JPH1175866A - マウスＦｒｉｚｚｌｅｄ−６ 遺伝子に類似したヒト７ＴＭ受容体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 Frizzled−６ポリペプチドおよびポリヌクレ
オチド並びに前記ポリペプチドの組換え法による生産方
法を提供する。 【解決手段】 配列番号２のFrizzled−６ポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列と全長において少なくと
も８０％同一であり、かつFrizzled−６ポリペプチドの
活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列、またはこのヌクレオチド配列に対して相補的なヌク
レオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドを単離す
る。 【効果】 Frizzled−６ポリペプチドおよびポリヌクレ
オチドは感染症、疼痛、癌、糖尿病、肥満、食欲不振、
過食、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高
血圧、閉尿、骨粗しょう症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、
アレルギー、良性の前立腺肥大、および精神ならびに神
経障害を含む機能障害または疾病の治療と、このような
症状の診断アッセイに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新たに同定された
ポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドによりコード
されるポリペプチド、前記のポリヌクレオチドおよびポ
リペプチドの使用、並びにその生産方法に関する。より
詳細には、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドは以後Frizzled−６と記すＧタンパク質共役受容体フ
ァミリーに関する。本発明はまた、このようなポリヌク
レオチドおよびポリペプチドの作用を阻害または活性化
することに関する。

【０００２】

【従来の技術】多くの医学的に重要な生物学的プロセス
が、Ｇタンパク質を含めたシグナル伝達経路に関与して
いるタンパク質および／または第二メッセンジャー(例
えばｃＡＭＰ)により媒介されるということはよく知ら
れている( Lefkowitz, Nature,19 91,351：353−354)。
本明細書中では、これらのタンパク質はＧタンパク質を
含む経路に関与しているタンパク質つまりＰＰＧタンパ
ク質と称される。これらのタンパク質のいくつかの例と
しては、アドレナリン作動薬およびドーパミンの受容体
( Kobil ka, B. K.ら、 Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1987,
84：46−50；Kobilka, B. K.ら、Science,1987，238：6
50−656；Bunzow, J.R.ら、 Nature,198 8,336： 783−
787)、Ｇタンパク質それ自体、エフェクタータンパク質
(例えばホスホリパーゼＣ、アデニルシクラーゼ、およ
びホスホジエステラーゼ)、アクチュエータータンパク
質(例えばプロテインキナーゼAおよびプロテインキナー
ゼC)( Simon, M.I.ら、Science,1991,252：802−8)の受
容体のようなGPC受容体が挙げられる。

【０００３】例えば、シグナル伝達の一つの形態におい
ては、ホルモンが結合することにより細胞内で酵素アデ
ニル酸シクラーゼが活性化される。ホルモンによるこの
酵素の活性化はヌクレオチドGTPの存在に依存する。GTP
もまたホルモンの結合に影響を及ぼす。Ｇタンパク質は
ホルモン受容体をアデニル酸シクラーゼと結びつけてい
る。Ｇタンパク質はホルモン受容体により活性化される
と、結合していたＧＤＰをＧＴＰと交換することが示さ
れた。このＧＴＰ担持形態は次に活性化されたアデニル
酸シクラーゼに結合する。GTPからGDPへの加水分解はＧ
タンパク質自身によって触媒され、Ｇタンパク質はその
不活性な基底状態に戻る。したがって、Ｇタンパク質は
シグナルを受容体からエフェクターへ引き継ぐ中間物質
として、およびシグナルの持続時間を制御する時計とし
て機能し、2つの役割を果たしている。

【０００４】Ｇタンパク質共役受容体の膜タンパク質遺
伝子スーパーファミリーは７つの推定上の膜貫通ドメイ
ンを有すると特徴付けられた。これらのドメインは細胞
外、または細胞質ループにより接続された膜貫通α−ヘ
リックスに相当すると考えられる。Ｇタンパク質共役受
容体には、ホルモンやウイルス、増殖因子および神経の
受容体といった多くの生物学的に活性な受容体が含まれ
る。

【０００５】Ｇタンパク質共役受容体(他には７ＴＭ受
容体としても知られている)は、少なくとも８つの異な
る親水性ループをつなぐ、約20〜30アミノ酸からなる７
つの保存された疎水性の領域を含むと特徴付けられてき
た。Ｇタンパク質共役受容体のファミリーには、精神病
および神経障害の治療に用いる神経弛緩薬と結合するド
ーパミン受容体を含む。このファミリーのメンバーの他
の例としてはカルシトニン、アドレナリン、エンドセリ
ン、ｃＡＭＰ、アデノシン、ムスカリン、アセチルコリ
ン、セロトニン、ヒスタミン、トロンビン、キニン、濾
胞刺激ホルモン、オプシン、内皮細胞分化遺伝子−1、
ロドプシン、におい物質、およびサイトメガロウイルス
受容体が含まれるが、これらに限らない。

【０００６】大部分のＧタンパク質共役受容体は、機能
性タンパク質の構造を安定化させていると考えられるジ
スルフィド結合を形成する保存されたシステイン残基
を、最初の２つの細胞外ループの各々において1個有す
る。７つの膜貫通領域はＴＭ1、ＴＭ2、ＴＭ3、ＴＭ4、
ＴＭ5、ＴＭ6、およびＴＭ7と称される。ＴＭ3はシグナ
ル伝達に関与している。

【０００７】システイン残基のリン酸化およびリピド化
(パルミトイル化またはファルネシル化)はいくつかのＧ
タンパク質共役受容体のシグナル伝達に影響を及ぼすこ
とができる。大部分のＧタンパク質共役受容体はその3
番目の細胞質ループおよび／またはカルボキシ末端内に
リン酸化部位を含むことが多い。β−アドレナリン受容
体のような数種のＧタンパク質共役受容体では、プロテ
インキナーゼＡおよび／または特異的な受容体キナーゼ
によるリン酸化が受容体の脱感作を媒介する。

【０００８】いくつかの受容体では、Ｇタンパク質共役
受容体のリガンド結合部位は数個のＧタンパク質共役受
容体膜貫通ドメインにより形成される親水性のソケット
(socket)を含み、このソケットはＧタンパク質共役受容
体の疎水性残基に囲まれていると考えられている。各々
のＧタンパク質共役受容体膜貫通ヘリックスの親水性の
側は内部に面し、極性を持つリガンド結合部位を形成し
ていると仮定されている。ＴＭ３はＴＭ３アスパラギン
酸残基のようなリガンド結合部位を有するため、一部の
Ｇタンパク質共役受容体におけるリガンドの結合に関与
してきた。ＴＭ５のセリン、ＴＭ６のアスパラギンおよ
びＴＭ６またはＴＭ７のフェニルアラニンまたはチロシ
ンもまたリガンド結合に関与している。

【０００９】Ｇタンパク質共役受容体は、ヘテロ三量体
Gタンパク質により種々の細胞内酵素、イオンチャンネ
ルおよびトランスポーターに細胞内で結合し得る（ Joh
n son ら、 Endoc.Rev., 1989,10:317−331参照）。個
々のGタンパク質のαサブユニットは特定のエフェクタ
ーを優先的に刺激して、細胞内の種々の生物学的機能を
モジュレートする。Ｇタンパク質共役受容体の細胞質側
の残基のリン酸化は、一部のＧタンパク質共役受容体の
Gタンパク質の共役を調節するために重要な機構である
として同定された。Ｇタンパク質共役受容体は、哺乳動
物宿主の非常に多くの部位で見つかっている。

【００１０】過去15年に渡り、７回膜貫通（7ＴＭ）受
容体を標的とする350種類近くの治療薬が市場に出回り
成功してきた。こうしたことは、これらの受容体に治療
用ターゲットとしての確立され実証された歴史があるこ
とを示している。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】明らかに、細菌感染、
真菌感染、原生動物感染およびウイルス感染、特にHIV
−１またはHIV−２により引き起こされる感染といった
感染症；疼痛；癌；糖尿病、肥満；食欲不振；過食；喘
息；パーキンソン病；急性心不全；低血圧；高血圧；閉
尿；骨粗しょう症；狭心症；心筋梗塞；潰瘍；アレルギ
ー；良性の前立腺肥大；および不安、精神***病、躁鬱
病、譫妄、痴呆、ハンチントン症またはジル・ド・ラ・ト
ゥーレット症候群のような深刻な精神薄弱およびジスキ
ネジアを含む精神及び神経障害を含むがこれらに限らな
い、機能障害または疾病を予防し、改善し、治療する上
で何らかの役割を果たす新たな受容体を同定して特徴付
ける必要性が存在している。本発明はこのような受容体
を提供するものである。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明は、一つの態様に
おいて、Frizzled−６ポリペプチドおよび組換え物質、
並びにその生産方法に関する。本発明のもう一つの態様
はFrizzled−６ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの
使用方法に関する。こうした使用には、とりわけ、細菌
感染、真菌感染、原生動物感染およびウイルス感染、特
にHIV−１またはHIV−２により引き起こされる感染とい
った感染症；疼痛；癌；糖尿病、肥満；食欲不振；過
食；喘息；パーキンソン病；急性心不全；低血圧；高血
圧；閉尿；骨粗しょう症；狭心症；心筋梗塞；潰瘍；ア
レルギー；良性の前立腺肥大；および不安、精神***
病、躁鬱病、譫妄、痴呆、ハンチントン症またはジル・
ド・ラ・トゥーレット症候群のような深刻な精神薄弱お
よびジスキネジアを含む精神及び神経障害の治療が含ま
れる。他の態様では、本発明は、本発明により提供され
る物質を用いてアゴニストおよびアンタゴニストを同定
する方法、並びに同定された化合物を用いてFrizzled−
６の不均衡と関連した状態を治療することに関する。本
発明のさらに他の態様は、不適当なFrizzled−６活性ま
たはFrizzled−６レベルと関連した疾病を検出するため
の診断アッセイに関する。

【００１３】定義 下記の定義は、本明細書中で頻繁に使用される用語を理
解しやすくするためのものである。「Frizzled−６」と
は、特に、一般的には配列番号２で表されるアミノ酸配
列を有するポリペプチドまたはそのアレリック変異体を
意味する。「受容体活性」または「受容体の生物学的活
性」とは、類似の活性、向上した活性、または望ましく
ない副作用が低下したこれらの活性を含めて、Frizzled
−６の代謝的または生理的機能を意味する。さらに、前
記Frizzled−６の抗原的および免疫原的活性も含まれ
る。「Frizzled−６遺伝子」とは、配列番号１で表され
るヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそ
のアレリック変異体および／またはそれらの相補体を意
味する。

【００１４】本明細書中で用いる「抗体」には、ポリク
ローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ抗体、一本
鎖抗体、ヒト化抗体、さらにＦａｂまたは他の免疫グロ
ブリン発現ライブラリーの産物を含むＦａｂフラグメン
トが含まれる。「単離された」とは、天然の状態から
「人間の手によって」改変されたことを意味する。「単
離された」組成物または物質が天然に存在するのであれ
ば、それはそのもとの環境から変化しているか移動して
おり、またはその両方である。例えば、生存している動
物の体内に自然界で存在するポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドは「単離された」ものではないが、その天然
状態の共存物質から分離されたポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドは、本明細書中で用いられるように、「単
離された」ものである。

