JP3280035B2 - 生物学研究、医療診断および治療用の分光生物撮像法、蛍光交配方法および細胞分類方法 - Google Patents

生物学研究、医療診断および治療用の分光生物撮像法、蛍光交配方法および細胞分類方法

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野及び背景 本発明はスペクトル法に関し、さらに詳しくは、生物
学研究、医療診断および治療用の分光撮像（イメージン
グ）法に関し、以下、この方法を分光生物撮像法と称す
る。本発明に係る方法は、空間的な構成（すなわち、分
布）を検出したり、細胞および組織の自然組成、構造、
器官および同位体トレーサープローブ（例えば、蛍光プ
ローブ）のような処理コンポーネント、並びに光透過、
反射、散乱および発光を利用する薬剤等を、高い空間お
よびスペクトル解像度で計量したりするために用いるこ
とができる。
分光計は、光を受光してその成分波長に分離（分散）
させ、波長を関数とする光の強度である光スペクトルを
測定するために設計された装置である。撮像（イメージ
ング）分光計は、対象から射出される光集めて各ピクセ
ル（画素）のスペクトルを測定する装置である。
分光学は、化学成分のスペクトル特性に基づいて材料
およびプロセスを特徴付けるために、科学および産業分
野において何十年も用いられてきている周知の分析ツー
ルである。分光学の物理的原理は、光と物質との相互作
用である。伝統的に、分光学は、サンプルからの射出
光、透過光、散乱光および反射光の強度を、波長の関数
として、高いスペクトル解像度で、測定するものである
が、空間的な情報は有していない。
一方、高い解像度の分光学と高い解像度の撮像法（す
なわち、空間情報）との合成である分光撮像（スペクト
ル撮像）法は、生物サンプルの解析には用いられていな
い。現在の所で最も近いものとしては、限られたスペク
トル情報のみを提供しつつ生物サンプルから高い空間解
像度の情報を得る物があるだけであり、このようなもの
の例として、一つもくしはいくつかの独立したバンドパ
スフィルターを用いて高い空間解像度の撮像を行うもの
がある（Andersson−Engels等による「Proceedings of
SPIE−Bioimaging and Two−Dimensional Spectroscop
y,1205,pp.179−189（1990）」参照）。また、サンプル
のいくつかの点もしくはサンプル全体の平均に限って高
い空間的な解像度（例えば、全スペクトル）を得るもの
もある（Alfano等による米国特許第4,930,516号参
照）。
以下に詳細に説明するように、分光学と撮像法とを組
み合わせることは、様々な生物学的研究および医学的用
途に有用である。一例を挙げれば、蛍光プローブで分類
（トレース）された後において、特定の細胞組成（例え
ば、蛋白質、核酸配列）の検出がある。このように分光
撮像法は、一回の測定でいくつかの蛍光体を特定し同時
にその分布を特定するために用いることができる。実
際、分光撮像法に固有の高い解像度は、重なり合うスペ
クトル領域を有した蛍光プローブ（もしくはその他の化
学成分）を分類するのに適している。同様に、分光撮像
法は、像のどの位置であっても、サンプルの環境的な不
均一性（例えば、pH等）により生じる微妙なスペクトル
シフトの検出も可能である。
概念上は、分光生物撮像システムは、（１）計測シス
テムと、（２）解析ソフトウェアとからなる。計測シス
テムは、光学および電子工学の全てを有し、サンプルの
照明態様（例えば、光源の選定）、測定モード（蛍光発
光もしくは透過）から、測定結果から所望の結果を抽出
するのに最適な校正までを含む。解析ソフトウエアは、
重要な結果を有意義な方法で解析し且つ表示するために
必要な全てのソウトウエアおよび数学的なアルゴリズム
を含む。
分光撮像法は、スペクトル吸収特性を識別して、地球
および他の惑星の内部研究を遠隔検査する分野におい
て、何十年にわたって用いられてきている。しかしなが
ら、遠隔検査式の分光撮像システム（例えば、ランドサ
ット、AVIRIS）は、コストが高く、大型且つ複雑な構成
であるため、その用途は航空および衛星用に限定されて
いる（MaymonおよびNeeck（1988）による「Proceedings
of SPIE−Recent Advances in Sensors,Radiometry an
d Data Processing for Remote Sensing」,924,pp.10−
22;Dozier（1988）による「Proceedings of SPIE−Rece
nt Advances in Sensors,Radiometry and Data Process
ing for Remote Sensing,924,pp23−30等を参照された
い）。
分光生物撮像システムと見なされる三つの基本的なタ
イプのスペクトル分散法がある。それは（ｉ）スペクト
ル格子法、（ii）スペクトルフィルター法および（ii
i）光学干渉分光法である。後述するように、光学干渉
分光法は本発明の方法を行うのに最適である。
例えば、DILORシステム（Valisa等（1995年９月）に
よるthe SPIE Conference European Medical Optics We
ek,BiOS Europe '95,スペイン バルセロナでの発表参
照）のように、スリットタイプの撮像分光計として良く
知られている格子分光（すなわち、モノクロメーター）
に基づくシステムにおいては、CCDアレイ検出器の一つ
の軸（空間軸）のみが実際のイメージデータを提供し、
第２軸（スペクトル軸）は、波長の関数として格子によ
って分散される光の強度をサンプリングするために用い
られる。このシステムはまた第１の焦点平面にスリット
を有し、どの時間においても視界をピクセル線に限定し
ている。このため、この方法では、入力ビームをCCDの
スペクトル軸に平行な方向に走査、すなわち、ライン走
査して初めて全体像を得ることができる。全ての計測が
完了する前には二次元イメージを得ることができないた
め、測定前に、計測領域内で所望の領域を選択したり、
システム焦点を最適化したり、露出時間を最適化したり
することはできない。格子分光に基づくスペクトルイメ
ージは遠隔計測用途では一般的に用いられている。これ
は、地球の上を飛行する航空機（もしくは衛星）は自然
なライン走査機構システムを有するからである。
スリットタイプ撮像分光計は、計器の前面側光学系に
より全ピクセルに同時に光を集めたとしても、一つのフ
レーム上のピクセルで測定される時間は同時ではないと
いう大きな欠点を有する。このため、所定のS/N比で必
要な情報を得るには比較的長い計測時間が必要であり、
逆に所定時間の測定ではS/N比（感度）はそれだけ低く
なる。さらに、スリットタイプの撮像分光器は、全画面
についての必要情報を集めるにはライン走査が必要であ
るため、測定結果精度は低下しやすい。
フィルターを用いるスペクトル分散法はさらに、独立
フィルターとチューナブルフィルターとに分類できる。
これらのタイプの撮像分光器においては、スペクトルイ
メージは、光路内に狭いバンドパスフィルターを挿入し
て、異なる波長毎に、且つ各時間毎に、画面内の全ピク
セルに照射される光にフィルターをかけて画像を得た
り、AOTFもしくはLCTF（下記参照）を用いて電気的に波
長域を走査して得られる。フィルターベーススペクトル
分散法を用いても、上述した格子を用いてスリットタイ
プの撮像分光計と同様に、各時間においては照射光の大
部分は用いられない。実際、測定される波長以外の光子
は全てはねられてCCDに到達しないので、特定の波長の
全体像が測定できるだけである。
音響−光学チューナブルフィルター（AOTFs）および
液晶チューナブルフィルター（LCTFs）のようなチュー
ナブルフィルターは可動部材を有しておらず、これらが
装着される装置のスペクトルレンジにおける任意の波長
にチューンすることができる。分光撮像分散法としてチ
ューナブルフィルターを用いる利点の一つは、任意に波
長を選択できること、すなわち、フィルターホイールを
用いることなく、任意の順序で多くの波長での強度分布
イメージを測定できる能力である。しかしながら、AOTF
sおよびLCTFsは、（ｉ）スペクトルレンジが限られ（例
えば、λmax＝２λmin）、このレンジ外の光は全て遮断
されなければならない、（ii）温度に敏感である、（ii
i）透過率が低い、（iv）偏光性がある、（ｖ）AOTFsの
場合には波長走査中にイメージシフト効果があるという
欠点を有する。
このようなフィルターおよびチューナブルフィルター
ベースのシステムは全て、スペクトル解像度に限界があ
り、感度が低く、簡便性に欠け、データの変換および表
示のためのソフトウエアアルゴリズムが複雑であるた
め、どのような用途においても分光撮像としては長年に
わたって継続して且つ広範囲にわたって用いられるもの
ではなかった。上述のように、本発明の発明者は、光干
渉型撮像分光計およびここで提案されているような解析
および表示アルゴリズムを用い、生体臨床医学に適用で
きる高解像度の撮像系と組み合わされた高解像度の分光
学について述べた文献を全く発見できなかった。但し、
上述したように、高解像度の撮像系と組み合わされた低
解像度および低感度の分光計や、サンプルの一カ所もし
くは数カ所についての高解像度の分光計についてある程
度研究した文献や、特許は見つかった。例えば、（１）
細胞遺伝研究に関して:Ried（Jan.1994）Fluoreszenz i
n situ Hybridizierung in der genetischen diagnosti
k,Faculty of theoretical medicine,Ruprecht−Karls
University Heidelberg、（２）細胞内の薬剤分布に関
して:Manfait and Charonov（1995）Fluorescence spec
tral imaging:State of the art and perspectives.″A
FC CYTOMETRIE '95,Reims,France,Sep.27th−29th,1995
において発表、（３）組織ガン検診に関して:Alfano et
al.による米国特許第4,930,516号;Andersson−Engels
（1990）Proceedings of SPIE,Bio−imaging and Two−
Dimentional Spectroscopy,1205,pp.179−189、およびP
itris et al.（1995）,Paper presented at European B
iomedical Optics Week by SPIE,12−16 September 199
5,Barcelona Spain、（４）細胞レベルにおけるガンの
特性表示に関して:Wied et al.（1981）Computer Discr
imination of Ectocervical Cells,The International
Academy of Cytology Analytical and Quantitative Cy
tology,Vol.3,p.225、（５）眼科学に関して:Delori（1
995）Appl.Optics Vol.27,1113,1988およびAppl.Optic
s,Vol.28,1061,並びにスリットカメラおよび蛍光血管造
影に関するその他の文献、例えば、Delori et al.（198
0）Vision Research,Vol.20,1099等がある。
しかしながら、これら文献および特許は、使用される
ハードウエアという観点において本発明とは異なる。こ
のハードウエアとは、高い空間およびスペクトル解像度
が得られる組み合わせ、結果を解析し表示するために用
いられるアルゴリズム、そして最後に、細胞および／も
しくは組織レベルにおいて診察医、研究者もしくは外科
医に与える化学生理および病理的な兆候等である。
上記の点で優れている画像のスペクトル解析用の方法
および装置が、1995年２月21日出願のCabib等による米
国特許出願第08/392,019号に開示されている。なお、こ
の特許出願は、画像のスペクトル解析用の装置および方
法を提供するために、全て本件出願の内容として取り込
まれる。この装置および方法によれば、画像からの射出
光を集めて得られる全情報を有効に利用して、従来のス
リットタイプもしくはフィルタータイプの画像スペクト
ルメーターに比べて、フレーム時間を大きく低減しさら
に／もしくはS/N比を大きく向上させ、さらにライン走
査を含まない。本発明によれば、各ピクセルのスペクト
ル強度を求め、対象の光学イメージを解析する方法が提
供される。このため、対象からの射出光を集め、各ピク
セルからの射出光のスペクトル強度をリニアに集めた所
定セットに対応して、調整された光を出力させる干渉計
を通過させ、この干渉計からの光を検出器アレイの上に
集め、全ピクセルについて独立して且つ同時に光干渉計
において作られた光路差（OPD）を走査検出し、検出器
アレイの出力（全ピクセルそれぞれの干渉像）を処理し
て各ピクセル毎のスペクトル強度を求める。この方法は
様々なタイプの干渉計を用いて実行され、この場合、干
渉計全体、干渉計内の一要素もしくは入射光の入射角を
変動させてOPDが変えられて干渉像が作られる。これら
全ての場合において、スキャナーが干渉計の一回の走査
を完了すると、画面に全ピクセルの干渉像が完成する。
上記の特性を有した装置は、上述のように干渉計を用い
ていることにより、従来のスリットタイプもしくはフィ
ルタータイプの画像スペクトルメーターと異なり、この
ため、集めたエネルギーを小孔もしくはスリットに限定
したり、干渉もしくはチューナブルフィルターにより狭
い波長域に限定したりすることがなく、その結果、シス
テム全体としてのスループットが向上する。このように
干渉計ベースの装置は、解析すべき対象からの射出光か
ら得られる全情報を有効に利用でき、測定時間を大幅に
低減させさらに／もしくはS/N比（すなわち、感度）を
大幅に向上させる。例えば、John B.Wellman（1987）Im
aging Spectrometers for Terrestrial and Planetary
Remote Sensing,SPIE Proceedings,Vol.750,p.140に述
べられている″whisk broom″を考えてみる。ここで、
ｎをリニアアレイにおける検出器の数とし、ｍ×ｍをフ
レーム内のピクセル数とし、Ｔをフレーム時間とする。
一つのフレームにおける各ピクセルの使用時間を検出器
アレイ全部について合計した時間は、nT/m2である。米
国特許出願第08/392,019号に開示の発明に係る方法の場
合には、同一サイズのアレイで同一のフレームレートを
用いれば、特定のピクセルについて全検出器の合計使用
時間は、nT/m2である。しかしながら、従来の格子法に
おいては各時間において全検出器によって見られるエネ
ルギーは、波長解像度がそのレンジの1/nであるので、
全エネルギーの1/nのオーダーとなる。これに対して、
米国特許出願第08/392,019号に開示の発明に係る方法の
場合には、モジュレーティング関数がラージOPDレンジ
についての平均が50％となる振動関数（例えば、ファブ
リペロ:Fabry−Perotを有した低フィネスエアリー関数
（low finesse Airy function）のようなシヌソイド（M
ichelson）もしくはこれと同様の周期的な関数）である
ので、１のオーダーとなる。干渉学の教科書（例えば、
Chamberlain（1979）The peinciples of interferometr
ic spectroscopy,John Wiley and Sons,pp.16−18 and
p.263参照）に述べられているFellgett効果（もしくは
多重効果）の標準処理に基づけば、本発明に係る装置
は、ノイズレベルが信号からは独立しているというノイ
ズ制限条件（システムもしくはバックグラウンドノイズ
が限定される条件）においては、ｎ0.5のファクターで
改善され、且つ、前記制限が信号光子ノイズにより生じ
る場合での狭いピーク波長におけるスペクトルレンジに
おいて、特定の波長の信号に対する平均信号の比の平方
根で改善されるようなS/N比の測定を有するということ
を示すことができる。このように、米国特許出願第08/3
92,019号に開示の発明によれば、スペクトルの再構築に
必要な全情報を得るために、必要OPDsの全てが画像の全
ピクセルについて同時に走査され、これにより、画像情
報とともにスペクトル情報が同時に集められる。この発
明は、遠隔検査のための望遠鏡、実験室での解析用の顕
微鏡、産業上でのモニター用の光ファイバーおよび医学
的な撮像、診断、治療等のような様々な光学的な構成と
して用いられる。
分光生物撮像システムは、潜在的に、画像中での空間
分布および組成を注目すべき化学成分間で、微妙なスペ
クトル差が存在する適用例に有用である。この計測は、
本質的には、特許出願第08/392,019号に述べられている
システムに付属のいずれかの光学システムを用いて行わ
れ、このような光学システムとしては、例えば、直立も
しくは反転型顕微鏡、蛍光顕微鏡、マクロレンズ、内視
鏡および眼底カメラがある。さらに、光透過（明視野お
よび暗視野）、自己蛍光および投与プローブの蛍光等を
含む標準的な実験方法を用いることができる。
蛍光計測は、出力スペクトルがシステム感度のスペク
トルレンジ内にあると仮定して、標準フィルターキュー
ブ（バリアフィルター、励起フィルターおよびダイクロ
イックミラーからなる）もしくは特殊用途用のカスタマ
イズされたフィルターキューブを用いて行うことができ
る。分光生物撮像法は、暗視野および位相差のような標
準空間フィルター法とともに、さらには偏光顕微鏡検査
法とともに用いることができる。このような方法を用い
るときでのスペクトル情報の効果は、計測スペクトル像
を正しく変換することである。
光透過および蛍光顕微鏡検査法において分光生物撮像
システム用の実験的な方法および特殊な用途はたくさん
ある。このような方法および用途としては、これに限ら
れるものではないが次のような物がある。（１）光透過
顕微鏡検査−着色組織サンプルの計測、（２）蛍光顕微
鏡検査：（ｉ）多重蛍光搬送体のスペクトル認識、（i
i）細胞レベル以下の区画（例えば、pH、Ca++イオン集
中）におけるミクロ的な環境変化および染料特性の検
出、（iii）自然色素（例えば、葉緑素）からの自己蛍
光の計測、および（iv）蛍光共鳴エネルギートランスフ
ァー（FRET）。これ以外の可能性のある用例としては、
（１）時間分解スペクトル画像（適切な外部トリガーを
有した格子強化CCDを用いて得られる）、（２）ラマン
散乱計測、がある。
Human Genome Project（HGP）の主たる利点の一つ
は、病理遺伝子およびその他の染色体領域および構造の
ための多数の核酸プローブの分離であった。このこと
は、展開し得るテストの数およびタイプがこれらプロー
ブに依存しているため、DNA診断における興味を呼び起
こした。近年においては、fluorescent in situ hybrid
ization（FISH）において特に関心がもたれており、こ
の（FISH）とは、試験した染色体領域を補う特定の核酸
プローブに共役な蛍光部分でマークを行うプロセスであ
り、これに続いて蛍光顕微鏡検査により蛍光部分が可視
化される。
基本的な実験室内において伝統的にFISHが用いられて
きているが、これと並行して、臨床分野においてもFISH
技術が用いられるようになってきている。FISHは細胞遺
伝学への最も進んだアプローチであると考えられてお
り、FISHから得られる染色体に関する情報量は、DNAハ
ンドリング法によって標準の核型から得られる情報より
ずっと多い。さらに、クラシカルな（中期の）細胞遺伝
学に比べて、休止期の細胞遺伝学のような技術を用いれ
ば、診断情報をずっと速く得ることができる。
本発明によればFISH撮像法が提供され、これによれ
ば、顕微鏡の視野内の全ピクセルから蛍光スペクトルを
同時に得ることができ、一回の実験で多くのプローブの
位置を検出することができる。染色体の特定プローブを
用いることができるとともに新規なラベリング法を用い
ることにより、この方法は、核染色体を異なる色（すな
わち、人間の核型用の24の異なる色）に着色することに
よりFISH核型を作り出すことができる。これにより非常
に高いサンプルスループットが達成でき、本質的にプロ
ーブの数に制限されない解析が可能となる。
本発明の別の目的は、生体コンポーネントから白色
光、紫外光もしくはレーザー励起発光スペクトルの量的
な分布マップを得ること（例えば、網膜血管における酸
化および脱酸素ヘモグロビンおよび／もしくは網膜にお
けるメラニン色素沈着レベル）や、健康なもしくは他の
病気の組織もしくは細胞からガン部を区別することであ
る。このような励起発光分光学によって得られる信号
は、組織を異なるコンポーネントに分類するために用い
ることができる。この方法によればさらに、蛋白質、炭
水化物、NAD+およびNADH、コラーゲン、エラスチンおよ
びフラビン、および細胞および／または組織内の種々の
添加変形媒介物を識別したり、これらの空間的な配置マ
ップを作成可能である。所定の波長の光を用いるととも
に種々のアルゴリズムにより解析することにより、組織
（もしくは細胞）のアルカリ度もしくは酸性度、組織内
における腫瘍の存在のみならず出血等を検知したり、そ
の分布マップを得たり、特性付けを行ったりすることが
できる。検出感度は、種々の蛍光タグを用いて高めるこ
とができる。これらタグは、細胞および／もしくは組織
レベルにおいて悪性度を判定するために用いることがで
き、このため、この方法はガン診断および終末治療の分
野で最も急速に発展している。生体サンプルからの発光
光を検出するための実験室的なシステムは世界中で様々
なものが知られている。今日、医学分野でのキーとなる
ものは、これら診療検知システムから得られる信号およ
び画像をどのように解析するかということであり、本発
明はこの点に関するものである。
このように医療診断および治療用並びに上述のような
制限のない生物学的研究用の分光生物撮像方法の必要性
が広く認識されており、このような方法を有することは
非常に利点が多く、この方法によれば、組織の空間構成
を検出したり、細胞および組織構成や治療プローブおよ
び薬剤の定量および有意義な表示を行ったりすること
を、光透過、反射、散乱および蛍光発光法を用いて行う
ことができる。
発明の概要 本発明によれば、生物学的な研究、医学診断および治
療用の分光撮像方法を得ることができ、この方法を以下
においては分光生物撮像方法と称する。本発明に係る方
法は、空間的な構成（すなわち、分布）を検出したり、
細胞および組織の自然組成、構造、器官および同位体ト
レーサープローブ（例えば、蛍光プローブ）のような処
理コンポーネント、並びに光透過、反射、散乱および発
光を利用する薬剤等を、高い空間およびスペクトル解像
度で計量したりするために用いることができる。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、分光生物撮像方法は、（ａ）分光撮像されるべき
サンプルを調製する工程、（ｂ）そのサンプルを光学装
置を通して観察する工程、この光学装置は撮像分光計に
光学結合されており、光学装置および撮像分光計は、
（ｉ）コリメート光学要素を用いてサンプルの全ピクセ
ルから入射光を同時に収集し、（ii）コリメートされた
入射光を多数の要素を有する干渉計系に通し、まず、光
が干渉計内部で異なった方向に進行する２つのコヒーレ
ント光線に分割され、次いで２つのコヒーレント光線が
再結合されて互いに干渉して出射光線が形成されるよう
にし、（iii）出射光線を、検出器要素の２次元アレー
を有する検出器上に出射光線を収束させる収束光学系に
通し、各時点で検出器要素の各々がサンプルの１つの、
全測定期間を通じて常に同一のピクセルであり、サンプ
ルの実像は検出器アレー面上で固定され、測定中のあら
ゆる時点で像は可視かつ識別可能であり、各検出器要素
は、異なる波長でピクセルから発せられる光の強度の特
定の一次結合である信号を生成するようにし、この一次
結合は瞬時光路差の関数とし、（iv）干渉計系の少なく
とも１つの要素を回転し、干渉計系によって生成された
２つのコヒーレント光線の間の光路差がサンプルの全ピ
クセルについて同時に走査されるようにし、（ｖ）記録
装置を用いて各検出器要素の信号を時間の関数として記
録し、データの第１のキューブ（立方体）を形成するこ
とによってサンプルの各ピクセルのスペクトルを得るた
めのものである、および（ｃ）数理アルゴリズムを用い
て第１のキューブを解釈する工程を含む。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、この方法はさらに（ｄ）解釈されたデータのキュ
ーブをマップする工程を含んでもよい。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記光学装置は、顕微鏡、カメラレンズ、内視
鏡、眼底カメラおよび眼底鏡からなるグループから選択
される。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記顕微鏡は、反射顕微鏡、透過顕微鏡、蛍光顕
微鏡、直立（縦型）顕微鏡、倒立顕微鏡、暗視野顕微
鏡、コンフォーカル顕微鏡、定在波コンフォーカル顕微
鏡および反射コントラスト顕微鏡からなるグループから
選択される。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記平行光は、サンプルからの透過光、サンプル
からの反射光、サンプルからの散乱光およびサンプルか
らの発光光からなるグループから選択される。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、サンプルからの前記発光光は、投与プローブ蛍
光、投与プローブ励起蛍光および自己蛍光のグループか
ら選択される。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、光源から生成される前記光は、レーザー、白色
光、フィルター透過光、紫外光および短波長レンジの光
のグループから選択される。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記光は複数の光源から生成され、これら光源は
同時にもしくは順次作動される。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記二次元アレイは、ビデオレートCCD、冷却高
ダイナミックレンジCCD、増感CCDもしくは時間ゲート増
感CCDのようなCCDからなる。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、サンプルは細胞、組織および微生物からなるグル
ープから選択される。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記細胞および組織は人体から採取される。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記細胞は、例えば、Rap染色により集められた
細胞、血液細胞、胎児細胞、悪性腫の疑いのある細胞、
***休止期の細胞、有糸***中細胞および還元***中細
胞である。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記組織は、網膜、網膜血管、腫瘍、皮膚、角
膜、髪、肺、胃、腸、膀胱、結腸、前立腺、頸部、動
脈、静脈および心臓からなるグループから選択される。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記サンプルが網膜であり、前記方法が、網膜血
管における酸化および脱酸化ヘモグロビンの検出および
／もしくは網膜のメラニン色素沈着レベルの検出用であ
る。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記サンプルが細胞、組織の一部および微生物か
らなるグループから選択され、前記光がプローブにより
励起され、このプローブは特定の細胞成分に結合され、
前記方法は細胞成分の存在もしくはそのレベルの検出用
である。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記プローブは共役蛍光部分を含み、前記励起が
蛍光部分の蛍光発光である。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記プローブがさらに核酸分子を含み、前記方法
がこの核酸分子と交配する細胞核酸（デオキシリボ核酸
および／もしくはリボ核酸）の存在もしくはそのレベル
の検出用である。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記プローブが抗体を含み、前記方法が、この抗
体により認識される細胞蛋白質の存在もしくはそのレベ
ル検出用である。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記蛍光部分が例えば、SpectrumOrangeTM,Spect
rumGreenTM,Aqua,Texas−Red,FITC,ローダミン、フルオ
レスセイン、カスケードブルーおよびこれらの組み合わ
せである。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記数学的アルゴリズムが、サンプルの各ピクセ
ルのスペクトルのポイントオペレーション解析である。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記ポイントオペレーション解析が、サンプルに
おける各ピクセルのスペクトルを変形関数に基づいてス
カラーマッピングすることを含む。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記ポイントオペレーション解析が、サンプルに
おける各ピクセルのスペクトルを変形関数に基づいて別
のスペクトルにマッピングすることを含む。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記数学的アルゴリズムが形態学解析であり、こ
の形態学解析が類似マッピングのようなスペクトル解析
に続いて行われる。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記数学的アルゴリズムが類似マッピング解析で
あり、これによりサンプルの各ピクセルにおける参照ス
ペクトルからのスペクトル差を計算する。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記類似マッピング解析がグレイレベルもしくは
疑似カラーイメージを作り出し、ここでは明るいピクセ
ルが小さなスペクトル差に対応し、暗いピクセルが大き
