로 예비 하이드리드화시킨다. 업자가 제시한 조건에 따라 Amersham MEGAPRIME 키트 (Amersham)를 사용하여표지한 클론 G30 DNA를 비등시키고 하이브리드화 용액(울리치 완충액 + 50% 포름아미드)에 최종 농도가 6 x 105cpm/ml가 되도록 가한다. 이 필터를 37℃에서 교반하면서 밤새 배양한다. 밤새 배양한 후, 프로브 용액을 제거하고, 필터를 5분간 65℃에서 2x SSC + 1.0% SDS 중에서 세척한다. 처음 세척한 후, 필터를 동일한 용액 중에서 15분간 65℃로 세척한 다음 실온에서 5분간 진탕한다. 마지막 세척법을 추가로 2회 반복한다. 필터를 실온에서 밤새 필름에 노출시킨다. 풀 #2에 상응하는, 평판 #2상의 단일 콜로니는 G30으로 하이브리드화되므로 양성이다. 이 콜로니를 집어서 스트리킹(streaking)하여 독립된 콜로니를 수득한다. 몇몇의 독립된 콜로니로부터 제조한 플라스미드 DNA를 DNA 서열분석한다. 하나의 콜론, 즉 40-2-2를 추가로 서열분석하고 1992년 8월 21일 수탁번호 제69055하에 이. 콜라이 형질전환체로서 아메리칸 타입 걸쳐 컬렉션(12301 Parklawn Dr., Rockville, MD20852)에 기탁하였다. 클론 40-2-2의 부분적 DNA 서열 및 이의 추론된 아미노산 서열은 서열확인번호: 17 및 18로 나타낸다.
필터 하이브리드화중에 글루카곤 수용체 서열의 존재를 확증하기 위해, 각각의 플라스미드 DNA 제제(각각의 이중 필터로부터 제조한 플라스미드 DNA 및 각각 3개의 10-2평판로부터 제조한 플라스미드 DNA)상에서 PCR 증폭 반응을 수행한다. 수집된 플라스미드 DNA를 각각 물중에서 1:20으로 희석하고, 각각의 DNA 1μl를 상술한 바와 같이 설정하여 수행하는 PCR 반응에서 주형으로서 사용한다. 수득되는 PCR 산물의 아가로즈 겔 전기영동은 풀 #2 및 10,000의 4개의 풀중 3개가 310 내지420bp 사이의 PCR-생성 밴드를 함유함을 나타낸다. 평판 #2에 상응하는, 풀 #2내 PCR-생성 밴드의 존재는 글루카곤 수용체 DNA 서열의 존재를 확증한다.
F. 사람 글루카곤 수용체의 5' 서열을 클로닝하기 위한 전략
클론 40-2-2의 부분적인 cDNA 서열의 분석 및 완전한 길이의 래트 글루카곤 수용체 cDNA 서열의 분석은, 40-2-2 클론에서 대략 25개 아미노산에 상응하는 아미노-말단 서열이 상실되었음을 나타낸다. 5' 사람 글루카곤 수용체 cDNA 서열은 프로흐만 (Frohman) 등의 방법(참조: Proc. Natl. Acad. Sic. USA 85:8998-9002, 1988)의 변형을 사용하여 수득한다. 요약하면, 올리고뉴클레오타이드 프라이머를, 40-2-2 암호 서열의 5' 말단 근처의 서열에 상기 서열이 하이브리드화되도록 설계한다. 이 프라이머를 G-테일링(tailing)된 사람 간 제1 쇄 cDNA 주형에 하이브리드화하고, 프라이머를 Taq I DNA 폴리머라제를 사용하여 5' 말단에 연장시킨다. 제2 폴리 d(C) 프라이머를 G-테일링된 cDNA 주형에 어닐링시켜 폴리머라제 연쇄 반응 증폭시킨 후, 연속적으로 클로닝하고, 서열분석하고 클론 40-2-2 중에 존재하는 암호 서열에 스플라이싱(splciing)시킨다.
3개의 cDNA 주형을 제조한다. 제1 주형은 시판되는 사람 간 제1 쇄 cDNA이다. 제2 및 제3 cDNA 주형은 사람 글루카곤 수용체에 대해 특이적인 서열을 함유하는 올리고 뉴클레오타이드를 사용하거나 전통적인 올리고 d(T) 프라이밍을 사용하여 시판되는 사람 간 mRNA(Clontech)로부터 제1 쇄 cDNA를 합성함으로써 제조된다.
사람 글루카곤 수용체 암호화 서열에 대해 특이적인 올리고뉴클레오타이드 ZC5433(서열확인번호: 13)을 사용하여 사람 간 mRNA로부터 합성에 의해 제2의 cDNA주형을 제조한다. 1μg/μl 사람 간 mRNA 2μl, 20pmole/μl ZC5433(서열확인번호: 13) 8μl 및 10mM 트리스 0.5μl, pH 7.4, 0.1mM EDTA를 함유하는 반응 혼합물을 68℃에서 7분간 배양한 후 빙상에서 빙상에서 2분간 배양한다. 배양후, 반응 혼합물에 5x SUPERSCRIPT 완충액(GIBCO-BRL) 4μl, 200mM 디티오트레이톨 1μl, 각각의 dNTP 10mM을 함유하는 용액 1μl, 0.25μ Ci/μl α32p-dCTP 1μl 및 SUPERSCRIPT 역 전사효소 5μl를 공급한다. 이 반응물을 45℃에서 1시간 동안 배양한다. 배양후, 반응물을 50℃에서 10분간 배양한다. TE 80μl를 가하여 반응을 종결시킨다. RNA를 0.5M EDTA 1μl 및 KOH 1μl를 가하여 가수분해한다. 가수분해 반응물을 65℃에서 5분간 배양한다. 배양후, 샘플을 50mM KOH, 0.1mM EDTA를 사용하여 1ml로 희석하고, 샘플을 CENTRICON 100 농축계(Amicon, Danvers, Mass) 상에 통과시킨다. 컬럼을 50mM KOH 1ml, 0.1mM EDTA로 세척한다. 농축된 cDNA를 수집하고 100mM HCl 1/2 용적으로 중화시킨다. 중화된 cDNA 샘플을 에탄올 침전시키고, 침전물을 증류수 26μl 중에 재현탁시킨다.
시판되는 올리고 d(T) 프라이머를 사용하여 사람 간 mRNA로부터 합성에 의해 제3 cDNA 주형을 제조한다. 반응 혼합물은 1μg/μl 사람 간 mRNA 2μl, 1μg/μl 올리고 d(T) 18(New England Biolabs, Beverly, Mass) 1μl 및 10mM 트리스 (pH 7.4) 5μl, 0.1mM EDTA를 함유하도록 제조한다. 상술한 합성을 위해 설정된 조건을 사용하여 cDNA를 합성한다.
다음 제1 쇄 cDNA를 G-테일링한다. 반응 튜브는, 사람 간 제1 쇄 cDNA QUICKCLONE; Clontech, Palo Alto, Calif.) 4μl, ZC5433(서열확인번호: 13)프라이머로부터의 사람 간 제1 쇄 cDNA 또는 올리고 d(T) 프라이머로부터의 사람간 제1 쇄 cDNA 4μl를 함유하도록 설정한다. 각각의 반응 혼합물에 물 22μl, 5x 완충액(Promega) 8μl, 10mM dGTP 4μl 및 15U/μl 터미날 트랜스퍼라제 2μl를 공급하고, 반응물을 30분간 37℃에서 배양한 후 65℃에서 10분간 배양한다. 다음 반응물을 10mM 트리스(pH 7.4), 1mM EDTA를 사용하여 90μl로 희석하여 에탄올 침전시킨다.
G-테일링된 cDNA의 제2 쇄 합성을 동일하게 수행한다. 각각의 cDNA를 우선 증류수 50μl 중에 현탁시킨다. 다음 각각의 cDNA에 5μl중 ZC4814(서열확인번호: 20) 100pmol을 가한다. 이 cDNA를, 68℃에서 5분간 각 혼합물을 가열시킨 후 빙상에서 2분간 배양하여 프라이머에 어닐링시킨다. 프라이머를 각각의 cDNA에 어닐링 시킨 후, 각각의 혼합물에 5x 폴리머라제 I 완충액(실시예 1) 20μl, 100mM 디티오트레이톨 1μl, 각각의 dNTD 10mM을 함유하는 용액 2μl, 0.5μ Ci/μl α32p-dCTP 2 μl, 3U/μl 이. 콜라이 DNA 리가제(New England Biolabs) 1μl, 7U/μl 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I(Amersham) 5μl을 가한다. 이 반응물을 5분간 22℃에서 배양한 후 2U/μl RNase H(GIBCO- BRL) 1.5μl를 가한후 16℃에서 2시간 동안 배양한다. 반응을, 10mM 트리스(pH 8.5) 200μl, 1mM EDTA에 이어 물-포화된 페놀 150μl 및 클로로포름 150μl를 가하여 종결시킨다. 이 혼합물을 와동시킨 후 22℃에서 3분간 원심분리하여 상을 분리한다. 수성상을 제거하고 상술한 바와 같이 페놀 및클로로포름으로 재추출한다. 제2의 페놀-클로로포름 추출후, 수성층을 클로로포름으로 추출한다. 수성층중 cDNA를 5μg 홍합 글리코겐 5μg, 8M 암모늄 아세테이트 100μl 및 이소프로판올 300μl를 가하여 침전시킴으로써 상층액중 혼입되지 않은 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 남겨두고 더 큰 핵산을 선택적으로 침전시킨다. cDNA를 원심분리에 의해 펠렛화하고 이 펠렛을 70% 에탄올로 세척한 후 공기 건조시킨다. cDNA 펠렛을 이중-증발시킨 물 15μl 중에 재현탁시킨다.