【００１５】「ポリヌクレオチド」とは、一般に任意の
ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオ
チドをさし、これは修飾されていないＲＮＡもしくはＤ
ＮＡ、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであり得
る。「ポリヌクレオチド」には、制限するものではない
が、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領
域が混じり合ったＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、
一本鎖領域と二本鎖領域が混じり合ったＲＮＡ、ＤＮＡ
とＲＮＡを含むハイブリッド分子（一本鎖でも、または
より典型的には二本鎖でもよく、一本鎖領域と二本鎖領
域が混じり合ったものでもよい）が含まれる。加えて、
「ポリヌクレオチド」はＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮ
ＡとＤＮＡの両方からなる三重鎖領域を意味する。「ポ
リヌクレオチド」という用語はまた、１個以上の修飾塩
基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡ、および安定性または
他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたは
ＲＮＡも含む。「修飾」塩基としては、例えば、トリチ
ル化された塩基およびイノシンのような特殊な塩基があ
る。ＤＮＡおよびＲＮＡに対してさまざまな修飾が行わ
れてきた。こうして、「ポリヌクレオチド」は、自然界
に一般的に存在するポリヌクレオチドの化学的、酵素的
または代謝的に修飾された形態、並びにウイルスおよび
細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含
する。また、「ポリヌクレオチド」は、しばしばオリゴ
ヌクレオチドと称される比較的短いポリヌクレオチドも
包含する。

【００１６】「ポリペプチド」とは、ペプチド結合また
は修飾されたペプチド結合（すなわち、ペプチドアイソ
スター）により連結された２個以上のアミノ酸を含む任
意のペプチドまたはタンパク質を意味する。「ポリペプ
チド」は短鎖（通常はペプチド、オリゴペプチドまたは
オリゴマーという）と長鎖（一般的にはタンパク質とい
う）の両方をさす。ポリペプチドは２０種類の受容体コ
ード化アミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。「ポリ
ペプチド」は、翻訳後プロセシングのような天然のプロ
セスで、または当技術分野で公知の化学的修飾法のいず
れかで修飾されたアミノ酸配列を含む。このような修飾
は基本的な教科書、より詳細な学術論文および研究文献
に詳述されている。修飾はペプチド骨格、アミノ酸側
鎖、アミノまたはカルボキシル末端を含めてポリペプチ
ドのどこでも行うことができる。同じタイプの修飾が所
定のポリペプチドのいくつかの部位に同程度でまたはさ
まざまに異なる程度で存在してもよい。また、所定のポ
リペプチドが多くのタイプの修飾を含んでいてもよい。
ポリペプチドはユビキチン化のために分枝していても、
分枝のある又はない環状であってもよい。環状の、分枝
した、または分枝した環状のポリペプチドは翻訳後の天
然プロセスから生じることがあり、また、合成法によっ
て製造することもできる。修飾としては、アセチル化、
アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの
共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌ
クレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の
共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架
橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有
架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形
成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、
ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチ
ル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リ
ン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸
化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸の転
移ＲＮＡ媒介付加、ユビキチン化などがある。例えば、
PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd
Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, Ne
w York, 1993; POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICAT
ION OF PROTEINS, B.C. Johnson 編, Academic Press,
New York,1983中のWold, F., Posttranslational Prote
in Modifications: Perspectivesand Prospects, pgs.
1-12; Seifter ら, “Analysis for protein modificat
ions and nonprotein cofactors", Meth Enzymol (199
0) 182:626-646;および Rattan ら, “Protein Synthes
is: Posttranslational Modifications and Aging",Ann
NY Acad Sci (1992) 663:48-62を参照のこと。

【００１７】本明細書中で用いる「変異体」とは、基準
のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと異なるが、不
可欠な性質を保持しているポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドのことである。典型的なポリヌクレオチドの変
異体は基準ポリヌクレオチドとヌクレオチド配列の点で
相違する。この変異体のヌクレオチド配列の変化は、基
準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
のアミノ酸配列を変更しても、しなくてもよい。ヌクレ
オチドの変化は、以下で述べるように、基準配列により
コードされるポリペプチドにおいてアミノ酸の置換、付
加、欠失、融合および末端切断（トランケーション）を
生じさせることができる。典型的なポリペプチドの変異
体は基準ポリペプチドとアミノ酸配列の点で相違する。
一般的には、基準ポリペプチドの配列と変異体の配列が
全般的によく類似しており、多くの領域で同一となるよ
うな相違に限られる。変異体と基準ポリペプチドは任意
に組み合わせた１以上の置換、付加、欠失によりアミノ
酸配列が相違していてよい。置換または挿入されるアミ
ノ酸残基は遺伝子コードによりコードされるものであっ
ても、なくてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドの変異体はアレリック変異体のように天然に存在す
るものでも、天然に存在することが知られていない変異
体であってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドの天然に存在しない変異体は、突然変異誘発法または
直接合成により調製することができる。

【００１８】「同一性」はヌクレオチド配列またはアミ
ノ酸配列の同一性の尺度である。一般に、最大級の整合
（一致）が得られるように配列を並べる。「同一性」そ
れ自体は当技術分野で認識された意味をもち、発表され
た技法を使って計算することができる。例えば、COMPUT
ATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A.M. 編, OxfordUn
iversity Press, New York, 1988; BIOCOMPUTING: INFO
RMATICS AND GENOMEPROJECTS, Smith, D.W. 編, Academ
ic Press, New York, 1993; COMPUTER ANALYSIS OF SEQ
UENCE DATA, PART I, Griffin, A.M. and Griffin, H.
G. 編, HumanaPress, New Jersey, 1994; SEQUENCE ANA
LYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje, G., Academ
ic Press, 1987; および SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, G
ribskov, M. and Devereux, J.編, M Stockton Press,
New York, 1991を参照のこと。２つのポリヌクレオチド
またはポリペプチド配列間の同一性を決定する方法は多
数存在していると同時に、「同一性」なる用語は当業者
には公知である (Carillo, H. and Lipton, D., SIAM J
Applied Math (1988) 48:1073) 。２つの配列間の同一
性または類似性を決定するために汎用される方法として
は、Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop 編,
Academic Press, San Diego, 1994 およびCarillo, H.
and Lipton, D., SIAM J Applied Math (1988) 48:1073
に記載される方法があるが、これらに限らない。同一
性および類似性の決定方法はコンピュータプログラムに
集成されている。２つの配列間の同一性および類似性を
決定するための好適なコンピュータプログラム法として
は、GCS プログラムパッケージ (Devereux, J.ら, Nucl
eic Acids Research (1984) 12(1):387)、BLASTP、BLAS
TN、FASTA (Atschul, S.F.ら, J Molec Biol (1990) 21
5:403)があるが、これらに限らない。

【００１９】一例として、配列番号１の基準ヌクレオチ
ド配列に対して、例えば、少なくとも９５％の「同一
性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチ
ドとは、このポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が配
列番号１の基準ヌクレオチド配列のそれぞれ１００ヌク
レオチドにつき最高で５つの点突然変異を含みうること
を除けば、基準配列と同一であることを意図している。
言い換えると、基準ヌクレオチド配列と少なくとも９５
％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチ
ドを得るには、基準配列中の５％までのヌクレオチドを
欠失させるか、他のヌクレオチドで置換するか、または
基準配列中の全ヌクレオチドの５％までのヌクレオチド
数を基準配列に挿入すればよい。基準配列のこれらの突
然変異は、基準ヌクレオチド配列の5'もしくは3'末端位
置、またはこれらの末端位置の間のどこかで起こり、基
準配列中のヌクレオチドの間に個々に、または基準配列
内に１以上の連続するグループとして配置することがで
きる。

【００２０】同様に、配列番号２の基準アミノ酸配列に
対して、例えば、少なくとも９５％の「同一性」を有す
るアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、このポリペ
プチド配列が配列番号２の基準アミノ酸配列のそれぞれ
１００アミノ酸につき最高で５つのアミノ酸変更を含み
うることを除けば、基準配列と同一であることを意図し
ている。言い換えると、基準アミノ酸配列と少なくとも
９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを
得るには、基準配列中の５％までのアミノ酸残基を欠失
させるか、他のアミノ酸で置換するか、または基準配列
中の全アミノ酸残基の５％までのアミノ酸数を基準配列
に挿入すればよい。基準配列のこれらの変更は、基準ア
ミノ酸配列のアミノもしくはカルボキシ末端位置、また
はこれらの末端位置の間のどこかで起こり、基準配列中
のアミノ酸残基の間に個々に、または基準配列内に１以
上の連続するグループとして配置することができる。

【００２１】

【発明の実施の形態】本発明のポリペプチド 一つの態様において、本発明はFrizzled−６ポリペプチ
ド（またはFrizzled−６タンパク質）に関する。このFr
izzled−６ポリペプチドには、配列番号２および４のポ
リペプチドだけでなく、配列番号２のアミノ酸配列を含
むポリペプチド、その全長において配列番号２のアミノ
酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０
％、より好ましくは少なくとも９５％同一であるアミノ
酸配列を含むポリペプチドも含まれる。さらに、少なく
とも９７〜９９％同一であるものが非常に好適である。
また、その全長において配列番号２のアミノ酸配列を有
するポリペプチドと少なくとも８０％、好ましくは少な
くとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一で
あるアミノ酸配列を有するポリペプチドもFrizzled−６
ポリペプチドに含まれる。さらに、少なくとも９７〜９
９％同一であるものが非常に好適である。Frizzled−６
ポリペプチドはこの受容体の少なくとも１つの生物学的
活性を示すことが好ましい。

【００２２】Frizzled−６ポリペプチドは「成熟」タン
パク質の形であっても、融合タンパク質のような、より
大きいタンパク質の一部であってもよい。しばしば、追
加のアミノ酸配列を含めることが有利であり、このよう
なアミノ酸配列としては、分泌すなわちリーダー配列、
プロ配列、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配
列、または組換え生産の際の安定性を確保する付加的配
列などがある。

【００２３】また、Frizzled−６ポリペプチドの断片も
本発明に含まれる。こうした断片は全体的に前記Frizzl
ed−６ポリペプチドのアミノ酸配列の一部と同一である
が、全部とは同一でないアミノ酸配列を有するポリペプ
チドである。Frizzled−６ポリペプチドと同様に、断片
は「フリースタンディング」（それ自体で独立）してい
ても、より大きいポリペプチド内に含まれていてもよ
く、つまりその大きいポリペプチドの一部または一領
域、最も好ましくは一つの連続領域、を断片が構成して
いてもよい。本発明のポリペプチド断片の代表的な例と
して、およその見当でアミノ酸番号１−２０、２１−４
０、４１−６０、６１−８０、８１−１００、および１
０１からFrizzled−６ポリペプチドの末端までの断片が
挙げられる。ここで、「およそ」とは、上記の範囲の一
端または両端で数個、５個、４個、３個、２個または１
個のアミノ酸が増えたり減ったりした範囲を含むもので
ある。

