JPH06506598A - 副甲状腺ホルモンのレセプターとそれをコードしているｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 副甲状腺ホルモンのレセプターとそれをコードしているＤＮＡ発明の背景 ここに記載するり（究の助成金は一部アメリカ合衆国政府によって提供されたも のであり、同政府は本発明に対し一定の権利を保有する。

本発明は内分泌レセプターに関する。

ホルモン作用発現の重要な段階は、ホルモンと標的細胞の原形質膜表面上にある レセプターとのｔ０互作用である。ホルモン−レセプター複合体の形成によって 、細胞外シグナルを細胞内に導入して種々の生物学的反応を顕現することが可能 となる。例えば、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）　、 甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び拭上性性腺刺激ホルモン（ＣＧ）のような ホルモンの、その細胞表面レセプターへの結合はレセプターの高次構造の変化を 誘発し、その結果、レセプターと導入分子、即ち、その−成分が（Ｇ８）である 刺激性グアニンヌクレオチド（ＧＴＰ）結合蛋白質との連携が起こる。この連携 はアデニル酸シクラーゼを刺激し、次いて蛋白質のリン酸化、ステロイドの合成 と分泌、及びイオンフラックスの調節のような他の細胞の過程を刺激する。アル ギニンバソプレッ／ン（ＡＶ）　、アンギオテンンンＩＩ、及びノルエピネフリ ンを含、　む他のホルモンの、その細胞表面レセプターへの結合の結果、（ＧＰ ）のような別のタイプのＧＴＰ結合蛋白質成分の活性化をもたらし、次いで酵素 ホスホリパーゼＣの活性を刺激する。ホスホリパーゼＣによる加水分解の生成物 は、細胞内カルシウムの動員と蛋白質のリン酸化を含む細胞内現象の複雑なカス ケードを引き起こす。

副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）はカルシウムの恒常性の主要な調節物質であり、そ の重要な標的細胞は骨と腎臓に存在する。カルシウム濃度の調節は、胃腸、筋肉 、神経、神紅筋、及び心臓血管などの系の正常な機能のために必要である。ＰＴ Ｈの合成と分泌は、主として血漿のカルシウムレベルによって制御される・低レ ベルはホルモンの合成と分泌の両方を刺激し、高レベルは抑制する。次いでＰＴ Ｈは、直接的または間接的に、３つのカルシウム交換部位、即ち、腸、骨、及び 腎臓におけるカルシウムの血中への流入を促進することによって血漿カルシウム レベルを維持する。ＰＴＨは腎臓における活性型ビタミンＤの生合成を助成する ことによってカルシウムの胃腸からの正味の吸収に寄与する。ＰＴＨは遺骨細胞 を阻害し、また、間接的に、骨吸収細胞である破骨細胞の分化を促進することに よって骨からのカルシウム再吸収を促進する。このホルモンは、また、〒１臓に 対する少なくとも３つの効果：尿細管のカルシウム再吸収の刺激、リン酸クリア ランスの向上、及び活性型ビタミンＤの合成を完結する酵素量の増大促進を仲介 する。ＰＴＨによるレセプター仲介のホスホリパーゼＣの活性化も報告されては いるが（Ｈｒｕｓｋａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ　７９：２ ３０．１９８７）、ＰＴＨはこれらの効果を主としてレセプター仲介によるアデ ニル酸シクラーゼの活性化を通じて発揮する。

カルシウム恒常性の崩壊は多くの臨床的障害（例えば、重症な骨の疾患、ｉ（血 、腎障害、潰瘍、筋障害、及び神経障害）を引き起こすことがあり、普通は、副 甲状腺ホルモンのレベルの変化を起こすような状態に起因するものである。高カ ルシウム血症は血漿カルシウムレベルの上昇を特徴とする症状である。それは、 しばしば、副甲状腺の病変（例えば、腺腫、増殖、または癌腫）の結果としてＰ ＴＨの生産過剰が起こる一次性副甲状腺機能冗進症に関連している。もう一つの タイプの高カルシウム血症、悪性の体液性高カルシウム血症（ＨＨＭ）はもつと も普通の腫瘍の症候群である。それは大抵の場合、腫ｆｉＡ（鱗状、腎臓、卵巣 または膀胱の癌腫）によるＰＴＨとアミノ酸相同性を共有する新しいクラスの蛋 白質ホルモンの生成に起因するようである。これらのＰＴＨ関連蛋白質（ＰＴＨ ｒＰ）は−見、ＰＴＨの腎臓と筋肉に対する作用のあるものを模倣し、これらの 組織におけるＰＴＨレセプターと相互作用すると信しられている。ＰＴＨｒＰは 、通常、ケラチノサイト、脳、下垂体、副甲状腺、副腎皮質、髄質、胎児の肝臓 、遺骨細胞様細胞、及び授乳期の乳腺を含む多くの組織に少量見出だされる。多 くのＨＨＭ悪性肚瘍において、ＰＴＨｒＰは循環系に高レベルで見出だされ、Ｈ ＨＭ関連の高カルシウムレベルを生じる。

本発明はを椎動物の細胞のレセプター、望むべくは、副甲状腺ホルモンレセプタ ーをコードしているＤＮＡ配列からなる分離されたＤＮＡを特徴とする。このレ セプターは、図３に示されているアミノ酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、：　３） に対し少なくとも３０％（望ましいのは少なくとも５０％、更に望ましいのは少 なくとも６０％、そして最も望ましいのは少なくとも７５％）同一のアミノ酸配 列を持つものである。即ち、２つのアミノ酸配列間で（標準の方法を用いて）最 近似部位をめる場合、前者の配列のアミノ酸歿基の少なくとも３０％が後者の配 列のアミノ酸技基と同一ということである。゛分離された゛とは、このＤＮＡが 、本発明のＤＮＡが由来する（何であれ）生物に本来あるゲノム内で、本発明の ＤＮＡをコードしている遺伝子に直接隣接している遺伝子のコーディング配列を 全く持たないということを意味する。分離されたＤＮＡは１本鎖、または２本鎖 でもよく、また、ゲノムＤＮＡ％ｃＤＮＡ、組換えハイブリッドＤＮＡ、あるい は合成りＮＡでもよい。それは自然に存在する細胞のレセプター（例えば、ＰＴ Ｈレセプター）をコードしているＤＮＡ配列と同一かも知れず、あるいは、この ような配列とは、１つあるいはそれ以上のヌクレオチドの欠落、（−１加、また は、置換によって異なるかも知れない。本発明の１本鎖ＤＮＡは、一般に少なく とも８ヌクレオチドの長さを持ち（望ましいのは、少なくとも１８ヌクレオチド の長さ、そして更に望ましいのは３０ヌクレオチドの長さ）、遺伝子あるいはｃ ＤＮＡの全長に及ぶこともある。これらはハイブリッド形成プローブとして用い るため、検出され昌いように標識されていることが望ましく、また、アンチセン スのこともあり得る。出来れば、この分離されたＤＮＡは高度緊縮条件下に、図 １（配列番号（以下、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、で表す）：１）、図２（ＳＥＱ　Ｉ ＤＮ０．２）、図３（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、：３）、あるいは図６　（ＳＥＱＩ Ｄ　Ｎｏ、：４）に示されているＤＮＡ配列の全体、あるいは一部とハイブリッ ドを形成することが望ましい。“高度緊縮”とは、例えばヒト腎臓のＰ　Ｔ　Ｈ レセプター複合体Ａの分離のだめの以下に記載されているような条件を意味する （Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ ｏｇｙ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８ つも参照のこと、ここには引用して組み込まれている）。最も望ましいのは動物 が哺乳類（オッポサム、ラットあるいははヒト）であり、ＤＮＡ配列が図１　（ ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、・１）、図２（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、：２）、図３　（Ｓ ＥＱＩＤ　Ｎｏ、：３）、あるいは図６（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、：４）に示され ているアミノ酸配列を本質的にすべてコードしており、あるいはＡｍｅｒｉｃａ ｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ）に寄託され 、ＡＴＣＣ受託番号６８６７０あるいは６８５７１と名付けられているプラスミ ドの１つのコーディング配列によってコードされていることである。本発明のＤ ＮＡは、この発明の細胞レセプター（例えば、副甲状腺ホルモンレセプター）、 あるいはそのレセプターの断片をコードするＤＮＡ配列を含むあるベクター［そ れは精製票品（例えば、ライブラリーを形成するベクターの混合物から分離され たあるベクター）として提Ｏｔされるかも知れない］に、及びそのベクター（あ るいは上記の分離されたＤＮＡ）を含む細胞、または本質的に相同な細胞集団（ 例えば、原核細１１３、あるいは哺乳動物細胞のような真核細胞）に組み込まれ ることもあり得る。“本質的に相同”とは、少なくとも９９％の細胞が本発明の ベクター（あるいは、場合によっては分離されたＤＮＡ）を含むことを意味する 。望ましいのは、二のベクター（例えば、Ｒ１５Ｂ）が副甲状腺ホルモンレセプ ターの発現を（例えば、ベクターを移入され、あるいはベクターで形質転換され た細胞に）指示する能力を持つことである。

別の観点から見ると、本発明は、細胞レセプターをコードしている組換えＤＮＡ 分子の発現によって生成される細胞レセプター、望むべくは副甲状腺ホルモンレ セプター（あるいはその本質的に精製された標品）を特徴とする。゛本質的に精 製された標品”とは、それが自然状態下で結合している蛋白質や脂質を実質的に は含まない標品のことである。

関連した観点からは、本発明は、自然状態下に存在するこの発明の細胞レセプタ ーの断片を含むポリペプチドを特徴とする。望ましいのは、このポリペプチドが 、副甲状腺ホルモンあるいは副甲状腺ホルモン関連蛋白質と結合する能力を持つ 自然状態下に存在する副甲状腺ホルモンレセプターの断片を含むことである。

好適な実施態様では、この断片は少なくとも６つのアミノ酸の長さで、以下のグ ループから選ばれた配列を持つ。

（ａ）ＴＮＥＴＲＥＲＥＶＦＤＲＬＧＭＩＹＴＶＧ；　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ。

（ｂ）ＹＬＹＳＧＦＴＬＤＥＡＥＲＬＴＥＥＥＬ；　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、： （ｃ）ＶＴＦＦＬＹＦＬＡＴＮＹＹＷＩＬＶＥＧ；　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、ニ ア） （ｄ）Ｙ−ＲＡＴＬＡＮＴＧＣＷＤＬＳＳＧＨＫＫＷ■ＩＱＶＰ　；　（ＳＥＱ ＩＤ　Ｎｏ、：８） （ｅ）ＰＹＴＥＹＳＧＴＬＷＱＩＱＭＨＹＥｋｌ；　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、： ９）（ｆ）ＤＤＶＦＴＫＥＥＱＩＦＬＬＨＲ，ＡＱＡ；　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ 、・１（ｇ）ＦＦＲＬＨＣＴＲＮＹ；　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、・１１）（ｈ） ＥＫＫＹＬＷＧＦＴＬ：　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、・１２）（ｉ）ＶＬＡＴＫＬ ＲＥＴＮ、６Ｃ；ＲＣＤＴＲＱＱＹＲＫＬＬＫ；　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、・１ ３）　あるいは （Ｄ断片（即ち、少なくとも６賎基の長さを持つが、全体よりは短い部分）ある いは（ａ）−（ｉ）の類似体（アナログ）で、副甲状腺ホルモン、あるいは副甲 状腺ホルモン関連蛋白質［ここで“類似体（アナａグ；　ａｎａｌｏｇ）”とは 、それが類似体であるペプチドと少なくとも５０％（そして望ましいのは少なく とも７０％）同等の配列を持つペプチドを指すコを結合する能力をｔξｆつもの 。出来れば、本発明のポリペプチドは組換えＤＮＡ分子の発現によって生成され るか、または合成品（即ち、生物学的よりも化学的な手段によって組み立−Ｃら れた）であることが望ましい。本発明はこのようなポリペプチドを生成する方法 を提供し、この方法には、本発明の細胞レセプター、あるいはレセプターの断片 をコードしている分離されたＤＮＡを含む細胞を提供すること、及びこの細胞を 、分離されたＤＮＡからポリペプチドの発現を可能にするような条件下で培養す ることが含まれる。

本発明は、また、この発明の細胞レセプター（出来ればヒトのＰＴＩＩレセプタ ーのような副甲状腺ホルモンレセプター）と免疫複合体を形成する能力のある抗 体（単クローン性または多クローン性）及び抗体の精製標品を特徴とする。この ような抗体は、抗原として（１）本発明の細胞レセプターの断片を含むポリペプ チド、あるいは（２）細胞表面上に存在する本発明の細胞レセプターを用いるこ とによって生成される。この抗体は、出来れば、本発明の細胞レセプターの活性 （即ち、レセプターにそのリガンドが結合する時、レセプターによって本来引き 起こされるカスケード反応の一部を４Ｍ成するもの）を中和（即ち、部分的に、 または完全に阻害する）する能力を持つことが望ましい。好適な実施態様におい て、本発明の抗体は副甲状腺ホルモンレセプターと免疫複合体を形成する能力を 持ち、ＰＴＨレセプターの生物学的活性（即ち、アデニル酸シクラーゼの活性化 、あるいはホスホリパーゼＣの刺激）を中和することが出来る。

また本発明には、製剤上許容出来る担体中に、（ａ）本発明の細胞レセプター、 （ｂ）本発明の細胞レセプターの断片を持つポリペプチド、あるいは（Ｃ）本発 明の細胞レセプターに対する抗体を含む治療混合物が包含される。これらの治療 混合物は、本発明の細胞レセプターのリガンドによる過剰刺激を特徴とする種々 の疾病を処置する手段を提Ｏ（する。好適な実施態様において、本発明のポリペ プチドにはＰＴＨレセプター、ＰＴＨレセプターの断片、及びＰＴＨレセプター と免ｒｉ複合体を形成する抗体が含まれる。これらのポリペプチド及び抗体は、 ＰＴＨあるいはＰＴ）ＩｒＰに関連する高カルシウム血症の症例を、これとは関 連のないものと識別するための診断加薬として有用である。

本発明の核酸プローグは、遺伝子工学の一般研究者が、細胞レセプター同族体、 あるいは本発明の細胞レセプターに関連した、いかなる動物由来にせよ、その細 胞レセプターを同定し、クローン化することを可能にし、本発明の配列の有用性 を拡大する。

本発明の池の特徴と利点は、以下の好適な実施態様の説明と請求の範囲から明ら かになるであろう。

発明の詳細な説明 先ず、図の簡単な説明をする。

図１はオボッサムの腎臓のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプタークローン、０Ｋ−１（ をコートしている［４酸とアミノ酸の配列の表示である（ＳＥＱ　ＪＤ　Ｎｏ、 ：１）。

図２はオボノサムの腎臓のＰＴＩＩ／ＰＴＨｒＰレセプタークローン、ＯＫ　− ０をコードしている核酸とアミノ酸の配列の表示である（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、 ：２）。

図３はラットの骨のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターのクローン、Ｒ１５Ｂをコー ドしている核酸とアミノ酸の配列の表示である（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、：３）。

図４はクローン０Ｋ−０及びＲ１５ＢがらのｃＤＮＡにコートされている（１定 アミノ酸配列の比較である。

図５は０Ｋ−０，０Ｋ−ＨとＲ１５Ｂの推定アミノ酸配列を配列相同性に従って 並へて比較したしのである。

図６はヒトのＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターをコードしている核酸とアミノ酸配 列の表示である（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、：４）。

図７はラットのガのＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターのｃＤＮＡ、ヒトのゲノムＤ ＮＡクローン及びヒトのＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターをコードしている２つの ｃＤＮＡクローンの略図である。

図８はヒトの腎臓のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターの推定アミノ酸配列の疎水性 プロットである。予測される貫膜ドメインＩ−Ｖ１１か示されている。Ａ、Ｂ、 Ｃは追加の疎水性部位を示す。

図９は０Ｋ−Ｈを移入したＣｏＳ細胞へのＰＴＨｒＰの結合を示すグラフである 。

図１０は０Ｋ−Ｈを移入したｃｏｓｍ胞におけるＮＩｅＰＴＨによる細胞内遊離 カル／ラムの刺激を示すグラフである。

図］１はＯＫ　−０を移入したＣＯ８細胞へのＰＴＨｒＰの結合を示すグラフで ある。

図１２は０Ｋ−０を移入したＣＯ８細胞におけるＮ１ｅｒ’ＴＩによる細胞内遊 層カルシウムの刺激を示すグラフである。

図１３はＲ１５Ｂを移入したＣＯ８細胞へのＰＴＨｒＰの結合を示すグラフであ る。

図１４はＲ１５Ｂを移入したＣＯ８細胞におけるＮＩｅＰＴＨによる細胞内遊離 カルシウムの刺激を示すグラフである。

図１５は０Ｋ−Ｈ，０Ｋ−０、あルイｊｉＲ１５Ｂを移入したＣＯＳ細胞ニオケ るＮ１ｅＰＴＨによるイノシトールリン酸代謝の刺激を示すグラフである。

図１６１；ＬＣＤＭ−８，０Ｋ−Ｈ，Ｒ１５Ｂを移入したＣｏＳ細胞におｌｔル Ｎ１ｅＰＴＨによるサイクリックＡＭＰ刺激を示すグラフである。

図１７はヒトの腎臓（ＡとＣ）及びラットの骨（ＢとＤ）のｒ’ＴＨ／ＰＴＨｒ Ｐレセプターを一過性に発現しているＣＯ８細胞への１２５Ｉ−標ｍＰＴＨ（１ −３４）（ＡとＢ）及び１２５　Ｉ−標識ＰＴＨｒＰ　（１−３６）（ＣとＤ） の結合を示すグラフである。競合するりガントには、ＰＴＨ（１−３４）（ロ） 、ＰＴＨｒＰ　（１−３６）　（ネ）　、　ＰＴＨ（３−３４）　（ａｌｌ）　 、　ＰＴＨ（７−３４）　（＋）が含まれる。データは特異的結合のパーセント として示され、少なくとも３つの独立した実験の平均値上標準偏差を表すもので ある。

図１８はヒトの腎臓のレセプターを一過性に発現しているＣｏＳ細胞における細 胞内ｃＡＭＰの蓄積刺激を示すグラフである。データは平均値上標準偏差を示し 、少なくとも３つの独立した実験を表すものである。

