BR112012028949B1

BR112012028949B1 - polipeptídeo análogo do hormônio paratireoideo, seu uso e método de produção, bem como ácido nucleico, vetor de expressão, célula e composição farmacêutica

Info

Publication number: BR112012028949B1
Application number: BR112012028949-7A
Authority: BR
Inventors: John T. Potts; Harald Jüppner; Makoto Okazaki; Thomas J. Gardella
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha; The General Hospital Corporation
Priority date: 2010-05-13
Filing date: 2011-05-12
Publication date: 2020-11-17
Also published as: KR101900078B1; EP2569003A2; US9492508B2; RU2604809C2; WO2011143406A2; CN103002906A; MX358161B; CN103002906B; KR20140031778A; WO2011143406A3; MX2012013232A; US20130116180A1; RU2012153768A; JP5941040B2; JP2013526864A; EP2569003A4; EP2569003B1

Abstract

POLIPEPTÍDEO ANÁLOGO DO HORMÔNIO PARATIREOIDEO, SEU USO E MÉTODO DE PRODUÇÃO, BEM COMO ÁCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA. A presente invenção baseia-se no desenvolvimento de dois ligantes de análogos de PTH, SP-PTH-AAK e Aib-SP-PTH-AAK, que têm atividade de longa atuação no receptor de PTH, como demonstrado in vitro e in vivo. Estes polipeptídeos são, assim, particularmente úteis no tratamento de doenças tais como hipoparatireoidismo, nas quais uma atividade de longa atuação é desejada.

Description

DECLARAÇÃO QUANTO AO FINANCIAMENTO DO GOVERNO FEDERAL

Esta invenção foi realizada com o financiamento do Governo dos Estados Unidos da América sob a subvenção DK-11794 concedida pelo Natio- nal Institutes for Health. O governo tem certos direitos sobre esta invenção. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Genericamente, a invenção refere-se a análogos do hormônio para tireoideo (PTH), particularmente aqueles que têm atividade agonista de longa atuação do receptor de PTH. Estes análogos podem ser usados para tratar doenças nas quais a atividade de longa atuação é desejável, tal como hipoparatireoidismo. PTH(1-34) é um produto terapêutico eficaz no tratamento de os- teoporose e condições de deficiência de PTH, a saber, hipoparatireoidismo. O hipoparatireoidismo é uma doença que dura a vida toda, caracterizada por uma produção inadequada do hormônio PARATIREOIDEO (PTH) pelas glândulas paratireoideas. Devido ao fato de que PTH é crítico para a regula- ção dos níveis de cálcio e fosfato, a perda de PTH reduz os níveis de cálcio no sangue e ossos e aumenta os níveis de fosfato (hipocalcemia e hiperfos- fatemia). A hipocalcemia leva a sintomas tais como instabilidade neuromus- cular, incluindo parestesias, contração muscular, espasmos laríngeos (que podem levar à incapacidade de falar e alertar os profissionais de saúde para a condição médica subjacente, que levou ao tratamento atrasado ou incorre- to), e possivelmente tetania e convulsões. Ele é o único distúrbio no qual o hormônio faltante (a saber, PTH) não está ainda disponível como terapia. PTH(1-34) foi identificado como uma alternativa segura e eficaz à terapia com calcitriol para hipoparatireoidismo é é capaz de manter níveis sé ri cos normais de cálcio sem hipercalciuria (Winer et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 88:4214-4220, 2003). Contudo, o polipeptídeo requer injeção pelo menos duas vezes ao dia, e a necessidade nesta doença de um análogo de PTH(1-34)de longa atuação foram, portanto reconhecidas (Winer et a!., supra).

Assim sendo, existe uma necessidade de se obter agonistas de receptores de PTH adicionais, particularmente aqueles que têm atividade de longa atuação no receptor de PTH.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se ao desenvolvimento de análogos de PTH e PTHrP analogs. Os polipeptídeos exemplificativos aqui descritos, SP-PTH-AAK e Aib-SP-PTH-AAK, têm longa atividade de atuação no recep- tor de PTH in vitro e também in vivo e apresentam alta solubilidade em solu- ção aquosa neutra. Os polipeptídeos da invenção são, portanto, apropriados para o tratamento de doenças nas quais uma longa atividade de atuação é desejada, incluindo hipoparatireoidismo.

A invenção, consequentemente, refere-se a um polipeptídeo (por exemplo, isolado), ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, incluindo a sequência de aminoácidos da fórmula (I).

Xoi-Val-Xo3-Glu-He-Gln-Leu-Xo8-His-Xio-Xii-Xi2-Xi3-Xi4-Xi5-Xi6- Xir-Xw-Arg-Arg-Arg-X^-Phe-Leu-X^-X^-Leu-lle-Ala-Glu-lle-His-Thr-Ala-Glu- lie . MI em que Xo, é Ser, Ala, ou Aib; X„3 é Ser, Ala, ou Aib; X» e Met, Leu, ou Nle, X é Asn, Ala, Vai, Asp, lie, Glu, ou Gin; X„ é Leu, Ala, Vai, Met, Lys, Arg, Har ou Tq>; X« é Gly, Ala, His, ou Arg; X13 é Lys. Ala, Leu, Gin, Arg. Hís, ou T x a His Leu Arg, Phe, Trp, ou Ser; X,5 é lie ou Leu; X,6 é Gin ou Asn, rX X X, é Ala, Leu, Met, Glu, Ser, ou Phe; X. é Aia, Phe, Glu, ” i «. Asn Trp, ou Lys; X25 é His, Arg, Leu, Trp, ou Lys; e X26 e Lys, His, Ser <5 Asn ou Arg; ou um seu fragmento, incluindo os aminoácidos 1-28, Ala' T™ 'β1 1 32, 1-33, 1-34, ou 1-35 da fórmula (I), desde que pelo 1-29, 1-3U, ’ y ~ _ia phθ e X26 não seja menos um entre X<8 náo seja Leu ou Met, X22 seja ,

HÍS' Em certas modalidades, o polipeptídeo inclui a fórmula (II): V val-Xos-θlu-lle-GIn-Leu-Xoβ-His-Xw-Xn-Xw-Lys-Xri-Xrδ-Xis- X°1' X Phe Leu-His-X2e-Leu-lle-Ala-Glu-He-His-Thr-Ala-Glu- X,rXi.-Arg-Ar9-ArS'X22 H'S 26 lie CD em que Xo. é Ser, Ala, ou Aib; Xo3 é Ser, Ala, ou Alb; X∞ é Met. Leu ot, N'e, X é Asn, Gin, ou Asp; X„ é Leu, Arg, Har, ou Lys; X12 e Gly ou Ala, X» His Trp ou Ser; X,5 é lie ou Leu; X.o é Gin ou Asn; X.r é Asp ou Ser; X.o e Ala’ou Leu; X22 é Ala ou Phe; e X26 é Lys ou His; ou um seu fragmento in- cluindo os aminoácidos 1-28, 1-29, 1-30, 1-31, 1-32, 1-33, 1-34, ou 1-3 fórmula (II). .....

Em outras modalidades, o polipeptídeo inclui a formula (III).

XOi-Val-Xo3-θlu-lle-Gln-Leu-Xo8-His-Xio-Xn-Xi2-Lys-Xi4-lle-Xi6- X17-Xi8-Arg-Arg-Arg-X22-Phe-Leu-His-X26-Leu-lle-Ala-Glu-lle-His-Thr-Ala-Glu- lie (HD em que X01 é Ser, Ala, ou Aib; X03 é Ser, Ala, ou Aib; X08 e Met, Leu, ou Nle, X10 é Asn ou Gin; Xn é Leu, Arg, ou Har; X12 é Gly ou Ala; X14 e His ou Trp, X16 é Gin ou Asn; Xi7 é Asp ou Ser; Xi8 é Ala ou Leu; X22 é Ala ou Phe; e X26 é Lys ou His; ou um seu fragmento, incluindo os aminoácidos 1-28, 1-29, 1- 30, 1-31, 1-32, 1-33, 1-34, ou 1-35 da fórmula (III).

Em modalidades específicas de qualquer um dos polipeptídeos acima, XOi e X03 são Ala; X1o é Gin; Xn é Arg; X12 é Ala; e X14 é Trp. Em ou- tras modalidades, XOi é Ala; X08 é Aib; Xw é Gin; Xn é Har; X12 é Ala; e Xi4 é Trp. Em qualquer um dos polipeptídeos acima, Xis pode ser Ala; X22 pode ser Ala; e/ou X26 pode ser Lys.