【００２４】好適な断片としては、例えば、アミノ末端
を含む一連の残基もしくはカルボキシル末端を含む一連
の残基の欠失、またはアミノ末端を含むものとカルボキ
シル末端を含むものとの二連の残基の欠失を除いた、Fr
izzled−６ポリペプチドのアミノ酸配列を有するトラン
ケーション(truncation)ポリペプチドが含まれる。ま
た、αヘリックスとαヘリックス形成領域、βシートと
βシート形成領域、ターンとターン形成領域、コイルと
コイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性
領域、β両親媒性領域、可変性領域、表面形成領域、基
質結合領域、および高抗原指数領域を含む断片のよう
な、構造的または機能的特性により特徴づけられる断片
も好適である。その他の好適な断片は生物学的に活性な
断片である。生物学的に活性な断片は、同様の活性をも
つ断片、その活性が向上した断片、または望ましくない
活性が減少した断片を含めて、Frizzled−６活性を媒介
するものである。さらに、動物、特にヒトにおいて抗原
性または免疫原性がある断片も含まれる。

【００２５】これらのポリペプチド断片はどれも、抗原
活性を含めたFrizzled−６の生物学的活性を保持するこ
とが好ましい。特定された配列および断片の変異型も本
発明の一部を構成する。好適な変異型は同類アミノ酸置
換により対象物と異なるもの、すなわち、ある残基が同
様の性質の他の残基で置換されているものである。典型
的なこうした置換は、Ala, Val, Leu と Ileの間；Ser
とThr の間；酸性残基AspとGlu の間；Asn とGln の
間；塩基性残基 LysとArg の間；または芳香族残基 Phe
とTyr の間で起こる。特に、数個、５〜１０個、１〜５
個または１〜２個のアミノ酸が任意の組合せで置換、欠
失または付加されている変異型が好適である。

【００２６】本発明のFrizzled−６ポリペプチドは任意
の適当な方法で製造することができる。このようなポリ
ペプチドには、単離された天然に存在するポリペプチ
ド、組換え的に生産されたポリペプチド、合成的に製造
されたポリペプチド、またはこれらの方法の組合せによ
り製造されたポリペプチドが含まれる。このようなポリ
ペプチドの製造のための手段は当業界でよく理解されて
いる。

【００２７】本発明のポリヌクレオチド 本発明のもう一つの態様はFrizzled−６ポリヌクレオチ
ドに関する。Frizzled−６ポリヌクレオチドには、Friz
zled−６ポリペプチドおよび断片をコードする単離され
たポリヌクレオチド、並びにこれらと密接に関連したポ
リヌクレオチドが含まれる。さらに特定すると、本発明
のFrizzled−６ポリヌクレオチドとしては、配列番号２
のFrizzled−６ポリペプチドをコードする配列番号１中
に含まれるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
および配列番号１および３の特定配列を有するポリヌク
レオチドがある。さらに、Frizzled−６ポリヌクレオチ
ドには、配列番号２のFrizzled−６ポリペプチドをコー
ドするヌクレオチド配列とその全長において少なくとも
８０％同一であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオ
チド、および配列番号１のヌクレオチド配列とその全長
において少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列
を含むポリヌクレオチドが含まれる。これに関連して、
少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチドが好適で
あり、特に少なくとも９５％同一であるものが好適であ
る。さらに、少なくとも９７％同一であるものがより好
ましく、少なくとも９８〜９９％同一であるものがより
一層好ましく、少なくとも９９％同一であるものが最も
好ましい。また、増幅反応に使用できる条件下、または
プローブやマーカーとして使用できる条件下でハイブリ
ダイズするのに十分な、配列番号１中に含まれるヌクレ
オチド配列との同一性を有するヌクレオチド配列もFriz
zled−６ポリヌクレオチドに含まれる。本発明はまた、
このようなFrizzled−６ポリヌクレオチドと相補的なポ
リヌクレオチドを提供する。

【００２８】本発明のFrizzled−６は、ヒトFrizzled−
６をコードする表１のｃＤＮＡ（配列番号１）の配列決
定の結果により示されるように、Ｇタンパク質共役受容
体ファミリーの他のタンパク質と構造的に関連してい
る。配列番号１のｃＤＮＡ配列は配列番号２の706個の
アミノ酸からなるポリペプチドをコードするオープンリ
ーディングフレーム（ヌクレオチド番号134−2252）を
含んでいる。表２のアミノ酸配列（配列番号２）は706
個のアミノ酸残基においてマウス膜貫通受容体Frizzled
−６[Wang,Y.,Macke,J.P.,Abella,B.S.,Andreasson,K.,
Worley,P.,Gil bert,D.J.,Copeland,N.G.,Jenkins,N.A.
およびNathans,J.,J.Biol.Chem.271(8),4468-4476(199
6)]と約67.3％の同一性を有する（fast−A使用）。さら
に、表２のアミノ酸配列(配列番号2)はマウスFrizzled
−３[Wang,Y.,Macke,J.P.,Abella,B.S.,Andreasson,K.,
Worley,P.,Gilbert,D.J.,Copeland,N.G.,Jenkins,N.A.
およびN athans,J.,J.Biol.Chem.271(8),4468-4476(199
6)]と706個のアミノ酸残基において約52％の同一性を有
する。表１のヌクレオチド配列（配列番号１）は2880個
のヌクレオチド残基においてマウス膜貫通受容体Frizzl
ed−６[Wang,Y.,Macke,J. P.,Abella,B.S.,Andreasson,
K.,Worley,P.,Gilbert,D.J.,Copeland,N.G.,Jenki ns,
N.A.およびNathans,J.,J.Biol.Chem.271(8),4 468-4476
(1996)]と約65％の同一性を有する（Fast−N使用）。さ
らに、表１のヌクレオチド配列(配列番号１)はマウスFr
izzled−３[Wang,Y.,Macke,J.P.,Abella,B.S.,Andreass
on,K.,Worley, P., Gilbert,D.J.,Copeland,N.G.,Jenki
ns,N.A.およびNathans,J.,J.Biol.Chem.27 1(8),4468-4
476(1996)]と2880個のヌクレオチド残基において約63％
の同一性を有する。したがって、本発明のFrizzled−６
ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、とりわけ、そ
れらの相同ポリペプチドおよびポリヌクレオチドと同様
の生物学的機能／特性をもつことが予測され、それらの
有用性は当業者には自明である。

【００２９】ヒトFrizzled−６のヌクレオチド配列（配
列番号１）

【表１】

【００３０】ヒトFrizzled−６のアミノ酸配列（配列番
号２）

【表２】

【００３１】Frizzled−６をコードする本発明の一つの
ポリヌクレオチドは、標準的なクローニングおよびスク
リーニングにより、ヒト甲状腺の細胞中のｍＲＮＡから
誘導されたｃＤＮＡライブラリーから、エクスプレスド
・シークエンス・タグ（expressed sequence tag: EST)
分析 (Adams, M.D. ら, Science (1991) 252:1651-165
6; Adams, M.D. ら, Nature (1992) 355:632-634; Adam
s, M.D.ら, Nature (1995) 377 Supp:3-174) を用いて
得ることができる。また、本発明のポリヌクレオチドは
ゲノムＤＮＡライブラリーのような天然源から得ること
ができ、商業的に入手可能な公知の技法を用いて合成す
ることもできる。

【００３２】配列番号２のFrizzled−６ポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列は、表１中に含まれるポリ
ペプチドコード配列（配列番号１のヌクレオチド番号13
4−2252）と同一であっても、遺伝子コードの重複性
（縮重）のため、やはり配列番号２のポリペプチドをコ
ードする配列であってもよい。

【００３３】本発明のポリヌクレオチドをFrizzled−６
ポリペプチドの組換え生産のために用いる場合、そのポ
リヌクレオチドには、成熟ポリペプチドのコード配列ま
たはその断片単独、他のコード配列（例えば、リーダー
もしくは分泌配列、プレ−、プロ−もしくはプレプロ−
タンパク質配列、または他の融合ペプチド部分をコード
するもの）と同じリーディングフレーム内にある成熟ポ
リペプチドのコード配列またはその断片が含まれる。例
えば、融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配
列がコードされ得る。本発明のこの態様の好ましい具体
例として、マーカー配列は、ｐＱＥベクター(Qiagen, I
nc.)により提供されかつGentz ら, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA (1989) 86:821-824に記載されるようなヘキサ
−ヒスチジンペプチド、またはＨＡタグである。また、
このポリヌクレオチドは5'および3'非コード配列、例え
ば、転写されるが翻訳されない配列、スプライシングお
よびポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位、お
よびｍＲＮＡ安定化配列を含んでいてもよい。

【００３４】さらに好適な具体例は、数個、５〜１０
個、１〜５個、１〜３個、１〜２個、または１個のアミ
ノ酸残基が任意の組合せで置換、欠失または付加されて
いる、表２のFrizzled−６ポリペプチドのアミノ酸配列
（配列番号２）を含むFrizzled−６変異型をコードする
ポリヌクレオチドである。中でも、本発明の好適なポリ
ヌクレオチドは表４のアミノ酸配列（配列番号４）をコ
ードする表３のヌクレオチド配列（配列番号３）中に含
まれるものである。

【００３５】ヒトFrizzled−６の部分ヌクレオチド配列
（配列番号３）

【表３】

【００３６】ヒトFrizzled−６の部分アミノ酸配列（配
列番号４）

【表４】

【００３７】本発明はさらに、前記の配列とハイブリダ
イズするポリヌクレオチドに関する。これに関して、本
発明は特にストリンジェントな条件下で前記のポリヌク
レオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドに関す
る。本明細書中で用いる「ストリンジェントな条件」と
は、配列間に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも
９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より一層好
ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性があるときだ
けハイブリダイゼーションが起こる条件を指す。

【００３８】配列番号１中に含まれるヌクレオチド配列
またはその断片と同一であるか実質的に同一である本発
明のポリヌクレオチドは、Frizzled−６ポリペプチドを
コードする全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離す
るために、また、Frizzled−６遺伝子との配列類似性が
高い他の遺伝子（ヒト以外の種に由来する相同体および
オーソログ体(ortholog)をコードする遺伝子を含む）の
ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するために、ｃＤ
ＮＡおよびゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションプロ
ーブとして用いることができる。このようなハイブリダ
イゼーション技法は当業者には公知である。一般的に、
これらのヌクレオチド配列は対象物のヌクレオチド配列
と８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％同
一である。プローブはたいてい１５個以上のヌクレオチ
ドを含み、好ましくは３０個以上を含み、５０個以上の
ヌクレオチドを有していてもよい。特に好ましいプロー
ブは３０〜５０個の範囲のヌクレオチドを有するもので
ある。

【００３９】一実施態様において、Frizzled−６ポリペ
プチド（ヒト以外の種に由来する相同体およびオーソロ
グ体を含む）をコードするポリヌクレオチドを得ること
は、配列番号１のヌクレオチド配列またはその断片（配
列番号３の断片を含む）を有する標識プローブを用い
て、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下
で適当なライブラリーをスクリーニングし、前記のポリ
ヌクレオチド配列を含む全長ｃＤＮＡおよびゲノムクロ
ーンを単離する各工程を含んでなる。このようなハイブ
リダイゼーション技法は当業者に公知である。ストリン
ジェントなハイブリダイゼーション条件は上で定義した
とおりであるか、または、50% ホルムアミド、５×SSC
(150mM NaCl, 15mM クエン酸三ナトリウム) 、50mMリン
酸ナトリウム (pH7.6)、５×Denhardt溶液、10% デキス
トラン硫酸および20μg/mlの変性し剪断したサケ***Ｄ
ＮＡを含有する溶液中で４２℃で一夜インキュベート
し、次いでフィルターを 0.1×SSC 中約６５℃で洗浄す
る条件である。

