KR20110106436A

KR20110106436A - 세포의 유전적 분석

Info

Publication number: KR20110106436A
Application number: KR1020117018456A
Authority: KR
Inventors: 프레드릭 캠미; 개리 브라이트; 구스타프 앤겔보그; 제임스 린톤; 맨프레드 콜러
Original assignee: 신텔렉트 인코포레이티드
Priority date: 2009-01-09
Filing date: 2010-01-08
Publication date: 2011-09-28
Also published as: WO2010081052A1; CN102341505A; JP2012514477A; AU2010203477B2; EP2385993A1; AU2010203477A1; US20100179310A1; EP2385993B1

Abstract

일부 양태들은 세포들의 이종 모집단 내에서부터 선택된 세포들의 유전적 분석 방법들에 관한 것이다. 우선, 상기 세포들의 모집단은 분할될 수 있다. 선택된 세포들은 영상화에 의하여 식별되고, 이후 특이적으로 표적화되고 에너지 빔으로 조사되고 용해되어, 이들의 세포 내용물이 배양 배지 속으로 특이적 방출되게 된다. 상기 배양 배지는 이후 표본화되어 원하는 핵산의 존재 여부를 위해 검사될 수 있다.

Description

세포의 유전적 분석{GENETIC ANALYSIS OF CELLS}

세포들의 이종 혼합물에서 특이적인 세포들의 mRNA 또는 게놈 DNA와 같은 세포 핵산의 분석은 통상적으로 1 내지 10 개 정도의 분석물들을 현장(in situ)에서 분석하거나 배경 모집단으로부터 소정의 세포(들)을 기계적으로 분리하고 이후 상기 분리된 세포(들)의 내용물들을 수집하고 분석함으로써 통상적으로 수행된다.

정제되지 않은 혼합물에서 세포들을 직접 분석하는 상기 현장 분석 접근법은 현장혼성화(in situ hybridization: ISH)를 포함한다. 일반적으로, 현장혼성화는 세포들 또는 조직 절편들 내에서 특이적인 mRNA 또는 DNA 서열들을 검출하는데 사용되며 실험에서 측정될 수 있는 수많은 분석물들에 의해 제한된다. 통상적으로, 현장혼성화는 실험에서 1 또는 2 개의 분석물에 대해 수행된다(Young WS 3rd. Methods Enzymol . (1989) 168:702-10, 본 명세서에 참고로 전체가 포함되어 있다). 상기 현장 분석 접근법은 세포 정제 없이 그리고 후속 분석을 위해 세포 내용물들의 수집 또는 저장 없이 세포 표본의 맥락에서 세포 내용물들의 직접적인 분석에 의해 특정된다. 현장 분석 접근법들은 일반적으로 수동적인 현미경 관찰을 통해 수행되며 고 수율(high-throughput)로 스케일 업(scale up) 또는 자동화로 처리할 수 없다.

세포 내용물들을 수집하기 이전에 세포들을 정제하는 기계적 분리 접근법은 항체 기반 자기 비드 세포 정제법(anibody-based magnetic bead cell purification: 예컨대, MACS

Cell Separation, 밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec), 독일), 유동 세포계측 세포 분류법(flow cytometric cell sorting), 레이저 미세절제법(laser microdissection) 또는 기계적 미세절제법을 포함한다. 세포(들)가 일단 분리되면, 완전한 유전자 발현 프로파일링(complete gene expression profiling)과 같은 고도로 복잡한 분석을 수행할 수 있다. 이러한 다양한 세포 분리 방법들 각각은 그 자신의 장점과 한계를 갖는다. 예를 들면, 자기 비드 정제법 및 유동 분류법은 작업을 적절히 수행하기 위해 상대적으로 많은 수의 세포들을 필요로 하고, 분리된 세포의 절대적인 순수성은 거의 달성되지 않으며 선택 매개변수들이 일반적으로 일부 표면 마커(marker)들에 한정된다. 레이저 미세절제법은 단일 세포 또는 많은 세포들을 분리할 수 있지만, 처리될 수 있는 표본들의 숫자에서 한정되며 일반적으로 특이적인 요구조건들을 갖는 조직 표본들에 적용된다(Luo 등, Nat Med . (1999) 5(1): 117-22, 본 명세서에 참고로 전체가 포함되어 있다). 기계적 미세절제법은 처리될 수 있는 세포와 표본 숫자들 양쪽 모든 면에서 한정된다. 상기 분리 방법들 모두를 이용하여, 세포, 특히 희소 세포 분석은 처리 도중에 다수의 관심 대상인 세포들이 소실되는 수율 문제로 인하여 힘든 작업이 되었다.

다양한 세포 유형들의 복잡한 혼합물에 있어서 특이적인 세포들을 분석하는 하나의 핵산 분석 응용법은 순환중인 흩어져 있는(disseminated) 종양 세포들의 유전적 분석이다. 그러한 세포들은 원발 종양에 의하여 발산되며 혈액 또는 림프 순환 내에 존재하거나 다양한 조직들에 상주한다. 흩어져 있는 종양 세포들은 전이의 원인이 되는 것으로 여겨진다. 암 질환으로 사망하는 사망의 대다수는 전이로 인한 것이며 원발 종양 때문이 아니며, 순환중인 흩어져 있는 종양 세포들은 높은 관심의 진단 대상이 되었다. 예를 들면, 베리덱스(Veridex) LLC(워렌(Warren), 뉴저지(NJ))는 혈중유방종양세포들의 개수를 진단하는 도구로, 열거하는 FDA 승인 진단 시험을 개시하였다. 그러나, 혈중종양세포들의 존재를 검출하는 진단 가치는 차치하고, 이러한 세포들을 분자적으로 분류할 수 있는 것은 매우 바람직하다. 그러한 정보는 더 나은 예후적 정보를 밝혀낼 수 있으며 처리 의견들(treatment opinions)의 방향을 가리킬 수 있다. 예를 들면, 헤르셉틴(Herceptin) 처리에 대한 표적인 Her-2 수용체는 유방암 환자들의 하부 모집단(sub-population)에서 과도하게 발현되어 나머지 유방암 환자들의 모집단을 헤르셉틴 처리에 대해 무반응하게 한다. 이 예는 개인화된 암 처리에 대한 필요성을 강조한다. 순환중인 흩어져 있는 종양 세포들의 분자 프로파일링은 적합한 마커들이 식별되는 발견 단계(discovery phase) 및 표본된 마커들이 실행되는 진단 단계 양쪽 모두에 상당한 기술적 과제를 안겨주고 있다. 그러한 과제는 소저의 세포들이 100,000 분의 1 내지 10,000,000 분의 1 만큼 적은 수로 희소한 것에 기인하는데, 이의 정제를 위해 탁월하게 효율적인 공정을 필요로 한다.

지금까지, 혈중종양세포들의 유전적 분석 또는 분자 프로파일링은 항체-매개 분리를 통해 농축된 종양 세포들에 대하여 압도적으로 수행되어 왔다. 본 명세서에 참고로 전체가 포함되어 있는 문헌[Smirnov 등, Cancer Res . (2005) 65(12):4993-7]에서는 인간 혈액으로부터 면역자기 분리에 의하여 농축된 혈중종양세포들의 유전자 발현 프로파일링에 대하여 보고하였다. 상기 보고된 연구에 있어서 한계는 백혈구들을 오염시켜 수적으로 적어지는 순수한 농축된 종양 세포들이 부족하다는데 있다. 적어도 100 개의 종양 세포들이 획득되고 배경이 1,000 내지 10,000 개 미만의 백혈구들인 경우에만 유용한 유전자 발현 데이터가 생성될 수 있다. 이러한 한계로 인하여 혈액 7.5 ㎖ 당 100 개를 초과하는 높은 혈중종양세포 개수를 갖는 환자들로 환자들의 선택을 한정하게 되었는데, 이는 중대한 제한이며; 한 연구에 따르면 암 환자들의 대다수는 혈액 7.5 ㎖ 당 10 개 미만의 혈중종양세포들을 갖는 것을 보여주었다(Allard 등, Clin Cancer Res . (2004) 10(20):6897-904, 본 명세서에 참고로 전체가 포함되어 있다). 또한, 백혈구들로 오염시키면 종양 세포들에 의해 고도로 발현되는 유전자들에 대한 분석을 제한하게 되었다. 최종적으로, EpCAM과 같은 특이적인 항원에 대항하는 항체를 이용하는, 혈중종양세포들의 양성 선택은 본질적인 약점들을 갖는다. 혈중종양세포들은 노출된 표면 항원의 양에 상당한 이질성(heterogeneity)을 보여, 이러한 세포들을 포획하는데 있어서 효율성이 가변적이어서(Allard 등, Clin Cancer Res . (2004) 10(20):6897-904), 이로 인해 분석 감도를 약하게 하는 것으로 알려져 있다.

항체 선택을 이용한, 순환중인 종양 세포들을 분리하는 다른 시스템은 딥 이온 에칭(deep ion etching)에 의해 제작된 78,000 개의 마이크로포스트(micropost)를 갖는 유동 챔버(flow chamber)로 이루어진 CTC 칩이다. 상기 마이크로포스트는 EpCAM에 대한 항체로 코팅된다. 혈액이 상기 챔버를 통해 펌핑됨에 따라, 혈중종양세포들은 상기 마이크로포스트상에 유지된다. 포획된 세포들은 소수의 유전자들의 여부에 대해 RT-PCR에 의해 분석된다. 공개된 데이터에 의하면 6 개의 암 유형들에 대해 평균 56%의 순도를 갖는 가변적인 순도의 분리된 혈중종양세포들을 보여주고 있다(Nagrath 등, Nature (2007) 450(7173):1235-9, 본 명세서에 참고로 전체가 포함되어 있다). 또한, 표본 불순도는 유전자 발현 프로파일들의 질을 약화시킬 것이다. 또한, 이 방법은 종양 세포들에 의하여 나타난 EpCAm 양의 변화에 의해 유발된 감도의 변화에 적용받기 쉽다.

미국특허 제5,445,934호 미국특허 제7,378,236호 미국특허 제6,326,489호 미국특허 제7,425,426호 미국특허 제6,514,722호 미국특허 공개공보 제2007-795857호

아래의 참고문헌들은 참고로 전체가 포함되어 있다: Allard 등, "Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases(종양세포는 비악성 질환을 가진 환자 또는 건강한 대상에서는 아니지만, 모든 주요 암종의 말초 혈액 속을 순환한다)" Clin Cancer Res. (2004) 10(20):6897-904 Almoguera 등, "Most human carcinomas of the exocrine pancreas contain mutant c-K-ras genes(대부분의 인간 외분비췌장 암종은 변종 c-K-ras 유전자를 함유한다)" Cell (1988) 53:549-554 Bos 등, "Prevalence of ras gene mutations in human colon cancers(인간 결장암 내의 ras 유전자 변이체의 만연)" Nature (1987)327: 293-297 Hanania 등, "Automated in situ measurement of cell-specific antibody secretion and laser-mediated prufication for rapid cloning of highly-secreting producers(다량 분비성 생산자의 신속한 클로닝을 위해 세포-특이적 항체 분비 및 레이저-매개로 하는 정제에 대한 자동화 인시튜 측정)" Biotechnol Bioeng. (2005) 30;91(7):872-6. Letfullin 등, "Laser-induced explosion of gold nanoparticles: potential role for nanophotothermolysis of cancer(골드 나노입자의 레이저-유도 폭발: 암의 나노광열용해를 위한 잠재적 역할)" Nanomed. (2006) 1(4):473-80. Luo 등, "Gene expression profiles of laser-captured adjacent neuronal subtypes(레이저-캡쳐된 인접 뉴런 아류형의 유전자 발현 프로파일)" Nat Med. (1999) 5(1):117-22. McCoy 등, "Characterization of a human colon/lung carcinoma oncogene(인간 직장/폐 암종 유발유전자의 특성)" Nature. 1983 302(5903):79-81. Nagrath 등, "Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology(마이크로칩 기술에 의한 암환자의 희귀 혈중 종양세포의 분리)" Nature. (2007) 450(7173): 1235-9. Pastinen 등, "A system for specific, high-throughput genotyping by allele-specific primer extension on microarrays(마이크로어레이분석시 대립유전자에 특이적인 프라이머 확장에 의한 특이적 고속 처리량 유전자형 판별 시스템)" Genome Res. (2000) 10(7):1031-42. Pinkel 등, "High resolution anlysis of DNA copy number variation using comparative genomic hybridzation to microarrys(마이크로어레이를 기반으로 한 유전체 비교분석을 이용하여 DNA 복제수 변화에 대한 고해상도 분석)" Nat Genet. (1998) 20(2):207-11. Slebos 등, "K-ras oncogene activation as a prognostic marker in adenocarcinoma of the lung(폐의 선암종에 있어서 예후 표지로서의 K-ras 종양유전자 활성)" N. Engl. J. Med. (1999) 323: 561-565. Smirnov 등, "Global gene expression profiling of circulating tumor cells(혈중 종양세포의 전체적인 유전자발현 프로파일링)", Cancer Res. (2005) 65(12): 4993-7. Turkevich 등, "A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold(콜로이드성 골드의 합성에 있어서 핵형성 및 성장 과정에 관한 연구)", Discuss. Faraday. Soc. 1951, 11, 55-75. Yan 등, "Dissecting complex epigenetic alterations in breast cancer using CpG island microarrays(CpG 아일랜드 마이크로어레이를 이용한 유방암의 복합적 후생적 변화의 해부)" Cancer Res. (2001) 1;61(23):8375-80. Young WS 3rd. "In situ hybridization histochemical detection of neuropeptide mRNA using DNA and RNA probes(DNA 및 RNA 프로브를 이용한 뉴로펩티드 mRNA의 인시튜 혼성화 조직화학적 검출)" Methods Enzymol. (1989) 168:702-10.