ZC4814(서열확인번호: 20)의 5' 말단과 상동성이고 아클로닝을 용이하게 하기 위한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 함유하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 및 40-2-2 클론중에 존재하는 암호 서열의 5' 말단에 대해 특이적인 올리고뉴클오레타이드 프라이머를 사용하여 5개의 일련의 반응물 중에서 이본쇄 cDNA를 증폭시킨다. 각각의 반응 혼합물은 10x 태크 I 완충액 5μl, 25mM MgCl2 3μℓ, 각각의 dNTP 2.5mM을 함유하는 용액 5μℓ, 이본쇄 cDNA 1μl, 및 태크 I 폴리머라제(Promega) 0.5μl 를 함유한다. 증류수를 최종 용량 50μl이 되도록 가한다. 이 반응물을 10pmole/μl의 ZC5624(서열확인번호: 21) 및 20pmole/μl의 ZC4812(서열확인번호: 19) 각각 1μl를 가하기전 98℃에서 5분간 변성시킨다. 각각의 샘플을 90℃로 유지시킨 광오일 70μl로 피복한다. 반응물을 30주기(60초간 95℃, 40초간 57℃, 60초간 72℃ 로) 동안 증폭시킨 후 72℃에서 7분간 연장시킨다.
각각의 PCR 산물을 아가로즈 겔 전기영동시키고 증폭된 단편을 각각 절제하고 TA 클로닝 키트(Invitrogen)를 사용하여 pCR1000내로 아클로닝시킨다. 각각의 연결물로부터의 3개의 클론을 선별하여, 주형 DNA의 공급원인 클론으로부터의 접종물을 포함하는 각각의 독립적인 PCR 반응 혼합물중 올리고뉴클레오타이드 프라이머 ZC5624(서열확인번호: 21) 및 ZC4812(서열확인번호: 19)를 사용하여 삽입체의 존재를 분석한다. 30주기의 증폭을 수행하는 것외에는 상술한 바와 같은 PCR 반응을 수행한다. 각각 원래의 PCR 반응으로부터의 단일 삽입체-양성 클론을 DNA 서열 분석한다. 완벽한 5' 사람 글루카곤 수용체 암호화 서열을 함유하는 것으로 나타난 2개의 클론중 1개의 클론을 선별하여 5' 사람 글루카곤 수용체 암호화 서열을 제공한다. 클론 9A를 Eco RI 및 Kpn I으로 분해하여 글루카곤 수용체의 5' 암호 서열을 함유하는 551bp 단편을 수득한다. 3' 글루카곤 수용체 암호화 서열은 40-2-2로 부터의 561bp Kpn I-Bam HI 단편으로서 수득된다. Eco RI-Kpn I 단편 및 561bp Kpn I-Bam HI 단편을 Eco RI 및 Bam HI의 존재하에 연결하여 콘카토머화(concatomerization)를 방지한다. 연결 산물인 1112bp 단편을 겔 정제하여 9Al으로 지정한다. 편의상, 단편 9Al을 Eco RI-Bam HI-분해된 pUC18내로 연결한다. 연결 혼합물을 이. 콜라이 균주 DH 10b 세포내로 형질 전환시키고 선별한 콜로니를 삽입체의 존재에 대해 분석한다. 1개의 클론, 9All은 삽입체를 함유한다.
글루카곤 수용체 암호화 서열을 플라스미드 p9All 및 클론 40-2-2-를 사용하여 포유동물 발현 벡터내로 작제하여 완전한 글루카곤 수용체 암호화 서열을 수득한다. 플라스미드 p9All을 PvuII 및 Bam HI으로 분해하여 967bp 단편을 분리한다. 클론 40-2-2를 Bam HI 및 Sac I으로 분해하여 3' 사람 글루카곤 수용체 암호화 서열을 함유하는 828bp 단편을 분리한다. 포유동물 발현 벡터 pHZ1을 Eco RI으로 분해하여 선형화하고, 말단을 T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 평활말단화한다. 다음평활-말단화된 선형 벡터를 SacI으로 분해한다. Pvu II-Bam HI 단편 967bp 및 Bam HI-Sac I 단편 828bp을 Sac I-분해된 평활 말단의 pHZ1 벡터와 연결시킨다.
플라스미드 pHZ1은 시험관내에서 전사된 mRNA로부터 포유동물 세포내 또는 개구리 난모세포 해독 시스템내에서 단백질을 발현시키는데 사용될 수 있는 발현 벡터이다. pHZ1 발현 단위는 마우스 메탈로티오네인-1 프로모터, 암호 서열의 삽입을 위한 유일한 제한 부위를 함유하는 다수의 클로닝 뱅크에 의해 플랭킹된 박테리오파지 T7 프로모터, 사람 성장 호르몬 터미네이터 및 박테리오파지 T7 터미네이터를 포함한다. 또한, pHZ1은 이. 콜라이 복제기점, 세균의 β 락타마제 유전자, SV40 프로모터 및 복제 기점을 포함하는 포유동물 선별 마커 발현 단위, 네오마이신 내성 유전자 및 SV40 전사 터미네이터를 포함한다.
프로모터와 같은 방향으로 글루카곤 수용체 cDNA 서열을 함유하는 pHZ1 플라스미드를 pLJ6'으로 지정한다. 삽입체 및 벡터 연결물을 서열분석하여 정확한 서열의 존재를 확증한다. 플라스미드 pLJ6'은 1993년 1월 15일 수탁번호 제69183호 하에 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(12301 ParkLawn Drive, Rockville, MD 20852)에 수탁되었다. pLJ6' 중에 존재하는 DNA 서열 및 글루카곤 수용체 cDNA의 추론된 아미노산 서열은 서열확인번호: 24 및 서열확인번호: 25로 나타낸다.
실시예 6
사람 소도 세포로부터 글루카곤 수용체 cDNA의 클로닝
사람 간 세포로부터 글루카곤 수용체를 클로닝하는 것외에, 글루카곤 수용체 cDNA를 사람 소도 세포 라이브러리로부터 수득한다. 사람 소도 세포 cDNA 라이브러리(실시예 1C)의 분취량을, 사람 글루카곤 수용체 cDNA의 5' 비해독 서열로부터의 서열에 의해 플랭킹된 Eco RI을 함유하는 센서 올리고뉴클레오타이드인 올리고뉴클레오타이드 ZC5763(서열 확인번호: 22) 및 사람 글루카곤 수용체 cDNA의 3' 비해독 서열로부터의 서열에 의해 플랭킹된 Xho I 부위를 함유하는 안티센스 올리고 뉴클레오타이드인 올리고뉴클레오타이드 ZC5849(서열확인번호: 23)을 사용하여 PCR 증폭시킨다. 올리고뉴클레오타이드 프라이머중에 제한 부위를 혼입하면, 수득되는 PCR 산물을 적합한 플라스미드 벡터내에 양방향으로 클로닝하기가 쉬워진다. PCR 반응 혼합물은, 소도 세포 cDNA 라이브러리 (실시예 1.C) 4μl, 10x 프로메가 PCR 완충액(Promega) 8μl, ZC5763(서열확인번호: 22) 20pmols, ZC5849(서열확인번호: 23) 20pmols, 각각의 데옥시리보뉴클레오타이드 20mM를 함유하는 용액 1μl 및 물 46.5μl를 함유하도록 한다. 이 혼합물을 3분간 95℃로 가열한 후, 열을 3분간 80℃로 강하시킨다. 이 혼합물을 사용할 때까지 80℃로 유지시킨다. 반응을 개시하기 위해, 10x 프로메가 PCR 완충액(Promega) 2μl, 5U/μl 태크 I 폴리머라제(Cetus) 2μl 및 물 16μl를 반응 혼합물에 가한다. 이 반응물을 광오일(Sigma) 50㎕로 피복하고, 반응을 30주기[95℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 2분 15초(72℃에서의 배양은 매 주기마다 3초씩 증가한다)]로 배양한 후, 72℃에서 10분간 배양한다. 최종으로 72℃에서 배양한 후, 이 반응물을 4℃에서 유지시킨다. PCR 산물의 10μl 분취량의 아가로즈 겔 전기영동은 대략 1.8 내지 1.9kb 단편의 존재를 입증한다. pLJ6'중에 존재하는 사람 글루카곤 수용체 cDNA를 기준으로 하여, 대략 1846bp의 단편이 예상된다.