【００４０】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、動物およびヒトの疾病に対する治療薬および診
断薬を探索するための研究用の試薬および材料として利
用することができる。

【００４１】ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含有するベ
クター、このベクターにより遺伝子操作された宿主細
胞、および組換え法による本発明のポリペプチドの生産
に関する。本発明のＤＮＡ構築物から誘導されたＲＮＡ
を用いてこの種のタンパク質を生産するための無細胞翻
訳系も使用することができる。

【００４２】組換え体生産に関しては、本発明のポリヌ
クレオチドの発現系またはその一部を組み入れるため
に、宿主細胞が遺伝子操作される。宿主細胞へのポリヌ
クレオチドの導入は、Davis ら, BASIC METHODS IN MOL
ECULAR BIOLOGY (1986) およびSambrook ら, MOLECULAR
CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.
Y. (1989) などの多くの標準的な実験室マニュアルに記
載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェ
クション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェク
ション、トランスベクション(transvection)、マイクロ
インジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェク
ション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレー
プローディング(scrape loading)、弾丸導入(ballistic
introduction)または感染により行うことができる。

【００４３】適当な宿主の代表的な例として、細菌細胞
（例：ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、大腸
菌、ストレプトミセス、枯草菌）、真菌細胞（例：酵
母、アスペルギルス）、昆虫細胞（例：ドロソフィラＳ
２、スポドプテラＳｆ９）、動物細胞（例：ＣＨＯ、Ｃ
ＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ 127、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ 29
3、Bowes メラノーマ細胞）および植物細胞が挙げられ
る。

【００４４】多種多様な発現系を使用することができ
る。こうした発現系として、特に、染色体、エピソーム
およびウイルス由来の系、例えば、細菌プラスミド由
来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵
母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エ
レメント由来、ウイルス（例：バキュロウイルス、ＳＶ
４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、ア
デノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レ
トロウイルス）由来のベクター、およびこれらの組合せ
に由来するベクター、例えば、コスミドやファージミド
のようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素
に由来するものがある。この発現系は発現を起こさせる
だけでなく発現を調節する制御配列を含んでいてもよ
い。一般的に、宿主内でのポリペプチドの産生のために
ポリヌクレオチドを維持し、増やし、発現するのに適し
た系またはベクターはどれも使用することができる。Sa
mbrookら, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL
(前掲) に記載されるような、日常的に用いられる公知
の技法のいずれかにより、適当なヌクレオチド配列を発
現系に挿入することができる。

【００４５】翻訳されたタンパク質を小胞体の内腔に、
細胞周辺腔に、または細胞外の環境に分泌させるため
に、適当な分泌シグナルを目的のポリペプチドに組み込
むことができる。これらのシグナルは目的のポリペプチ
ドに対して内因性であっても、異種シグナルであっても
よい。

【００４６】スクリーニングアッセイで使用するためFr
izzled−６ポリペプチドを発現させようとする場合、そ
のポリペプチドを細胞の表面に産生させることが好適で
ある。この場合は、スクリーニングアッセイでの使用に
先立って細胞を回収する。Frizzled−６ポリペプチドが
培地に分泌される場合は、そのポリペプチドを回収し精
製するために培地を回収する。細胞内に産生される場合
は、その細胞をまず溶解し、その後にポリペプチドを回
収する必要がある。

【００４７】組換え細胞培養物からFrizzled−６ポリペ
プチドを回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたは
エタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換
クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフ
ィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロ
マトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含
めた公知の方法を用いることができる。最も好ましく
は、高速液体クロマトグラフィーが精製に用いられる。
ポリペプチドが単離および／または精製中に変性される
ときは、タンパク質を再生させるための公知の技法を用
いて、活性のあるコンフォメーションを復元することが
可能である。

【００４８】診断アッセイ 本発明はまた、診断薬としてのFrizzled−６ポリヌクレ
オチドの使用に関する。機能障害と関連したFrizzled−
６遺伝子の変異型の検出は、Frizzled−６の過少発現、
過剰発現または変化した発現により生ずる疾病またはそ
の罹病性の診断に追加しうる、またはその診断を下しう
る診断用ツールを提供するだろう。Frizzled−６遺伝子
に変異がある個体を、さまざまな技法によりＤＮＡレベ
ルで見つけ出すことができる。

【００４９】診断用の核酸は、被験者の細胞、例えば血
液、尿、唾液、組織の生検または剖検材料から得ること
ができる。検出のためにゲノムＤＮＡを直接使用して
も、分析前にＰＣＲまたは他の増幅法を使って酵素的に
増幅してもよい。同様の方法でＲＮＡまたはｃＤＮＡを
使用することもできる。欠失および挿入変異は、正常な
遺伝子型と比較したときの増幅産物のサイズの変化によ
り検出できる。点突然変異は増幅ＤＮＡを標識Frizzled
−６ヌクレオチド配列とハイブリダイズさせることで同
定できる。完全にマッチした配列とミスマッチの二重鎖
とはＲＮアーゼ消化により、または融解温度の差異によ
り区別できる。また、ＤＮＡ配列の差異は、変性剤を用
いるもしくは用いないゲルでのＤＮＡ断片の電気泳動の
移動度の変化により、または直接ＤＮＡ配列決定によっ
ても検出できる（例えば、Myers ら, Science (1985) 2
30:1242 を参照のこと）。特定位置での配列変化はヌク
レアーゼプロテクションアッセイ（例えば、ＲＮアーゼ
およびＳ１プロテクション）または化学的開裂法によっ
ても確認できる（Cottonら, Proc. Natl. Acad. Sci.US
A (1985) 85:4397-4401を参照のこと）。別の実施態様
では、例えば、遺伝子変異の効率のよいスクリーニング
を行うため、Frizzled−６ヌクレオチド配列またはその
断片を含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築
することができる。アレイ技法は公知で、一般的な適用
可能性を有し、遺伝子発現、遺伝的連鎖および遺伝的変
異性を含めた分子遺伝学のさまざまな問題を解きあかす
ために用いられている（例えば、M. Chee ら, Science,
Vol.274, pp.610-613 (1996) を参照のこと）。

【００５０】診断アッセイは、前記の方法によりFrizzl
ed−６遺伝子の変異を検出することで、細菌感染、真菌
感染、原生動物感染およびウイルス感染、特にHIV−１
またはHIV−２により引き起こされる感染といった感染
症；疼痛；癌；糖尿病、肥満；食欲不振；過食；喘息；
パーキンソン病；急性心不全；低血圧；高血圧；閉尿；
骨粗しょう症；狭心症；心筋梗塞；潰瘍；アレルギー；
良性の前立腺肥大；および不安、精神***病、躁鬱病、
譫妄、痴呆、ハンチントン症またはジル・ド・ラ・トゥー
レット症候群のような深刻な精神薄弱およびジスキネジ
アを含む精神及び神経障害への罹りやすさを診断または
判定する方法を提供する。

【００５１】さらに、被験者から得られたサンプルから
Frizzled−６ポリペプチドまたはFrizzled−６ｍＲＮＡ
のレベルの異常な低下または増加を測定する方法によ
り、細菌感染、真菌感染、原生動物感染およびウイルス
感染、特にHIV−１またはHIV−２により引き起こされる
感染といった感染症；疼痛；癌；糖尿病、肥満；食欲不
振；過食；喘息；パーキンソン病；急性心不全；低血
圧；高血圧；閉尿；骨粗しょう症；狭心症；心筋梗塞；
潰瘍；アレルギー；良性の前立腺肥大；および不安、精
神***病、躁鬱病、譫妄、痴呆、ハンチントン症または
ジル・ド・ラ・トゥーレット症候群のような深刻な精神薄
弱およびジスキネジアを含む精神及び神経障害の診断を
下すことができる。発現の低下または増加は、当技術分
野で公知のポリヌクレオチド定量法のいずれか、例えば
ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼプロテクション、ノ
ーザンブロット、その他のハイブリダイゼーション法に
よりＲＮＡレベルで測定することができる。宿主から得
られたサンプル中のFrizzled−６ポリペプチドのような
タンパク質のレベルを測定するためのアッセイ法は当業
者によく知られている。こうしたアッセイ法として、ラ
ジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブ
ロット分析、ＥＬＩＳＡアッセイなどがある。

【００５２】かくして、もう一つの態様において、本発
明は、疾病（特に細菌感染、真菌感染、原生動物感染お
よびウイルス感染、特にHIV−１またはHIV−２により引
き起こされる感染といった感染症；疼痛；癌；糖尿病、
肥満；食欲不振；過食；喘息；パーキンソン病；急性心
不全；低血圧；高血圧；閉尿；骨粗しょう症；狭心症；
心筋梗塞；潰瘍；アレルギー；良性の前立腺肥大；およ
び不安、精神***病、躁鬱病、譫妄、痴呆、ハンチント
ン症またはジル・ド・ラ・トゥーレット症候群のような深
刻な精神薄弱およびジスキネジアを含む精神及び神経障
害）またはこのような疾病への罹りやすさを診断するた
めのキットに関し、このキットは、(a) Frizzled−６ポ
リヌクレオチド（好ましくは、配列番号１のヌクレオチ
ド配列）もしくはその断片、(b) (a) のヌクレオチド配
列に相補的なヌクレオチド配列、(c) Frizzled−６ポリ
ペプチド（好ましくは、配列番号２のポリペプチド）も
しくはその断片、または(d) Frizzled−６ポリペプチド
（好ましくは、配列番号２のポリペプチド）に対する抗
体、を含んでなる。このようなキットにおいて、(a) 、
(b) 、(c) または (d)が実質的な構成成分であることが
理解されよう。

【００５３】染色体アッセイ 本発明のヌクレオチド配列はまた、染色体の同定にも有
用である。この配列は個々のヒト染色体上の特定の位置
を標的指向し、その特定位置とハイブリダイズすること
ができる。本発明に従って関連配列の染色体地図を作成
することは、これらの配列と遺伝子関連疾患とを相関さ
せる上で重要な第一段階である。ひとたび配列が正確な
染色***置にマッピングされたら、その染色体上のその
配列の物理的位置を遺伝地図データと相関させることが
できる。この種のデータは、例えば、V. McKusick, Men
delian Inheritance in Man (Johns Hopkins Universit
yWelch Medical Library からオンラインで入手可能)
中に見いだせる。その後、同一の染色体領域にマッピン
グされた遺伝子と疾患との関係を連鎖分析（物理的に隣
接した遺伝子の共遺伝）により同定する。

【００５４】患者と正常個体とのｃＤＮＡまたはゲノム
配列の差異も調べることができる。患者の一部または全
部に変異が観察されるが、どの正常個体にも観察されな
い場合は、その変異が疾病の原因である可能性がある。

【００５５】抗体 本発明のポリペプチドまたはその断片もしくは類似体、
またはそれらを発現する細胞は、Frizzled−６ポリペプ
チドに免疫特異的な抗体を産生するための免疫原として
も使用することができる。「免疫特異的」とは、その抗
体が従来技術における他の関連ポリペプチドに対するそ
の親和性よりも本発明のポリペプチドに対して実質的に
高い親和性を有することを意味する。