なスペクトル差に対応する。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記類似マッピング解析がグレイレベルもしくは
疑似カラーイメージを作りだし、ここでは明るいピクセ
ルが大きなスペクトル差に対応し、暗いピクセルが小さ
なスペクトル差に対応する。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記スペクトル差が、各ピクセルのスペクトルと
参照スペクトルとの差の絶対値を所定波長レンジにおい
て積分して定義されるスカラーである。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記数学的アルゴリズムが分類マッピング解析で
あり、これにより、各ピクセルのスペクトルにおけるい
くつかの参照スペクトルからのスペクトル差を計算す
る。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記分類マッピング解析が疑似カラーイメージを
作り出し、このイメージにおいていくつかの参照スペク
トルの一つに対して所定最大スペクトル差を有する一群
のピクセルが所定疑似カラーにより着色される。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記スペクトル差が、各ピクセルのスペクトルと
前記いくつかの参照スペクトルの一つの差の絶対値を所
定波長レンジにおいて積分して定義されるスカラーであ
る。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記数学的アルゴリズムが主要コンポーネント解
析である。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記主要コンポーネント解析が、（ａ）全測定ピ
クセルおよび波長、なお、複数波長が用いられるときに
は励起光源の波長を含む、の共変マトリクスを構築し、
（ｂ）この共変マトリクスを対角化するとともに全直交
スペクトルベースエレメントを見つけだし、（ｃ）どの
ベースエレメントがサンプルの所定特徴を有するかを探
し出すようになっている。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記数学的アルゴリズムが一次結合解析である。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記一次結合解析が、前記第１のスペクトルキュ
ーブデータおよび前記第２のスペクトルキューブデータ
に属する一対の対応ピクセルの対応波長間に算術関数を
適用して、第３スペクトルキューブデータを求めるよう
になっている。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記一次結合解析は、二つのスペクトルキューブ
データの平均演算、時間変化追跡およびスペクトル正規
化からなるグループから選択される。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記一次結合解析は、算術関数によって各ピクセ
ルのスペクトル波長の全てに所定スカラーを与えるもの
であり、この算術関数は加算、減算、乗算、除算および
これらの組み合わせからなるグループから選択される。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記一次結合解析はバックグラウンドの除去に用
いられ、サンプルのバックグラウンド部に位置するピク
セルのスペクトルがサンプルのピクセルのスペクトルか
ら引き去られる。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記一次結合解析が校正処理に用いられ、サンプ
ル観察前に測定されたスペクトルがサンプルのピクセル
のスペクトルを除するために用いられる。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記数学的アルゴリズムが光密度解析である。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記光密度解析が光密度マップである変換イメー
ジを得るためのものである。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記数学的アルゴリズムは予め設定された波長レ
ンジを用いてRGBカラーイメージを計算する。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記数学的アルゴリズムはピクセルの各スペクト
ル用の二つの異なる波長間の比を算出する。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記数学的アルゴリズムはピクセルの各スペクト
ル用の二つの異なる波長間の比を算出し、このように算
出された比に応じて、各ピクセルを明色もしくは暗色の
人口色で着色する。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、本方法は、サンプルに投与された多重蛍光搬送体
のスペクトル特定を行うために用いられる。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、本方法は、サンプルにおける局所的な電位、pHレ
ベルおよび細胞間のイオン集中などのようなミクロ的な
環境変化を検出するために用いられる。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、本方法は、サンプル内の葉緑素、ポルフィリンお
よび／もしくは細胞質蛋白のような自然成分からの自己
蛍光を測定するために用いられる。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、本方法は、生物学研究、薬品開発産業、病理学に
おける細胞および組織分類、血液学、尿中のバクテリア
の存在解析、染色体中での遺伝子識別およびマッピン
グ、遺伝子病診断、細胞器官解剖学および生理学、細胞
核におけるクロマチン分配および凝縮、細胞質器官およ
び成分マッピング、核皮膜マッピング、皮膚癌のマッピ
ング、黒色腫およびほくろの選別、ポートワイン母斑、
および光力学的治療の前、間および後の皮膚画像作成か
らなる用途グループから選択される用途のために用いら
れる。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記細胞質成分はNAD+、NADH、フラビンおよびチ
トクロームからなるグループから選択される。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、本方法は、サンプルにおける少なくとも二つの蛍
光間の空間分離を決定する蛍光共鳴エネルギー移転を測
定するために用いられるが、少なくとも一つの蛍光搬送
体はサンプルに外部から投与される。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記サンプルが細胞、組織および微生物からなる
グループから選択され、前記方法はサンプルにおける細
胞および細胞レベル以下の詳細の認識およびマッピング
を行うために用いられる。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記サンプルはRomanowsky−Griemsa着色法、Hae
matoxylin−Eosin着色法およびMay−Grunwald−Giemsa
着色法からなるグループから選択された方法により着色
される。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記細胞レベル以下の詳細は、核におけるクロマ
チン組織のタイプであり、このタイプは異質染色質およ
び真正染色質からなるグループから選択される。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、前記サンプルが細胞、組織および微生物からなる
グループから選択され、前記方法はサンプルにおける生
命プロセスを時間を関数としてモニターするために用い
られる。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、本方法は蛍光交配法であり、この方法は、（ａ）
少なくとも一つの蛍光染料を用いて少なくとも一つの核
酸分子を特定し、少なくとも一つの蛍光追跡核酸プロー
ブを得るステップと、（ｂ）生物サンプルの細胞核酸と
前記プローブとを交配させるステップとを有し、さら
に、これらステップに変えてもしくはこれらステップに
追加して（ａ）少なくとも一つの核酸プローブと生物サ
ンプルの細胞核酸とを交配させるステップと、（ｂ）前
記少なくとも一つのプローブを少なくとも一つの蛍光染
料により特定するステップとを有し、これらに続いて次
のステップが行われる。（ｃ）蛍光顕微鏡を通して生物
サンプルを観察するステップ、この蛍光顕微鏡は撮像分
光計に光学的に繋がり、これら蛍光顕微鏡および撮像分
光計は生物サンプルの各ピクセルのスペクトルを次のス
テップに基づいて得る。（ｉ）平行光学系を用いて生物
サンプルの全ピクセルからの射出光を同時に集光するス
テップと、（ii）この射出平行光をたくさんのエレメン
トを有する干渉計システムを通過させるステップと、な
お、これにより、まず干渉計内を異なる方向に流れる二
つの干渉ビームに分離され、そして、これら二つの干渉
ビームが互いに干渉して再結合され励起ビームが作られ
る、（iii）この励起ビームを合焦光学システムを通過
させて二次元配列の検出エレメントを有する検出器に合
焦させるステップと、なお、これにより、各瞬間におい
て、各検出エレメントがイメージの一部であり、測定の
全期間において生物サンプルにおける同一ピクセルとな
り、これにより生物サンプルの実際のイメージが検出器
アレイの面上で静止され、測定中いつでもこのイメージ
を観察でき且つ認識でき、このため、各検出エレメント
が異なる波長におけるピクセルから射出される光強度の
一次結合である信号を発生し、なお、一次結合は瞬間的
な光路差の関数であり、（iv）干渉計システムの一つも
しくは複数の要素を回転させるステップと、なおこれに
より、この干渉計システムによって作られた二つの干渉
ビーム間の光路差が、生物サンプルの全ピクセルについ
て同時に走査され、（ｖ）第１スペクトルキューブデー
タを形成するために記録装置を用いて時間の関数として
各検出エレメントの信号を記録するステップとからな
る。最後に、（ｄ）数学的アルゴリズムを用いて前記第
１スペクトルキューブデータを変換するステップを有
し、この数学的アルゴリズムは背景削除および／もしく
は分類マッピングシステム用の一次結合である。
後述の本発明に係る好ましい実施例における特徴によ
れば、本方法は細胞分類方法であり、次のステップから
なる。（ａ）解析用の細胞スミア（標本）を準備するス
テップ。（ｂ）透過顕微鏡により前記細胞スミアを観察
するステップは、なお、透過顕微鏡は撮像分光計と光学
的に繋がり、透過顕微鏡および分光計は細胞スミアの各
ピクセルのスペクトルを次のステップに基づいて得る。
（ｉ）平行光学系を用いて細胞スミアの全ピクセルから
の射出光を同時に集光するステップと、（ii）この射出
平行光をたくさんのエレメントを有する干渉計システム
を通過させるステップと、なお、これにより、まず干渉
計内を異なる方向に流れる二つの干渉ビームに分離さ
れ、そして、これら二つの干渉ビームが互いに干渉して
再結合され励起ビームが作られる、（iii）この励起ビ
ームを合焦光学システムを通過させて二次元配列の検出
エレメントを有する検出器に合焦させるステップと、な
お、これにより、各瞬間において、各検出エレメントが
イメージの一部であり、測定の全期間において細胞スミ
アにおける同一ピクセルとなり、これにより細胞スミア
の実際のイメージが検出器アレイの面上で静止され、測
定中いつでもこのイメージを観察でき且つ認識でき、こ
のため、各検出エレメントが異なる波長におけるピクセ
ルから射出される光強度の一次結合である信号を発生
し、なお、一次結合は瞬間的な光路差の関数であり、
（iv）干渉計システムの一つもしくは複数の要素を回転
させるステップと、なおこれにより、この干渉計システ
ムによって作られた二つの干渉ビーム間の光路差が、細
胞スミアの全ピクセルについて同時に走査され、（ｖ）
第１スペクトルキューブデータを形成するために記録装
置を用いて時間の関数として各検出エレメントの信号を
記録するステップとからなる。最後に、（ｃ）数学的ア
ルゴリズムを用いて前記第１スペクトルキューブデータ
を変換するステップを有する。
本発明によれば、サンプルの各ポイント（すなわち、
ピクセル）から独立して且つ同時に集められたデータの
分光分析を可能としているので、従来のものが有する欠
点を十分に克服できる。この方法によれば、サンプルの
位置を関数とした材料および分子タイプおよび集中度の
情報のみならず、従来の形態学解析（例えば、Ruteberg
による米国特許第4,965,727号参照）による従来のイメ
ージ情報が得られる。このため、本発明は、光透過、反
射、散乱および蛍光法を用いて、高い空間およびスペク
トル解像度で、細胞および組織コンポーネント、構造、
細胞器官、遺伝物質、投与蛍光追跡プローブの空間組織
および量の検出を行うことのみならず、細胞および組織
内での投与薬剤の分布検出を行うことができる。本発明
のさらなる効果は、分光データの変換が非常にシンプル
であることである。本発明のもう一つの効果は、フィル
ター、格子およびその他の散乱技術による既知のFellge
ttもしくはフーリエ変換分光学の多重効果であり、これ
により、スペクトル計測において高いS/N比での表現が
可能である。本発明の肝要の部分は多数の数学的アルゴ
リズムであり、このため、データを意味ある方法で変換
もしくは表示するためにコンピュータソフトウエアが必
須である。
図面の簡単な説明 以下に本発明について添付の図面を参照して例示的に
説明するが、ここで、 図１は、従来（従来技術に係る）のスリットタイプ撮
像分光計を示す。
図２は、米国特許出願第08/392,019号に従って構成さ
れた従来技術に係る撮像分光計の主要構成を示すブロッ
ク図である。
図３は、米国特許出願第08/392,019号に従って構成さ
れた撮像分光計に用いられる非可動タイプの干渉計、す
なわち、サグナック（Sagnac）干渉計を示す。
図４は、選択スペクトルレンジを強調するための疑似
RGB（赤、緑および青）色の定義を示す。各疑似色の強
度は、曲線の一つを掛けた後、曲線の下側の面積を積分
して計算される。
図５（ａ）は、オリンパス倒立顕微鏡（IMT2）に添付
のSpectraCubeTMベースの分光生物撮像システムを用い
て得られた、プロピディウム（propidium）ヨウ素で着
色した細胞の蛍光スペクトルイメージを示し、図５
（ｂ）は、本発明に方法を用いて図５（ａ）に示す画像
の三つの独立ピクセルからの蛍光発光スペクトルのプロ
ットである。
図６（ａ）は、有糸***中の細胞のRGB疑似色イメー
ジを示し、***細胞はアクリジンオレンジで着色されて
いる。図６（ｂ）は、細胞のスペクトルイメージを差く
るために測定された二つのスペクトルのプロットであ
り、細胞質領域からの第１のスペクトル（Ｍ印）はアク
リジンオレンジの単一形状に特徴があり、核領域からの
第２のスペクトル（Ｄ印）はアクリジンオレンジの二成
分形状に特徴がある。図６（ｃ）は、参照スペクトルと
してアクリジンオレンジの二成分形状のスペクトルを用
いて同様なマッピング解析を行った結果を表す。図６
（ｄ）は、参照スペクトルとしてアクリジンオレンジの
単一形状のスペクトルを用いて同様なマッピング解析を
行った結果を表す。
図７（ａ）は、Oedogonium sp.algaからのトータル発
光蛍光を示し、図７（ｂ）は、参照スペクトルとして図
７（ｅ）のスペクトルＡを用いた同様のマッピング解析
結果であり、図７（ｃ）は、図７（ａ）における像の薄
い赤色蛍光スペクトルを用いた同様のマッピング解析結
果であり、図７（ｄ）は、参照スペクトルとして図７
（ｅ）のスペクトルＢを用いて同様のマッピング解析結
果であり、図７（ｅ）は図７（ａ）〜（ｄ）に示す試験
片の四つの異なるピクセルからの蛍光スペクトルを示
す。
図８（ａ）は、血液細胞を着色するためMay−Grunwal
d−Giemsa法により着色された血漿細胞を示し、図８
（ｂ）は、図８（ａ）の細胞の異なる細胞レベル以下の
場所（Ａ〜Ｅ）を示す。
図９（ａ）は、図８（ｂ）の矢印で示す五つのピクセ
ルからの透過光スペクトルを示し、図９（ｂ）は、図８
（ａ）および（ｂ）の細胞の外側で記録された射出光に
比較して計算された図９（ａ）のスペクトルに対応する
吸収スペクトルを示す。
図10は、図９（ａ）に示すスペクトルA,B,CおよびD/E
がそれぞれ参照スペクトルとして用いられたときでの定
量的な類似マッピング解析を示す。
図11（ａ）,11（ｂ）,11（ｃ）および11（ｄ）は、図
12（ａ）に示すゾウリムシの四つの異なる場所の蛍光ピ
クセルスペクトルを示し、生きているゾウリムシが蛍光
顕微鏡（オリンパスBH2 RFC）に添付のSpectraCubeTM
システムによって解析された。ゾウリムシ細胞は緑色光
（最大545nmのバンドパス）により励起され、このシス
テムにより赤色蛍光が測定された。
図12は摂取藻類によるゾウリムシの蛍光イメージを示
し、この解析により、（ａ）ゾウリムシ細胞は緑色光
（最大545nmのバンドパス）により励起され、赤色フィ
ルター（590nm）を通して観測された赤色蛍光を示し、
（ｂ）図11（ａ）のスペクトル１に藻づく類似マッピン
グ解析により、ゾウリムシの上部に自然藻類の葉緑素の
含有率の高い二つの顕著な領域が見いだされ、これはお
そらく細胞咽頭及び口腔を示しており、（ｃ）細胞咽頭
の隣にほぼ１ピクセルの空胞点（図11（ａ）のスペクト
ル２を用いたマップ）が見られ、（ｄ）および（ｅ）図
11（ｂ），（ｃ）のスペクトル4,5を用いたマップがそ
れぞれ、同一区画の狭い領域に輪郭を描いて、細胞質の
中央部に大きな空胞が見られ、（ｆ）図11（ｄ）のスペ
クトル６を用いたマッピングにより、消化物が細胞から
排出される細胞肛門領域が見られる。
図13は、図14に示す二匹の交尾するゾウリムシの空胞
における藻類葉緑素の蛍光スペクトルである。交尾する
ゾウリムシの空胞の上部（１）および下部（２）の個々
のピクセルスペクトルであり、スペクトル（３）は図14
A〜Ｃに示す二つの細胞の中央接触部におけるピクセル
から得られた。
図14A,B,Cは、（ａ）二匹の交尾するゾウリムシの空
胞における藻類葉緑素の蛍光を示し、（ｂ）交尾するゾ
ウリムシにおける空胞および自然葉緑素含有率の類似マ
ッピングイメージ（図13のスペクトル２によるマップ）
を示し、一つの細胞は大きな食物空胞を有し、もう一つ
は小さな空胞を有し、これらはそれぞれタイプＩおよび
タイプII細胞に対応する。（ｃ）図13の低強度スペクト
ル３がマッピングに用いられ、細胞の細胞質における反
射赤色光を示す。
図15は葉緑素の退化ステップを示す。
図16（ａ）および（ｂ）は、May−Grunwald−Giemsa
着色赤芽球細胞の五つの異なる細胞箇所（すなわち、個
々のピクセル）の多重透過スペクトルおよび吸収スペク
トルを示す。
図17a,17b,17c,17d,17e,17f,17g,17h,17i,17j,17k,17
l,17m,17n,17oおよび17pは、RGB（a,e,i,m）イメージ
と、真正染色質（b,f,j,n）のスペクトル、異質染色質
（c,g,k,o）のスペクトルから得られた類似マッピング
結果と、前赤芽球（ａ−ｄ）、好塩基性の正赤芽球（ｅ
−ｈ）、初期赤芽球（ｉ−１）および後期赤芽球（ｍ−
ｐ）の細胞質コンポーネント（d,h,l,p）のスペクトル
から得られた類似マッピング結果とを示す。
図18a,18b,18c,18d,18eおよび18fは、Ｂ−16黒色腫細
胞における光感作中での包含PP蛍光の細胞サイズ以下の
局所化を示す。細胞は５−ALAとともに20時間培養さ
れ、400nmの光で励起され、図19a−ｃのスペクトルを参
照スペクトルとする類似マッピング解析を用いて赤色蛍
光画像を得て解析された。
図19a,19bおよび19cは、それぞれ図18a,18bおよび18c
に示した細胞からの4,4および２の個々のピクセル蛍光
スペクトルを示す。
図20aおよび20bは、血清富裕媒体においてPPとともに
培養された黒色腫細胞における外因性PPの蛍光局所化を
示し、（ａ）はexo−PPとともに培養された後での制御
黒色腫再部位の赤色蛍光を示し、（ｂ）は（ａ）と同様
の細胞に１分の光照射（4J/cm2）を行った後での赤色蛍
光分布を示す。
図21a,21bおよび21cは図20a,20bの細胞および暗所で
５分の培養を行った後での細胞の付加イメージの単一ピ
クセル蛍光スペクトルを示し、（ａ）は図20aに示す細
胞における細胞レベル以下の場所の異なる場所（すなわ
ち、個々のピクセル）からの五つの単一ピクセルスペク
トルを示し、（ｂ）は光照射の後での図20bの細胞から
の四つのスペクトルを示し、（ｃ）は暗所でさらに５分
間の培養を行った後での細胞レベル以下の箇所からの四
つのスペクトルを示す。
図22はゾオキサンテラ蛍光マップの三つのランダムな
ピクセルのスペクトルグラフであり、671nmに発光ピー
クを有する。
図23A,23B,23C,23D,23Eおよび23Fにおいて、A,Cおよ
びＥは正規化前での三つのサンゴの多重ピクセル蛍光マ
ップを示し、B,DおよびＦは発光強度に対応して、654nm
から685nmの間で、それぞれA,CおよびＥの蛍光イメージ
に示されたトランスアクトに沿って、正規化された三次
元図であり、ＡおよびＢはFavites halicoraで、Ｃおよ
びＤはGoniastrea retiformisであり、ＥおよびＦはMil
lepora dichotomaである。
図24a,24bおよび24cは、共生体（ａ）Favites halico
ra,（ｂ）Goniastrea retiformis,（ｃ）Millepora dic
hotomaに隣接するピクセルに対する蛍光値の回帰曲線を
示し、いくつかの放射トランスアクトに沿った同一距離
に見られるピクセルから測定した平均値が示され、第１
ポイントと第５ポイントとの距離が2.4mmであり、縦線
が±S.E.であり、破線が回帰曲線であり、回帰結果はFa
vites halicoraがr2＝0.905であり、Goniastrea retifo
rmisがr2＝0.066であり、Millepora dichotomaがr2＝0.
062である。
図25a,25bおよび25cは、三つのサンゴ（ａ）Favites
halicora,（ｂ）Goniastrea retiformis,（ｃ）Millepo
ra dichotomaのスペクトル類似マップを示し、全ピクセ
ルが高蛍光を有する選択ピクセルと比較されている。類
似性がグレイスケールで示され、明るいピクセルが高い
類似性を有し、暗いピクセルは低い類似性を有する。
図26a,26bおよび26cは、Texas−Red and Rhodamineに
添付の二つの異なるプローブを用いて行われた休止期FI
SHを示し、（ａ）は顕微鏡を介して観察されるオリジナ
ルイメージを示し、（ｂ）は本発明に係る方法によって
測定されて処理された後の同一サンプルイメージを示
し、（ｃ）は、Texas−Red and Rhodamine蛍光搬送体に
よる蛍光スペクトルを示す。
図27a,27bおよび27cは、異なる蛍光搬送体により区別
された六つの異なるプローブを用いて行われた休止期FI
SHを示し、（ａ）は顕微鏡を介して観察されるオリジナ
ルイメージで、細胞はDAPI二より着色されており、
（ｂ）は本発明に係る方法によって測定されて処理され
た後の同一サンプルイメージを示し、（ｃ）は六つの蛍
光搬送体の蛍光スペクトルである。
図28は、Papanicolaouテスト（すなわち,Pap着色）で
一般的に用いられるようにHaematoxylin−Eosin着色細
胞のRGBイメージを示し、Ａマークが付けられた細胞がH
PV（human Papilloma virus）癌性頸部細胞であり、Ｂ
マークが付けられた細胞が正常頸部細胞であり、C,Dお
よびＥは多形核細胞、鱗状細胞の核およびＡマーク細胞
の細胞質を示す。
図29は、固有値μｉが20の異なる主要コンポーネン
ト、すなわち、波長レンジ（ｉ＝1,....,20）の関数と
してプロットされた主要コンポーネント解析を示す。
図30aはピクセル強度として図29のスペクトル積BV20
の値を用いて得られた黒および白色強度イメージを示
し、図30bおよび30cは図29のベクトル積BV10およびBV13
の値を用いて得られた黒および白色強度イメージを示
す。
好ましい実施例の説明 本発明は、医療診断、治療および生物学的研究用に用
いることのできる分光生物撮像方法に関する。特に、本
発明は、光の透過、反射、散乱および蛍光発光法を用
い、高い空間および分光解像度で、空間的機構を検出
し、細胞および組織成分、構造および、プローブや薬物
等、投与された成分を定量するために用いることができ
る。したがって、本発明は、例えば、生体細胞の解剖お
よび生理を研究し、単一の測定で多くの遺伝子および染
色体を効果的にマップし、切片中の癌性もしくは他の病
的な細胞および組織を顕微鏡下もしくは生体中でマクロ
レンズもしくはいずれかのタイプの内視鏡もしくは基底
部カメラを通して、例えば除去すべき組織の手術中に手
術医をガイドする目的で検出および同定するために、結
果の解釈および有用な表示を主として強化された撮像形
状で可能にする。
図４〜30に示す本発明をよりよく理解するために、ま
ず、図１に示すように２次元の検出器アレイを利用した
従来の（従来技術の）スリット型撮像分光計の構造およ
び作用を参照する。
すなわち、図１に示す従来技術の撮像分光計は、４で
概略的に示す対象からの入射光を集光し、対象４の略平
行光を、スリット６を有する第１の焦点面に収束させて
視野を形成するための２で示す集光光学系を備える。ス
リット６から出射する光はコリメータレンズ８でコリメ
ートされ、分光散乱要素10（例えば回折格子）を通され
て、様々な波長が分離される。分光散乱要素10からの出
力は収束レンズ12によって第２に焦点面内の二次元検出
器アレイ上に収束される。検出器アレイ14の出力は信号
処理装置16に送られる。
図１の従来技術の撮像分光計に示された２次元検出器
アレイにおいては、系の運動（例えば矢印13で示すラス
ター運動もしくは直線走査）が第１次元に沿った走査を
行う。第２次元の走査は系の運動方向に垂直に配された
スリット６によって行われる。したがって、スリット６
はアレイ14内の各検出器があらゆる時間において１つの
ピクセルが単一の波長に寄与するように機能することを
保証する。これは各ピクセルのスペクトルを分離するた
めに必要である。
背景技術の欄および上記で述べたように、図１に示す
従来技術の欠点は、光学系２がすべてのピクセルから実
際に同時にエネルギーを集めるにも関わらず、１フレー
ムのピクセルの多くは任意の時間には測定されないこと
である。その結果、所要フレーム時間は有意に増大し、
また／もしくはSN比（感度）はこのようなスリットを必
要としない系に比べて顕著に低下する。
図２は本願に充分記載されたものとして引用するカビ
ブ等（Cabib et al）の1995年２月21日出願の米国特許
出願08/392,019号に開示された改良型の従来技術の撮像
分光系を示すブロック図である。この撮像分光計は本発
明の撮像を実施するのに極めて適した構成を有する。
すなわち、図２に示す従来技術の撮像分光計は、20で
一般的に示される集光光学系、ブロック22で示される１
次元スキャナ、ブロック24で示される光路差（OPD）発
生器もしくは干渉計、ブロック26で示される１次元もし
くは２次元検出器アレイ、およびブロック28で示される
信号処理装置およびディスプレイを含む。
系20において重要な要素はOPD発生器もしくは干渉系2
4であり、これは分析されるべき対象の各ピクセルから
出射する光の分光強度の所定の一次結合に対応する変調
光を出力する。干渉計の出力は検出器アレイ上に収束さ
れる。したがって、スペクトル再生に必要なすべての情
報を得るため、すべての必要な光学位相差は視野のすべ
てのピクセルについて同時に走査される。対象中のすべ
てのピクセルのスペクトルはこのようにして撮像情報と
同時に収集され、像の分析がリアルタイムで可能とな
る。
米国特許出願08/392,019号による装置は様々な構成で
実施することができる。特に、使用される干渉系は米国
特許出願08/392,019号の関連する図面に記載されるよう
に他のミラーと組み合わせることができる。
すなわち、米国特許出願08/392,019号によれば、他の
型の干渉計が使用可能である。これらは、上記米国特許
出願にさらに記載されるように、（１）OPDを変化させ
て光を変調する移動型干渉計、すなわち、走査厚を有す
るファブリ−ペロー型干渉計、（２）光学集光計からの
光線を受容するビームスプリッタおよびスキャナを含
み、光線を２つの経路に分割するマイケルソン型干渉
計、（３）OPDが入力光線の入射角度によって変化す
る、他の光学手段と結合させることもできるサニャック
型干渉計、および（４）４つのミラーとビームスプリッ
タとを加えた干渉計を含む。
図３はOPDが入力光線の入射角度によって変化する干
渉計を利用する米国特許出願08/392,019号によって構成
された撮像分光計を示すものである。光軸に対して小さ
な角度で干渉計に入射する光線はこの角度に対して直線
的に変化するOPDを付与される。
図３の干渉計において、全ピクセルにおいて光源30か
らの光線は光学集光系31によってコリメートされた後、
機械的スキャナ32によって走査される。次いで、光はビ
ームスプリッタ33を通過して第１の反射鏡、さらに第２
の反射鏡35に到達し、後者によって反射されてビームス
プリッタ33に戻り、これを通過して、収束レンズ36を通
って検出器アレイ37（例えばCCD）に至る。この光線は3
3、第２の反射鏡35、そして最後に第１の反射鏡34によ
って反射された光線と干渉する。
１走査の最後で各ピクセルはすべてのOPDで測定さ
れ、したがって、対象の各ピクセルのスペクトルはフー
リエ変換で再構築される。光軸に平行な光線は補償さ
れ、光軸に対して角度（θ）を有する光線はビームスプ
リッタ33の厚さ、その屈折率、およびθの関数であるOP
Dを付与される。小さな角度においては、OPDはθに比例
する。適当な反転および注意深い記録によって、各ピク
セルのスペクトルが計算される。
図３の構成において、角度β（図３ではβ＝45゜）で
ビームスプリッタに入射する光線はOPD＝０で干渉計を
通過し、一般角β＝θで入射する光線は次式（１）で与
えられるOPDを付与される。
OPD（β，θ,t,n）＝ｔ［（n2−sin2（β＋θ））0.5 −（n2−sin2（β−θ））0.5＋2sinβsinθ］ （１） ここで、βはビームスプリッタに対する光線の入射
角、θは光軸からの光線の角距離もしくは中心位置に対