図１９はヒトの腎臓（Ａ）と５ａＯ８−２細胞（Ｂ）から作られた総ＲＮＡ（〜 １０μｇ／レーン）のノーザンプロット分析の表示である。プロットはヒト腎臓 のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターをコードしている完全長のｃＤＮＡとハイブリ ッドを形成した。２８Ｓと１８３のリポソームＲＮＡバンドの位置が示されてい る。

図２０はヒトのゲノムＤＮＡを５ｓｔｌ、Ｈｉｎｄｌｌｌ及びＸｈｏｌ（−１０ μｇ／レーン）で消化したもののサザーンプロット分析を示す。プロットはヒト の腎臓のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターをコードしている完全長のｃＤＮＡとハ イブリッドを形成した。

図２１はＲ１５Ｂによってコードされているラットの骨のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレ セプターの細胞膜における配置提案の略図である。

材籾と方法 ３４））、　［Ｎ　ｌ　ｅ”１８．　Ｔ　ｙ　ｒ”’コ　ｂＰＴＨ（３−３４） アミド（ＰＴＨ（３−３４））及び［ＮＩ　ｅ”１８．Ｔｙ　ｒ”］　ｂＰＴＨ （７−３４）アミド（ＰＴＨ（７−３４））はＢａｃｈｅｍ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅ ｍｉｃａｌｓ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡから購入した；　［Ｔｙｒ”Ｇ］　ＰＴ ＨｒＰ　（１−３６）アミド（ＰＴＨｒＰ　（１−３６））は記ａ　（Ｋｅｕ　 ｔｍａｎ　ｅ　ｔ　ａ　１．、　ＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇＹ　１１７：１２３ ０，１９８５）されているように、Ａｐｐｌｆｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　５ ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ　４３０Ａを用いて合成した。ダルベツコ変法イーグル培 地（ＤＭＥＭ）　、ＥＤＴＡ／）リブシン及びゲンタマイシンはＧＩＢＣＯ（Ｃ ｉｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、ＮＹ）から、牛脂児血ンｎ　（ＦＢＳ）はＨ４ｃｒ ｏｎｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｌｏｇａｎ。

ＵＴから入手した。ヒト腎臓の総ＲＮＡはスエーデン、ウプサラ、大学病院のＰ ｅｒ　Ｈｅｌｌｍａｎｎ氏によって提供された。オリゴヌクレオチドブライマー はＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３８０Ｂ　ＤＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓ ｉｚｅｒを用いて合成した。制限酵素類、フレノウ酵素、Ｔ４ポリヌクレオチド キナーゼとＴ４ＤＮＡリガーゼは、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ。

Ｂｅｖｅｒｌｙ、　ＭＡから購入した。子牛アルカリホスファターゼは、Ｂｏｅ ｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ、　ドイツから購入した。すべての他の試薬 は入手ｉｉＪ能の最−純度のものであった。

細胞 使用された細胞には、ＣＯＳ細胞、ＯＫ細胞、５ａＯ５−２細胞、ＣＨＯ細胞、 ＡｔＴ２Ｏ細胞、ＬＬＣ−ＰＫＩ細胞及びＵＭＲ−１０６細胞が含まれ、Ａｍｅ ｒｉｃａｎｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｌ ａｎｄ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、受託番号、夫々、ＣＲＬ１６５０、ＣＲＬ６５５ １、ＨＴＢ８５、ＣＣＬ６１、ＣＣＬ８９、ＣＬＩＯＩ及びＣＲＬ１１６１を含 む種々の供給源から入手した。ＲＯ５１７／２及びＲＯ３１７／２．８はＧｉｄ ｅｏｎ　Ｒｏｄａｎ博士（Ｍｅｒｃｋ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ　 Ｐｏ１ｎｔ、　ＰＡ）を含むいくつかの供給源から入手した。ＭＣＭＣ−３Ｔ３ 胞はマウスの骨細胞から誘導されるが、滋野長平博士（医化学、医学部、京都大 学、京都、日本）を含む種々の供給源からも入手出来る。

すべての細胞は湿度９５％の空気、ＣＯ２５％を含む気相で培養され、牛胎児血 清ＣＭ、Ａ、　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｗａｌｋｅｒｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を５ ％、あるいは、１０％添加したハムＦ−１２培地、あるいはＤＭＥＭ培地（Ｇｒ ａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｏ、）で単層培養として維持 された。培地は３乃至４日ごとに交換され、細胞は２乃至３遍ごとに標準の方法 を用い、トリプシン処理によって継代培養された。

総ＲＮＡは、最初にラットの骨肉腫（ＲＯ３）細胞（ＲＯ３１７／２．８）とオ ボソサムの腎臓（ＯＫ）細胞から、グアニジンイソチオシアネートを用いる標準 法（Ｕｌｌｒｉｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　上９６：　１３１３゜１ ９７７；　Ｃｈｉｒｇｗｉｎ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙよっ て分離された。次いでポリＡ＋ＲＮＡ５　（ｍＲＮＡｓ）は、ＡｖｉｖとＬｅｄ ｅｒ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｆ、ＵＳＡ　６９：１４０８ ７、１９７２）の方法により、総ＲＮＡ５をオリゴｄＴカラム（Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ、Ｐｊｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）を通した後回収された。ＲＯ３１７／２ ．８　ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーは、ポリＡ＋ＲＮＡからＧｕｂｌｅ ｒとＨｏｆｆｍａｎ（Ｇｅｎｅ（Ａｍｓｔ、）　２５：　２６３．　１９８３） の方法を用いて作られた。オリゴｄＴをプライマーとする、及びランダムプライ マーをプライマーとするｃＤＮＡは、夫々、ポリＡ＋ＲＯ３１７／２゜８及びＯ Ｋ細胞のｍＲＮＡから合成された（ＡｖｉｖとＬ　ｅ　ｄ　ｅ　ｒ　＋前記）ｏ ｃＤＮＡはＢｓ　ｔＸ１リンカ−（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ 。

ＣＡ）に連結され、５−２０％の酢酸カリウム密度勾配遠心（３時＋＋８，５５ ．０００ｘｇ）によってサイズ選別が行われた。サイズ選別されたｃＤＮＡは、 次いで、非自己アニーリングＢｓ　ｔＸ１制限部位を用いてプラスミドベクター 、ｐｃＤＮＡＩ　（ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入された。その結果得られたプ ラスミドライブラリーは、次に、より大きなヘルパープラスミド、ｐ３を持つＥ 、ｃｏｌｉ　（ＭＣ１０６１／Ｐ３、Ｉｎｖ　ｉ　ｔ　ｒｏｇｅｎ）を形質転換 するのに用いられた。ｐ３プラスミドは、２つの遺伝子にアンバー変異を持ち、 アンピンリン及びテトラサイクリン耐性をコードしている。アンピシリン及びテ トラサイクリンを用いると、ｐ３とｐｃＤＮＡ　Ｉ内に含まれているｔＲＮＡサ プレッサー遺伝子の両方を持つ細胞のみが成長することが出来た。変異した細菌 は、次いで集密状態まで培養され、プラスミドｃＤＮＡは標苧技法（例えば、Ａ ｕ５ｅｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＢｉｏｌｏｇｙＳ　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　５ｏｎｓ、Ｎ ｅｗ　Ｙｏｒｋ。

１９８９をり照のこと）により分離された。これらＤＮＡは、次いでＤＥＡＥ− デキストラン溶液に取り込まれ、予め“サイドフラスコ゛　（Ｎｕｎｃ、デンマ ーク）中で７５％の集密度にまで培養されたアフリカミドリザルのＷｊＭ（Ｃ０ Ｓ）細胞に移入するのに用いられた。

ＲＯ８あるいはＯＫ細胞の機能的に完全な副甲状腺ホルモン／副甲状腺ホルモン 関連蛋白質（ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ）のレセプターを発現する能力のあるプラスミ ドを含むＣＯ５細胞のスクリーニングは、Ｇｅａｒｉｎｇらの方法（ＥＭＢＯＪ 、　８：　３６７６、１９８９）に従い、これにサイドフラスコ中でのＤＥＡＥ −デキストラン移入を含むいくらかの変法を加えて行った。移入して４８時間後 、細胞は既述の方法（Ｙａｍａｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｎｄｏｃｒ＊’Ａ 　［Ｔｙ　ｒ３６］　ＰＴＨｒＰ　（１−３６）アミドとの結合能を検査された 。洗浄後、細胞は１．２５％のゲルタールアルデヒドで固定され、１９６のゼラ チンで洗浄された。サイドフラスコの先を折った後、残りの顕微鏡用スライドを ＮＴＢ−２写真用乳ｉ＆（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、 ＮＹ）に浸した。４℃で３−４０間反応後、スライドは現像、固定され、モして ０．０３°０のトルエンブルーて染色された。各スライドのスクリーニングは光 学顕微鏡（オリンパス）下で行われた。ＲＯ３細胞からのプラスミド−ＤＮＡの １プール及びＯＫ細胞からのプラスミド−ＤＮＡの２プール、（１０，０００個 の独立クローン）から、夫々、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターを発現している３ −４個の移入されたＣＯ８細胞が得られた。これらのプールは後に再分割された 。サブブールはＣＯ５細胞に移入するのに用いられ、そして個々のクローンは、 放射性リガンドを結合することの出来るレセプター蛋白質を発現たことが確認さ れた。

ラムダＧＴＩＯ中のヒト腎臓のオリゴｄＴをプライマーとするｃＤＮＡライブラ ’Ｊ　−（１，７ｘ　１０Ｇ独立り０−ン）　及ヒＥＭＢＬ　３　（Ｓ　ｐ６／ Ｔ７）　（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　ＣＡ）中のヒト胎１Ｄ ＮＡのゲノムライブラリ−（２，５ｘｌＯ独立クローン）は、３２Ｐ　、識（ラ ンダムプライマーをプライマーとする標識キット、ベーリンガー、マンハイム、 ドイツ）されたＢａｍＨＩ／Ｎｏｔｌ　１．８ｋｂの制限酵素断片で、ラットの 骨のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターをコーディング配列の大部分をコードしてい るものとのプラークハイブリッド形成法（Ｓａｍｂｒｏｏｌｃ　ｅｔ　ａｌ、、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ ｌ、２版、１０８−１１３頁、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ、１９８９）によってスクリー ニングされた（図３）。ニトロセルロースフィルターは、５０％ホルムアミド、 ４ｘ食塩＜えん酸ナトリｆｙム（ＳＳＣ；　’ｘＳＳＣ：　３００ｍＭＮａＣ１ ，３０ｍＭ＜えん酸ナトリウム、ｐＨ７，０）、２Ｘデンハルト溶液、１０％硫 酸デキストラン、１００μｇ／ｍｌのサケ***ＤＮＡ　（最終ａ度）を含む前ハ イブリッド形成溶液中、４２℃で４時間インキュベートした。ハイブリッド形成 は、同し溶液中で４２℃で１８−２４時間行われた。フィルターは、２ｘＳＳＣ １０，１％ＳＤＳて室温で３０分間、次いで、１ｘＳＳＣ１０，１％ＳＤＳで４ ５℃で３０分間洗浄した。フィルムは、増強スクリーンを用い、−８０℃で１８ −２４時間、露出した。

各ライブラリーから、約百万個のクローンがスクリーニングされた。陽性のりロ ーンはプラーク法で精製され、ラムダファージＤＮＡが分離された（Ｓａｍｂｒ ｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、上記）。クローン化された挿入断片は、ファージＤＮＡ から、制限酵素エンドヌクレアーゼ　ＨｉｎｄｌｌおよびＥｃｏＲＩ　（ラムダ ＧＴＩＯライブラリー）、あるいはＸｂＯＩおよびＳｓ　ｔ　Ｉ　（ＥＭＢＬ３ ライブラリー）を用いて取り出され、次いで適当な脱リン酸化された制限酵素部 位をヨン　２　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　キット、Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ｃ１ｅａｖｅｌａｎｄ。

ＯＨ）によって行われた。

℃て３分間：４０サイクル）を含む最終容量１００μｌの中で増幅された。

２つの独立したＰＣＲは、以下の２つの異なった正方向のプライマーを用いて行 われた：１）２つの以前にクローン化されたＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプター（上 述）コーディング末端に基づく変性プライマーＰＫ−１（５”−ＧＧＡＡＴＴＣ ＣＡＴＧＧＧＡＧＣＧＧＣＣＣＧＧＡＴ−３’；　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、：１５ ）、及び、ｌｌ）ヒトゲノムクローンＨＰＧＩの５゛−非コーディング領域に基 づくブライｖ−ＰＫ−２（５−−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＣＧＧＣＣＣＴＡＧＧＣ ＧＧＴ−３−；　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、：　１６）、両ＰＣＲ反応ハヒトのＰＴ Ｈ／ＰＴＨｒＰレセプターのコーディングｅｌｉ域の７１３−７３１＃目のヌク レオチドを現す逆ブライ７−Ｈ２６（５−−ＡＧＴＡＴＡＧＣＧＴＣＣＴＴＧＡ ＣＧＡ−３−）を用いた（図４）。ＰＣＲの生成物はクレノー酵素により末端を 平滑にされ、ＥｃｏＲＶて切断されて、脱リン酸されたｐ　ｃ　ＤＮＡ　Ｉにク ローン化された。

ノーザンブロノト分析、総ＲＮＡ１′！５ａＯ５−２細胞及びヒト腎臓がらグア ニジウムチオシアネート法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ 。

１８：５２９４．　１９７９）によって抽出された。ノーザンプロット分析のた め、〜１０μｇの総ＲＮＡが１．５％／３７％ホルムアルデヒドゲル上での電気 泳動にかけられ、ニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ Ｓｃｈｕｅ　ｌ　ｌ、　Ｋｅｅｎｅ、　ＮＨ）にプロットされた。ハイブリッド 形成条件はファージライブラリースクリーニングの条件と同しであった（上を見 よ）。

フィルターは、０，５ｘＳＳＣ１０，１９６ＳＤＳの最終洗浄条件で３０分間、 ６０℃で洗浄し、オートラジオグラフィーのために露出した。

サザンブロソト分析：ヒトゲノムＤＮＡはＳＤＳ／プロテイナーゼに法（Ｇｒｏ ｓｓ−Ｂｅｌｌａｒｄ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、 　３６：３２、１９７３）を用いて生成された。サザーン分析のため、〜１０μ ｇのＤＮＡがＳｓｔ　Ｉ、Ｐｖｕｌ　Ｉ及びＸｈｏＩによって消化され、０．８ ％アガロースゲル上の電気泳動にかけられ、ニトロセルロースＭ（Ｓｃｈｌｅｉ ｃｈｅｒａｎｄ　５ｃｈｕ　ｌ　ｌ、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ）にプロットされた。ハ イブリッド形成条件はファージライブラリースクリーニングの条件と同じであっ た（上を見よ）。フィルターは、０．５ｘＳＳＣ１０，１％ＳＤＳの最終洗浄条 件で３０分間、５５℃で洗浄し、オートラジオグラフィーのために露出した。

機能う丹斤 ＣＯ８細胞に発現されたクローン化レセプターの機能的諸性質を特徴づける試験 には以下のものが含まれた。

１）ＰＴＨとＰＴＨｒＰの断ハ及び類似体の結合、１１）ＰＴＨとＰＴＨｒＰの 断片及び類似体によるす・ｒクリックＡＭＰ蓄積の刺激、 ＩＩＩ）ＰＴＨとＰＴＨｒＰの断片及び類似体による細胞内の遊離カルシウムの 増大、及び ＩＶ）ＰＴＨとＰＴＨｒＰの断片及び類似体によるイノシトールリン酸代謝の活 性化。ノｊ法論は次の通りである ＴＨ）及び［Ｔｙ　ｒ３６］　ＰＴＨｒＰ　（１−３６）アミド（ＰＴＨｒＰ） はＮａ　１２５１　（ｔＱ体なし、Ｎｅｗｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、　 Ｂｏｓｔ。

ｎ、ＭＡ）により既報（Ｓｅｇｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ 、　２５４：６９８０．　１９７９）に従ってヨード化され、逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃ １，：よって精製された。簡略に述べると、標識されたペプチドは０．１％のト リフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に溶かされ、Ｃ，８Ｓｅｐ−ｐａｋカートリッジ（Ｗ ａｔｅｒｓ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）に かけられ、０．１％ＴＦＡ中６０９中子０９６アセトニトリル溶液溶出された。

凍結乾燥後、ラジオリガンドは、次いで、Ｃ，８−μＢｏｎｄａｐａｌｃカラム （３，９ｍｍｘ３０ｃｍｏＷａｔｅｒｓ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ）にかけられ、 ０．　１９６ＴＦＡ１１＋３Ｃ１−５０％のアセトニトリルの直線占８度勾配を 用い、２ｍｌ／分の流速で３０分かけて溶出した。ラジオリガンドは、２つのピ ークに別れて溶出した：最初のピークは約３８％のアセトニトリルのところで溶 出し、より高い総結合と特異的結合を示したので、この研究に用いられた。比活 性は５００±７５ｍＣ１／ｍｇで、これは平均のヨード−ペプチド比１に相当す る。

ＣＯ５−７細胞は１５ｃｍのプレートで、ＤＭＥＭ、１０％の熱不活性化ＦＢ３ １１０ｍｇ／Ｌゲンタマイシン中、８０−９０％の密集度まで培養された。ＤＥ ＡＥ／デキストラン法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、上記）により１−２ μｇのプラスミドＤＮＡを移入した２４時＋１４Ｊ後、細胞をトリプシン処理し 、多穴プラスチック皿（直径１６あるいは３５ｍｍ、　Ｃｏ　ｓ　ｔ　ａ　ｒ、 Ｃａｍｂ　ｒ　ｉｄｇｅ、ＭＡ）に、細胞濃度５ｘ１０　細胞／ｃｍ”で再配分 した。細胞数は移入後わずかに増加したのみであった。更に培養を４８時間続け た後、ラジオレセプターアッセイが行われた。培養培地は、研究開始直前、５０ ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７，７）　、１００ｍＭＮａＣ＋、　２ｍＭＣａＣＩ２ ．５ｍＭＫＣ＋、０゜５９６熱変性牛１ｍ児血清（ＣＩ　ＣＢＯ）　、５％熱変 性ウつ血ｔｉｖ（ＫＣＢｉｏｌ。