【００５６】Frizzled−６ポリペプチドに対する抗体
は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒ
ト以外）に該ポリペプチドまたはエピトープを含む断
片、類似体もしくは細胞を投与することにより得られ
る。モノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養
物により産生される抗体をもたらす任意の技法を用いる
ことができる。例を挙げると、ハイブリドーマ技法 (Ko
hler, G.およびMilstein, C., Nature (1975) 256:495-
497)、トリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法
(Kozborら, Immunology Today (1983) 4:72) およびＥ
ＢＶ−ハイブリドーマ技法 (Coleら, MONOCLONAL ANTIB
ODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R. Liss,
Inc., 1985) などがある。

【００５７】本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体
をつくるために、一本鎖抗体の調製法（米国特許第4,94
6,778 号）を適応させることができる。また、ヒト化抗
体を発現させるために、トランスジェニックマウスまた
は他の哺乳動物を含む他の生物を利用することができ
る。前記の抗体を用いて、そのポリペプチドを発現する
クローンを単離・同定したり、アフィニティークロマト
グラフィーでそのポリペプチドを精製することもでき
る。Frizzled−６ポリペプチドに対する抗体は、とりわ
け、細菌感染、真菌感染、原生動物感染およびウイルス
感染、特にHIV−１またはHIV−２により引き起こされる
感染といった感染症；疼痛；癌；糖尿病、肥満；食欲不
振；過食；喘息；パーキンソン病；急性心不全；低血
圧；高血圧；閉尿；骨粗しょう症；狭心症；心筋梗塞；
潰瘍；アレルギー；良性の前立腺肥大；および不安、精
神***病、躁鬱病、譫妄、痴呆、ハンチントン症または
ジル・ド・ラ・トゥーレット症候群のような深刻な精神薄
弱およびジスキネジアを含む精神及び神経障害の治療に
使用できる可能性がある。

【００５８】ワクチン 本発明の別の態様は、哺乳動物において免疫学的応答を
引き出す方法に関し、この方法は、特に細菌感染、真菌
感染、原生動物感染およびウイルス感染、特にHIV−１
またはHIV−２により引き起こされる感染といった感染
症；疼痛；癌；糖尿病、肥満；食欲不振；過食；喘息；
パーキンソン病；急性心不全；低血圧；高血圧；閉尿；
骨粗しょう症；狭心症；心筋梗塞；潰瘍；アレルギー；
良性の前立腺肥大；および不安、精神***病、躁鬱病、
譫妄、痴呆、ハンチントン症またはジル・ド・ラ・トゥー
レット症候群のような深刻な精神薄弱およびジスキネジ
アを含む精神及び神経障害から前記動物を防御するため
の抗体および／またはＴ細胞免疫応答を生ずるのに十分
なFrizzled−６ポリペプチドまたはその断片を哺乳動物
に接種することを含んでなる。本発明のさらに別の態様
は、哺乳動物を疾病から防御する抗体を産生させるよう
な免疫学的応答を引き出すために、in vivo でFrizzled
−６ポリヌクレオチドの発現を指令するベクターを介し
てFrizzled−６ポリペプチドを供給することを含んでな
る、哺乳動物において免疫学的応答を引き出す方法に関
する。

【００５９】本発明の更なる態様は、哺乳動物宿主に導
入したとき、その哺乳動物においてFrizzled−６ポリペ
プチドに対する免疫学的応答を引き出す免疫学的／ワク
チン製剤（組成物）に関し、この組成物はFrizzled−６
ポリペプチドまたはFrizzled−６遺伝子を含有する。ワ
クチン製剤は適当な担体をさらに含んでいてもよい。Fr
izzled−６ポリペプチドは胃の中で分解されうるので、
非経口的（皮下、筋肉内、静脈内、皮内等への注射を含
む）に投与することが好ましい。非経口投与に適した製
剤としては、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤およびこの製
剤を受容者の血液と等張にする溶質を含みうる水性およ
び非水性の無菌注射液、並びに懸濁化剤または増粘剤を
含みうる水性および非水性の無菌懸濁液がある。こうし
た製剤は１回量容器または数回量容器（例えば、密閉ア
ンプルおよびバイアル）で提供することができ、また、
使用直前に無菌の液状担体を添加するだけでよい凍結乾
燥状態で保管することもできる。ワクチン製剤はこの製
剤の免疫原性を増強するためのアジュバント系、例えば
水中油型のアジュバント系や当技術分野で公知の他のア
ジュバント系を含んでいてもよい。投与量はワクチンの
比活性で変化し、ルーチンな実験操作により簡単に決定
できる。

【００６０】スクリーニングアッセイ 本発明のFrizzled−６ポリペプチドは、このポリペプチ
ドを活性化する化合物（アゴニスト）またはその活性を
阻害する化合物（アンタゴニスト、または阻害剤ともい
う）のスクリーニング法において使用することができ
る。こうして、本発明のポリペプチドは、例えば、細
胞、無細胞調製物、化学物質ライブラリーおよび天然産
物の混合物中の小分子基質およびリガンドの結合を評価
するためにも用いられる。これらの基質およびリガンド
は天然の基質またはリガンドであっても、構造的または
機能的な模擬物であってもよい（Coligan ら, Current
Protocols in Immunology 1(2): Chapter 5 (1991)を参
照のこと）。

【００６１】Frizzled−６ポリペプチドは多くの病理を
含めて多数の生物学的機能に関与している。したがっ
て、一方ではFrizzled−６ポリペプチドを刺激し、他方
ではFrizzled−６ポリペプチドの機能を阻害し得る化合
物および薬物を見つけ出すことが望まれる。一般的に、
アゴニストは細菌感染、真菌感染、原生動物感染および
ウイルス感染、特にHIV−１またはHIV−２により引き起
こされる感染といった感染症；疼痛；癌；糖尿病、肥
満；食欲不振；過食；喘息；パーキンソン病；急性心不
全；低血圧；高血圧；閉尿；骨粗しょう症；狭心症；心
筋梗塞；潰瘍；アレルギー；良性の前立腺肥大；および
不安、精神***病、躁鬱病、譫妄、痴呆、ハンチントン
症またはジル・ド・ラ・トゥーレット症候群のような深刻
な精神薄弱およびジスキネジアを含む精神及び神経障害
のような症状の治療および予防目的で用いられる。アン
タゴニストは細菌感染、真菌感染、原生動物感染および
ウイルス感染、特にHIV−１またはHIV−２により引き起
こされる感染といった感染症；疼痛；癌；糖尿病、肥
満；食欲不振；過食；喘息；パーキンソン病；急性心不
全；低血圧；高血圧；閉尿；骨粗しょう症；狭心症；心
筋梗塞；潰瘍；アレルギー；良性の前立腺肥大；および
不安、精神***病、躁鬱病、譫妄、痴呆、ハンチントン
症またはジル・ド・ラ・トゥーレット症候群のような深刻
な精神薄弱およびジスキネジアを含む精神及び神経障害
のような症状のさまざまな治療および予防目的で使用し
うる。

【００６２】一般に、こうしたスクリーニング法は本発
明の受容体ポリペプチドをその表面に発現する適当な細
胞を用いるものである。この種の細胞には哺乳動物、酵
母、ショウジョウバエ由来の細胞または大腸菌細胞が含
まれる。次いで、この受容体を発現する細胞（もしくは
発現された受容体を含む細胞膜）を試験化合物と接触さ
せて、その結合または機能的応答の刺激もしくは阻害を
観察する。

【００６３】あるスクリーニング技術では、受容体の活
性化により生じる細胞外のｐH変化や細胞内カルシウム
の変化を測定する系で、本発明の受容体を発現する細胞
(例えば、トランスフェクトされたCHO細胞)を使用する
ことを含む。この技法では、化合物を本発明の受容体ポ
リペプチドを発現する細胞に接触させることができる。
次に、第二メッセンジャーの応答(例えば、シグナル伝
達、ｐH変化、またはカルシウムレベルの変化)を測定
し、候補化合物が受容体を活性化するかまたは阻害する
かどうかを決定する。

【００６４】他の方法は、受容体により媒介されるｃＡ
ＭＰおよび／またはアデニル酸シクラーゼの蓄積の阻害
または刺激を測定することにより受容体インヒビターを
スクリーニングするものである。こうした方法では、本
発明の受容体を用いて真核細胞をトランスフェクトし
て、その細胞表面に受容体を発現させることを含む。次
いでこの細胞を本発明の受容体の存在下で候補アンタゴ
ニストにさらし、ｃＡＭＰの蓄積量を測定する。候補ア
ンタゴニストが該受容体に結合し、これにより受容体の
結合を阻害する場合は、受容体により媒介されるｃＡＭ
Ｐまたはアデニル酸シクラーゼの活性レベルは低下する
かまたは増加するだろう。

【００６５】本発明の受容体に対するアゴニストまたは
アンタゴニストを検出するための別の方法として、米国
特許第5,482,835 号に記載の酵母ベースの技術がある。
これらのアッセイでは候補化合物の結合を簡単に試験す
ることができ、そこでは候補化合物と直接または間接に
結合された標識により、または標識した競合物質との競
合を用いるアッセイにより、該受容体を担持する細胞へ
の付着が検出される。さらに、これらのアッセイでは、
該受容体をその表面に担持する細胞に適した検出系を用
いて、候補化合物が該受容体の活性化により生ずるシグ
ナルを結果的にもたらすか否かを試験することができ
る。一般的に、活性化の阻害剤は既知のアゴニストの存
在下でアッセイされ、そして候補化合物の存在がアゴニ
ストによる活性化に与える影響が調べられる。

【００６６】さらに、これらのアッセイは、候補化合物
とFrizzled−６ポリペプチドを含む溶液とを混ぜ合わせ
て混合物をつくり、この混合物中のFrizzled−６活性を
測定し、そしてこの混合物のFrizzled−６活性を標準と
比較する各ステップを単に含むだけでよい。

【００６７】また、Frizzled−６のｃＤＮＡ、タンパク
質またはこのタンパク質に対する抗体を用いて、細胞内
でのFrizzled−６ｍＲＮＡまたはタンパク質の生産に及
ぼす添加化合物の作用を検出するためのアッセイを組み
立てることができる。例えば、当技術分野で公知の標準
方法によりモノクローナルまたはポリクローナル抗体を
用いて、Frizzled−６タンパク質の分泌レベルまたは細
胞結合レベルを測定するためのＥＬＩＳＡを構築するこ
とができ、これは適切に操作された細胞または組織から
のFrizzled−６の生産を抑制または増強する物質（それ
ぞれアンタゴニストまたはアゴニストともいう）の探索
に用いることができる。スクリーニングアッセイを行う
ための標準的な方法は当技術分野でよく理解されてい
る。

【００６８】Frizzled−６の潜在的なアンタゴニストの
例としては、抗体、ある場合には、Frizzled−６のリガ
ンドと密接な関係があるオリゴヌクレオチドもしくはタ
ンパク質（例えば、リガンドの断片）、または該受容体
と結合するが応答を誘導しない（それゆえ該受容体の活
性を妨げる）小分子などがある。