する干渉計の回転角、ｔはビームスプリッタの厚さ、ｎ
はビームスプリッタの屈折率である。
式１によれば、中心角に対して正および負の角度の双
方で走査を行うことにより、各ピクセルについて両面イ
ンターフェログラムを得ることができ、これによって、
相誤差の解消を促進し、より正確なフーリエ変換計算が
可能になる。走査振幅により到達最大OPDが決定される
が、これは測定の分光解像度に関係する。一方、角度ス
テップの大きさは系が感度を有する最短波長によって決
定される。実際にサンプリング理論［Chamberlain（197
9）,The Principles of Interferometric Spectroscop
y,John Wiley and Sons,53〜55ページ参照］によれば、
このOPDステップは系が感度を有する最短波長の半分未
満でなければならない。
考慮すべきもう１つのパラメータはマトリックス中の
検出器要素の微小寸法である。収束光学系を通して、要
素は干渉計中に微小なOPDを画定し、これによってイン
ラーフェログラムを矩形関数で畳み込む効果を有する。
この結果、短波長において系の感度が低下し、要素によ
って画定されたOPD以下の波長についてはゼロまで低下
する。このため、変調伝達関数（MTF）条件が満足され
ること、すなわち、干渉計の検出器要素によって画定さ
れるOPDが装置が感度を有する最短波長よりも小さいこ
とを保証しなければならない。
したがって、米国特許出願08/392,019号に開示された
発明に従って構成された撮像分光計は単に視野内の各ピ
クセルから入射する光の強度を測定するだけでなく、所
定の波長範囲における各ピクセルのスペクトルをも測定
する。また、これらは任意の時間において視野内の各ピ
クセルによって出射されたすべての光線をより良く利用
し、したがって、上述のように、フレーム時間の顕著な
減少および／または分光計感度の顕著な増大を可能にす
る。このような撮像分光計は様々な型の干渉計および光
学集光および収束系を含むことができ、したがって、医
療診断および治療および生物学的研究用途、地質学的お
よび農業的調査のための遠隔探査等の広範な様々な用途
に使用することができる。
米国特許出願08/392,019号に開示される発明による撮
像分光計はイスラエル国ミグダルヘマク、インダストリ
アル・パークのスペクトラル・ダイアグノスチックス
（SD）社（Spectral Diagnostics Ltd.,Industrial Par
k,Migdal Haemek,Israel）によって開発されたものであ
り、以下、スペクトラキューブ（SpectraCubeTM）と称
する。様々な光学器具に光学的に接続されたスペクトラ
キューブシステムは本発明の方法を実施するために使用
された。スペクトラキューブシステムは表１にしめすよ
うな特性を有する。
スペクトラキューブシステムは、例えばＣ−マウント
もしくはＦ−マウントコネクタを介して容易にあるゆる
顕微鏡もしくはマクロレンズに取り付けられ、測定中は
あらゆる向きに配することができる。また、このシステ
ムは他の拡大手段および様々な型の内視鏡およびカメラ
に接続することができる。したがって、細胞および組織
の分光像を様々な倍率および照明法で得ることができ
る。
分光像の表示および分析 a.一般論 上述のように分光像は、分光情報を像の空間機構と組
み合わせる３次元のデータアレイＩ（x,y,λ）である。
このため、分光像はその次元性から分光キューブと称さ
れる１組のデータであり、これは他の手段では得ること
が困難で場合によっては不可能である特性の抽出および
量の評価を可能にするものである。分光学およびデジタ
ル画像分析は莫大な量の文献［例えば、Jain（1989）,F
undamentals of Digital Image Processing,Prentice−
Hall Internationalを参照］によって言及されているた
め、以下の説明は主として単一のデータセット、すなわ
ち分光キューブに分光および画像情報を組み合わせるこ
との利点に的を絞っている。
分光キューブの可能な分析型の１例は分光および空間
データを別々に用いること、すなわち、分光アルゴリズ
ムを分光データに、２次元画像処理アルゴリズムを空間
データに適用するものである。
分光アルゴリズムの１例として、各ピクセルでの強度
が「類似性」の程度に比例するグレー（もしくは他の
色）スケールの像（類似性マップ）を形成する、参照ス
ペクトルと全ピクセルのスペクトルとの間の類似性を演
算するアルゴリズムを考える。グレースケール像はさら
に、所望の特性およびパラメータを抽出するために画像
処理およびコンピュータ画像法（例えば、画像強調、パ
ターン認識等）を用いてさらに分析することができる。
換言すれば、類似性マッピングは参照スペクトル（ライ
ブラリに予め記憶されたものでも同一もしくは他の分光
像のピクセルに属するものでもよい）と分光像の各ピク
セルとの差の絶対値の積分を演算し、グレーレベルもし
くは偽カラー（白黒もしくはカラー）像を表示するもの
であり、この像では明るいピクセルが小さな分光差、暗
いピクセルが大きな分光差、あるいはその逆にそれぞれ
対応する。
同様に、分類マッピング類似マッピングについて記載
されたものと同じ計算を行い、表示された像の各ピクセ
ルを、その分類に従って、数種の参照スペクトルのうち
の１つに最も類似した所定の異なった偽カラーでペイン
トする。
また、非分離演算に基づいた分光像アルゴリズム、す
なわち、局所的分光情報および隣接ピクセル間の空間的
相関を含むアルゴリズム（これらのアルゴリズムの１つ
は後述のように主要素分析である）を適用することもで
きる。
分光キューブ（すなわち、Ｉ（x,y,z））のようない
ずれかの３次元（3D）データを取り扱う際に自然に生じ
る要求の１つは意味のあるようにそのデータ構造を可視
化することである。断層撮影データ等、例えば共焦点顕
微鏡によって得られ、各点が一般に３次元空間の異なっ
た場所（x,y,z）における強度を示す他の型の3Dデータ
とは異なり、分光像は異なった波長における同一の２次
元面（すなわち、サンプル）の強度を示す像のシーケン
スである。このため、データの分光キューブを観察する
ための２つの最も直感的な方法は像面（空間データ）も
しくは１ピクセルまたは１組のピクセルを波長の関数と
して３次元山谷ディスプレイで観察するものである。一
般に、像面はいずれかの単一の波長で測定された強度も
しくは各像ピクセルにおいて所望の分光領域にわたって
分光分析アルゴリズムを適用した後に得られるグレース
ケール像を表示するために用いることができる。分光軸
は、一般に、いずれかの所望のピクセル近傍で行われる
ある種の空間演算（例えばスペクトルの平均化）の結果
として得られるスペクトルを表示するために使用するこ
とができる。
例えば、分光像を、単純な白黒カメラで得ることので
きるような像に類似したグレースケール像として、ある
いは１つもしくは数種の人口色を用いて重要な特性を強
調もしくはマップした多色像として表示することが可能
である。このようなカメラはCCDアレイの分光領域（例
えば400nm〜760nm）にわたって光学信号を単純に積分す
るものであるため、「相当する」白黒CCDカメラ像は以
下のように分光軸に沿って積分することによって3D分光
像データベースから算出することができる。
式２において、ｗ（λ）は、すべて適当に重み付けさ
れた像のいくらかの分光領域にわたる積分に基づく様々
なグレースケール像を算出するための一般的な重み付け
応答関数である。例えば、それぞれ赤（Ｒ）、緑
（Ｇ）、青（Ｂ）に対する三刺激性応答関数に対応する
３つの異なる重み付け関数｛wr（λ）,wg（λ）,w
b（λ）｝で式（２）を評価すると、従来のRGBカラー画
像を表示することが可能である。また、意味のある新規
の（偽）カラー画像を表示することもできる。図４はこ
の単純なアルゴリズムのパワーを示す１例である。｛wr
（λ）,wg（λ）,wb（λ）｝を関心のあるスペクトルの
内部に配分されたガウス関数と考えると、この場合に結
果として表示される偽カラー画像は重み付け関数に対応
する分光領域中のデータのみが強調され、これら３領域
の分光差はより明確に検出できるようになる。
b.点演算 点演算は単一のピクセル（一度に１つより多くのピク
セルに関与しない）演算として定義される。例えば、グ
レースケール像において、点演算は、所定の変換関数に
従って各ピクセルの強度（強度関数）を他の強度にマッ
プする演算とすることができる。この型の変換の特定の
例は各ピクセルの定数による乗算である。
点演算の概念は分光像に拡張することができる。ここ
で、各ピクセルはそれ自体の強度関数（スペクトル）、
すなわちｎ次元ベクトルV1（λ）；λ∈［λ1,λｎ］を
有している。分光像に適用される点演算は各ピクセルの
スペクトルを以下の変換関数によってスカラー（すなわ
ち強度値）にマップする演算として定義することができ
る。
v2＝ｇ（V1（λ））；λ∈［λ1,λｎ］ （３） この型の点演算の１例は式３に従ってグレースケール
像を構築するものである。より一般的な場合、点演算は
各ピクセルのスペクトル（ベクトル）を以下の変換関数
に従って、他のベクトルにマップする。
V2(１)=ｇ(V1(λ));1∈[1,N]，λ∈[λ1,λｎ]（４） ただし、Ｎ≧ｎ この場合、分光像は他の分光像に変換される。
ここで、点演算の定義は異なる分光像の対応するピク
セル間の演算を含むように拡張することができる。この
型のアルゴリズムの重要な例は光学濃度分析である。光
学濃度は分光的に調査されている対象の領域を透過スペ
クトルよりも高いダイナミックレンジで強調し、図示す
るために用いられる。光学濃度は対数演算によって透過
に関係し、したがって、正関数である。光学濃度と測定
されたスペクトルとの間の関係はランベルト−ベールの
法則によって与えられる。
ここで、OD（λ）は波長の関数としての光学濃度、Ｉ
（λ）は測定されたスペクトル、IO（λ）は測定された
参照スペクトル、τ（λ）はサンプルの分光透過率であ
る。式５は、IO（λ）を（１）ODが計算されたものと同
一の分光キューブ中のピクセル、（２）第２のキューブ
中の対応するピクセル、および（３）ライブラリ由来の
スペクトルから選ばれたものとし、各波長で各ピクセル
について計算される。
光学濃度は測定系の分光応答性にもCCD検出器の不統
一性にも依存しないことに注目されたい。このアルゴリ
ズムは相対濃度をマップするのに有用であり、サンプル
中の吸収体の吸収係数およびサンプルの厚さが既知であ
る場合には、これら吸収体の絶対濃度をマップするのに
も有用である。したがって、以下の請求項に用いられる
「レベル」という語は「量」、「相対量」、「絶対濃
度」および「相対濃度」をも意味するものである。
他の例には様々な一次結合分析、例えば、（１）加
算、減算、乗算、除算、およびそれらの組み合わせ等の
算術関数によって所定のスペクトルをピクセル各々のス
ペクトルに適用して新たな分光キューブを得、各ピクセ
ルの得られたスペクトルを第１のキューブの各スペクト
ルと選択されたスペクトルとの合計、差、積、商、およ
びそれらの組み合わせとするもの、および（２）所定の
スカラーを上述の算術関数によって分光像のピクセルの
各々のスペクトルに適用するものが含まれる。
このような一次結合は、例えば、背景領域に位置する
ピクセルのスペクトルをピクセル各々のスペクトルから
減算する背景サブトラクションおよびサンプル分析に先
だって測定されたスペクトルを用いて分光像中のピクセ
ルの各々のスペクトルを分割する校正工程に用いること
ができる。
他の例にはグレーレベル画像としての比画像計算およ
び表示が含まれる。このアルゴリズムは分光像の各ピク
セルについて２つの異なる波長における強度の間の比を
計算し、これに対応してピクセル各々をより明るいもし
くはより暗い人口色でペイントするものである。例え
ば、比が高いピクセルはより明るく、比が低いピクセル
はより暗く（あるいは逆に）ペイントし、分光感度を有
する物質の分布を表示する。
c.空間分光組み合わせ演算 上述の分光像分析方法のすべてにおいて、アルゴリズ
ムは分光データに適用される。分光的に処理されたデー
タを画像として表示することの重要性は、主に定性的で
あり、使用者に有用な画像を提供することにある。しか
しながら、その用途によっては、分光像に固有の空間分
光相関を利用するアルゴリズムを適用することにより、
入手可能な画像データをより意味のあるように用いるこ
とも可能である。空間分光演算は分光像分析の最も強力
な型を代表する。１例として、以下の場合を考える。
サンプルはｋ種の異なった蛍光体で染色されたｋ種の
セル型を含有している（ここで用いられる「セル」とい
う語は生物細胞および「器具の視野内の領域」の双方を
意味する）。各蛍光体は別個の蛍光発光スペクトルを有
しており、ｋ種のセル型のうちの１つのみに結合する。
ｋ種のセル型の各々についてセル当たりの平均蛍光濃度
を知ることが重要である。この仕事を達成するために
は、以下の手順、すなわち、（１）画像中の各ピクセル
をそのスペクトルに従ってｋ＋１のクラス（ｋ種のセル
型プラス背景）に分類し、（２）画像を様々なセル型に
分割し、各型由来のセル数をカウントし、（３）各クラ
スの寄与する蛍光エネルギーを合計し、これを対応する
クラス由来のセルの総数で除算することからなる手順を
用いることができる。
この手順は分光および空間データの双方を使用する。
関連する分光データは特徴的なセルスペクトルの形状
（すなわち分光「シグネチャ」）を有し、空間データは
その多くが目には類似して見える様々な型のセル（すな
わち、セルブロッブ）からなる。この型の場合に対して
理想的な型の測定は分光像である。上記の場合、セルは
それらの特徴的分光シグネチャによって区別することが
できる。よって、適当な点演算を行うことによって、各
ピクセルがｋ＋１の値の１つに割り当てられた人工画像
を生成する。異なったセル型の蛍光発光スペクトルがSi
（λ）;i＝1,2,...,k,λ∈［λ1,λｎ］として既知であ
り、各ピクセル（x,y）で測定されたスペクトル（x,y）
がｓx,y（λ），λ∈［λ1,λｎ］であるとすると、以
下のアルゴリズムが可能な分類法（上記のステップ１）
である。
e2 iをセル型ｉに付着した蛍光体の既知のスペクトル
からの測定されたスペクトルの偏差とする。この場合、
最小２乗された「距離」の定義を採用すると、 が得られる。ここで、Ｒλは関心のある分光領域であ
る。画像の各点［ピクセル（x,y）］は次いで以下の基
準を用いてｋ＋１のクラスの１つに分類することができ
る。
点（ｘ、ｙ）∈クラスｋ＋１ if e2 i＞閾値 for全ｉ∈［1,k］ （７） 但し、点（ｘ、ｙ）∈クラスρ if e2 i＞閾値、ρは
min［e2 i］＝e2 ρ ここで、上述のステップ２および３（画像分割および
平均蛍光強度の計算）は式６および７に記載されたアル
ゴリズムに従って形成された人工画像上での標準的なコ
ンピュータ画像演算を用いて直接行われる。
他の方法は各ピクセルで測定されたｓx,y（λ）をｋ
種の既知のスペクトルsi（λ）;i＝1,2,...,kの一次結
合としてとして表現するものである。この場合、以下の
解となる係数ベクトルＣ＝［c1,c2,...、ck］を得る。
dF/dci＝０をｉ＝1,2...kについて解く（すなわち、
Ｆを最小とするciの値を得る）と、マトリクス式Ｃ＝A
-1B（９）、但し、Ａは要素 の次元ｋの正方行列、 として定義されるベクトル、が得られる。
算術演算を同様に２つ以上の分光キューブおよび／も
しくは所定のピクセルのもしくはライブラリ由来のスペ
クトルに適用することができる。例えば、データの第１
の分光キューブおよびデータの第２の分光キューブに属
するピクセルに属する対応するピクセル対の対応する波
長間で算術演算を適用し、例えば、データの２つの分光
キューブの平均化、時間変化のフォローアップ、分光標
準化等の目的でデータの第３の分光キューブを得ること
が考えられる。
多くの場合、分光像に存在する対象（例えばセル）は
その化学的構成要素および／もしくは構造が互いにいく
らか異なっている。共分散もしくは相関行列を生成する
ことによる主要成分分析を用いると、これらの小さな差
が増大する。以下に、共分散行列を用いた主要成分分析
を簡単に記載する。主要成分分析に関する詳細について
はMartens and Naes（1989）,Multivariate Calibratio
n,John Wiley ＆ Sons,英国、およびEsbensen et al.編
（1994）,Multivariance Analysis−in practice、Comp
uter−aided modeling as CAMO、およびUnscrambler's
User's guide,Trondheim,ノルウェーを参照されたい。
すなわち、ここで波長λｉ（ｉ＝1,...,N）での画像
のピクセルの強度は長さがピクセル数ｑに等しいベクト
ルと考えられる。これらのベクトルが測定波長に対して
１個づつ、計Ｎ個あるため、これらベクトルはｑ行Ｎ列
の行列B'に配列することができる。
行列B'の列各々について平均 を定義し、第２の標準化行列Ｂを として定義する。
共分散行列Ｃを行列Ｂに対して次元NxNのＣ＝BT・Ｂ
として定義する。Ｃは対角化し、固有ベクトルおよび固
有値はＣ・Vi＝μｉ・Vi、ただし、ViはＮ個の直交単位
ベクトルであり、μｉはｉ番目の単位ベクトルViの方向
における分散を示す固有値である。一般に、最小成分が
ピクセルの関数として最高の変動性を示す。
積BVi（ｉ＝1,...,N）は直交基底部の要素上への分光
像の射影であり、黒色画像および白色画像として別々に
表示することができる。これらの画像は所定の波長でフ
ィルターされた通常の白黒画像からは明確に得られない
特性を明らかにすることができる。
分光生物撮像系は、画像中の化学的構成要素間もしく
は機構にわずかな分光差が存在するすべての用途で潜在
的に有用である。測定は事実上いかなる光学系を用いて
も行うことができる。今日存在する撮像装置と本発明を
使用することのできるそれらの用途は以下の通りであ
る。
（１）反射顕微鏡、透過顕微鏡、蛍光顕微鏡、垂直倒立
顕微鏡、暗視野顕微鏡、共焦点（正常・定在波共焦点）
顕微鏡、反射コントラスト顕微鏡等を含む様々な型の顕
微鏡。これらの校正は生物学的研究、薬物開発業界、
（臨床的および解剖学的）病理学における細胞および組
織分類、血液学、最近の型を検出するための尿分析、遺
伝子同定および（間期および有糸***の中）染色体にお
けるマッピング、遺伝病診断、細胞オルガネラ解剖学お
よび生理学、核内におけるクロマチン分布および濃縮、
細胞質マッピング、核膜マッピング等に使用することが
できる。
特に、これらの構成は自動装置として、あるいは、染
色済もしくは未染色の、細胞塗末スミアもしくは組織切
片に由来するある細胞が病的か健康かを、病的である場
合にはその疾患の型および段階を生理学者が決定するた
めの器具として構築することができる。例えば、これら
の構成は支給頚癌のパップ塗末スミア分析、異なる型の
白血病に関する血液塗末スミア分析等に用いることがで
きる。
（２）正常レンズ、マクロレンズ、ズーム等を含む様々
な型のカメラレンズ、および皮膚、角膜、髪、および他
の人体外部組織を反射、自動蛍光、もしくは投与された
プローブ蛍光もしくは薬物誘導蛍光によって撮像するた
めの眼科カメラ。これらの構成の定型的な用途には
（ｉ）皮膚癌のマッピング、（ii）黒色腫と母斑（ほく
ろ）との区別化、（iii）ポートワイン様斑マッピング
および他の皮膚色素沈着病、（iv）処理前、中、および
後に処理時間を最適化（副作用を最小化）するために行
われるフォトダイナミック療法（PDT）、（ｖ）角膜病
が含まれる。
（３）腹腔鏡、可撓性もしくは剛性のファイバ光学要素
を含む細胞鏡、および肺、胃、腸、膀胱、結腸、前立
腺、子宮頚部、動脈、静脈、心臓等、いずれかの体内組
織を、例えば、白色光の反射、自動蛍光、およびレーザ
誘導蛍光等あらゆる検出モードで、通常および時分割状
態の双方で、短波長および多波長励起の双方を用いて、
撮像するのに適した他の内視鏡を含む様々な型の内視
鏡。これらの構成の円形的な用途は診断用の癌細胞マッ
ピングおよび病理学者および手術前、中、後の外科医の
ための分析器具、および手術中に病的組織の境界を正確
に可視化するためのものを含む。
（４）基底部カメラもしくは様々な基底部鏡、すなわち
（ｉ）糖尿病もしくは他の健康状態によって引き起こさ
れる虚血のようなあらゆる型の網膜疾患を、分析および
初期診断器具の双方として、また網膜のどの部分が冒さ
れ、病的血管および網膜組織をマップするために現在使
用されているフルオレセイン血管撮影法の追加物もしく
は置換物として、何時治療するするかを決定するための
治療器具として、マップするために用いられるもの、
（ii）網膜のレーザ治療中に眼科医が光凝固もしくは切
除すべき組織の領域および／もしくは境界を示すための
器具とするもの。
上述のように、透過、反射、散乱および蛍光光学にお
ける分光生物撮像系には多くの実験方法および特定の用
途がある。よって、全般に、光のような分析すべき放射
線は広範な供給源に由来するものとすることができる。
例えば、供給源は放射線を自然に出射するものであって
もランプもしくは他の照明された物体からの放射線を反
射もしくは透過するものであってもよい。また、UVやレ
ーザ等の適当な照明と共に、また照明波長が撮像分光計
に到達するのを防止する適当な手段と共に、各場合に問
題となる単数もしくは複数の対象に関する異なった情報
を得るために、蛍光もしくはラマン分光撮像測定を行う
ことができる。
蛍光顕微鏡法 a.一般論 多数の染料の使用［Jain（1989）,Fundamentals of D
igital Image Processing,Prentince−Hall Internatio
nal参照］は組織および細胞分析器具のうち、最も強力
かつ一般的なものの１つである。したがって、蛍光顕微
鏡法は光学顕微鏡に用いられる最も重要な実験方法のう
ちの１つである［Lakowicz（1983）,Principles of Flu
orescence Spectroscopy Plenum Press,New York,Londo
n］。蛍光プローブのパワーは主として特定の染料が結
合する生物学的構造の多様さによる［Waggoner（198
6）,Applications of Fluorescence in the Biomedical
Sciences,Taylor et al編,New York;Alan R.Liss,Inc,
3〜28ページ］。蛍光プローブの詳細な検討について
は、Mason（編）（1993）Fluorescent and Luminescent
Probes for Biological Activity,Biological Techniq
ues Series,Sattelle編集,Academic Press Limited,Lon
don、およびPloem and Tanke（1987）,Introduction to
Fluorescence Microscopy,Oxford University Press,R
oyal Microscopical Societyを参照されたい。
新規かつ、より洗練された多色蛍光染料分子の急速な
開発により、これらの染料の潜在力を充分に利用するこ
とのできる、より進んだ蛍光撮像技術への要求が形成さ
れ続けるであろう。蛍光染料がこれまで与え、今後も、
現在行われている研究の過程で与えるであろう革命的な
衝撃についての議論に関しては、Taylor et al（199
2）,The New Vision of Light Microscopy,American Sc
ientist,80巻、322〜335ページを参照されたい。
分光生物撮像は単純なフィルタに基づく方法に対して
蛍光撮像用途にいくつかの重要な利点を提供する。これ
らの利点には以下のものが含まれる。（１）関心のある
サンプル中の染料分子の実際の挙動に対してより多くの
定量的知見を提供する完全なスペクトルの測定。（２）
望ましくないバックグラウンド発光によって起こる従来
の問題の多くを解消する能力。（３）蛍光プローブの発
光スペクトルにそのミクロ環境（例えば温度）によって
生じる望ましくないあるいは予期できない分光シフトを
考慮してプローブ濃度を決定できるが、これに対して、
蛍光強度がバンドパスフィルタを用いてのみ測定される
場合、このような分光シフトは検出されず、プローブ濃
度分析時に顕著な誤差を引き起こす。（４）蛍光像取得
の単純化、そして、以下詳細に述べるように、適当な分
光分析アルゴリズムと共に使用される場合、単一の測定
で、多くの分光的に重なった蛍光染料を分離かつマップ
することが可能である。実際に、多変数分析、主要成分
回帰および他の分類アルゴリズムのような洗練されたデ
ータ分析アルゴリズム（Martens and Naes（1989）,Mul
tivariate Calibration,John Wiley ＆ Sons,Great Bri
tain参照）を適用することにより、多くの分光的に関連
したパラメータを同時に分析することが可能である。
分光生物撮像は、望ましくないバックグラウンド発光
に関連する問題を解消する手段を提供する。蛍光撮像顕
微鏡法は典型的には、サンプルが所望の短波長で励起さ
れかつプローブの蛍光発光に対応する限られた分光帯域
の波長のみが検出器（例えば、眼、カメラ等）に到達す
るように保証する蛍光フィルタキューブを用いて行われ
る［Mason（編）,Fluoresecent and Luminescent Probe
s for Biological Activity,Biological Series,Sattel
le編集,Academic Press Limited,London］。蛍光強度は
通常、励起源よりも数オーダー低いので、このようなバ
ックグラウンド発光は完全には除去できない［Benson e
t al（1985）,Cell Biol.,100,1309〜1323ページ］。望
ましくないバックグラウンド発光の３つの主要な供給源
は以下の通りである。（１）ジクロイックミラーコーテ
ィングおよび／もしくはフィルタで完全には遮断されな
い励起源からの放射線、（２）サンプルおよび時には光
学要素にも由来する自然蛍光は顕著にバックグラウンド
蛍光に寄与する。サンプル自然蛍光の効果は通常、吸収
および発光帯域が測定サンプルのそれらと重ならない蛍
光プローブを選択することによって低減することができ
る。同様に、自然蛍光を低減するように適当にコーティ
ングされた光学要素を選択することによっても、この種
の自然蛍光は最小化することができる。（３）励起フィ
ルタ、ジクロイックミラーおよびバリアフィルタの不適
当な（もしくは最適でない）組み合わせ。
入手可能な最善のフィルタリング方法であっても、望
ましくないバックグラウンド発光によって、関連する発
光をそのバックグラウンド（ノイズ）から引き出すこと
はしばしば困難となり、時には不可能となる。一方、分
光生物撮像系は（ｉ）蛍光染料の分光形状および分光領
域と（ii）バックグラウンド発光（自然蛍光を含む）の
分光形状および分光領域との間の分光差を用いて、望ま
しくないバックグラウンド発光の効果を除去することが
できる。
したがって、適当な分光像分析方法を蛍光プローブの
発光スペクトルに適用することにより、蛍光撮像測定の
S/N比、したがって、その精度を向上させることが可能
である。結果の定量化が望まれる場合、この分光生物撮
像方法の利点は比撮像に特に重要である。また、分光生
物撮像系は、フィルタをベースとした測定で最適のフィ
ルタを選択するのに費やされる時間および労力を節約す
ることができる。
蛍光測定において分光撮像が、望ましくないバックグ
ラウンド強度をどのように除去することができるかの１
例を図5a〜5bに示す。図5aは沃化プロピジウムで染色さ
れた細胞の蛍光分光像を示す。この像はオリンパス社の
倒立顕微鏡（IMT2）に取り付けられたスペクトラキュー
ブを用いて得たものである。サンプルは水銀光源で照明
し、蛍光強度はDMGフィルタキューブ（DM580ジクロイッ
クミラー、D590励起フィルタおよびBP545バリアフィル
タ）を通して撮像した。図5bは３つの別個の像ピクセル
に由来する蛍光発光スペクトルをプロットしたものであ
る。３つのスペクトルが各々２つのピークを有している
ことに着目されたい。623nmのピークは沃化プロピジウ
ムの実際の蛍光発光スペクトルによるものであり、775n
mの第２ピークは励起もしくはバリアフィルタで完全に
は除去されなかった励起光の残りに過ぎない。この望ま
しくないバックグラウンド放射線はさらに別の励起フィ
ルタ（例えばオリンパス社のPB460）もしくは適当なバ
リアフィルタを追加することによって除去可能である。
しかしながら、同じ測定が（PB460フィルタを用いな
い、非分光）撮像系で行われたとすると、各ピクセルで
測定された強度は、775nmピークの望ましくない信号の
寄与を含む図5bに示したスペクトルの積分に比例するこ
とになる。この状況を改善するように、従来のCCD像に
適用することのできる補正アルゴリズムが存在するが、
ノイズを伴う［Benson et al（1985）,Cell Biol.100,1
309〜1323ページ］。しかしながら、各ピクセルでの蛍
光を波長の関数として測定する分光生物撮像系を用いれ
ば、容易に分析を、関心のある蛍光染料の発光に対応す
る波長（例えば623nmピークの周辺）のみに限定し、そ
して、図5aに示す像において行われたように、残存する
偽の供給源の信号への寄与を除去することができる。
本発明の方法による分光生物撮像のパワーを適当な蛍
光標識と組み合わせることにより、多色蛍光像の取得は
大幅に単純化させることができる。分光撮像によって得
られる利益を充分に認識するためには、多数のプローブ
を含有するサンプルからの蛍光を測定するためにフィル
タをベースとする方法を使用する場合の典型的な工程を
考える。まず、互いに充分に異なる吸収および発光スペ
クトルを有するプローブを選択しなければならない。現
在、実際には、この要求により、試料中の蛍光標識の数
は３ないし５に制限される。次いで、励起波長を選択す
るための１つと発光スペクトルを捕捉するための１つと
からなる２つのフィルタホイールを回転することによ
り、あるいは、励起波長を選択するための１つのフィル
タホイールを回転する一方で３重ジクロイックフィルタ
で発光スペクトルを捕捉することにより、各試料に対し
て１つづつ蛍光像を得る。（運動部のない）回転可能な
フィルタを用いて励起および／もしくは発光波長を制御
する方法も提案されている。近年、多分光干渉フィルタ
を用いて多数の蛍光体を撮像することが可能になった
［Lengauer et al（1993）,Human Molecular Genetics
2,502〜512ページ］。（例えばフィルタキューブを交換
することによって）ジクロイックミラーを交換する手段
も必要である。各波長において像の焦点を再調節するこ
とも頻繁に必要となり、時には、より高いS/N比を得る
ために、CCDカメラの露光時間さえも代えなければなら