Em certas modalidades, o polipeptídeo é substancialmente idên- tico (por exemplo, pelo menos 90% óu 95% idêntico) a um polipeptídeo des- crito acima (por exemplo, em que Xi8 e X22 são Ala e em que X26 é Lys). Em certas modalidades, o polipeptídeo apresenta maior solubilidade em solução aquosa neutra (por exemplo,solução salina tamponada com fosfato (PBS) em pH 7,4) em comparação com SP-PTH (por exemplo, é pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 95% tão solúvel em solução aquosa neutra em comparação com solução de ácido acético (por exemplo, pH 1, 2, 3, 4 tal como ácido acético 10 mM (pH 2,9)). Em certas modalidades, o polipeptídeo é biologicamente ativo (por exemplo, um agonista de receptor de PTH). Em certas modalidades, o polipeptídeo se liga ao estado R° do receptor de PTH- 1 humano com uma afinidade maior do que aquela de hPTH(1-34). Em ou- tras modalidades, o polipeptídeo tem um comprimento menor do que 200, 150, 100, 75, 50, 40, 39, 38, ou 37 aminoácidos. O polipeptídeo pode ser amidado em seu terminal C.

Em uma modalidade específica, o polipeptídeo includes ou é a sequência de aminoácidos:

Ala-Val-Ala-Glu-lle-GIn-Leu-Met-His-GIn-Arg-Ala-Lys-Trp-lle-GIn- Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Phe-Leu-His-Lys-Leu-lle-Ala-Glu-lle-His-Thr-Ala- Glu-lle, ou em seu fragmento que inclui os aminoácidos 1-28, 1-29, 1-30, 1-31, 1-32, 1-33, 1-34, ou 1-35 da dita sequência. Em outra modalidade, o polipeptídeo inclui ou é a sequência de aminoácidos.

Ala-Val-Aib-Glu-lle-GIn-Leu-Met-His-GIn-Har-Ala-Lys-Trp-lle-GIn- Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Phe-Leu-His-Lys-Leu-lle-Ala-Glu-lle-His-Thr-Ala- Glu-lle, ou um seu fragmento que inclui os aminoácidos 1-28, 1-29, 1-30, 1-31 1-32, 1-33, 1-34, ou 1'35 da dita sequência. Em outras modalidades, o peptídeo inclui ou é a sequência de aminoácidos selecionada no grupo que consiste em:

Ala-Val-Ala-Glu-lle-GIn-Leu-Nle-His-GIn-Arg-Ala-Lys-Trp-He-GIn- Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Phe-Leu-His-Lys-Leu-lle-Ala-Glu-lle-His-Thr-Ala- Glu-lle;

Ala-Val-Ala-Glu-lle-Gln-Leu-Leu-His-Gln-Arg-Ala-Lys-Trp-H®-θln- Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Phe-Leu-His-Lys-Leu-lle-Ala-Glu-lle-His-Thr-Ala- Glu-lle;

Ala-Val-Aib-Glu-lle-GIn-Leu-Nle-His-GIn-Har-Ala-Lys-Trp-llθ-θin- Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Phe-Leu-His-Lys-Leu-lle-Ala-Glu-lle-His-Thr-Ala- Glu-lle; e

Ala-Val-Aib-Glu-lle-GIn-Leu-Leu-His-GIn-Har-Ala-Lys-Trp-lie-^in- Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Phe-Leu-His-Lys-Leu-lle-Ala-Glu-lle-His-Thr-Ala- Glu-lle, oQ ou um seu fragmento que inclui os aminoácidos 1-28, 1-Z 1 ' > 1 31 1-32, 1-33. 1-341 ou 1-35 da dita secluência-

Qualquer um dos polipeptídeos descritos acima pode ser amida- do no seu terminal C.

A invenção refere-se também a uma composição farmacêutica que inclui um polipeptídeo da invenção (por exemplo, qualquer polipeptídeo descrito acima ou neste relatório descritivo) e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Em certas modalidades, o polipeptídeo da invenção é sintetizado por síntese em fase sólida ou é produzido de forma recombinante.

A invenção refere-se também a um método para tratar um indi- víduo que tem uma doença selecionada, por exemplo, no grupo que consiste em hipoparatireoidismo, hiperfosfatemia, osteoporose, reparo de fraturas, osteomalacia, artrite, e trombocitopenia. O método inclui administrar um po- lipeptídeo da invenção ou uma composição farmacêutica que inclui um poli- peptídeo da invenção ao indivíduo em uma quantidade suficiente para tratar a doença. O polipeptídeo ou a composição farmacêutica pode ser adminis- trada, por exemplo, por via subcutânea, intravenosa, intranasal, transpulmo- nar, transdérmica, e oral.

A invenção refere-se também a um ácido nucleico que inclui uma sequência que codifica um polipeptídeo da invenção. O ácido nucleico pode estar ligado operacionalmente a um promotor. O ácido nucleico pode ser parte dé um vetor. A invenção refere-se também a uma célula que inclui o vetor e um método para produzir um polipeptídeo desenvolvendo a célula sob condições nas quais o polipeptídeo codificado é expressado.

O termo "indivíduo" significa um animal humano ou não-humano (por exemplo, um mamífero).

O termo "tratar" significa melhorar pelo menos um sintoma de uma condição ou doença em um indivíduo que tem a condição ou doença (por exemplo, um indivíduo diagnosticado com hipoparatireoidismo), em comparação com um controle equivalente não tratado. Tal redução no sin- toma (por exemplo, uma redução em níveis sanguíneos de cálcio ou aumen- to em níveis séricos de fosfato) é pelo menos 5%, 10%, 20%, 40%, 50%, 60%, 80%, 90%, 95%, ou 100%, medido por qualquer técnica padrão.

O termo "polipeptídeo purificado" ou "polipeptídeo isolado" signi- fica um polipeptídeo que foi separado de outros componentes. Tipicamente, o polipeptídeo é substancialmente puro quando ele está pelo menos 30%, em peso, livre de outros componentes. Em certas modalidades, a prepara- ção é pelo menos 50%, 60%, 75%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% em peso, livre de outros componentes. Um polipeptídeo purificado pode ser obtido, por exemplo, por extração a partir de uma fonte natural; por ex- pressão de um polinucleotídeo recombinante que codifica esse polipeptídeo; ou sintetizando quimicamente o polipeptídeo. A pureza ode ser medida por qualquer método apropriado, por exemplo, cromatografia de coluna, eletrofo- rese em gel de poliacrilamida, ou análise por HPLC.

O termo "biologicamente ativo" significa que o composto ou composição (por exemplo, um polipeptídeo aqui descrito) tem pelo menos um efeito biologicamente significativo depois da administração a uma célula ou animal (por exemplo, um ser humano ou mamífero não-humano). As ati- vidades biológicas de PTH, PTHrP, e seus análogos (por exemplo, aqueles aqui descritos) incluem, sem limitações, ligação a receptores, produção de cAMP ou IP3, proteína quinase A, proteína quinase C, fosfolipase C, fosfoli- pase D, e ativação de fosfolipase A2, mudanças (por exemplo, aumentos ou diminuições) em níveis intracelulares, plasmáticos, ou urinários de cálcio ou fosfato, e mudanças no metabolismo ou catabolismo ósseo in vivo ou in vi- tro. Um polipeptídeo biologicamente ativo da invenção (por exemplo, qual- quer polipeptídeo aqui descrito), por exemplo, pode apresentar aumentos (por exemplo, pelo menos 5%, 10%, 25%, 50%, 100%, 500%, 1.000%, 10.000%) ou diminuições (por exemplo, 95%, 90%, 75%, 50%, 25%, 10%, 5%, 1%, 0,1%, 0,01%, ou 0,001%) em qualquer atividade biológica em com- paração com um controle apropriado (por exemplo, um polipeptídeo do tipo selvagem ou uma sua fenocópia tal como PTH(1-34) ou PTHrP(1-36)).