ｇｉｃａｌ　Ｉｎｃ、、　Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）を含む緩衝液と交換された。

特に指示のない限り、研究は、細胞をこの緩衝液中、１５℃、４時間、４ｘ１０ ５ｃｐｍ／ｍｌ　（９，６ｘｌＯＭ）の１２５、−標識のＮ　Ｉ　ｅ　ＰＴＨあ るいはＰＴＨｒＰとインキュベートして行われた。

インキュベーションは、緩衝液を吸引除去し、粘着性細胞を含む培養皿を０゜９ ％ＮａＣ１溶液で繰り返しく３回）、１５秒間にわたって洗浄することによって 終焉させた。細胞に結合した放射能は、各ウェルに連続（３回）ＩＮＮａＯＨ（ ２００μｌ）を加えることによって回収された。室温で３０分後、このＮａＯＨ はガラス管に移された。二回目、三回目のｌＮＮａＯＨ（２００μｌ）による抽 出を、−回目のものと合わせ、総放射能はγ−スペクトロメター（Ｐａｃｋａｒ ｄ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｄｏｗｎｅｒｓ　Ｇｒｏｖｅ、　ＩＬ）でａｌ 定された。細胞を含まぬ培養皿へのトレイサーの付着は、たとえ容器が培養培地 とブレインキュベーションされても、無視出来る程度であった（加えられた総カ ウントの０．２％以下）。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６２：１１２９．　１９８６）のようにして測定された 。

２４穴プレート内の細胞を０．１％ＢＳＡと２ｍＭＩＢＭＸを含む培地で洗浄し た。次いで、細胞はＰＴＨまたはＰＴＨｒＰと１５分間、３７℃でインキュベー トした。上清を除き、細胞は直ちにプレート全体をドライアイス粉末中に置くこ とによって凍結した。細胞内ｃＡＭＰは１ｍｌの５０ｍＭＨＣｌ中で細胞を融か すことによって抽出され、抗ｃ　Ａ　Ｍ　Ｐ抗体（例、Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、Ｌ ｏｕｉｓ、　ＭＯ）を用い、特異的ラジオイムノアッセイによって分析された。

ｃＡＭＰの代オっりにトレーサーとして用いられたｃＡＭＰ類似体（２−−０− モノサクシニルーアデノンン３−：５”−サイクリックモノリン酸トシルメチル エステル、Ｓ　ｉ　ｇｍａより購入）は、クロラミンＴ法によりヨウ素化された 。遊離のヨウ素は、ヨウ素化されたｃＡＭＰ類似体をＣｌ８Ｓｅｐ−ｐａｋカー トリッジ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉ　１ｆｏｒｄ、ＭＡ）に吸着することによって除 去した。

溶出された。ヨウ化ｃ　Ａ　Ｍ　Ｐ類似体は凍結乾燥され、１ｍｌの０．　１％ ＴＦＡにもどし、Ｃ１８逆相ＦＰＬＣカラム（Ｗａ　ｔ　ｅ　ｒ　ｓ）に注入さ れた。カラムを０゜１０％ＡＣＮの１％ＴＦＡ溶液で平衡化し、０．１９６ＴＦ Ａ中、１０−３０％ＡＣＮの密度勾配で溶出した。この操作によりモノヨウ化ｃ ＡＭＰ類似体を、非ヨウ化ｃＡＭＰ類似体から分離することが可能となる。トレ ーサーは一２０℃で保存する時は、４ケ月までは安定である。アッセイに用いら れた標準品、アデノシン３’、５−りん酸はＳ　ｉ　ｇｍａから購入した。試料 （１−１０μｌのＨＣＩ抽出液）あるいは標準品（０，０４−０４−１Ｏ０ｆ／ チユーブ）を５０ｍ１ｖｆ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，５）で希釈し、トリエチル アミンと無水酢酸の混合物（容量比　２：１）１０μｌてアセチル化した。アセ チル化後、ｃＡＭＰ抗血清を、ＰＢＳ　（ｐＨ７，４）　、５ｍＭＥＤＴＡ及び １％正常ウサギ血清中に作られた原液（１：４０００）から加えた。トレーサー は、０．　１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７，４）で希釈して加えられた（２０ ．ＯＯＯｃｐｍ／チューブ）。アッセイは４℃で一晩インキユベートした。結合 したトレーサーは１００μｍのヤギの抗ウサギ抗血清（１２０、Ｐ　Ｂ　Ｓ　ｒ ｌｌ）及び１ｍｌの７％ポリエチレングリコール（分子量５０００−６０００） を加えて沈殿させ、２００Ｏｒｐｍで３０分間、４℃で遠心した。上清を除き、 結合した放射能をγ−カウンター（Ｍｉｃｒｏｍｅｄｉｃ）で測定した。標準曲 線はＭｉｃｒｏｍｅｄｉｃがら提供された４−パラメーターＲＩＡプログラムを 用いて算定した。典型的な例では、アッセイ感度は０．ｌｆｍｏｌ／チューブで 、トレーサーの５０％を置換する標準濃度は５ｆｍｏｌ／チューブである。

ｃＡＭＰ蓄積をアッセイする別法では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターｃＤＮＡ を移入されたＣｏｓ細胞は、プラスチックポリスマンによって、１ｏｍＭトリス ー塩酸（ｐＨ７，５）　、０．２ｍＭＭｇＣＬ　０．　５ｍＭ１＋レン’ｊ’Ｊ コールビス（２−アミノエチル）Ｎ、Ｎ−一四酢酸（ＥＧＴＡ）（Ｓ　ｉ　ｇｍ ａ）と１ｍＭジチオトレイトール（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）を含む溶液中に集められる 。細胞は緊密に合ったダウンスホモジエナイザーの２０ストロークでポモジエナ イズし、１３．０００ｘｇて１５分間４℃で遠心する（Ｅｐｐｅｎｄｏｒ（、５ ４１２型。

Ｂｒｔｎｋｍａｎｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｉｎｃ、、Ｗｅｓｔｂｕｒｇ ＋　ＮＹ）。原形質膜を含むベレットはダウンスホモジェナイザーて数ストロー クにより同じ緩衝液に再度懸濁し、更に同緩衝液で希釈して蛋白￥ｊ′ａ度を、 Ｌｏｗｒｙらの方法（Ｌｏｗｒｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

より３：　２６５．　１９５１）でａｌ定して約１．２ｍｇ／ｍｌとする。約３ ０μｇ（２５μＩ）の膜を、種々の濃度のホルモン、または媒体のみと１ｏ分間 、３７℃（最終容量、１００μｌ）　で、５０ｍＭＭＪスー塩酸（ｐＨ７，５） 　、０゜８ｍＭＡＴＰ、４ｘｌＯｃｐｍ［（２−３２Ｐ］ＡＴＰ（Ｎｅｗ　Ｅｎ ｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ、　Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）、９ｍＭテオフィリン、４ ．２ｍＭＭｇＣ１２６ｍＭＫＣｌ、０．１２９６ＢＳＡ、及び５ｍＭクレ７チン リ／ｕ酸２　ゝ （Ｓｃｈｗａｒｔｚ／Ｍａｎｎ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、　Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋ ｅｎｓｅｎ　＆　Ｃｏ、、Ｏｒａｎｇｅｂｕｒｇ、　ＮＹ）とタレアチンホスホ キナーゼ（Ｓ　ｃ　ｈｗａ　ｒ　ｔ　ｓ／Ｍａ　ｎ　ｎ）を含むＡＴＰ再生系と インキュベートする。インキュベーションは、膜懸濁液を加えることによって開 始され、１゜Ｏμｌの２０ｍＭｃＡＭＰ、約５０，０００ｃｍｐの［３Ｈ］　ｃ ＡＭＰと８０ｍＭＡＴＰを含む溶液を加えることによって終了させる。反応混合 物を煮沸し、生成された［３２Ｐ］　ｃＡＭＰはイオン交換カラム（Ｄｏｗｅｘ 　５０　Ｗ−Ｘ４゜Ｂｉｏｒａｄ　Ｌａｂ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）とア ルミナ（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）上の連続カラムクロマトグラフィーによって精製され る。［３２Ｐ］　ｃＡＭＰはβ−シンチレーションカウンターＣＰａｃｋａｒｄ 　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｃｏ。

）で、［””ＰコｃＡＭＰの回収に対する補正をしてａｐｊ定される。

細胞内遊離カルシウムのＪ＋定 ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターｃＤＮＡを移入された細胞の細胞内カルシウムレ ベルの測定は、Ｆｕｒａ−２ＡＭ（Ｆｕｒａ−２のアセトメトキシエステル、Ｍ ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ　Ｉｎｃ、、　Ｅｕｇｅｎｅ、　ＯＲ）を負荷 した細胞を用いて行われた。方法論の詳細は以下の通りである：ＣＯ５細胞を塗 布したカバーガラスを、Ｆｕｒａ−２ＡＭを負荷し、以下のものを含む（ｍＭ濃 度）緩衝液中でインキュベートした：ＨＥＰＥＳ　（Ｎ−１２−ヒドロキシエチ ルコ　ピベラノン−Ｎ−−［２−エタンスルポン酸］）、２υ。

Ｃａ　ＣＩ　２．１　；　ｋＣｌ、５　；　ＮａＣＩ、　１４５　；　Ｍｇ５ｏ ４．０．５　；ＮａＨＣＯ３，２５；　Ｋ２ＨＰＯ４，１，４；　グル：７−ス 、１０；およびＦｕｒａ−２ＡＭ（１−（２（５−一カルボキシオキサゾールー ２゛−イル）−６−アミツヘンゾフランー５−オキシ］　−２−（２−−アミノ −５′−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ、　Ｎ、　Ｎ−、Ｎ−一四酢酸ペンタア セトキシメチルエスｆル）、０．５　；　３７℃でｐＨ７，４，９５％空気と５ ９６　ＣＯ２とを４５分間通した。Ｆｕｒａ−２ＡＭを負？；ｊした細胞は、次 いて、以下のものを含む（ｍＮ１濃度で）修正クレブス・ヘンゼライト（ＫＨ） 緩衝液で洗浄した：　ＨＥＰＥＳ、２０；　ＣａＣｌ２．　１；　ＫＣＩ、　５ ；　ＮａＣｌ、　１４５；Ｍｇ５ｏ　Ｏ，５；　Ｎａ　ＨＰＯ１；　グルコース 、５；ｐＨ７゜４ゝ　２　４′ ４゜エステルの開裂か起きたことをチェックするために、Ｆｕｒａ−２ＡＭイン キュベーション後、時間を変えて励起スペクトルを測定した。インキュベーショ ン開始後５分て、励起スペクトルは約３６０ｎｍにピークがあり、Ｆｕｒａ−２ ＡＭの不完全な加水分解を反映していたが、３０分を越えると、励起スペクトル はＦｕｒａ−２の特徴である約３４５ｎｍにピークがあった。

個々の細胞の蛍光を１ｌＦＩ定するために、カバーガラスを顕微鏡の組織チャン バー（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ、、ＭＤ）に 置いた。チャンバーは、シリコンラバーシールを持つテフロン製の浅い、傾斜の ついたコンパートメントがらなっていた。カバーガラスはチャンバーの底の役割 をした。カバーガラスを所定の場所に密着させるシリコンラバーには、ヒーター ／クーラーリングか封し込められていた。温度はヒーターに０−７．４ボルトを 加えることによって、２２℃〜３７℃の間で変動させた。温度を特定しない限り 、実験は３７℃で施行された。チャンバーは倒立顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ　ＩＭ−３ ５゜Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、　ＮＹ）の載物台に載せた。Ｆｕｒａ−２の蛍光のた めに、コンデンサー（Ｐｈｏｔｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｔｅｎａ ｔｉ。

ｎａ　ｌ　（ＰＴＩ）　Ｉｎｃ、、　ＮＪ）の焦点におがれた７５ワットのキセ ノンアーク灯で励起された。ｖｌ、仮が透過光分割器と交番する回転チョッパー によって交番される回折格子単色光分光器が、波長選定に使用された。単色光分 光器の出力は結集されて一本の共通の光路を形成し、調節可能な虹彩を通して発 光■スのハウジングを励起した。次いて、光は石英レンズを、そして１００倍の ニコン蛍光対物レンズを通して二色性の鏡を通過した。光量子計算ＰＭＴ装置に よる検出が光の出力測定に使用された。データの分析は、ＭＳ−ＤＯ５操作系を 用いるＩＢＮ１互換性ＡＴ／２８６コンピユータにＰＴＩソフトウェアを使用し て行った。データは圧縮二者択一性形式に保存、操作された。

細胞内のカルシウム濃度は次式に従って計算された＝　［Ｃａ２“］ｉ−Ｋｄ（ Ｒ−Ｒｍｉ　ｎ）／　（Ｒｍａｘ−Ｒ）Ｂ、、ここで、Ｒは３４０と３８０ｎｍ における細胞の蛍光の比てあり；ＲｍａｘとＲｍｉｎは、夫々、飽和量のカルシ ウムと実際上ゼロのカルシウムの存在下の、Ｆｕｒａ　２の３４０と３８０ｎｍ 励起波長における蛍光強度の比てあり、Ｂは３８０ｎｍにおけるゼロカルシウム 存在下のＦｕｒａ−２の蛍光の、飽和量のカルシウム存在下の蛍光に対する比で あり。

Ｋｄ１４Ｆ　ｕ　ｒ　ａ−２のカルシウムに対する解離常数である。Ｒｍａｘを 測定するために、実験の終末にイオノマイシンをＦｕｒｓ−２を負荷した細胞に 加えて細胞外（１ｍＭ）と細胞内環境の間のＣａ２＋を平衡化した。次いで、Ｒ ｍｉｎを計算するために、１ｒｎＭのＥＧＴＡを細胞浸液に加えた。異なった温 度では異なった解は常数が用いられた：　３４−３７℃においては２２４ｎＭ、 及び２４−２７℃においては１３５ｎＭである。

イノシトールりん酸の測定 ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターを移入されたＣＯ８細胞におけるイノシトールり ん酸の代謝レベルは既報の方法を用いてｈ１定された（Ｂｏｎｖｅｎｔｒｅ　ｅ ｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６５：　４９３４．　１９９０） 。

２つの別個のクローン（ＯＫ　−Ｈ及びＯＫ　−０）は、ともにＯＫ細胞のｃＤ ＮＡライブラリーから分離されたが、およそ２キロベースの長さを持っていた。

これらのクローンの決定されたヌクレオチド配列と予想されるアミノ酸配列は、 夫々、図１（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、：１）及び図２（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、：２ ）に示されている。ＲＯ８細胞のｃＤＮＡライブラリーから分離されたＲ１５Ｂ クローンは、およそ４キロベースの長さてあった。ラットの間のＰＴＨ／ＰＴＨ ｒＰレセプターの決定されたヌクレオチド配列と予想されるアミノ酸配列は図３ （ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、：３）に示されている。

３つのｃＤＮＡクローンは、イニンエーターメチオニンとして有望な候補者と予 想されるメチオニン残基をコードしているコドンを持つという範鴫によって完全 な長さのものと思われる。これらメチオニンコドンの後ろには、“シグナルペプ チド“配列であることを示唆する性質を持つアミノ酸配列（ＤＮＡから演鐸して ）が続く。３つのレセプターｃＤＮＡはすべて、Ｇ−ｆｆｌ白質関連のレセプタ ーに典型的なモデル、推定の７回−置換モデルへの“適合”を可能にする位置に 終止コドンをＦ、＋７つ。最も重要なことは、３つのクローン化されたレセプタ ーが、すべて、リガンドと結合して活性化された時、細胞内のエフェクターを活 性化する能力を有することである。これらの諸性質は、分離された３つのクロー ンすべてが、宛仝艮のｃＤＮＡをエンコードすることを示唆する。

図４は、０Ｋ−０及びＲＯ３１５ＢからのｃＤＮＡによってコードされているア ミノ酸配列間の高度の相同性を示す。これら２つのレセプター間には、仝体て８ ７９ｂの相同性かあり、７７．８％のアミノ酸の一致がある。このアミノ酸の長 い範囲にわたっての高度の一致は、ＰＴＨレセプターのアミノ酸配列が進化の上 で高度に保持されていることを証明している。これは、０Ｋ−０とＲ１５Ｂ両者 からのデータをヒトを含む他の動物種に外挿することを可能にする。

図５は、３つのクローン化されたｃＤＮＡすべでの推定アミノ酸配列を配列相同 性に従って一線に整列させたものである。０Ｋ−Ｈ配列は０Ｋ−０とＣ−末端尾 部を除き同一である。ここで０Ｋ−０配列は全部で５８５アミノ酸残基を持つが 、０Ｋ−Ｈ配列は５］５アミノ酸で止まっている。これは、０Ｋ−０配列と比べ て０Ｋ−Ｈ配列に欠けているただ１個のヌクレオチド（Ｇ）に起因し、旧名にお けるフレームシフトと早期の終止コドンの原因となっている。ＯＫ−〇と０Ｋ− Ｈが２つの別個の遺伝子の産物か、あるいは実験室の人為産物かは不明である。

Ｇ蛋白質に共役したレセプターのいくつかは、イントロン無しの遺伝子によって コードされている（Ｋｏｂｉｌｋａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３２９ニ ア５、１９８７；　Ｋｏｂｉｌｋａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ 、　２６２ニア３２１．　１９８７；　Ｈｅｃｋｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１ ．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、、　６：７０．　１９９２；　Ｋｏｂｉｌｋａｅｔ 　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３８：６５０．　１９８７；　Ｂｏｎｎｅｒ　 ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３７＋５２７．　１９８７；　５ｕｎａｈ ａｒａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３４７：８０．　１９９０）。

ヒトのＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターｃＤＮＡを単離するために、ヒトゲノムラ イブラリーとヒトゲノムライブラリーの両者を、ラットの骨のＰＴＨ／ＰＴＨｒ Ｐレセプターのコーディング領域の大部分を代表するプローブ（ＢａｍＨＩ／Ｎ ｏｔｌ）を用いてスクリーニングした（図３）。ヒト腎臓のｃＤＮＡライブラリ ーのスクリーニングの結果、クローンＨＫ−１が分離されるに至った（図６）［ ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、：６］。ラムダＧＴＩＯの２つのＥｃｏＲＩクローニング サイトの１つが、ライブラリー構成の結果、除去されたことが判明したので、ｃ ＤＮＡ挿入断片及び３７ｋｂ　（左）ラムダアームの〜２５０ｂｐを含むＨｉｎ ｄｌｌｌ／ＥｃｏＲＩファージ断片をｐ　ｃ　ＤＮＡ　Ｉの相当する制限部位に サブクローニングした。ＤＮＡ配列決定の結果、クローン化されたｃＤＮＡは、 ３′コーデイング領域の〜ｘｏｏｏｂｐと、への多い３−一末端を含む３゛非コ ーデイングｎＲ＋Ａの〜２００ｂｐを含むことが判明した。Ｘｈｏ１部位に対す る５゛側コーデイング領域は、次いでライブラリーを再スクリーニングするのに 使用され、クローンＨＫ−２の分離を導いたが、これは、ｐ　ｃ　ＤＮＡ　Ｉへ のサブスクリーニング後、コーディング領域の〜１４００ｂｐを含むことが判明 した。ライブラリーの第三のスクリーニングに対しては、ＨＫ−２のＰｖｕｌｌ ／Ｐｓｔｌが用いられた−　分離されたクローンＨＫ−３はＨＫ−２と同一であ ることが判明した。