본 명세서에 기재된 시스템, 방법 및 장치들은 각각 몇 가지 양태들을 가질 수 있으며, 그 어느 하나도 그것이 가지는 바람직한 속성들의 유일한 원인은 아니다. 하기 청구항들에 의해 표현되는 바와 같이 본 공개물의 범위를 한정하지 않고, 그것이 가지는 더 빼어난 특징들이 간략히 다루어질 것이다. 이러한 토론을 고려한 이후 그리고 특히 "발명을 실시하기 위한 구체적인 내용"이라는 제목의 부분을 읽은 이후에, 본 기술의 특징들이 희소 세포들을 포함하여, 세포 모집단에서 세포들의 상대적으로 빠르고 정확한 분석을 포함하는 장점들을 어떻게 제공하는지 알게 될 것이다.

본 명세서에 개시된 일부 실시예들은 세포들의 균일한 모집단 내에서 존재하는 세포들의 특이적인 유전적 분석 방법들에 관한 것이다. 일부 실시예에서, 관심 대상인 세포들이 식별되어, 상기 식별된 세포들은 표적된 세포 또는 세포들의 용해를 일으키기에 충분한 에너지로 상기 세포들을 조사하여 주변 배양 배지로 자신들의 세포 내용물들을 방출하게 되고, 방출된 핵산들을 함유하는 배양 배지는 표본되며 상기 표본된 배양 배지에 존재하는 핵산들은 분석된다. 일부 실시예들에서, 세포들이 삼투를 통해 물을 흡수하고 이후 단백질들을 변성시키는 과니딘 티오사이네이트(guanidine thiocyanate)와 같은 무질서 유발제(chaotropic agent)를 첨가하거나, 세포막을 분열시키고 단백질들을 변성시키는 도데실 황산 나트륨과 같은 계면활성제를 첨가하여, 이후 파열되도록 배양 배지의 몰 삼투압 농도를 낮춤으로써 세포들의 용해가 이루어질 수 있다. 여기의 예들 중 많은 것들이 핵산들의 분석과 관련되어 있다고 하더라도 단백질, 대사체 등과 같은 세포 내용물들 중 임의의 것을 이러한 방법들에 의하여 분석될 수 있다는 것에 유의하라.

일부 실시예들은 세포들의 이종 모집단 내에서 희소 세포로부터 핵산들의 분리방법들에 관한 것이다. 예를 들면, 상기 방법들은 (a) 상기 희소 세포를 함유하는 상기 저장소 내에서 희소 세포의 농도가 적어도 X-배 증가하도록(X는 저장소의 수를 상기 세포의 이종 모집단 중의 희소 세포의 수로 나누어진 것), 상기 세포들의 이종 모집단을 복수개의 저장소(bins)로 분할하는 단계; (b) 어느 저장소가 상기 희소 세포를 함유하는지를 결정하기 위해 저장소 각각의 실질적인 전체 면적을 신속히 영상화(imaging)하는 단계; (c) 세포의 용해를 유발하고 상기 희소 세포로부터 배지 속으로 핵산을 방출하기 위해 상기 희소 세포를 함유하는 상기 저장소에 시약을 첨가하는 단계; 및 (d) 용해된 상기 희소 세포들을 함유하는 상기 저장소만으로부터 방출된 핵산을 함유하는 배지를 수집하여, 상기 희소 세포로부터 상기 핵산을 수집하는 단계를 포함할 수 있다.

일부 양태들에서, 상기 방법들은 예를 들면, (a) 상기 희소 세포를 함유하는 저장소 내에서 희소 세포의 농도가 적어도 X-배 증가하도록(X는 저장소의 수를 상기 세포의 이종 모집단 중의 희소 세포의 수로 나누어진 것), 상기 세포의 이종 모집단을 복수개의 저장소로 분할하는 단계; (b) 어느 저장소가 상기 희소 세포를 함유하는지를 결정하기 위해 저장소 각각의 실질적인 전체 면적을 영상화하는 단계; (c) 상기 저장소의 영상들을 참조하여 상기 희소 세포들을 함유하는 저장소 내에서 상기 희소 세포들의 위치들을 찾는 단계; (d) 상기 희소 세포들을 함유하는 저장소 내에서 상기 희소 세포들의 위치들에 집중된 에너지 빔(energy beam)을 향하게 하여 다른 세포들을 상당히 용해시키지 않고 상기 희소 세포들의 특이적인 용해 및 상기 희소 세포들로부터 핵산들을 배지 속으로 방출하게 하는 단계; 및 (e) 용해된 상기 희소 세포들을 함유하는 저장소로부터 방출된 핵산들을 함유하는 배지를 수집하여, 비-희소 세포 핵산에 비해 희소 세포 핵산이 Y-배(Y는 상기 저장소 내의 용해되지 않은 비-희소 세포의 수) 풍부할 때까지 상기 희소 세포로부터 상기 핵산을 수집하는 결과를 낳는 단계를 포함할 수 있다.

일부 양태들에서, X는 예를 들면, 약 10, 30, 100, 300, 1,000, 3,000, 10,000, 30,000 및 100,000일 수 있다. 상기 저장소는 예를 들면, 다중 웰 플레이트의 웰들일 수 있다.

다른 일부 실시예들은 예를 들면, (a) 세포들의 이종 모집단을 영상화에 적합한 표면으로 옮기는 단계; (b) 상기 표면의 실질적인 전체 면적을 신속히 영상화하는 단계; (c) 상기 표면의 영상들을 참조하여 상기 표면상의 희소 세포들의 위치들을 찾는 단계; (d) 상기 희소 세포들의 위치들에 집중된 에너지 빔을 향하게 하여 다른 세포들을 상당히 용해시키지 않고 상기 희소 세포들의 특이적인 용해 및 상기 희소 세포들로부터 핵산들을 배지 속으로 방출하게 하는 단계; 및 (e) 용해된 상기 희소 세포들을 함유하는 저장소로부터 방출된 핵산들을 함유하는 배지를 수집하여, 비-희소 세포 핵산에 비해 희소 세포 핵산이 Y-배(Y는 상기 저장소 내의 용해되지 않은 비-희소 세포의 수) 풍부할 때까지 상기 희소 세포로부터 상기 핵산을 수집하는 결과를 낳는 단계를 포함하는 방법들에 관한 것이다. 일부 양태들에서, Y는 예를 들면, 약 10, 30, 100, 300, 1,000, 3,000, 10,000, 30,000 및 100,000일 수 있다.

상기 방법들은 상기 세포들의 이종 모집단을 상기 희소 세포들과 선택적으로 결합하는 작용제와 접촉시키는 단계를 더 포함할 수 있으며, 상기 작용제는 빛의 성질로서 검출할 수 있는 신호를 발생한다. 또한, 상기 방법들은 RNA 분해효소 억제제를 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.

일부 실시예들은 세포들의 이종 모집단 내에서 희소 세포들로부터 핵산들의 분리방법들에 관한 것이다. 상기 방법들은 예를 들면, (a) 상기 희소 세포를 함유하는 저장소 내에서 희소 세포의 농도가 적어도 X-배 증가하도록(X는 저장소의 수를 상기 세포의 이종 모집단 중의 희소 세포의 수로 나누어진 것), 상기 세포의 이종 모집단을 복수개의 저장소로 분할하는 단계; (b) 어느 저장소가 상기 희소 세포를 함유하는지를 결정하기 위해 저장소 각각의 실질적인 전체 면적을 영상화하는 단계; (c) 시약을 상기 세포들을 함유하는 저장소에 첨가하여 상기 세포들의 용해 및 상기 희소 세포들로부터 핵산들을 배지 속으로 방출하게 하는 단계; 및 (d) 용해된 상기 희소 세포들을 함유하는 저장소 만으로부터 방출된 핵산들을 함유하는 배지를 수집하여, 상기 희소 세포들로부터 상기 핵산들을 수집하는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 일부 실시예들은 세포들의 이종 모집단 내에서 희소 세포들로부터 핵산들의 분리방법들에 관한 것으로서, 상기 방법들은 예를 들면, (a) 상기 희소 세포를 함유하는 저장소 내에서 희소 세포의 농도가 적어도 X-배 증가하도록(X는 저장소의 수를 상기 세포의 이종 모집단 중의 희소 세포의 수로 나누어진 것), 상기 세포의 이종 모집단을 복수개의 저장소로 분할하는 단계; (b) 어느 저장소가 상기 희소 세포를 함유하는지를 결정하기 위해 저장소 각각의 실질적인 전체 면적을 영상화하는 단계; (c) 상기 희소 세포들을 함유하는 저장소 내에서 상기 희소 세포들의 위치들을 찾는 단계; (d) 상기 희소 세포들을 함유하는 저장소 내에서 상기 희소 세포들의 위치들에 집중된 에너지 빔을 향하게 하여 다른 세포들을 상당히 용해시키지 않고 상기 희소 세포들의 특이적인 용해 및 상기 희소 세포들로부터 핵산들을 배지 속으로 방출하게 하는 단계; 및 (e) 용해된 상기 희소 세포를 함유하는 저장소로부터 방출된 핵산들을 함유하는 배지를 수집하여, 상기 희소 세포로부터 상기 핵산들을 수집하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 양태들에서, 상기 찾는 단계는 예를 들면, 상기 저장소의 영상들을 참조하여 수행될 수 있다. 일부 양태들에서, 상기 수집하는 단계는 비-희소 세포 핵산에 비해 희소 세포 핵산이 Y-배 풍부할 때까지 상기 희소 세포로부터 상기 핵산을 수집하는 결과를 낳을 수 있으며, 상기 Y는 상기 저장소 내의 용해되지 않은 비-희소 세포의 수이다. 일부 양태들에서, Y는 예를 들면, 약 10, 30, 100, 300, 1,000, 3,000, 10,000, 30,000 및 100,000일 수 있다.

일부 실시예들에서, 상기 방법들은 예를 들면, 상기 세포들의 이종 모집단을 상기 희소 세포들과 선택적으로 결합하는 작용제와 접촉시키는 단계를 더 포함할 수 있으며, 상기 작용제는 빛의 속성으로서 검출할 수 있는 신호를 발생한다. 또한, 일부 실시예들에서, 상기 방법들은 예를 들면, (a) 및 (e) 단계 중 어느 한 곳에 RNA 분해효소 억제제를 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 양태들에서, 상기 저장소는 예를 들면, 다중 웰 플레이트의 웰들일 수 있다.