O termo "substancialmente idêntico" significa um ácido nucleico ou sequência de aminoácidos que, quando alinhada otimamente usando, por exemplo, os métodos descritos abaixo, compartilham pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identi- dade de sequências com um segundo ácido nucleico ou sequência de ami- noácidos, por exemplo, uma sequência de PTH ou PTHrP ou fragmento de- la. "Identidade substancial" pode ser usado para se referir a vários tipos e comprimentos de sequência, tal como sequência de comprimento inteiro, epítopos ou peptídeos imunogênicos, domínios funcionais, sequências codi- ficadoras e/ou reguladoras, éxons, introns, promotores, e sequências genô- micas. A identidade percentual entre dois polipeptídeos ou sequências de ácidos nucleicos é determinada de várias maneiras que são de conhecimen- to geral nessas técnicas, por exemplo, usando softwares de computador dis- poníveis para o público, tais como Smith Waterman Alignment (Smith et al., J. Mol. Biol. 147:195-7, 1981); "Best Fit" (Smith e Waterman, "Advances in Applied Mathematics", 482-489, 1981) como incorporado em GeneMatcher Plus™, Schwarz e Dayhof (1979), "Atlas of Protein Sequence and Structure", Dayhof, M. O., Ed páginas 353-358; programa BLAST (Basic Local Align- ment Search Tool; (Altschul etal., J. Mol. Biol. 215: 403-10, 1990), BLAST-2, BLAST-P, BLAST-N, BLAST-X, WU-BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2, CLUSTAL, ou o software Megalign (DNASTAR). Além disso, os versados nessas técni- cas podem determinar parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo qualquer algoritmo necessário para atingir alinhamento máximo sobre o comprimento das sequências que estão sendo comparadas. Em ge- ral, no caso de proteínas, o comprimento de sequências de comparação de- ve ser de pelo menos 6 ou 8 aminoácidos, de preferência 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, ou 500 aminoácidos ou mais até o comprimento inteiro da proteína. No caso de ácidos nucleicos,o comprimento de sequências comparadas deve ser gene- ricamente de pelo menos 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93, 96, 99, 102, 105, 108, 111, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, ou pelo menos 1.500 nucleotídeos ou mais até o com- primento da molécula de ácido nucleico. Deve-se entender que para os pro- pósitos de determinar a identidade de sequências quando se compara uma sequência de DNA com uma sequência de RNA, um nucleotídeo de timina é equivalente a um nucleotídeo de uracila. As substituições conservativas in- cluem tipicamente substituições dentro dos seguintes grupos: glicina, alani- na; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; e fenilalanina, tirosina.

O termo "pH neutro" significa um pH de cerca de 6-9 (por exem- plo, 6,5-8,0). Os valores específicos de pH neutro incluem 6,5, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, e 8,0.

Outras características e vantagens da invenção ficarão eviden- tes a partir da descrição detalhada que se segue, junto com os desenhos, e reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

As Figuras 1A e 1B são gráficos que ilustram as afinidades de li- gação de análogos de PTH pelas conformações de PTHR1 do rato em R° (Figura 1A) e RG (Figura 1B). Como ilustrado, SP-PTH-AAK apresentou a ligação mais forte às formas R° e RG do receptor. PTH(1-34) apresentou a ligação mais fraca à forma R° do receptor. Os parâmetros de adaptação das curvas estão indicados embaixo de cada gráfico.

A Figura 2 é um gráfico que ilustra as respostas de cAMP ao PTH(1-34), SP-PTH, SP-PTH-AAK, Aib-SP-PTH, e Aib-SP-PTH-AAK em células MC3T3-E1. Os parâmetros de adaptação das curvas estão indicados embaixo de cada gráfico.

A Figura 3 é um gráfico que ilustra a luminescência em células MC3T3-E1 transfectadas com uma construção cAMP-elemento de resposta- gene de luciferase depois do tratamento com PTH(1-34), SP-PTH, SP-PTH- AAK, Aib-SP-PTH, Aib-SP-PTH-AAK, ou PTH(3-34). Os parâmetros de a- daptação das curvas estão indicados embaixo de cada gráfico.

As Figuras 4A e 4B são gráficos que ilustram a correlação entre estimulação com cAMP e ligação a R° (Figura 4A) ou RG (Figura 4B).

As Figuras 5A e 5B são gráficos que ilustram a afinidade de liga- ção de PTH(1-34), SP-PTH, SP-PTH-AAK, Aib-SP-PTH, e Aib-SP-PTH-AAK às formas R° (Figura 5A) e RG (Figura 5B) do receptor de PTH-1 humano.

Os parâmetros de adaptação das curvas estão indicados embaixo de cada gráfico.

A Figura 6 é um gráfico que ilustra a estimulação com cAMP de PTH(1-34), SP-PTH, SP-PTH-AAK, Aib-SP-PTH, e Aib-SP-PTH-AAK no re- ceptor de PTH-1 humano como expressado em células HKRK-B7.

As Figuras 7A e 7B são gráficos que ilustram a estimulação com cAMP depois da remoção por lavagem do ligante. A Figura 7A ilustra a gera- ção de cAMP em pmol/poço, e a Figura 7B ilustra estes resultados normali- zados para a estimulação máxima com cAMP para cada ligante.

As Figuras 8A-8E são gráficos que ilustram os níveis sanguíneos de cálcio em camundongos que receberam injeções subcutâneas de veículo, ou de 5 nmol/kg de PTH(1-34), SP-PTH, SP-PTH-AAK, Aib-SP-PTH, ou Aib- SP-PTH-AAK durante 0-8 horas (Figura 8A) ou 0-30 horas (Figura 8B). Re- sultados similares estão ilustrados para peptídeos a 10 nmol/kg injetados por via subcutânea na Figura 8C (0-24 horas) e Figura 8D (0-54 horas). Resulta- dos de um expeimento similar sob condições de jejum também estão ilustra- dos (Figura 8E).

A Figura 9 é um diagrama esquemático que ilustra o protocolo experimental usado para medir cálcio no sangue, níveis séricos de fosfato, e razão de cálcio para creatinina na urina de ratos TPTX.

As Figuras 10A-10E são gráficos que ilustram as respostas de cálcio sanguíneo (Figura 10A) e fosfato inorgânico sérico (Figura 10B) em ratos TPTX que receberam administração de veículo, SP-PTH, SP-PTH- AAK, Aib-SP-PTH, ou Aib-SP-PTH-AAK. Ratos operados de forma simulada estão ilustrados como um controle. Um experimento similar comparando SP- PTH a 1,25 e 5 nmol/kg com PTH(1-34) a 1,25, 5, e 20 nmol/kg também está ilustrado (Figura 10C). Os perfis farmacocinéticos em ratos normais que re- ceberam injeção intravenosa de 10 nmol/kg de PTH(1-34) ou SP-PTH tam- bém estão ilustrados (Figura 10D). Os perfis farmacocinéticos em ratos TPTX que receberam injeção intravenosa de 24,3 nmol/kg de hPTH(1-34), hPTH(1-84), ou SP-PTH-AAK também estão ilustrados (Figura 10E).

A Figura 11A é um diagrama esquemático que ilustra o protocolo experimental usado para medir os níveis séricos e urinários de cálcio e fosfa- to em macacos cinomolgos que receberam injeção intravenosa de SP-PTH ou SP-PTH-AAK.

A Figura 11B é um gráfico que ilustra a concentração plasmática de SP-PTH no macaco depois de injeção intravenosa de 1 nmol/kg.

As Figuras 12A-12C são gráficos que ilustram calico sérico (Fi- guras 12A e 12C) e fosfato sérico (Figura 12B) em macacos cinomolgos que receberam injeção de veículo, SP-PTH, SP-PTH-AAK, ou PTH(1-34) (* P<0,05, versus veículo; ** P<0,01 versus veículo). As Figuras 12A e 12B ilustram os resultados usando 0,25 nmol/kg de SP-PTH ou SP-PTH-AAK, ou controle com veículo, injetados por via intravenosa. A Figura 12C ilustra as concentrações séricas de cálcio depois de uma dose aumentada em 10 ve- zes (10 nmol/kg) de PTH(1-34) injetado por via subcutânea.

As Figuras 13A e 13B são gráficos que ilustram as razões de creatinina para cálcio urinário (Figura 13A) e fosfato urinário (Figura 13B) em macacos cinomolgos que receberam uma injeção intravenosa de veículo, SP-PTH, ou SP-PTH-AAK (* P<0,05, versus veículo; ** P<0,01 versus veícu- lo).

A Figura 14 é um diagrama esquemático que ilustra o protocolo experimental para medir os níveis séricos de cálcio e séricos de fosfato em macacos cinomolgos que receberam veículo ou 2,5 nmol/kg ou 10 nmol/kg de SP-PTH ou SP-PTH-AAK.

As Figuras 15A-15H são gráficos que ilustram os níveis séricos e urinários de cálcio e fosfato e os níveis séricos de creatinina em macacos cinomolgos que receberam veículo, 2,5 nmol/kg ou 10 nmol/kg de SP-PTH- AAK, 10 nmol/kg de PTH(1-34), ou 10 nmol/kg of de PTH(1-84). A Figura 15A ilustra os níveis séricos de cálcio, e as Figuras 15B e 15C ilustram os níveis séricos de fosfato inorgânico. A Figura 15D ilustra os níveis séricos de creatinina. As Figuras 15E e 15G ilustram os níveis urinários de cálcio, e as Figuras 15F e 15H ilustram os níveis urinários de fosfato.