【００６９】かくして、他の態様において、本発明は、
Frizzled−６ポリペプチドのアゴニスト、アンタゴニス
ト、リガンド、受容体、基質、酵素など、またはFrizzl
ed−６ポリペプチドの生産を低下または増加させる化合
物を同定するためのスクリーニングキットに関し、この
キットは、(a) Frizzled−６ポリペプチド（好ましく
は、配列番号２のポリペプチド）(b) Frizzled−６ポリ
ペプチド（好ましくは、配列番号２のポリペプチド）を
発現する組換え細胞、(c) Frizzled−６ポリペプチド
（好ましくは、配列番号２のポリペプチド）を発現する
細胞膜、または(d) Frizzled−６ポリペプチド（好まし
くは、配列番号２のポリペプチド）に対する抗体、を含
んでなる。このようなキットにおいて、(a) 、(b) 、
(c) または (d)が実質的な構成成分であることが理解さ
れよう。

【００７０】予防および治療法 本発明は、Frizzled−６活性の過剰量と不足量のどちら
にも関係した異常な状態の治療法を提供する。Frizzled
−６の活性が過剰である場合は、いくつかのアプローチ
が利用可能である。一つのアプローチは、Frizzled−６
に対するリガンドの結合をブロックすることにより、ま
たは第２のシグナルを抑制することで異常な状態を軽減
することにより、活性を阻害するのに有効な量で、前記
の阻害剤化合物（アンタゴニスト）を製剤学上許容され
る担体とともに患者に投与することを含んでなる。もう
一つのアプローチでは、内因性のFrizzled−６との競合
状態でリガンドと結合する能力がまだある可溶性形態の
Frizzled−６ポリペプチドを投与することができる。こ
のような競合物質の典型的な例はFrizzled−６ポリペプ
チドの断片である。

【００７１】さらに別のアプローチでは、発現阻止法を
使って内因性Frizzled−６ポリペプチドをコードする遺
伝子の発現を抑制することができる。こうした公知技術
は、体内で生成されるか別個に投与されるアンチセンス
配列の使用を必要とする。例えば、Oligodeoxynucleoti
des as Antisense Inhibitors of Gene Expression,CRC
Press, Boca Raton, FL (1988)中のO'Connor, J Neuro
chem (1991) 56:560を参照のこと。あるいはまた、この
遺伝子と共に三重らせんを形成するオリゴヌクレオチド
を供給することもできる。例えば、Lee ら, Nucleic Ac
ids Res (1979) 6:3073; Cooney ら, Science (1988) 2
41:456; Dervanら, Science (1991) 251:1360 を参照の
こと。これらのオリゴマーはそれ自体を投与することも
できるし、関連オリゴマーをin vivo で発現させること
もできる。

【００７２】Frizzled−６およびその活性の過少発現に
関係した異常な状態を治療する場合も、いくつかのアプ
ローチを取ることができる。一つのアプローチは、治療
上有効な量のFrizzled−６を活性化する化合物（すなわ
ち、前記のアゴニスト）を製剤学上許容される担体とと
もに患者に投与して、異常な状態を緩和することを含ん
でなる。別法として、患者の関連細胞においてFrizzled
−６を内因的に産生させるために遺伝子治療を用いるこ
とができる。例えば、上で述べたような複製欠損レトロ
ウイルスベクターによる発現のために本発明のポリヌク
レオチドを遺伝子操作する。次にレトロウイルス発現構
築物を単離し、本発明のポリペプチドをコードするＲＮ
Ａを含有するレトロウイルスプラスミドベクターで形質
導入されたパッケージング細胞に導入する。その結果、
パッケージング細胞は対象の遺伝子を含有する感染性の
ウイルス粒子を産生するようになる。in vivo での細胞
処理およびin vivo でのポリペプチド発現のために、こ
れらの産生細胞を患者に投与する。遺伝子治療の概論に
関しては、Human Molecular Genetics, T Strachanand
A P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd (1996) 中
のChapter 20, GeneTherapy and other Molecular Gene
tic-based Therapeutic Approaches(およびその中の引
用文献) を参照のこと。もう一つのアプローチは治療量
のFrizzled−６ポリペプチドを適当な製剤学上の担体と
ともに投与することである。

【００７３】製剤および投与 可溶性形態のFrizzled−６ポリペプチドのようなペプチ
ド、アゴニストおよびアンタゴニストペプチド、または
小分子は適当な製剤学上の担体と組み合わせて製剤化す
ることができる。このような製剤は治療上有効な量のポ
リペプチドまたは化合物と、製剤学上許容される担体ま
たは賦形剤を含有する。この種の担体としては、食塩
水、生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、
エタノール、およびこれらの組合せがあるが、これらに
限らない。製剤は投与様式に適合させるべきであり、こ
れは当技術分野の技量の範囲内である。本発明はさら
に、前記の本発明組成物の１以上の成分を充填した１以
上の容器を含んでなる医薬用パックおよびキットに関す
る。本発明のポリペプチドおよび他の化合物は単独で使
用しても、他の化合物、例えば治療用化合物と一緒に使
用してもよい。

【００７４】医薬組成物を全身投与するときの好ましい
形態は、注入（注射）、典型的には静注である。皮下、
筋肉内または腹腔内のような他の注入経路も使用でき
る。全身投与の別の手段は、胆汁酸塩、フシジン酸、そ
の他の界面活性剤などの浸透剤を用いた経粘膜および経
皮投与である。さらに、腸溶剤またはカプセル剤として
適切に製剤化されているのであれば、経口投与も可能で
ある。これらの化合物は軟膏、ペースト、ゲルなどの剤
形で局所に投与しても、かつ／または局在化させてもよ
い。

【００７５】必要な投与量範囲はペプチドの選択、投与
経路、製剤の性質、患者の状態、そして医師の判断に左
右される。しかし、適当な投与量は患者の体重１kgあた
り0.1 〜100 μg の範囲である。利用可能な化合物が多
種多様であり、それぞれの投与経路の効率も異なるた
め、必要とされる投与量は広範に変動することを予想す
べきである。例えば、経口投与は静注による投与よりも
高い投与量を必要とすることが予想される。こうした投
与量レベルの変動は、当技術分野でよく理解されている
ような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整するこ
とができる。

【００７６】治療に用いるポリペプチドは、上述したよ
うな「遺伝子治療」と称する治療法において、患者の体
内で産生させることもできる。例えば、患者由来の細胞
を、ex vivo でポリペプチドをコードするＤＮＡまたは
ＲＮＡのようなポリヌクレオチドにより、例えばレトロ
ウイルスプラスミドベクターを用いて、遺伝子工学的に
操作する。その後、この細胞を患者に導入する。

【００７７】

【実施例】別に詳細に記載する以外は、当業者には公知
で通常の標準的な技法を使用して以下の実施例を行なっ
た。これらの実施例は例示するもので、本発明を制限す
るものではない。

【００７８】実施例１：哺乳動物細胞における発現 本発明の受容体を、ヒト胚腎293（HEK293）細胞または
付着性dhfr CHO細胞のいずれかにおいて発現させた。受
容体の発現を最大にするために、ｐCDNまたはｐCDNA3ベ
クターへ挿入する前に、一般的には全ての５'および３'
非翻訳領域（UTRs）を受容体ｃＤＮＡから取り除いた。
これらの細胞をリポフェクチンを用いて個々の受容体ｃ
ＤＮＡによりトランスフェクトし、400 mg／mlのＧ418
の存在下で選択した。3週間の選択後に、個々のクロー
ンを拾い、さらなる分析のために増殖させた。ベクター
のみでトランスフェクトしたHEK293またはCHO細胞を陰
性対照として使用した。個々の受容体を安定して発現し
ている細胞系を単離するために、一般的に約24個のクロ
ーンを選択し、ノーザンブロット分析により分析した。
受容体ｍＲＮＡは、通常、分析したＧ418耐性クローン
の約50％において検出可能であった。

【００７９】実施例２：結合アッセイおよび機能アッセ
イ用のリガンドバンク(bank) 200を越える推定上の受容体リガンドのバンクがスクリ
ーニングのために集成された。このバンクには以下のも
のが含まれる。すなわち、ヒトの７回膜貫通(7TM)受容
体を介して作用することが知られている伝達物質、ホル
モンおよびケモカイン；ヒト7ＴＭ受容体の推定上のア
ゴニストでありうる、天然に存在する化合物；非哺乳動
物の生理活性ペプチド(哺乳動物の対応物は未だ同定さ
れていない)；および天然には見出せないが未知の天然
リガンドと共に７ＴＭ受容体を活性化する化合物であ
る。このバンクは結合アッセイと機能(すなわち、カル
シウム、ｃＡＭＰ、ミクロフィジオメーター( microphy
siometer )、卵母細胞電気生理学など、以下を参照)ア
ッセイの両方を用いて、既知のリガンドに対する該受容
体を最初にスクリーニングするために使用された。

【００８０】実施例３：リガンド結合アッセイ リガンド結合アッセイは受容体薬理学をつきとめるため
の直接的な方法を提供し、また高処理量方式にも適用が
可能である。受容体の精製リガンドを結合実験のために
高い比活性( 50−2000 Ci／mmol )で放射性標識した。
次に、放射性標識化のプロセスがその受容体に対するリ
ガンドの活性を低下させないことを確かめた。緩衝液、
イオン、ｐHおよびヌクレオチドのような他のモジュレ
ーターについてのアッセイ条件を最適化し、膜および全
細胞の両受容体源についての実施可能な生じうるシグナ
ル対ノイズ比を確立した。これらのアッセイのために、
特異的受容体結合を、全結合放射能から、過剰の未標識
競合リガンドの存在下で測定した放射能を差し引いた値
として定義した。可能であれば、２以上の競合リガンド
を用いて残留する非特異的な結合を確定する。

【００８１】実施例４：アフリカツメガエル卵母細胞に
おける機能アッセイ 本発明の受容体ｃＤＮＡをコードする線状化プラスミド
の鋳型からのキャップしたＲＮＡ転写物を、標準的な手
法に従い、in vitroでＲＮＡポリメラーゼを使用して合
成した。in vitroでの転写物を最終濃度0.2 mg／mlで水
中に懸濁した。卵巣葉(ovarian lobes)を成熟雌カエル
から取り出し、ステージVの脱濾胞化卵母細胞を得て、
ＲＮＡ転写物(10ng／卵母細胞)を微量注入装置を用いて
50nlで単回注入した。２つの電極電位クランプを用い
て、アゴニストへの暴露に応答した個々のアフリカツメ
ガエルの卵母細胞からの電流を測定した。室温でCa²⁺を
含まないバース(Barth's)培地中で記録を行なった。こ
のアフリカツメガエル系を使用して、活性化用リガンド
についての既知のリガンドおよび組織／細胞抽出物をス
クリーニングすることができる。

【００８２】実施例５：ミクロフィジオメトリックアッ
セイ 多様な第二メッセンジャー系の活性化により、細胞から
少量の酸が放出される。この酸は主として細胞内のシグ
ナル伝達プロセスを活気づけるために必要な代謝活性が
増強した結果として産出される。この細胞を取り巻く培
地におけるｐＨの変化は非常に小さいが、サイトセンサ
ー( CYTOSENSOR )ミクロフィジオメーター（ Mole cula
r Devices Ltd., Menlo Park,CA ）により検出できる。
したがって、このサイトセンサーは本発明のＧタンパク
質共役型受容体のような、細胞内シグナル伝達経路を利
用するエネルギーに共役する受容体の活性化を検出する
ことができる。