ない。この結果得られる、各々異なった蛍光染料の発光
に対応する白黒画像は次いで疑似着色され、（容易に得
られる市販ソフトウェアと共にデジタルコンピュータを
用いることによって）重ね合わされる。こうして得られ
る画像は数個の蛍光標識の位置をそれぞれ異なる偽カラ
ーで示す。ジクロイックミラーの位置のわずかな変化に
よってデジタル画像が並進シフトするため、多波長ジク
ロイックミラーの使用［４重波長バンドパス特性を有す
るジクロイックの使用についてはHiraoka et al（199
2）,Seminars in Cell Biology,第２巻、153〜164ペー
ジを参照されたい］または重ね合わせに先立つ画像の位
置合わせが必要である。画像位置合わせ法はより一般的
であるが、時間がかかり、しばしばわずかに満足な結果
を生じるに過ぎない困難な問題である。これらはまた、
多色蛍光像を得る際に考慮しなければならない技術的難
関である［Waggoner et al（1989）,Part B of Methods
in Cell Biology,第30巻、17章、449〜148ページ、Tay
lorおよびWang編集、Academic Press社］。
したがって、本発明の分光生物撮像方法はフィルタを
ベースとする方法が蛍光撮像に課していた基本的な制限
の１つを克服する。（後述のテキサスレッドおよびロー
ダミン蛍光体の実施例に示されるように発光スペクトル
が大幅に重なり合う染料を含む）無制限の数の蛍光染料
の発光スペクトルを同時測定可能とすることにより、分
光生物撮像は多数の蛍光プローブの発光像を順番に得る
必要をなくす。使用される蛍光プローブが一般的な励起
源で励起可能な場合、分光生物撮像系の使用による利点
は最大となる。この場合、単一の分光像獲得により、ほ
ぼ無制限の数の染料の蛍光発光を捕捉でき、（１）重な
り合わない染料の選択、（２）フィルタキューブの交
換、（３）励起もしくは発光フィルタの交換、（４）焦
点および／もしくは露光時間の最適化もしくは画像の位
置合わせの必要がなくなる。もちろん、難点は一般的な
供給源で励起できる適当な染料を選択することにある。
したがって、互いに授受される蛍光エネルギーで励起
される染料は、分光生物撮像系を用いる多色蛍光撮像に
最適である。明らかに、類似した発光特性を有する染料
の使用は（例えば顕微鏡下における）視覚検出をより困
難にする。しかしながら、この制限は本発明の分光生物
撮像方法を使用することによって解消される傾向にあ
る。
b.多数蛍光体の分光同定 本発明による分光生物撮像の使用により、数多くの染
料（すなわち、蛍光体、蛍光部分）を１回の測定で同時
に測定することが可能になる。染料の型にはなんら制限
がなく、分光的に重なり合う染料（例えばローダミンと
テキサスレッド）も後述（実施例５参照）のように適当
なアルゴリズムを適用することによって同定し、それら
出現を画像中にマップすることができる。多くの染料を
同時に使用する場合、それらの励起波長、蛍光強度およ
び発光スペクトルを注意深く考慮するべきである。これ
が適切に行われた場合、結果は定量的に分析することも
できる。例えば、数種のタンパク質を、これらに特異的
に結合する蛍光標識された適当な抗体を用いた単一の測
定においてマップすることが可能である。標準的な校正
された染料を用いて絶対濃度を測定することも可能であ
る。多数蛍光プローブの検出が顕著な利点となり得る重
要な１例はFISH（蛍光インシチュハイブリダイゼーショ
ン）［Emanuel（1993）,Growth Genetics and Hormones
9,6〜12ページ］であり、これは染色体レベルで遺伝子
を分析し、遺伝子増幅、欠落、転移、再配置等の遺伝子
欠陥の可能性を発見するために用いられる。
多くの癌および出産欠陥を含むある種の病気および障
害は１つ以上の遺伝子中の欠陥によって引き起こされ
る。他の多くの病気は遺伝子成分を有すること、すなわ
ち、単独では病気を引き起こさないが、それに寄与し、
あるいは生命の後期において病気を発展させる遺伝子欠
陥が存在することが知られ、あるいは推測されており、
当分野においては、多因病および遺伝素因と呼ばれる現
象である。既知の病気と可視遺伝子欠陥との相関によっ
て、医者は明確な診断をし、多くの病気の早期診断およ
び治療を可能にする。遺伝子カウンセリングは予期され
る親や危険性のある個人に将来の潜在的かつ深刻な問題
を警告することができ、適当な介入を可能にするもので
ある。
これまでに5000を超える遺伝子的障害が同定され、そ
れらの多くは多重遺伝子欠陥と関連づけられている。染
色体が遺伝情報の担体であることが発見された後、科学
者は特定の障害の原因となる染色体内の可視欠陥を実証
することが可能であると推論した。1960年代にスライド
グラスに展開された有糸***染色体の顕微鏡ベースの分
類のために染色技術が開発された。数10年にわたり、染
色体バンド化パターンはヒト遺伝子障害と有糸***染色
体の観察される構造的異常とを相関させるために使用さ
れた。染色体は典型的にはギームザ染色（Ｇ−バンド
化）の後に明視野顕微鏡法で観察されるか、あるいは、
蛍光染色後に蛍光顕微鏡法で観察され、長さ方向に沿っ
た特徴的な明暗バンドが明らかにされる。患者のバンド
化パターンを正常な染色体のものと注意深く比較するこ
とにより、異常や遺伝子病を引き起こす転移（染色体間
もしくは内での遺伝子物質の交換）、欠損（染色体もし
くは染色体片の損失）、追加、反転および他の欠陥のよ
うな異常が明らかになる。
しかしながら、例えば、膿性線維症（CF）や他の多く
のもののような多くの深刻な遺伝子病は１つもしくは数
個のヌクレオチドのみの追加、欠損もしくは置換を伴う
突然変異によって引き起こされる。このような小さな欠
陥は上述の染色体バンド化技術では検出不可能であり、
多年にわたり、細胞遺伝学者は微小な欠陥を見いだしか
つ定量化するための技術を開発しようと努力してきた。
蛍光インシチュハイブリダイゼーション（FISH）は過
去25年間に多くの補完的技術の改良によって発展した。
その出現は、染色体上の遺伝子の正確な位置をマップす
るためのより良い器具を開発し、染色体の総染色では可
視化できない小さな遺伝子欠陥を検出しようとする細胞
遺伝学者の要求によって促されたものである。ヒトの全
遺伝子を同定かつマップしようとする大胆な計画である
ヒトゲノムプロジェクト（HGP）はFISHに関心を認め、
必要の多いDNAプローブの開発を促進した。また、現在
のFISH技術は同時に強力な免疫学的プローブの開発、顕
微鏡法および分光法用の優れた蛍光染料の種類の増大、
および蛍光顕微鏡法に用いられる対物レンズ、照明器お
よびフィルタの劇的な改良によって可能となった。
FISHのパワーおよび有用性は多くの要因による。
（１）FISHは分離された染色体および核のみならず固定
されたパラフィン埋め込み組織切片内の全細胞に対して
も使用できる。（２）これは比較的小さな欠陥を検出で
きる（より小さな欠陥を検出する能力は一定して増加し
ている）。（３）これは結果を比較的迅速に提供するこ
とができる。（４）その適度な費用により、多くの診断
および研究所での使用が可能である。（５）様々なプロ
ーブおよび標本型に対する応用開発が可能である。
（６）高い特異性および感度を（７）典型的には２時間
である短い処理時間で得ることができる。
FISHの多くの用途においては、細胞遺伝学者は顕微鏡
の接眼レンズもしくはモニター上の像を観察するだけ
で、蛍光標識が存在するか否かを決定することができ
る。いくらかより複雑な標本においては、１つもしくは
２つの着色された標識を単純計数することができる。し
かしながら、デジタル画像を処理し、かつそれらから数
量データを抽出することができるという能力により、FI
SH技術には新たな膨大な可能性が追加される。本発明の
ような適当な撮像方法は、標識された染色体および遺伝
子座を明確が同定できるように微弱なFISH画像を強化す
ることができる。容易に達成可能な実験条件下で、標識
された部位を自動計数することが可能である。また、各
標識された部位を測定し、DNA量を計算して、例えば、
特定の遺伝子の、存在する複製数を明らかにすることも
できる。多色FISHのような新規技術はカラー画像分析を
用いて多数（3,4,5およびそれ以上）の蛍光プローブを
検出し、定量化する。
上述のように、FISHは標識されたプローブの位置、各
染色体上の標識された部位の数、および各部位における
標識の強度（遺伝子物質の量）に関する情報を提供する
ことができる。動原体（反復DNA）プローブは各標的染
色体に存在する複製を標識し計数するために用いられ
る。遺伝子座に特異的なプローブは遺伝子物質の小領域
の位置をマップするために使用される。これらの型のプ
ローブの双方は原型のままの相間核および有糸***染色
体スプレッドに用いることができ、視覚的に計数可能で
ある。これらは、特定の染色体、染色体断片、もしくは
遺伝子の複製を過多もしくは過小に有することによって
特徴づけられる遺伝子病を同定するために慣習的に使用
される。ある種の癌のごく初期段階においては、細胞が
異常と認識される前に、特定の遺伝子の数が増大する、
当分野において遺伝子増幅と呼ばれる現象が起こること
があるが、これは遺伝子座特異性プローブの使用によっ
て検出可能である。FISHを用いて癌性細胞中の染色体異
常を検出すると、病気が到達した発達段階を指摘し、し
たがって、その多くの効果が段階に対して特異的な、最
適の治療を選択することができる。したがって、貴重な
時間を節約し、患者の苦痛を最小化し、最も効果的な、
段階に特異的な治療を選択される。
１つの特定の染色体を（例えばフロー血球計算によ
り）分離することによってその染色体の全表面を均一に
標識子し、これを（例えば音波処理によって）物理的に
もしくは（例えばエンドヌクレアーゼによって）酵素的
に切断し、全片に対して１組のプローブを発生させるこ
とが可能である。全染色体プローブは染色体ペイントと
しても知られており、標的染色体のすべての複製物を蛍
光標識するものである。染色体ペインティングの重要な
用途の１つはある種の癌で特徴的に起こるような２つの
染色体間の欠損および転移の検出にある。
例えば、染色体Ａが特異的に緑のペイントで標識さ
れ、染色体Ｂが特異的に赤のペイントで標識される場
合、ＡからＢへの物質のあらゆる転移は赤い染色体上の
緑色領域（あるいは反対）として認められる。典型的に
は、正常な染色体から発生した染色体ペイントを用いて
異常な（患者の）染色体の欠損もしくは転移を検出す
る。逆染色体ペインティングは異常な染色体から発生し
たプローブを用いて、異常な染色体に物質を寄与した様
々な正常な染色体に由来するDNAを同定する。
比較ゲノムハイブリダイゼーション（CGH）は逆染色
体ペインティングの変種であり、染色体の完全な組から
２つのDNAプローブのカクテルを発生するものである。
１つのカクテルは正常な１組の染色体から発生し、他は
１組の異常な（例えば腫瘍）染色体から発生する。２つ
組のプローブは異なるレポータ分子を用い、例えば、正
常なDNAが赤い蛍光を示し、異常なDNAが緑の蛍光を示す
ようにする。正常な***中期のスプレッドは両カクテル
で同時にハイブリッド化され、カラー画像分析を用いて
評価される。赤よりも緑の蛍光が強い正常な染色体領域
は、患者の異常な細胞中のその遺伝子でDNA増幅（多数
の遺伝子複製）が起きたことを示す。緑よりも赤の蛍光
が強い（緑／赤比の低下した）領域は、患者の染色体中
の遺伝子欠損部位を示し、赤と緑の蛍光が同等である領
域はその部位でDNAの変化が起こらなかったことを示
す。CGHおよび関連する技術は従来の標識よりも複雑で
あるが、従来可能であったよりも、より微細かつ広範囲
な遺伝子変化を検出かつ定量化することを可能にするも
のである。
上記の説明から、核型判定、転移／再配置検出、染色
体欠損／増幅、および遺伝子マッピングが、単純なカラ
ー蛍光画像の代わりに、比較的高分光解像度で全分光像
を構築する本発明の感度の高い定量的な分光撮像方法に
よって、大いに利益を得ることがわかる。その理由は、
このような方法がサンプル調製時間を短縮し、ハイブリ
ッド化された蛍光プローブをバックグラウンドに残存す
るものから（小さな分光シフトによって）区別すること
を可能にし、極めて多数のプローブを同時に測定するこ
とを可能にするからである。
したがって、本発明の目的の１つは、プローブ技術に
おける利点を活用するFISH撮像法を提供することにあ
る。本発明によれば、任意の染色体分析において分析可
能なプローブ数を大幅に増加させ、かつ従来技術の方法
に比べて自動化の速度および程度を劇的に向上する。
本発明のFISH撮像法はスペクトラキューブ系の利点を
活用するものであり、単一の実験で顕微鏡視野内の全ピ
クセルからの蛍光スペクトルを同時に得、数多くのプロ
ーブの位置を検出できるものである。染色体特異性プロ
ーブおよび新規の標識法が入手できることに関連して、
これらの方法は異なった色（すなわち、ヒト核型につい
ては24色の異なった色）でペイントされた各染色体を有
するFISH核型が形成可能である。これらの方法により、
極めて高いサンプル処理能力が得られ、実質的に無制限
の数のプローブについての分析が可能になる。
上述のように、本発明の主要な概念の１つはFISH分析
に多くの蛍光プローブを使用することにある。FISHに用
いられるDNAプローブを標識するためには、酵素反応を
用いてビオチンもしくはジゴキシンのようなハプテンを
DNAに組み込む間接法を含む、数多くの方法が利用可能
である。有糸***染色体スプレッドもしくは間期核への
ハイブリダイゼーションに続いて、蛍光標識を免疫学的
方法を用いてハイブリッドに付着させる。より近年に
は、蛍光染料は直接プローブに組み込まれ、中間ステッ
プを用いることなく測定されている。標準的なFISH染料
にはフルオロセイン、ローダミン、テキサスレッド、お
よびカスケードブルーが含まれ、多プローブ分析は異な
るプローブを異なるハプテンもしくは蛍光染料で標識す
ることによって達成される。
蛍光は発光の１形態であり、光子が、基底電子状態に
ある蛍光体と呼ばれる分子に吸収された後に生じるもの
である。電子がより高いエネルギー軌道に移る結果、分
子は励起状態まで高められる。この余分なエネルギーは
電子が当初の基底状態に戻るときに散逸し、光量子を放
出する。蛍光は吸収光よりも波長が長い。このシフトは
制限されており、発光は励起波長近傍で行われる。この
ため、ある分光領域で励起される蛍光体は類似した分光
領域で発光する。例えば、励起が青色領域で起こる場
合、発光は緑色と予想される。したがって、異なるスペ
クトルを発する数多くの異なるプローブを使用したい場
合、それらは波長が近接してなければならず、多くの場
合、重なり合っていることが明らかである。したがっ
て、異なったプローブを識別可能とするためには、分光
解像度が極めて重要である。
本発明の方法によれば、各プローブに偽カラーが付与
され、その情報はコンピュータ画面に表示される。多色
蛍光の使用により、多数のプローブによって利益を受け
得るFISHを重要な臨床用途にまで拡張する可能性が生じ
る。その例には異数性および染色体構造研究、標識染色
体および完全なFISH核型の検出が含まれる。単一のハイ
ブリダイゼーションによって多重情報が得られるため、
処理能力が向上し、遺伝子投与効果の評価もしくは欠損
の程度の測定のために内標準を用いることができる。
本発明の方法は白色光源もしくはコヒーレントな光源
によって数個の狭い分光帯域で励起された蛍光、および
冷却されたCCDを備えたセンサを用いるものである。し
たがって、各々異なったDNAプローブを表す多数のスペ
クトルを同時に測定することができる。このため、染色
体の多数のスナップショットを撮影した後で画像を再構
築する、時間がかかりかつ人工的な結果を生じる従来の
方法に比べて画像取得の速度および精度が向上する。よ
って、本発明は、高感度、高速、かつ高精度に多数プロ
ーブの検出を可能にするため、従来の細胞遺伝学的撮像
に対して顕著な進歩性を示すものである。
c.ミクロ環境変化の検出 （例えば、抗体に付着した際の）蛍光染料の使用は特
定の化学物質（例えばタンパク質）の存在を同定するこ
とに限定されない。また、ある種の染料は実際の化学的
および物理的なパラメータをプローブするためにも使用
できる。例えば、水素原子を獲得もしくは損失するとス
ペクトルが変化する染料はpHインジケータとして機能す
ることができる。局所的電位、pHレベル、および細胞間
濃度（例えばナトリウム、マグネシウム、遊離カルシウ
ム等）は現在、様々な用途に用いられている。例えば、
Tsien（1994）,Chemical and Engineering News,34,34
〜44ページを参照されたい。
環境感受性染料の使用は、一般的な分析方法［Bright
et al,BioTechniques 5,556〜563ページ］である比撮
像に密接に関連する。今日使用されている染料のいくつ
かにおいては、分光範囲の一部においてのみ、環境に関
連した分光変化が起こる。２つの分光範囲における蛍光
発光の比を測定することにより、サンプルの厚さ、照明
の不均一さ等に左右されずに環境の影響を調べることが
できる。
本発明の分光生物撮像方法は、２つの（もしくは３つ
の）別個の波長における蛍光を測定する従来の技術を用
いることなく、完全なスペクトルを測定できるものであ
り、比撮像用途においていくつかの利点を有している。
完全なスペクトルを測定することは比撮像の精度および
感度を顕著に向上する。例えば、完全なスペクトルを用
いて、２つの異なった分光範囲で２つの積分された強度
の比を測定し、同時に、関連した分光範囲のみにおいて
積分をおこなうことにより、すべてのバックグラウンド
強度を除去することが可能である。また、測定された分
光データをライブラリに保存された参照スペクトルに当
てはめることによる関心のある環境パラメータを決定す
るような、より洗練されたアルゴリズムを分光データの
分析に用いることもできる。分光分析は画像の各点で行
われるため、（例えば、Rutenbergの米国特許第4,965,7
25号に記載されるように）サンプルの充分な形態学的分
析が可能である。分光生物撮像はこのように、関心のあ
る物理的および化学的パラメータをマップ（すなわち画
像として表示）する能力を提供し、潜在的により画期的
かつ効果的な研究を可能にするものである。
分光生物撮像技術を用いることにより、それ自体では
他の比方法を用いる分析に適合しない環境感受性染料を
使用することが可能になる。また、数種の環境パラメー
タ（例えば電圧およびpH）に感受性の染料の検出は適当
な分析アルゴリズムを用いることによって達成できる。
スペクトラキューブ系を用いてミクロ環境感受性染料
の蛍光発光を検出する方法の１例を図6a〜ｄに示す。図
6aは有糸***期の細胞のRGB偽カラー画像を示し、有糸
***細胞はアクリジンオレンジで染色されている。アク
リジンオレンジは染料の形態によってその蛍光発光が変
化する線量である。単量体形態において、染料分子は溶
液中で高度に希釈され（すなわち、低濃度となり）、蛍
光極大は530nm付近にある。これに対し、二量体（およ
び多量体）の蛍光は、濃縮溶液において典型的には640n
mにピークを有する［W.T.Mason（編）（1993）,Fluores
cent and Luminescent Probes for Biological Activit
y,Biological Techniques Series,Sattelle編集、Acade
mici Press社、Londonの第６章参照］。図6bは、図6aの
分光像で測定された数千のスペクトルから選択された２
つのスペクトルをプロットしたものである。スペクトル
Ｍはアクリジンオレンジが単量体である細胞質領域から
選択されたものであり、スペクトルＤはアクリジンオレ
ンジが二量体である核領域から選択されたものである。
これら２つのスペクトルは染色体上の点の蛍光発光（ス
ペクトルＤ）および細胞の細胞質上の点の蛍光発光（ス
ペクトルＭ）に対応する。アクリジンオレンジ染料は、
アクリジンオレンジ分子とその周囲の化学的環境との間
のエネルギー移動の結果として分光シフトを示す。図6c
および6dは、アクリジンオレンジの単量体形（Ｍ）およ
び二量体形（Ｄ）のスペクトルをそれぞれ参照スペクト
ルとして用いて行われた２つの類似性マッピング（上記
参照）の結果を示すものである。このアルゴリズムは異
なる形態の染料分子間の定量的識別を容易にし、したが
って、細胞の構造および環境に関して付加的な知見を可
能にするものである。図6cは図6bのスペクトルＤを参照
スペクトルとして用いた類似性マッピング分析の結果を
示すものである。この分析により、調査された有糸***
細胞の極に二量体形のアクリジンオレンジが蓄積し、こ
こで核酸の多くが濃縮されていることが明らかになっ
た。図6dは図6bのスペクトルＭを参照スペクトルとして
用いた類似性マッピング分析の結果を示すものである。
図6c〜ｄに示した画像は、このように、単量体形のアク
リジンオレンジ（細胞質内）および二単量体形のアクリ
ジンオレンジ（染色体内）の蛍光によって分光差を強調
するものである。したがって、本発明の方法は細胞成分
によって誘発された蛍光シフト（すなわち投与されたプ
ローブによって誘発された蛍光）を明らかにするのに極
めて適している。
d.天然含量からの自然蛍光の測定 葉緑素は自然（すなわち天然）蛍光を示す天然顔料で
ある［Haliwell（1981）,Chloroplast Metabolism−the
structure and function of chloroplast in green le
af cells,Clarendon,Oxford,U.K.］。葉緑素の蛍光スペ
クトルは広範に研究されている。なぜなら、それは典型
的な蛍光染料由来のスペクトルよりも複雑であり［Pars
on（1988）,Photosynthesis and Other Reactions Invo
lving Light,Biochemistry（Zubay編），第２版、564〜
597ページ、Macmillan,New York］、また、葉緑素自然
蛍光は多くの用途で重要であるためである。例えば、葉
緑素自然蛍光測定を用いて細胞代謝をプローブし、光合
成を追跡することができる。また、自然蛍光はポルフィ
リン類、天然細胞質タンパク質および他の化合物でも起
こる。細胞中の異なった部分の分光差を測定できるとい
う分光生物撮像系の能力は生体細胞中の細胞小器官の機
能に重要な知見を提供する。葉緑素分光撮像の１例を図
7a〜ｄに示す。Oedogonium種の藻を蛍光顕微鏡法で検査
した。励起は緑色分光範囲（540nm）で行われ、赤色分
光帯の発光をスペクトラキューブ系で測定した。図7aは
試料から発光された総蛍光を明らかにする。赤色葉緑素
蛍光（右側）および試料中の細胞残部からの関連する緑
色励起光（左側）の双方が明確に認められる。赤色蛍光
を示す個々の藻細胞は部分的にしか見えない。試料の４
つの異なるピクセルに由来する蛍光スペクトルを図7eに
示す。発光ピークを685nmに有するスペクトルＡは赤色
蛍光が支配的な中央の藻中の点から測定したものであ
る。一方、スペクトルＢは、ピークを542nmに有する、
緑色発光を示す細胞残部の点に対応する。スペクトルＣ
およびＤは藻上の２つの付加的な点に対応する。図7bに
示すように、スペクトルＡを類似性マッピング分析のた
めの参照スペクトルとして用いると、残部で隠された藻
の部分を含んで、藻中の葉緑素を正確に見出し、その比
濃度を測定することができた。この偽着色された図は、
葉緑素は、分散されているが、細胞の中心に位置してい
ることを示している。図7cは、画像中の赤色蛍光が微弱
な点を参照スペクトルとして用いた類似性マッピング分
析の結果である。これらから、異なる細胞部位で異なる
葉緑素強度が存在すること、例えば、蛍光のいくらかは
細胞膜の周囲で起こることが示される。したがって、類
似性マッピングアルゴリズムを用いることにより、細胞
中の特定の細胞下領域から発せられる特徴的な蛍光を可
視化することもできた。図7dは細胞残分に由来する緑色
スペクトルを参照スペクトル（図7eのスペクトルＢ）と
して用いた類似性マッピング分析を適用した場合の細胞
残分のスポンジ状構造を強調するものである。また、こ
の最後の分析は、緑色光を反射する藻の細胞壁を明らか
にした。さらに、この類似性は、単細胞藻の位置も示し
た。
自然蛍光の研究は他の多くの用途を有している。例え
ば、自然皮膚蛍光の研究は、異なった組織成分および組
織の組織学的機構に対応する「分光指紋」を同定した。
組織分光指紋を用いて異常組織から正常なものを識別す
ることは広範に研究されている。例えば、Marchesini e
t al（1991）,Photochemistry and Photobiology 53,77
〜84ページ;Bottiroli et al（1994）,Lasers in Surge
ry and Medicine;およびProfio（1984）,IEEE Journal
of Quantum Electronics QE−20,1502〜1506ページを参
照されたい。このような医療診断用途における分光生物
撮像の潜在的臨床有用性は顕著であると思われる。
e.蛍光共鳴エネルギー転送 FRETは２つの蛍光体間の空間的分離を測定可能にする
蛍光法である。FRETにおいては、「ドナー」および「ア
クセプタ」と呼ばれる２つの異なった蛍光体が用いられ
る。この１対の蛍光体は、ドナーが励起された場合、こ
れが蛍光を発するか、その吸収したエネルギーを第２の
蛍光体（アクセプタ）に転送して後者を蛍光発光させる
ことができるように、注意深く選択される。したがっ
て、発光スペクトルの違いからドナーとアクセプタとを
識別することが可能である。
ドナーとアクセプタとの物理的分離は、エネルギー転
送効率は２つの蛍光体間の距離に強く依存する（典型的
には効率は分離距離の６乗の逆数に比例する）。これら
２つの蛍光体を２つの異なる型の分子にもしくは２つの
異なる状態にある同一の分子に付着させ、（顕微鏡に取
り付けられた）分光生物撮像系を用いてFRETを測定する
と、異なる分子（もしくは分子状態）を、それらの空間
的分布を同時に測定しながら、識別する能力が容易なも
のとなる。エネルギー転送現象に関する詳細な考察は当
分野の文献に見出すことができる［Herman（1989）,Flu
orescence Microscopy of Living Cells in Culture,パ
ートＢ、第８章、219〜243ページ、Taylor and Wang編
集、Academic Press社；およびJovin and Arndt−Jovin
（1989）,Cell Structure and Function by Microspect
rofluorometry,第５章、Academic Press社参照］。
FRETは３つのパラメータを測定することによって行わ
れる。これらは（ｉ）ドナー吸収ピークで励起された時
のドナー発光ピーク強度、（ii）ドナー吸収ピークで励
起された時のアクセプタ発光ピーク強度、および（ii
i）アクセプタ吸収ピークで励起された時のアクセプタ
発光ピーク強度である。次いで、これら３つのパラメー
タを補正および分析して、検査中の２つの蛍光体の分離
距離および位置を得る。
分光生物撮像系、特にスペクトラキューブ系を用いる
ことにより、測定結果が向上するのみならず、測定が容
易になる。実際、分光生物撮像法を用いることにより、
励起がドナー吸収帯にある場合にはドナーおよびアクセ
プタ吸収帯の双方が同時に測定可能であるため、２回の
測定しか必要とされない。
分光生物撮像法を用いることにより、FRET法をさらに
発展させることができる。例えば、FRET用に、環境変化
に感受性を有するアクセプタを選択し、分子距離測定と
同時に、比撮像法を用いてミクロ環境変化をモニタする
ことができる。さらに別の例としては、FRETを２つの異
なるアクセプタと共に用い、（異なる発光スペクトル
で）２つの分離距離および蛍光***置に関する情報を同
時に供給することができる。二重アクセプタ実験を従来
の方法で行うのは極めて困難である。分光生物撮像の使
用はFRET結果の精度を高め、実験手順を簡略化し、より
強力な分析法を可能にすることができる。
透過顕微鏡法 光学顕微鏡法は生物学および病理学において細胞およ
び組織を可視化するための最も基本的な技術である。透
過顕微鏡法は細胞小器官および構造の細部の本質的に低
いコントラストの影響を大きく受ける。このコントラス
トを改善するために数多くの方法が開発されており、そ
れらには染色および空間フィルタリングが含まれる。本
発明の分光生物撮像法の使用は、透過顕微鏡下で検査さ
れる細胞および組織の見掛け上のコントラストを増大さ
せるための最も直接的な方法の１つであり、これによっ
て、この一般的な顕微鏡的方法の同定および識別能力は
劇的に改善される。ここで提案される基本的な手法は、
分光像を測定し、次いで、この大量な情報を分光的およ
び形態学的分析法およびアルゴリズムと共に使用して、
細胞および細胞下の細部を同定かつマップしようとする
ものである。
生物学的試料の組織学的検査を促進するために、前世
紀中に、細胞中の異なる巨大分子に特異的に結合する有
機染色を用いる様々な染色技術が開発されたが、分子ベ
ースの染色技術は今日まで経験的なものである。他の画
像コントラスト強化法には暗視野および偏光法のような
空間フィルタリング技術の使用が含まれる［Kam（198
7）,Quarterly Reviews of Biophysics,20,201〜259ペ
ージ参照］。最も一般的な染色技術はロマノウスキ−ギ
ームザ染色およびヘマトキシリン−エオシンである。ロ
マノウスキ−ギームザ染色法は２つの染料を用いるもの
で、その１つはアズールＢ（トリメチルメチオニン）、
すなわちチアジン染料であり、２つめはエオシンＹ（ヒ
ドロキシキサンテンブロマイド）である。チアジンはカ
チオン性染料であり、したがって酸性細胞成分に結合す
る傾向にあり、エオシンはアニオン性染料であり、塩基
性細胞成分に結合する傾向にある。これら２つの要素は
いわゆるロマノウスキ−ギームザ効果を形成すると広く
認められており、この効果は、いくつかの染色部位で特
定の紫色の新規な染料複合体の発達として発現される。
アズールＢ−エオシン複合体の分子ベースは不明であ
る。ある著者はアズールＢがDNAの燐酸基のようなアニ
オン性構造に結合し、エオシンは同時にDNAの隣接する
カチオン性部位およびアズールＢの双方に結合すると考
えている。より最近に提案されたアズールＢ−エオシン
複合体のモデルでは、フリードリッヒおよび同僚［Frie
drich et al（1990）,Histochemistry 93,247〜256ペー
ジ］はアズールＢが最初にDNA分子の燐酸ジエステル残
基に結合すると示唆した。著者等はエオシン分子のフェ
ニル基が（単一面に存在する）アズールＢ分子に結合す
る部分であると仮定した。紫色はエオシン吸収ピークの
赤色シフトの結果であり、これは結合したエオシンの誘
電偏光によって引き起こされる。このようなアズールＢ
−エオシン複合体の存在そのものは他者によって依然と