ゲノムライブラリーのスクリーニング（〜１０６　ｐｆｕ）の結果、４つの独立 したクローンが分離された。これらのクローンの制限酵素消化断片のサザーンブ ロノト分析を正常ゲノムＤＮＡのそれとの比較した結果、１つの１５ｋｂのゲノ ムクローン、ＨＰＧＩ　（また、ＨＧＪＡとも呼ばれる）は、５ｓｔｌで消化さ れた正常のヒトゲノムＤＮＡからの、ハイブリッドを形成するＤＮＡＦｌと同し サイズの５ｓｔｌ／５ｓｔｌ断片を含むことが判明した（下記参照）。５ｓｔｌ ／５ｓｔｌ断片を構成するハイブリッドを形成する２、３ｋｂの５ｓｔｌ／５ｓ ｔＩＤＮＡ断片と、〜８ｋｂＸｈｏｌ断片は、共にｐｃＤＮＡＩにサブクローニ ングされｔ：。さらにＳ　ｓ　ｔ　Ｉ／Ｓ　ｓ　ｔ　ｌＤＮＡ断片のサザーンブ ロ・ット分析の結果、ある−１０００ｂｐのＢ　ａｍＨＩ／Ｓ　ｓ　ｔ　Ｉ断片 がヒトのＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターの一部をコードしており、これが、後に 、推定のシグナルペプチドと〜１ｏｏｏｂｐのイントロンによって中断されてい る５゛−非コーディング領域をコートしているエキソンを代表していることが判 明した（図７）。

コーディング領域の残る〜４５０ヌクレオチドを分離するために、ヒト腎臓から のポリ（Ａ）＋ＲＮＡを１１１２でブライミングの後、逆転写した（図７）。１ 本鎖合成後、２つの独立したＰＣＲを以下の２つの別個の正方向プライマーを用 いて行った　１）２つの以前にクローン化されたＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプター 、ＯＫ−〇とＲ１５Ｂの５゛−コーディング末端に基づく変性プライマーＲＫ− １，及び、ｉ　１）ＨＰＧＩの５′−升コーディング領域に括づくプライマーＲ Ｋ−２である。Ｈ−２６が両反応の逆プライマーとして用いられた。サザーンプ ロットおよび制限地図分析によって、ヒトのＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターをコ ードしている増幅されたＤＮＡの予想されたサイズが確認された。ヒトのＰ　Ｔ 　Ｈ／ＰＴＨｒＰの５゛−末端をコードしている平滑末端のＰＣＲ生成物は、脱 リン酸されたＥｃｏＲＶ部位を用いてｐ　ｃ　ＤＮＡ　Ｉにクローン化された。

各ＰＣＲクローンの配列分析によって、それらの５′ヌクレオチドの違いは正方 向プライマーの配列の違いによることが確認されたが、それ以外は同一の配列で あることが明らかとなった。ヒトのＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターｃＤＮＡの両 鏡のヌクレオチド配列決定により、５９３アミノ酸残Ｕを持つ蛋白質をコードし ている開放読取り枠が明らかとなった（図６、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、：４）。

完全長のヒト腎臓のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターｃＤＮＡ、ＨＫｒｋは、ＰＣ Ｒクローン＃２とＨＫ−２のＢａｍＨＩ／Ｐｖｕｌｌ断片を用いて構成された。

ヒトのＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターをコードしている完全長のｃＤＮＡを用い て、ヒト腎臓と５ａＯ３−２細胞からの総ＲＮＡ　（〜１０μｇ／レーン）のノ ーザンプロット分析の結果、〜２．５ｋｂの１つの主要なハイブリッドを形成す るＤＮＡ１ｉが明かにされた（図１９）。正常のヒトゲノムＤＮＡのＸｈｏｌ消 化物は、同じ完全長のｃＤＮＡ（図２０）でプローブされると、１つの主要な約 ５゜５ｋｂのハイブリッドを形成する種と、弱くノルイブリッドを形成する４と ８ｋｂの２つのＤＮＡＰＩが現れた。これらのデータは、ヒトのＰＴＨ／ＰＴＨ ｒＰレセプターが単一の遺伝子の産物であることを示唆している。完全長のクロ ーンは、次いて、機能的及び生物学的諸性質検討のため、上述の方法によりＣＯ ３細胞に一過性に発現された。

ヒトのレセプターのオソポサム腎臓のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプター及びラット 骨のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターとの比較により、夫々、８１％と９１％のア ミノ酸配列の同一性が明らかになり、結果として非常に類似した疎水性プロット を示した（図８）。すべての細胞外システィンは、推定シグナルペプチドにおけ る２つのンステイン残基を含めて、すべての可能性のある細胞外のＮ−グルコン ル化部位のように、保存されている。ヒトの腎臓とう・ノドの骨のＰＴＨ／ＰＴ ＨｒＰの間で同一でないアミノ酸のいくつかは、ヒトとオボツサムのレセプター の間では保存されていることが判明した。これらの保存されているアミノ酸残基 は、５１位のＡｒｇからＬｅｕ、５８位のＡｒｇからＴｒｐ、２６２位のＡｒｇ からＨｉｓ、３５８位のＡｓｐからＨｉｓ、４２２位の目ｅからＴｈ　ｒ、及び 、４２７位のＴｈｒからＬｅｕである。

生物学的諸性質の検討 オボノサムとラットのＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターの生物学的性質の機能的特 性の検討は一過性に移入されたＣＯ８細胞において、放射性リガンドとして１２ ５１−ＰＴＨｒ　Ｐと１２５１−Ｎ　ｌ　ｅ　ＰＴＨの両方を用いるラヂオレセ ブターアッセイ法により、また、リガンドによるｃＡＭＰの蓄積、細胞内遊離カ ルシウムの増加、及びイノシトールりん酸代謝の促進を測定するバイオアッセイ により、上記の方法によって行われた。

図９は０Ｋ−Ｈを発現しているＣＯ８細胞が、１２５１−ＰＴＨｒＰを結合する ことを示している。これらのデータは、また、無傷のＰＴＨ（１−３４）　、ま たはアミノ末端で短縮されている（即ち、３−３４及び７−３４類似体、これら は８泣と１８泣にメチオニンの代わりにＮ１ｅｉｆ換を、そして３４位のフェニ ルアラニンの代わりにチロシン置換を持っている）ＰＴＨ類似体が結合の競合阻 害剤として用いられた場合、ＰＴＨｒＰの結合が阻害されることを示している。

同様に、０Ｋ−Ｈを発現しているｃｏｓ細胞への１２５１−Ｎ　ｌ　ｅ　ＰＴＨ の結合は、ＰＴＨｒＰあるいはＰＴＨｒＰ断片が競合阻害剤として用いられた時 、阻害された。

これらのデータは、ＰＴＨとＰＴＨｒＰは共に０Ｋ−Ｈによってコードされてい るレセプターに結合することを示唆している。

図１０は、ＯＫ　−Ｈを発現しているＣＯ８細胞が、Ｎ１ｅＰＴＨに暴露される と細胞内のＪ１２ｍ力ルンカルシウムを増大するが、ＯＫ　−０あるいはＲ１５ Ｂレセプターを発現しく図１２と図１４）　、Ｎ　Ｉ　ｅＰＴＨで刺激されてい るＣＯ８細胞と比べると、増加はｆｆｆ［が低いか（平均−３９ｎｍ）、あるい は全く無いことを示している。０Ｋ−０あるいはＲ１，５Ｂを発現しているＣＯ ８細胞とは異なり、０Ｋ−Ｈを発現しているＣＯ８細胞はＮ１ｅＰＴＨで刺激さ れた時、イノシトールりん酸の代謝の増加は検出されない（図１５）。

図１１は０Ｋ−Ｏを発現しているｃｏｓ細胞か、１２５１−ＰＴＨｒＰを結合す ることを示している。これらのデータは、また、ＰＴＨｒＰの結合が、無傷のＰ ＴＨ（１−３４）　、またはアミノ末端で短縮されている（即ち、３−３４及び ７−３４類似体、これらは８位と１８位にメチオニンの代わりにＮｌｅ置換を、 そして３４位にフェニルアラニンの代わりにチロシン置換を持つ）ＰＴＨ類似体 が結合の競合阻害剤として用いられた場合、阻害されることを示している。同様 に、ＯＫ　−Ｈを発現しているｃｏｓ細胞への１２５１−Ｎ　ｌ　ｅ　ＰＴＨの 結合は、Ｉ’ＴＨｒＰあるいはＰＴＨｒＰ断片が競合阻害剤として用いられた時 、阻害された。これらのデータは、ＰＴＨとＰＴＨｒＰが共に０Ｋ−０によって コードされているレセプターに結合することを示唆している。

図１２は０Ｋ−０を発現しているＣＯＳ細胞が、ＮＩ　ｅＰＴＨとＰＴＨｒＰに よる刺激後、細胞内の遊離カルシウム濃度及びイノシトールりん酸の代謝速度を 増大することを示している（図１５）。

図１３はＲ１５Ｂを発現しているｃｏｓ細胞が、１２５Ｉ−ＰＴＨｒＰを結合す ることを示している。これらのデータは、また、ＰＴＨｒＰの結合が、無傷のＰ ＴＨ（１−３４）　、またはアミノ末端で短縮されている（即ち、３−３４及び ７−３４類似体、これらは８位と１８位にメチオニンの代わりにＮｌｅ置換を、 そして３４位にフェニルアラニンの代わりにチロシン置換を持つ）ＰＴＨ類似体 が結合の競合阻害剤として用いられた場合、阻害されることを示している。同様 に、ＯＫ　−Ｈを発現しているｃｏｓ細胞への１２５１−Ｎ　ｌ　ｅ　ＰＴＨの 結合は、ＰＴＨｒＰあるいはＰＴＨｒＰ断ハが競合阻害剤として用いられた時、 阻害された。これらのデータは、ＰＴＨとＰＴＨｒＰが共にＲ１５Ｂによってコ ードされているレセプターに結合することを示唆している。

図１４は、Ｒ１５Ｂを発現しているＣＯ８細胞が、０Ｋ−０を発現しているＣＯ ５細胞が刺激された場合と同程度に細胞内カルシウム濃度を増大することを示し ている。

図１５は、Ｒ１５Ｂあるいは０Ｋ−０を発現しているＣＯＳ細胞が、Ｎ　ｌ　ｅ 　ＰＴＨあるいはＰＴＨｒＰによる細胞の刺激後、イノシトール三りん酸（ＩＦ ５）とイノシトール三りん酸（ＩＦ５）蓄積の急速な増加によって証明されるよ うに、フォスファチジルイノシトールの加水分解速度を増大することを示してい る。逆に、０Ｋ−Ｈを発現しているＣＯＳ細胞は、Ｎ１ｅＰＴＨ，あるいはＰＴ ＨｒＰによる刺激後も、イノシトール三りん酸とイノシトール三りん酸の蓄積に いかなる増加も検出出来なかった。これらのデータは、Ｒ１５Ｂと０Ｋ−０によ ってコードされているＰＴＨレセプターはホスホリパーゼＣに、恐らくＧｐを介 して共役していることを示唆する。０Ｋ−０とＯＫ　−Ｈの間の唯一の違いはＣ 末端尾部にあるので、これらのデータは０Ｋ−０とＲ１５Ｂによってコードされ ているＰＴＨレセプターのＣ末端はホスホリパーゼＣの活性化に関与しているこ とを強く示唆する。

図１６は、Ｒ１５ＢとＯＫ　−Ｈを発現しているＣＯ８細胞が、Ｎ　ｌ　ｅ　Ｐ ＴＨによる刺ｆｆ１ｆｆｌ、ｃＡＭＰ蓄積を増大することを示している。同様の 結果は、０Ｋ−Ｏを発現しているＣＯ８細胞においても得られた。ｃＤＭ１８ベ クターのみを移入されたＣＯ８細胞てはｃＡＭＰ刺激は認められなかった。これ らのデータは、アデニル酸シクラーゼに共役しているＰ　Ｔ　Ｈレセプターは、 レセプターのＣ末端の細胞ｎ側の完全長の尾部を必要としないことを示唆してい る。これらのデータは、ＯＫ及びＲＯ３ｉＢ胞のｃＤＮＡライブラリーの双方か らクローン化された３つのＰＴ１ｉ／ＰＴＨｒＰレセプターのすべてが、両ペプ チドのアミノ末端リガンドを同等に結合することを示唆している。リガンドによ るこれらすべてのレセプターの活性化は、アデニル酸シクラーゼを、恐らくはグ アニンヌクレオチド結合蛋白質（Ｇ−蛋白質）の１つの活性化を通じて、刺激す る（細胞内ｃＡＭＰの増加によって測定されるように）。Ｇ−蛋白質は、三量体 ペプチド構造を持ち、そのうち、サブユニットの１つ、アルファーは、夫々、別 個であるが、他の２つ、へ−ターとガンマは同一か、または相同性が高い。これ らＧ−蛋白質の１つ、（Ｇｓ）はＧ−アルファー゛刺激性”　（Ｇ−アルファー Ｓ）を含み、これはアデニル酸シクラーゼの活性化に関与する。

リガンドのＯＫ　−Ｈへではなく、ＯＫ−〇とＲ１５Ｂへの結合もまた、細胞内 の遊離カルシウムを増加してイノシトールりん酸の代謝を刺激する。これらの性 質は、０Ｋ−０とＲ１５Ｂレセプターのりガントによる活性化は、共に第二の細 胞内エフェクター、ホスホリパーゼＣの刺激をもたらすことを強く示唆している 。

これら活性化されたレセプターとホスホリパーゼＣとの共役機構は、Ｇｓとは全 く異なるＧ−蛋白質であるらしい。対照的に、カルボキシ末端で切り詰められて いる活性化された０Ｋ−Ｈレセプターは、活性化された時のその性質が、ホスホ リパーゼＣを活性化しないか、あるいはホスホリパーゼＣを効果のない活性化を することを示唆する。

ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターのカルボキシ末端尾部の生化学的役割は、鋳型と してＲ１５Ｂを、そして４８１位に終止コドンを挿入された上流プライマーとを 用いる標準ＰＲＣ技法により、カルボキシ末端短縮ラットレセプターを構成する ことによって、さらに検討された。簡略に述べると、上流プライマーはラットｃ ＤＮＡ配列（図３．　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、＋　３を見よ）の１４９４−１５１ ３番のヌクレオチドに基づく合成オリゴヌクレオチドで、これに終止コドンとＸ ｂａｌクローニング部位が加えられたものであった。３０回のＰＣＲサイクルが 行われ、各サイクルは変性９２℃、１分、アニーリング６０℃、１分；延長７２ ℃１分からなっていた。生成物はＮ５ｉｌとＸｂａｌによって切断され、ゲル電 気泳動によって精製された。Ｒ１５Ｂは、ＸｂａＩとＮ５ｉｌによって順次消化 され、精製されたＰＣＲ生成物は、次いで、Ｘｂａｌ−Ｎｓｉｌで切断されたＲ １５Ｂベクターに連結された。その結果出来たプラスミド、Ｒ４８０は細菌中で 増幅され、配列が決定された。

Ｒ４８０は、５９１アミノ酸残基を持つレセプター中のものと同−Ｉｊ４８０の アミノ酸をコードしている。この短縮ｃＤＮＡはＣ０８−７（一過性発現）とＣ ＨＯ細胞（安定発現）に発現された。短縮レセプター、Ｒ４８０と自然型レセプ ター、ＲＢを発現しているＣＯ３−７とＣＨＯ細胞は共にＰＴＨ（１−３４）を 同等の親和性を持って結合する。活性化されると、Ｒ４８０は、正常型レセプタ ーと同様にＣＯ５−７とＣＨＯ細胞におけるｃＡＭＰ蓄積を刺激した。正常型レ セプターとは対照的に、Ｒ４８０はＰ　Ｔ　Ｈで刺激された時、ＣＯ５−７細胞 、あるいはＣＨＯ細胞にも［Ｃａ２＋］イオンの増加を仲介しなかった。これら のデータは、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターによるホスホリパーゼＣとアデニル 酸シクラーゼの活性化に幻する分子的要求性はお互いに異なっていることを示唆 し、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターのカルボキシ末端尾部のホスホリパーゼＣと の、しかしアデニル酸シクラーゼとではない、共役における主要な役割を指摘し ている。

勿論、活性化されたＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターが追加のＧ−蛋白質および／ または細胞内のエフェクター分子を活性化する可能性もまたある。

クローン化されたヒトのＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターを移入されたＣＯ５−７ 細胞の分析によって、放射標識ＰＴＨ（１−３４）とＰＴＨｒＰ　（１−３６） （−２００，０００ｃｐｍ）が発現されたレセプターに、Ｒ１５Ｂ　（特異的結 合、夫々、８．　１＋３．　５％と７．　１＋４．　１％）を発現しているＣＯ ５−７細胞に対して観察されたのと同様の効率（特異的結合・夫々、１０．１± ３．７％と７．６±６．　０９．ｉ）で結合することが明らかとなった。発現さ れたヒトＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターは、ラット骨のレセプターよりも２倍高 い見掛けのＫｄでＰＴＨ（１−３４）と結合した：　〜５ｎＭ対−１０ｎＭ（図 １７）。しかしながら、それらの高度のアミノ酸相同性にも拘らず、２つのレセ プターはＰＴＨ（３−３４）とＰＴＨ（７−３４）に対する親和性に著しい差異 を表した。ＰＴＨｒＰ　（１−３６）はヒトのＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターに 対し、ラットのレセプターに対するよりも２から４倍低い親和性を示した（ＨＫ ｒＫに対する〜３５ｎｍ３５％５Ｂに対する一１０ｎＭ）、このことはＰＴＨｒ Ｐ　（１−３６）がラジオリガンドとして用いられた時の方が、さらに著明であ った。ＰＴＨ（３−３４）及びＰＴＨ（７−３４）に対する親和性は、発現され たＨＫｒＫの方がＲ１５Ｂよりも７から３５倍も高かった（ＰＴＨ（３−３４） に対して、夫々、〜７ｎＭ対−４５ｎＭ；ＰＴＨ（７−３４）に対して、夫々、 −６０ｎ　Ｍ対〜２０００ｎＭ）。いずれかのレセプターを発現しているＣＯ８ 細胞において、ＰＴＨ（１−３４）とＰＴＨｒＰ　（１−３６）は共に細胞内の ′ｔｉ離カルシウムとｃＡＭＰの蓄積を同程度に刺激した（図１８）。

ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターの関係 ヒトのＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターのアミノ酸配列は、ラット、真獣類動物か らの骨ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターと比べて、非常に高度の保存を示すが、オ ボッサム、−９袋動物のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターとの配列の相同性はそれ ほど著明ではない。オボノサムの腎臓及びラットの骨のレセプターのように、ヒ トの腎臓のレセプターは、ＰＴＨまたはＰＴＨｒＰて刺激された時、細胞内のＣ ＡＭＰと遊離のカルシウムの増加を誘引する。ヒトのＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプ ターとオポッサム及びラットの同族体間の高度の相同性にも拘らず、一過性に発 現されたヒトのレセプターは、ラットの骨のレセプターとは異なった機能的特徴 を持っている。これには、ＰＴＨ（１−３４）に対するやや高い親和性とＰＴＨ ｒＰ（１−３６）に対する著しく低い親和性が含まれる。より高い親和性はＰＴ Ｈ（３−３４）と特にＰＴＨ（７−３４）に対して認められ、そのヒトのレセプ ターに対する親和性はラット骨レセプターと比較して約３５倍も高がった。これ らの発見は、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ類自体の将来の開光自体要な意味を持つかも知 れない、それは種得異的な組織は、インビトロでアンタゴニスト（とアゴニスト ）の有効性検査に対する適当な組織であることを予言するからである。

ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターの他のレセプターに対する関係ＰＴＨとＰＴＨｒ Ｐレセプターの生化学的諸性質は、これらがＧ−蛋白質連携の膜レセプターとし て知られている膜レセプター分子群のメンバーであることを示唆している。よく 調べられているＧ−蛋白質レセプターの構造的特徴は、それらがすべて、数個の 連続した疎水性アミノ酸からなる少なくとも７つの領域を持ち、これらの領域の 各々が原形質膜を貫通するのに十分な長さのものであることである。

Ｇ−蛋白質連繋の模レセプターの１つのザブファミリー、糖ペプチドレセプター サブファミリーと呼ばれるものには、糖ペプチドホルモン（甲状腺刺激ホルモン 、黄体形成ホルモン、濾胞刺激ホルモン、及び絨毛性性腺刺激ホルモン）によっ て結合され、活性化されるレセプターが含まれる。これらのレセプターは、すべ て以下のような特徴がある：　（１）リガンド結合ドメインの一部またはすべて を含むと思われる広範な推定アミノ末端細胞外ドメイン（３００アミノ酸残基よ りも大）を持ち、（２）著しいアミノ酸相同性を、殊に、７つの推定置換ドメイ ンに示すことである。もう１つのサブファミリー、アドレナリン作動性／ムスカ リン作動性サブファミリーと呼ばれるものには、カテコールアミン、神経筋伝達 物質、及びレチノールうのような小分子のりガントによって活性化されるレセプ ターが含まれる。これらのレセプターは、すべて、特に７つの推定置換ドメイン における著しいアミノ酸相同性に加えて、比較的短い（２５−７５アミノ酸）推 定アミノ末端細胞外ドメインが特徴である。これらのレセプターのリガンドによ る活性化には、多数の置換ドメインの内の少なくとも幾つがが関与すると思われ 、レセプターのアミノ末端部が関与するとは思われない。

ラットのＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプター（図３）の推定アミノ酸配列から推論さ れ得るい（っがの構造的特徴は、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰが１つのＧ−蛋白質連繋の レセプターであることを示唆している。アミノ末端は、１つの疎水性ドメイン及 び３つの連続したロイシン残基を含むシグナルペプチドの特性を示す。この２０ −２８アミノ酸残基からなるアミノ酸範囲は、他の糖蛋白質レセプターの細胞外 ドメインに先行するアミノ末端のように、リーダー配列として役立つのかも知れ ない。また、推定ｉｉｓドメインを代表する７つの疎水性部分の集団がある（図 １９）。

オボノサムの腎臓、ラットの骨、及びヒト腎臓のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプター の予想されるアミノ酸配列は、これらがＧ−蛋白質連繋のレセプターサブファミ リーのいずれにもうまく当て嵌まらないことを示唆している。ラット及びヒトの ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターの糖ペプチドレセプター及びアドレナリン作動性 ／′ムスカリン作動性サブファミリーとの全般的相同性はおよそ１０がら２０％ であるが、置換ドメイン内のｔ目間性はこれより幾分高い。後のことは、これら の領域に出て来る疎水性アミノ酸のすべては限られているので、当然のことと予 想される。２０％相同性は、これらサブファミリーの夫々のメンバーとして一般 に受け入れられているレセプター間で見出だされる相同性よりも遥かに低い。加 えて、これらの配列には、限られた領域にさえ、強い相同性（即ち、正確に合っ ているうアミノ酸配列）として特徴付けられるようなものを持つ部分は全く存在 しない。

新たに特性が解明されたセクレチン及びカルシトニンレセプターとの最近の比較 （Ｉｓｌ＋１ｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ、、ＥＭＢＯＪ、１０＋１６３５゜コ９Ｑ１ ：Ｌｉｎｅｔａ１．．５ｃｉｅｎｃｅ２５４：１０２２゜１９９１）によって、 これらのレセプターとＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターの間には３０から４Ｃ１９ ０の同一性のあることが？１１明している。ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターはカ ルシトニンレセプターより１００個以上アミノ酸が長いけれども、オポノサム腎 臓のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプター（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、：２）とブタ腎臓の カルシトニンレセプター（ＧｅｎＢａｎｋ　受託番号　Ｘ７４４２０）のアミノ 酸配列の間には〜３２％の一致がある。推定置換ドメインＶｌ＋の１８アミノ酸 のうち１７の範囲は同一である。また、４つのＮ一連結グルコシル化部位のうち ２つ、及び８つの細胞外システィンとして可能性のあるもののうち７つの位置が 保存されている。２つのレセプター間の主要な差異は、それらΦＮＨ２−末端と Ｃ００Ｈ−末端のドメインにあると思われる。ラットのセクレチンレセプター（ ＧｅｎＢａｎｋ　受託番号　Ｘ５９１３２）とヒトのＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプ ターのアミノ酸配列の比較により、推定置換ドメインＶＩＥの２５のアミノ酸の うち２１の範囲が一致していて、これら２つのレセプター間には４３％の相同性 のあることが示唆されている。Ｐ　Ｔ　Ｈ／　Ｐ　Ｔ　１１　ｒ　Ｐ　ｓカルシ トニン、及びセクレチンのレセプター間の類似性は、こいれらが７回膜貫通の６ 蛋白質に共役してアデニル酸シクラーゼを活性化するレセプターの新しいファミ リーを代表することを示唆している。これらレセプターのアミノ酸配列が与えら れれば、この道の専門家はこれらの配列を比較し、一致して核酸プローブ設＝１ に役立つ領域をめ、このファミリーに属する他のレセプターの確認と分離に用い ることが出来るであろう。

クローンの寄託 特許手続きの目的のための微生物寄託についての国際的承認に関するブタペスト 条約の約条の下に、ｃＤＮＡＲｙｉプラスミドＲ１５Ｂ、０ＩＣ−〇及び０Ｋ− Ｈ；ファージＨＰＧ１；及びヒトのクローンの一部を含むプラスミド（名称８Ａ ６）が、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）に寄託され、そこでは、夫々の受託番号ＡＴＣＣＮｏ、６８５７１ ．６８５７２，６８５７３，４０９９８．及び６８５７０を付けられている。

申請者の指定代理人、Ｔｈｅ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ　Ｃｏｒｐ。

ｒａｔｉｏｎは、ＡＴＣＣがこの寄託の永続性と、もし、特許が許可された場合 には、その容品な分鵡を１！！ｌＪｔする寄託所であることを申し立てる。この ように寄託物質の分譲に関するすべての制限は、特許の許可と共に改変されるこ となく撤去される。物質は特許申請の未決期間中は、３７　ＣＦＲ１，１４及び ３５Ｕ、Ｓ、Ｃ，１２２の下、コミッシ四ナーによって資格ありと決定された者 に分ｊされる。寄託された物質はあらゆる必要な注意を払って維持され、寄託さ れたプラスミドの試ｔ４提供に対する最も新しい要請後少な（とも５年間、そし て、いかなる場合でも、寄託の日付後、少なくとも３０年の期間、あるいは特許 の実行期間、いずれか長い方の期間、生存状態で、ｌり染されないように保存を 継続する。

申請者の指定代理人は、もし、寄託物の状態のために、要請があっても寄託所が 試料を提供出来ないならば、寄託物を取り替える責任のあることを認める。

ポリペプチド 本発明によれば、ポリペプチドには、図１−３及び６に夫々、示されているオボ ッサム、ラット及びヒトの副甲状腺ホルモンレセプター、及びいかなる他の自然 界に存在するレセプターにせよ、これらのレセプターをクローン化して発現する のに用いられたものに類似の方法により、あるいは、ここに記述されている配列 の１つの全体または１部をプローブとして利用する方法によって生成され得るも のを含む。さらに、副甲状腺ホルモン、または副甲状腺ホルモン関連蛋白質に対 する結合能のあるＰＴＨレセプターの類似体あるいは断片も本発明の範囲内にあ る。

興味ある特異なレセプター類似体には、同類アミノ酸置換によってのみ異なる、 例えば、同じクラスの他の代わりに１アミノ酸の５ｉｔｊＪＬ（ｆｌＪえば、グ リシジの代わりにバリン：リジンの代わりにアルギニン、等）、あるいは、１つ 、またはそれ以上の非同類アミノ酸の置換、欠失、また副甲状腺ホルモン、また は副甲状腺ホルモン関連蛋白質に結合するレセプターの能力を破壊しない位置に された挿入によってのみ異なるアミノ酸配列を持つ完全長、あるいは部分長のレ セプター蛋白質が含まれる。

特に関心のある特異なレセプター断片には、これらに限られるわけではないが、 レセプターの部分で、−次アミノ酸配列からＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ法（例えば 、Ｃｈｏｕ　ａｎｄ　Ｆａｓｍａｎ、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

４７：２５１．　１９７８参照）のような疎水性／親水性号Ｅ算法を用いて細胞 外であると推定されたものが含まれる。親水性ドメイン、特に少なくとも１０個 のアミノ酸からなる疎水性区間（参照、置換ドメイン）は、細胞外ドメインの有 力な候補もとして現れて来る。図２１は、１つのＰＴＨレセプクーの細胞外、細 胞内及び置換ドメインの予１１Ｆ＋される配置を図示している。

特定のＰＴＨレセプター断片の例には、Ｒ１５Ｂクローンの推定アミノ酸配列に 由来する以下ののアミノ酸配列（標準の一文字記号で示されている）が含まれて いる。

細胞外ドメイン： ＲＰ−１：　ＴＮＥＴＲＥＲＥＶＦＤＲＬＧＭＩＹＴＶＧ　（ＳＥＱ　ＩＤＮｏ 、：　５） ＲＰ−２：　ＶＬＹＳＧＦＴＬＤＥＡＥＲＬＴＥＥＥＬ　（ＳＥＱ　ＩＤＮｏ、 ：　６） ＲＰ−３：　ＶＴＦＦＬＹＦＬＡＴＮＹＹＷＩＬＶＥＧ　（ＳＥＱ　ＩＤＮｏ、 ＋　７） ＲＰ−４：　Ｙ−ＲＡＴＬＡＮＴＣ，ＣＷＤＬＳＳＧＨＫＫＷＩＩＱＶＰ　（Ｓ ＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、：　８） ＲＰ−５：　ＰＹＴＥＶＳＧＴＬＷＱＩＱＭＨＹＥＭ　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、 ：ＲＰ−６：　ＤＤＶＦＴＫＥＥＱＩＦＬＬＨＲＡＱＡ　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ 、：細胞内ドメイン ＲＰｉ−７：　ＦＲＲＬＨＣＴＲＮＹ　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、：　１１）ＲＰ ｉ−８：　ＥＫＫＹＬＷＧＦＴＬ　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、：　１２）ＲＰｉ− ９：　ＶＬＡＴＫＬＲＥＴＮＡＧＲＣＤＴＲＱＱＹＲＫＬＬＫ　（ＳＥＱ　ＩＤ 　Ｎｏ、：　１３） これらの断片はＫｅｕｔｍａｎｎらの方法（Ｅｄｎｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１１ ヱ：　１２３０．　１９８４）によって合成され、ＨＰＬＣによって精製された 。

ポリペプチドの発現 本発明によるポリペプチドは、本発明の細胞レセプターの一部または全体をコー ドしている配列を持つ組換え核酸から、なにが適すな発現系、例えば、適当な宿 主細胞（原核あるいは真核）の、適当な発現伝達体（Ｈ，ｐｃＤＮＡＩ）内の組 換え核酸による突然変異を用いて、発現することにより生成すること力呵能であ る。正確にいかなる細胞を用いるがは、本発明にとって重要ではない。しかしな がら、本発明のポベブチドがＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターの全体または一部を 含む場合には、以下の宿主細胞か好適である：　ＣＯＳ細胞、ＬＬＣ−ＰＫＩ細 胞、ＯＫ細胞、Ａ　ｔ　Ｔ２ＣＩ細胞、及びＣＨＯ細胞。移入の方法及び発現伝 達体の選択は選ばれた宿主系に依存する。哺乳類細胞の移入の方法は、例えば、 Ａｕ５ｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｔ、（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｌｅｙ　＆　５ｏｎ ｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８９）に記載されており、発現伝達体は、例えば、Ｃ ｌｏｎｉｎｇ　Ｖｅｃｔｏｒｓ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（ Ｐ、Ｉｆ、　Ｐｏｕｗｅｌｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５．　補遺、　１９８７ ）に論じられているものから選んでもよい。安定に移入された細胞は、レセプタ ーＤＮＡを宿主細胞の染色体に組み込むことによって作ることが出来る。適当な りＮＡは、ｐｃＤＮＡ、ｐｃＤＮＡＩ−Ｎｅｏ、あるいは他の適切なプラスミド に挿入され、次いて、細胞は、このプラスミドにより、ｐｓＶ　２−Ｎｅｏ、あ るいはｐｓＶ−２−ＤＨＦＲとの共同移入をして、あるいはしないで、標準電気 が孔、りん酸カルシウム、及び／あるいはＤＥＡＥ／デキストラン技法によって 移入される。移入された細胞の選択は、累進的に上昇するレヘルのｃ４１８（Ｇ ｅ口ｅｔ　１ｃｉｎ、　ＧＩＢＣＯ）、そしてもし必要ならば、メトトレキサー トを用いて行われる。

本発明のポリペプチドをフードしているＤＮＡ配列は、また、原核宿主細胞にも 発現することが出来る。細胞のレセプター、あるいはレセプター断片をコードし ているＤＮＡは、原核細胞宿主における発現をもたらすことの出来る制御シグナ ルに作動可能に連結されたベクター上を運ばれる。もし希望ならば、コーディン グ配列は、その５′−末端に、発現された蛋白質の宿主細胞の周辺腔への分泌を もたらし、それによって蛋白質の回収とその後の精製を容品にすることの出来る 既知のノブナル配列をなにかコードしている配列を含むもとも出来る。最も頻繁 に用いられる原核細胞は種々のＥ、　ｃｏｌｉの株である。しかし、他の微生物 の株もまた使用してよい。プラスミドベクターは、複製起Ｊ１＼、選択可能のマ ーカー、及び宿主微生物に適合する株に由来する制御配列を含むものが用いられ る。

例えば、互、　ｃｏｌｉは、ｐＢＲ３２２、これはＢｏｌｉｖｅｒ　ｅｔ　ａｌ 。

（Ｇｅｎｅ　２＋　９５．　１９７７）によって、３つの自然界に存在するプラ スミド、そにうち２つはＳａ　１ｍｏｎｅ　Ｉ　ｌａの株から、１つはＥ、　ｃ ｏｌ上から分離されたものであるが、に由来する断片を用いて構成されたプラス ミドであるか、その誘導体を用いて変異させることが出来る。ｐＢＲ３２２は、 アンピシリン及びテトラサイクリン耐性由来の遺伝子を含み、そのため、希望す る発現ベクターの構築において、保持され、あるいは破壊され得る多数の選択可 能なマーカーを提供する。一般に用いられる原核細胞の制御配列（また、“調節 因子”とも呼ばれる）は、ここては、随意的にオペレーター、リポソーム結合部 位配列と共に、転写開始のためのプロモーターを含むものと定義される。蛋白質 の発現を指令するために一般に用いられるプロモーターには、ラムダ−由来のＰ Ｌプロモーター及びＮ−遺伝子リポソーム結合部位（Ｓｉｍａｔａｋｅ　ｅｔ　 ａｌ、。

Ｎａｔｕｒｅ　２９２：１２８．　１９８１）ばかりでなく、β−ラクタマーゼ （ペニンリナーゼ）、ラクトース（ｌａｃ）（Ｃｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａ ｔｕｒｅ　１９８：　１０５６．　１９７７）及びトリプトファン（Ｔｒｐ）プ ロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、 　８：　４０５７．１９８０）　も含まれる。

本発明の細胞レセプター蛋白質は、以下のような性質を持っているので、細胞内 に発現すると、それは細胞膜へ、部分的には膜を貫通して移動し、その結果、そ の一部は膜に埋め込まれて止まり、一部は細胞外に伸展し、一部は細胞内に止ま る。このような埋め込まれた細胞レセプターを持つ形質転換された細胞は、それ 自身、本発明の方法の中で用いられてもよく、あるいは、レセプター蛋白質は膜 から抽出され、精製されることも可能である。