일부 실시예들은 세포들의 이종 모집단 내에서 희소 세포들로부터 핵산들의 분리방법들에 관한 것이다. 상기 방법들은 예를 들면, (a) 세포들의 이종 모집단을 영상화에 적합한 표면으로 옮기는 단계; (b) 상기 표면의 실질적인 전체 면적을 영상화하는 단계; (c) 상기 표면의 영상들을 참조하여 상기 표면상의 희소 세포들의 위치들을 찾는 단계; (d) 상기 희소 세포들의 위치들에 집중된 에너지 빔을 향하게 하여 다른 세포들을 상당히 용해시키지 않고 상기 희소 세포들의 특이적인 용해 및 상기 희소 세포들로부터 핵산들을 배지 속으로 방출하게 하는 단계; 및 (e) 용해된 상기 희소 세포들로부터 방출된 핵산들을 함유하는 배지를 수집하여, 상기 희소 세포들로부터 상기 핵산들을 수집하는 단계를 포함할 수 있다.

일부 실시예들에서, 상기 및 본 명세서의 어딘가에 기재된 방법들은 예를 들면, 나노입자 라벨(label)로 상기 세포들을 라벨링하는 단계를 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 나노입자 라벨링은 에너지 빔 매개 세포 용해의 효율성을 향상시키는데 사용될 수 있다.

다른 일부 실시예들은 세포의 내용물들의 분석방법들에 관한 것이다. 상기 방법들은 예를 들면, 분석을 위해 관심 대상인 세포를 포함하는 세포들의 모집단을 제공하는 단계; 상기 세포들의 모집단 내에서 적어도 하나의 관심 대상인 세포를 찾는 단계; 에너지 빔을 상기 적어도 하나의 관심 대상인 세포의 위치로 향하게 하는 단계로서, 상기 에너지 빔은 상기 세포로부터 내용물들을 방출하기에 충분한 상기 관심 대상인 적어도 하나의 세포를 적어도 부분적으로 용해시키기에 충분한 에너지를 갖는 단계; 및 상기 관심 대상인 세포로부터 방출된 내용물들을 분석하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 양태들에서, 상기 관심 대상인 세포는 예를 들면, 유핵 혈구 세포(nucleated blood cell), 일차 세포(primary cell), 세포주(cell line), 종양 세포, 병든 세포, 감염된 세포, 재조합 세포, 형질감염된 세포, 공학적으로 조작된 세포(engineered cell) 또는 돌연변이된 세포일 수 있지만, 여기에 한정되지 않는다. 일부 양태들에서, 세포 모집단은 예를 들면, 혈액, 림프, 뇌척수액, 척수, 외과적 시료들, 생검, 세포 배양물, 세포 라이브러리, 공학적으로 조작된 세포 모집단 등으로부터 온 세포 모집단일 수 있지만, 여기에 한정되지 않는다. 일부 양태들에서, 상기 방법들은 예를 들면, 상기 세포들의 모집단을 상기 관심 대상인 적어도 하나의 세포에 특이적인 라벨과 접촉시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 라벨은 예를 들면, 다클론성 또는 단일클론성 항체, 항체의 단편, 렉틴, 리간드, 단백질, 펩티드, 지질, 아미노산, 핵산, 잠금 핵산(Locked Nucleic Acid: LNA)과 같은 변형된 핵산, 합성 소분자 또는 라벨링용 임의의 기타 부분 중 하나 이상을 포함할 수 있지만, 여기에 한정되지 않는다. 일부 양태들에서, 상기 라벨은 예를 들면, 양고추냉이 과산화효소, 알칼리성 인산분해효소, 베타-갈락토시다제(beta-galactosidase), 베타-락타마제(beta-lactamase), Cy3 또는 Cy5, 플루오레신 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 피코알록시아닌(phycoallocyanin), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민(rhodamine), 6-카복시-X-로다민(6-carboxy-X-rhodamine: ROX), 6-카복시로다민(6-carboxyrhodamine: R6G), 텍사스 레드(Texas Red), 알렉사플루오르 염료(ALEXAFluor Dyes), BODIPY 형관단(fluorophore)들, 오레곤 그린(Oregon Green), 쿠마린(coumarin) 및 쿠마린 유도체들 또는 TAMRA 중 하나 이상을 포함할 수 있지만, 여기에 한정되지 않는다. 일부 양태들에서, 상기 라벨은 나노입자를 더 포함할 수 있다. 일부 양태들에서, 상기 나노입자는 에너지 빔 매개 세포 용해의 효율을 향상시킬 수 있다.

일부 양태들에서, 상기 찾는 단계는 예를 들면, 상기 세포들의 모집단을 영상화하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 상기 찾는 단계는 예를 들면, 상기 라벨의 존재에 근거하여 상기 적어도 하나의 관심 대상인 세포를 찾는 단계를 포함할 수 있다. 일부 양태들에서, 상기 방법들은 RNA 분해효소 억제제를 제공하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 양태들에서, 상기 세포 모집단은 예를 들면, 하나 이상의 빈으로 분할될 수 있다. 일부 양태들에서, 상기 방법들은 예를 들면, Fc 수용체-차단 시약을 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다.

일부 양태들에서, 상기 적어도 하나의 관심 대상인 세포는 예를 들면, 약 10,000 분의 1 미만의 농도로 상기 세포 모집단 내에 존재할 수 있다. 일부 양태들에서, 상기 적어도 하나의 관심 대상인 세포는 예를 들면, 약 100,000개의 세포 중 1개의 세포 내지 약 10,000,000개의 세포 중 1개의 세포의 농도로 상기 세포 모집단 내에 존재할 수 있다.

일부 양태들에서, 상기 방법들은 예를 들면, 적어도 상기 방출된 세포 내용물들을 수집하는 단계를 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 세포 내용물들은 핵산들, 폴리펩티드류, 단백질류, 지질류, 세포기관들 등일 수 있지만, 여기에 한정되지 않는다.

일부 양태들에서, 상기 분석하는 단계는 예를 들면, PCR, RT-PCR, 정량 RT-PCR, 마이크로어레이(microarray) 분석, 뉴클레아제 보호 분석, 퀀티젠(Quantigene) 분석, 타크만 SNP 검정(Taqman SNP assay), PCR-제한 절편 길이 다형성(PCR-restriction fragment length polymorphism), RNA 서열분석, DNA 서열분석, 차세대 서열분석, 단일 분자 실시간(Single Molecule Real Time: SMART) DNA 서열분석 기술 또는 나노스트링(Nanostring) 기술 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

일부 실시예들은 본 명세서에 기재된 방법들의 개별적 단계들 또는 특징들 중 하나 이상뿐만 아니라 상기 및 본 명세서의 어딘가에 기재된 방법들의 하나 이상을 수행하도록 구성된 장치들, 시스템들 및 기구들에 관한 것이다.

상기 사항은 개요이며, 따라서 필요하다면 세부사항의 단순화, 일반화 및 생략 사항을 포함한다; 따라서, 당업자는 상기 개요는 예시적인 것 일뿐이며 한정되는 의도는 아니라는 것을 알 것이다. 본 명세서에 기재된 방법들, 조성들 및/또는 장치들 및/또는 다른 주제의 다른 양태들, 특징들 및 장점들은 본 명세서에 설명된 교지에서 명백할 것이다. 상기 개요는 아래 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용에서 더 기술되는 개념들을 단순화한 형태로 발췌한 것을 소개하는데 제공된다. 이 개요는 청구된 주제의 중심 특징들 또는 본질적인 특징들을 확인하는 의도는 아니며, 청구된 주제의 범위를 결정하는 보조로서 사용되는 의도도 아니다.

본 개시물의 이전 및 다른 특징들은 첨부된 도면들과 연계하여 주어진, 이하 상세한 설명 및 첨부된 청구의 범위로부터 더 명백해 질 것이다. 이러한 도면들은 본 개시물에 따라 일부 실시예들만 묘사하며 따라서, 그 범위를 한정하는 것으로 간주해서는 안 된다는 것을 이해하여, 본 개시물은 첨부된 도면들의 사용을 통해 더 특징적으로 그리고 상세히 기술될 것이다.
도 1은 다른 처리들을 한 이후에 조직 배양 웰들에서 RNA 분해효소 활성을 묘사하는 그래프이다.
도 2는 다양한 배지 조제들이 용해된 세포들로부터 RNA의 수율에 미치는 효과를 묘사하는 그래프이다.
도 3은 인간 PBMC들의 배경에서 면역염색된 SW480 세포의 사진이다. 화살표는 SW480 세포를 나타낸다.
도 4는 단일 용해된 SW480 세포로부터 Ki-ras 유전자의 코돈 12에서의 돌연변이의 존재를 보여주는 서열 자취이다.
도 5는 금 나노입자 라벨링이 레이저 매개 용해 효율에 미치는 영향을 묘사하는 그래프이다.
도 6은 16 개의 단일 종양 세포 표본들에서 5 개의 선택된 유전자들의 검출을 보여주는 표이다.

발명을 실시하기 위한 구체적인 내용에 기재된 예시적인 실시예들, 도면들 및 청구항들은 한정적인 것을 의미하지 않는다. 본 명세서의 교지는 예를 들면, 청구항들에 의해 정의되고 다루어지는 사항들을 포함하여 수많은 다른 방법들로 적용될 수 있다. 본 명세서의 양태들은 다양한 형태로 구체화될 수 있으며, 본 명세서에 개시된 임의의 특이적인 구조, 기능 또는 양쪽 모두가 단순히 대표적인 것이라는 사항은 명백하다. 본 명세서의 교지에 따라, 당업자는 본 명세서에 개시된 양태는 임의의 다른 양태와는 독립하여 수행될 수 있고 이러한 양태들 중 둘 이상은 다양하게 결합될 수 있다는 것을 알 것이다. 예를 들면, 시스템 또는 장치는 구현될 수 있거나 방법은 당업자에 의해 본 명세서에 설명된 양태들을 임의로 적당한 수 만큼 또는 조합해서 사용하여 실행될 수 있다. 또한, 그러한 시스템 또는 도구는 구현될 수 있거나 그러한 방법은 본 명세서에 설명된 하나 이상의 양태들 이외에 또는 이와 달리 다른 구조, 기능성 또는 구조 및 기능성을 사용하여 실행될 수 있다. 다른 실시예들은 사용될 수 있으며, 여기에 제시된 주제의 사상 또는 범위를 벗어나지 않으면서 달리 변경할 수 있다. 본 명세서에 일반적으로 설명되고 도면에 예시된 바와 같이, 본 개시물의 양태들은 다양하게 다른 구성으로 배열, 치환, 조합 및 설계될 수 있으며, 이 모든 것들은 명시적으로 고려되고 이 개시물의 일부를 이루고 있다는 것을 쉽게 알 것이다. 다른 실시예들이 개시물 및 청구항들 내에 속할 수 있는 것처럼 개시된 실시예들은 아래에 기재된 실시예들에 한정되지 않는다는 것을 알아야 할 것이다.

본 명세서에 개시된 일부 실시예들은 세포들의 이종 모집단 내에서 존재하는 세포들의 특이적인 유전적 분석 방법들에 관한 것이다. 일부 실시예들에서, 관심 대상인 세포들이 식별되어, 상기 식별된 세포들은 표적된 세포 또는 세포들의 용해를 일으키기에 충분한 에너지로 상기 세포들을 조사함으로써 주변 배양 배지로 자신들의 세포 내용물들을 방출하게 되고, 방출된 핵산들을 함유하는 배양 배지는 표본화되며 예를 들면, 상기 표본화된 배양 배지에 존재하는 핵산들과 같은 상기 표본화된 배양 배지에 존재하는 물질들은 분석된다. 일부 실시예들에서, "희소" 세포는 주어진 세포들의 모집단 내에서 1,000 분의 1 내지 100,000,000 분의 1로 드물게 존재한다. 일부 바람직한 실시예들에서, 희소 세포는 주어진 세포들의 모집단 내에서 100,000 분의 1 내지 1,000,000 분의 1로 드물게 존재한다. 다른 바람직한 실시예들에서, 희소 세포는 주어진 세포들의 모집단 내에서 1,000,000 분의 1 내지 10,000,000 분의 1로 드물게 존재한다.