As Figuras 16A e 16B são gráficos que ilustram a solubilidade de polipeptídeos em solução PBS em pH 7,4.

A Figura 16C ilustra a estabilidade de SP-PTH-AAK em tampões de fosfato/citrato e em ácido acético 10 mM a 5, 25, e 40°C. A quantidade do peptídeo SP-PTH-AAK intacto remanescente na amostra, em comparação com a amostra inicial, foi medida por rPHPLC.

As Figuras 17A e 17B são gráficos que ilustram o efeito de P- TH(1-34) (Figura 17A) e M-PTH(1-28) (Figura 17B) sobre os níveis sanguí- neos de cálcio em camundongos que expressam o receptor de PTH do tipo selvagem ou deficiente em fosforilação (PD).

As Figuras 18A e 18B são gráficos que ilustram o efeito de P- TH(1-34) (Figura 18A) e M-PTH(1-28) (Figura 18B) sobre os níveis sanguí- neos de cAMP em camundongos que expressam o receptor de PTH do tipo selvagem ou PD.

Á Figura 19 é um gráfico que ilustra o efeito de SP-PTH-AAK sobre os níveis sanguíneos de cálcio e camundongos que expressam o re- ceptor de PTH do tipo selvagem ou PD.

As Figuras 20A-20D são gráficos que ilustram os efeitos de SP- PTH administrado uma vez ao dia sobre Ca sérico e urinário em ratos TPTX. Ratos TPTX e do controle simulado foram tratados uma vez ao dia, por 10 dias, por intermédio de injeção subcutânea, com veículo (Simulado e TPTX) ou SP-PTH (1, 2. 4, ou 8 nmol/kg), ou com 1,25(OH)2D (0,075 oru0.2 pg/kg orn). Depois da última injeção no Dia 10, os ratos foram colocados em gaio- las metabólicas, e o sangue da veia jugular foi obtido em 8 (Figura 20A) e 24 h (Figura 20B); a urina foi coletada nos intervalos 0-8 (Figura 20C) e 8-24 h (Figura 20D); médias ± s.e.m: n = 5;P versus veículo < 005. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a novos análogos do hormônio PARATIREOIDEO (PTH) que têm atividade prolongada no receptor de PTH. Estes análogos são exemplificados por SP-PTH-AAK ([Ala1,3,12'18,22, Gin10, Arg11,Trp14,Lys26]PTH(1-14)/PTHrP(15-36)) e Aib-SP-PTH-AAK (Ala1’1218’22, Aib3,Gln10,homoArg11,Trp14,Lys26]PTH(1-14)/PTHrP(15-36)). Como descrito abaixo, estes polipeptídeos se ligam com afinidade mais alta à conformação R° não-acoplada à proteína G do receptor de PTH-1 (PTHR1) in vitro do que PTH(1-34) e outros polipeptídeos referenciais. Consequentemente, estes polipeptídeos induzem respostas prolongadas da sinalização de cAMP em células cultivadas. Estes polipeptídeos apresentaram também aumentos pro- longados nos níveis sanguíneos de cálcio ionizado em cobaias (camundon- gos, ratos, e macacos) em comparação com PTH(1-34) ou outros análogos testados. Por causa das suas propriedades confirmadas de longa atuação in vivo, os análogos têm utilidade como tratamentos para condições tais como hipoparatireoidismo.

Os polipeptídeos exemplificativos, SP-PTH-AAK e Aib-SP-PTH- AAK, incluem uma parte do terminal N baseada na sequência de PTH(1-14) humano e uma parte do terminal C baseada na sequência de PTHrP huma- no (vide Tabela 1 abaixo), sendo que ambas partes dos terminais N e C que têm substituições de aminoácidos intensificadoras da afinidade. Estes poli- peptídeos apresentam surpreendentemente altas afinidades de ligação e potências de sinalização de cAMP in vitro, bem como efeitos funcionais in- tensificados in vivo, como ilustrado nos Exemplos abaixo. Finalmente, estes polipeptídeos apresentaram alta solubilidade, comparável ao polipeptídeo PTH(1-34) do tipo selvagem, como descrito abaixo. Baseado nestas proprie- dades, estes polipeptídeos podem ser usados em qualquer aplicação na qual uma atividade prolongada do receptor de PTH é desejada, por exemplo, para o tratamento de hipoparatireoidismo. Ligação a R° versus RG de agonistas de PTH

Como descrito na Publicação PCT na WO 2009/017809, um es- tado "R°" inusitado do receptor de PTH, no qual o receptor mão está ligado à proteína G, mas é capaz de ligação a agonistas, foi identificado. Anterior- mente acreditava-se que duas formas de um receptor acoplado à proteína G poderiam ser distinguidas: uma forma (RG) que está ligada à proteína G e uma forma (R) que não está ligada à proteína G. A sinalização de GPCR requer que a proteína G seja ativada diretamente pelo receptor, isto é, o es- tado RG deve se formar, e esta formação de RG pode ser induzida pela liga- ção de um ligante de agonista. A ligação de um ligante de agonista induz ou estabiliza o estado RG, e reciprocamente, o estado RG estabiliza a alta afi- nidade de ligação de um agonista. Depois da ligação de GTP, ou um análo- go não hidrolisável de GTP, tal como GTPyS, uma proteína G acoplada ao receptor se dissociará do receptor, fazendo com que o receptor reverta para um estado de baixa afinidade. Reconhece-se agora que alguns GPCRs, tai como PTHR, podem formar um estado inusitado (R°) que pode se ligar a certos ligantes de agonistas com alta afinidade, mesmo na presença de GTPyS, e assim sendo, mesmo quando o receptor está presumivelmente ligado por uma proteína G. Baseado nesta descoberta do estado R°, a publi- cação PCT n- WO 2009/017809 descreve que ligantes que se ligam com alta afinidade ao estado R°, além do estado RG, têm meia-vida de atividade mais longa do que os ligantes que se ligam a R° com afinidade mais baixa. Esta atividade prolongada não depende da biodisponibilidade ou da farma- cocinética do ligante in vivo. Correspondentemente, os agonistas uma dura- ção de ação curta têm uma afinidade mais baixa pela forma R° do receptor.

Como descrito nos exemplos abaixo, SP-PTH-AAK e Aib-SP- PTH-AAK apresentam ligação substancialmente maior à forma R° do recep- tor de PTH em comparação com hPTH(1-34) in vitro, e apresentam atividade de atuação longa in vitro e in vivo. Os polipeptídeos da invenção são, portan- to, apropriados como agonistas de PTH de longa atuação.

Preparação dos polipeptídeos da invenção

Os polipeptídeos da invenção (por exemplo, SP-PTH-AAK e Aib- SP-PTH-AAK) são passíveis de produção por síntese em solução ou em fa- se sólida, e por síntese usando química de combinação. A técnica de síntese de peptídeos em fase sólida foi, particularmente, aplicada com sucesso na produção de PTH humano e pode ser usada para a produção destes com- postos (para orientação, vide Kimura et al., supra e Fairwell et al., Biochem. 22:2691, 1983). O sucesso em produzir PTH humano em uma escala relati- vamente grande foi relatado em Goud et al., J. Bone Min. Res. 6:781, 1991. A abordagem da síntese de peptídeos sintéticos infere o uso de sintetizado- res automatizados e resina apropriada como fase sólida, à qual é anexado o aminoácido do terminal C do polipeptídeo desejado. A extensão do peptídeo na direção do terminal N é então conseguida exitosamente acoplando uma forma adequadamente protegida do próximo aminoácido desejado, usando protocolos químicos baseados em FMOC ou BOC tipicamente, até completar a síntese. Os grupo protetores são então clivados do peptídeo, usualmente com clivagem do peptídeo da resina, e o peptídeo é então isolado e purifica- do usando técnicas convencionais tais como HPLC em fase reversa usando acetonitrila como solvente e ácido triflúor-acético como agente de páreamen- to de íons. Tais procedimentos estão descritos genericamente em inúmeras publicações pode-se fazer referência, por exemplo, a Stewart e Young, "So- lid Phase Peptide Synthesis," 2- Edição, Pierce Chemical Company, Rock- ford, IL (1984).

Os polipeptídeos da invenção podem ser produzidos também de forma recombinante por qualquer método conhecido nessas técnicas. Siste- mas de expressão procarióticos (por exemplo, bacterianos) e eucarióticos (por exemplo, leveduras e mamíferos) também podem ser usados para pro- duzir os polipeptídeos da invenção, particularmente quando o polipeptídeo inclui apenas aminoácidos codificados para o genoma (por exemplo, não Aib ou Har).