PCR 반응물을 클로로포름으로 추출한 후, 2회의 페놀: 클로로포름 추출 및 최종의 클로로포름 추출을 수행한다. 최종 추출후, 4μg/μl 글리코겐 담체(Boehringer Mannheim Corporation) 5μl를 가하고, 이 혼합물을 암모늄 아세테이트 및 에탄올 존재하에 침전시킨다. 이 DNA를 원심분리로 펠렛화하고, 이 펠렛을 70% 에탄올로 세척한다. DNA 펠렛을 물중에 재구성 시키고 Xho I 및 Eco RI으로 분해한다. DNA를 겔 정제하여, Xho I 및 Eco RI으로 선형화한 플라스미드 pBLUESCRIPT SK*(Stratagene Cloning Systems)내에 아클로닝시킨다. 연결 혼합물을 이. 콜라이 균주 DH10B 세포(GIBCO-BRL)내로 형질전환시킨다. 플라스미드 DNA를 선별된 형질전환체로부터 제조하고, 이 DNA를 제한 효소 및 서던 블롯 분석에 적용한다. 클론을 pLJ6'중에 존재하는 사람 글루카곤 수용체 cDNA 삽입체와 비교한다. 진단용 제한 효소 분해를 기초로 하여, 선별된 클론을 서열분석한다. 서열분석은 하나의 클론, 즉 PSLIGR-1이 글루카곤 수용체 암호화 서열을 함유함을 나타낸다. pLJ6'중에 존재하는 간 cDNA와 비교한 결과, PSLIGR-1의 암호 영역은 글루카곤 수용체 암호화 영역내에 3개의 뉴클레오타이드 변화를 포함한다. 뉴클레오타이드 변화중 1개는 사이런트 돌연변이(silent mutation)이며, 나머지 2개는 표 5에 나타낸 바와 같이 보존성 아미노산의 변화를 가져온다. 이러한 변화의 분석은, 이들이 대립 유전자 변화를 나타내는 다형성의 차이로 인한 것임을 나타낸다.
표 5
실시예 7
사람 글루카곤 수용체 유전자의 클로닝
사람 글루카곤 수용체 게놈성 클론을 수득하기 위해, 게놈성 DNA의 2개의 라이브러리를 프로브로서 사람 글루카곤 수용체 cDNA를 사용하여 스크리닝한다. 증폭된 사람 λFIX II 백인 남자 태반 게놈성 라이브러리 및 증폭된 사람 폐 λFIX 게놈성 라이브러리(이 라이브러리 모두는 Stratagene Cloning Systems, Catalog numbers 946203 및 944201로부터 각각 수득된다)를 사람 글루카곤 수용체 유전자에 대해 스크리닝한다.
증폭된 사람 폐 게놈성 라이브러리를 연마하고 대략 4 x 104플라크 형성 단위(pfu)를 직경이 150mm인 30개의 평판에 각각 이. 콜라이 균주 LE392 세포(Stratagene Cloning Systems)로 플레이팅한다. 추가로 10개의 평판에 이.콜라이 균주 LE392 세포 및 대략 6 x 104pfu/평판으로 플레이팅한다. 이 평판을 37℃에서 밤새 배양하고, 선별을 위해 30개 평판을 선별한다.
각각의 30개 평판에 대해 이중 필터를 제조한다. 각각의 필터를 업자의 추천법에 따라 HYBOND 나일론 막 (Amersham)으로 평판을 피복하여 제조한다. 필터를 평판로부터 들어내고, 세포를 1.5M NaCl, 0.5M NaOH 중에서 5분간 실온으로 분해한다. 필터를 5분간 1M 트리스-HCl (pH 7.5), 1.5M NaCl 중에서 중화하고, 필터를 STRATALINKER (Stratagen Cloning Systems)내에서 UV 에너지 1200μ Joules로 고정시킨다. 필터를 고정시킨후, 필터를 0.25 x SSC, 0.25% SDS, 1mM EDTA중에서 65℃로 3회 예비세척한다. 필터를 예비 세척한 후, 필터를, 0.45μm 필터를 통과시켜 여과하고 사용전에 즉시 열-변성시킨 연어 정자 DNA 100μg/ml(최종농도)를 가한 예비하이브리드화 용액(5 x SSC, 5x Denhardt 용액, 0.2% SDS, 1mM EDTA) 중에서 예비하이브리드화한 10개의 필터의 6개 배취로 쪼갠다. 이 필터를 65℃에서 밤새 예비하이브리드화 한다.
p40-2-2로부터의 사람 글루카곤 수용체 cDNA를 업자의 추천법을 사용한 Amersham MEGAPRIME 키트(Amersham)를 사용하여 램덤-프라이밍한다. 필터의 각각의 배취로부터의 예비하이브리드화 용액을 28.5 x 106cpm의 프로브를 함유하는 새로운 예비하이브리드화 용액으로 교체한다. 이 필터를 65℃에서 20시간 동안 하이브리드화한다. 하이브리드화후, 하이브리드화 용액을 제거하고, 필터를 실온에서 0.25 x SSC, 0.2% SDS, 1mM EDTA를 함유하는 세척 용액 중에서 매 4 또는 5회 세정한다. 세정후, 필터를 세척 용액중에서 65℃로 8회 연속적으로 세척한 후, 70℃로 최종적으로 세척한다. 70℃로 세척한 후, 필터를 방사선사진 필름(XAR-5; Eastman Kodak Co.; Rochester, NY)에 4일간 -70℃에서 강화 스크린으로 노출시킨다.
방사선 사진의 실험은 방사선 표지된 프로브와 하이브리화하는 4개 영역의 존재를 나타낸다. 4개 영역 각각으로 부터의 아가 플러그(plug)를 정제하기 위해 집어낸다. 각각의 아가 플러그를 SM(Maniatis et al., eds, Molecubr Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1982; 본원에서 모두를 인용) 1ml, 1% 클로로포름 중에 밤새 침지시킨다. 밤새 배양한 후, 각각의 플러그로부터의 파지를 SM중에서, 1:1000으로 희석시킨다. 5, 25 및 50μl의 분취량을 이. 콜라이 균주 LE392 세포와 함께 플레이팅한다. 이 평판을 배양하고, 단일 리프트를 5 및 25μl 플레이팅으로부터의 평판으로부터 제조한다. 상술한 바와 같이 필터를 제조, 예비하이브리드화, 하이브리드화 및 세척한다. 필터를 방사선사진 필름에 노출시킨다.
방사선 사진의 실험은 4개의 클론 각각으로부터 양성적으로 표지된 영역을 나타낸다. 총 10개의 아가 플러그를 원래의 클론 각각에 대해 2개 이상의 양성 영역을 나타내는 양성 영역으로부터 집어낸다. 이 아가 플러그를 상술한 바와 같이 처리한다. 각각의 아가 플러그로부터의 파지를 SM 중에서 1:10,000으로 희석한다. 2.5 및 10μl의 분취량을 이. 콜라이 균주 LE392 세포와 함께 플레이팅한다. 이 평판을 배양하고, 단일 리프트를 적합하게 분리된 플라그를 지닌 평판으로부터의 평판으로부터 제조한다. 필터를 상술한 바와 같이 제조하여 하이브리드한다. 필터의 방사선사진은 명확한 플라그에 상응하는 노출영역을 나타낸다. 4개의 원래의 클론 각각으로부터 1개 이상의 클론이 양성인 12개의 양성 플라그를 집어낸다. 각각의 평판으로부터 1개의 플라그를 추가의 분석을 위해 선별한다.
파지 클론 2-2-1, 3-1-1, 14-2-1 및 11-2-1로부터의 아가 플러그를 상술한 바와 같이 처리한다. 이 파지를 SM 중에서 1:1000으로 희석하고 이. 콜라이 LE392 세포 배양물내에 접종한다. 이본쇄 DNA를 실질적으로 그로스버거(Grossberger; Nuc, Acids Res. 15:6737, 1987, 본원에서 참조로 인용)가 기술한 바와 같이 제조한다. 이본쇄 DNA를 XbaI으로 분해하여 게놈성 삽입체를 유리시킨다. 아가로즈 겔 전기영동은 클론 2-2-1 및 11-2-1이 9kb XbaI 삽입체를 함유하며, 클론 14-2-1이 15kb 삽입체를 함유하고 클론 3-3-1이 13kb 삽입체를 함유함을 입증한다. XbaI-분해되고 XbaI-Bam HI-분해된 클론의 서던 블롯 분석은 사람 글루카곤 수용체 cDNA가 표 6에 나타낸 단편에 하이브리드화됨을 나타낸다.