상기 희소 세포들의 분석 방법들의 독특한 특성은, 상기 분석 대상 세포가 분석 이전에 어떤 식으로든지 정제되거나 기계적으로 조작될 필요가 없다는 것이다. 또한, 상기 방법들은 매우 특이적이다. 상기 분석의 특이성은 세포를 조사하여 용해되도록 하는 정확성에 있다. 예를 들면, 레이저를 이용하여, 단일 세포들이 세포들의 혼합된 모집단 내에서 표적화되고 특이적으로 용해되어 세포 분석에 있어서 극도로 높은 특이성을 가능하게 한다. 또한, 관심 대상인 세포들을 기계적 분리를 위해서라기보다는 예를 들면, 검출 목적을 위해서만 특이적인 식별을 이용할 수 있다. 이러한 속성은 기계적인 제약을 고려할 필요가 없음에 따라 세포 라벨링의 세기로 환산해 보건대 더 강한 내성을 가능하게 할 수 있다. 또한, 상이한 라벨들의 조합을 현재 기술에 용이하게 사용할 수 있다. 최종적으로, 분비된 생성물들의 측정(Hanania 등, Biotech . and Bioengineering, 91(7), 2005, 본 명세서에 참고로 전체가 포함되어 있다)과 같은 기능적 라벨들은 일부 실시예들에서 혈중종양세포 식별에 채용될 수 있다. 분비된 생성물들은 세포의 표면상에 또는 분석 대상인 세포의 근처에서 포획되고 예를 들면, 본 명세서에 참고로 전체가 포함되어 있는 미국특허 제7,425,426호에 기재되어 있는 라벨링된 항체들을 이용하여 이후 검출될 수 있다.

상기 언급된 바와 같이, 상기 방법들은 예를 들면, 다른 세포들의 혼합물 내에 존재하는 관심 대상인 세포들로부터 핵산들과 같이, 세포들로부터의 물질들을 분석하는데 이용될 수 있다. 핵산들은 리보뉴클레오티드들 또는 데옥시리보뉴클레오티드들로 되거나 이들 양쪽 모두의 혼합물로 된 중합체들이다. RNA는 통상적으로 50 내지 10,000 뉴클레오티드 길이의 리보뉴클레오티드들의 중합체이며 DNA는 통상적으로 50 내지 220,000,000 뉴클레오티드 길이의 데옥시리보뉴클레오티드들의 중합체이다. 이 기술을 이용하여 용해된 세포들로부터 획득할 수 있는 핵산들은 메신저 RNA(mRNA), 마이크로 RNA, tRNA, rRNA, 바이러스성 RNA, 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)와 같이, 삽입체 구성체(construct)로부터 발현된 RNA 또는 siRNA와 같이 세포들로 전달감염된 RNA, 게놈 DNA, 미토콘드리아 DNA 및 바이러스성 DNA를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.

상기 획득된 핵산들은 PCR, RT-PCR, 타크만 프로브들 또는 Sybr 그린 화학을 이용한 정량 RT-PCR, 예를 들면 세퀴놈(Sequenom, 샌디에고(San Diego), 캘리포니아) 사의 매스 어레이(Mass Array) 시스템을 이용한 정량 RT-PCR, 마이크로어레이 분석, 뉴클레아제 보호 분석, 퀀티젠 분석(파노믹스(Panomics)), 타크만 SNP 검정, PCR-제한 절편 길이 다형성, RNA 서열분석, DNA 서열분석, 일루미나 게놈 분석기(Illumina Genome Analyzer) 또는 ABI 고체 기구 또는 로체(Roche) 454 기구 또는 헬리코스 바이오사이언시스 사(Helicos Biosciences Corporation: 캠브리지, 매사추세츠), 단일 분자 실시간(SMRT) DNA 서열분석 기술(퍼시픽 바이오사이언시스(Pacific Biosciences), 멘로 파크(Menlo Park), 캘리포니아) 및 나노스트링(Nanostring) 기술(나노스트링 테크날로지스(Nanostring Technologies), 시애틀, 워싱턴)을 포함하지만, 여기에 한정되지 않은 다양한 방식으로 분석될 수 있다.

세포들은 원핵 및 진핵 세포들을 포함하는 임의의 기원(origin)일 수 있다. 이의 제한되지 않는 예들은 포유류 세포들, 설치류 세포들, 비인간 영장류 세포들 및 인간 세포들을 포함한다. 세포들은 예를 들면, 혈액, 림프, 뇌척수액, 척수, 외과적 시료들, 생검물 등으로부터 획득될 수 있다. 또한, 분석 대상인 세포들은 예를 들면, 세포 배양물들, 세포 라이브러리들 및 공학적으로 조작된 세포 모집단들로부터 획득될 수 있다. 세포들은 본 명세서에 개시된 방법들에 사용되기 이전에 예를 들면, 밀도 원심분리, 면역자기 농축, 고정된 항체 포획을 통한 농축, 형광 활성 세포 분류(FACS), 막 여과, 비연관 세포들(irrelevant cells)의 응집 및 비연관 세포들의 화학적 용해로부터 획득될 수 있다. 세포들은 예를 들면, 유핵 혈구 세포, 일차 세포, 세포주, 종양 세포, 병든 세포, 감염된 세포, 형질감염된 세포, 공학적으로 조작된 세포, 돌연변이화된 세포 등을 포함할 수 있다.

표적화된 세포들로부터 세포 내용물들의 방출은 상기 세포들의 용해를 부분적으로 유발하기에 충분한 용량의 방사선으로 표적화된 세포들을 조사하여 달성될 수 있다. 바람직한 방사선 원은 세포 용해를 일으키는데 충분한 파장 및 에너지의 레이저이다. 일부 실시예들에서, 본 개시물의 방법들에 유용한 레이저들은 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2200, 2400, 2600, 2800 및 3000 ㎚으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 범위와 동일하거나 임의의 범위 사이의 파장을 갖는 방사선을 전달하는 레이저들이다. 예를 들면, 일부 실시예들에서, 상기 파장은 약 355 ㎚ 및 약 2940 ㎚ 사이, 바람직하게는 355 ㎚ 및 1064 ㎚ 사이, 가장 바람직하게는 355 ㎚ 및 532 ㎚ 사이일 수 있다. 일부 실시예들에서, 본 개시물의 방법들에 유용한 레이저들은 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 및 100 J/㎠ 사이의 임의의 숫자 미만, 초과 또는 동일한 숫자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 에너지 밀도를 갖는 방사선 용량을 전달할 수 있다. 일부 실시예들에서, 본 개시물의 방법들에 유용한 레이저들은 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰ 및 10¹¹ W/㎠ 사이의 임의의 숫자 미만, 초과 또는 동일한 숫자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 방사조도(irradiance)를 갖는 방사선 용량을 전달할 수 있다. 본 명세서에 사용된 방사조도라는 용어는 단위 면적당 전력을 의미하며, 종종 평방센티미터 당 와트의 단위로 표현된다. 일부 실시예들에서, LEAP^TM Cell Processing Workstation(신텔렉트(Cyntellect) 사, 샌디에고, 캘리포니아)은 세포들을 식별하고 조사하는데 사용될 수 있다. 또한, 본 명세서에 참고로 전체가 포함되어 있는 미국 특허 번호 6,514,722에 개시된 장치들, 시스템들 및 방법들이 활용될 수 있다.

레이저는 다른 세포들을 상당히 용해시키지 않고 희소 세포들의 특이적인 용해를 일으키는데 사용될 수 있다. 일부 실시예들에서, 다른 세포들을 상당히 용해시키지 않는다는 것은 세포들의 모집단에서 비-희소 세포들의 10% 미만이 상기 레이저에 의하여 용해된다는 것을 나타낸다. 일부 바람직한 실시예들에서, 다른 세포들을 상당히 용해시키지 않는다는 것은 세포들의 모집단에서 비-희소 세포들의 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3% 또는 2% 미만이 상기 레이저에 의하여 용해된다는 것을 나타낸다. 더 바람직한 실시예들에서, 다른 세포들을 상당히 용해시키지 않는다는 것은 세포들의 모집단에서 비-희소 세포들의 1% 미만이 상기 레이저에 의하여 용해된다는 것을 나타낸다. 또 다른 바람직한 실시예들에서, 다른 세포들을 상당히 용해시키지 않는다는 것은 희소 세포들보다 더 적은 비-희소 세포들이 상기 레이저에 의하여 용해된다는 것을 나타낸다.

일부 실시예들에서, 본 명세서에 기재된 방법들은 분당 생물학적 시료의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20 평방미터 사이의 임의의 숫자와 적어도 동일한 숫자로 영상화할 것이다. 일부 실시예들에서, 본 명세서에 기재된 방법들은 분당 생물학적 시료의 적어도 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 20, 4 또는 8 백만 세포들을 포함하는 세포들의 모집단들에 대하여 수행된다.

RNA 분해효소 억제제는 RNA 분해효소 A, RNA 분해효소 B, RNA 분해효소 C, RNA 분해효소 T1, RNA 분해효소 H, RNA 분해효소 P, RNA 분해효소 I 및 RNA 분해효소 III을 포함하는 공지된 RNA 분해효소들 중 임의의 것 또는 이 모두의 활성을 억제하는 단백질, 단백질 절편, 펩티드 또는 소분자이다. 공지된 RNA 분해효소 억제제들의 일부 예들은 ScriptGuard(에피센터 바이오테크놀로지스(Epicentre Biotechnologies, 매디스(Madison), 위스콘신), Superase-in(암비온(Ambion), 오스틴, 텍사스), 스톱 RNA 분해효소 억제제(Stop RNase Inhibitors)(5 프라임 사(5 PRIME Inc), 게이더스버그, 매릴랜드), ANTI-RNase(암비온), RNA 분해효소 억제제(복제)(암비온), RNaseOUT^TM(인비트로겐(Invitrogen), 칼스배드, 캘리포니아), Ribonuclease Inhib III(인비트로겐), RNasin

(프로메가(Promega), 매디슨, 위스콘신), 프로텍터 RNA 가수분해효소 억제제(로체 응용 과학(Roche Applied Science), 인디애나폴리스, 인디애나), 플라센탈(Placental) RNA 분해효소 억제제(USB, 클리블랜드, 오하이오) 및 ProtectRNA^TM(시그마(Sigma), 세인트 루이스, 미주리)를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 일부 실시예들에서, RNA 분해효소 억제제는 예를 들면, 분석 대상인 세포 또는 세포들을 함유하는 웰과 같은 세포의 위치에서, 상기 웰 내에서 RNA 분해효소 활성을 상당히 억제하는데 충분한 농도가 1 내지 100%, 바람직하게는 20 내지 100%, 가장 바람직하게는 50 내지 100%로 첨가될 수 있다.

일부 실시예들에서, 관심 대상인 세포 또는 세포들의 식별은 혼합물 내에서 분석대상이 아닌 다른 세포들과 결합하지 않고, 관심 대상인 세포(들)와 특이적으로 결합하는 작용제를 사용하여 수행될 수 있다. 상기 라벨링 작용제는 예를 들면, Fab, F(ab')2, Fd 및 Fv와 같은 다클론성 또는 단일클론성 항체 또는 그 절편을 포함하는 임의의 적당한 작용제일 수 있다. 상기 라벨링 작용제는 예를 들면, 렉틴일 수 있다. 상기 라벨링 작용제는 형광, 화학형광, 형광 수명, 형광 편광, 회절 등과 같이 빛의 성질로서 검출될 수 있는 신호와 같은 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 임의의 부분을 사용하여 라벨링될 수 있다. 또한, 상기 라벨링 작용제는 예를 들면, 양고추냉이 과산화효소, 알칼리성 인산분해효소, 베타-갈락토시다제(beta-galactosidase), 베타-락타마제(beta-lactamase) 등과 같은 효소 마커를 사용하여 라벨링될 수 있다. 일부 양태들에서, 형관단(fluorophore)들이 바람직하다. 적당한 형관단들은 예를 들면, 바람직하게는 Cy3 또는 Cy5, 플루오레신 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 피코알록시아닌(phycoallocyanin), 바람직하게는 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민(rhodamine), 6-카복시-X-로다민(ROX), 6-카복시로다민(R6G), 텍사스 레드, 알렉사플루오르 염료, BODIPY 형광단, 오레곤 그린, 쿠마린(coumarin) 및 쿠마린 유도체들, TAMRA 등과 같은 효소 마커를 사용하여 라벨링될 수 있다.