Modificações de Polipeptídeos

Qualquer um dos polipeptídeos aqui descritos (por exemplo, SP- PTH-AAK e Aib-SP-PTH-AAK) pode conter uma ou mais modificações tais como modificações no terminal N ou terminal C. As modificações incluem acetilação, acilação, ADP-ribosilação, amidação, anexação covalente de fla- vina, anexação covalente de um grupamento heme, anexação covalente de um nucleotídeoi ou derivado de nucleotídeo, anexação covalente de um lipí- deo ou derivado de lipídeo, anexação covalente de fosfotidilinositol, reticula- ção, ciclização, formação de ligação dissulfeto, desmetilação, formação de ligações cruzadas covalentes, formação de cistina, formação de piroglutama- to, formilação, gama-carboxilação, glicosilação, formação de âncora de GPI, hidroxilação, iodação, metilação, miristoilação, oxidação, processamento proteolítico, fosforilção, prenilação, racemização, selenoilação, sulfatação, adição de aminoácidos mediada por RNA de transferência às proteínas, tal como arginilação, e ubiquitinação. Vide, por exemplo, "Proteins-Structure and Molecular Properties", 2- Edição, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York, 1993; e Wold, F., "Posttranslational Protein Modificati- ons: Perspectives and Prospects", páginas 1-12 em "Posttranslational Cova- lent Modification of Proteins", B. C. Johnson, Editor, Academic Press, New York, 1983; Seifter etal., Methods Enzymol. 182:626 646 (1990); e Rattan et al., Ann. NY Acad. Sci. 663A& 62 (1992).

Qualquer um dos polipeptídeos da invenção pode incluir ainda uma sequência heteróloga (um parceiro de fusão), formando assim uma pro- teína de fusão. A proteína de fusão pode incluir um parceiro de fusão tal co- mo um marcador de purificação ou detecção, por exemplo, proteínas que podem ser detectadas direta ou indiretamente, tal como proteína fluorescen- te verde, hemaglutinina, ou fosfatase alcalina), domínios ligantes de DNA (por exemplo, GAL4 ou LexA), domínios de ativação de genes (por exemplo, GAL4 ou VP16), marcadores de purificação, ou peptídeos sinalizadores de secreção (por exemplo, sequência sinalizadora de pré-pró-tripsina). Em ou- tras modalidades, o parceiro de fusão pode ser um marcador, tal como c- myc, poli-histidina, ou FLAG. Cada parceiro de fusão pode conter um ou mais domínios, por exemplo, uma sequência sinalizadora de pré-pró-tripsina e o marcador FLAG. Em outros casos, o parceiro de fusão é uma proteína Fc (por exemplo, Fc do camundongo ou Fc humana).

Métodos para tratamento de doença

Qualquer doença associada à disfunção de PTH ou desequilí- brios de cálcio ou fosfato, pode ser tratada com os polipeptídeos aqui descri- tos (por exemplo, SP-PTH-AAK e Aib-SP-PTH-AAK). Os polipeptídeos po- dem ser usados para tratar hipoparatireoidismo, hiperfosfatemia, osteoporo- se, reparo de fraturas, osteomalacia, artrite, ou trombocitopenia, ou podem ser usados para aumentar a mobilização de células-tronco em um indivíduo. Qualquer modo de administração (por exemplo, administração oral, intrave- nosa, intramuscular, oftálmica, tópica, dérmica, subcutânea, e retal) pode ser usado nos métodos de tratamento da invenção. Um médico determinará a dosagem apropriada para o paciente que está sendo tratado, a qual depen- derá em parte da idade e porte do paciente, a gravidade da doença ou con- dição, e a doença ou condição específica que está sendo tratada. Formulação de composições farmacêuticas

A administração de qualquer polipeptídeo aqui descrito (por e- xemplo, SP-PTH-AAK e Aib-SP-PTH-AAK) pode ser por qualquer meio a- propriado que resulta em uma concentração do composto que tratada o indi- víduo e a doença ou condição. O polipeptídeo pode ficar contido em qual- quer quantidade apropriada em uma substância carreadora apropriada, e está genericamente presente em uma quantidade de 1-95% em peso do pe- so total da composição. A composição pode ser fornecida em uma forma de dosagem que é apropriada para a via de administração oral, parenteral (por exemplo, intravenosa ou intramuscular), retal, cutânea, nasal, vaginal, ina- lante, cutânea (emplastro), ocular, ou intracraniana. Assim sendo, a compo- sição pode ser na forma de, por exemplo, comprimidos, ampolas, cápsulas, pílulas, pós, granulados, suspensões, emulsões, soluções, géis incluindo hidrogéis, pastas, pomadas, cremes, unguentos, esguichos, dispositivos de distribuição osmótica, supositórios, enemas, formas injetáveis, implantes, sprays, ou aerossóis. As composições farmacêuticas podem ser formuladas de acordo com a prática farmacêutica convencional (vide, por exemplo, "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20- edição, 2000, edi- tor A.R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, "Philadelphia, and Encyclo- pedia of Pharmaceutical Technology", editores J. Swarbrick e J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York).

As composições farmacêuticas podem ser formuladas para libe- rar o composto ativo imediatamente após a administração ou em tempo ou período de tempo predeterminado depois da administração. Estes últimos tipos de composições são conhecidos genericamente como formulações com liberação controlada, que incluem (i) formulações que criam concentra- ções substancialmente constantes do(s) agente(s) dae invenção dentro do corpo durante um período de tempo prolongado; (ii) formulações que, depois de tempo de retardo predeterminado, podem criar concentrações substanci- almente constantes dos agentes da invenção dentro do corpo durante um período de tempo prolongado; (iii) formulações que sustentam a ação do(s) agente(s) durante um periodo de tempo predeterminado mantendo um nível relativamente constante e eficaz do(s) agente(s) no corpo com minimização concomitante de efeitos colaterais indesejáveis associados a oscilações no nível plasmático do(s) agente(s) (padrão cinético dente de serra); (iv) formu- lações que localizam a ação dos agente(s), por exemplo, colocação espacial de uma composição com liberação controlada adjacente ou no tecido ou ór- gão doente; (v) formulações que conseguem conveniência de dosagem, por exemplo, administrando a composição uma vez por semana ou uma vez a cada duas semanas; e (vi) formulações que assestam a ação do(s) agen- te(s) usando veículos ou derivados químicos para distribuir o composto para um tipo específico de célula-alvo. A administração do composto na forma de uma formulação com liberação controlada é especialmente preferida pra os compostos que têm uma janela de absorção estreita no trato gastrointestinal ou uma meia-vida biológica relativamente curta.

Inúmeras estratégias podem ser adotadas para obter liberação controlada, nas quais a taxa de liberação excede a taxa de metabolismo do composto em questão. Em um exemplo,a liberação controlada é obtida pela seleção apropriada de vários parâmetros de formulação e ingredientes, in- cluindo, por exemplo, várias composições com liberação controlada e reves- timentos. Assim sendo, o composto é formulado com excipientes apropria- dos dentro de uma composição farmacêutica que, depois da administração libera o composto de uma maneira controlada. Os exemplos incluem compo- sições com um único ou múltiplos comprimidos ou cápsulas unitárias, solu- ções oleosas, suspensões, emulsões, microcápsulas, complexos molecula- res, microsferas, nanopartículas, emplastros, e lipossomas.

Composições Parenterais

A composição que contém os polipeptídeos aqui descritos (por exemplo, SP-PTH-AAK e Aib-SP-PTH-AAK) pode ser administrada por via parenteral por injeção, infusão, ou implantação (subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, ou similares) em formas de dosagem, formu- lações, ou por intermédio de dispositivos de distribuição apropriados ou im- plantes que contêm veículos e adjuvantes convencionais, atóxicos, farma- ceuticamente aceitáveis. A formulação e a preparação dessas composições são bem conhecidas pelos versados nessas técnicas de formulação farma- cêutica.

As composições para uso parenteral podem ser fornecidas em formas de dosagem unitárias (por exemplo, ampolas de dose única), ou em frascos que contêm várias doses e aos quais um conservante apropriado pode ser adicionado (vide abaixo). A composição pode ser na forma de uma solução, suspensão, emulsão, dispositivo de infusão, ou dispositivo de distri- buição para implantação, ou pode ser apresentada como um pó desidratado para ser reconstituído com água ou outro veículo apropriado antes do uso. Além do(s) agente(s) ativo(s), a composição pode incluir veículos e/ou exci- pientes apropriados aceitáveis em termos parenterais. O(s) agente(s) ati- vo(s) podem ser incorporados em microsferas, microcápsulas, nanopartícu- las, lipossomas, ou similares, para liberação controlada. Além disso, a com- posição pode incluir agentes auxiliares de suspensão, solubilização, estabili- zação, ajuste do pH, agentes para ajuste da tonicidade, e/ou agentes disper- santes.