して疑問視されている［Friedrich et al（1990）,Hist
ochemistry 93,247〜256ページ;Bittiroli et al（199
0）,Lasers in Surgery and Medicine;Profio（1984）,
IEEE Journal of Quantum Electronics QE−20,1502〜1
506ページ;Herman（1989）,Fluorescence Microscopy o
f Living Cells in Culture,パートB,第８章、219〜243
ページ、Taylor and Wang編集、Academic Press社；お
よびJovin and Arndt−Jovin（1989）,Cell Structure
and Function by Microspectrofluorometry,第５章、Ac
ademic Press社参照］。
どの技術でも、染色によって、細胞の細胞下区画を識
別し、特に核内のクロマチン機構を識別することが可能
である。ダークブルーに染色されたヘテロクロマチンと
ピンクに染色された真正クロマチンとの間の比は細胞切
片中の細胞を評価する際の主要な決定因子の１つである
ことが確立されている。しかしながら、染色された試料
から得られた結果は依然として、ある程度は、経験、技
術、および主観的解釈の問題である。科学者の経験によ
る効果を低減するため、有機染色と巨大分子との間の相
互作用の分光特性を研究し、したがって、DNA染色のい
わゆるロマノウスキ−ギームザ効果を評価しようとする
試みが行われた。
透過光学顕微鏡法に適用された分光撮像は細胞および
組織の寸法、形状およびテクスチャ特性の定量的測定を
大幅に向上することができる。この技術は形態計測と呼
ばれ、生物学および病理学において急成長している分野
である［Erler et al（1993）,Modern Pathology,6,612
〜618ページ］。形態計測分光像分析は微細な細胞学的
および血液学的特性を評価し、診断的および予知的評価
のための有用な超構造的および医学的情報を得ることを
可能にする［Hytiroglou et al（1992）,Cancer 69,88
〜212ページ］。本発明の方法による分光生物撮像を用
い、染色された組織における真正クロマチンに対するヘ
テロクロマチンの比を定量的に測定しかつ異なる細胞小
器官を同定する能力は下記および実施例２で示される。
細胞生物学における分光生物撮像の利点は、この技術
が所定の染色された細胞の分光的情報を点ごとに測定で
きることにある。細胞画像の各ピクセルは所定の点にお
ける透過光に関する正確な情報を提供し、これは直ちに
吸収スペクトルに換算される。図8aは血球用のメイ−グ
ルンワルド−ギームザ法によって染色された血漿血球を
示すものである。図8bは細胞の様々な細胞下部位、およ
び矢印で示された４つのスペクトルが収集されたピクセ
ルを示す。ピクセルＡはヘテロクロマチン、ピクセルＢ
は青色染色された細胞質ゾル領域、ピクセルＣは細胞質
小胞、ピクセルＥは細胞質ゾル中の点を示す。これらの
スペクトル（Ａ〜Ｅ）はこの分光像中に存在する１万個
のうちの５つに過ぎない。図9aは細胞画像のこれら５つ
のピクセル由来の透過光スペクトルを示す。これらのス
ペクトルは入射照明光源について補正がされていない。
真正クロマチンおよびヘテロクロマチンからの透過光は
強度が低く、いくらかの分光差を示す（図9aにおけるス
ペクトルＡおよびＣを比較されたい）ことが認められ
る。一方、細胞質ゾルから得た点のスペクトル（Ｂ）は
特異的な変化、特に光強度差を示す。図9bは細胞外で記
録された入射光に相対的に計算された対応スペクトルの
吸収を示す。染色された細胞中の細胞下区間（Ａ〜Ｅ）
は画像中に肉眼で認められる色範囲の起因となる分光特
性を有することが認められる。しかしながら、肉眼は異
なる着色巨大分子複合体をそれらの色に基づいて識別か
つ分離するには能力が限られている。スペクトラキュー
ブをベースとするシステムを本発明と組み合わせると、
画像から選択されたスペクトルを、全画像を構成する他
の１万個の異なるスペクトルと比較することが可能にな
る。したがって、画像の各点は選択された（すなわち参
照）スペクトルに対する、あるレベルの類似性によって
特徴づけられる。上述の類似性マッピングと呼ばれる数
理アルゴリズムは元の分光像からグレーレベル画像を形
成する。原則として、このアルゴリズム（および他の多
くの類似したアルゴリズムが試験可能である）を用いる
ことにより、選択された参照ピクセルと類似した特性を
有する画像中のすべてのピクセルを見出すことができ
る。この技術は染色された細胞中の微細部を識別する肉
眼の能力を高める。このような画像は特定の画像に関連
する定量的な結果として定義することができる。
図10a〜ｄは図8aのスペクトルを用いて再構築した４
つの定量的類似性マッピング画像を示すものである。図
10aは図9aのスペクトルＡを参照スペクトルとするマッ
ピングで再構築された類似性マップである。核内の真正
クロマチン領域の微細構造が顕著に強調されている。真
正クロマチンネットワークが核の全部にわたって緊密に
結合し、核膜の上部にまで及んでいることが検出でき
る。核の中心には特に明るい部位があり、核小体を示す
ものと思われるが、この推測は図10cに示す類似性マッ
プによって支持される。図10bは図9aの参照スペクトル
Ｂを用いて構成された類似性マップをしめすものであ
る。この図では２つの主要な特性が認められ、これらは
双方とも膜境界に関連する。その１つは細胞の中心にあ
り、他方は細胞外膜を画定するものである。新規に形成
された画像は、細胞質ゾルの中心の明るいアレーは大き
なゴルジ複合体であるという考えを支持することができ
るものであり、この解釈は、ゴルジ領域を取り巻く周囲
の液胞を示す図10dの類似性マップによって支持され
る。図9aの参照スペクトルＣを用いたマッピング後の核
ヘテロクロマチンを図10cに示す。この画像は図10aに示
したものと補完的であるが、他方、核ヘテロクロマチン
の様々な複合体間におけるいくつかの予期できない結合
を示している。最後に、図10dは、図9aのスペクトルＤ
およびＥを組み合わせたマッピングによって得られたも
のであり、細胞ゾル中の液胞構造、主として細胞質液胞
を明らかにしている。驚くべきことに、この類似性マッ
プは、細胞下区間を取り巻く別の膜である核膜を識別す
る。
これらメイ−グルンワルド−ギームザ染色された細胞
の分光撮像結果に基づけば、各点（もしくはピクセルと
して定義されるもの）は、数種のカテゴリに分類できる
その特異的な吸収および透過スペクトルを有している。
研究の現時点では、「紫色ロマノウスキ−ギームザ複合
体」と呼ばれるものと高い相関を有することのできる分
光成分を示すいくつかの兆候が存在する。ヘテロクロマ
チンの吸収スペクトル（図10c）は明らかに540nmにおい
て顕著なピークを示しており、これは「紫色ロマノウス
キ−ギームザ複合体」と記載されたものと良好に対応す
る［Friedrich et al（1990）,Histochemistry 93,247
〜256ページ;Bittiroli et al（1990）,Lasers in Surg
ery and Medicine;Profio（1984）,IEEE Journal of Qu
antum Electronics QE−20,1502〜1506ページ;Herman
（1989）,Fluorescence Microscopy of Living Cells i
n Culture,パートB,第８章、219〜243ページ、Taylor a
nd Wang編集、Academic Press社；およびJovin and Arn
dt−Jovin（1989）,Cell Structure and Function by M
icrospectrofluorometry,第５章、Academic Press社参
照］。分光的な細胞質特性（図9aのスペクトルＢ）は類
似性マッピングに用いられると、核膜、ゴルジ槽、細胞
質液胞、および細胞外膜を示すと考えられる成分を明確
に識別することを可能にする。しかしながら、染色され
た細胞は、空気中で乾燥されると、細胞質層の重なりを
招き、これによって見掛け上の解像度が低下することが
ある。細胞の特定の深さに集中し、したがって、この技
術の可能性を顕著に向上することのできるアルデヒド固
定細胞の使用が、分光撮像をさらに発展させるために、
示唆される。
ある場合には、透過法および未染色組織を用いて得た
分光像が、蛍光顕微鏡技術によって見出されるものと類
似した情報を提供することがある。分光蛍光生物撮像と
透過顕微鏡法とを組み合わせることの利点の１つは、
「クリーンな」測定技術が使用可能であること、すなわ
ち、潜在的に毒性の染料もしくは固定剤を使用する必要
がないことにある。
したがって、本発明によれば、高い空間および分光解
像度を特徴とする分光生物撮像法が提供され、この方法
は、（ａ）分光撮像されるべきサンプルを調製する工
程、（ｂ）そのサンプルを光学装置を通して観察する工
程、この光学装置は撮像分光計に光学結合されており、
光学装置および撮像分光計は、（ｉ）コリメート光学要
素を用いてサンプルの全ピクセルから入射光を同時に収
集し、（ii）コリメートされた入射光を多数の要素を有
する干渉計系に通し、まず、光が干渉計内部で異なった
方向に進行する２つのコヒーレント光線に分割され、次
いで２つのコヒーレント光線が再結合されて互いに干渉
して出射光線が形成されるようにし、（iii）出射光線
を、検出器要素の２次元アレーを有する検出器上に出射
光線を収束させる収束光学系に通し、各時点で検出器要
素の各々がサンプルの１つの、全測定期間を通じて常に
同一のピクセルであり、サンプルの実像は検出器アレー
面上で固定され、測定中のあらゆる時点で像は可視かつ
識別可能であり、各検出器要素は、異なる波長でピクセ
ルから発せられる光の強度の特定の一次結合である信号
を生成するようにし、この一次結合は瞬時光路差の関数
とし、（iv）干渉計系の少なくとも１つの要素を回転
し、干渉計系によって生成された２つのコヒーレント光
線の間の光路差がサンプルの全ピクセルについて同時に
走査されるようにし、（ｖ）記録装置を用いて各検出器
要素の信号を時間の関数として記録し、データの第１の
キューブを形成することによってサンプルの各ピクセル
のスペクトルを得るためのものである、および（ｃ）数
理アルゴリズムを用いて第１のキューブを解釈する工程
を含む。この方法はさらに（ｄ）解釈されたデータのキ
ューブをマップする工程を含んでもよい。光学装置は上
述のいずれのものであってもよいが、これらに限定され
るものではない。コリメートされた光はサンプルの透過
光、反射光、散乱光、もしくは発光光とすることができ
る。サンプルの発光光は投与されたプローブの蛍光、投
与されたプローブに誘発された蛍光、もしくは自然蛍光
とすることができる。光はいかなる供給源に由来しても
よく、例えば、レーザ、白色光、濾過光、紫外光および
／もしくは小さな波長範囲を有する光等、いかなる型の
ものであってもよい。光は複数の光源に由来するものと
することもでき、光源は同時または順に作動させること
ができる。二次元アレーはビデオ級のCCD、冷却高ダイ
ナミックレンジCCD、増感CCDもしくは時間ゲート増感CC
Dとすることができる。サンプルは、細胞、組織、もし
くは全生体等、あらゆる生物学的サンプルとすることが
でき、ヒトを含むいかなる種に由来するものであっても
よい。細胞はパップ塗末で収集された細胞、血球、胎児
細胞、悪性の疑いがある細胞、***間期中の細胞、有糸
***中の細胞もしくは減数***中の細胞を含むいずれの
型の細胞であってもよい。組織は、眼の網膜、網膜血
球、腫瘍、皮膚、角膜、毛髪、肺、胃、腸、膀胱、結
腸、前立腺、頚部、動脈、静脈もしくは心臓を含むいず
れの型であってもよい。
さらに、本発明によれば、サンプルは細胞、組織切片
もしくは生体とすることができ、光はプローブによって
誘発され、プローブは特定の細胞成分に結合するものと
すると、本方法はその細胞成分の存在もしくはレベルを
検出するためのものとなる。プローブは共役蛍光残基を
含むことができ、誘発されるのは蛍光残基の蛍光発光で
ある。プローブはさらに、デオキシリボ核酸および／も
しくはリボ核酸のような核酸分子を含んでもよく、この
場合、本方法は細胞の核酸分子とのハイブリッド化の存
在もしくはレベルを検出するために用いられる。また、
プローブは抗体を含むことができ、この場合、本方法
は、抗体によって認識される細胞タンパク質の存在もし
くはレベルを検出するために用いられる。蛍光残基は生
物学的用途に用いられるいかなる蛍光残基であってもよ
く、当業者に理解されるように、生物学的用途に用いら
れる未発見のいかなる蛍光残基をさらに含んでもよい。
数理アルゴリズムは上述のアルゴリズムから選択する
ことができ、また、上述のアルゴリズムのいかなる組み
合わせであってもよく、また、当業者に理解されるよう
に、数理アルゴリズムは分光像を分析および／もしくは
表示するのに適した現在既知もしくは未開発のいかなる
ものであってもよい。
本発明の方法はサンプルに投与された複数の蛍光体の
分光的同定のため、例えば、制限されるものではない
が、サンプル中の局所電位差、pH値および細胞内イオン
（例えば、水素、ナトリウム、マグネシウム、亜鉛およ
びカルシウム）濃度のようなミクロ環境変化を検出する
ため、サンプル中の葉緑素、ポリフィリンおよび／もし
くは細胞質タンパク質のような天然成分からの自然蛍光
を測定するため、サンプル中の少なくとも２つの蛍光体
間の空間分離を測定するための蛍光共鳴エネルギー転送
を測定し、例えば、制限されるものではないが、サンプ
ル中の細胞の核内のクロマチン機構の型のような細胞お
よび細胞下細部を同定かつマップするため、時間の関数
としてサンプル中の生命過程をモニタするため、インシ
チュでの染色体ペインティングを含むインシチュハイブ
リダイゼーションにおける蛍光のため、および細胞分類
のために用いることができる。
次いで、上記の説明と共に本発明を示す以下の実施例
を参照する。
実施例１ 類似性マッピングアルゴリズムを使用したとき、藻を与
えたゾウリムシの消化サイクルの分光撮像分析 この実施例は、細胞の生命サイクルの異なった時点で
数個の分光キューブを測定しかつ、各試験時において、
細胞中の特定の化学物質もしくは小器官の位置を類似性
マッピングで強調することによって行われる分光撮像
が、いかに細胞の生命過程を明らかにするかを示すもの
である。したがって、これは、時間の関数として、細胞
の小器官の間の運動もしくは化学的変化、エネルギー交
換、もしくは代謝反応を明らかにする。本発明がなぜ生
命過程の研究に理想的であるのは、高い解像度および感
度で測定を行うことにより、細胞および組織を特徴づけ
る小さな化学変化を容易に追跡することができ、これら
の変化は生命過程自体に関連しているからである。
図11a〜ｄはゾウリムシ（Paramecium vulgaris）の
４つの別個の細胞部位（すなわちピクセル）における葉
緑素の２つのスペクトルを示すものである。蛍光顕微鏡
（オリンパス社のBH2 RFC）に取り付けられたスペクト
ラキューブシステムを使用して生体ゾウリムシを分析し
た。ゾウリムシ細胞は緑色光源（バンドパス極大545n
m）で励起し、赤色蛍光をこのシステムで測定した。ス
ペクトル１および２では630nmおよび695nmにおける蛍光
ピークがわずかに異なっていることが認められる。これ
ら２つのピークの相対強度はスペクトル３〜６に示され
るように細胞内の局在性の関数として変化する。
ゾウリムシい摂取された藻の未加工の葉緑素自然蛍光
像を図12aに示す。ゾウリムシ細胞質中にはわずかな赤
色葉緑素蛍光強度の変化しか認められない。上記の類似
性マッピングアルゴリズムを使用することにより、ある
程度の分光分化を示す細胞構造を表示することが可能と
なった。他のすべてのピクセルとの比較の基準となる、
ゾウリムシ細胞（図11a）の周辺および中心から選択さ
れた５つのピクセルの蛍光スペクトル、およびその結果
を５つの異なる強調画像で示す。これらスペクトルの各
々は類似性マッピングによって他のすべてのピクセルス
ペクトルと比較した。これらの結果を図12b〜ｆに示
す。
図12bに示すように、図11aのスペクトル１を参照とし
て用いる類似性マッピングにより、ゾウリムシ上部に２
つの別個の（白い）領域が明らかになった。これらスペ
クトルは高い含有量の天然藻葉緑素を明示し、したがっ
て、おそらく細胞咽頭および口腔前庭を示すものであ
る。図12cに示すように、図11aのスペクトル２を参照と
して用いる類似性マッピングにより、細胞咽頭および細
胞質ゾルに隣接して、移動液胞を示す各々約１ピクセル
の小さなスポットが明らかになる。図12dに示すよう
に、図11bのスペクトル３もしくは４を参照として用い
る類似性マッピングにより、細胞質の中間部に、630nm
の低いピークによって特徴づけられる、減成した藻から
なる大きな液胞が明らかとなった。図12eの画像は図11c
のスペクトル５を参照として用いる類似性マッピングに
よって得られたものであり、図12dのものと同一の区間
に、ほぼ同一の630/695比を示す狭く画定された領域を
明らかにした。したがって、図12eは同一のファゴリソ
ソームによる藻の減成の進行した段階である。図11dの
スペクトル６を参照として用いる類似性マッピングによ
って得られた図12fの画像は、外薄膜系近傍に大きな領
域を明示しており、これはおそらく消化された老廃物が
細胞から除去される細胞肛門を示すものである。このよ
うな老廃物は天然葉緑素の含量が最低であり、フェオフ
ァイチン含量が最大である。
図13は交配する２つのゾウリムシの藻周辺液胞に生息
する藻共生体の赤色蛍光スペクトルを明示する。スペク
トル１および２は、それぞれ、結合するゾウリムシの上
部および下部の液胞に由来する。これら２つのスペクト
ルは高い630nmピークおよび低い659nmピークを示す。増
大した695nmピークを有する同一のスペクトルが、藻周
辺液胞のあらゆるピクセルにおいて、細胞中のいかなる
部位も分光変化させることなく、記録された。図14aは
図13のスペクトル１を参照として用いて、交配するゾウ
リムシ中の藻周辺液胞および天然葉緑素含量の類似性マ
ッピング画像を明らかにする。ゾウリムシの有***配
は、一般に体の口腔領域に付着するタイプＩおよびタイ
プIIの２つの交配細胞の付着によって始まる。図14bに
示す２つの細胞は、図13のスペクトル２を参照として用
いてマップされた、一方が他方よりも大きな藻周辺液胞
を含有するもので、それぞれタイプＩおよびタイプII細
胞に対応する［Morris et al（1994）,Appl Spectrosco
py 48,857〜866］。図13の低蛍光強度スペクトル３を類
似性マッピングの参照として使用すると、図14cに示す
ように、２つの交配細胞の細胞質を見ることができる。
葉緑素分解の欠如はこれらの細胞中の藻の共生体状態を
明示する。
よって、実施例１は、適当なアルゴリズムと組み合わ
されたフーリエ変換多ピクセル分光法によって単一生体
細胞からの分光情報が明らかにできることを示す。
空間情報は蛍光強度および全スペクトルの点毎の情報
の双方を明らかにし、これらの情報によれば、類似性マ
ッピングアルゴリズムを用いて局所的生化学情報を明ら
かにすることができる。従来のミクロ蛍光光度法を用い
たり、狭いバンドフィルタを用いた場合には、ピクセル
毎の情報は容易に得られなかった。交換可能なフィルタ
に基づいた比撮像は、容易に得られない主要な分光情報
を必要とするため、本質的な制限を有している。もう１
つの制限は、少数の適当なフィルタを調節する必要性で
ある。このように、フィルタをベースとした撮像はサン
プルの波長および空間依存性の強度を容易に得ることの
できるものではない。一方、分光撮像用の回転フィルタ
装置は生物学的方法には適当でない［Morris et al（19
94）,Appl Spectroscopy 48,857〜866］。プリズム光学
分光法と組み合わせた共焦点走査レーザ顕微鏡法［Trep
te et al（1994）,J.Microscopy 176,238〜244］はピク
セル分光情報を明らかにする能力を有しているが、多ピ
クセル分光情報に基づく類似性マッピングおよび画像再
構築のためには現在まで開発されていない。
この実施例では、単一の生体細胞において区分化され
た葉緑素減成過程を可視化するためにフーリエ変換多ピ
クセル分光法を適用した。ゾウリムシの食物サイクルの
生化学は２つの主工程からなり、その１つはあらゆるエ
ンドサイトーシス性小胞の一般則として、摂取物を液胞
内へのプロトンポンピングによって酸性化することであ
る。次の工程では、エンドサイトーシス性小胞とのリソ
ソーム融合によって、加水分解性酵素がエンドサイトー
シス性小胞を加水分解するエンドリソソームを形成す
る。低pHと加水分解性リソソーム活性によって、図15
（分子ＡおよびＢ）に示すように、天然葉緑素はフェオ
ファイチンに減成する。葉緑素からのマグネシウムの喪
失は630nmから695nmへの分光蛍光シフトの根拠である。
さらなるリソソーム酵素の加水分解活性により、テトラ
ピロール環を開き、蛍光性のない鎖状構造を形成する
（図15の分子Ｃ）。これら３つの状態は上記に示されて
おり、このような変化が生じた細胞部位の位置を明らか
にした。分光情報を使用すれば、天然葉緑素およびフェ
オファイチンの部位および、減成サイクルの終端を示す
低蛍光部位の位置を明らかにすることができた。
葉緑素もしくはフェオファイチンの同定可能ないずれ
かのスペクトルの分光マッピングおよび画像再構築によ
って得られた画像は生化学過程の空間情報および決定さ
れた場所を含んでいる。したがって、本発明の方法を使
用する分光像分析は、酵素反応中に分光変化が起こる生
体細胞中における代謝過程を明らかにするために理想的
である。
実施例２ 骨髄正赤芽球および巨赤芽球におけるクロマチン縮合：
多ピクセル分光分析および類似性マッピングによる撮像 血球の標準的な分析は、アズールＢおびエオシン染料
を用いるメイ−グルンワルド−ギームザもしくはロマノ
ウスキ法のいずれかによる染色に基づく。分光ミクロ分
析は従来の方法で染色された細胞から得られるデータを
強調することが認められた。すなわち、分光サブトラク
ション法を用いて、ガルブレス等（Galbraith et al）
は様々な細胞構造の識別着色が染料成分の割合変化によ
って説明できるっことを示した［Galbraith et al（198
0）,J−Microsc.119（３）:313〜30］。フリードリッヒ
等（Friedrich et al）はロマノウスキ−ギームザ染色
された細胞核は、いわゆるロマノウスキ帯と呼ばれる、
染料複合体の発色団に由来する、鋭く強い吸収帯を552n
mに有していることを示した。他の吸収帯はDNAに結合し
たアズールＢのカチオンに由来するものとされた［Frie
drich et al（1990）,Histochemistry 93（３）:247−5
6］。エオシンのアニオンは主に疎水性相互作用によっ
て電気的中性のDNA−アズールＢ複合体のアズールＢ骨
格に結合する。エオシン吸収はエオシンと電気的中性の
DNA−アズールＢ複合体のアズールＢ骨格との相互作用
によって赤色シフトする［Friedrich et al（1990）,Hi
stochemistry 93（３）:247−56］。核クロマチン粒度
のコンピュータ化された分光ミクロ分析を用いることに
より、スピナ等（Spina et al）は良性および悪性***
細胞の間の顕著な区別を明らかにした［Spina et al（1
992）,Virchows−Arch−Ｂ−Cell−Pathol 62（２）:11
9〜24］。この方法の原理は、メイ−グルンワルド−ギ
ームザ法で染色された塗末の粗さのパラメータとして、
真正クロマチックからヘテロクロマチック巣への高いコ
ントラスト勾配の急激な変化の分析に基づいたものであ
る。この方法においては、コンピュータに援助された２
つの画像ローパスフィルタの間のサブトラクションが用
いられ、したがって、デジタル化された画像上には高コ
ントラスト勾配の値しか保持されなかった。
赤血球前駆体の成熟中、核および膜の双方は一連の定
性的形態変化を示す。赤血球系列のうち、最も初期に認
識可能な要素である前赤芽球は、一般に原始細胞を特徴
づける、細胞質好塩基性、仁、微細な網状もしくは点状
核クロマチンおよび大きな細胞寸法を有している。前赤
芽球は一連の有核細胞を生じ、赤芽球は縮合度が増大す
る核クロマチンを斬次発達させて、仁および細胞質好塩
基性を失い、増加するヘモグロビン含量を得る。このシ
ーケンスは任意の段階に分割されるが、それらは通常３
段階、すなわち（Ｉ）好塩基性もしくは初期赤芽球、あ
るいは正赤芽球Ａ、（II）多染色性もしくは中間赤芽球
あるいは正赤芽球Ｂ、（III）正染色性もしくは後期赤
芽球、あるいは正赤芽球Ｃ［Hayhoe and Flemans（199
2）Hematological Cytology,第３版、11ページ、Wolfe
Publishing社、London］。正染色性正赤芽球は小型で核
濃縮性であり、その細胞質はわずかに多染色性である。
前赤芽球もしくは正赤芽球のいずれかの核成熟異常は、
ビタミンB12もしくは葉酸欠乏、骨格異形成、化学療法
効果等、様々な状況で観察される。
この実施例の目的は本発明の方法と組み合わされたス
ペクトラキューブシステムがヒト赤血球新生骨髄細胞の
核から多ピクセル分光情報を得、かつクロマチン縮合と
分光データとを相関させることができることを示すこと
にある。すなわち、核クロマチン構造と識別化との間の
相関は、核の幾何学性および空間的配置に左右されず、
分光的基盤によって可能になるであろう。
メイ−グルンワルド−ギームザ染色された赤芽球の多
ピクセルスペクトルを分析した。典型的には単一の細胞
から、各々細胞の異なる細胞部位（すなわちピクセル）
を示す104個のスペクトルを得た。各ピクセルについて
２組の相補的データ、すなわち透過および吸収スペクト
ルを得た。図16aおよび16bはそれぞれ単一の細胞の５つ
の異なる細胞部位（すなわちピクセル）の透過および吸
収スペクトルを示すものである。スペクトルＡはヘマト
クロマチン、スペクトルＢは真正クロマチン、スペクト
ルＣは細胞質小器官（すなわち青色細胞質）、スペクト
ルＤは細胞質（すなわちピンク細胞質）、スペクトルＥ
はゴルジ装置のものである。異なる赤血球分化細胞に由
来する細胞核の透過スペクトル（例えば図16aのスペク
トルＡ）は類似したパターンを呈する。すなわち、図16
bのスペクトルＡに示すように450〜700nmの領域に低い
光透過率を有すると共に、吸収極大を550および570nmに
備えている。550nmの鋭い吸収ピークはいわゆるロウマ
ノスキ−DNA複合体に関連付けることができる。このよ
うに、細胞下レベルで特異的な分光的詳細が得られた。
赤血球細胞中の真正クロマチン（例えば図16aおよび16b
のスペクトルＢ）は550〜720nmの分光領域で高い緑色お
よび赤色光透過能力および吸収を示した。これらの一般
的な特徴的分光の外観は核部位毎に異なっていた。
細胞染色結合属性は異なったパターンを示した。すな
わち、一般に高い光透過能力および青色シフトした吸収
スペクトル（例えば図16aおよび16bのスペクトルＣおよ
びＤ）を示した。ゴルジ様領域（図16aおよび16bのスペ
クトルＥ）および多の細胞質アレーは局在化された分光
パターンを明らかにした。
図17a〜ｐに示すように、真正クロマチン、ヘテロク
ロマチンおよび細胞質成分のスペクトル（それぞれ図16
aのスペクトルA,B,C）を赤血球新生の４段階（すなわち
赤血球の分化）を代表する４つの細胞の元画像の残りの
104個の細胞との類似性マッピング分析のための参照ス
ペクトルとして使用した。上述のように、類似性マッピ
ング関数は１つの選択されたスペクトルの面積積分と分
光キューブの他のスペクトルとの間の差を計算する。再
構築された画像はグレースケールに対応して明るさの変
化したピクセルからなり、２つの間の類似性の程度を明
示する。すなわち、この実施例では、ピクセルが明るい
ほど、２つのスペクトルはより類似している。図17a,17
e,17iおよび17mはそれぞれ前赤芽球、好塩基性正赤芽
球、初期赤芽球、および後期赤芽球の元RGB画像を示す
ものである。元RGB画像を調べることにより、変化はな
いが、４つの異なった赤芽球細胞間で核寸法がある程度
見える（図17mと17iを比較されたい）ことに注目された
い。図17b,17f,17j,17nは、図16aのスペクトルＢを参照
スペクトルとして用いたもので、真正クロマチンの核ア
レー（白色領域）を明示する。図17c,17g,17k,17oは図1
6aのスペクトルＡを参照スペクトルとして用いたヘテロ
クロマチン類似性マッピングの結果であり、真正クロマ
チンの核アレー（白色領域）を明示する。検査された細
胞は、真正クロマチンの量が減少し、ヘテロクロマチン
の量が増加するにつれて、より分化することに着目され
たい。さらに、検査された細胞における真正クロマチン
およびヘテロクロマチンの配置を比較（例えば図17fお
よび17gを比較）すると、相補的画像が明示されること
に着目されたい。前赤芽球の真正クロマチンおよびヘテ
ロクロマチン画像（それぞれ図17bおよび17c）は、主要
な核流域が、互いに結合していない小パッチとして配置
された染色真正クロマチン複合体からなることを明示す
る。図17fおよび17gは好塩基性赤芽球を示す。真正クロ
マチンの分光マップはヘテロクロマチンと比べて（図17
fを図17gと比べて）、領域寸法、縮合、および分布にお
いて前赤芽球に対する顕著な相違を示す。初期および後
期赤芽球の分化に伴う核形態およびクロマチンパッケー
ジングの変化を図17j,17k,17n,および17oに示す。後期
赤芽球の真正クロマチン（図17n）およびヘテロクロマ
チン（図17o）画像はクロマチンの葉への最大縮合を示
すことに着目されたい。図17b,17f,17jおよび17nに示す
ように、真正クロマチン画像は核膜をも検出した。図17
d,17h,17lおよび17pは、細胞質参照スペクトル（図16a
のスペクトルＤ）への類似性マッピングによって得られ
た。細胞質液胞（例えば、ゴルジ装置、図16のスペクト
ルＥ）は類似した分光染色描写をしめした（図示省
略）。これらの像はゴルジ様構造および細胞の外側境界
を示す。
したがって、スペクトラキューブおよび本発明による
類似性マッピングアルゴリズムを用いた分光画像分析お
よび分光マッピングは、核***に先だって行われるクロ
マチンの染色体アレーへの漸進的縮合を解明した。この
分光撮像方法は縮合された染色体アレーおよびそれらの
境界の微小な変化を強調するのに理想的である。初期お
よび後期赤芽球の高度に縮合されたクロマチン領域の鋭
い境界は他の核質とは特異的に区別された（図17kおよ
び17o）。これらの構造は個々のまたはグループ化され
た染色体の特異的機構に対応する可能性がある。
スペクトラキューブを本発明の方法と組み合わせて使
用することにより、このように、健康な組織で起こる発