【００８３】実施例６：抽出物／細胞上清スクリーニン
グ 多くの哺乳動物受容体が存在するが、今のところ同一動
物種(cognate)の活性化用リガンド(アゴニスト)は見つ
かっていない。したがって、これらの受容体を活性化す
るリガンドは、今日までに同定されたリガンドバンクに
は含まれていない可能性がある。よって、本発明の７Ｔ
Ｍ受容体もまた、天然のリガンドを同定するために組織
抽出物に対して機能的に(カルシウム、ｃＡＭＰ、ミク
ロフィジオメーター、卵母細胞電気生理学などの機能ス
クリーンを使用して)スクリーニングされた。陽性の機
能的な応答を示す抽出物を、活性化用リガンドが単離さ
れ同定されるまで順次サブ分画することができる。

【００８４】実施例７：カルシウムおよびｃＡＭＰ機能
アッセイ HEK293細胞で発現された7ＴＭ受容体は、ＰＬＣおよび
カルシウムの動員活性化および／またはｃＡＭＰの刺激
または阻害と機能的に共役することが示された。受容体
トランスフェクト細胞またはベクター対照細胞における
HEK293細胞中の基礎カルシウムレベルは、正常な100nM
〜200nMの範囲で観察された。組換え受容体を発現して
いるHEK293細胞を、fura２を添加し、一日で＞150個の
選択したリガンドまたは組織／細胞抽出物をアゴニスト
誘導カルシウム動員について評価した。同様に、組換え
受容体を発現しているHEK293細胞を標準的なｃＡＭＰ定
量アッセイを用いて、ｃＡＭＰ産生の刺激または阻害に
ついて評価した。一時的にカルシウムを動員する、また
はｃＡＭＰの変動を示すアゴニストをベクター対照細胞
で試験し、このときの応答が受容体を発現しているトラ
ンスフェクト細胞に特有なものであるかどうかを決定し
た。

【００８５】本明細書中に引用された、特許および特許
出願明細書を含めた全ての刊行物は、あたかも各刊行物
が明確にかつ個々に示されているかのように、その全体
を参考としてここに組み入れるものとする。

【００８６】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：2880 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 CGGAGCCGTC TCAGGTCCCT GGGGGGAACG GTGGGTTAGA CGGGGACGGG AAGGGACAGC 60 GGCCTTCGAC CGCCCCCCGA GTAATTGACC CAGGACTCAT TTTCAGGAAA GCCTGAAAAT 120 GAGTAAAATA GTGAAATGAG GAATTTGAAC ATTTTATCTT TGGATGGGGA TCTTCTGAGG 180 ATGCAAAGAG TGATTCATCC AAGCCATGTG GTAAAATCAG GAATTTGAAG AAAATGGAGA 240 TGTTTACATT TTTGTTGACG TGTATTTTTC TACCCCTCCT AAGAGGGCAC AGTCTCTTCA 300 CCTGTGAACC AATTACTGTT CCCAGATGTA TGAAAATGGC CTACAACATG ACGTTTTTCC 360 CTAATCTGAT GGGTCATTAT GACCAGAGTA TTGCCGCGGT GGAAATGGAG CATTTTCTTC 420 CTCTCGCAAA TCTGGAATGT TCACCAAACA TTGAAACTTT CCTCTGCAAA GCATTTGTAC 480 CAACCTGCAT AGAACAAATT CATGTGGTTC CACCTTGTCG TAAACTTTGT GAGAAAGTAT 540 ATTCTGATTG CAAAAAATTA ATTGACACTT TTGGGATCCG ATGGCCTGAG GAGCTTGAAT 600 GTGACAGATT ACAATACTGT GATGAGACTG TTCCTGTAAC TTTTGATCCA CACACAGAAT 660 TTCTTGGTCC TCAGAAGGAA ACAGAACAAG TCCAAAGAGA CATTGGATTT TGGTGTCCAA 720 GGCATCTTAA GACTTCTGGG GGACAAGGAT ATAAGTTTCT GGGAATTGAC CAGTGTGCGC 780 CTCCATGCCC CAACATGTAT TTTAAAAGTG ATGAGCTAGA GTTTGCAAAA AGTTTTATTG 840 GAACAGTTTC AATATTTTGT CTTTGTGCAA CTCTGTTCAC ATTCCTTACT TTTTTAATTG 900 ATGTTAGAAG ATTCAGATAC CCAGAGAGAC CAATTATATA TTACTCTGTC TGTTACAGCA 960 TTGTATCTCT TATGTACTTC ATTGGATTTT TGCTGGGCGA TAGCACAGCC TGCAATAAGG 1020 CAGATGAGAA GCTAGAACTT GGTGACACTG TTGTCCTAGG CTCTCAAAAT AAGGCTTGCA 1080 CCGTTTTGTT CATGCTTTTG TATTTTTTCA CAATGGCTGG CACTGTGTGG TGGGTGATTC 1140 TTACCATTAC TTGGTTCTTA GCTGCAGGAA GAAAATGGAG TTGTGAAGCC ATCGAGCAAA 1200 AAGCAGTGTG GTTTCATGCT GTTGCATGGG GAACACCAAG TTTCCTGACT GTTATGCTTC 1260 TTGCTCTGAA CAAAGTTGAA GGAGACAACA TTAGTGGAGT TCGCTTTGTT GGCCTTTATG 1320 ACCTGGATGC TTCTCGCTAC TTTGTACTCT TGCCACTGTG CCTTTGTGTG TTTGTTGGGC 1380 TCTCTCTTCT TTTAGCTGGC ATTATTTCCT TAAATCATGT TCGACAAGTC ATACAACATG 1440 ATGGCCGGAA CCAAGAAAAA CTAAAGAAAT TTATGATTCG AATTGGAGTC TTCAGCGGCT 1500 TGTATCTTGT GCCATTAGTG ACACTTCTCG GATGTTACGT CTATGAGCAA GTGAACAGGA 1560 TTACCTGGGA GATAACTTGG GTCTCTGATC ATTGTCGTCA GTACCATATC CCATGTCCTT 1620 ATCAGGCAAA AGCAAAAGCT CGACCAGAAT TGGCTTTATT TATGATAAAA TACCTGATGA 1680 CATTAATTGT TGGCATCTCT GCTGTCTTCT GGGTTGGAAG CAAAAAGACA TGCACAGAAT 1740 GGGCTGGGTT TTTTAAACGA AATCGCGGGA GAGATCCAAT CAGTGAAAGT CGAAGAGTAC 1800 TACAGGAATC ATGTGAGTTT TTCTTAAAGC ACAATTCTAA AGTTAAACAC AAAAAGAAGC 1860 ACTATAAACC GAGTTCACGC AAGCTGAAGG TCATTTCCAA ATCCATGGGA ACCAGCACAG 1920 GAGCTACAGC AAATCATGGC ACTTCTGCAG TAGCAATTAC TAGCCATGAT TACCTAGGAC 1980 AAGAAACTTT GACAGAAATC CAAACCTCAC CAGAAACATC AATGAGAGAG GTGAAAGCGG 2040 ACGGAGCTAG CACCCCCAGG TTAAGAGAAC AGGACTGTGG TGAACCTGCC TCGCCAGCAG 2100 CATCCATCTC CAGACTCTCT GGGGAACAGG TCGACGGGAA GGGCCAGGCA GGCAGTGTAT 2160 CTGAAAGTGC GCGGAGTGAA GGAAGGATTA GTCCAAAGAG TGATATTACT GACACTGGCC 2220 TGGCACAGAG CAACAATTTG CAGGTCCCCA GTTCTTCAGA ACCAAGCAGC CTCAAAGGTT 2280 CCACATCTCT GCTTGTTCAC CCAGTTTCAG GAGTGAGAAA AGAGCAGGGA GGTGGTTGTC 2340 ATTCAGATAC TTGAAGAACA TTTTCTCTCG TTACTCAGAA GCAAATTTGT GTTACACTGG 2400 AAGTGACCTA TGCACTGTTT TGTAAGAATC ACTGTTACGT TCTTCTTTTG CACTTAAAGT 2460 TGCATTGCCT ACTGTTATAC TGGAAAAAAT AGAGTTCAAG AATAATATGA CTCATTTCAC 2520 ACAAAGGTTA ATGACAACAA TATACCTGAA AACAGAAATG TGCAGGTTAA TAATATTTTT 2580 TTAATAGTGT GGGAGGACAG AGTTAGAGGA ATCTTCCTTT TCTATTTATG AAGATTCTAC 2640 TCTTGGTAAG AGTATTTTAA GATGTACTAT GCTATTTTAC TTTTTTGATA TAAAATCAAG 2700 ATATTTCTTT GCTGAAGTAT TTAAATCTTA TCCTTGTATC TTTTTATACA TATTTGAAAA 2760 TAAGCTTATA TGTATTTGAA CTTTTTTGAA ATCCTATTCC AGTATTTTTA TCATGCTATT 2820 GTGATATTTT AGCACTTTGG TAGCTTTTAC ACTGAAATTT CTAAGAAAAT TGTAAAATAG 2880