Como indicado acima, as composições farmacêuticas de acordo com a invenção podem ser em uma forma apropriada para injeção estéril. Para preparar tal composição, o(s) agente(s) ativo(s) apropriado(s) são dis- solvidos ou colocados em suspensão em um veículo líquido aceitável em termos parenterais. Dentre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregados estão água, água ajustada até um pH apropriado pela adição de uma quantidade apropriada de ácido clorídrico, hidróxido de sódio ou um tampão apropriado, 1,3-butanodiol, solução de Ringer, solução de dextrose, e solução isotônica de cloreto de sódio. A formulação aquosa pode conter também uma ou mais conservantes (por exemplo, p-hidróxi-benzoato de me- tila, etila ou n-propila). Nos casos em que um dos compostos é apenas es- cassamente ou ligeiramente solúvel em água, um agente intensificador de dissolução ou solubilização pode ser adicionado, ou o solvente pode incluir 10-60% em peso de propilenoglicol ou similares. Os exemplos que se seguem pretendem ilustrar e não limitar a invenção.

Exemplo 1 Síntese de Polipeptídeos

Os peptídeos exemplificativos [Ala1’12,Aib3,Gln10,Har11,Trp14]PTH 1 19 18 92 5 (1-14)/PTHrP(15-36) (Superpotente Aib-PTH: Aib-SP-PTH) e [Ala1’ ’ ’ , Aib3,Gln10Har11,Trp14,Lys26]PTH(1-14)/PTHrP(15-36) (Superpotente Aib-AAK PTH: Aib-SP-PTH-AAK) foram sintetizados pela instalação Massachusetts General Hospital Biopolymer Core. Aib e Har representam ácido a-amino- isobutírico e homoarginina, respectivamente. •j 0 Os peptídeos exemplificativos [Ala1,3’12,Gln10,Arg11,Trp14]PTH(1- 14)/PTHrP(15-36) (Superpotente PTH: SP-PTH) e [Ala1t3’12t18>22,Gln10,Arg11. Trp14,Lys26]PTH(1-14)/PTHrP(15-36) (SP-PTH-AAK) foram sintetizados por Sigma Aldrich (Hokkaido, Japão) e American Peptide Company, Inc. (Califórnia, USA). Todos os polipeptídeos foram dissolvidos em ácido acético 10 mM e estocados a -80°C. As concentrações dos polipeptídeos foram determinadas usando o método de PACE (Pace et al., Protein Science 4:2411-23, 1995) ou por análise de aminoácidos. Cada um destes polipeptídeos está indicado na Tabela 1 abaixo.

Exemplo 2

Caracterização - Ligação a R°/RG e potência de cAMP

A ligação de PTH(1-34), SP-PTH, SP-PTH-AAK, Aib-SP-PTH, e Aib-SP-PTH-AAK às formas R° e RG do receptor de PTH-1 foi medida usando um método descrito na Publicação PCT n2 WO 2009/017809 ou um método similar. Resumidamente, a forma R° do receptor pode ser favorecida pela adição do análogo de nucleotídeo não-hidrolisável, GTPyS. A forma RG pode ser favorecida, por exemplo, por co-transfecção de células com uma subunidade Gas dominante negativa. A ligação é medida baseado no deslocamento de um ligante rastreador radioativo (125l-PTH(1-34)). Como ilustrado na Figura 1A, os quatro polipeptídeos testados apresentam cerca de 1-2 ordens de magnitude de ligação mais forte à forma R° do receptor de PTH do rato em comparação com PTH(1-34). Particularmente, SP-PTH-AAK apresentou um aumento maior do que duas ordens de magnitude na ligação (log EC50 de -9,7 versus -7,5 para PTH(1-34)). Os dados são médias de quatro experimentos, cada um realizado em duplicata. As curvas foram adaptadas para os dados usando Graph-Pad Prism 4.0. A inserção em cada figura ilustra os parâmetros de adaptação.

A ligação a RG no receptor de PTH do rato também foi aumen-tada em SP-PTH-AAK e Aib-SP-PTH-AAK em comparação com hPTH(1-34) (Figura 1B).

A atividade estimulante de cAMP destes polipeptídeos também foi avaliada, usando dois métodos diferentes: um radioimunoensaio (RIA; Figura 2) e um elemento responsivo a cAMP fundido a um gene de lucifera-se (Figura 3). Resumidamente, os ensaios de RIA de cAMP foram realizados em células MC3T3-E1 intactas, uma linhagem de células pré-osteoblásticas do camundongo, em placas com 96 poços, como descrito por Okazaki et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 105:16525-30, 2008). As células foram tratadas com o ligante indicado em concentrações variadas (-12 a -6 log M) por 30 minutos à temperatura ambiente na presença de IBMX, após o que o tampão foi removido, e as reações foram terminadas pela adição de HCI 50 mM. Os teores de cAMP dos lisados com HCI foram então determinados por RIA. Os dados são médias de seis experimentos, cada um realizado em duplicata. As curvas foram adaptadas aos dados usando Graph-Pad Prism 4.0. A inserção ilustra os parâmetros de adaptação de cada curva.

A resposta de cAMP-elemento de resposta-luciferase foi medida como se segue. Células MC3T3-E1 foram transfectadas em placas de 96 poços com DNA plasmídico que codifica um gene de luciferase fundido a um promotor do Elemento de Resposta de cAMP (CRE), uma construção de plasmídeo desenhada para avaliar a sinalização por intermédio da via cAMP/PKA. Em 48 horas depois da transfecção, as células foram incubadas a 37°C por quatro horas no meio contendo qualquer um dos dois veículos (- 14 log M na abscissa da plotagem) ou concentrações variadas (-13 to -6 log M) do ligante indicado. A atividade de luciferase, como luminescência, foi então medida usando o reagente Promega Steady-GIo e uma leitora de pla- cas PerkinElmer Co. Envision. Os dados são médias de três experimen- tos,cada um realizado em duplicata. O valor basal bruto obtido em poços tratados com veículo foi 9434 ±1303 contagens/segundo. As curvas foram adaptadas aos dados usando Graph-Pad Prism 4.0. A inserção na Figura ilustra os parâmetros de adaptação.

A correlação entre potência de cAMP e ligação a R° (Figura 4A) ou RG (Figura 4B) também foi calculada. Uma forte correlação entre ligação a R° e potência de cAMP foi observada. Uma correlação mais baixa foi ob- servada entre ligação a RG e potência de cAMP.

Os experimentos de ligação a R° e RG foram repetidos com o receptor de PTH humano (Figuras 5A e 5B). Neste caso, ensaios de ligação competitiva para a conformação s R° e RG de PTHR1 foram realizados em membranas preparadas a partir de células COS-7 transfectadas, como des- crito por Dean et al., Mol. Endocrinol. 22:156-66, 2008. Os dados são médias de três experimentos, cada um realizado em duplicata. As curvas foram a- daptadas aos dados usando Graph-Pad Prism 4.0. A inserção ilustra os pa- râmetros de adaptação. Da mesma forma que com os receptores do rato, os polipeptídeos SP-PTH, SP-PTH-AAK, Aib-SP-PTH, e Aib-SP-PTH-AAK a- presentaram ligação a R° intensificada em comparação com PTH(1-34).

Os ensaios de potência de cAMP também foram realizados ci-sando o receptor humano (Figura 6). Neste caso, células HKRK-B7, que são derivadas a partir de células LLC-PCK1 e são transfectadas de forma estável com o PTHR1 humano, foram incubadas por 30 minutos em tampão conten- 5 do veículo (-11 log M na abscissa da plotagem), ou concentrações variadas (-10 a -6 log M) do ligante indicado,e o teor de cAMP nas células foi medido por RIA. SP-PTH-AAK, Aib-SP-PTH-AAK, SP-PTH, e Aib-SP-PTH apresentaram potências de cAMP similares a PTH(1-34). Um resumo dos dados é fornecido na Tabela 2.