無傷の蛋白質を細胞膜に繋ぎ止める責任を負う蛋白質の疎水性部分を欠くペプチ ド断片は、発現しても、膜に埋め込まれることは期待されない。これらが細胞内 に止まるか、あるいは細胞外培地に分泌されるかは、分泌を促進する機構（例え ば、シグナルペプチド）が含まれているか、否かによる。もし、分泌されれば、 本発明のポリペプチドは培地から収穫することが出来る。もし、そうでなければ 、細胞は解体して、所期のポリペプチドは細胞の全内容から分離しなければなら ない。発現される可能性のあるポリペプチドの特殊例は、限界はないが、以下の ものか含まれる １）図３に示されるようなラットの骨のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターの、推定 リーダー配列を含む、アミノ酸１−１９２からなるアミノ末端部分。

２）図３に示されるようなラットの骨のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターの、推定 リーダー配列を除外した、アミノ酸２７−１９２からなるアミノ酸末端部分。

３）図３に示されるようなラットの骨の完全長のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプタ４ ）ＰＲ−１（上記のような）。

５）ＰＲ−２（上記のような）。

本発明のポリペプチドは、アフイニテイクロマトグラフイーを用いて容易に精製 すること力咄来る。これらのポリペプチドの抗体、あるいはレセプター特異的リ ガンド（例、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターに対するホルモンＰＴＨとＰＴＨｒ Ｐ）は、セファ０−ス　４　ＣＮＢｒ−活性化セフ７０−ス（Ｐｈａｒｍａｃｉ ａ）のような固を目支持体に共有結合し、本発明のポリペプチドをなんらかの混 入物質から分離するのに用いてもよい。一般的には、１ｍｇのリガンドあるいは 抗体がＣＮＢｒで活性化されたセファロースと４℃で１７−２０時間（振盪下） インキュベートされる。セファロースは、ＩＭＩ−リス塩酸（ｐＨ８）で洗浄し て過剰の油性部位をブロックする。セファロース−ＰＴＨ、セファロース＝ＰＴ ＨｒＰ、あるいはセファロース−抗体は、次いて、粗ポリペプチドとりん酸緩衝 食ｔｇｄ　（ｐＨ’；’、４）中、４℃で２時間インキュベート−される（振盪 下）。セファロースは、次いて、一般的にはカラムに充填され、入念にＰＢＳで ６し浄され（一般的にはカラム容の１０倍）、水で希釈した塩酸（ｐＨ１，８５ ）で溶出される。

溶出液は、次いて、凍結乾燥により濃縮され、その純度は、例えば、逆層ＨＰＬ Ｃて検査される。

抗細胞レセプター抗体 本発明の細胞レセプターあるいはレセプター断片は、専門家にはよく知られてい るなにか通常の方法によって、ポリクローナル抗体を産生ずる方法、及びモノク ローナル抗体を産生ずる方法を含め、抗体を産生ずるのに用いること力咄来る。

例えば、Ｐ　Ｔ　Ｈレセプターの推定アミノ酸配列は、他のＧ蛋白質連鎖レセプ ターに見出だされる領域に類侃した細胞外と細胞内とりつれる領域（図２１を見 よ）を点々配置した数個の置換（即ち、疎水性）ドメインを持つと思われる伍白 質構造を示している。この情報は、レセプター蛋白質の、細胞外に露出している 見込みがあり、従ってｉｎ　ｖｉｖｏて抗体に提示されるであろう領域の選択を 手引きするために用いることが出来る。このような領域の１つ、あるいはさらに 多くを表舅する短いペプチドを合成しく例えば、化学的に、あるいは組換えＤＮ Ａ技法により）、ポリクローナル、あるいはモノクローナル抗体を産生ずるため に動物（例えば、ウサギ、あるいはマウス）を免疫するのに用いること力咄来る 。例えば、上記のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターのペプチドのあるもの（ＲＰ− １、ＲＰ−５、及びＲＰ−６）は、標準の技法を用いて化学的に合成され、以下 の手順によりウサギにポリクローナル抗体を産生ずるのに用いられた。

完全フロインドアジュバントで乳化された所定のペプチドの標品をウサギに皮内 に注射する。追加免疫は、不完全あるいは完全アジュノくントで、１月間隔で注 射される。

抗体価は２つの方法のいずれかを用いて評価される。第一に、抗体を１％正常ウ サギ血清で連続希釈し、　Ｉ−標識ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプター断片と常法（ 例えば、Ｓｅｇｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、上記）により２４時間、４℃でインキュベ ーンヨンする。結合した　ｌ−標識ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプター断片は、非結 合のものから、１００μｍの第二抗体（抗ウサギＩ　ｇＧ、Ｓ　ｉ　ｇｍａ）を ２０倍に希釈したもの及び１ｍｌの５％ポリエチレングリコールを加え、次０て 、２００Ｏｒｐｍで３０分、４℃で遠心することによって分離される。上清を除 去し、ベレットをγカウンターで、放射活性の分析をする。第二の方法で１よ、 自然型の（例えば、ＲＯ３１７／２．８、ＯＫ、５ａｎｓ−２細胞）ある０（１ 組換え（Ｒ１５Ｂ、０Ｋ−０あるいは０Ｋ−Ｈを移入されたｃｏｓ細胞あるＬＴ ＋よＣＨＯ細胞）ＰＴＨ／ＰＴＹＨｒＰレセプターを発現して０る細胞系力（、 連続希釈された抗体と４℃、２０℃、あるいは３７℃で１−４時間インキュベー トされる。細胞をＰＢＳで（３回）洗浄し、１２５　Ｉ−標識（ＮＥＭ、Ｄｕｐ ｏｎｔ）あるいはＦＩＴＣ−標識（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）の第二抗体と２時間、４℃ でインキュベートする。洗浄後（ＰＢＳで３回）、細胞は０．１ＭＮａＯＨで溶 解してγカウンターでｆ則定されるか（もし、１２５１−標識の第二抗体が用（ １られｔこＩＩ！Ｉ）、あるいは１％バラフォルムアルデヒドで固定し、蛍光顕 微鏡法で検査された（もし、ＦＩＴＣ−標識の第二抗体か用いられた時）。

抗体を生成するもう１つの方法は、抗原として細胞（例えば、レセプターをコー ドしているＤＮＡを移入されたＣＯＡ細胞のような哺乳類の細胞）の表面に発現 されている本発明の無傷の細胞レセプター蛋白質を利用する。このような細胞は 、常法、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン移入法により、細胞レセプターの高度 の発現をコードし、且つ、指令することの出来るヘクターを用いて生成すること が出来る。例えば、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターに特異的なモノクローナル抗 体は以下の手順で生成される。

ラットの組換えＰ　Ｔ　Ｈレセプターを細胞表面に＋ＱＩｆに発現している無１ 易のＣＯ８細胞をＢａ１ｂ−Ｃ７ウス（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｌａｂｏ ｒａｔ。

ｒｉｅｓ、Ｗｉｌｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）の腹腔内（ＩＰ）に注射する。

マウスは４週ごとにＩＰ注射により追加免疫を受け、融合の３０前に、静脈内（ ＩＶ）追加免疫により超免疫される。このマウスから肺臓細胞を分離し、ミエロ ーマ細胞と常法により融合する。ハイブリドーマは、標準のヒボキサンチン／ア ミノプテリン／チミン（ＨＡＴ）培地で常法に従って選別される。ＰＴＨレセプ ターを認識する抗体を分泌するハイブリドーマは、最初、細胞あたりＰＴＨレセ プターのコピーを元来豊富に発現する細胞系（ＰＯ３１７／２．８あるいはＯＫ 細胞）で、標準の免疫的技法を用いてスクリーニングして確認される。ＰＴＨレ セプターに結合することの出来る抗体を生成するこれらのハイブリドーマは培養 して、ザブクローニングされる。次いてモノクローナル抗体の性質を新たに検討 するために、ラヂオレセブター及びｃＡＭＰ刺激アッセイを用いる二次スクリー ニングを行うことが出来る（以下参照）。

ＰＴＨレセプターアンタゴニスト及びアゴニストのスクリーニング本発明のポリ ペプチド及び抗体ならびに他の化合物は、Ｐ　Ｔ　Ｈ競合性、及びアンタゴニス ト的あるいはアゴニスト的な性質について、ここに記載のアッセイを用いてスク リーニングすることが出来る。

１例をあげると、無傷の細胞上のＰＴＨレセプターを認識するこれらの抗体は、 ＰＴＨあるいはＰＴＨｒＰとＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターへの結合に対し競合 する能力についてスクリーニングされる。細胞表面にＰＴＨレセプターを発現し ている細胞は、１２５１−ＰＴＨ類似体である１２５１−Ｎ１ｅＰＴＨあるいは １２５１−ＰＴＨｒＰと、試料のポリクローナルあるいはモノクローナル抗体の 存在下、４時間、１５℃でインキュベートされる。使用される抗体は、粗抗血清 、細胞培地、あるいは腹水由来のものか、あるいは精製された形のものである。

インキュベーション後、細胞は結合緩衝液（例えば、生理食塩水）で洗浄、融解 され、ガンマ−カウンターを用いて放射活性を定量分析される。ＰＴＨレセプタ ーへのＰＴＨ類以体の結合を低減する抗体は、競合的、低減しないものは非競合 的と分類される。

抗体及びポリペプチドを含め、化合物は、それらのアゴニストあるいはアンタゴ ニストとしての性質につき、上記のｃＡＭＰ蓄積、細胞内カルシウム、及び／あ るいはイノシトールりん酸のアッセイを用いてスクリーニングすること力咄来る 。細胞表面上にＰＴＨレセプターを発現している細胞は、ＰＴＨ，ＰＴＨレセプ ター抗体、あるいは両者を組み合わせたものと、２ｍＭＩ　ＢＭＸ　（３−イソ ブチル−１−メチル−キサンチン、Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ） の存在下、５−６０分間、３７℃でインキュベートされる。サイク１ルックＡＭ Ｐの蓄積は、上述のように、特異的ラジオイムノアッセイによってＣＩ定される 。ＰＴＨレセプターへの結合に対してＰＴＨと競合し、且つ、ＰＴＨのｃ　Ａ　 Ｍ　Ｐ蓄積に対する効果を阻害する化合物は、競合的ＰＴＨアンタゴニストと見 做される。

反対に、ＰＴＨレセプターへのＰＴＨの結合と競合しないが、なお、ＰＴＨによ るｃ　Ａ　Ｍ　Ｐ蓄積促進を阻害する（恐らくは、レセプター活性化部位を妨害 することにより）化合物は、非競合的アンタゴニストと見做される。ＰＴＨレセ プターへの結合に対しＰＴＨと競合し、ＰＴＨの存在あるいは非存在下にｃＡＭ Ｐの蓄積を刺激する化合物は競合的アゴニストである。ＰＴＨレセプターへの結 合に対してＰＴＨと競合しないが、ＰＴＨの存在あるいは非存在下に、なお、ｃ ＡＭＰ蓄積を刺激する能力があるか、あるいはＰＴＨ単独によって観察されるよ りも高い蓄積を刺激する化合物は、非競合的アゴニストと見做される。

その特異的リガンド間の相互作用に関連すると特徴づけられるような疾病の診断 、分類、予後、及び／あるいは処ばに有用である。例えば、高カルシウム血症及 び低カルシウム血症のいくつかの型は、Ｐ　Ｔ　Ｈ及びＰＴＨｒＰとＰＴＨ／Ｐ ＴＨｒＰレセプター（ｔｋ数）間の相互作用に関連している。紬カルシウム血症 は、血清のカルシウムレベルに異常な上昇のある状態である：　それは、しばし ば、副甲状腺機能亢進症、骨粗髪症、乳腺、肺、及び前立腺の癌腫、食道の頭部 及び頚部の類表皮癌、多発性骨髄腫、及び副腎腫を含む他の病気に関連している 。低カルシウム血症は、血清カルシウムレベルが異常に低い状態であり、例えば 、甲状腺手術後に起こる付効ＰＴＨの不足から生じることがある。

初めの例では、本発明の化合物は、珍断薬の製造に用いられ、これらは、高カル シウム血症を診断し、種々の高カルシウム状態を区別する、即ち、ＰＴＨあるい はＰＴＨｒＰによって奴介される高カルシウム血症（例えば、副甲状腺機能亢進 症及び悪性の体液性高カルシウム血症）を、これらの因子を含まぬ病気（例えば 、骨に直接接触している恕性肚瘍の存在によって媒介される局所的骨軟化症、及 び破骨細胞活性化因子（インターロイキン）、リンホトキンン、カルントリオー ル、タイプＥプロスタグランディン、及びビタミンＤ様ステロールのような体液 性因子の増大によって媒介されるいくつかの希少型恕性腫瘍関連の高カルシウム 血症）から区別するために用いられる。

診断の１つの方法においては、血清の総カルシウム及び／あるいはイオン化され たカル／ラムのレベルは、本発明のＰＴＨあるいはＰＴＨｒＰアンタゴニストの 投与の前後に常法によって９１足される。ＰＴＨあるいはＰＴＨｒＰ関連の高カ ルシウム血症は、本発明のアンタゴニストの投与後の血清カルシウムレベルの低 下として検出することが出来る。対照的に、ＰＴＨあるいはＰＴＨｒＰ以外の因 子によって媒介される品カルシウム血症状態に対しては、血ｌｎカルシウムレベ ルはアンタゴニストの投与後でさえ、不変のままの筈である。

本発明の他の診断的応用として、ＰＴＨあるいはＰＴＨｒＰに関連する癌、例え ば、営性の体液性高カルシウム血症に関連する癌、を診断するために、及び、癌 治療の間、Ｐ　Ｔ　ＨあるいはＰＴＨｒＰのレベルを監視するために、生物的試 料中のＰＴＨあるいはＰＴＨｒＰのレベルの測定が可能でなる。この方法には、 本発明の組換え副甲状腺ホルモンレセプターの、組織試料に存在するＰＴＨある いはＰＴＨｒＰへの結合を、ここに記述されている結合アッセイを用いて、１Ｉ Ｉ１１定することが含まれている。結合のレベルは、直接測定することも出来る （例えば、放射標識をしたＰＴＨレセプターを用い、内在性ＰＴＩ（に結合する 放Ｑ・ｊ能をアッセイすることによって）。代わりに、試料（例えば、組織切ハ ）へのＰＴＨレセプターの結合は、組織切片をＰＴＨレセプターに特異的な抗体 で、標準の免疫技法（Ｃ１ｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　５：３３ ９．　１９８６）を用い染色して追跡することが出来る。

第三の診断的アプローチでは、細胞系を（Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ、。

に記載されている方法により）適当なプロモーターに連結されたＰＴＨレセプタ ー遺伝子で安定に移入することか出来る。代わりに、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプ ターは、真核のヘクター、即ち、ｐｃＤＮＡＩから発現され、そして変異ＤＨＦ Ｒ遺伝子を共移入して、メトトレキサー１−選択（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ　ｅｔ　ａ ｌ。

、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、８０：２４９５−２４９９、　 １９８３）を紅でさらに遺伝子の増幅を可能にすることが出来る。遺伝子のこの ような高度の発現によって、ＰＴＨあるいはＰＴＨｒＰに超感受性である不滅の 細胞系が生成される。このような細胞は、ＰＴＨあるいは））ＴＨｒＰの血液レ ベルを検出するための特に有用な手段を提供する。このような細胞系は、上昇し たＰＴＨあるいはＰＴＨｒＰレベルを伴う状態（例えば、上記の状＠）、あるい は、ＰＴＨあるいはＰＴＨｒＰの異常に低いレベルを伴う状態（例えば、上記の 状＠）の診断に用いることが出来る。このような細胞系は、また、高カルシウム 血症あるいは低カルシウム血症の治療の間に、夫々、ｌ’ＴＨあるいはＰＴＨｒ Ｐレベルの退行あるいは増昇の監視に有用である。

高カルシウム血症の疑いのある患者は、本発明の化合物を用いて治療してもよい 。症状は突如として現れることがあり、逆転しなければ致命的なこともあり得る ので早急な介入が重要である。１つの応用において、血清カルシウムレベルは、 ＰＴＨあるいはＰＴＨｒＰのアンタゴニストを含む、即座の治療の１コースで安 定化する。この様なアンタゴニストには、ＰＴＨレセプター媒介による細胞の活 性化に介入することが決定されている（ここに記述のアッセイによりン本発明の 化合物か含まれる。アンタゴニストを投与するために、適当な抗体あるいはペプ チドは、一般に、生理食塩水のような適当な担体中に調剤することによって薬剤 の製造に用いられ、ＰＴＨレセプターへのＰＴＨあるいはＰＴＨｒＰの結合に対 し適切な競合を提供する用量で、静脈内注射される（例えば、血清カルシウムレ ベルを１．０ｍｇ／ｄｉ以下に下げるのに十分な用ｆｆ１）。代表的な用量は、 −日当たり、体重１ｋｇにつき、抗体あるいはペプチド、ｌｏｇからＩＱｍｇで ある。

治療は、許容カルシウムレベル（即ち、レベルは１０．１ｍｇ／ｄｉ以下）の長 期維しヶのため、必要な時は反復してもよい。これは、高カルシウム血症の切っ 掛けとなる、根底にある病状の緊急処置に必要かも知れない、あるいは、それは 、例えば、骨粗に症のような病状の長期にわたる処置に用いてもよい。

他の応用において、本発明の方法に従ってアゴニストであると特徴付けづけられ ている本発明の化合物は、治療上、例えば、副甲状腺の部分的あるいは完全な外 科的除去からおこる低カルシウム血症の処置に用いられる。アゴニストは、適当 な担体（例えば、生理食塩水）中で調剤され、血ｌｌ’ｒのカルシウムを許容レ ベル（即ち、およそ８ｍｇ／ｄｌ）までの上昇をもたらす用量で、出来れば静脈 内投与されるのか望ましい。有用な用ｍ範囲は、１日、体重１ｋｇ当たり、アゴ ニスト１ｎｇから１０ｍｇである。適切な血清カルシウムレベルを維持するため に必要な場合、処置を縁り返すことも出来る。長期の処置は、副甲状＃切除を受 けた患者に必要なことがある。