展的変化をモニタすることが可能になった。また、様々
な悪性腫瘍は独自の発展性によって特徴づけられるた
め、スペクトラキューブシステムおよび本発明の方法を
用いてこれらの特徴をモニタし、したがって、例えば、
このような悪性腫瘍の（例えば存在および段階を）早期
診断することが可能である。
実施例３ 黒色腫の５−アミノレブリン酸を介した光力学療法：類
似性マッピングアルゴリズムを用いたスペクトラキュー
ブ分光撮像システムによって測定された光増感剤相互作
用 悪性黒色腫の光力学療法（PDT）は部分的にしか理解
されていない［Marcus（1992）,Photodynamic Therapy
−Basic Principles and Clinical Applications,Hende
rsonおよびDougherty編集,Marcel Dekker,New York,219
〜268ページ］。腫瘍の着色の程度と退行の程度との間
に強い相関が認められ、明るい腫瘍は暗い腫瘍よりもは
るかに良性である［Nelson et al（1988）,J Nat.Cance
r Inst.,80,56〜60］。ヒトの着色された黒色腫はPDTに
は満足に反応せず、（例えば虹採の）メラニン欠乏性黒
色腫が陽性に反応すると結論づけられた［Favilla et a
l,（1991）Br.J Ophthalmol.,75,718〜721］。一方、皮
膚病変に対する５−アミノレブリン酸（ALA）誘発PDTの
顕著な効果およびALAを介した実験的な黒色腫PDTの結果
［Malik et al（1987）,Biol.Cell,60,33〜40］は黒
色腫PDTのは発展に新たな可能性を開いた。白血病細胞
中で天然前駆体５−ALAから生合成されたプロトポルフ
ィリン（PP）は、たとえ低光量でも癌細胞破壊のための
効果の高い光増感剤であることが示された［Malik and
Lugaci（1987）Brit.J.Cancer,56,589〜595;Malik et a
l（1989）,J.Photobiol.Photobiol.Photochem.B,4,195
〜205;およびHanania and Malik（1992）Cancer Lett.,
65,127〜131］。５−ALA−PDTはヒトに適用して、特に
基礎細胞腫のような皮膚癌ならびに内部充実性腫瘍の選
択的根絶に成功した［Peng et al（1992）,Int.J.Cance
r,52,433〜443］。局所的な５−ALA−PDTの適用もしく
はその全身系注射は腫瘍の画定およびその光破壊の双方
において高い選択性を示すことが示された［Kennedy an
d Pottier（1992）,J Photochem.Photobiol.B.,14,275
〜292;およびPeng et al（1992）,Int.J.Cancer,52,433
〜443］。これらの結果は急速に***する変形細胞にお
ける周囲の正常組織に比べて顕著に高められたPP生合成
および蓄積に直接起因するものである。５−ALA−PDTは
選択的腫瘍治療のための安全かつ強力な道具であると考
えられており、その目標の１つは黒色腫用にそれを開発
することである。B16黒色腫細胞における内PP生合成の
刺激は、効率的な光力学的殺細胞を容易にするためのポ
リフィリンの化学的誘発剤によって顕著に増強されるこ
とが示された［Malik et al（1987）,Biol.Cell,60,33
〜40］。
本実施例で明らかになったのは、外因性PPによる治療
に比較した、内因性PPを蓄積する単一の細胞上での主要
な光化学過程および光力学的反応である。PP蛍光の分光
像分析によって、１つの細胞における多数のピクセル変
化が明らかになり、少なくとも100×100（すなわち10,0
00）の異なるスペクトルが単一の細胞から得られた。分
光撮像および類似性マッピングを用い、以下に示すよう
に、単一細胞中の点分光変化および細胞間光増感標的の
位置を見出すことが可能であった。
この目的で、ネズミ黒色腫細胞、ラインB16クローンF
10を、10％ウシ胎児血清および抗生物質を添加したRPMI
−1640培地［Malik et al（1987）,Biol.Cell,60,33〜4
0］、組織培養プレートもしくはテルマノックス（Therm
anox）カバー片（Nunc,Napervile IL）で、５％のCO2を
含む湿気のある37℃の雰囲気で培養した。移行のため、
細胞はトリプシンEDTAで脱離させ、１週間に２回再培養
した。黒色腫B16細胞による内因性PPの刺激法は（１）
誘発段階およびそれに続く（２）生合成段階からなるも
のであった。誘発期は細胞をDMSOで48時間処理すること
によって達成した。これに続いて、段階（２）すなわち
５−ALA（0.3mA）との血清欠乏培地中での24時間のイン
キュベーションを行った。５−ALA−培地のpHは7.0に調
節した。段階（２）後、細胞はペレット化し、PBSです
すぎ、ポルフィリン抽出を下記のように行った。外因性
ポルフィリンを用いた試験のためには、プロトポルフィ
リンIX（Sigma）を1NのNaOHに溶解し、燐酸緩衝液中で1
0mMまで希釈し、24時間、黒色腫培地に添加した。局在
化実験のためにフォトフリンII（QLT）についても同じ
処理を行った。
黒色腫B16細胞は上記のようにDMSOおよび５−ALAの作
用によってポルフィリンを蓄積しており、これに対して
320〜450nm発光で極大が380nmのフィリップス「黒色
光」源を用いて１〜５時間の照射を行い、20W/m2とし
た。細胞は１〜4kJ/m-2の光量で照射された。照明は量
子ラジオメータ光度計LI−85型（Lambda Instrument Co
rp.,NE,USA）によって測定した。
B16黒色腫細胞内の光増感中における内因性プロトポ
ルフィリン（内因性PP）の細胞下局在化を本発明の方法
によってスペクトラキューブシステムで分析した。黒色
腫細胞はALAと共にインキュベートし、次いで、個々の
生体細胞中の内因性PPの蛍光を３つのモードで記録し
た。これらは（１）従来の蛍光像、（２）100×100ピク
セルの蛍光分光像、および（３）分光類似性マッピング
を行い、点スペクトル情報から画像を再構築することに
よって形成された処理画像である。図18aに示すよう
に、生の蛍光像は細胞質ゾルの全域にわたって内因性PP
の小胞分布を明示した。内因性PP局在化のこのパターン
はミトコンドリアおよびリソソームならびに内質網状槽
の蓄積を反映している可能性がある。これらの細胞内小
器官は光増感中の主標的であることが示された。図19a
は、それぞれ図18aに示した細胞の異なる細胞部位に由
来し、各々１つのピークを635nmに、もう１つのピーク
を705nmに有する４つの蛍光スペクトルを示す。これら
２つのピークの相対強度は、処理された細胞の細胞内区
間における部位の位置によって変わるものではなかっ
た。図19a（実線）に示す１つの蛍光スペクトルは図18z
の細胞の１つの小胞から選択された。図18dの画像は、
選択されたスペクトル（図19aの実線）を参照として用
いた類似性マッピングで再構築された。図18dに示すよ
うに、再構築された画像は、膜および小胞蛍光の区分を
明示した。図18dに示すように、１分間の光照射中に、
細胞中の内因性PPは漂白され、蛍光強度は低下し、図19
bに示す別の測定スペクトルは625nmおよび670nmへの左
方向のシフトを明示した。これら２つのピークの間の強
度比は細胞中の部位毎に雑多な状況を明らかにした。図
19bの実線スペクトルを用いた類似性マッピングは、図1
8dに示すものと基本的に同様な、図18eに示す新たな像
を形成した。図18cに示すように、長い照射間隔（３
分）の後に、細胞の蛍光像は顕著に影響を受けた。図19
cに示すように、図18cの細胞の２つの異なる点から得た
スペクトルは650〜670nmに１つのピークを有していた。
蛍光像（図18c）もしくは図18fに示したものは図19cの
実線で示すスペクトルを参照として用いた類似性マッピ
ングに由来した画像であり、鮮明な小器官構造は認める
ことができず、これは細胞破壊の結果であると考えられ
る。したがって、分光変化は２つの主因を示すことがで
きた。その１つは光増感の最も可能性の高い結果として
の細胞下レベルでの光生成物の形成［Konig et al（199
3）,J.Photochem.B:18,287〜290］であり、他方、光照
射中のpH変化の可能性も排除できない。
異なった細胞下区間で生合成され、ミトコンドリアに
蓄積された内因性PPは本実施例により、親水性環境に保
持されることが明らかになった。光照射は２つの効果、
すなわち、いくつかの光生成物の形成およびミクロ環境
におけるpH変化を生み出した。疎水性、親水性、酸度等
のミクロ環境の光生成物形成に対する効果および寄与
［Konig et al（1993）,J.Photochem.B:18,287〜290］
は単一の生体細胞のミクロ蛍光分光法では分離すること
が困難である。
極めて異なる細胞内区間局在化が富血清培地において
外因性PPでインキュベートした単一細胞内で可視化され
た。図20aは核周辺領域における外因性PPの蛍光像およ
び特異的局在化を示し、これはおそらくゴルジ複合体お
よび核膜を網羅するものである。また、蛍光は細胞質ゾ
ルの他の部位でも認められ、外膜でもわずかに認められ
た。図21aに示すように、図20aに示した細胞の５つの異
なるピクセルのスペクトルは、ピクセル毎に変化せず強
度のみが異なる２つの固有な特徴的蛍光ピークを明らか
にした。主蛍光ピークは670nm、他のピークは625〜630n
mに位置することが認められる。図20bに示すように、外
因性PPの１分間の光増感により、即座の損傷および再局
在化が誘発された。中央に配置された外因性PPは核膜を
取り巻く全般的な円形配置に変化した。４つの個々のピ
クセルに関する図21bに示すように、630nmは完全に消失
し、蛍光は650〜670nmにシフトした。４つの個々のピク
セルに関する図21cに示すように、暗所における追加の
５分間の後インキュベーションによって、蛍光の部分的
な回復が認められた。新たなスペクトルは異なる細胞下
部位において２つのピークを630および670nmに示した。
よって、これらの結果は、富血清培地に添加された外
因性PPがエンドサイトーシスを介して摂取され、エンド
サイトーシス−エンドソーム経路を通ってゴルジ複合体
に供給されたことを示す。エンドソーム局在化に関する
仮説はスペクトルへの酸性pHの影響を示す分光分析によ
って支持される。ポルフィリン蛍光スペクトルに対する
pHの影響に関する知見はポッチェ［Pottier（1990）,J.
Photochem.Photobiol.B:Biol.,6,103〜109］によって示
された。外因性PPのいくらかは外膜に局在化する。光照
射は赤色蛍光に影響し、外因性PPからの光生成物の形成
を明示する。暗所での後インキュベーションはスペクト
ルの点特性を変化させ、その後は核膜に特異的な局在化
が認められた。顕著な分光シフトはより低酸性の環境で
のポルフィリン局在化と光生成物形成を反映するものと
考えることもできる。分光撮像は単一細胞における細胞
下分光変化を可視化および測定することができ、この方
法は従来の細胞集団の蛍光分光法とは顕著に異なってい
る。したがって、細胞質小器官の微細な分光シフトおよ
び光生成物の局在化を本発明の方法で明らかにすること
ができた。
実施例４ サンゴにおける葉緑素のミクロ分布に対する表在生物の
影響および蛍光分光撮像によるその検出 造礁性（リーフビルディング）サンゴはその組織に鞭
毛藻と呼ばれる内部共生藻を滞在させている。鞭毛藻は
その光合成物を宿主サンゴに寄与し［Muscatine et al
（1989）,Proc.R.Soc.Lond.B 236:311〜324;Lewis and
Smith（1971）Proc.R.Soc.Lond.B 178:111〜129］、後
者の***物を溶解無機栄養素として吸収することができ
る。ムスカチンおよびデリア［Muscatine and D'Elia
（1978）,Limnol.Oceanogr.23:725〜734］は造礁性サン
ゴにおけるアンモニウムの吸収および保持が光によって
増進し、これは鞭毛藻による同化を示唆することを示し
た。アンモニウム濃度の変化は鞭毛藻の集団密度に影響
を与える［Muscatine et al（1989）,Proc.R.Soc.Lond.
B 236:311〜324］。バイテル［Bythell（1988）,Proc。
6th Int.Coral Reef Sym.Australia,2:535〜540］は鞭
毛藻によるアンモニウムの正味摂取があること、および
アミノ酸の異化によって分解されたあらゆるアンモニウ
ムは共生的関係内で再利用されるに違いないことを明ら
かにした。彼は窒素の入手可能性が低いことによってこ
の関係の生産性が厳しく制限されたことを示唆した。
鞭毛藻はその刺胞動物宿主の活性によって生成される
窒素およびリンに富んだ***物をいくらか獲得する［Jo
hannes et al.（1970）,Limnol.Oceanogr.15:579〜58
6］。アンモニウムの内部循環は関係の窒素要求のいく
らかを供給する。この窒素保存および回収方法は貧栄養
水中での生存に不可欠である。しかしながら、回収は損
失を防ぐのみに過ぎず、成長および再生に必要な付加的
な窒素を供給するものではないため、これらの要求を満
たすためには外部供給源も必要となる。
鞭毛藻の集団密度は栄養供給によって制限される［Ho
egh−Guldberg and Smith（1989）,Mar.Ecol.Prog.Ser.
57:173〜186;およびCook and D'Elia（1987）Symbiosis
4:199〜212］。サンゴと密接に関係して生息する共生
生物も異化窒素を関係に寄与することができ、それら近
傍の鞭毛藻密度の増加等を招く。メイヤーおよびシュル
ツ［Meyer and Schultz（1985）,Limnol.Oceanogr.30:1
57〜166］はサンゴ頭部上に滞在する魚がその***物で
栄養レベルを増加させることによって組織のバイオマス
および鞭毛藻濃度を増加させる可能性のあることを示唆
した。
また、サンゴは様々な無脊椎動物を滞在させており、
そのいくつかは定着性であってサンゴ骨格に付着してお
り、他は内部に潜伏するかサンゴ組織および骨格に覆い
被さっている。サンゴに生育するカニであるクリプトチ
ラス・コラリディテス（Cryptochirus corallidytes）
は巨大なサンゴ骨格中のくぼみに見出され、イスラエル
国エイラトのファヴィイダエ（faviidae）サンゴに一般
的なものである。ポッツ［Potts（1915）,Papers from
the department of Marine Biology:33〜69］はこれら
のカニの形態およびそれらのくぼみについて記載した。
しかしながら、カニとその宿主との関係の本質は不明で
ある。サンゴ共生体はそれらの***物を、鞭毛藻を含む
近隣の藻に寄与することができるものと示唆される。
ピルガマチナエ（Pyrgamatinae）サブファミリーを構
成するフジツボはサンゴの義務的共生体である。何人か
の著者はサンゴとフジツボとの間で物質の交換があると
主張しているが、そのような関係は未だ確認されていな
い。クック等［Cook et al（1991）Hydrobiologia 216/
217:285〜290］はフジツボ（Savignium milleporum）か
ら***されたリンがその宿主（MIllepora dichotoma）
の鞭毛藻によって吸収されることを示した。
イガイ種（Lithophaga）は生体サンゴの骨格内に潜伏
する［Kleemann（1980）,Reef.J.moll.Stud.46:13〜5
4］。これらは生体サンゴ骨格を成長用待避所として用
い、その上の海から濾過によって食物を摂取する。ま
た、アストレオポラ・ミリオフタルマ（Astreopora myr
iophthalma）に生息するリトファーガ・シンプレックス
（Lithophaga simplex）によって***されるアンモニウ
ムが宿主サンゴの鞭毛藻によって吸収されることが示さ
れた。
したがって、共生的表在生物の***物が周囲領域を富
栄養化するものと推測される。これは、葉緑素濃度の増
加によって示される共生体近傍における高い鞭毛藻濃度
を招くものであろう。このような微小な距離において藻
の密度を測定することは困難であり、知られている限り
において、この距離内での変化は明らかになっていな
い。
本実施例は、この問題を実験的に解消することのでき
る本発明の方法の使用を記載するものである。すなわ
ち、スペクトルキューブシステムを用いて、小領域での
葉緑素濃度変化を検出した。
葉緑素分子が光で励起されると、自然蛍光として知ら
れる過程によってフォトンが発せされる。分子から蛍光
によって発せられた光はその励起光よりも赤く、波長の
違いは振動エネルギーの損失を示す。生体内での葉緑素
ａの蛍光発光スペクトルはその主帯域を685nm付近に有
する。多くの光合成顔料が溶液中で蛍光を示すことが知
られているが、生体内では葉緑素ａの蛍光が支配的であ
る。なぜなら、他の顔料はそれらの吸収したエネルギー
を比較的高い効率で葉緑素ａに転送するからである。こ
の蛍光の測定は葉緑素ａの検出および見積もりのための
手段を提供する［Kirk（1983）,Light and Photosynthe
sis in Aquatic Ecosystems,Cambridge University,Cam
bridge,401ページ］。365nmもしくは405nmで励起される
と、刺胞動物組織はそれらの組織中の蛍光物質により、
異なった波長で発光する。しかしながら、650nmを超え
る波長の蛍光源は鞭毛藻中の葉緑素である［Mazel（198
5）,Mar.Ecol.Prog.Ser.120:185〜191］。ハーディ等
［Hardy et al（1992）,Mar.Ecol.Prog.Ser.88:247〜25
5］は、可視漂白に先だって葉緑素濃度の現象を明らか
にするために葉緑素蛍光を測定した。
この目的で、エイラートのインターユニヴァーシティ
・インスティチュートの前の紅海で試料を採取した。以
下のサンゴおよびその関係物を蛍光分析に用いた。すな
わち、ファヴィテス・ハリコラ（Favites halicora）と
穴カニ（Cryptochirus coralliodytes）、ゴニアストレ
ア・レチフォルミス（Goniastrea retiformis）とリソ
ファーガ・レッセプシアナ（Lithophaga lessepsian
a）、およびヒドロサンゴ（Millepora dichotoma）とフ
ジツボ（Savignium milleporum）である。サンゴは実験
室に運び、通気した海水中に保存した。すべての測定は
採取２日以内に行った。鞭毛藻はウォーターピック（Wa
rerPik）でサンゴから分離した［Jonnanes et al（197
0）,Limnol.Oceanogr.15:579〜586］。
分離した鞭毛藻の蛍光分光撮像は、落射蛍光顕微鏡に
取り付けたスペクトラキューブシステムで行った。分光
類似性マップは、各蛍光マップから比較的高発光のピク
セルを選択し、次いで蛍光マップ中の他のすべてのピク
セルをこのピクセルと比較することによって作成した。
選択されたピクセルに類似した発光度を有するピクセル
は明るいドットを呈し、他のピクセルの類似の程度はド
ットの陰影で表現される。
生体サンゴの分光像は、サンゴを海水中に配し、接写
レンズを取り付けたスペクトラキューブシステムで観察
することによって得られた。サンゴは250Wのオリエル・
キセノンランプ（Oriel Xenon Lamp）で照明した。38
0nm〜580nmの広帯域励起光（ドイツ、ショット（Schot
t）社の励起フィルタBG−39）を用い、そのフィルタは
光源とサンゴとの間に配置し、590nmの発光フィルタ
（ドイツ、ショット社のOG−59）をサンゴと分光撮像カ
メラとの間に配置した。
サンゴ上の各ピクセルで得た葉緑素蛍光値は特定部位
の葉緑素濃度およびその様相に依存する。サンゴの表面
の様相は励起および発光光の強度に主要な影響を与え
る。この影響を除去するため、各ピクセルの励起値を系
列の最高励起値に調節した（スペクトルの標準正規
化）。トランセクトは共生動物を横切るように画像に沿
って描出した。各ピクセルの励起および赤色発光の強度
値を測定した。処理に沿っていずれかの赤色蛍光ピクセ
ルを選択し、これを他のピクセルと比較することによ
り、コンピュータプログラムは、トランセクト（Ｘ軸）
および蛍光強度（Ｙ軸）に沿った波長（Ｚ軸）の連続し
て正規化された３次元分光表示を作成した。この3D表示
はトランセクトに沿った相対蛍光強度を、励起に対する
地理的影響による補正と共に示した。
ピクセルは共生動物に隣接する画像上でランダムに選
択し、４つの連続的なピクセルを追加した。各系列で、
第１および第５のピクセル間の距離は2.4mmであった。
各ピクセルの発光と励起との比は相対蛍光指標（RFI＝
発光／励起）として定義した。５つの連続的ピクセル毎
の正規値は、同一系列中の最高値のピクセルに関係づけ
ることによって再び正規化し、各５ピクセル系列の相対
値を得た。
鞭毛藻の蛍光スペクトルを測定するため、２つの分離
した藻を用いた。図22に示すように、２つの鞭毛藻の蛍
光マップ上の３つのランダムなピクセルの分光曲線は67
1nmで葉緑素蛍光ピークを示す。
共生体を担持する３つのサンゴを分析した。図23a,23
cおよび23eは正規化前の３つの宿主の多ピクセル蛍光マ
ップ、および分光分析に用いた処理を示す。トランセク
トは共生体を横切った。図23b,13dおよび23fは上記のよ
うに正規化された654nmおよび685nmの範囲における相対
強度蛍光を示す。極大発光は670nmにあり、葉緑素ａに
典型的なものであった。ファヴィテス・ハリコラ（図23
b）ではくぼみの周縁で最高蛍光値が認められ、トラン
セクトがくぼみから遠ざかるにつれて蛍光強度が低下し
ており、くぼみ周縁での高い葉緑素濃度を示している。
しかしながら、くぼみ自体からは発光がなかった。ゴニ
アストレア・レチフォルミスおよびミレアポラ・ディコ
トマ（それぞれ、図23dおよび23f）ではトランセクトに
沿った明瞭な蛍光パターンはなかった。イガイのサイホ
ン領域およびフジツボの開口部からは発光がなかった。
図24a〜ｃは数種の放射状トランセクトに沿って等間
隔で見出される９〜11ピクセルの平均値の分析結果を示
す。値は共生体に隣接するピクセルに対する相対値であ
る。回帰曲線（点線）も示す。ファヴィテスおよびクリ
プトチルス（図24a）の場合にのみ、明確な蛍光勾配が
検出できた。
図25a〜ｃに示すように、３つのサンゴに対して分光
類似性マップを構築した。上述のように、類似性マッピ
ングのためのコンピュータ法は単一の選択された特異的
スペクトルを元の画像を構成する残りのスペクトルと比
較する。これは、参照アルゴリズムと他のすべてとの間
の差を計算することにより、図25a〜ｃに示すような分
光類似性を有する新たな画像を作成する。最高RFI値を
有する最高相対蛍光スペクトルを選択して分光類似性マ
ッピングに使用した。図25aはカニのくぼみ周辺の高い
葉緑素濃度を強調する。ゴニアストレア・レチフォルミ
ス（図25b）ではイガイ（4mm）のサイホン近傍により高
い傾向があるが、これは相対強度傾向トランセクト（図
23d）では明示されなかった。ミレアポラ・ディコトマ
（図25c）では、共生体（3mm）近傍で局在化された葉緑
素蛍光の類似したパターンがあり、これは主として、フ
ジツボの皿を被覆するヒドロサンゴ組織上に存在する
が、図25bに示すゴニアストレア・レチフォルミスでは
より不明瞭である。
したがって、本実施例では、本発明の方法を用いた、
無脊椎動物共生体を担持する３つのサンゴ種における葉
緑素蛍光分布が示された。これらの結果は共生カニ（Cr
yptochirus）のくぼみ近傍に高濃度の葉緑素ａを示す。
トランセクトに沿って顕著な葉緑素減少がある。この場
合、葉緑素濃度の変化は鞭毛藻濃度の変化に起因しな
い。くぼみ周縁の高い葉緑素レベルは青緑藻に由来する
ものであり、これらの藻はくぼみ壁に存在する支配的な
藻群である。ゴニアストレア・レチフォルミスおよびミ
レアポラ・ディコトマの場合、共生動物の葉緑素濃度の
違いによる顕著な違いはない。しかしながら、分光類似
性マップによって、ゴニアストレア・レチフォルミスお
よびミレアポラ・ディコトマの場合にも鞭毛藻の変化を
検出することが可能になった。類似性マップの利点は一
度にマップ中の全ピクセルが比較可能なことにある。す
べての共生体はその***物によって周囲の藻を富栄養化
することができる。ファヴィテス・ハリコラの場合、栄
養分補給に対して青緑藻は鞭毛藻と拮抗し、したがっ
て、共生体の周囲の支配的な群であると考えられる。ゴ
ニアストレア・レチフォルミスおよびミレアポラ・ディ
コトマの場合、鞭毛藻の濃度は共生体の影響を受ける。
ゴニアストレア・レチフォルミスおよびミレアポラ・デ
ィコトマにおける共生体の定量的影響の違いは共生体の
寸法およびそれらの宿主サンゴの形状の違いによるもの
であろう。共生動物のそれらの宿主サンゴに対するこの
ような影響が報告されたのはこれが初めてである。
よって、本発明の分光撮像方法の使用はこのような変
化の識別を可能にした。これらの方法は小さな表面領域
からの蛍光を測定し、これをその領域における顔料濃度
と関連づけることを可能にした。解像度は使用される光
学系の倍率のみに制限される。分光撮像分析は10^4を超
える他ピクセルスペクトルを生成し、これらのスペクト
ルを用いたアルゴリズム的比較および計算を可能にし
た。この実験的な系に対し、選択領域蛍光測定は、限定
されたアレーの分光情報を明らかにできるに過ぎず、分
光マッピングおよび再構築をすることはできない［Geze
et al（1983）,J.Photochem.Photobiol.B.20:23〜3
5］。本発明の方法のもう１つの利点は、細胞中の顔料
を測定する分光的方法の多くは破壊的であり、濃度測定
は通常溶媒中での抽出後に行われるのに対し、本実施例
に用いられた方法は生体内での顔料測定を可能にしたこ
とにある。サンゴでは通常、ウォーターピックを用いて
組織を除去し［Johannes and Wiebe（1970）,Limnol.Oc
eanogr.15:822〜824］、抽出後、分析を行う。ウォータ
ーピックを用いて組織を除去することにより、小さなサ
ンゴ表面領域の検査ができなくなり、サンプルの空間的
境界は不明瞭になるが、本発明の方法を用いれば、サン
ゴは無傷のままであり、測定後は水に戻すことができ
た。
実施例５ スペクトラキューブおよび一次結合アルゴリズムを用い
た、改良された蛍光インシチュハイブリダイゼーション
（FISH） 本発明の方法と組み合わされたスペクトラキューブシ
ステムを用いた分光生物撮像は、１回の測定で高感度
に、多数のプローブの同時検出を可能にすることによっ
て、FISHの有用性を高める。この結果、FISHによる遺伝
子異常の検出における効率および信頼性が大幅に向上す
る。
上述のように、蛍光インシチュハイブリダイゼーショ
ン（FISH）は多くの研究および診断分野において重要性
の増大する役割を果たしている。70年代におけるその導
入開始以来、FISH技術は顕著に進化し、単一遺伝子配
列、部分的染色体配列および全染色体（すなわち染色体
ペインティング）さえの検出および同定を可能にした。
FISHの多くの用途は、病気の早期検出から、遺伝子病お
よび異常を発見してその後に治療する出生前診断、体細
胞異数性診断等にまで及んでいる。
相同の核酸配列のハイブリダイゼーションに基づくFI
SHの高い感度および選択性により、たとえ１キロベース
（kb）という短い配列であっても観察可能である（そし
て、これはおそらく時と共に改善され、15〜30ベースペ
アという短い配列の検出まで可能にし、この結果、点突
然変異の検出をも可能にするであろう）。FISHはDNAプ
ローブ、蛍光染料、蛍光顕微鏡法、高性能CCDカメラお
よび撮像技術の改良と共に改良されている。
多数のプローブを同時に検出する能力はすでに文献で
FISHを効率的な診断器具とするものとして示されている
［Rudkin and Stollar（1977）,Nature,265,172〜17
3］。しかしながら、従来の方法は面倒であり、使用が
困難である。以下に例示するように、適当なアルゴリズ
ムと組み合わせたスペクトラキューブシステムによれ
ば、その分光解像度および感度によって、多数のプロー
ブの検出が大幅に改善される。この能力を例示するた
め、図26a〜ｃを参照する。これらは、蛍光体テキサス
レッドおよびローダミンで標識された染色体１および染
色体17に特異的なDNAプローブを用いて行った間期FISH
測定の１例を含むものであり、その蛍光スペクトルは極
めて類似している。染色体１プローブは染色体のサブテ
ロマー領域のためのミッドサテライト・プローブであ
り、テキサスレッドで標識されてビチオン後ハイブリダ
イゼーションを介してDNAプローブにリンクしていた。
染色体17プローブは染色体の動原体領域のためのαサテ
ライトプローブであり、ローダミンで標識されてディゴ
キシゲニン後ハイブリダイゼーションを介して第２のDN
Aプローブにリンクしていた。図26aは元画像を顕微鏡を
通して眼に見える状態で示し、図26bはスペクトラキュ
ーブシステムで測定および処理した後の同一のサンプル
を示し、図26cはテキサスレッド（Ｔ）およびローダミ
ン（Ｒ）蛍光体の蛍光スペクトルを示す。
図26cに示すように、テキサスレッドおよびローダミ
ンの分光ピークは15nmしか相違せず、したがって、フィ
ルタに基づく系を用いてこれらを区別することは極めて
困難であろう。
図26aに示す顕微鏡を通したカラーFISH画像を観察す
ると、正確な数のドット（１〜４で示す）の認識および
画像に現れるプローブ型の信頼度は特に高くはない。一
方、図26bに示すように、スペクトラキューブシステム
は各スペクトルに対して測定されたスペクトルを利用す
るものであり、ドットの存在を確かめ、これらを正確に
計数し、異なる対をそれらの間の小さな蛍光差によって
高信頼度で識別することができる。テキサスレッドおよ
びローダミン蛍光の人工着色によって、図26cに示すよ
うに、プローブに特異的な蛍光の位置を高精度に決定す
ることができた。すなわち、ドット１および２はテキサ
スレッドのものであり、ドット３および４はローダミン
のものである。
図27a〜ｂは６つのプローブを用いた、間期における
核DNAのハイブリダイゼーション後のFISH測定の１例で
ある。図27aは元画像を示し、図27bはすべての検出され
た対のスペクトラキューブ測定、分光処理および人工着
色ディスプレイを示し、図27cは、スペクトラキューブ
システムを用いる３重ジクロイックフィルタを通して検
出された、ハイブリダイゼーション後の６つの染色体の
スペクトル（染色体によって1,8,10,11,17およびＸとラ
ベルされている）を示す。（蛍光体、プローブおよび染
色体の詳細については、後述の表２およびChroma Corp.