추가로 분석하기 위해 클론 11-2-1 및 14-2-1을 선별한다. 클론 2-2-1은 클론 11-2-1과 동일하므로 추가로 분석하지 않는다. 편의상, 클론명을 표 6에 반영된 바와 같이 변경한다. 이본쇄 DNA를 실질적으로 마니아티스(Maniatis)가 기술한 방법을 사용하여 플라스미드내로 아클로닝하기 위한 각각의 파지 클론으로부터 제조한다. DNA를 Xba I으로 분해하고, 겔-정제하며 Xba I로 분해하여 선형화하고 재환형화를 방지하기 위해 송아지 알칼린 포스파타제로 처리한 플라스미드 pBLUESCRIPT SK+(Stratagene Cloning Systems)내로 아클로닝시킨다. 연결 혼합물을 BioRad GENEPULSER(Bio-Rod Laboratories; Richmond, CA)로 400 ohms, 25μ farads 및 2.3KV에서 ELECTROMAX DH10B 세포(GIBCO-BRL)내로 전기천공을 통해 도입한다. 플라스미드 DNA를 선별된 형질전환체로부터 제조한다. 클론 6 및 2로부터의 게놈성 삽입체를 함유하는 클론을 각각 pSLHGR6 및 pSLHGR2로 명명한다. 클론 pSLHGR6 및 pSLHGR2을 서열분석한다. 서열분석 및 사람 글루카곤 수용체 cDNA의 암호 영역과의 비교는 암호 영역을 지닌 12개 엑손의 존재를 나타낸다. 염색체 위치 분석은 실질적으로 두르남(Durnam) 등이 기술한(참조: Mol. Cell. Biol 8;1863-1867, 1988, 본원에서 참조로 인용) 바와 같이 제조한 중기 염색체 스프레드(spread) 상에서 바이오티닐화된 사람 글루카곤 수용체 유전자 프로브 및 염색체 17-특이적인 중심절(centromere) 프로브를 사용하여 수행한다. 염색체 변성, 하이브리드화 및 단일색 검출은 핑클(Pinkel) 등의 방법(참조: Proc. Natl. Acad. Sci US 83:2934-2938), 1986, 본원에서 참조로 인용) 및 기에비트 (Kievits) 등의 변형법(참조: Cytogenet. Cell Genet. 53:134-136, 1990, 본원에서 참조로 인용)에 따라 수행하는데, 단 하이브리드화를 65%(vol/vol) 포름아미드/10% 덱스트란 설페이트/2x SSC 내에서 수행하고, 하이브리드화 후 세척을 65% 포름아미드/2x SSC로 42℃에서 수행한 후 팔미터(Palmiter) 등의 기술한 바와 같이(참조: Proc. Natl. Acod. Sci. USA 89:6333-6337, 1992, 본원에서 참조로 인용) 0.1x SSC로 55℃에서 세척하는 것은 예외이다. q25위치는 테스타(Testa) 등의 방법(Cytogenet. Cell Genet. 60:247-249, 1992, 본원에서 참조로 인용)에 따라 하이브리드화된 중기 스프레드 일부를 DAPI 염색하여 확증한다. DAPI 염색은 Q-밴드와 유사한 패턴을 만든다.
증폭된 사람 태반 게놈성 라이브러리(Stratagene)는 상술한 방법을 사용하여 글루카곤 수용체 유전자에 대해 완전치않게 선별한다. 요약하면, 라이브러리를 연마하고 이. 콜라이 균주 LE392 세포 및 대략 5 x 104pfu를 각각의 30개 150-mm 평판 상에 플레이팅한다. 또한, 11개의 150-mm 평판을 대략 105pfu 및 이. 콜라이 LE392 세포으로 각각 플레이팅한다. 평판을 밤새 37˚C에서 배양하고 38개 평판을 스크리닝하기 위해 선별한다.
나일론 필터 리프트를 상술한 바와 같이 제조, 세척 및 예비하이브리드화한다. 사람 소도 글루카곤 수용체 cDNA 단편, G30(실시예 4)를 업자의 추천법에 따라 Amersham MEGAPRIME 키트(Amersham)를 사용하여 랜덤 프라이밍한다. 필터의 각각의 배취로부터 예비하이브리드화 용액을 1.1 x 106cpm의 프로브를 함유하는 새로운 예비하이브리드화 용액으로 교체한다. 필터를 65˚C에서 밤새 하이브리드화한다. 하이브리드화 후, 하이브리드화 용액을 제거하고, 필터를 0.25x SSC, 0.25% SDS, 1mM EDTA 함유 세척 용액중에서 실온으로 각각 4 또는 5회 세정한다. 세정 후, 필터를 세척 용액중에서 65˚C로 8회 연속 세척한다. 70˚C에서 세척한 후, 필터를 방사선사진 필름(XAR-5; Eastman Kodak Co.)에 4일간 -70˚C에서 강화 스크린을 사용하여 노출시킨다.
방사선사진의 실험은 확증적인 양성 시그날이 없음을 나타내나, 약하게 표지된 영역에 상응하는 7개 영역을 추가 분석을 위해 집어낸다. 이 클론을 상술한 바와 같이 제2 스크린에 적용시키나, 제2 스크린의 방사선사진은 표지된 영역이 없음을 나타낸다. 이 클론은 분석하지 않는다.
실시예 8
포유동물 세포내에서 글루카곤 수용체 cDNA의 발현
A. BHK 570 세포내에서 래트 글루카곤 수용체의 발현
플라스미드 pLJ4를 실질적으로 그라함 및 반데름 엡(Graham 및 Uan der Eb; Virology 52:456, 1973. 본원에서 참조로 인용)이 기술한 칼슘 포스페이트 방법을 사용하여 BHK570 세포(아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션에 수탁번호 10314로 기탁)내로 플라스미드 pLJ1과 함께 공동-형질감염시킨다. 플라스미드 pLJ1은 아데노바이러스 5ori, SV40 인핸서, 아데노바이러스 2 주요 후기 프로모터, 아데노바이러스 2 삼부체 리더, 5' 및 3' 스플라이스 부위, DHFRrcDNA, SV40 폴리아데닐화 시그날 및 pML-1 벡터 서열을 포함하는 플라스미드 p416으로부터 유래된다(참조: Lusky and Botchan, Nature 293:79-81, 1981). p416으로 부터의 Eco RI-Xba I DHFR 발현단위를 Eco RI 및 Xba I으로 분해하여 선형화한 pUC18내로 연결시켜 플라스미드 pLJ1을 작제한다. 형질 감염된 세포를 생장 배지[Dulbecco's modified Eagle'smedium(DMEM); 10% 송아지 태 혈청, 1x PSN 항생물질 혼합물(GIBCO BRL 600-5640), 및 20mM L-글루타민 함유]상에서 생장시킨다. 비-선택성 생장 배지중에서 몇일간 배양한 후, 성장 배지를 선별 배지(250mM 메토트렉세이트(MTX)를 함유하는 생장 배지)로 교체한다. 세포를 쪼개고 선별 배지 중에서 1:20 및 1:50으로 희석하여 10-cm 평판내로 옮긴다. 250mM MTX 중에서 선별한지 7 내지 10일후, 클로닝 실린더를 사용하여 콜로니를 집어내어 24-웰 평판내로 옮긴다. 수득되는 콜론을 상술(실시예 3)한 바와 같이 글루카곤과 결합할 수 있는 능력에 대해 시험한다. 2 x 105세포의 각각의 클론을 24-웰 평판의 웰에 플레이팅함으로써 전체 세포상에서 글루카곤 결합을 수행한다. 평판을 5% CO2중에서 72시간 동안 37˚C로 배양한다. 글루카곤 결합을 최종 PBS 세척후, 세포를 트립신화에 의해 웰로부터 제거하여 튜브 내로 옮기는 것외에는, 실시예 3에 기술된 바와 같이 수행한다. 이 튜브를 계수기로 계수한다. 가장 높은수를 지니므로 글루카곤과 가장 잘 결합할 수 있는 세포를 추가의 특성 확인을 위해 선별한다. 선별된 형질전환체를 실시예 8D에 기술한 바와 같이 글루카곤-매개된 cAMP 반응 및 실시예 8E에 기술된 바와 같이 글루카곤-매개된 세포내 칼슘 반응에 대해 검정한다. 글루카곤 결합 검정을 후술한 바와 같이 형질감염체로부터의 막 제제상에서 수행한다.