Exemplo 3

Resposta de cAMP depois da lavagem do ligante

A capacidade de SP-PTH-AAK, Aib-SP-PTH-AAK, SP-PTH, e Aib-SP-PTH testimularem a atividade de cAMP depois da lavagem do ligante também foi testada. Os ensaios da lavagem de cAMP foram realizados em células MC3T3-E1 e em placas com 96 poços, como descrito por Okazaki et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 105:16525-30, 2008. As células foram tratadas à temperatura ambiente com o ligante indicado (100 nM) por cinco minutos; para cada ligante, foram usados poços para obter o inicial (valores máximos de cAMP); nestes poços, as células foram co-incubadas com ligante e IBMX. Depois de cico minutos de tratamento inicial, o tampão foi removido, e no caso dos poços iniciais, as reações foram terminadas pela adição de HCI 50 mM. Nos outros poços, as células foram enxaguadas três vezes com tampão, e incubadas em tampão durante tempos variados, como indicado na abscissa; após o que o tampão foi substituído por um tampão que contém IBMX, e as células foram incubadas por mais cinco minutos. Depois disso, o tampão foi removido e as reações foram terminadas pela adição de HCI 50 M. Os teores de cAMP dos lisados com HCI foram então determinados por RIA.

Como ilustrado nas Figuras 7A e 7B, SP-PTH, SP-PTH-AAK, Aib-SP-PTH, e Aib-SP-PTH-AAK mantiveram a atividade estimulante de cAMP por períodos de tempo mais longos do que PTH(1-34),indicando as-sim que estes polipeptídeos têm atividade agonista com atuação mais longa. Exemplo 4 Estudos em camundongos

As respostas de Ca++ no sangue de camundongos também fo-ram testadas. Camundongos (C57 BL/6) receberam injeção subcutânea de veículo ou do ligante indicado para dar uma dose final de 5 nmol/kg de peso corporal, e o sangue foi coletado pela cauda em tempos depois da injeção e avaliado quanto à concentração de Ca++ usando um analisador de sangue Bayer Rapid Lab model 348. Como ilustrado, todos os polipeptídeos, inclu-ding PTH(1-34), apresentaram níveis similares de cálcio duas horas depois da administração (Figura 8A). Em pontos no tempo posteriores (4, 6, 8, e 24 horas), entretanto, os níveis sanguíneos de cálcio aumentaram em camun-dongos que receberam SP-PTH, SP-PTH-AAK, Aib-SP-PTH, ou Aib-SP- PTH-AAK em comparação com os camundongos que receberam PTH(1-34) ou um veículo (Figuras 8A e 8B). Um experimento similar usando 10 nmol/kg por injeção intravenosa também foi conduzido com resultados similares (Figuras 8C e 8D). Um experimento similar conduzido sob condições de jejum também foi realizado, como ilustrado na Figura 8E.

Exemplo 5 Estudos em ratos

Os efeitos de polipeptídeos em ratos que sofreram tiroparatireoi- dectomia (TPTX) também foram testados. Neste caso, cinco ratos Crl.CD(SD) machos com cinco semanas de idade foram obtidos em Charles River Laboratories Japan, Inc. (Kanagawa, Japão) e aclimatados por 1 semana sob condições laboratoriais usuais a 20-26°C e 35-75% de umidade Os ratos tiveram livre acesso à água encanada e ração usual para roedores (CE-2) contendo 1,1% de cálcio, 1,0% de fosfato, e 250 UI/100g de vitamina D3 (Clea Japan, Inc., Shizuoka, Japão).

A tiroparatireoidectomia (TPTX) foi realizada em ratos com seis semanas de idade. Os ratos TPTX foram selecionados (< 1,0 mM) quanto ao cálcio sérico ionizado (iCa) por sangramento da veia da cauda em 24 horas depois da operação. Os ratos TPTX foram divididos em seis grupos de cinco ou seis animais por iCa em 72 horas depois da operação. O grupo TPTX com veículo recebeu por injeção intravenosa o veículo (solução 10 mM de ácido acético) em uma dose de 1 ml/kg de peso corporal pela veia da cauda. SP-PTH, SP-PTH-AAK, Aib-SP-PTH, e Aib-SP-PTH-AAK receberam injeção intravenosa em ratos TPTX em doses de1,25 nmol/kg.

Para medir o cálcio e fosfato sérico, os ratos foram anestesiados usando cetamina, e o sangue foi coletado pela veia do pescoço vêem vários tempos (por exemplo, em 6, 8, 24, 48, e 72 horas)depois de cada injeção (Figura 9). O cálcio e fósforo sérico foram determinados por um autoanalisa- dor (Modelo 736-20 Hitachi, Tóquio, Japão).

Como ilustrado nas Figuras 10A e 10B, os níveis séricos de cál-cio foram aumentados por um período prolongado depois da administração intravenosa dos polipeptídeos, e os níveis séricos de fosfato foram reduzi-dos. Para comparação, um experimento similar comparando SP-PTH a 1,25 e 5 nmol/kg com PTH(1-34) a 1,25, 5, e 20 nmol/kg também é fornecido (Figura 10C). Estas diferenças não parecem ser mediadas por mudanças na farmacocinética, pois PTH(1-34) e SP-PTH apresentaram perfis similares em ratos normais (Figura 10D) e em ratos TPTX (Figure 10E). As propriedades destes peptídeos em ratos TPTX estão indicadas na Tabela 3.

Exemplo 6 Ensaio de hipercalcemia em macacos cinomolgos

Os efeitos de SP-PTH e SP-PTH-AAK ("SP-AAK") sobre os ní-veis séricos e urinários de cálcio e fosfato foi estado em macacos cinomol-gos. Resumidamente, macacos cinomolgos machos com três ou quatro anos de idade (HAMRI Co., Ltd., Ibaraki, Japão) tiveram seu peso corporal medido. O sangue foi coletado em tubos de ensaio. Os macacos receberam administração intravenosa ou subcutânea de cada polipeptídeo em uma dose de 0,3 ml/kg. As concentrações dos polipeptídeos na solução de insumo foram ajustadas por diluição com 25mmol/L de tampão de fosfato/citrato/ 00mmol/L de NaCI/0,05% de Tween 80 (pH.5,0) (tampão PC). Todos os polipeptídeos foram deixados descansando sobre gelo momentos antes da administração. Os polipeptídeos foram administrados aos grupos de três macacos cada respectivamente. Em 1, 2, 4, e 8 horas depois da administra- ção, o sangue foi coletado pela veia safena para monitorar o curso de tempo de níveis de cálcio e fósforo (Figura 11 A). Observou-se que SP-PTH tem uma meia-vida plasmática de cerca de 4 minutos (Figura 11B).

Como ilustrado nas Figuras 12A e 12B, a injeção de SP-PTH ou SP-PTH-AAK aumentou o cálcio sérico (Figura 12A) por um período de tempo substancial depois da injeção. O fosfato sérico foi similarmente diminuído (Figura 12B). A Figura 12C ilustra, para comparação, o breve efeito calcêmi- co de PTH(1-34) dado por via subcutânea em uma dose 40 vezes mais alta do que nos experimentos das Figuras 12A e 12B. A razão de cál- cio/creatinina na urina foi diminuída em camundongos que receberam qualquer um dos dois polipeptídeo em comparação com um veículo (Figura 13A). A razão de fosfato/creatinina na urina também foi medida, como ilustrado na Figura 13B.

Experimentos similares foram realizados usando injeção subcu-tânea dos polipeptídeos usando duas doses diferentes (2,5 nmol/kg ou 10 nmol/kg; Figura 14). A partir destes experimentos, aumentos no cálcio sérico foram observados de uma maneira dependente da dose com SP-PTH e também SP-PTH-AAK (Figura 15A). Reduções em fosfato inorgânico sérico também foram observados (Figuras 15B e 15C). A Figura 15D ilustra aumentos nos níveis séricos de creatinina. Os dados de cálcio e fosfato na urina também foram coletados. Estes dados são do mesmo experimento ilustrado nas Figuras 15A-15D. A urina foi coletada em intervalos de 24 horas antes da injeção (T=0) e em tempos depois disto e avaliada quanto a Ca (Figuras 15E e 15G), Pi (Figuras 15F e 15H) e creatinina; [Ca] e [PI] estão expressos como razões para [creatinina]. As Figuras 15G e 15H apresentam a mudança a partir de valores antes da injeção. Os dados são médias ±s.e.m.; n=3/grupo.

Exemplo 7 Solubilidade

As solubilidades relativas de SP-PTH-AAK e SP-PTH em dife-rentes tampões foram avaliadas foram avaliadas em um ensaio de precipi-tação in vitro. Para cada polipeptídeo, dois frascos, cada um contendo 50 pg de polipeptídeo em pó liofilizado; um frasco foi reconstituído em 50 pL de PBS em pH 7,4; o outro frasco foi reconstituído em 50 pL de ácido acético 10 mM (pH 2,9) para dar concentrações finais de 1,0 mg/mL ou 1,5 mg/mL. Depois de uma hora à temperatura ambiente, os frascos foram centrifugados a 15.000 x g por 2 minutos. O sobrenadante foi removido e o teor de proteína foi testado usando o ensaio Pierce BCA (Thermo Fischer Scientific, Rockford, III.). Para cada polipeptídeo, o teor da amostra de PBS foi expresso como porcentagem do teor da amostra de ácido acético cor-respondente.