本発明の（亥酸もまた治療のために用いることが出来る。ＰＴＨレセプターｍＲ ＮＡ（あるいはＰＴＨレセプターｍＲＮＡにアンチセンスであるＲＮＡを表現す る核酸Ｊｊ、ｊ成）にアンチセンスであるオリゴヌクレオチドは、抗癌治療とし て用いられることもある。このアプローチは、例えば、ＰＴＨレセプター、ＰＴ ＨあるいはＰＴＨｒＰＯ量あるいは活性を増大するケノムの再配列あるいは増幅 から生じる高カルシウム血症に対して有用である。この方法には、ｉｎ　ｖｉｖ ｏで、アンチセンスオリゴヌクレオチドを癌細胞に挿入することが含まれている 。アンチセンス鎖は、内在性ＰＴＨレセプターｍＲＮＡとハイブリッドを形成し て、蛋白質の翻訳を妨害し、それによって、この様な細胞におけるＰＴＨレセプ ターの生成を低下させ、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ関連の腫瘍増殖を抑制する。アンチ センスの設計及び宿主細胞への挿入方法は、例えば、Ｗｅｉｎｂｅｒｇ　ｅｔ　 ａｌ、。

Ｕ、Ｓ、特許番号４．７４０，４６３に記載されており、ここでは引用して組み 込まれている。本発明の０Ｋ−Ｈ，０Ｋ−０及びＲ１５ＢＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレ セプターの生化学的特徴の検討は、Ｐ　Ｔ　Ｈのそのレセプターとの相互作用に よって引き起こされることが現在知られている２つの伝達経路は別個のものであ り、分別されるかも知れないことを示している。これらレセプターの予想アミノ 酸配列は、イノシトールりん酸代謝を検出可能な程度に活性化するようには見え ない０Ｋ−）１は、０Ｋ−０あるいはＲ１５Ｂよりも７０アミノ酸分短いことを 示唆している。本発明の配列とここに開示されている情報を用いて、いかなる動 物種からのＩ’ＴＩ／ＰＴＨｒＩ’レセプター遺伝子にせよ、これをクローン化 、次いで改変して（例えば、部位特異的変異誘発により）、ホスホリパーゼＣを 活性化しないＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターを生成することが出来る。このこと は、骨の再吸収及び肯の造成を含め、ＰＴＨによって仲介される種々の作用を分 別する６■能性を示すものであり、骨粗同庁のような骨の疾病の治療に対して大 きな重要性を持つ。

ＰＴＨレセプターをコードしている本発明の核酸は、また、選択された組織特異 的ブロモター及び／あるいはエンハンサ−に連鎖し、その結果生じた７％イブリ ッド遺伝子を、常法により（例えば、Ｌｅｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｕ、Ｓ、特 許番号４，７３６．８６６に記述され、ここには参照して組み込まれているよう な）、初期の分化段階にある動物の胚（例えば、受精した卵母細胞）に導入して 形質転換した動物を作り出し、選択した組織（例えば、骨のオステオカルシンブ ロモター）にＰＴＨレセプターを高レベルで発現することが出来る。この様なブ ロモターは、形質転換動物におけるＰＴＩＨレセプターの組織特異的発現を指令 するために用いられる。利用されるＰＴＨレセプターの型は、用いられる動物種 のものに類吋のＰＴＨレセプターをコードしている型、あるいは、それは、別種 のＰＴＨレセプター類自体をコードすることも出来る。１つの特例において、形 質転換されたニワトリが、ニワトリの輸卵管に高レベルの発現を指令するプロモ −ターからＰＴＨレセプターを発現するように工作された。このような動物は、 高いカルシウム含量と、従ってより固い殻を持つ卵を産むことが期待される。

他の実施態様 他の実施態様は、以下の特許請求の範囲内にある。例えば、本発明の核酸には、 トリ、あるいは有袋類、げっ菌類、または人類のような補乳類を含むいかなるを 椎動物種にせよ、これらから本来分離された遺伝子、あるいはｃＤＮＡあるいは ＲＮＡを包含する。オボッサム、ラット、及びヒトのような多様な動物種からの ＰＴＨレセプターに対して証明された高度の相同性は、ここに開示されたＰＴＨ レセプターの分離方法が、多様な動物種からの関連した細胞レセプターの分離に 広く応用されることを示唆している。

ＤＮＡ及びアミノ酸配列のコンピュータ寄託（１）一般情報 （ｉ）申請者　Ｓｅｇｒｅ、　Ｇｉｎｏ　Ｖ。

Ｋｏｒｎｅｎｂｅｒｇ、Ｈｅｎｒｙ　Ｍ。

Ａｂｏｕ−５ａｍｒａ、Ａｂｕｄｕｌ−ＢａｄｉＪｕｐｐｎｅｒ、Ｈａｒａｌｄ Ｐｏｔｔｓ、　Ｊｏｈｎ　Ｔ、、　Ｊｒ。

５ｃｈｉｐａｎｉ、Ｅｒｍｅｓｔｉｎａ（ｉ　ｉ）発明の名称：　副甲状腺ホル モンレセプター及びこれをコードしているＤＮＡ （ｉ　ｉ　ｉ）配列の数二　３ （ｉｖ）通信住所 （Ａ）受信者　Ｆｉｓｈ　＆　Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ（Ｂ）ａリ　２２５　Ｆｒ ａｎｋｌｉｎ　５ｔｒｅｅｔ（Ｃ）市　Ｂｏｓｔｏｎ （Ｄ）州　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（Ｅ）国　Ｕ、　Ｓ、　Ａ。

（Ｆ）郵便番号　０２１１０−２８０４（Ｖ）コンピュータの解読可能型 （Ａ）媒体タイプ二３．５′ディスケット、１．４４メガビツト記憶容量（Ｂ） コンピュータ：ＩＢＭ　ＰＳ／２　モデル　５０２あるいは５５Ｘ（Ｃ）作動系 ：　夏ＢＭ　Ｐ、Ｃ，ＤＯ５（バージａン３．３０）（Ｄ）ソフトウェア：　ワ ードパーフェクト（バージョン　５．０）（ｖｉ）現在の申請データ： （Ａ）申請番号： （Ｂ）提出日時： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）以前の申請データ （Ａ）申請番号：、　０７／６８１，７０２ＧＴＧ　ＣＣＣｋＴｃ　ＣＴ（ｉ　 ＧＣＡ　ＧＣＴ　ＡＴＴ　ＧＴＧ　ＣＴＣＡＡＣＴＴＴ　ｌｒＴ　ＧＴＴ　ｍ　 ＡＴｃ　ｋｋＴ　１２１X ＣＴＣＡＴｃａ　ＣＯＧ　Ｃ’ｒＡ　ＴＴＴ　ＧＧＧ　ＯＴＧ　ＣＡＣＴＡＣ八 τＣＧＴＩ：　ＴＴＣＡＴＯＯＣＣＡＣＧ　ＣＣＧ　１３６R ＡＴＯＣ’ＴＣＴＴＣＡＡＴ　ＴＣＡ　ＴＴＣＣＡＧ　ＣＧＡ　ＴＴＴ　ＴＴｃ 　ＧＴ’Ｔ　Ｇｅｅ　ＡＴＴ　ＡＴＡ　ＴＡＣＴＧＴ　１４T９ ＴＴＣＴＧＣｋｋＴ　ＧＧＡ　ＧＡＧ　ＧＴｋ　ＣＡＡ　ＧＣｋ　ＧＡＱ　ＡＴ Ｃ入ＡＧ　ＡＡＧ　ＴＣＡ　ＴＧＧ　ｋＧｃ　ＣＧｋ　１５O７ ＧＧＡ　ＣＣＴ　ＣＣＡ　ＧＧＧ　０４ｅ　’ｒＧＧ　ＣＣＴ　ＴＯＴ　ＣＣＯ ＴＣＡ　ＧＣＣＣＴＣＧＡＣ丁＾ＧＣＴＣＣＴＧＧ　１６５Q （２）配列確認番号　２　に対する情報。

（１）配列の特徴 （Ａ）長さ　１８６３ （Ｂ）タイプ　を炭酸 （Ｃ）鎖の状態、１本鎖 （ｐ）トポロジー、　線状 （ｘｉ）配列の記述：　５ＥＱＵＥＮＣＥ　ＩＤ　Ｎｏ：　２：ＴＧＣｗＧＣＡ ＣＡＧＣＣＡＣＣＣ？ＧＴ？ＣＧＴＡＧＴＣＣｋＧＧ　ＧＧＣＣＡＣＣＣＣＡ　 ＣＴＧＡＧＣＴＧＧＣｋＴｋＴＣ八ＧＣＴへ@６０ ＧＴＧＧＣＣＣＣＧＴ　ＴＧＧＡＣＴＣＧＧＣＣＣＴＡＧＧＧＡＡＣＧ６ＣＧＧ ＣＧ　ＡＴＧ　ＧＧＡ　ＧＣＧ　ＣＣＣＣＧＱ　ＡＴＣ１１T ＧＣＴ　ＧＴＡ　ＡＧＣＡＴＣＴＴＣＡＴＣＡＡＧ　ＧＡＴ　ＧＣＴ　ＧＴＧ　 ＣＴＣＴＡＣＴＣＧ　ＧＧＧ　ＧＴＴ　ＴＣＣＦ３コ５八ＣＡ　ＧＡＴ　ＧＡＡ 　ＡＴＣＧＡＣＣＧＣ入子ＣＡＣＣＣＡＧ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＡＣＧ　 ＧＣＣＴＴＣＡＣＡ　８８３ＧＡＧ　ＣＣ’Ｔ　ＣＣＣＣＣＴ　ＧＣＴ　ＧＡＣ ＭＧ　ＧＣＧ　ＧＧＴ　ＴＴＴ　ＧＴＧ　ＧＧＣＴＧＣＡＣＡ　ＧＴＧ　ＧＣＧ 　９コＩＧ丁＾　＾ｃｃａテＣＴＴＣＣ’！’Ｔ　丁＾ＣＴ丁ｃ　ＣＴｃ　八ｃ ｃ　八ｃｃ　入ＡＣＴ入Ｃ丁＾ｃ’ｒｃｃ　＾ＴＣＣ丁Ｃ９７９ＧＴＧ　ＧＡＡ 　ＧＧＣＣ’ｒＣＴＡＣ（ＴＴ　ＣＡＣｋＧＣＣＴＣＡＴＣＴ’ＴＣＡＴＯ００ 丁　？！’Ｔ　ＴＴＣＴＣＴ　１０２７（ＡＧ　ＡＡＡ　ｋ）Ｇ　ＴＡ？　ＣＴ ＣＴＧＧ　ＧＯＴ　ＴｒＣＡＣＡ　ＴＴＡ　ＴＴＴ　ＧＧＣＴＧＧ■ＣＣＴＣＣ Ｃ’Ｔ　１０７５ＧＣＣＧＴＧ　ＴＴＴ　ＧＴＣＧＣＴ　ＧＴＧ　ＴＧＧ　ＧＴ Ｇ　ＡＣＣＧＴＧ　ＡＧＧ　ＧＣＴ　ＡＣＡ　ＣＴＣＧＣＣＩＩＵＣ１１２３八 Ｃ’ｒ　ＧＡＧ　ＴＣＣＭ　ＧｋＣｍ　ＡＣＴ　Ｔｏｏ　ＧＧＧ　＾＾丁　入＾ Ｇ　ＡＡＡ　丁Ｃａ　ＡＴＣ＾τ＾　ＣＡＣＸｉミツ１　ＡＴＡ　ＡＴＣＡＧＡ 　ＧＴＣＣＮＸ　ＧＣＴ　ＡＣＴ　ＡＡＡ　ＣＴＣＣＧＯＯＡＧ　ｋｃｃ　ＡＡ Ｔ　ＧＣＡ　ＧＧＧ　ＡＧＡ　１Q６７ ＴＯＴ　ＧｋＣＡｃｅ　ｋＧＧ　ＣＡＡ　（ＪＧ　ＴＡＴ　ＡＧｊｋ　ＡＡＧ　 ａＴｃ　（？ＯＡＡＧ　ＴＣＣＡＣＣＣＴｋ　ＣＴＣ１３１T ＣＴＣ入ＴＯＣＣＯＣＴＡ　ＴＴＴ　ｃｃａ　ａＴｃ　ｃＡＣＴｉｃ　ＡＴＣＧ ＴＣＴＴＣＡＴＯＧＣＣＡＣＧ　ＣＣＧ　１３６３ＴＡＣ入ＣＡＧ入＾　ＧＴＡ 　ＴＣＡ　ＧＧＧ　ＡＴＴ　ｃＴ丁　ｔｃｃ　ｃλ＾　ＧτＣＣ＾Ａ　ＡＴＣＣ ＡＣＴＡＴ　Ｇ＾＾　１４１１＾Ｔｌ１ｉ　ＣＴＣＴＴＣ入ＡＴ　ＴＣＪｋ　ｆ ｆｃ　ＣＡ（ｉ　ＧＧＡ　ＴＴＴ　ＴＴＣＧ’ｌ”ｒ　ＧＣＣＡＴＴ　へ丁Ａ　 τ＾ＣＭ丁@１４５９ ＴＴＣＴＧＣへ人Ｔ　ＧＧＡ　Ｇ＾ａａτ＾　ＣＡＡ　ＣＣＡ　ＣＡＧ　ＡＴＣ 入＾Ｇ　λ＾ＧＴＣ＾　’ｒｃｃ　ＡＣＣＣＧＡ　１５０７ＧＧＡ　ＣＣＴ　Ｃ ＧＡ　ＧＧＯＧＧＧ　ＣＴＯＧＣＣＴＴＣＴＣＣＣＴＣ＾ＧＣＣＯＴ　ＣＧＡ　 ＣＴＡ　ＧＣＴ　Ｃ（ゴ　１６５１ｃｃｒ　ａｃｃ　入ＣＣ入＾＾　ＧＡＴ　Ｃ ＡＣＧＧＧ　ＴＡ’ｒ　ＣＴＣＡＡＴ　ＧＧＣＴＣＴ　ＧＧＡ　ＣＴＴ　ＴＡＴ 　ＧＡＧ　１７X５ ＣＣＡ　Ａ？’Ｃ０７丁　ＧＧＧ　ＣＡＡ　ＣＡＧ　ＣＣＣＣＣＴ　ＣＣＡ　Ｃ ＴＣＣＴＯＧＡＧ　ＧｋＱ　ＧＡＧ　ＡＣＡ　ＧＡＧ　１８S３ 人ＣＡ　ＧＴＣＡＴＧ　ＴＧＡＣＣＣＡＴＡＴ　Ｃ１８６３（２）配列確認番号 二　３　に関する情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：　２０５１ （Ｂ）タイプ：　核酸 （Ｃ）鎖の状態、２本鎖 （Ｄ）トポロジー：　線状 （ｘ　ｉ　）　配列（’）Ｈａ述：　５ＥＱＵＥＮＣＥ　ＩＤ　Ｎｏ：　３：Ｃ ＴＡ　ＣＴＣＴＧＣＴＧＣＣＣｋ　ＧＴＧ　ＣＴＣｋＧＣＴＣＣＧＣＡ　ＴＡＴ 　ＧＣＱ　ＣＴＣＧＴｌｆｆ　ＯＡＴ　ＧＣＧ　１５６ＧＡＣＧＡＴ　ＣＴＣｆ ｆｒ　ＡＣＣＡＡＡ　Ｇ＾ＧＧλ＾　ＣＡＧ　Ａｆｆｉ　ＴＴＣＣ’ｒＧ　ＣＴ Ｇ　ＣＡ（！　ＣＧＴ　ＧＣＣ２０S ＾ＡＣＡＴＡ　Ａ丁Ｃａ＾Ｇ　τＯＣＡＣＡＡＧ　（ＪＣＴＧＣＡＣＡ　ＣＣＡ 　ＧＣＡ　ＴＣＴ　Ａｃｅ　ＴＣＡ　（ａ）　３００ＡＡＧ　ＣＣＣｋＧＧ　Ａ ＡＡ　ＧＭｉ　ＡＡＱ　ＧＣｋ　ＴＣＧ　（４Ａ　ｋｋＧ　ＴＴＣＴＡＣＣＣＴ 　ＧＡＣＴＣＴ　ｍ　３４８ＧＡＣ入ＡＣＡＡＧ　ＧＡＣＧＴＯＣＣＣＡＣＣＧ ＯＣＡＧＣ入ＧＧ　ＣＧＣ曳（ｉＡ　ＧＧＯＣＧＴ　ＣＣＣ７０丁　３９６ＣＴ Ｇ　ＣＣＣＧＡＩｆｆ　ＴＧＧ　ＧＡＣ入＾ＣＡＴＣＧＴＴ　ＴＧＣＴＧＧ　Ｃ ＣＡ　Ｔ”＋＾　ＧＧＧ　ＧＣＡ　ＣＣＡ　００丁　４S４ Ｇｕ　ＧＴＧ　ＧＴＧ　ＧＣＪｋ　ＧＴＡ　ＣＣＴ　ＴＣｉＴ　ＣＣＣＧＡＴ　 ＴＡＣＡＴＴ　丁ＡＴ　ＧＡＣｆｆｃ　ＡＡＴ　ＣＡＣ４９Q ＡＭ　ＣＡＣＣＡＴ　ＧＣＣＴＡＣＡＣＡ　ＣＧＣＴＧＴ　ＧＡＣＣｆｆＣＡＡ Ｔ　ＣＧＣＡＧＣＴＧＧ　ＧＡＧ　ＧＴＧ　５４０ＧＡＧ　ＡＡＧ　入ＡＧ　Ｔ ＡＣＣＴＧ　ＴＯＧ　ＧＧＣＴＴＣＡＣＣＡＴＣｍ　ＧＧＣＴＧＧ　ＧＧＴ　Ｃ ＴＡ　ＣＣＧ　１０６８Ｃ’ＴＣＧＴＧ　ＣＣＧ　ＣＴＣ′！＋ｒＴ　ＧＧＴ　 ＣＴＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＧＴＣＴＴＣＡＴＯＧＣＣ’ｒＴｏ　ＣＣＯ１３５６ ＴＡＣＡｃｅ　ＧＡＧ　ＣＴＣ丁ＣＡ　ＧＧＧ　Ａ（Ｊ　ＴＴＧ　ＴＧＧ　ＣＡ Ｇ　ＡＴＣＣＡＧ　ＡＴＯＣＡＴ　ＴＡＴ　ＱＡＧ　１４０S ＾τＧ　ＣＴｅ　’！？ＣＡＡＣＴＣＣＴＴＣＣＡＯＧＧＡ　ＴＴＴ　７７丁　 ＣＴＴ　ＧＣＣＡＴＣＡＴＡ　丁ＡＣＴＣＴ　１４％２ＴＴＣＴＧＣＡＡＴ　Ｇ ＧＴ　ＧＡＧ　ＧＴＯＣＡＧ　ＧＣＡ　ＧＡＧ　ＡＴＴ　ＡＧＯＡＡＧ　ＴＣＡ 　’ＮＡ　ＡＣＣＣＧＣ１５００ＴＧＧ　ＡＣＡ　ＣＴＣｅ　’ｒＴＱ　ＧｋＣ 茸ｅ入ｋＧ　ＣＣＣＡＡＡ　ＧＣｋ　ＣＯＡ　ＡＧＴ　ＧＯＩＩＩ　ＡＧＴ　Ａ ＧＣ１５４８ＡＧＣＴＡＣＡＧＣＴＡＴ　％ＣＣＣＡ　ＡＴＣＧＴＧ　ＴｃＴＣ ＡＣＡＣＧ＾Ｇ？引℃＾ＣＣＡＡＴ引ｍ　１５９６ＧＧＣＣＣＣＣＧＴ　ＧＣＡ 　ＧＧＡ　ＣＴＣ入ＧＣＣＴＣＣＣＣＣＴＣＡＣＣＣＣＣＣＧＣＣＴＣＣＣＴ　 ＣＣＴ　１６４４ＡＣＡ　ＧＴＣＡＴＯＴＯ＾ｎｃＡ　ＣＴＡＧＧＧＧＣＣＴ　 ＡＣＡＣＴＧＣＴＧＧ　ＣＣ’ｒＧＧＯＣＡＣＡ　１８８５請求されているもの は以下の通りであるＦＩＧ、　Ｉ ＴｃｃｃｃＡｃＡｃｃ　ＣＡＣＣ’：ＴにＴ’ｒＧ　ＧＴＡＧＴＣＣＡＧＧ　ｃ ｃｃｅｘｃｃｃｃｘ　ｃｒｃ＾−ｃ　ＡＴＡＴＣＡＧＣ’ｒf　：ｕ ＴτＣ【 Ｆ！６１ ＧＧＣτ５ＳＡＧＣＣＡＧＴＳ：；λλＴＯ’；ＣＣλＴＣＡ：：＾　Ｃフτり ＣごｓＧａ　τλＴＣフＣλＡＧＣλ’ｒｃｃ’ズーｒ（：bＡＴ　ｌ？’−二 ′ｖ：ｃ＋＋＝６ｓＡＡｃ　＝Ｃ，、’ｒ＝＝ニー＋＋　：、”ｑｒｃ’＝＝＝ ：：：　、’５ｃａｃＣ：）ＳＧＣ入ＣＣＡＡＪＧＡ？ＣλモfＧＧＴｋＴｃＴ 　１７−： ：λＡＴＣＳ、：？ｒ　ＳＳ；、：Ａｒｃ　ＡＧＣＣＡＡＴＣＳフ　”、ＳＧＧ ：ａλλＣＡＧ　こ；：；；τ：＝ＣτＣＣフＣＧＡＧＧＡ@１３２二 ＧＧＡＧＡＧλＣ入ＧλＣλＧＴＣλτＣＴＣλＣαスＴλτ：　１８６２ＦＩ Ｃ，２ ＣＡＧ　ＧＣＡ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＴＣＣＡＧＧ　ＧＡＡ　ＧＴＴ　τστ　Ｇ ＡＣＡ１４　人ＧＣＣＧＧ　Ｃｍ　（ＪＧ　ＧＡＴ　４０３Ｇｉｎ　入１ａ　Ｇ ｎｕ　Ｇｌｕ　５自ｒ　入ｒｑ　Ｇｌｕ　！、’＆ｉ　ミ＠ｒ　ｘｓｐ　入ｒｇ 　Ｓａｒ　入ｑ　ｕｕ　Ｇｉｎ　Ｍｐ９０　÷５　１ｏ。