B. 막 제제를 사용한 글루카곤 결합
pLJ14 BHK 형질감염체로부터의 막을 래트 간 막 제제와125I-글루카곤에 결합할 수 있는 능력에 대해 비교한다. 막은 실질적으로 로드벨(Rodbell) 등이 기술한바와 같이 제조한다(참조: J. Biol. Chem, 246:1861-1871, 1971, 본원에서 참조로 인용). 간 막의 2개의 배취를 12 내지 16마리의 참수시킨 어린 암컷 래트로부터의 간 약 80gm으로부터 각각 제조한다. 간을 빠르게 제거하여 빙냉된 비이커내에 둔다. 간을 10g 분획으로 분리한다. 이 분획을 가위로 잘게 썰어 결합 조직을 써는 과정동안에 제거한다. 이 분획을 다운스 균질화기(Dounce homogenizer)로 별도로 균질화시킨다. 각각의 분획에, 배지(표 2) 25ml를 균질화기내의 잘게썬 조직에 가하고, 조직을 얼음 버킷(bucket)내에서 자유 막자(loose pestle)로 8회 격렬하게 스트로크(stroke)하여 균질화시킨다. 균질화한 후, 균질물을 냉 배지(표 2) 450ml 내에 수집한다. 수집된 균질물을 3분간 교반하고 2개층의 무명(cheesecloth)을 통해 여과한 후 4개 층의 무명을 통해 여과한다. 균질물을 30분간 1500xg에서 4˚C로 원심분리한다. 상층액을 버리고, 펠렛을 깨끗한 다운스 균질화기내로 수집한다. 이 펠릿을 자유 막자로 3회 약하게 스트로크하여 재현탁시킨다. 재현탁된 펠렛을 69% 슈크로즈 용액 62ml를 함유하는 250ml 분도기(graduate)내로 따라낸다(표 2). 증류수를 최종 용량이 110ml가 되도록 가하고, 이 혼합물을 완전히 혼합한후 차게 유지한다. 용액의 농도를 굴절계(Bausch & Lomb, Rochester, N. Y)로써 측정한 바와 같이 69% 슈크로즈 또는 물을 사용하여 44.0% +/-0.1%로 조정한다. 슈크로즈 현탁액을 한외원심분리기 튜브(25 x 89mm)내에 균일하게 분산시킨다. 각각의 현탁액을 42.3% 슈크로즈 용액(표 2) 20ml으로 조심스럽게 피복하고, 현탁액을 4˚C에서 SW28 로터(Sorvall, Dupont Company, Wilmington, Del.)내에서 150분간 24,000rpm으로 원심분리한다.
원심분리한 후, 각각의 튜브로부터의 부유물질을 18-게이지 주사바늘을 통해 10ml짜리 주사기내로 흡입시켜 제거한다. 각각의 튜브로부터의 물질을 수집하여 주사바늘을 통해 혼합물을 빨아들였다가 분출함으로써 배지(표 2) 약 100ml 중에 재현탁시켜 원심분리 튜브내로 옮긴다. 이 튜브를 배지(표 2)로 충전시킨 다음 SS-34로터(Sorvall) 내에서 15분간 15,000 RPM으로 원심분리한다.
상층액을 조심스럽게 따라 버린다. 펠렛을 배지(표 2) 중에 재현탁시키고 증류수로써 1:1000으로 희석한다. 흡광도를 1cm 큐벳내에서 판독하여 단백질 농도를 측정한다. 단백질 농도는 하기 식을 사용하여 측정한다:
막 제제를 분취하여 드라이아이스/에탄올 욕 중에 동결시켜 -80℃에서 저장한다.
막은 선택 배지중 150-mm 평판에서 군집상태(confluency)에 이를때까지 성장시킨 BHK 형질감염체로부터 제조한다. 군집된(confluent) 형질감염체의 2개의 평판을 냉 인산염 완충된 염수(PBS; Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.)로 2회 세정하고, 1mM PMSF를 함유하는 PBS 10ml를 각각의 평판에 가한다. 각각의 평판으로부터의 세포를 PBS 용액내로 스크래핑하고, 각각의 평판으로부터의 세포를 각각 새로운 튜브내에 이전시킨다. 각각의 평판을 1mM PMSF를 함유하는 PBS 5ml로 세정하고, 세정물을 각각의 세포와 함께 수집한다. 세포를 테이블 톱 원심분리기(table top centrifuge)내 4˚C에서 2,000rpm으로 원심분리한다. 상층액을 버리고, 세포를30ml 5mM Hepes, 1mM PMSF, pH 7.5중에 재현탁시킨다. 세포를 빙상에서 15분간 배양한 후 47,800xg로 4˚C에서 원심분리한다. 각각의 펠렛을 1M PMSF를 함유하는 PBS 용액중에 재현탁시키고, 분취하여 -80˚C에서 동결시킨다.
글루카곤 결합 검정을 사용한 경쟁 분석을 래트 간 및 BHK 형질전환체 막 제제상에서 수행한다. 요약하면, BSA 20μl 또는 HOAC 10mM 중에 10-11M 내지 10-6M로 희석시킨 글루카곤 20μl를 함유하는 반응 튜브를 제조한다. 각각의 튜브에 2x 결합 완충액 100μl;125I-글루카곤(Amersham) 20μl; 1mM NaHCO320μl; 10mMHOAc 20μl, 0.5% BSA(Novo Nordisk N/A, Bagsvaerd, Demmark); 및 증류수 40μl를 가한다. 결합 반응을 막 제제 20μl를 반응 튜브에 가하여 개시한다. 이 반응물을 30분간 30˚C에서 배양한다. 막을 원심분리기 내에서 고속으로 10분간 4˚C에서 원심분리하여 펠렛화한다. 각각의 샘플로 부터의 상층액을 흡입하여, 펠렛을 계수한다. 표지되지 않은 글루카곤과의 경쟁으로 글루카곤 결합의 경우와 거의 동일한 S자 곡선이 수득된다(제3도). 스카트카드 분석(Scatchard analysis; Scatchard, Ann, N. Y. Acad. Sci. 51:660-672, 1949; 본원에서 참조로 인용)에 의해, 클로닝된 수용체에 대한 Kd는 50nM이고 래트 간 막에 대한 Kd는 49nM이다(제4도).
pLJ4에 의해 암호화된 수용체의 특이성을125I-글루카곤 결합에 대해 경쟁하는 관련된 펩타이드 호르몬의 능력에 대해 시험한다. μmole량의 글루카곤 및 관련된 펩타이드(표 7)를 각각 상술한 결합 검정중 pLJ4 형질감염체의 막 제제에125I-글루카곤과 함께 가한다. 천연 글루카곤 및 길항체 des-His' [Glu9] 글루카곤 아미드만이 막에 결합하는 것에 대하여125I-글루카곤과 경쟁할 수 있다.
C. COS-7 세포내에서 래트 글루카곤 수용체의 발현
글루카곤에 의해 자극되어 cAMP 수준을 증가시킬 pLJ4로 형질감염시킨 COS-7 세포의 능력을 후술하는 바와 같이(실시예 8D) Amersham SPA 키트(Amersham)를 사용하여 평가한다. 이 검정은, 글루카곤-자극된 pLJ4 형질감염체가 대조군 벡터만으로 형질감염시킨 COS-7 세포보다 cAMP를 약 5배 더 축적시킨다. 관련된 펩타이드세크레틴, VIP, PTH, GLP 및 칼시토닌을 각각 100nM 내지 1000nM의 농도로 형질 감염체에 가하여 cAMP 수준을 증가시킬 수 있는 이의 능력을 검정한다. 검정 결과는 관련된 펩타이드의 어느 것도 cAMP 수준을 현저히 증가시킬 수 없음을 나타낸다.
D. 전체 세포상에서 루시퍼라제 및 아데닐레이트 사이클라제 활성 검정
래트 글루카곤 수용체 cDNA를, 하나 이상의 사이클릭 AMP 반응요소를 함유하는 프로모터, 루시퍼라제 cDNA 및 hGH 터미네이터를 포함하는 발현 단위인 ZK6으로 안정하게 형질 감염시킨 BHK570 세포주내에서 발현시킨다. 이 세포주는, 글루카곤이 이의 수용체에 결합함에 의한 반응에서, 루시퍼라제 활성, 아데닐레이트 사이클라제 활성 및 세포내 칼슘 농도를 측정할 수 있게 허용한다.
플라스미드 ZK6내에서 프로엔케팔린 사이클릭 AMP 반응 요소(CRE)가 Zem 233으로부터 수득한다. Zem 233은 플라스미드 Zem 67 및 Zem 106으로부터 유래한다. 플라스미드 Zem 106은 전구체 Zem 93으로부터 작제된다. Zem 93을 작제하기 위해, MT-1 프로모터를 포함하는 Kpn I-Bam HI 단편을 MiThGHlll (Palmiter et al., Science 222; 809-814, 1983)로부터 분리하여 pUC18내로 삽입한다. 다음 플라스미드 Zem 93을 Sst I으로 분해하고 재-연결하여, MT-1 프로모터에 대해 5' 방향으로 약 600bp의 서열이 제거된 플라스미드 Zem 106을 생성시킨다.