일부 실시예들에서, Fc 수용체-차단 시약도 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 차단 시약은 표적화되거나 라벨링된 세포들의 세포-매개 사멸을 방지할 수 있다. 스파이크된(spiked) 종양 세포들의 세포 매개 사멸은 종양 세포들 및 일차 인간 PBMC들을 상기 종양 세포들상의 표면 항원에 대항하는 일차 항원으로 염색한 이후에 관찰되었다. PBMC들, 적당하게는 단핵세포들 또는 대식세포들을 종양 세포들에 부착하는 것이 분명히 관찰됨에 따라 이 효과가 명백해졌다. 이 부착은 비록 사용된 항체가 마우스 단일클론성 항체일지라도 이에 의하여 매개될 것으로 예상되었다. 일부 양태들에서 Fc 수용체-차단 시약의 세포 함유물(inclusion)을 사용하여 바람직하지 않을 수 있는 이 효과를 방지한다. Fc 수용체-차단 시약들은 항체들의 Fc-영역들이 세포들상에 존재하는 Fc 수용체들과 상호작용하는 것을 차단한다. Fc 수용체-차단 시약은 예를 들면, 수용체 결합에 대하여 세포 라벨링을 위해 사용되는 항체와 경쟁하는 면역글로불린일 수 있다. 또한, Fc 수용체들과 결합하고 이를 차단하는 특이적인 항체들도 사용될 수 있다. 항체들의 Fc 영역이 Fc 수용체와 결합하는 것을 억제하는 합성 소분자들도 Fc 수용체 차단 시약들로서 사용될 수 있다. 적당한 차단 시약들은 예를 들면, 밀테니 바이오텍(오번, 캘리포니아)의 FcR 차단 시약을 포함한다.

발현 프로파일링용으로 사용되는 마이크로어레이들은 당해 기술자에게 공지된 다양한 포맷들로 출시된다. 이의 제한되지 않는 예들은 이의 방법, 재료 및 교지 모두에 대해 본 명세서에 참고로 전체가 각각 포함되어 있는 미국특허 제5,445,934호, 제7,378,236호 및 제6,326,489호에 주어져 있다. 대부분의 마이크로어레이들은 DNA의 공간적으로 배열된 구간들을 사용하여 혼성화에 함으로써 용액 내의 해당 cDNA 또는 cRNA("표적들"이라고 통칭함)의 양을 측정한다. 상기 마이크로어레이상의 한 점으로부터 발생된 신호는 표본 내에서 특정 서열, 통상적으로는 세포 유전자의 발현과 서로 연관된다. 통상적으로, 수백 내지 수천개의 다양한 cDNA들 또는 cRNA들의 발현은 마이크로어레이 상에서 시험된다. 또한, 마이크로어레이들은 게놈 DNA에서 유전자들의 카피 숫자 변이(Pinkel 등, 1998, 본 명세서에 참고로 전체가 포함되어 있다), 단일 뉴클레오티드 다형성의 존재(Pastinen 등, 2000, 본 명세서에 참고로 전체가 포함되어 있다) 및 게놈 DNA 메틸화 상태(Yan 등, 2001, 본 명세서에 참고로 전체가 포함되어 있다)를 평가하는데 사용될 수 있다. 신규한 마이크로어레이들은 베라코드(Veracode) 시스템(일루미나, 샌디에고, 캘리포니아)과 같은 비드-기반 어레이들을 포함한다. 나노스트링(시애틀, 워싱턴)은 DNA 표적들이 평편한 표면상에서 고정되고 분석되는 "역(reverse)" 무작위 순서의 마이크로어레이를 시판한다. 그러한 마이크로어레이는 본 명세서에 개시된 방법들, 시스템들 및 장치들로 통합될 수 있다.

일부 실시예들에서, 나노입자들은 예를 들면, 세포들의 용해를 보조하기 위하여 방법들, 물질들, 장치들 및 시스템들로 통합될 수 있다. 나노입자들은 세포들의 레이저-매개 용해를 용이하게 하기 위하여 사용될 수 있다. 나노입자는 1 내지 1000 ㎚, 바람직하게는 2 내지 500 ㎚, 가장 바람직하게는 3 내지 100 ㎚의 크기 범위에 있는 입자이다. 나노입자들은 금 및 은과 같은 귀금속류, 인듐 인화물 및 카드뮴 황화물과 같은 반도체 물질들을 포함하는 다양한 물질들로 제작될 수 있다. 나노입자들은 당업자에게 공지된 다양한 방법들을 통해 제작될 수 있다. 이의 예들은 금 용액의 제어된 침전을 통해 형성된 금 나노입자들(Turkevich 등, 1951, 본 명세서에 참고로 전체가 포함되어 있다)을 포함한다. 나노입자들은 코팅되어 현탁 입자를 안정화시키거나 상기 나노입자의 세포 독성을 감소시킬 수 있다. 예를 들면, 금 나노입자들은 우 혈청 알부민과 코팅되어 현탁액을 안정화시킬 수 있다. 나노입자들은 분자들에 부착되어 분자들이 세포들과 회합하는 것을 촉진할 수 있다. 나노입자들로 부착되는 적당한 분자들의 제한되지 않는 예들은 항체, 항체 절편, 단백질, 펩티드, 렉틴, 지질, 아미노산, 핵산, 잠금 핵산과 같은 변형된 핵산 및 합성 소분자를 포함한다. 상기 분자들을 나노입자들에 부착하는 일부 제한되지 않는 방법들은 당해 기술자에게 알려져 있다. 부착은 예를 들면, 정전기 또는 소수성 상호작용을 포함하는 공유성 또는 가역성일 수 있다. 일부 실시예들에서, 나노입자들은 표적화된 세포들에 레이저 조사를 수행하기 이전에 공정 내의 임의의 점에 있는 세포들에 첨가될 수 있다. 예를 들면, 나노입자들은 초기 세포 염색 단계 도중 또는 세포들이 웰들 안에 배분된 후에 첨가될 수 있다.

나노입자들의 적당한 표면 변형 여부에 대한 검사 방법이 고안되었다. 다양한 세포 유형들은 최종 농도 1 μM의 칼세인(Calcein) AM으로 로딩(loaded)되고 다중 웰 플레이트들 안에 살포되었다. 일련의 농도 범위와 다른 표면 변형을 갖는 나노입자들이 다른 웰들에 첨가되었다. 세포들은 LEAP 기구상에서 레이저 펄스로 조사되었으며, 세포 용해는 레이저 처리 이후에 칼세인 AM-양성 세포들의 환원으로 측정되었다. 레이저-매개 세포 용해를 증가시키기 위한 다양한 나노입자 코팅들의 효력는 나노입자 농도 대 용해 효율 용량 반응 곡선들로부터 EC₅₀ 수치를 도출하여 측정되었다.

인간 혈액속의 혈중종양세포( circulating tumor cell )의 분석

일 실시예에서, 환자의 인간 혈액을 수집하고, 당해 분야에 공지된 방법을 포함한 적합한 방법, 예를 들어 염화암모늄 함유 완충액을 이용하여 적혈구를 용해함으로써 적혈구를 제거한다. 이런 적혈구가 제거된 혈액 표본을 혈중종양세포로 특정하게 확인된 라벨링된(labeled) 항체와 혼합하여, 형광성과 같은 빛의 속성에 의해 검출가능하게 한다. 이러한 항체의 예는 피코에리트린으로 콘쥬게이트된 (phycoerythrin-conjugated) 안티-EpCAM 항체이다. 이러한 항체는 다양하게 상업적으로 구입 가능한 공급원으로부터 입수할 수 있다. 라벨링되지 않은 1차 항체와 2차 항체의 혼합체, 1차 항체에 대해 지시된 라벨링된 항체도 사용될 수 있다. 이러한 예로는 1차 생쥐 항-EpCAM 항체와 2차 염소 항-생쥐, 피코에리트린-라벨링 항체가 있다. 그런 다음, 이 세포를 세척 후에 멀티웰 플레이트, 예를 들어 384-웰 플레이트에 웰 당 10 내지 100,000의 밀도로 분할시킨다. 종양세포를 확인하기 위해 예를 들어, 플레이트를 영상화함으로써 종양 세포를 확인할 수 있다. 필요하다면, 하나 또는 그 이상의 종양세포를 함유하는 웰에 RNA 분해효소 억제제를 첨가시킨 다음, 예를 들어 표적으로 하는 세포를 용해시키기에 충분한 레이저 펄스를 이용하여 조사함으로써 이 세포들을 용해시킬 수 있다. 그 다음, 배지를 흡입에 의해 흡인한다. 예를 들어, 유전자의 선택 번호를 위한 RT-PCR, 마이크로어레이 유전자 발현 프로파일링, 차기 세대 시퀀싱 또는 기타 다른 적합한 방법 등을 포함한 적합한 방법에 의해서 수집된 RNA를 분석할 수 있다. 일부 실시예에서는, 이렇게 도출된 데이터를, 예를 들어 암 검사, 암진단, 암예후, 치료법 모니터링, 치료법 선택에, 또는 암 검사, 암진단, 암예후, 치료법 모니터링, 치료법 선택에 적합한 마커를 확인하기 위한 발견 단계에 이용할 수 있다.

렌티바이러스 형질감염된 세포( lentivirus transfected cell )의 분석

다른 일 실시예에서, 100 내지 100,000,000개의 서로 다른 DNA 구조물(DNA construct) 렌티바이러스 라이브러리, 예를 들어 shRNA, shRNAmir(Thermo Fisher Scientific, Huntsville, AL) 또는 DNA를 세포 개체군에 감염시킨다. 일정 시간 후에, 빛의 특성의 형태의 기능성 판독, 예를 들어 녹색형광단백질과 같은 형광성 리포터 단백질의 양 변화를 사용하여, 원하는 특성을 가진 감염된 DNA 구조물을 함유하는 세포 또는 세포들을 확인할 수 있다. 원하는 특성에는 예를 들어 단백질의 발현 또는 은닉, 탄수화물 또는 지질의 발현, 신호전달 경로의 활성화 또는 비활성화, 단백질의 세포 내 분포, 단백질, 탄수화물 또는 지질의 결합 특성 등이 포함될수 있다. 필요하다면, 분석하고자 하는 세포를 함유하는 웰에 RNA 분해효소 억제제를 첨가할 수 있다. 확인된 세포 또는 세포들은 예를 들어 표적으로 하는 세포를 용해시키기에 충분한 레이저 펄스를 이용하여 조사함으로써 용해시킬 수 있다. 그 다음, 예를 들어 배지를 흡인하여 수거한다. 용해된 세포속에 존재하는 DNA 구조물은 예를 들어, 유전자의 선택 번호를 위한 PCR, PCR 및 시퀀싱, RT-PCR, RT-PCR 및 시퀀싱, 마이크로어레이 분석, 차기 세대 시퀀싱 또는 기타 다른 적합한 방법에 의해 확인될 수 있다.