Como ilustrado na Figura 16A, os polipeptídeos SP-PTH-AAK e SP-Aib-PTH-AAK apresentaram solubilidade similar a hPTH(1-34)NH2. O teste de solubilidade de hPTHrP, fragmentos, e análogos está ilustrado na Figura 16B. O teste de solubilidade de SP-PTH-AAK também foi realizado. SP-PTH-AAK foi estocado em diferentes concentrações de peptídeo em tampão de fosfato/citrato 50 mM (PC) (pH 4,0, 4,5, e 5,5) e ácido acético 10mM a 5, 25, e 40°C por 4 semanas. A análise de peptídeo intacto por H- PLC em fase reversa revelou estabilidade quase completa a 25 °C por 4 se-manas (Figura 16C). A 40°C, um produto degradado, possivelmente um de-rivado de metionina/óxido, foi detectado nos cromatogramas de HPLC como "ombro" do pico principal.

Exemplo 8

Efeito em receptores de PTH deficientes em fosforilação (PD)

A atividade de SP-PTH-AAK foi testada em camundongos "knock-in" que expressam um receptor de PTH PD no lugar do receptor de PTH do tipo selvagem (Bounoutas et al., Endocrinology 147: 4674, 2006). Como explicado por Bounoutas, os receptores PD apresentam internalização deficiente, o que pode levar a uma sinalização de cAMP prolongada. PTH(1-34) do tipo selvagem e o mais potente M-PTH(1-28) fo-ram testados quanto à sua capacidade para alterar os níveis sanguíneos de cálcio em camundongos do tipo selvagem e PD. Como ilustrado nas Figuras 17A e 17B, aumentos em níveis sanguíneos de cálcio foram reduzidos ou eliminados nos camundongos PD em comparação com camundongos do tipo selvagem.

Os níveis sanguíneos de cAMP também foram comparados en- tre os dois tipos de camundongos. No caso de PTH(1-34) do tipo selvage e no caso de M-PTH(1-28), os níveis sanguíneos de cAMP foram aumentados em magnitude e duração prolongada nos camundongos PD em comparação com os camundongos do tipo selvagem (Figuras 18Ae 18B).

O efeito de SP-PTH-AAK sobre os níveis sanguíneos de cálcio em camundongos do tipo selvagem e PD está ilustrado na Figura 19. Sur- preendentemente, SP-PTH-AAK reduziu o nível sanguíneo de cálcio por pelo menos seis horas depois da injeção e nunca subiu acima dos níveis obser- vados com o controle com veículo.

Exemplo 9

Dosagem diária repetitiva em ratos TPTX

Os presentes experimentos de uma única injeção realizados em roedores e macacos revelaram atividades biológicas duradouras, em alguns casos, por mais do que 24 horas, acredita-se que se prolongaram extraordi- nariamente nestes experimentos devido às altas doses usadas, como indi- cado pela hipercalcemia acentuada. No uso terapêutico em seres humanos, seriam administradas doses suficientes para apenas normalizar Ca sanguí- neo. Um experimento ainda deve determinar se é realmente factível normali- zar sCa depois de um esquema de dosagem repetitivo. Realizou-se, então, o experimento das Figuras 20A-2D, no qual ratos TPTX foram tratados diaria- mente por 10 dias com SP-PTH em doses de 1, 2, 4 e 8 nmol/kg (subcutâ- nea). Para comparação, 1,25(OH)2-vitamina-D (calcitriol) em doses de 0,075 e 0,2 pg/kg (oral) foram usados durante os mesmos períodos de tempo. Neste estudo, a dose de 4 nmol/kg de SP-PTH deu o controle mais satisfató- rio de sCa, pois se evita a hipercalcemia em 8 horasdepois da última injeção (Figura 20A), e ele se manteve quase normal sCa em 24 horas (Figura 20B). O impressionante é que a excreção de cálcio na urina foi baixa em todos os pontos no tempo com a dose de 4 nmol/kg de SP-PTH, o que contrasta com cálcio elevado na urina com calcitriol a 0,2 pg/kg, a dose necessária para atingir na faixa de 8- 9 mg/dL (Figuras 20C e 20D).

Análise Estatística

Os dados descritos acima estão representados genericamente como a média ± erro-padrão (SEM). A significância estatística foi determinada usando o software SAS (Ver.5.00.010720, SAS Institute Japan, Tóquio, 5 Japão). Uma diferença em valores de p values <0,05 foi considerada estatisticamente significante. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.

Outras modalidades

Todas as patentes, pedidos de patente, e publicações mencionadas neste relatório descritivo, incluindo os pedidos de patente n— US. 10 61/334,319, depositado em 13 de maio de 2010, e 61/415,141, depositado em 18 de novembro de 2010, são aqui incorporados como referência até o mesmo grau como se cada patente, pedido de patente ou publicação inde-pendente fosse específica e individualmente indicada para ser incorporada como referência.

Claims

1. Polipeptídeo, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mocmn caracterizado pelo fato de que possui a fórmula (I): niebiiiu, vw* Xoi -Val-Xo3-G I u-l le-G I n-Leu-Xoβ-H is-Xi o-Xi i -Xi 2-X13-X14-X15-X1β- Xi7-Xi8-Arg-Arg-Arg-X22-Phe-Leu-X25-X26-Leu-lle-Ala-Glu-lle-His-Thr-Ala-Glu- lle (I) X01 é Ser ou Ala; X03 θ Ser, Ala ou Aib; X08 é Met, Leu ou Nle; X10 é Gin ou Asn; X11 é Arg, Leu ou Har; X12 é Ala ou Gly; X13 é Lys; Xu é Trp ou His; X15 é lie; X16 is Gin; X17 é Asp; X18 é Ala; X22 é Ala; X25 é His; e X26 é Lys.

2. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que X01 e X03 são Ala, X10 é Gin, X11 é Arg, X12 é Ala e X14 é Trp.

3. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que X01 é Ala, X03 é Aib, X10 é Gin, X11 é Har, X12 é Ala e Xu é Trp.

4. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo possui a sequência de aminoácidos: Ala-Val-Ala-Glu-lle-GIn-Leu-Met-His-GIn-Arg-Ala-Lys-Trp-lle-GIn- Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Phe-Leu-His-Lys-Leu-lle-Ala-Glu-lle-His-Thr-Ala- Glu-lle.

5. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo possui a sequência de aminoácidos: Ala-Val-Aib-Glu-lle-GIn-Leu-Met-His-GIn-Har-Ala-Lys-Trp-lle-GIn- Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Phe-Leu-His-Lys-Leu-lle-Ala-Glu-lle-His-Thr-Ala- Glu-lle.

6. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo possui uma sequência de aminoácidos selecionada no grupo que consiste em: Ala-Val-Ala-Glu-lle-GIn-Leu-Nle-His-GIn-Arg-Ala-Lys-Trp-lle-GIn- Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Phe-Leu-His-Lys-Leu-lle-Ala-Glu-lle-His-Thr-Ala- Glu-lle; Ala-Val-Ala-Glu-lle-GIn-Leu-Leu-His-GIn-Arg-Ala-Lys-Trp-lle-GIn- Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Phe-Leu-His-Lys-Leu-lle-Ala-Glu-lle-His-Thr-Ala- Glu-lle; Ala-Val-Aib-Glu-lle-GIn-Leu-Nle-His-GIn-Har-Ala-Lys-Trp-lle-GIn- Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Phe-Leu-His-Lys-Leu-lle-Ala-Glu-lle-His-Thr-Ala- Glu-lle; e Ala-Val-Aib-Glu-lle-GIn-Leu-Leu-His-GIn-Har-Ala-Lys-Trp-lle-GIn- Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Phe-Leu-His-Lys-Leu-lle-Ala-Glu-lle-His-Thr-Ala- Glu-lle.

7. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

8. Uso de um polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que é para preparar uma composição farmacêutica para tratar m o due tem uma doengasefoc onada do grupo due consiste em h.poparatreo.d.smo, h.perfosfatem.a, osteoporose, reparo de fraturas, osteomalacia, artnte e trombocitopenia, em due.a .composição farmacêutica e formulada para 5 administração ao referido indivíduo em uma quantidade suficiente para tratar a referida doença.

9. Uso, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica é formulada para administração subcutânea, intravenosa, intranasal, transpulmonar, transdérmica e oral.