프로엔케팔린 CRE는, 우선 Zem 106을 EcoRI 및 Sst I으로 분해하여 Zem 106 내지 SV40 프로모터의 5' 말단내에 삽입시켜 벡터-함유 단편을 분리한다. 올리고 뉴클레오타이드 ZC982 및 ZC983(서열확인번호: 3 및 4)은, 어닐링시, 5' EcoRI 부위 및 3' Sst I 부위에 의해 플랭킹된 뉴클레오타이드 -71 내지 -133(Comb et al.,Nature 323-353-356, 1986)으로부터의 프로엔케팔린 CRE를 암호화하도록 설계된다. 올리고뉴클레오타이드 ZC982 및 ZC983(서열확인번호: 3 및 4)을 키나제 처리하고, 어닐링하고, 선형화된 Zem 106과 연결시켜 플라스미드 Zem 224를 수득한다.
플라스미드 Zem 67은 pIC19R(Marsh et al., Gene 32: 481-486, 1984)을 Sma I 및 Hind III로 우선 분해함으로써 수득한다. 맵 위치 270(Pvu II)로부터 위치 5171(Hind III)에 이르는 SV40의 ori 영역을 선형화된 pIC19R에 연결하여 플라스미드 Zem 67을 수득한다. 플라스미드 pSV2-네오(American Type Culture Collection 수탁번호 제37149호)로 부터의 HindIII-Bam HI 네오마이신 내성 유전자-SV40 터미네이터 단편을 Hind III-Bgl II-분해된 Zem 67내로 삽입시켜 Zem 220을 수득한다.
플라스미드 Zem 220으로부터의 SV40 프로모터-네오마이신 내성 유전자-SV40 터미네이터 발현 단위를 Eco RI 단편으로서 분리한다. 플라스미드 Zem 224를 Eco RI으로 분해하고 송아지 알칼린 포스파타제로 처리하여 재환형화를 방지한다. 네오마이신 발현 단위 및 선형화된 Zem 224를 연결한다. CRE에 인접한 SV40 프로모터를 함유하는 플라스미드를 Zem 233으로 지정한다.
플라스미드 Zem 233에 추가의 CRE 서열, TATA 박스, 및 프로엔케팔린 CRE 서열의 3'쪽에 바로 위치한 lacZ 암호 부위 및 방향의 폴리(A) 서열을 삽입시켜 변형 시킴으로써, 수득되는 발현단위는 Zem 233중에 존재하는 네오마이신 내성 발현 단위와는 반대 방향으로 위치한다. 폴라스미드 Zem 233은 Sst I 및 Bam HI으로 분해하여 선형화한다. 올리고뉴클레오타이드 ZC3509 및 ZC3510 (서열확인번호: 5 및 6)은, 어닐링시 수득되는 이본쇄가 5' Sst I 점착성 말단 및 3' Eco RI 점착성 말단을 지닌 α 당단백질 CRE(Delegeane et al., Mol. Cell. Biol. 7:3994-4002, 1987)을 암호화하도록 설계한다. 올리고뉴클레오타이드를 표준 방법에 따라 어닐링한다. 티미딘 키나제 TATA 박스는 티미딘 키나제 유전자의 -79 내지 +18 뉴클레오타이드에 걸친 Eco RI-Pst I 단편으로서 수득된다(참조: Meknight, Cell 31:355-366, 1982). lacZ 유전자의 3' 서열 및 이와 결합된 폴리(A) 서열은, lacZ 암호화 영역 및 pUC18 벡터내에 클로닝된 마우스 프로타민 터미네이터 서열을 함유하는 플라스미드 pLacF(Jaques Peschon, Immunex Corp., Seattle, Wash.)로부터의 Pst I-Bam HI 단편으로서 수득된다. Sst I-Bam HI 선형화된 Zem 233, Sst I-Eco RI ZC3509/ZC3510 어댑터, Eco RI-Pst I TATA 박스 단편 및 Pst I- Bam HI lacZ 서열을 연결한다. Zem 233의 네오마이신 내성 유전자 발현 단위에 대해 정방향으로 위치한 발현 단위를 함유하는 플라스미드를 KZ5로 지정한다.
루시퍼라제 유전자 및 사람 성장 호르몬(hGH) 터미네이터 서열을 사용하여 KZ5중에 존재하는 lacZ 암호 서열 및 폴리(A) 서열을 교체한다. 루시퍼라제 유전자는 초기에는 1.7kb Xho I-Xba I 단편으로서 플라스미드 α-168luc(Delegeane et al., Mol. Cell. Biol. 7:3994-4002, 1987; 및 deWet et al., Mol. Cell. Biol. 7:725-737, 1987)로부터 입수되었다. hGH 터미네이터를 Zem 219b(수탁번호 제ATCC 68979호하에 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(Rockville, Md)에 이. 콜라이 형질전환체로서 기탁됨)로부터의 Xba I-Sal I 단편으로서 수득한다. 루시퍼라제 유전자 및 hGH 터미네이터 서열을 편의상 Xho I-Sal I 선형화된 pIC 19H(Marsh et al., ibid) 내로 아클로닝시킨다. 수득된 플라스미드 KZ8을 XhoI 및 SalI으로 분해하여 루시퍼라제-hGH 터미네이터 서열을 분리한다. 플라스미드 KZ5 유전자를 Sal I 으로 분해하여 단편을 함유하는 벡터를 분리하고 송아지 알칼린 포스파타제로 처리하여 재환형화를 방지한다. Xho I-Sal I 루시퍼라제-hGH 터미네이터 단편을 Sal I-분해된 KZ5와 연결한다. 프로모터에 대해 적절한 방향으로 위치한 루시퍼라제-hGH 터미네이터를 함유하는 플라스미드를 KZ6으로 지정한다.
실질적으로 문헌[참조: Graham and Van der Eb, Virology 52:456, 1973; 본원에서 참고로 인용되고 있음]에 기술된 바와 같은 인산칼슘 침전법을 사용하여 플라스미드 KZ6를 BHK 570 세포(아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁번호 10314로 기탁)내로 형질감염시킨다. 형질감염시킨 세포를 생장 배지[10% 태아 송아지 혈청, 1 x PAN 항생제 혼합물(지브코-BRL) 및 2.0mM L-글루타민을 함유하는 둘베코의 변형 이글(Eagle) 배지(DMEM)]에서 생장시킨다. 비-선택성 생장 배지에서 수일간 배양한 후, 생장 배지를 G418 선택 배지(500μg/ml의 G418을 함유하는 생장 배지)로 대체시킨다. 이후 세포를 군집상태에 이를때까지 생장시키고 이후 이를 트립신 처리하고 제한 희석으로 플레이팅하여 96-웰 평판의 웰내로 옮긴다. 세포를 G418 선택 배지내에서 1 내지 2주간 생장시킨다. 단일 콜로니를 함유하는 웰로부터의 클론을, 하기 기술하는 루시퍼라제 검정에서 폴스콜린(forskolin)에 대한 반응능력에 대해 분석한다. 폴스콜린은 세포성 cAMP 수준을 증가시키므로, 수용체-독립적 방법으로 관련된 cAMP-의존성 생물학적 반응 경로를 경유하게 된다. 폴스콜린에 반응할 수 있는 콜론을 BHK/KZ6-19-46으로 나타낸다.
인산칼슘-매개된 형질감염을 이용하여 상술한 바와 같이 BHK/KZ6-19-46 세포를 pLJ4와 pLJ1 또는 pZCEP와 pLJ1(pZCEP 형질감염체는 음성 대조군으로 사용)로 공동-형질감염시킨다. 전술한 바와 같이 형질감염체를 250nM 메토트렉 세이트에서 선별한다.
형질감염체는 선별된 효능제에 의한 CRE-루시퍼라제 반응을 유도하기 위해 3배수로 분석한다. 6개의 임의의 pLJ4 형질감염체를 분석하고, 임의의 pZCEP 형질 전환체를 분석한다(음성 대조군). 미세역가 검정 평판을, 100μl의 선택 배지중에 각 웰이 2 x 104세포를 함유하도록 하고, 세포를 밤새 생장시킨다. 효능제는 하기된 2x의 최종 검정 농도에서, 선택 배지중에서 제조한다.
3중 샘플 웰중에 100μl의 각각의 2x 용액을 가하여 유도를 개시한다. 미유도 수준은 10% 태아 송아지 혈청을 함유하는 100μl의 DMEM을 가하여 3중 웰에서 측정한다. 평판을 37℃, 5% CO2에서 4시간 배양시켜 루시퍼라제 생성을 유도한다.
유도후, 배지를 제거하고 웰을 200μl/웰 PBS로 1회 세척한다. 세척후, 25 μl의 1x Cell Cultue Lysis Reagant (위스콘신 메디슨 소재의 프로메가 코포레이션의 루시퍼라제 검정 시스템)를 각각의 웰에 가하여 평판을 실온에서 15분간 배양한다. 평판을, 40μl의 루시퍼라제 검정 기질(프로메가 루시퍼라제 검정 시스템 제조)을 가한 랩시스템스 루미노스칸(Labsystems Luminoskan) 미세역가 광도계(일리노이 오톤 그로브 랩시스텝스 인코포레이티드)로 옮기고, 3초간 반응물을 혼합하고 웰당 2초간 루시퍼라제 시그날을 통합시킨다. 각각의 효능제에 대한 배수 유도는 다음식으로 계산한다.