【００８７】配列番号：２ 配列の長さ：706 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Glu Met Phe Thr Phe Leu Leu Thr Cys Ile Phe Leu Pro Leu Leu 1 5 10 15 Arg Gly His Ser Leu Phe Thr Cys Glu Pro Ile Thr Val Pro Arg Cys 20 25 30 Met Lys Met Ala Tyr Asn Met Thr Phe Phe Pro Asn Leu Met Gly His 35 40 45 Tyr Asp Gln Ser Ile Ala Ala Val Glu Met Glu His Phe Leu Pro Leu 50 55 60 Ala Asn Leu Glu Cys Ser Pro Asn Ile Glu Thr Phe Leu Cys Lys Ala 65 70 75 80 Phe Val Pro Thr Cys Ile Glu Gln Ile His Val Val Pro Pro Cys Arg 85 90 95 Lys Leu Cys Glu Lys Val Tyr Ser Asp Cys Lys Lys Leu Ile Asp Thr 100 105 110 Phe Gly Ile Arg Trp Pro Glu Glu Leu Glu Cys Asp Arg Leu Gln Tyr 115 120 125 Cys Asp Glu Thr Val Pro Val Thr Phe Asp Pro His Thr Glu Phe Leu 130 135 140 Gly Pro Gln Lys Glu Thr Glu Gln Val Gln Arg Asp Ile Gly Phe Trp 145 150 155 160 Cys Pro Arg His Leu Lys Thr Ser Gly Gly Gln Gly Tyr Lys Phe Leu 165 170 175 Gly Ile Asp Gln Cys Ala Pro Pro Cys Pro Asn Met Tyr Phe Lys Ser 180 185 190 Asp Glu Leu Glu Phe Ala Lys Ser Phe Ile Gly Thr Val Ser Ile Phe 195 200 205 Cys Leu Cys Ala Thr Leu Phe Thr Phe Leu Thr Phe Leu Ile Asp Val 210 215 220 Arg Arg Phe Arg Tyr Pro Glu Arg Pro Ile Ile Tyr Tyr Ser Val Cys 225 230 235 240 Tyr Ser Ile Val Ser Leu Met Tyr Phe Ile Gly Phe Leu Leu Gly Asp 245 250 255 Ser Thr Ala Cys Asn Lys Ala Asp Glu Lys Leu Glu Leu Gly Asp Thr 260 265 270 Val Val Leu Gly Ser Gln Asn Lys Ala Cys Thr Val Leu Phe Met Leu 275 280 285 Leu Tyr Phe Phe Thr Met Ala Gly Thr Val Trp Trp Val Ile Leu Thr 290 295 300 Ile Thr Trp Phe Leu Ala Ala Gly Arg Lys Trp Ser Cys Glu Ala Ile 305 310 315 320 Glu Gln Lys Ala Val Trp Phe His Ala Val Ala Trp Gly Thr Pro Ser 325 330 335 Phe Leu Thr Val Met Leu Leu Ala Leu Asn Lys Val Glu Gly Asp Asn 340 345 350 Ile Ser Gly Val Arg Phe Val Gly Leu Tyr Asp Leu Asp Ala Ser Arg 355 360 365 Tyr Phe Val Leu Leu Pro Leu Cys Leu Cys Val Phe Val Gly Leu Ser 370 375 380 Leu Leu Leu Ala Gly Ile Ile Ser Leu Asn His Val Arg Gln Val Ile 385 390 395 400 Gln His Asp Gly Arg Asn Gln Glu Lys Leu Lys Lys Phe Met Ile Arg 405 410 415 Ile Gly Val Phe Ser Gly Leu Tyr Leu Val Pro Leu Val Thr Leu Leu 420 425 430 Gly Cys Tyr Val Tyr Glu Gln Val Asn Arg Ile Thr Trp Glu Ile Thr 435 440 445 Trp Val Ser Asp His Cys Arg Gln Tyr His Ile Pro Cys Pro Tyr Gln 450 455 460 Ala Lys Ala Lys Ala Arg Pro Glu Leu Ala Leu Phe Met Ile Lys Tyr 465 470 475 480 Leu Met Thr Leu Ile Val Gly Ile Ser Ala Val Phe Trp Val Gly Ser 485 490 495 Lys Lys Thr Cys Thr Glu Trp Ala Gly Phe Phe Lys Arg Asn Arg Gly 500 505 510 Arg Asp Pro Ile Ser Glu Ser Arg Arg Val Leu Gln Glu Ser Cys Glu 515 520 525 Phe Phe Leu Lys His Asn Ser Lys Val Lys His Lys Lys Lys His Tyr 530 535 540 Lys Pro Ser Ser Arg Lys Leu Lys Val Ile Ser Lys Ser Met Gly Thr 545 550 555 560 Ser Thr Gly Ala Thr Ala Asn His Gly Thr Ser Ala Val Ala Ile Thr 565 570 575 Ser His Asp Tyr Leu Gly Gln Glu Thr Leu Thr Glu Ile Gln Thr Ser 580 585 590 Pro Glu Thr Ser Met Arg Glu Val Lys Ala Asp Gly Ala Ser Thr Pro 595 600 605 Arg Leu Arg Glu Gln Asp Cys Gly Glu Pro Ala Ser Pro Ala Ala Ser 610 615 620 Ile Ser Arg Leu Ser Gly Glu Gln Val Asp Gly Lys Gly Gln Ala Gly 625 630 635 640 Ser Val Ser Glu Ser Ala Arg Ser Glu Gly Arg Ile Ser Pro Lys Ser 645 650 655 Asp Ile Thr Asp Thr Gly Leu Ala Gln Ser Asn Asn Leu Gln Val Pro 660 665 670 Ser Ser Ser Glu Pro Ser Ser Leu Lys Gly Ser Thr Ser Leu Leu Val 675 680 685 His Pro Val Ser Gly Val Arg Lys Glu Gln Gly Gly Gly Cys His Ser 690 695 700 Asp Thr 705

【００８８】配列番号：３ 配列の長さ：315 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 TCTGAACAAA GTTGAAGGAG ACAACATTAG TGGAGTTTGC TTTGTTGGCC TTTATGACCT 60 GGATGCTTCT CGCTACTTTG TACTCTTGCC ACTGTGCCTT TNTGTGTTTG TTGGGCTCTC 120 TCTTCTTTTA GCTGGCATTA TTTCCTTAAA TCATGTTCGA CAAGTCATAC AACATGATGG 180 CCGGAACCAA GAAAAACTAA AGAAATTTAT GATTCGAATT GGAGTCTTCA GCGGCTTTGT 240 ATCTTGTGCC ATTAGTGACA CTTCTCGGAT GTTACGTCTA TGAGCAAGTG AACAGGATTA 300 CCTGGGAGAT AACTT 315

【００８９】配列番号：４ 配列の長さ：26 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Leu Asn Lys Val Glu Gly Asp Asn Ile Ser Gly Val Cys Phe Val Gly 1 5 10 15 Leu Tyr Asp Leu Asp Ala Ser Arg Tyr Phe 20 25

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 31/70 ＡＡＮ Ａ６１Ｋ 31/70 ＡＡＮ ＡＡＲ ＡＡＲ ＡＢＦ ＡＢＦ ＡＢＪ ＡＢＪ ＡＢＮ ＡＢＮ ＡＢＳ ＡＢＳ ＡＢＵ ＡＢＵ ＡＢＶ ＡＢＶ ＡＣＤ ＡＣＤ ＡＣＬ ＡＣＬ ＡＣＭ ＡＣＭ ＡＣＮ ＡＣＮ ＡＣＶ ＡＣＶ ＡＤＦ ＡＤＦ ＡＤＰ ＡＤＰ ＡＤＴ ＡＤＴ ＡＤＵ ＡＤＵ ＡＤＹ ＡＤＹ ＡＤＺ ＡＤＺ ＡＥＢ ＡＥＢ 38/00 ＡＡＡ 45/00 45/00 48/00 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ０７Ｋ 14/705 16/28 16/28 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566 33/53 33/577 Ｂ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＡＡ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ユアン，ズ アメリカ合衆国 19406 ペンシルバニア 州， キング オブ プラッシア，ウェイ ン ドライブ 525

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号２のFrizzled−６ポリペプチド
   をコードするヌクレオチド配列と全長において少なくと
   も８０％同一であり、かつFrizzled−６ポリペプチドの
   活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配
   列、またはこのヌクレオチド配列に対して相補的なヌク
   レオチド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチ
   ド。
2. 【請求項２】 前記のポリヌクレオチドが、配列番号２
   のFrizzled−６ポリペプチドをコードする配列番号１中
   に含まれるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１に
   記載のポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 前記のポリヌクレオチドが、その全長に
   おいて配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも８０
   ％同一であるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１
   に記載のポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 配列番号１のポリヌクレオチドである、
   請求項３に記載のポリヌクレオチド。
5. 【請求項５】 ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１に
   記載のポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 配列番号２のFrizzled−６ポリペプチド
   のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が付
   加、欠失または置換されており、かつFrizzled−６ポリ
   ペプチドの活性を有するアミノ酸配列をコードするヌク
   レオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド。
7. 【請求項７】 下記発現系が適合性の宿主細胞内に存在
   するとき配列番号２のポリペプチドと少なくとも８０％
   同一であるアミノ酸配列を含むFrizzled−６ポリペプチ
   ドを産生することができる発現系を含んでなるＤＮＡま
   たはＲＮＡ分子。
8. 【請求項８】 請求項７に記載の発現系を含有する宿主
   細胞。
9. 【請求項９】 Frizzled−６ポリペプチドを産生させる
   のに十分な条件下で請求項８に記載の宿主細胞を培養
   し、この培養物から前記ポリペプチドを回収することを
   含んでなる、Frizzled−６ポリペプチドの産生方法。
10. 【請求項１０】 宿主細胞が適当な培養条件下でFrizzl
    ed−６ポリペプチドを産生するように、請求項７に記載
    の発現系を用いて宿主細胞を形質転換またはトランスフ
    ェクションすることを含んでなる、Frizzled−６ポリペ
    プチドを産生する細胞の作製方法。
11. 【請求項１１】 全長において配列番号２のアミノ酸配
    列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んで
    なるFrizzled−６ポリペプチド。
12. 【請求項１２】 配列番号２のアミノ酸配列を含む、請
    求項１１に記載のポリペプチド。
13. 【請求項１３】 請求項１１に記載のFrizzled−６ポリ
    ペプチドに免疫特異的な抗体。
14. 【請求項１４】 請求項１１に記載のFrizzled−６ポリ
    ペプチドの増大した活性または発現を必要としている患
    者を治療するための医薬組成物であって、治療上有効な
    量の、 (a) 前記受容体に対するアゴニスト、および／または
    (b) 前記ポリペプチド活性のin vivo 生産をもたらす形
    の、配列番号２のFrizzled−６ポリペプチドをコードす
    るヌクレオチド配列と全長において少なくとも８０％同
    一であるヌクレオチド配列、または前記ヌクレオチド配
    列に対して相補的なヌクレオチド配列を含んでなる単離
    されたポリヌクレオチド、を含んでなる医薬組成物。
15. 【請求項１５】 請求項１１に記載のFrizzled−６ポリ
    ペプチドの活性または発現を抑制する必要がある患者を
    治療するための医薬組成物であって、治療上有効な量
    の、 (a) 前記受容体に対するアンタゴニスト、および／また
    は(b) 前記受容体をコードするヌクレオチド配列の発現
    を抑制する核酸分子、および／または(c) 前記受容体と
    そのリガンドについて競合するポリペプチド、を含んで
    なる医薬組成物。
16. 【請求項１６】 請求項１１に記載のFrizzled−６ポリ
    ペプチドの発現または活性と関連した被験者の疾病また
    はその罹病性の検出方法であって、 (a) 前記被験者由来のゲノム中のFrizzled−６ポリペプ
    チドをコードするヌクレオチド配列に突然変異があるか
    どうかを調べる、および／または(b) 前記被験者から得
    られたサンプル中のFrizzled−６ポリペプチド発現の存
    在または量を分析する、ことを含んでなる方法。
17. 【請求項１７】 請求項１１に記載のFrizzled−６ポリ
    ペプチドに対するアゴニストの同定方法であって、 (a) Frizzled−６ポリペプチドを発現している細胞と候
    補化合物とを接触させ、そして(b) その候補化合物がFr
    izzled−６ポリペプチドの活性化によりシグナルを発生
    させるか否かを調べる、ことを含んでなる方法。
18. 【請求項１８】 請求項１７に記載の方法により同定さ
    れたアゴニスト。
19. 【請求項１９】 請求項１１に記載のFrizzled−６ポリ
    ペプチドに対するアンタゴニストの同定方法であって、 (a) Frizzled−６ポリペプチドを発現している細胞とア
    ゴニストとを接触させ、そして(b) 前記アゴニストによ
    り発生したシグナルが候補化合物の存在下で減少するか
    否かを調べる、ことを含んでなる方法。
20. 【請求項２０】 請求項１９に記載の方法により同定さ
    れたアンタゴニスト。
21. 【請求項２１】 請求項１０に記載の方法により作製さ
    れた組換え宿主細胞またはFrizzled−６ポリペプチドを
    発現しているその膜。