단백질 변이체(protein variant)를 발현하는 세포의 분석

다른 일 실시예에서, 원하는 특성을 가진 단백질 변이체를 발현하는 세포 또는 세포들을 확인하기 위해서, 예를 들어 영상화에 의해, 연구의 대상인 단백질 변이체의 DNA 라이브러리를 발현하는 세포 개체군을 분석한다. 원하는 특성에는 예를 들어 단백질의 발현 정도; 단백질의 세포내 및 세포외 분포; 단백질의 접힙; 단백질의 열 안정성, 시토카인, 케모카인, 인터루킨, 성장 인자, 신경전달물질 및 지질 등과 같은 체외 물질로 세포를 자극시킨 후에 단백질의 위치 변화 등이 포함된다. DNA를 분석하고자 하는 경우, 표적으로 하는 세포를 용해시키기에 충분한 레이저 펄스를 이용하여 조사함으로써 확인된 세포를 용해시킬 수 있다. 그 다음, 예를 들어 배지를 흡인한 후에, 예를 들어, PCR 또는 PCR 및 이후의 시퀀싱에 의해 용해된 세포속에 함유되어 있는 DNA 구조물을 확인할 수 있다. RNA를 분석하고자 하는 경우, 웰 속의 RNA 분해효소를 현저히 억제하기에 충분한 농도의 RNA 분해효소 억제제를 웰 속에 첨가시킨 후에, 예를 들어, 표적으로 하는 세포를 용해시키기에 충분한 레이저 펄스를 이용하여 조사함으로써 확인된 세포를 용해시킬 수 있다. 그 다음, 배지를 흡인한 후에, 예를 들어, RT-PCR 또는 RT-PCR 및 이후의 시퀀싱 등에 의해 용해된 세포속에 함유되어 있는 핵산 구조물을 확인할 수 있다.

조직 배양 세포의 분석

다른 일 실시예에서, 조직으로부터 분리된 1차 세포를 세포 배양 플레이트 내에서 배양시킨다. 이 세포를 함유하는 세포 배양 웰 속에, 리간드, 예를 들어 펩티드, 단백질, 단백질 단편, 소분자, 지질, 칸나비노이드, 아미노알킬인돌, 에이코사노이드(eicosanoid), 천연 추출물, 분별화된 조직 추출물 등을 첨가할 수 있다. 리간드의 첨가에 대한 반응을 나타내는 세포들은 예를 들어, FLUO4(Invitrogen)와 같은 Ca² ⁺ 반응성 염료에 의해 측정되는 세포내 Ca² ⁺의 증가 또는 감소 등과 같은 빛 속성의 변화; 세포 형상의 변화; 세포에 의해 발현되는 리포터 유전자로부터의 신호의 변화; 또는 프로피디움 아이오다이드와 같은 검출가능한 염료의 세포내로의 유입에 의해 확인될 수 있다. 웰 속의 RNA 분해효소 활성을 현저히 억제하기에 충분한 농도로 리간드를 첨가하는 것에 즉각 반응하는 세포를 함유하는 웰 속에 RNA 분해효소 억제제를 첨가할 수 있다. 그리고 나서, 예를 들어, 표적으로 하는 세포를 용해시키기에 충분한 레이저 펄스를 이용하여 조사함으로써 확인된 세포를 용해시킬 수 있다. 그 다음, 배지를 예를 들어, 흡입에 의해 수집한 후에, 예를 들어, RT-PCR, 정량적인 RT-PCR, 마이크로 어레이 분석, 차기 세대 시퀀싱, 나노스트링 기법, 퀀티젠(Quantigene) 분석(Panomics, Fremont, CA), 퀀티플렉스 분석(Quantiplex assay; Panomics) 또는 기타 다른 적합한 방법을 사용하여 배지 내로 방출된 RNA를 프로파일링할 수 있다. 반응성 세포와 비-반응성 세포로부터 도출된 발현 데이터를 비교함으로써, 예를 들어, 첨가된 리간드에 대한 반응성에 관여하는 mRNA 및 해당 단백질을 확인할 수 있다. 또한, 반응성 세포로부터 도출된 발현 데이터에 의해 반응성 세포 유형을 확인할 수 있다.

"분할( patitioning )"을 이용한 인간 혈액속의 혈중종양세포의 분석

일 실시예에서, 환자의 인간 혈액을 수집하고, 적혈구를 제거한 다음, 혈중종양세포로 특정하게 확인된 라벨링 항체와 혼합하여, 형광성과 같은 빛의 속성에 의해 검출가능하게 한다. 이러한 항체의 예는 피코에리트린으로 콘쥬게이트된 항-EpCAM 항체이다. 그런 다음, 이 세포를 세척 후에 384-웰 플레이트와 같은 다중 웰 플레이트내에 웰 당 10 내지 100,000의 밀도로 살포한다. 종양세포를 확인하기 위해서 플레이트를 영상화한다. 일부 실시에서, 분할을 이용할 수 있다. 분할이라는 것은 표본을 부표본(subsample)로 나누어서, 다중 웰 플레이트의 웰과 같은 저장소 또는 분리된 분할 차단 구역으로 부표본을 위치시키는 것을 의미한다. 일부 실시예에서, 이 방법은 어떠한 저장소가 희소 세포를 함유하는 지를 결정하기 위해 각 저장소의 사실상 전체 구역을 영상화한다. 본 명세서에서 사용되는 "각 저장소의 사실상 전체 구역"이라는 용어는 예를 들어, 저장소의 구역의 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 및 100%와 동일하거나 그 이상, 또는 그 수치 또는 그 사이의 범위를 포함하는 의미이다. 혈액 표본을 다수의 웰 내로 분배시키는 분할 효과로 인해, 희소 종양 세포의 농도는 이 세포가 존재하는 희소 웰 속에서 증가할 것이다. 웰 당 혈액 세포의 수가 5,000개이면, 단일 종양 세포의 농도는 이 세포가 존재하는 웰 내에서는 5,000개에 대해 1이 될 것이고, 존재하지 않는 웰 내에서는 제로가 될 것이다. 따라서, 종양 세포가 발견될 수 있는 특정 세포 웰 속의 종양 세포 빈도수의 뚜렷한 증가는 유전자 분석의 민감성을 증가시킬 수 있다. 하나 이상의 종양세포를 함유하는 웰(들)은 예를 들어, RLT 완충액(Qiagen)을 사용하여 세포용해시킬 수 있다. RNA 및/또는 DNA를 추출하여, 예를 들어, PCR, PCR 및 시퀀싱, RT-PCR, RT-PCR 및 시퀀싱, 정량적인 RT-PCR, 마이크로 어레이 분석, 차기 세대 시퀀싱, 나노스트링 기법, 퀀티젠 분석, 퀀티플렉스 분석 또는 기타 다른 적합한 방법에 의해 분석한다.

RNA 분해효소 억제제 및 RNA 운반체가 용해 세포로부터 RNA 의 회복에 미치는 영향

본 실시예는 시약 제제(reagent formulation)에 의한 HeLa 용해 세포로부터 RNA의 회수의 최적화를 설명한다. 단일 세포는 총 10 내지 100 pg의 RNA를 함유할 수 있다. 소량의 RNA 방출에의 관여를 증가시키는 세포 배양 플레이트 내의 단일 세포의 용해는 배지 내에 존재하거나 용해된 세포로부터 방출된 RNA 분해효소에 의한 분해에 의해 또는 표면상에 흡착으로 인해 상실될 수 있다.

RNA 분해효소 활성에 대한 테스트는 다음과 같이 실행되었다. 10% 태아 소 혈청(Invitrogen)을 함유하는 100 μl의 완전 배지(complete medium; MEM - Invitrogen)를 사용하여 37 ℃에서 세포 배양 인큐베이터 내에서 밤새도록 384-웰 C-lect^TM 플레이트(Cyntellect, San Diego, CA)를 배양하였다. 배양 후에, 이 웰을 수동 다중피페터(multipipettor)를 사용하여 행크스 발란스 염 용액(Hank's Balanced Salt Solutions; HBSS - Invitrogen)으로 3회 세척하였다. RNA 분해효소 얼러트(Alert) 시약(Ambion)을 제조자의 권고사항에 따라 혼합한 다음, 조직 배양 웰에 가하였다. 이 표본을 37 ℃에서 30분간 배양한 후에, 제니오스(Genios) 플레이트 리더(Tecan)를 이용하여 판독하였다. 그 결과는 도 1에 도시되어 있다. 테스트 조건은 최종 농도 1 단위/μl(ScriptGuard^TM - Epicentre Biotechnologies)에서 +/- HBSS 세척 및 +/- RNA 분해효소 억제제("RNAse Inh")의 첨가이었다. 그 결과는 a) 완전 배지는 50 × 10^-6 단위의 RNA 분해효소 A/웰인 RNA 분해효소 얼러트 키트를 사용한 양의 대조군과 같이, 다량의 RNA 분해효소 활성을 가진다; b) RNA 분해효소 억제제의 첨가로 인해 RNA 분해효소 활성의 양을 상당히 감소시켰다; c) 웰을 HBSS로 3회 세척함으로써 웰 속의 RNA 분해효소의 활성을 감소시켰으나, 완전히 제거하지는 못했다; 및 d) 웰을 HBSS로 세척하고 RNA 분해효소를 첨가함으로써 최저량의 RNA 분해효소의 활성을 얻을 수 있다는 점을 보여준다. 이 실험으로부터, RNA 분해효소 억제제의 첨가가 웰 속의 용해 세포로부터의 RNA의 회복을 촉진시킬 수 있다는 결론을 도출하였다.

웰 당 약 200개의 HeLa 세포를 384-웰 C-lect^TM 플레이트(Cyntellect) 내에 살포하였다. 살포 후 수일 후에, Calcein AM(Invitrogen)으로 착색시키고 나서, 웰을 HBSS로 세척하였다. LEAP 기기(Cyntellect)를 이용하여 17.2 μm의 레이저 스팟 직경 및 10.4 μJ의 에너지를 가진 532 nm 레이저 펄스를 사용하여 표적화함으로써 20개의 HeLa 세포를 용해시켰다. 배지(HBSS)의 절반을 수거하였고, 이로부터 RNeasy 마이크로 컬럼(Qiagen, Valencia, CA)을 사용하여 RNA를 추출하였다. 총 RNA의 지표로서, GAPH mRNA를 정량화함으로써 RNA 수득량을 측정하였다. GAPH mRNA 정량화는 ABI 7500 실시간 PCR 기기(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용한 절대 정량 Sybr Green RT-PCR 분석에 의해 이루어졌다. 역전사(reverse transcription)는 High Capacity cDNA 합성 키트(Applied Biosystems)를 사용하여 수행되었으며, Sybr Green PCR은 Maxima SYBR Green qPCR 믹스(Fermentas, Glen Burnie, MD)를 사용하여 수행되었다. 다음과 같은 배지 제제를 여러가지 조합으로 테스트하였다. 즉, +/- 1× RNAse 억제제(RNAse Inh, ScriptGuard, 1U/μl), +/- RNA 운반체(PI, 100ng/웰의 폴리이노신산, SIGMA), +/- 2× RNAse 억제제. 양성 대조군으로서, 100ng/웰의 폴리이노신산을 함유하는 RLT(RNeasy 키트, Qiagen)의 첨가에 의해 웰 속의 모든 세포를 용해시킨 다음, RNeasy 마이크로 컬럼을 사용하여 RNA를 정제한 후에, 상술한 바와 같이 RT-PCR에 의해 분석하였다. GAPH mRNA 수량은 양성 대조군에 대해 표준화되었으며, 예상량의 %로서 표시한다. 그 결과는 도 2에 나타나있다. 그 결과는 a) HBSS 내에서 20개의 세포를 용해시킴으로써 4.0%의 GAPH mRNA 수득량을 얻었다; b) 폴리이노신산을 단독으로 첨가시키면 RNA 수득량을 현저하게 개선시키지 못한다; c) RNA 분해효소 억제제를 첨가시킴으로써 RNA 수득량을 53.3%로 극적으로 개선시켰다 ; 및 d) RNA 분해효소 억제제의 양의 증가는 RNA 수득량을 극적으로 개선시키지 못했다는 점을 보여준다. 결론적으로, RNA 분해효소 억제제의 첨가가 용해 세포로부터의 RNA 수득량을 현저하게 개선시켰다.