하나의 pLJ4 형질감염체 클론인 KZ6/rGR-DHFR-2는 글루카곤에 의한 루시퍼라제의 6-10배 유도를 나타냈으나 GLP, VIP 또는 CT에 의한 유도는 나타나지 않았다.
글루카곤 및 폴스콜린에 대한 형질전환체 클론 KZ6/rGR- DHFR-2의 cAMP 반응은 또한, 제조자의 지침에 따라, cAMP[125I] 신틸레이션 근측 검정 시스템(Amersham)을 방사면역분석으로 검정한다. 간단하게, KZ6/rGR-DHFR-2 세포 ml당 100μl의 2 x 105세포를 다중-웰 배양 접시의 웰내에 플레이팅시키고 선택배지 내에서 밤새 생장시킨다. 글루카곤 및 폴스콜린을 DMEM, 10% 태아 송아지 혈청, 10μM IBMX에서 각각 0.0001 - 1000nM 및 25μM으로 제조한다.
생장 배지를 50μl/웰의 효능제(글루카곤이나 폴스콜린으로)로 대체시킨다. 세포를 효능제와 함께 37˚C, 5% CO2에서 10분간 배양한다. 배양후, 각각의 웰에 200μl의 비등수를 가하여 세포를 용해시킨다. 15분후 상층액을 수거하고, 아세테이트 완충액중에서 1:5 또는 1:40으로 희석시킨다(cAMP[125I]신틸레이션 근측 분석 시스템(Amersham)). 제조자가 제공하는 프로토콜에 따라 트리에틸아민과 아세트산 무수물을 사용하여 샘플을 아세틸화한다.
100μl 분취량의 각각의 아세틸화한 샘플을, LKB T-트레이의 웰내에서, 75μl의125I-cAMP, 75μl의 항-석시닐 cAMP 항혈청 및 75μl의 당나귀 항-래빗 IgG 커플링된 SPA 비이드(모든 검정 용액은 cAMP[125I]신틸레이션 근측 분석 시스템(Amersham)에 제공됨)와 혼합한다. 트레이를 밀봉하고 회전 플랫폼 진탕기에서 200rpm으로 연속 진탕시키면서 밤새 배양한다. 샘플을 1205 BETAPLATE 액체 신틸레이션 카운터(미들랜드 게티스버그, 파마시아 LKB 인스트루먼츠 인코포레이티드 제조)로 계수한다. 2-128fmol 아세틸화된 cAMP의 표준곡선도 전개시킨다. 전체125I-cAMP 결합 및 비-특이적 결합도 측정한다. KZ6/rGR-DHFR-2는, 포화된 글루카곤(10-100nM)에서 140배의 cAMP 수준 유도를, 0.25nM에서 ED50을 나타낸다.
E. 세포내 칼슘 농도 측정
글루카곤에 대한 pLJ4 형질전환체의 세포내 칼슘 반응을 실질적으로 문헌[참조: Grynkiewiz et al., J. Biol. Chom. 260:3440-3450, 1985, 본원에서 참고로 인용됨]에 기술된 반응을 사용하여 분석한다. 플라스미드 pLJ4 BHK 형질전환체를 챔버당 5 x 104세포로 2 웰 커버글라스 챔버(NUNC)내에 시딩시킨다. 세포를 메토트렉세이트 선택 배지내에서, 정상 배양 조건하에서 1 내지 3일간 생장시킨다. 흡입시켜 배지를 제거하고, 챔버를 1ml의 이미징 완충액(표 3 참조)으로 2회 세정한다. 세포를 암실에서 실온으로 0.5ml의 푸라-2 AM 용액(표 3)과 30분간 배양한다. 배양후, 푸라-2 AM 용액을 제거하고 세포를 1ml 이미징 완충액으로 3회 세정한다. 최종 세정후 각각의 챔버에 0.5ml의 완충액이 잔류한다. 세포를 암실에서 실온으로 30 내지 120분간 정치시켜 둔다.
수은 아크등과 10X 및 40X 니콘 플루오르 드라이 대물렌즈가 장착된 니콘 디아포트 도립 형광현미경 하에서 영상화를 수행한다. 실험은, Sun SPARC II 워크스테이션과 이노비젼(노스케롤라이나 리써치 트라이앵글 파크 제조) RATIOTOOL 소프트웨어로 제어 및 분석한다. 교류 여기 파장은, 340nm와 380nm 밴드 통과 필터를 갖는 자동화된 필터 휠을 통해 상기 소프트웨어로 조절한다. 방출 영상은 이색성 거울(380nm 컷오프)에 의해, Genesis II 영상 강화기가 장치된 Dage-MTI72 CCD 카메라로 지시되고 소프트웨어에 의해 디지탈로 기록된다.
세포내 칼슘 농도를, 디지탈 현미경 영상 영역의 각각의 픽셀(512 × 480 픽셀)에 대한 각각의 2개 여기 파장 (340/380)에서의 방출 강도의 비율을 계산함으로써 모니터링 한다. 그린키에비쯔 등(상기 참조)은 이 같은 비율이, 세포를 로딩하기 위해 사용된 아세톡시메틸 유도체(푸라-2 AM)를 흡수하여 탈에스테르화시킨 세포내에서, 푸라-2 염료에 의해 가시화되는 칼슘 농도와 관련 있음을 보인바 있다. RATICTOOL 소프트 웨어는 이 같은 정보를, 칼슘 농도로 보정해 낼 수 있는 허상 칼라 영상으로서 나타낸다. 영상을 얻고 이 같은 계산을 각 실험 동안에 5초 간격으로 실시한다.
자극전에 기저 상태를 설정하기 위해 세포를 적어도 60초간(12개 영상) 모니터링한다. 자극은 200nM 글루카곤을 함유하는 0.5ml의 영상화 완충액을 커버글라스 챔버내의 0.5ml의 영상화 완충액에 가하여 수행하고, 이로써 100nM의 최종 농도를 수득한다. 세포를 모니터링하고 자극후 적어도 3분간 영상을 기록한다.
글루카곤 첨가 직후 각 영역에서 세포수에 상당하는 비율 영상이 급작스럽게 변화되는 것이 관찰된다.
RATIOTOOL 소프트웨어를 사용하여 이를 정량하여, 각각의 반응하는 세포에 상당하는 비율 영상의 특정 영역의 평균값을 계산한다. 대략 1.4의 평균 휴지 비율을 갖는 세포들은 3 내지 4의 값으로 급격하게 상승한다. 이들은 높은 값에서 40 내지 50초간 머문후에 기준선까지 서서히 소멸된다. 독립적인 보정 실험은 이같은 사실이, 대략 150nM의 휴지기 값으로부터 대략 400nM의 피크값으로 세포내 칼슘 농도의 변화를 반영함을 나타낸다.
F. 이노시톨 포스페이트 측정
pLJ4 또는 허위-형질감염된 BHK 570 세포로부터의 글루카곤 수용체를 발현하는 BHK 570 세포를 웰당 약 200,000 세포로 24-웰 조직 배양 접시에 플레이팅시킨다. 24시간후 각 웰 중의 세포를, 2.0μ Ci의 미오-(2-3H)이노시톨(비활성-20Ci/mmol; Amersham 제조)을 함유하는 0.5ml의 MTX 선택 배지 중에서 배양시켜 표지한다. 24시간 배양 말기에, 세포를, 10mM LiCl을 함유하는 20mM Hepes(pH 7.0) 완충액(시그마 케미칼 캄파니)으로 완충시킨, 1ml의 예열된 DMEM(둘베코의 변형시킨 이글 배지; JRH 바이오사이언시스, Lenexa, Kam.)로 세척한다. 세척 배지를 흡입시켜 제거하고 900μl의 신선한 완충 배지로 대체시킨다. 세포를 37˚C에서 5분간 배양 시킨다. 배양시킨후, 각각의 효능제와 길항제를 삼중 웰에 가하고 표 8에 나타낸 용량과 조건에 따라 배양시킨다.
표 8
세포를 빙상에 놓아 반응을 종결시킨다. 배지를 흡입 제거한 후, 1ml의 냉 DMEM과 1ml의 빙냉 10% 퍼클로로산을 가하여 세포를 용해시킨다. 10분후 세포 용해물을 각각 500μl 10mM EDTA(pH 7.0)를 함유하는 빙상의 튜브로 옮긴다. 6mM Hepes 완충액중 900μl의 1.5M KOH를 가하여 샘플을 중화시키고 pH가 7 내지 7.5 사이에 달할 때까지 KOH-HEPES 용액을 적가한다. 중화시킨 샘플을 밤새 -20˚C에서 동결시킨다.