Cat No.61502の記載を参照されたい。） 図27aは間期の細胞核の元RGB画像を示すものであり、
これから、肉眼でも、あるいは単純なRGBカラー測定を
用いても、色を互いから識別することは困難であること
が明らかである。熟練した観察者でも最良の場合に６色
のうち、３色を検出できるに過ぎない。しかしながら、
図27bは、バックグラウンド・サブトラクションおよび
分類（上記を参照）のための独自の分類アルゴリズムで
分光データを処理した後の、図27aに示したものと同一
のサンプルを示し、この結果得られるドットは以下のよ
うに人工着色で強調された。すなわち、茶−B1;シアン
−C;青−B2;黄−Y;緑−G;および赤−Ｒであり、背景に
は人工着色である黒−B3を付与した。観察されるよう
に、６対の蛍光体すべてが見え、対同士を容易に識別す
ることができる。
さらに、青（B2）で強調された１対は肉眼もしくはカ
ラーカメラの使用では殆ど見つけられないが、分光立方
体上でバックグラウンド・サブトラクション・アルゴリ
ズムを適用した後には検出された（図27aと27bとを比較
されたい）。
使用されたプローブは染色体8,10,11,17およびｘの動
原体領域用の５つのαサテライトプローブ、および染色
体１のサブテロマー領域用のミッドサテライトプローブ
である。上記染色体の各々およびDAPIカウンタ染色（ba
ckg.）を標識するために使用した蛍光体、それらの発光
ピークおよび人工的なディスプレイ色の分類を表２にま
とめる。
図27cに示した６つの蛍光体の各々の正規化された分
光シグネチャから、数個の比較的広い分光範囲で測定を
行うフィルタに基づいたシステムでは、スペクトル同士
が大きく重なり合っているため、異なるプローブ種を確
実に識別することは不可能であることが明らかである。
このようなシステムは、各プローブの強度の絶対的測定
により依存し、したがって、バックグラウンド信号およ
びノイズにより影響される。さらに、細胞自体に由来す
る自然蛍光でも分光の重なりが生じることに留意された
い。この場合にも、各ピクセルについて分光情報が得ら
れることによって、自然蛍光の寄与が除去でき、より正
確な結果が得られる。
画像の各点の全スペクトルを測定することによって、
プローブの特異性の問題も克服することができる。実際
にいくつかの場合、ある染色体DNA配列に適合するプロ
ーブが別の（通常は類似した）配列に対してもより低い
特異性を有し、この第２の配列にもより低い確率でハイ
ブリッド化する。この結果、ある種のプローブが異常に
多くなる、誤った外観を呈することになる。しかしなが
ら、プローブの化学的環境の小さな変化により、第２の
場合の蛍光スペクトルは第１のものからわずかにシフト
している。スペクトラキューブシステムは、その分光解
像度および感度により、この影響を解消することができ
る。同様な影響は、サンプル調製中に充分に洗浄されな
かったプローブについても存在し、誤った陰性の診断に
寄与する。したがって、本発明の方法と組み合わされた
スペクトラキューブシステムは、誤った診断の起こる危
険性を低減することを助けるものである。
多数のもしくは類似した染料に一般化して、図26a〜
ｂおよび27a〜ｃの例は、多数のプローブを検出および
識別することが可能であること、および、それらの間に
小さな分光差が存在していれば、スペクトラキューブが
１回の測定でそれらを検出かつ同定することを示してい
る。
当業者には、他のおよび／もしくは既知のおよび未発
見または未開発の蛍光体および蛍光体の組み合わせを上
述の様々なFISH用途に使用して多数の部位を同時に検出
したり、各染色体の各型を特有の色で染色したりできる
こと等が明らかである。従来の細胞および分子生物学で
使用される蛍光体のリストは、Kasten（1993）,Introdu
ction to Fluorescent Probes:Properties History and
Applications,in Fluorescent and Luminescent Probe
s for Biological Research,Mason編、Academic Press
社,London,24〜31ページに見出される。また、例えば、
生物発光および化学発光のような他の標識法ならびに非
蛍光標識法も同様に適用できることが当業者には明らか
である。
したがって、FISH分析にスペクトラキューブシステム
を使用することによって、以下のような主要な利点を得
ることができる。スペクトラキューブシステムはその高
分光解像度によって多数のプローブの同時検出を可能に
するのに対し、従来の手段を用いて（例えば蛍光顕微鏡
を用いて）FISHを行うと、１回のハイブリダイゼーショ
ンに使用されるプローブ数が２〜４に制限される。した
がって、FISH分析にスペクトラキューブシステムを使用
することによって、労力および時間が節約される。さら
に、FISH分析にスペクトラキューブシステムを使用する
と全分析に少数の細胞しか必要でなくなるが、これは分
析すべき細胞の数が限られている場合には重要な特徴で
ある。
実施例６ スペクトラキューブシステムを使用した網膜異常診断 糖尿病性網膜症は潜在的視覚破壊状態であり、多くの
場合、時期を得たレーザ治療で制御することができる
［Ferris（1993），（解説）JAMA 269:1290〜1291］。
米国眼科学会は患者が治療されるべき臨床的状態を何時
進行させたかを検出するクリーニングスケジュールを示
唆した［Diabetic Retinopathy:American Academy of O
phtalmology Preferred Practice Patterns,San Franci
sco,Cal.:American Academy of Ophtalmology Quality
of Care Committee Retinal Pane,American Academy of
Ophtalmology,1989］。
しかしながら、示唆されたスクリーニングスケジュー
ルは高価であり、また、ある個人にとっては、患者は時
折スケジュールされた検査の間に深刻な網膜症を進行さ
せることもあるため、現在の高価なスクリーニングでも
充分ではない。それにも関わらず、スクリーニングは費
用効率が高いことが示されている［Javitt et al（198
9）,Ophtalmology 96:255〜64］。この研究は、危険性
の高い患者と低い患者をより効果的に同定できれば、健
康管理追跡検査にかかる大量な金額が節約できることを
示している。したがって、糖尿病性網膜症のスクリーニ
ングの精度を向上し、それにかかる費用を低減すること
のできるあらゆる方法は臨床的価値の高いものとなる。
現在、糖尿病性網膜症のためのスクリーニング評価と
して推奨されているものには、詳細な網膜評価および、
選択された場合におけるカラー網膜写真法が含まれる
［Diabetic Retinopathy:American Academy of Ophtalm
ology Preferred Practice Patterns,San Francisco,Ca
l.:American Academy of Ophtalmology Quality of Car
e Committee Retinal Pane,American Academy of Ophta
lmology,1989］。網膜のフルオレシン血管撮影法は現在
日常的に行われているが、侵略略的で、不快なものであ
り、時には死を招く。さらに、フルオレシン血管撮影法
で得られる付加的な情報は患者を即座のレーザ治療の恩
恵を受け得るものとそうでないものとに分類する助けと
ならない［Ferris（1993），（解説）JAMA 269:1290〜
１］。
本発明によれば、スペクトラキューブ技術を特別に開
発されたアルゴリズムと組み合わせ、分光データと撮像
情報を同時に使用することにより、網膜虚血の異なった
段階を分類することができ、したがって、医者が多くの
糖尿病患者を虚血性のものと非虚血性のものとに分類す
ることを可能にする臨床手段となる。
網膜への酸素供給は脈絡膜および網膜循環の双方によ
って提供される。脈絡膜は無欠陥の外網膜中の光受容体
への酸素源であり、網膜循環は内網膜中の中性要素およ
び神経繊維への酸素供給を維持する上で重要な役割を果
たす。網膜の高い酸素要求により、糖尿病性網膜症、高
血圧、鎌状赤血球症、および血管閉塞性疾患において観
察されるような循環変化は機能障害および広範な網膜組
織損傷を招く。
ヒックハム等［Hickham et al（1963）,Circulation
27,375］により、網膜管中の酸素飽和の非侵略的な測定
が初めて提案されたが、これは光学ディスクを横切る網
膜管に対して２波長写真法（560および640nm）を使用す
るものである。より進んだ方法はDelrori（1988）,Appl
ied Optics 27,1113〜1125に提案されたピットマン（Pi
ttman）およびデュリング（Duling）の３波長法に基づ
くものである。
スペクトラキューブシステムは、自らが供給する分光
情報に基づき、網膜管におけるヘモグロビンの飽和レベ
ルの非侵略的測定を可能にするだけでなく、自らが提供
する撮像情報のため、網膜虚血の検出およびマッピング
に用いることができる。ニューラルネットワークアルゴ
リズムの主要成分と組み合わせれば、異なった網膜症段
階の分類や糖尿病患者の治療分類にも使用することがで
きる。
生体組織における多くの化学物質は管および代謝の機
能に関係する。したがって、たとえば網膜虚血の主要素
が、オキシ−およびデオキシ−形状のヘモグロビン濃度
を通して測定可能な酸素であったとしても、また、NAD^
＋、NADH、フラビン、チトクロム等、他の構成成分の濃
度を測定することによっても重要な情報を得ることがで
きる。必要かつ特定の測定で利用可能な時間およびコン
ピュータ資源の量と得ることのできる情報量、感度、信
頼性および特異性とは相殺関係にある。
従来技術の多くが、このような組織の化学成分の分光
検出を、反射における吸収ピーク、およびUVもしくは青
色光における蛍光ピークを単波長もしくは多波長励起で
それらの濃度に相関させるものとして記載していること
を考えれば、本発明の方法と組み合わせたスペクトラキ
ューブシステムはこのような成分の１つ以上の濃度を同
時にマップするために使用することができる。スペクト
ラキューブシステムが作動させる特定のハードウェアに
よって、得られる情報の型および量が決定されるであろ
う。
例えば、最も単純かつ最も直接的な構成は、スペクト
ラキューブを基底部カメラのCCDポートに取り付けて網
膜が撮像されるようにすると同時に、基底部カメラの同
じ広帯域白色光源を用いて網膜からの反射光を測定する
ものである。この場合、酸素濃度はデロリ（Delori）の
アルゴリズムを用いて測定することができ［Delori（19
95）,Appl.Optics Vol.27,1113,1988、およびAppl.Opti
cs,Vol.28,1061;およびDelori et al（1980）,Vision R
esearch,Vol.20,1099］、また、同様に、撮像された画
像の全ピクセルに拡張することができる。スペクトラキ
ューブに基づいたより複雑なシステムは（１）自然蛍光
分光撮像、（２）UVもしくは青色光蛍光励起ランプを用
いる分光撮像、（３）単一で、連続して、もしくは順
に、波長650,442,378,337,325,400,448,308,378,370,35
5,および他の同様な情報を与える同等な波長のいずれか
にあるレーザ励起蛍光を用いる分光撮像である。
これらの構成はいくつかの様式で構築することが可能
であり、独立していてもよく、また、同一の装置中でい
かなる数の組み合わせに結合してもよい。装置は光源
（複数でもよい）、基底部カメラおよびスペクトラキュ
ーブからなり、データを解析し、眼科医に有用なように
表示するためのコンピュータおよびソフトウェアを含
む。
白色光反射、自然蛍光、単波長連続波レーザ励起蛍
光、もしくは多波長レーザ励起蛍光の場合、サンプルは
照明され、分光像が測定される。
パルスレーザ（複数でもよい）照明の場合、スペクト
ラキューブの実施方法は若干変形され、いくらかの基本
的でも実質的でもないが装置の作動に重要なハードウェ
ア変更を必要とする。これらは以下の通りである。
単一パルスレーザ励起蛍光分光撮像の場合、レーザパ
ルスとスペクトラキューブのCCDのフレーム取り込みと
を干渉計の走査角度と同期させ、各パルスにおいて干渉
計がステップを行い、新たなフレームがコンピュータに
よって収集されるようにする（一般に数パルスを各フレ
ームのために使用することもできるが、この数はフレー
ム毎に変化しないようにする）。こうして、各OPD値に
おいて、インターフェログラムは所定の（異なった）数
のレーザパルスに対応する。これは、各フレームを同一
の総照明強度で取り込むことを確実にするために必要で
あり、さもなければ、各フレームは異なった数のレーザ
パルスに由来する蛍光を測定することになり、インター
フェログラムは歪む。
数パルスのレーザに誘発された蛍光分光撮像の場合、
実施方法は２つの手法で行うことができる。すなわち
（１）上述のように順に各レーザについて全分光立方体
を収集すること；これは、測定中に１つのレーザのみが
活性化され、最後には各レーザ波長について１つの測定
された分光立方体が存在するようにすることを意味す
る、と（２）各レーザを順に干渉計およびフレーム取り
込みと同期させてパルス化し、すべてのレーザが順に次
の干渉計ステップおよび次のフレームの取り込みの前に
切り替えられるようにし、最後には１つの分光立方体の
みが測定されるようにすることである。
最後には当然、すべての情報を分析および解析しなけ
ればならない。最も重要なアルゴリズムは、画像の異な
った波長間および異なったピクセル間で得られる強度を
比較するものとなろう。これらのアルゴリズムは強度の
変形、および組織中の異なった領域間および異なった波
長間の比を考慮すべきである。この方法は極めて感度が
高く、また、大きな定量的情報を提供するものであるた
め、スリットランプ撮像（白色光もしくは濾過光）の代
わりとなり得る。
他の用途は当業者に明らかであろう。これらには脈絡
膜虚血、急性区分脈絡膜虚血、虚血性視神経症、角膜お
よび虹採障害等による視覚喪失、および現在白色光や由
来の異なる蛍光を用いた撮像法で分析されている多くの
他のものが含まれる。
実施例７ 腸、膀胱、肺、頚部および他の器官における生体内での
癌性組織のマッピング スペクトラキューブシステムは内視鏡および腹腔鏡を
含むあらゆる撮像光学要素に取り付け可能であるため、
手術前、中、もしくは後において外科医が切断の開始部
位、停止部位を決定したり、病理組織が手術において除
去されたかどうかを判断する助けになり得る。スペクト
ラキューブシステムは本質的に組織の性質質を、その分
光特性に関係した化学組成を通して分析し、使用者が把
握、判断および行動を行うための視覚マップ（通常強調
されたもの）を提供するのに本質的に適している。
生体内で癌性組織を検出する場合、ハードウェア構成
および関与する分析および表示アルゴリズムの双方は上
述の眼科の実施例（実施例６参照）に酷似している。違
いは集光光学要素（基底部カメラに代わる異なる型の内
視鏡）、検出に関わるいくつかの基本的分子成分の型で
あり、これらのいくつかは、酸素濃度のようにおそらく
共通であり、他の付加的なものはコラーゲンおよびエラ
スチン、DNAクロマチンのような細胞核内の遺伝子物質
等である。多波長もしくはパルス化励起の場合における
照明および同期の要求も同様である［Pitris et al.,Pa
per presented at European Biomedical Optics Week b
y SPIE,1995年９月12〜16日、Barcelona Spain］。
実施例８ 主要コンポーネント解析を用いた細胞および組織分類に
よる診断病理学の補助 今日、細胞および組織の顕微鏡検査に基づいて診断お
よび手術の決定が多くなされている。検査員は、血液、
膣および頸管スミアおよび尿サンプルのような細胞スミ
ア、もしくは着色および／もしくは固着された組織に基
づいて決定を行う。典型例として広く知られたPapスミ
アがあり、これはパピロマ（Papilloma）ウイルス頸管
癌を検査するため、多数の頸管スミアについてなされ
る。
解析は病理学者により行われるが、病理学者は長年に
わたって顕微鏡を通して観察し、細胞の形状、色彩、核
および細胞質の相対サイズ、群生する細胞およびその他
の空間的な特徴などに基づいて、細胞の認識および分類
を実際に学んでいる。病理学者はまた、スミアに見れれ
る残滓物質および人工物を無視することを学んでいる。
このような検査はしかしながらたぶんに主観によると
ころが多く、毎日行われるべき検査があまりに多いた
め、しばしば技術者が予備選別を行って、深い検査を必
要とする疑いのある細胞もしくは組織のみを病理学者に
提供している。但し、予備選別は人間のミスもしくは疲
労などによりある程度信頼性に欠ける可能性がある。
病理学分野においては、このようなテストの客観性お
よび信頼性をもっと向上させるとともに自動化すべきで
あるという必要性が広く認識されている。今日、病理学
者は最終診断を行う必要があるが、将来において選別お
よび診断が自動的に行えるようになるとは確信できるも
のではない。
賢い変換および表示アルゴリズムを有したSpectraCub
eTMテクノロジーは、病理診断の全ステージにおいて、
選別において用いることができ、病理学者による診断に
おける客観性及び信頼性の向上の助けとなり、いずれは
完全な自動診断の助けとなりえる。
病気に犯された細胞は、病気の種類および段階に応じ
て化学的に大きく変化することが良く知られている。そ
の結果、これらの変化は、分光分析データ、着色細胞も
しくは組織の光透過、自己蛍光、追跡プローブの蛍光も
しくは顕微鏡観察における反射コントラストとして現れ
る。分光分析と撮像と組み合わされてなるSpectraCube
TMシステムは、これら全てのモード観察に用いることが
でき、これらの特性を検出するとともに定量測定を行う
ための非常に優れた装置であり、適切な数学的な処理を
行うことにより、病理学者もしくは外科医に診断決定の
ための測定結果を提示することができる。
表示および変換のために用いられるアルゴリズムは上
述のいずれもの、例えば、異なるタイプについての類似
マッピングおよび分類法、主要コンポーネント解析法、
神経ネットワーク法、その他の当業者にとって明らかな
方法である。
図28〜図30には、診断病理学の分野での本発明を用い
る方法を示している。図28は、バパニコラテスト（すな
わち、Papスミア）用に通常的に用いられる頸管スミアH
aematoxy−Eosin着色細胞について、本発明の方法を用
いて得られた透過顕微鏡RGBイメージを示す。イメージ
（画像）の中央の細胞（Ａマーク部であり、細胞の核を
示す）がHPV（human Papillona virus）細胞（すなわ
ち、癌性の頸管細胞）であり、一方、イメージの右下部
細胞（Ｂマーク部であり、細胞の細胞質を示す）が正常
頸管細胞である。符号C,DおよびＥは多形核細胞（すな
わち、好中球）を示し、鱗状細胞の核をＢ符号で示し、
癌性細胞の細胞質をそれぞれ示す。これら細胞は白黒イ
メージで示されている（但し、オリジナルはカラーであ
る）ため、若干不鮮明であるが、これらの境界は手作業
で付けられた人工的な線で区別されている。
得られたスペクトルキューブは上述の主要コンポーネ
ント解析が行われる。この目的のため、全スペクトルレ
ンジ（450nm−800nm）が20の狭い波長レンジに分割され
る。すなわち、Ｎ＝20であり、ここでは、各波長レンジ
のそれぞれにおける各ピクセルの光強度に基づく20の白
黒イメージとして参照する。言い換えれば、20の所定主
要コンポーネントが存在する。これら20のイメージは、
上述の行列（マトリクス）B'の列を形成するために用い
られる。行列ＢおよびＣ、さらに行列Ｃの固有ベクトル
Vjおよび固有値μｉが上述のようにして計算される。図
29において、固有値μｉが、20の異なる主要コンポーネ
ント、すなわち、波長レンジ（ｉ＝1,...,20）の関数と
してプロットされる。図30aは、ピクセル強度としてベ
クトル積BV20の値を用いて得られた白黒強度イメージを
示し、これは白黒カメラを通して観察されるオリジナル
イメージや、図28のように白黒イメージとして表示され
たイメージと非常に良く似ている。しかしながら、図か
ら分かるように、サンプルに固有の重要なスペクトル情
報を有しておらず、サンプルを通過した光に影響され、
顕微鏡ランプのスペクトルを主として有する。一方、図
30b,30cに示されるように、多の固有ベクトル、例え
ば、BV10およびBV13を用いて同様に得られた強度イメー
ジは新たな効果を示す。癌性細胞（図28のＡ）の端部の
まわりのピクセルおよび癌性細胞のみが他の部分より高
い強度（図30b,30cにおける白色ゾーン）を示し、一
方、正常細胞（図28のＢ）は他のイメージ部分より低い
強度（図30b,30cにおける暗色ゾーン）を示す。このた
め、図29に示されるように検査イメージにおいて存在値
が非常に低い主要コンポーネント10および13に応答する
物質もしくは構造は、それがなんであれ、癌性細胞に特
有であり、正常細胞の下で表されるということを結論付
けることができる。このため、あるタイプの細胞もしく
は細胞の一部のみが行列Ｂおよび固有値Viとともに構成
される一つもしくは複数のイメージを示すという事実
を、本発明の方法により測定されるときに各タイプを分
類するために用いることができる。
まとめると、先の米国特許出願第08/392,019号に、二
次元CCDセンサおよび電子機器を組み合わせて得られる
特に高感度の干渉法に基づくユニークな分光撮像システ
ムが述べられており、これによれば、空間的に系統だっ
た方法で何百何千ものスペクトルを同時に特定しコンピ
ュータに記憶することができる。本発明は、これら機器
（ハードウエア）が生物研究、医学治療および診断にど
のように用いることができるかということを述べる。こ
こに提案される方法における分光分析と撮像との組み合
わせ方法は新たな分野を開くものであり、これを分光生
物撮像と称する。
本発明が優れている点は、分光測定および測定データ
をサンプルの全ての点（すなわち、ピクセル）において
独立して且つ同時に収集できるので、サンプル位置を関
数として物質および分子タイプおよびその集中度に関す
る情報を提供でき（これにより物質の存在および集中度
をマップ化できる）、さらに、これと同時に従来の撮像
法も同時に得ることができることである（これにより従
来の形態学的解析（例えば、米国特許第4,965,725号参
照）も可能となる）。このため、本発明は、光透過、反
射、散乱および蛍光方法を用いて高い空間およびスペク
トル解像度で、細胞および組織成分、構造、器官、遺伝
物質、投与蛍光追跡プローブの存在検出および定量検査
や、細胞および組織内での投与薬剤の分配測定を行うこ
とができる。
本発明のさらなる効果は、分光分析データの変換が非
常に単純であることである。本発明に係るデータは位置
毎に集められるのではなく、撮像画面から集められ、い
くつかの波長ではなく多数の波長に対して集められると
いう事実から、本発明は、（１）例えば、同一の患者の
癌性および非癌性組織表面を比較するので、各患者の組
織を比較する場合とは異なり、着色効果を自動的に除去
することができ、（２）異なる波長での強度の比較を行
うことができるので、求める特性からは独立したスペク
トル効果を自動的に除去することができ、（３）一旦、
システムソフトウエアが適切な特性強調（例えば、人工
色もしくは他の手段の使用）を行ったり、適切なディス
プレイ（例えば、コンピュータの画面もしくはビデオ画
面）上に強調イメージを表示したりすると、イメージに
おける求める特性およびその境界を容易に視覚化してユ
ーザに示すことができる。
本発明のさらなる効果は、フィルター、格子およびそ
の他の分散技術による周知のFellgettもしくは多重効果
フーリエ変換分光分析であり、これはスペクトル測定に
おいて高いS/N比を示す。但し、ノイズレベルが信号か
ら独立している（背景もしくはシステム限定作動）時、
およびノイズが信号の平方根に比例し（フォトンノイズ
制限）且つ信号が全スペクトルレンジでの平均信号より
高い場合である。
本発明のさらなる効果は、先の米国特許出願第08/39
2,019号に詳細が開示されている空間的な光学形状によ
り、このシステムコンセプトおよびシステムハードウエ
アそのものを撮像すべきどのようなサンプル表面にも用
いることができ、現存するもしくは将来開発されるどの
ような撮像光学系にも用いることができるということで
ある。
本発明の重要点はまた、計測データを意味ある方法で
変換し表示するためにコンピュータソフトウエアとして
用いられる数多くの数学的アルゴリズムである。同一の
機器（主として研究分野のユーザ用であり、様々な作業
が可能となる）において、もしくは別々の機器（実務家
用であり、特化された迅速な作業が可能となる）におい
て、さらに、種々の用途に応じて要求される多様性の組
み合わせおよびレベルにおいて、多くのタイプのアルゴ
リズムを用いることができるのは明らかである。このア
ルゴリズムは（現在および将来、この技術分野で知られ
ている）スペクトル情報の変換に厳格に基づくものとす
ることができる。このようなものとしては、特定の化学
エレメントもしくは分子のスペクトル吸収もしくは発光
ピークがあり、このような化学物質の集中度マッピン
グ、もしくは厳格に形態学に用いられる。このとき、イ
メージ形状および現在および将来のイメージ処理アルゴ
リズム、もしくはスペクトルおよび撮像情報の組み合わ
せが用いられ、このようなものとしては、例えば、主要
コンポーネント解析、算術演算、背景除去もしくは異な
るタイプの分類分けによる全ピクセルのスペクトル間の
比較、異なるピクセルもしくは空間範囲間での比較、お
よび異なる波長もしくは空間範囲間での比較がある。
当業者によれば、上述の撮像システムもしくは撮像分
光分析システムに付属のものを用いて、もしくは将来出
現する撮像装置を用いて、上記のものと類似もしくは関
連する多種の用途を見いだすことができるのは明らかで
ある。
以上においては、限られた数の実施例に基づいて本発
明を説明したが、これ以外にもたくさんの本発明の変形