혈중혈액세포 속의 희소 종양세포의 변이 분석

연관 모델 내에서 희소 세포의 유전자 함량의 분석 능력을 테스트하기 위해서, 인간의 결장 세포계의 세포인 SW480을 인간의 주변 혈액 단핵세포(PBMCs) 내로 주입하였다. SW480 세포는 Ki-ras 유전자(McCoy 등, "Characterization of human colon/lung carcinoma oncogen(인간의 결장/폐 암종 종양유전자의 특징)", Nature 1983 302(5903): 79-81)의 변이를 은닉하는 것으로 알려져 있다. 이 유전자는 결장, 폐 및 췌장 암종에 공통적으로 존재한다(Bos, 등, Nature (1987) 327: 293-297; Slebos 등, N. Engl . J. Med . (1990) 323: 561-565; Almoguera 등, Cell (1988) 53: 549-554, 이 문헌들 각각은 본 명세서에서 전체로서 참고문헌으로 소개됨). 변이를 검출하기 위해서, 변이를 함유하는 Ki-ras mRNA 단편을 RT-PCR에 의해 증폭시킨 다음, 이 PCR 제제를 시퀸싱(sequencing)하였다(Eton Biosceince, San Diego, CA). 변이는 Ki-ras 유전자의 코돈 12에서의 G → T 전환이다. SW480 세포를 확인하기 위해서, EpCAM(eBiosceince, San Diego, CA)에 대한 피코에리트린으로 콘쥬게이트된 항체를 사용하였다. EpCAM은 상피세포 접착분자(epithelial cellular adhesion molecule)를 의미한다. 이 분자는 상피세포에 의해 특이적으로 발현되며, 혈중암종세포를 확인 및 분리하는데 흔히 사용된다. SW480 세포를 신선한 PBMCs(AllCells, Hayward, CA)를 함유한 현탁액 중에 혼합한 다음, 1 μl 농도의 Calcein AM(Invitrogen)으로 착색시키고 1.25 ng/μl 농도의 EpCAM 항체로 처리하였다. 세포를 HBSS로 3회 세척한 후에, 1600 PBMCs에서 얻어지는 밀도로 평균 웰 당 SW480 세포의 절반 수준으로 384-웰 C-lect 플레이트(Cyntellect) 내로 분배하였다. 이 플레이트를 LEAP 기기(Cyntellect)를 사용하여 영상화하였다. 단일 SW480 세포를 함유하는 웰을 확인한 다음, 각각 최종 농도가 1 unit/μl가 되도록, 총 용량 20 μl 중 100 ng의 수준으로 RNA 분해효소 억제제(ScriptGuard - Epicentre Biotechnologies)와 폴리이노신산(Sigma)을 가하였다. 24 μm의 점 직경 및 6.9 μJ의 에너지를 가진 532 nm 레이저 펄스를 사용하여 조사함으로써, 단일 SW480 세포를 용해시켰다. 세포용해시킨 후, 웰의 배지의 절반을 흡인한 다음, RNeasy 키트의 RLT(Qiagen)와 혼합하였다. 제조자의 계획서에 따라서 RNeasy 마이크로 컬럼을 사용하여 RNA를 정제하였다. High Capacity cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems) 및 티타늄 PCR 키트(Clontech, Mountain View, CA)를 사용하여 RT-PCR에 의해, Ki-ras mRNA에서의 변이를 스패닝(spanning)하는 단편을 증폭시켰다. 1차 프라이머 쌍 내부에 PCR 프라이머를 갖춘 이중 PCR(nested PCR)을 사용하여 2차 증폭과정에서 PCR 증폭 절(amplicon)을 증폭시켰다. 이 단계는 SW480 세포 속에 다량의 Ki-ras가 비교적 적기 때문에 사용될 수 있다. PCR 퀵 키트(Qiagen)를 사용하여 이중 PCR 제제를 정제한 후에, 시퀸싱((Eton Biosceince)에 의해 분석하였다. 도 3은 약 1,600 PBMCs의 배경에서 단일 SW480 세포(화살표)를 보여준다. 이미지는 원래 두 가지 색으로, SW480 세포는 녹색이고 PBMCs는 적색이다. SW480 세포를 용해시킨 후에, RT-PCR 및 시퀸싱에 의해 분석하였다. 도 4는 1,600 PBMCs의 바탕에서 레이저-매개 용해에 의해 세포용해된 단일 SW480 세포를 분석함으로써, 유도된 서열 트레이스의 변이가 존재한다는 것을 보여준다. 염기 85는 변이 유전자형에서는 "A"이고, 정상 유전자형에서는 "C"이다. 서열 트레이스는 PCR 증폭 절의 안티센스 가닥으로부터 형성되며, 따라서 mRNA에서는 'A'가 'U'에 상응하고, Ki-ras mRNA에서는 'C'가 'G'에 상응한다. 384-웰 플레이트는 총 1,600 × 384 PBMCs = 614,400 PBMCs를 함유하므로, 1,600 PBMCs의 한 웰내에서 하나의 SW480 세포의 변이를 검출할 수 있는 능력은 614,400 PBMCs 당 하나의 SW480 세포를 분석할 수 있는 능력으로 해석된다.

골드 나노입자 라벨링을 이용한 레이저- 매개된 세포용해의 향상

레이저 조사에 의해 세포 용해를 유발하기 위해서, 레이저 펄스는 세포를 기계적으로 파괴시키는 응력파 또는 충격파를 발생해야 한다. 이러한 응력파 또는 충격파를 발생시키는데 필요한 레이저 에너지는 세포, 배지 또는 세포가 접촉하고 있는 기질에 의한 레이저광의 흡수에 따라 좌우된다. 나노입자-매개된 광분해는 환자로부터 종양을 제거하기 위한 치료법으로서 기술되어 있다(Letfullin 등, 2006; 이 문헌은 본 명세서에서 전체로서 참고문헌으로 소개됨). 나노입자는 표적으로 하는 종양세포와 표적으로 하지 않는 건강한 세포 사이의 광학적 대비(optical contrast)를 유발시킴으로써, 특히 표적화된 세포를 파괴시키기 위한 수단으로서 사용되었다(Oraevsky 등, 2008; 이 문헌은 본 명세서에서 전체로서 참고문헌으로 소개됨). 본 실시예에서는, 세포 용해를 유도하는데 필요한 레이저 파워를 감소시킴으로써, 표적화된 세포의 레이저-매개 용해를 촉진시키도록 나노입자로 콘쥬게이트된 항체를 사용하였다. 레이저 파워의 감소는 표적화 되지 않는 주변 세포의 용해를 의도치않게 유발시키는 위험을 줄여줌으로써, 표적화된 세포에 대한 분석 전문성을 개선시킬 수 있다.

나노입자 라벨링을 이용하여 레이저-매개된 세포용해가 향상되는지를 테스트하기 위해서, 현탁액 속의 SW480 세포를 1.25 ng/μl 농도의 EpCAM 항체(eBiosceince) 및 1 μM 농도의 Calcein AM(Invitrogen)으로 라벨링하였다. HBSS로 3회 세척한 후에, 한 세트의 세포는 1.25 ng/μl 농도의 2차 골드-라벨링 항체(염소-안티 생쥐, 30nm - Ted Pella, Redding, CA)로 착색시키고, 한 세트는 5 ng/μl 농도의 피코에리트린-라벨링 2차 항체(eBiosceince)로 착색시켰다. 이 착색된 세포를 HBSS로 3회 세척한 후에, HBSS 속의 384-웰 C-lect 플레이트(Cyntellect) 내에 살포하였다. LEAP에 의한 레이저 프로세싱 이전 및 이후에, Calcein AM-양성 세포의 수를 정량화함으로써, 세포 용해 효율을 측정하였다. 도 5는 서로 다른 착색 및 레이저 파워 조건하에서 레이저-매개된 세포용해 효율에 대한 그래프를 보여준다. 세포용해 효율은 사멸된 표적 세포의 %로서 표시된다. 나노입자 라벨링법을 이용함으로써, 세포용해 효율이 두 가지 레이저 파워 농도에서 모두 93%였다. 나노입자 라벨링을 사용하지 않은 경우(도 5의 피코에리트린 그룹), 세포용해 효율이 2.9 μJ에서 10%, 6.9μJ에서 66%였다. 따라서, 나노입자 라벨링은 레이저-매개된 세포용해 효율을 향상시키고, 효과적인 세포용해에 필요한 레이저 파워를 감소시킨다.

나노입자 라벨링이 충분히 강력하고 특이적이면, 특이적 표적 세포(들)에 집중적인 에너지를 가하는 것보다는, 적합한 양의 에너지를 전체 세포 개체군에 조사함으로써, 표적 세포(들)의 특이적 세포용해를 달성할 수 있다. 세포에 감광제(sensitizer), 경우에 따라 골드 나노입자를 가함으로써, 표적 세포(들)만이 치사량의 에너지를 흡수하는 반면, 주변의 비표적 세포들은 손상되지 않도록 하는 광역학 치료법(photodynamic therapy)의 많은 예가 있다. 예를 들어, 치료 효과를 향상시키기 위해 통상적인 광역학 치료법과 골드 나노쉘(nanoshell)을 이용한 광열 치료법의 병행 치료(An in vitro study, James Chen Yong Kah, 등, Lasers in Surgery and Medicine , Vol 40, Pages 584-589, 2008) 및 골드 나노입자를 이용한 플라즈몬 광열 치료법(plasmonic photothermal theraphy; PPTT)(Xiaohua Huang, 등, Lasers in Medical Sceince, vol 23, pgs 217-228, 2007; 이 문헌은 본 명세서에서 전체로서 참고문헌으로 소개됨)이 있다. 본 실시예에서, 상술한 기술을 실행하기 위해서, 영상화 단계, 표적 세포를 찾는 단계 또는 희소 표적 세포에 특이적으로 에너지 빔을 향하게 하는 단계없이, 보다 간단한 장치 및 방법을 사용할 수 있다.

나노입자로 촉진되고 레이저를 매개로 하는 세포용해를 이용하여 혈중종양세포 모델내의 단일 종양세포의 유전자 발현 분석

인간의 PBMCs에 주입된 단일 종양세포의 제한된 세트의 유전자 발현을 검출하기 위해서, 나노입자 라벨링 및 그 후의 레이저-매개로 하는 세포용해를 이용하였다. 인간의 PBMCs에 인간 유방암 세포인 MCF-7을 주입한 다음, EpCAM 항체(eBiosceince)와 피코에리트린-라벨링 EpCAM 항체(eBiosceince)의 혼합물을 둘 다 0.625 ng/μl의 농도로 착색하였다. 세포 현탁액 1 ml 당 100 μl의 FcR 차단 시약(Miltenyi, Auburn, CA)을 가하였다. 2% FBS를 함유하는 HBSS로 세포를 세척한 후에, 2차 골드-라벨링 항체(염소-항 생쥐, 30nm, Ted Pella)로 착색한 다음, 2% FBS를 함유하는 HBSS로 다시 한번 세척하였다. 마지막으로, 착색 공정 중에 용해된 세포로부터 방출되는 RNA를 억제하기 위해서, 100 μl/ml의 FcR 블로킹 시약 및 0.27 ng/μl RNA 분해효소 A(Fermentas)를 함유하는 HBSS 속에 세포를 재현탁시켰다. 이 세포 혼합물을 2000 cells/well의 농도로 384-웰 C-lect 플레이트 내에 살포하였다. LEAP를 사용하여 플레이트를 영상화하였다. MCF-7 세포가 검출된 웰 내에, 최종 농도가 3 units/μl가 되도록 ScriptGuard RNA 분해효소 억제제(Epicentre Biotechnologies) 및 100 ng/well의 폴리이노신산(Sigma)를 첨가하였다. LEAP 기기를 이용하여 2.9 μJ의 레이저 펄스 조사에 의해 단일 MCF-7 세포를 용해시켰다. 총 웰 체적의 절반을 흡인시킨 후, TargetAmp 1.0 반응에 가하고 제조자의 권고사항(Epicentre Biotechnologies)에 따라 처리함으로써 mRNA를 증폭시켰다. 증폭시킨 RNA를 High Capacity cDNA 합성 키트(Applied Biosystems)를 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. 그 다음, ABI 7500 실시간 PCR 기기(Applied Biosystems)를 이용한 Maxima SYBR Green qPCR 믹스(Fermentas)를 사용하여 5개의 선별된 유전자에 대해 정량적 PCR을 수행하였다. 분석하고자 하는 유전자는 암 연관성 및 MCF-7 세포에서의 발현을 기초로 해서 문헌에서 선택하였다. 그 유전자는 (유전자 기호)CCDC6, KRT19, MUC1, EpCAM 및 TFF-1이다. 용해된 단일 MCF-7 세포로부터 얻은 16개의 표본을 분석하였으며, MCF-7 세포가 웰 내에 존재하지만 용해되지 않은 6개의 음성 대조군을 분석하였다. 유전자가 36 미만의 교차 순환 값을 가지면, 발현된 것으로 추정된다. 세포가 양성으로 분류되기 위해서는 5개 중 적어도 3개의 유전자가 발현되어야 한다. 16개의 단일 종양세포 표본 중 15개가 양성으로 분류되었는데(도 6), 이는 94%의 성공적인 분류율에 해당한다. 6개의 음성 대조군 표본의 경우, 하나도 양성으로 분류되지 않았다.