동결된 샘플을 해빙시키고 침전물을 샘플로부터 침강시킨다. 상충액을, 각각 메탄올 및 1M KHCO35ml로 세척하고 이어서 15ml의 물로 연속 세척시킨 AMPREP 미니컬럼(Amicon 제조)에 적용시킨다. 샘플을 적용시킨후, 유동물을 수거한다.
컬럼을 1ml의 물로 4회 세척하고 1ml의 샘플을 각각의 세척후에 수거한다. 이노시톨 포스페이트를 각각의 적용후에 수거한 1ml의 샘플로, 1ml의 0.25M KHCO3를 4회 연속 적용하여 컬럼으로 부터 용출시킨다. 각각의 샘플에 10ml의 OPTIFLUOR(팩카드 인스트루먼트 캄파니, Menden, Conn.)을 가하고, 샘플을 계수한다. 이노시를 포스페이트 경로의 자극은 표지된 이노시톨 포스페이트 농도의 증가로 나타난다. 어떠한 샘플에서도 이노시톨 포스페이트 생성의 자극은 관찰되지 않았다.
G. COS7 세포내에서 사람 글루카곤 수용체의 발현
상술한 DEAE-덱스트란 방법을 사용하여 플라스미드 pLJ6'를 COS7 세포내로 형질감염시킨다. 형질감염시킨후 세포를 유리 챔버 슬라이드(실시예 3에서와 같음)상에서 72시간 동안 생장시킨다.125I-글루카곤을 사용한 원 위치(in situ) 글루카곤 결합분석 후, 실시예 3에 기술한 바와 같이 유제 방사선사진법을 수행한다. 50% 이상의 세포가 특이적 방식으로 글루카곤이 결합된 pLJ6'으로 형질감염되었다.
H. BHK570 세포내에서 사람 글루카곤 수용체의 발현
BHK570(아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁번호 10314로 기탁됨)을 인산칼슘 형질감염법(실시예 8)을 사용하여 플라스미드 pLJ6'으로 형질감염시킨다. 단일 콜로니가 가시화될 때까지 G418의 존재하에 형질감염된 세포를 선별한다. 클로닝 실린더를 사용하여 단일 콜로니를 클로닝시킨다. 상기한 바와 같이 수행된 요오드화 처리된 글루카곤에 대한 원 위치 결합을 사용하여, 클론이 글루카곤에 결합하는 것을 보여준다.
pLJ6'-형질감염된 세포를 실질적으로 실시예 8.C에 기술한 것과 같이 cAMP 축적에 대해 검정한다. 형질감염체는 글루카곤, 세크레틴, VIP 또는 GLP-1으로 자극시킨후 검정한다. 이 검정은 축적된 pLJ6-형질감염된 세포가, 대조군 세포 보다도 글루카곤 자극후 cAMP의 농도를 증가시킴을 보여주고 있다. 세크레틴, VIP 또는 GLP-1을 사용한 형질전환체의 자극은 증가된 cAMP 축적을 전혀 나타내지 않았다. 세포내 칼슘 반응은 실질적으로 실시예 8E에 기술된 바와같이 측정한다. 글루카곤-자극된 pLJ6'-형질감염된 세포는, 칼슘 지시제 Fura-2의 형광성의 신속한 상승으로 나타나는 바와 같이 세포내 칼슘 수준의 증가를 입증한다. 이러한 결과는, pLJ6'가 글루카곤과 결합할 수 있으며 시그날 전달을 용이하게 하는 작용성 사람 글루카곤 수용체를 암호화함을 나타낸다.
전술한 바로부터, 본 발명의 특정 양태가 설명의 목적으로 본원에서 기술된바 있긴 하지만, 본 발명의 정신과 범주로부터 벗어남 없이 여러가지 개질이 가해질 수 있음을 알 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부된 특허청구의 범위로 한정된다.

Claims (14)

  1. a) 서열확인번호(SEQ ID NO) 14의 뉴클레오타이드 145번 내지 1599번의 서열, b) 서열확인번호 14의 뉴클레오타이드 226번 내지 570번의 서열, c) 서열 확인번호 24의 뉴클레오타이드 53번 내지 1486번의 서열 및 d) 서열확인번호 17의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹중에서 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 글루카곤 수용체 또는 글루카곤 수용체 펩타이드를 암호화하는 분리된 DNA 분자.
  2. 제 1항에 있어서, 글루카곤 수용체 또는 글루카곤 수용체 펩타이드가 래트 및 사람 글루카곤 수용체, 및 래트 및 사람 글루카곤 수용체 펩타이드로 이루어진 그룹중에서 선택되는 DNA분자.
  3. 제 1항에 있어서, a) 서열확인번호 14의 뉴클레오타이드 145번 내지 1599번의 서열, b) 서열확인번호 14의 뉴클레오타이드 226번 내지 570번의 서열, 및 c) 서열확인번호 24의 뉴클레오타이드 53번 내지 1486번의 서열로 이루어진 그룹중에서 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자.
  4. 제 1항에 있어서, 글루카곤 수용체 또는 글루카곤 수용체 펩타이드가 a) 서열확인번호 15의 1번 아미노산 메티오닌으로부터 485번 아미노산 트레오닌까지의아미노산 서열, b) 서열확인번호 15의 28번 아미노산 글루타민으로부터 142번 아미노산 티로신까지의 아미노산 서열, c) 서열확인번호 25의 1번 아미노산 메티오닌으로부터 477번 아미노산 페닐알라닌까지의 아미노산 서열, d) 서열확인번호 18의 아미노산 서열, 및 e) 10개 이상의 아미노산 길이를 갖는, a), b), c), 또는 d) 아미노산 서열의 펩타이드 단편으로 이루어진 그룹중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 DNA 분자.
  5. 글루카곤 수용체 또는 글루카곤 수용체 펩타이드를 암호화하는 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 따른 DNA 분자를 포함하는 제1 DNA 절편, 및 이에 작동적으로 연결되어 상기 제1 DNA 절편 발현에 필요한 부가적 DNA 절편을 포함하는 DNA 작제물.
  6. 제5항에 따른 DNA 작제물을 함유하는, 세균 세포 또는 포유동물 세포로부터 선택되는 숙주 세포.
  7. 제6항에 따르는 숙주세로를 제1 DNA 절편의 발현을 촉진시키는 조건하에서 배양시킴을 포함하여, 글루카곤 수용체 또는 글루카곤 수용체 펩타이드를 생산하는 방법.
  8. a) 서열확인번호 15의 1번 아미노산 메티오닌으로부터 485번 아미노산 트레오닌까지의 아미노산 서열, b) 서열확인번호 15의 28번 아미노산 글루타민으로부터 142번 아미노산 티로신까지의 아미노산 서열, c) 서열확인번호 25의 1번 아미노산 메티오닌으로부터 477번 아미노산 페닐알라닌까지의 아미노산 서열, d) 서열확인번호 18의 아미노산 서열, 및 e) 10개 이상의 아미노산 길이를 갖는 a), b), c), 또는 d) 아미노산 서열의 펩타이드 단편으로 이루어진 그룹중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 분리된 글루카곤 수용체 또는 글루카곤 수용체 펩타이드.
  9. 제8항에 있어서, 서열확인번호 15의 28번 아미노산 글루타민으로부터 150번 아미노산 티로신까지의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 글루카곤 수용체 또는 글루카곤 수용체 펩타이드.
  10. 글루카곤의 글루카곤 수용체로의 결합을 차단시키는, 제8항에 따른 글루카곤 수용체 또는 글루카곤 수용체 펩타이드에 특이적으로 결합하는 분리된 모노클로날 항체.
  11. 제1항에 따른 DNA 분자와 하이드리브화 할 수 있는 프로브.
  12. (a) 재조합 글루카곤 수용체로의 화합물의 결합 및 반응 경로(response pathway)를 통한 관련된 반응을 허용하도록, pH 5 내지 9의 완충액중 4℃ 내지 55℃의 온도에서 5 내지 15분 동안, 글루카곤 효능제의 존재하에 상기 화합물을 상기반응 경로와 연계된 제8항에 따른 분리된 글루카곤 수용체 또는 글루카곤 수용체 펩타이드에 노출시키는 단계; 및
    (b) 글루카곤 효능제 단독에 의한 반응 경로의 자극에 비해, 상기 화합물이 글루카곤 수용체에 결합함으로써 야기되는 반응 경로의 자극이 감소됨을 탐지하여 이로부터 글루카곤 길항제의 존재를 측정하는 단계들을 포함하여, 글루카곤 길항제의 존재를 탐지하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 반응 경로가 막-결합된 아데닐레이트 사이클라제 반응 경로인 방법.
  14. 제12항에 있어서, 반응 경로가 루시퍼라제 리포터 시스템을 포함하는 방법.
KR1019950700793A 1992-08-28 1993-08-30 글루카곤수용체 KR100375260B1 (ko)

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US07/938,331 1992-08-28
US08/086,631 US5776725A (en) 1992-08-28 1993-07-01 Recombinant production of glucagon receptors
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US08/086631 1993-07-01
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