例、修正例、および用途があることは明らかである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｂ 11/00 Ｇ０１Ｊ 3/443 Ｇ０１Ｊ 3/443 Ｇ０１Ｎ 21/27 Ｅ Ｇ０１Ｎ 21/27 21/64 Ｅ 21/64 33/48 Ｐ 33/48 33/483 Ｃ 33/483 Ｇ０２Ｂ 21/36 Ｇ０２Ｂ 21/36 Ａ６１Ｂ 3/12 Ｅ (72)発明者 ダーク ジー ソエンクセン アメリカ合衆国、カリフォルニア 92008、カールスバッド、チェシャイア 3638 (72)発明者 ダリオ カビブ イスラエル国、ティムラート 23840、 ハボルシュ ７ (72)発明者 ロバート エー バックワルド イスラエル国、ラマト イシャイ 30095、ハダガンストリート (72)発明者 ツビ マリック イスラエル国、クファー ハロエ 38955、 (56)参考文献 特開 平４−339225（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−301562（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−88116（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−112122（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−244239（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−126746（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−10814（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−296834（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−300684（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−174631（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−209187（ＪＰ，Ａ) 特表 平５−503367（ＪＰ，Ａ) 特表 平11−503239（ＪＰ，Ａ) 米国特許4976542（ＵＳ，Ａ) 米国特許5539517（ＵＳ，Ａ) 国際公開95／18236（ＷＯ，Ａ１) 国際公開95／20148（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 21/62 - 21/74 G01N 21/00 - 21/01 G01N 21/17 - 21/61 G01N 33/48 - 33/50 G01J 3/00 - 3/52 ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＷＰＩ／Ｌ（ＱＵＥＳＴＥＬ) 実用ファイル（ＰＡＴＯＬＩＳ) 特許ファイル（ＰＡＴＯＬＩＳ)

Claims (69)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】高い空間およびスペクトル解像度を特徴と
    する分光生物撮像方法でって、 （ａ）分光撮像されるべきサンプルを調製し、 （ｂ）そのサンプルを撮像分光計に光学的に結合された
    光学装置を通して観察することにより、 （ｉ）コリメート光学要素を用いてサンプルの全ピクセ
    ルからの入射光を同時に集光し、 （ii）コリメートされた入射光を多数の要素を有する干
    渉計系に通して、光を干渉計内部で異なった方向に進行
    する２つのコヒーレント光線に分割し、次いで２つのコ
    ヒーレント光線を再結合して互いに干渉させ、出射光線
    を形成するようにし、 （iii）出射光線を合焦光学系に通して、検出器要素の
    ２次元アレーを有する検出器上に出射光線を合焦させ、
    各時点において、前記検出器要素の各々が、測定の全期
    間にわたり前記サンプルの１つの常に同一のピクセルの
    像となり、 該サンプルの実像が検出器アレーの面上で静止し測定の
    全期間にわたり該像が可視的で、かつ、識別可能な状態
    となるようにし、 前記検出器要素の各々によって、各時点についての光路
    差の関数として、異なる波長で前記ピクセルから発せら
    れた光の強度の特定の一次結合となる信号を生成し、 （iv）干渉計系の少なくとも１つの要素を回転させるこ
    とによって、干渉計系に生成された２つのコヒーレント
    光線の間の光路差をサンプルの全ピクセルについて同時
    に走査されるようにし、 （ｖ）記録装置を用いて各検出器要素の信号を時間の関
    数として記録し、データの第１のスペクトルキューブを
    形成し、 （ｃ）数理アルゴリズムを用いて第１のスペクトルキュ
    ーブを解釈する工程を含むことを特徴とする分光生物撮
    像方法。
  2. 【請求項２】（ｄ）解釈されたデータのスペクトルキュ
    ーブをマップする工程を更に含むことを特徴とする請求
    項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】前記光学装置は、顕微鏡、カメラレンズ、
    内視鏡、眼底カメラおよび眼底鏡からなるグループから
    選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】前記顕微鏡は、反射顕微鏡、透過顕微鏡、
    蛍光顕微鏡、直立（縦型）顕微鏡、倒立顕微鏡、暗視顕
    微鏡、コンフォーカル顕微鏡、定在波コンフォール顕微
    鏡および反射コントラスト顕微鏡からなるグループから
    選択されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】前記平行光は、サンプルからの透過光、サ
    ンプルからの反射光、サンプルからの散乱光およびサン
    プルからの発光光からなるグループから選択されること
    を特徴とする請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】前記サンプルからの前記発光光は、投与プ
    ローブ蛍光、投与プロープ励起蛍光および自己蛍光のグ
    ループから選択されることを特徴とする請求項５に記載
    の方法。
  7. 【請求項７】光源から生成される前記光は、レーザー、
    白色光、フィルター透過光、紫外光および短波長レンジ
    の光のグループから選択されることを特徴とする請求項
    １に記載の方法。
  8. 【請求項８】前記光は複数の光源から生成され、これら
    光源は同時に作動されることを特徴とする請求項１に記
    載の方法。
  9. 【請求項９】前記光は複数の光源から生成され、これら
    光源は順次作動されることを特徴とする請求項１に記載
    の方法。
  10. 【請求項１０】前記２次元アレイは、ビデオレートCC
    D、冷却高ダイナミックレンジCCD、増感DDCもしくは時
    間ゲート増感CCDのようなCCDか、 前記光は複数の光源から生成され、これら光源は同時に
    作動されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  11. 【請求項１１】前記サンプルは細胞、組織および微生物
    からなるグループから選択されることを特徴とする請求
    項１に記載の方法。
  12. 【請求項１２】前記細胞および組織は人体から採取され
    ることを特徴とする請求項11に記載の方法。
  13. 【請求項１３】前記細胞は、例えば、Pap染色により集
    められた細胞、血液細胞、胎児細胞、悪性腫の疑いのあ
    る細胞、***休止期の細胞、有糸***中細胞および還元
    ***中細胞であることを特徴とする請求項11に記載の方
    法。
  14. 【請求項１４】前記組織は、網膜、網膜血管、腫瘍、皮
    膚、角膜、髪、肺、胃、腸、膀胱、結腸、前立腺、動
    脈、静脈および心臓からなるグループから選択されるこ
    とを特徴とする請求項11に記載の方法。
  15. 【請求項１５】前記サンプルが網膜であり、前記方法
    が、網膜血管における酸化および脱酸化ヘモグロビンの
    検出用であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  16. 【請求項１６】前記サンプルが網膜であり、前記方法
    が、網膜のメラニン色素沈着レベルの検出用であること
    を特徴とする請求項１に記載の方法。
  17. 【請求項１７】前記サンプルが細胞、組織の一部および
    微生物からなるグループから選択され、前記光がプロー
    ブにより励起され、このプローブは特定の細胞成分に結
    合され、前記方法は細胞成分の存在もしくはそのレベル
    の検出用であることを特徴とする請求項１に記載の方
    法。
  18. 【請求項１８】前記プローブは共役蛍光部分を含み、前
    記励起が蛍光部分の蛍光発光であることを特徴とする請
    求項17に記載の方法。
  19. 【請求項１９】前記プローブがさらに核酸分子を含み、
    前記方法がこの核酸分子を交配する細胞核酸の存在もし
    くはそのレベルの検出用であることを特徴とする請求項
    18に記載の方法。
  20. 【請求項２０】前記細胞核酸がデオキシリボ核酸おとび
    リボ核酸からなるグループから選択されることを特徴と
    する請求項19に記載の方法。
  21. 【請求項２１】前記プローブが抗体を含み、前記方法
    が、この抗体により認識される細胞蛋白質の存在もしく
    はそのレベルの検出用であることを特徴とする請求項17
    に記載の方法。
  22. 【請求項２２】前記蛍光部分が、SpectrumOrangeTM、Sp
    ectrumGreenTM、Aqua、Texas−Red、FITC、ローダミ
    ン、フルオレスセイン、カスケードブルーおよびこれら
    の組み合わせからなるグループから選択されることを特
    徴とする請求項18に記載の方法。
  23. 【請求項２３】前記数学アルゴリズムが、サンプルの各
    ピクセルのスペクトルのポイントオペレーション解析で
    あることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  24. 【請求項２４】前記ポイントオペレーション解析が、サ
    ンプルにおける各ピクセルのスペクトルを変形関数に基
    づいてスカラーマッピングすることを含むことを特徴と
    する請求項23に記載の方法。
  25. 【請求項２５】前記ポイントオペレーション解析が、サ
    ンプルにおける各ピクセルのスペクトルを変形関数に基
    づいて別のスペクトルにマッピングすることを含むこと
    を特徴とする請求項23に記載の方法。
  26. 【請求項２６】前記数学的アルゴリズムが形態学解析で
    あることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  27. 【請求項２７】前記数学的アルゴリズムが類似マッピン
    グ解析であり、これによりサンプルの各ピクセルにおけ
    る参照スペクトルからのスペクトル差を計算することを
    特徴とする請求項１に記載の方法。
  28. 【請求項２８】前記類似マッピング解析がグレイレベル
    もしくは擬似カラーイメージを作りだし、明るいピクセ
    ルが小さなスペクトル差に対応し、暗いピクセルが大き
    なスペクトル差に対応することを特徴とする請求項27に
    記載の方法。
  29. 【請求項２９】前記類似マッピング解析がグレイレベル
    もしくは擬似カラーイメージを作りだし、ここでは明る
    いピクセルが大きなスペクトル差に対応し、暗いピクセ
    ルが小さなスペクトル差に対応することを特徴とする請
    求項27に記載の方法。
  30. 【請求項３０】前記スペクトル差が、各ピクセルのスペ
    クトルと参照スペクトルとの差の絶対値を所定波長レン
    ジにおいて積分して定義されるスカラーであることを特
    徴とする請求項27に記載の方法。
  31. 【請求項３１】前記数学的アルゴリズムが類似マッピン
    グ解析であり、これにより、各ピクセルのスペクトルに
    おけるいくつかの参照スペクトルからのスペクトル差を
    計算することを特徴とする請求項１に記載の方法。
  32. 【請求項３２】前記分類マッピング解析が擬似カラーイ
    メージを作りだし、このイメージのおいていくつかの参
    照スペクトルの一つに対して所定最大スペクトル差を有
    する一群のピクセルが所定擬似カラーによち着色される
    ことを特徴とする請求項31に記載の方法。
  33. 【請求項３３】前記スペクトル差が、各ピクセルのスペ
    クトルと前記いくつかの参照スペクトルの一つとの差の
    絶対値を所定波長レンジにおいて積分して定義されるス
    カラーであることを特徴とする請求項31に記載の方法。
  34. 【請求項３４】前記数学的アルゴリズムが主要コンポー
    ネント解析であることを特徴とする請求項１に記載の方
    法。
  35. 【請求項３５】前記主要コンポーネント解析が、 （ａ）全測定ピクセルおよび波長、なお、複数波長が用
    いられるときには励起光源の波長を含む、の共変マトリ
    クスを構築し、 （ｂ）この共変マトリクスを対角比するとともに全直交
    スペクトルベースエレメントを見つけだし、 （ｃ）どのベースエレメントがサンプルの所定特徴を有
    するかを探し出す ことからなることを特徴とする請求項34に記載の方法。
  36. 【請求項３６】前記数学的アルゴリズムが一次結合解析
    であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  37. 【請求項３７】前記一次結合解析が、前記第１のスペク
    トルキューブデータおよび前記第２のスペクトルキュー
    ブデータに属する一対の対応ピクセルの対応波長間に算
    術関数を適用して、第３スペクトルキューブデータを求
    めるようになっていることを特徴とする請求項36に記載
    の方法。
  38. 【請求項３８】前記一次結合解析は、二つのスペクトル
    キューブデータの平均演算、時間変化追跡およびスペク
    トル正規化からなるグループから選択されることを特徴
    とする請求項36に記載の方法。
  39. 【請求項３９】前記一次結合解析は、算術関数によって
    各ピクセルのスペクトル波長の全てに所定スカラーを与
    えるものであり、この算術関数は加算、減算、乗算、除
    算およびこれらの組み合わせからなるグループから選択
    されることを特徴とする請求項36に記載の方法。
  40. 【請求項４０】前記一次結合解析はバックグラウンドの
    除去に用いられ、サンプルのバックグラウンド部に位置
    するピクセルのスペクトルがサンプルのピルセルのスペ
    クトルから引き去られることを特徴とする請求項36に記
    載の方法。
  41. 【請求項４１】前記一次結合解析が校正処理に用いら
    れ、サンプル観察前に測定されたスペクトルのサンプル
    のピクセルのスペクトルを除するために用いられること
    を特徴とする請求項36に記載の方法。
  42. 【請求項４２】前記数学的アルゴリズムが光密度解析で
    あることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  43. 【請求項４３】前記光密度解析が光密度マップである変
    換イメージを得るためのものであることを特徴とする請
    求項42に記載の方法。
  44. 【請求項４４】前記数学的アルゴリズムは予め設定され
    た波長レンジを用いてRGBカラーイメージを計算するこ
    とを特徴とする請求項１に記載の方法。
  45. 【請求項４５】前記数学的アルゴリズムはピクセルの各
    スペクトル用の二つの異なる波長間の比を算出すること
    を特徴とする請求項１に記載の方法。
  46. 【請求項４６】前記数学的アルゴリズムはピクセルの各
    スペクトル用の二つの異なる波長間の比を算出し、この
    ように算出された比に応じて、各ピクセルの明色もしく
    は暗色の人口色で着色することを特徴とする請求項１に
    記載の方法。
  47. 【請求項４７】前記方法は、サンプルに投与された多重
    蛍光搬送体のスペクトル特定を行うために用いられるこ
    とを特徴とする請求項１に記載の方法。
  48. 【請求項４８】前記方法は、サンプルにおけるミクロ的
    な環境変化を検出するために用いられることを特徴とす
    る請求項１に記載の方法。
  49. 【請求項４９】前記ミクロ的な環境変化は、局所的な電
    位、pHレベルおよび細胞間のイオン集中からなるグルー
    プから選択されることを特徴とする請求項48に記載の方
    法。
  50. 【請求項５０】前記イオンが水素イオン、ナトリウムイ
    オン、マグネシウムイオン、亜鉛イオンおよびカルシウ
    ムイオンからなるグループから選択されることを特徴と
    する請求項49に記載の方法。
  51. 【請求項５１】前記方法は前記サンプル内の自然成分か
    らの自己蛍光を測定するために用いられることを特徴と
    する請求項１に記載の方法。
  52. 【請求項５２】前記自然成分が、葉緑素、ポルフィリン
    および細胞蛋白質からなるグループから選択されること
    を特徴とする請求項１に記載の方法。
  53. 【請求項５３】前記サンプルが、網膜、網膜血管、腫
    瘍、皮膚、角膜、髪、肺、胃、腸、膀胱、結腸、前立
    腺、頚部、動脈、静脈、心臓およびスミア細胞からなる
    グループから選択されることを特徴とする請求項51に記
    載の方法。
  54. 【請求項５４】前記方法は、生物学研究、薬品開発産
    業、病理学における細胞および組織分類、血液学、尿中
    のバクテリアの存在解析、染色体中での遺伝子識別およ
    びマッピング、遺伝子病診断、細胞器官解剖学および生
    理学、細胞核におけるクロマチン分配および凝縮、細胞
    質器官および成分マッピング、核皮膜マッピング、皮膚
    癌のマッピング、黒色腫およびほくろの選別、ポートワ
    イン母斑、および光力学的治療の前、間および後の皮膚
    画像作成からなる用途グループから選択される用途のた
    めに用いられることを特徴とする請求項１に記載の方
    法。
  55. 【請求項５５】前記細胞質成分はNAD+、NADH、フラビン
    およびチトクロームからなるグループから選択されるこ
    とを特徴とする請求項54に記載の方法。
  56. 【請求項５６】前記方法は、サンプルにおける少なくと
    も二つの蛍光間の空間分離を決定する蛍光共鳴エネルギ
    ー移転を測定するために用いられることを特徴とする請
    求項１に記載の方法。
  57. 【請求項５７】前記蛍光搬送体のうち少なくとも一つは
    サンプルに外部から投与されることを特徴とする請求項
    56に記載の方法。
  58. 【請求項５８】前記サンプルが細胞、組織および微生物
    からなるグループから選択され、前記方法はサンプルに
    おける細胞および細胞レベル以下の詳細の認識およびマ
    ッピングを行うために用いられることを特徴とする請求
    項１に記載の方法。
  59. 【請求項５９】前記サンプルはRomanowsky−Griemsa着
    色法、Haematoxylin−Eosin着色法およびMay−Grunwald
    −Giemsa着色法からなるグループから選択された方法に
    より着色されることを特徴とする請求項58に記載の方
    法。
  60. 【請求項６０】前記細胞レベル以下の詳細は、核におけ
    るクロマチン組織のタイプであり、このタイプは異質染
    色質および真正染色質からなるグループから選択される
    ことを特徴とする請求項59に記載の方法。
  61. 【請求項６１】前記サンプルが細胞、組織および微生物
    からなるグループから選択され、前記方法はサンプルに
    おける生命プロセスを時間を関数としてモニターするた
    めに用いられることを特徴とする請求項１に記載の方
    法。
  62. 【請求項６２】（ａ）少なくとも一つの蛍光染料を用い
    て少なくとも一つの核酸分子を特定し、少なくとも一つ
    の蛍光追跡核酸プローブを得るステップ、 （ｂ）生物サンプルの細胞核酸と前記プローブとを交配
    させるステップ、 （ｃ）撮像分光計に光学的に繋がった蛍光顕微鏡を通し
    て生物サンプルを観察する間に、 （ｉ）平行光学系を用いて生物サンプルの全ピクセルか
    らの射出光を同時に集光し、 （ii）この射出平行光を複数のエレメントを有する干渉
    計システムに通して、干渉計内を異なる方向に進む二つ
    の干渉ビームに分類し、そして、これら二つの干渉ビー
    ムを互いに干渉させて再結合させ励起ビームを生成し、 （iii）この励起ビームを合焦光学システムに通して二
    次元配列の検出エレメントを有する検出器に合焦させ、 各時点において、前記検出器要素の各々が、測定の全期
    間にわたり前記サンプルの１つの常に同一のピクセルの
    像となり、 該サンプルの実像が検出器アレーの面上で静止し測定の
    全期間にわたり該像が可視的で、かつ、識別可能な状態
    となるようにし、 前記検出器要素の各々によって、各時点についての光路
    差の関数として、異なる波長で前記ピクセルから発せら
    れた光の強度の特定の一次結合となる信号を生成し、 （iv）干渉計システムの一つもしくは複数の要素を回転
    させることによって、 干渉計システムにより作られた二つの干渉ビーム間の光
    路差を、生物サンプルの全ピクセルについて同時に走査
    し、 （ｖ）記録装置を用いて時間の関数として各検出エレメ
    ントの信号を記録して、第１スペクトルキューブデータ
    を形成し、生物サンプルの各ピクセルのスペクトルを得
    るステップ、及び （ｄ）数学的アルゴリズムを用いて前記第１スペクトル
    キューブデータを変換するステップ、 からなることを特徴とする蛍光交配方法。
  63. 【請求項６３】（ａ）少なくとも一つの核酸プローブと
    生物サンプルの細胞核酸とを交配させるステップ、 （ｂ）前記少なくとも一つのプローブを少なくとも一つ
    の蛍光染料により特定するステップ、 （ｃ）撮像分光計に光学的に繋がった蛍光顕微鏡を通し
    て生物サンプルを観察する間に、 （ｉ）平行光学系を用いて生物サンプルの全ピクセルか
    らの射出光を同時に集光し、 （ii）この射出平行光を複数のエレメントを有する干渉
    計システムを通過させて、 干渉計内を異なる方向に流れる二つの干渉ビームに分離
    し、これら二つの干渉ビームを互いに干渉させて再結合
    させ励起ビームを生成し、 （iii）この励起ビームを合焦光学システムに通して二
    次元配列の検出要素を有する検出器に合焦させ、 各時点において、前記検出器要素の各々が、測定の全期
    間にわたり前記サンプルの１つの常に同一のピクセルの
    像となり、 該サンプルの実像が検出器アレーの面上で静止し測定の
    全期間にわたり該像が可視的で、かつ、識別可能な状態
    となるようにし、 前記検出器要素の各々によって、各時点についての光路
    差の関数として、異なる波長で前記ピクセルから発せら
    れた光の強度の特定の一次結合となる信号を生成し、 （iv）干渉計システムの一つもしくは複数の要素を回転
    させることによって、 この干渉計システムにより作られた二つの干渉ビーム間
    の光路差を、生物サンプルの全ピクセルについて同時に
    走査し、 （ｖ）記録装置を用いて時間の関数として各検出エレメ
    ントの信号を記録し、第１スペクトルキューブデータを
    形成して、生物サンプルの各ピクセルのスペクトルを得
    るステップ、及び （ｄ）数学的アルゴリズムを用いて前記第１スペクトル
    キューブデータを変換するステップ、 からなることを特徴とする蛍光交配方法。
  64. 【請求項６４】前記数学的アルゴリズムが分類マッピン
    グ解析であり、これにより、各ピクセルのスペクトルに
    おけるいくつかの参照スペクトルからのスペクトル差を
    計算することを特徴とする請求項62に記載の方法。
  65. 【請求項６５】前記数学的アルゴリズムが一次結合解析
    であり、背景を除去するためのものであることを特徴と
    する請求項62に記載の方法。
  66. 【請求項６６】追加の数学的アルゴリズムとしての分類
    マッピング解析を用いるステップをさらに有し、この追
    加数学的アルゴリズムにより前記各ピクセルのスペクト
    ルに関して、少なくとも一つの参照スペクトルとのスペ
    クトル差を計算することを特徴とする請求項65に記載の
    方法。
  67. 【請求項６７】前記分類マッピング解析が、前記各ピク
    セルのスペクトルに関して、少なくとも一つの参照スペ
    クトルとのスペクトル差を計算するステップを含むこと
    を特徴とする請求項64に記載の方法。
  68. 【請求項６８】前記分類マッピング解析が、前記各ピク
    セルのスペクトルに関して、少なくとも一つの参照スペ
    クトルとのスペクトル差を計算するステップを含むこと
    を特徴とする請求項66に記載の方法。
  69. 【請求項６９】（ａ）解析用の細胞スミアを準備するス
    テップ、 （ｂ）撮像分光計に光学的に繋がった透過顕微鏡により
    前期細胞スミアを観察する間に、 （ｉ）平行光学系を用いて細胞スミアの全ピクセルから
    の射出光を同時に集光し、 （ii）この射出平行光を複数の要素を有する干渉計シス
    テムに通して、干渉計内を異なる方向に進む二つの干渉
    ビームに分離し、そして、これら二つの干渉ビームを互
    いに干渉させて再結合させ励起ビームを生成し、 （iii）この励起ビームを合焦光学システムに通して二
    次元配列の検出要素を有する検出器に合焦させ、 各時点において、前記検出器要素の各々が、測定の全期
    間にわたり前記サンプルの１つの常に同一のピクセルの
    像となり、 該サンプルの実像が検出器アレーの面上で静止し測定の
    全期間にわたり該像が可視的で、かつ、識別可能な状態
    となるようにし、 前記検出器要素の各々によって、各時点についての光路
    差の関数として、異なる波長で前記ピクセルから発せら
    れた光の強度の特定の一次結合となる信号を生成し、 （iv）干渉計システムの一つもしくは複数の要素を回転
    させることによって、 干渉計システムにより作られた二つの干渉ビーム間の光
    路差を、細胞スミアの全ピクセルについて同時に走査
    し、 （ｖ）記録装置を用いて時間の関数として各検出エレメ
    ントの信号を記録して、第１スペクトルキューブデータ
    を形成し、細胞スミアの各ピクセルのスペクトルを得る
    ステップ、及び （ｃ）数学的アルゴリズムを用いて前記第１スペクトル
    キューブデータを変換するステップ、 からなることを特徴とする細胞分類方法。
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