본 명세서에서 복수 또는 단수 용어의 사용에 대해서, 당해 기술분야의 숙련자(이하, 당업자라 함)라면 문맥상 및/또는 실제 적용시 적절하다면 복수를 단수로, 및/또는 단수를 복수로 해석할 수 있다. 본 명세서에서 명확하게 하기 위해서 다양한 단수/복수 배열이 특별히 기재될 수 있다.

당업자라면 본 명세서 및 특히 첨부된 특허청구범위(예를 들어, 첨부된 특허청구범위의 본문)에서 사용되는 용어는 일반적으로 "개방적" 용어로서 사용된다(예를 들어, "포함하는"이라는 용어는 "포함하지만 그에 국한되는 것은 아닌" 의 의미로 해석되어야 하며, "가지는"이라는 용어는 "적어도 가지는"의 의미로 해석되어야 하고, "포함한다"라는 용어는 "포함하지만 그에 국한되는 것은 아니다" 라는 의미로 해석되어야 한다)는 점을 이해할 것이다. 또한, 당업자라면 청구항에서 특정한 숫자가 기재되는 경우, 그것은 청구항에서 명백하게 그 의미를 기재하기 위한 것이며, 이러한 기재가 없는 경우는 그에 대한 상세한 설명이 필요하지 않다는 것을 의미한다는 점을 이해할 것이다. 예를 들어, 이해를 돕기 위해, 첨부되는 특허청구범위는 청구항의 기재를 도입하기 위해 도입 어구인 "적어도 하나" 및 "하나 또는 그 이상"이라는 용어를 청구항 기재에 사용할 수 있다. 그러나, 이러한 구의 사용은 부정관사에 의한 청구항 기재의 도입이 이러한 기재만을 포함하는 실시예에 대해 도입 청구항의 기재를 포함하는 특정 청구항을 한정하는 것을 의미하는 것으로 해석되어서는 안된다. 심지어 동일한 청구항이 "하나 이상" 또는 "적어도 하나" 및 부정관사(예를 들면, 부정관사는 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 의미하는 것으로 이해되어야 한다)를 포함하는 경우에도 특정 항을 제한하는 것은 아니다. 청구항 기재를 도입하기 위해 정관사를 사용하는 경우에도 동일하게 유효하다. 또한, 도입 청구항 기술에 특정한 숫자가 명백하게 기재되는 경우라 할 지라도, 당업자라면 이러한 기재가 적어도 기재된 숫자 이상이라는 것을 의미하는 것으로 해석되어야 한다는 점을 인지할 것이다(예를 들어, "2개의 기재"의 노출된 의미는 다른 변경 사항이 없다면, 적어도 2개의 기재, 또는 하나 또는 그 이상의 기재를 말한다). 또한, "A, B, 및 C 등 중 적어도 하나"와 같은 통상적인 표현이 사용되는데, 당업자는 일반적으로 이러한 표현은 관례적 표현으로 이해하도록 의도된 것이라는 점을 이해할 것이다(예를 들어, "A, B 및 C 중 적어도 하나를 구비한 시스템"이라는 것은 A를 단독으로, B를 단독으로, C를 단독으로, A와 B를 함께, A와 C를 함께, B와 C를 함께, 및/또는 A와 B와 C를 함께 구비한 시스템을 포함하나 이에 국한되는 것은 아니다). "A, B, 또는 C 등 중 적어도 하나"와 같은 통상적인 표현이 사용되는 경우, 당업자라면 일반적으로 이러한 표현은 관례적 표현으로 이해하도록 의도된 것이라는 점을 이해할 것이다(예를 들어, "A, B 또는 C 중 적어도 하나를 구비한 시스템"이라는 것은 A를 단독으로, B를 단독으로, C를 단독으로, A와 B를 함께, A와 C를 함께, B와 C를 함께, 및/또는 A와 B와 C를 함께 구비한 시스템을 포함하나 이에 국한되는 것은 아니다). 또한, 당업자라면 발명의 상세한 설명, 특허청구범위, 또는 도면에서 역접 접속사 및/또는 둘 또는 그 이상의 대체 용어들을 나타내는 어구가 그 대체 용어들 중 하나, 대체 용어들 중 다른 한쪽 또는 양쪽을 포함할 가능성을 고려해야 한다는 점을 이해해야 할 것이다. 예를 들어, 어구 "A 또는 B"는 "A" 또는 "B" 또는 "A와 B"일 가능성을 포함하는 것으로 이해해야 할 것이다.

본 명세서에 다양한 양태 및 실시예에 대해 기술하였으며, 다른 양태 및 실시예에 관한 것은 당업자에게 명백할 것이다. 본 명세서에 개시된 다양한 양태 및 실시예는 설명을 하기 위한 것으로, 후술하는 특허청구범위에 의해 제시되는 진정한 범위 및 취지를 제한하기 위한 것은 아니다.

Claims

세포의 이종 모집단 중의 희소 세포로부터 핵산을 분리하는 방법에 있어서,
(a) 희소 세포를 함유하는 저장소 중의 희소 세포의 농도가 적어도 X-배 증가하도록(X는 저장소의 수를 상기 세포의 이종 모집단 중의 희소 세포의 수로 나누어진 것), 상기 세포들의 이종 모집단을 복수개의 저장소(bins)로 분할하는 단계;
(b) 어느 저장소가 희소 세포를 함유하는지를 결정하기 위해 저장소 각각의 실질적인 전체 면적을 영상화(imaging)하는 단계;
(c) 세포의 용해를 유발하고 희소 세포로부터 배지 속으로 핵산을 방출시키기 위해, 희소 세포를 함유하는 상기 저장소에 시약을 첨가하는 단계; 및
(d) 용해된 희소 세포를 함유하는 상기 저장소만으로부터 방출된 핵산을 함유하는 배지를 수집하여, 희소 세포로부터 핵산을 수집하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분리 방법.
세포의 이종 모집단 중의 희소 세포로부터 핵산을 분리하는 방법에 있어서,
(a) 희소 세포를 함유하는 저장소 중의 희소 세포의 농도가 적어도 X-배 증가하도록(X는 저장소의 수를 상기 세포의 이종 모집단 중의 희소 세포의 수로 나누어진 것), 상기 세포의 이종 모집단을 복수개의 저장소로 분할하는 단계;
(b) 어느 저장소가 희소 세포를 함유하는지를 결정하기 위해 저장소 각각의 실질적인 전체 면적을 영상화하는 단계;
(c) 희소 세포를 함유하는 저장소 내에서 희소 세포의 위치를 찾는 단계;
(d) 희소 세포를 함유하는 저장소 내에 희소 세포의 위치에 집중된 에너지 빔(energy beam)을 향하게 하여 다른 세포를 상당히 용해시키지 않고, 상기 희소 세포의 특이적인 용해를 유발하고, 상기 희소 세포로부터 핵산을 배지 속으로 방출하게 하는 단계; 및
(e) 상기 용해된 희소 세포를 함유하는 저장소로부터 방출된 핵산들을 함유하는 배지를 수집하여, 상기 희소 세포로부터 상기 핵산들을 수집하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분리 방법.
제 2 항에 있어서,
상기 찾는 단계는 상기 저장소의 영상을 참조하여 수행되는 것을 특징으로 하는 핵산 분리 방법.
제 2 항 및 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포의 이종 모집단을 상기 희소 세포들과 선택적으로 결합하는 물질과 접촉시키는 단계를 더 포함하되, 상기 물질은 빛의 속성으로서 검출할 수 있는 신호를 발생하는 것을 특징으로 하는 핵산 분리 방법.
제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 내지 (e) 단계 중 어느 한 곳에 RNA 분해효소 억제제를 첨가하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분리 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 X는 약 10, 30, 100, 300, 1,000, 3,000, 10,000, 30,000 및 100,000으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산 분리 방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 저장소는 다중 웰 플레이트의 웰인 것을 특징으로 하는 핵산 분리 방법.
제 2 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 수집하는 단계는 비-희소 세포 핵산에 비해 희소 세포 핵산이 Y-배 풍부해 질 때까지 상기 희소 세포로부터 상기 핵산을 수집하는 결과를 낳으며,
상기 Y는 상기 저장소 내의 용해되지 않은 비-희소 세포의 수인 것을 특징으로 하는 핵산 분리 방법.
제 2 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 Y는 약 10, 30, 100, 300, 1,000, 3,000, 10,000, 30,000 및 100,000으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산 분리 방법.
세포의 이종 모집단 중의 희소 세포로부터 핵산을 분리하는 방법에 있어서,
(a) 세포의 이종 모집단을 영상화에 적합한 표면으로 옮기는 단계;
(b) 상기 표면의 실질적인 전체 면적을 영상화하는 단계;
(c) 상기 표면의 영상을 참조하여 상기 표면상의 희소 세포의 위치를 찾는 단계;
(d) 희소 세포의 위치에 집중된 에너지 빔을 향하게 하여, 다른 세포를 상당히 용해시키지 않고 상기 희소 세포의 특이적인 용해를 유발하고, 상기 희소 세포로부터 배지 속으로 핵산을 방출하게 하는 단계; 및
(e) 용해된 상기 희소 세포로부터 방출된 핵산을 함유하는 배지를 수집하여, 상기 희소 세포로부터 상기 핵산을 수집하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분리 방법.
제 2 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포를 나노입자 라벨로 라벨링(labeling)하는 단계를 더 포함하며,
상기 나노입자 라벨링은 상기 에너지 빔-매개 세포용해의 효율을 향상시키는데 사용되는 것을 특징으로 하는 핵산 분리 방법.
세포의 내용물을 분석하는 방법에 있어서,
분석을 위하여, 관심 대상인 세포를 포함하는 세포의 모집단을 제공하는 단계;
상기 세포의 모집단 중의 적어도 하나의 관심 대상인 세포를 찾는 단계;
적어도 하나의 관심 대상인 세포의 위치에 상기 세포로부터의 내용물을 방출하기에 충분하며, 상기 적어도 하나의 관심 대상인 세포를 적어도 부분적으로 용해시키기에 충분한 에너지를 갖는 에너지 빔을 향하게 하는 단계; 및
상기 관심 대상인 세포로부터 방출된 상기 내용물을 분석하는 단계를 포함하는 세포 내용물 분석 방법.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포의 모집단을 상기 관심 대상인 세포에 특이적인 라벨과 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 13 항에 있어서,
상기 라벨은 다클론성 또는 단일클론성 항체, 항체의 단편, 렉틴, 리간드, 단백질, 펩티드, 지질, 아미노산, 핵산, 잠금 핵산(Locked Nucleic Acid: LNA)과 같은 변형된 핵산, 합성 소분자 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 13 항 및 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 라벨은 나노입자를 더 포함하며,
상기 나노입자는 상기 에너지 빔-매개 세포 용해의 효율을 향상시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 15 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 찾는 단계는 상기 세포의 모집단을 영상화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 18 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 찾는 단계는 상기 라벨의 존재에 기초하여 상기 적어도 하나의 관심 대상인 세포를 찾는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
RNA 분해효소 억제제를 제공하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포 모집단은 하나를 초과하는 저장소로 분할되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
Fc 수용체-차단 시약을 첨가하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 적어도 하나의 관심 대상인 세포는 상기 세포의 모집단 내에 약 10,000 분의 1 미만의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 적어도 하나의 관심 대상인 세포는 상기 세포의 모집단 내에서 약 100,000 개의 세포 중 1개 내지 약 10,000,000개의 세포 중 1개의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 핵산을 적어도 하나 수집하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.