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Claims (48)

【特許請求の範囲】
1. １．脊椎動物の細胞レセプターをコードしているＤＮＡ配列からなる分離された ＤＮＡであって、前記レセプターが、図３に示されているアミノ酸配列に少なく とも３０％の同一性を持つアミノ酸配列を持つことを特徴とする方法。
2. ２．請求項１に記載されている分離されたＤＮＡであって、前記ＤＮＡ配列が図 １に示されているアミノ酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１）の本質的にすべてを コードしていることを特徴とする方法。
3. ３．請求項１に記載されている分離されたＤＮＡであって、前記ＤＮＡの配列が 図３に示されているアミノ酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．３）の本質的にすべて をコードしていることを特徴とする方法。
4. ４．請求項１に記載されている分離されたＤＮＡであって、前記分離されたＤＮ Ａが（８Ａ６）であって、ＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号６８５７０と 呼ばれていることを特徴とする方法。
5. ５．請求項１に記載されている分離されたＤＮＡであって、前記ＤＮＡの配列が 図６に示されているアミノ酸配列（ＳＥＱ．ＩＤ　ＮＯ．４）の本質的にすべて をコードしていることを特徴とする方法。
6. ６．請求項１に記載されている分離されたＤＮＡであって、前記ＤＮＡの配列が 図１に示されているＤＮＡ配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１）とハイブリッドを形 成することを特徴とする方法。
7. ７．請求項１に記載されている分離されたＤＮＡであって、前記ＤＮＡの配列が 図３に示されているＤＮＡ配列（ＳＥＷ　ＩＤ　ＮＯ．３）とハイブリッドを形 成することを特徴とする方法。
8. ８．請求項１に記載されている分離されたＤＮＡであって、前記ＤＮＡの配列が 図６に示されているＤＮＡ配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．４）とハイブリッドを形 成することを特徴とする方法。
9. ９．ベクターの精製標品であって、前記ベクターが副甲状腺ホルモンレセプター をコードしているＤＮＡ配列からなることを特徴とする方法。
10. １０．請求項１に記載されている分離されているＤＮＡを含む細胞であることを 特徴とする方法。
11. １１．請求項１０に記載されている細胞であって、前記細胞が前記の分離されて いるＤＮＡから上記細胞レセプターを発現する能力のあることを特徴とする方法 。
12. １２．本質的に均質な細胞群であって、その各々が請求項１に記載されている分 離されたＤＮＡを含むことを特徴とする方法。
13. １３．分離されたＤＮＡが、副甲状腺ホルモンあるいは副甲状腺ホルモン関連蛋 白質を結合することの出来るポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列からなる ことを特徴とする方法。
14. １４．ポリペプチドを生成する方法で、前記方法が以下のことからなることを特 徴とする： 副甲状腺ホルモンレセプターあるいはその断片をコードしている分離されたＤＮ Ａを含む細胞を提供する方法、及び前記ＤＮＡからポリペプチドの発現を可能に する条件下に前記細胞を培養する方法。
15. １５．副甲状腺ホルモンレセプター遺伝子の１部からなる１本鎖ＤＮＡであって 、前記部分が少なくとも１８核酸の長さであることを特徴とする方法。
16. １６．請求項１５に記載されている１本鎖ＤＮＡであって、前記部分が前記副甲 状腺ホルモンレセプター遺伝子のすべてよりも短いことを特徴とする方法。
17. １７．請求項１５に記載されている１本鎖ＤＮＡであって、上記ＤＮＡが標識さ れて検出可能であることを特徴とする方法。
18. １８．副甲状腺ホルモンレセプターｃＤＮＡの１部からなる１本鎖ＤＮＡであっ て、上記部分が少なくとも１８ヌクレオチドの長さであることを特徴とする方法 。
19. １９．請求項１８に記載されている１本鎖ＤＮＡであって、前記ＤＮＡがアンチ センスであることを特徴とする方法。
20. ２０．副甲状腺ホルモンレセプターをコードしている組換えＤＮＡ分子の発現に よって生成される副甲状腺ホルモンレセプターを特徴とする方法。
21. ２１．請求項２０に記載されている副甲状腺ホルモンレセプターの本質的に精製 された標品を特徴とする方法。
22. ２２．請求項５に記載されているＤＮＡの発現によって、生成される副甲状腺レ セプターの本質的に精製された標品を特徴とする方法。
23. ２３．少なくとも６個のアミノ酸、そして副甲状腺ホルモンレセプターの完全な アミノ酸配列よりは少ないアミノ酸からなるポリペプチドであって、上記ポリペ プチドが副甲状腺ホルモンあるいは副甲状腺ホルモン関連蛋白質を結合出来るこ とを特徴とする方法。
24. ２４．請求項２３に記載されでいるポリペプチドであって、上記副甲状腺ホルモ ンレセプターがヒト副甲状腺レセプターであることを特徴とする方法。
25. ２５．請求項２３に記載されているポリペプチドであって、上記断片が以下のも のからなることを特徴とする方法。 （Ａ）ＴＮＥＴＲＥＲＥＶＦＤＲＬＧＭＩＹＴＶＧ、（ｂ）ＶＬＹＳＧＦＴＬＤ ＥＡＥＲＬＴＥＥＥＬ、（ｃ）ＶＴＦＦＬＹＦＬＡＴＮＹＹＷＩＬＶＥＧ、（ｄ ）Ｙ−ＲＡＴＬＡＮＴＧＣＷＤＬＳＳＧＨＫＫＷＩＩＱＶＰ、（ｅ）ＰＹＴＥＹ ＳＧＴＬＷＱＩＱＭＨＹＥＭ、（ｆ）ＤＤＶＦＴＫＥＥＱＩＦＬＬＨＲＡＱＡ、 （ｇ）ＦＦＲＬＨＣＴＲＮＹ、 （ｈ）ＥＫＫＹＬＷＧＦＴＬ、 （ｉ）ＶＬＡＴＫＬＲＥＴＮＡＧＲＣＧＴＲＱＱＹＲＫＬＬＫ、あるいは（ｊ） 副甲状腺ホルモンあるいは副甲状腺ホルモン関連蛋白質を結合出来る（ａ）から （ｉ）の断片。
26. ２６．製剤上許容される担体中に、（ａ）副甲状腺ホルモンレセプターあるいは （ｂ）上記レセプターの断片からなるポリペプチドを含む治療混合物を特徴とす る方法。
27. ２７．副甲状腺ホルモンレセプターと免疫複合体を形成することが出来る抗体を 特徴とする方法。
28. ２８．請求項２７に記載されている抗体と製剤上許容される担体からなる治療混 合物を特徴とする方法。
29. ２９．動物の血中カルシウムレベルを低減する方法であって、請求項２６に記載 されている治療混合物を、上記動物に、副甲状腺ホルモンあるいは副甲状腺ホル モン関連蛋白質による、上記動物の副甲状腺ホルモンレセプターの活性化の阻害 に効果的な用量で投与することからなることを特徴とする方法。
30. ３０．動物の血中カルシウムレベルを低減する方法であって、請求項２８に記載 されている治療混合物を、上記動物に、副甲状腺ホルモンあるいは副甲状腺ホル モン関連蛋白質による、上記動物の副甲状腺ホルモンレセプターの活性化の阻害 に効果的な用量で投与することからなることを特徴とする方法。
31. ３１．副甲状腺ホルモンレセプターへの結合に対し、副甲状腺ホルモンと競合す る能力のある化合物を確認する方法であって、該方法が以下の内容からなること を特徴とする： （ａ）請求項２３に記載されているポリペプチドを副甲状腺ホルモンと、候補化 合物の（ｉ）存在下あるいは（ｉｉ）非存在下に接触させる、及び（ｂ）上記候 補化合物の存在下における上記ポリペプチドの副甲状腺ホルモンヘの結合レベル （ｉ）を、上記候補化合物の非存在下における上記ポリポリペプチドの副甲状腺 ホルモンヘの結合レベル（ｉｉ）と比較する；上記候補化合物の存在下における 結合レベルが、その非存在下よりも低い場合は、上記候補化合物は上記レセプタ ーへの結合に対し、上記副甲状腺ホルモンと競合する能力のあることを示唆する 。
32. ３２．副甲状腺ホルモンレセプターへの結合に対し、副甲状腺ホルモン関連蛋白 質と競合する能力のある化合物を確認する方法であって、該方法が以下の内容か らなることを特徴とする： （ａ）請求項２３に記載されているポリペプチドを副甲状腺ホルモン関連蛋白質 と、候補化合物の（ｉ）存在下あるいは（ｉｉ）非存在下に接触させる、及び（ ｂ）上記候補化合物の存在下における上記ポリペプチドの副甲状腺ホルモン関連 蛋白への結合レベル（ｉ）を、上記候補化合物の非存在下における上記ポリペプ チドの副甲状腺ホルモン関連化合物への結合レベル（ｉｉ）と比較する；上記候 補化合物の存在下における結合レベルが、その非存在下よりも低い場合は、上記 候補化合物は上記レセプターへの結合に対し、上記副甲状腺ホルモン関連蛋白質 と競合する能力のあることを示唆する。
33. ３３．副甲状腺ホルモンレセプターへの結合に対し、副甲状腺ホルモンと競合す る能力のある化合物を確認する方法であって、該方法が以下の内容からなること を特徴とする： （ａ）副甲状腺ホルモンを請求項１１に記載されている細胞と、候補化合物の（ ｉ）存在下あるいは（ｉｉ）非存在下に組み合わせる、及び（ｂ）上記候補化合 物の存在下における上記副甲状腺ホルモンヘの上記レセプターの結合レベル（ｉ ）を、上記候補化合物の非存在下における上記副甲状腺ホルモンヘの上記レセプ ターの結合レベル（ｉｉ）と比較する；上記候補化合物の存在下における結合レ ベルが、その非存在下よりも低い場合は、上記候補化合物は上記レセプターへの 結合に対し上記副甲状腺ホルモンと競合する能力のあることを示唆する。
34. ３４．副甲状腺ホルモンあるいは副甲状腺ホルモン関連蛋白質の細胞表面上の副 甲状腺レセプターへの結合を阻害する能力のある化合物を特徴とする方法。
35. ３５．請求項３４に記載されている化合物と製剤上許容される担体からなる治療 混合物を特徴とする方法。
36. ３６．副甲状腺ホルモンレセプターをコードしているＤＮＡ配列に相同なＤＮＡ 配列を確認する方法であって、該方法が以下の内容からなることを特徴とする： ゲノムあるいはｃＤＮＡライブラリーを提供し；上記ライブラリーを請求項１８ に記載されている１本鎖ＤＮＡと、上記１本鎖ＤＮＡ及び上記ライブラリー中の 相同ＤＮＡ配列間にハイブリッド形成が可能なような条件下に接触させ；及び 上記ライブラリーから、上記１本鎖ＤＮＡとハイブリッドを形成しているクロー ンを割り出し確認する。そして、ハイブリッド形成は、上記クローンの中に、副 甲状腺ホルモンレセプターをコードしているＤＮＡ配列に相同なＤＮＡ配列の存 在することを示唆する。
37. ３７．副甲状腺ホルモンレセプターあるいはその断片をコードしているＤＮＡ配 列からなるトランス遺伝子を持つ形質転換されたヒト以外の脊椎動物を特徴とす る方法。
38. ３８．以下の内容からなる診断法を特徴とする方法：（ａ）動物から１回目の血 液試料を取り；（ｂ）請求項３５に記載されている混合物を上記動物に投与し； （ｃ）上記混合物の上記投与のあとに上記動物から２回目の血液試料を取り；（ ｄ）上記１回目の血液試料中のカルシウムレベルを上記２回目の血液試料中のも のと比較し、上記２回目の血液試料中のカルシウムレベルの方が低い場合は、副 甲状腺ホルモン関連の状態をの診断に役立つ。
39. ３９．請求項１に記載されている分離されたＤＮＡであって、上記ＤＮＡの配列 が副甲状腺ホルモンレセプターをコードしていることを特徴とする方法。
40. ４０．請求項２０に記載されている副甲状腺ホルモンレセプターを治療及び診断 に用いることを特徴とする方法。
41. ４１．請求項２３に記載されているポリペプチドを治療及び診断に用いることを 特徴とする方法。
42. ４２．請求項２７に記載されている抗体を治療及び診断に用いることを特徴とす る方法。
43. ４３．請求項２６に記載されている治療混合物を、副甲状腺ホルモンあるいは副 甲状腺関連蛋白質による動物の副甲状腺ホルモンレセプターの活性化を阻害する ための、あるいは、動物の血中カルシウムレベルを低減するための治療に用いる ことを特徴とする方法。
44. ４４．請求項２８に記載されている治療混合物を、副甲状腺ホルモンあるいは副 甲状腺関連蛋白質による動物の副甲状腺ホルモンレセプターの活性化を阻害する ための、あるいは、動物の血中カルシウムレベルを低減するための治療に用いる ことを特徴とする方法。
45. ４５．請求項２０に記載されている副甲状腺ホルモンレセプターを、副甲状腺ホ ルモンあるいは副甲状腺ホルモン関連蛋白質による動物の副甲状腺ホルモンレセ プターの活性化を阻害するための、あるいは、動物の血中カルシウムレベルを低 減するための治療に用いる薬剤の製造に利用することを特徴とする方法。
46. ４６．請求項２３に記載されているポリペプチドを、副甲状腺ホルモンあるいは 副甲状腺ホルモン関連蛋白質による動物の副甲状腺ホルモンレセプターの活性化 を阻害するための、あるいは、動物の血中カルシウムレベルを低減するための治 療に用いる薬剤の製造に利用することを特徴とする方法。
47. ４７．請求項２７に記載されている抗体を、副甲状腺ホルモンあるいは副甲状腺 ホルモン関連蛋白質による動物の副甲状腺ホルモンレセプターの活性化を阻害す るための、あるいは、動物の血中カルシウムレベルを低減するための治療に用い る薬剤の製造に利用することを特徴とする方法。
48. ４８．患者における副甲状腺ホルモンあるいは副甲状腺ホルモン関連蛋白質によ って仲介される高カルシウム血症状態を確認する方法であって、該方法が以下の 内容からなることを特徴とする方法： （ａ）患者からの１回目の血液試料中のカルシウムレベルを測定し、（ｂ）請求 項２８に記載されている治療混合物の投与後のある時期に患者から採取された２ 回目の血液試料中のカルシウムレベルを測定し、（ｃ）２つの血液試料のカルシ ウムレベルを比較して、２回目の血液試料中のカルシウムレベルの方がより低い 場合は、患者に副甲状腺ホルモンあるいは副甲状腺ホルモン関連蛋白質に関係の ある状態のあることを示唆する。