KR20030094281A - 세포에 기초한 질병상태의 검출 및 질병상태의 구별 - Google Patents

Abstract

본 발명은 높은 감도와 우수한 특이성을 갖고 질병의 상태를 감지하고 분리하는 방법을 제공한다. 본 발명은 세포에 기초한 시료가 비정상적인 세포를 가지고있는지를 판별할 수 있고 또한 병리학적으로 질병의 존재를 확인할 수 있다. 상기 방법은 다른 시료에서 서로 분자 마커의 표현 패턴의 라벨이 바뀐다.

Description

세포에 기초한 질병상태의 검출 및 질병상태의 구별{Cell-based detection and differentiation of disease states}

상기 특정 질병의 조기 발견은 질병이 여전히 국부적으로 그 병원균의 영향이 있기는 하지만 환자로 하여금 조기에 진단과 치료를 받을 수 있게 하기에 환자에게 생존의 확률을 크게 높여줄 수 있다. 질병을 식별하는 주요한 두 가지 측정 방법은 질병의 민감도(Sensitivity=True Positives/(True Positives+False Negatives) 과 특이성(Specificity=True Negatives/False Positives+True Negatives)의 측정을 들 수가 있는데, 이것은 질병을 가지지 않는 사람을 검출해 내지 않고 한치의 오차도 없이 모든 감염된 개개인들을 얼마나 정확하게 식별해 낼 수 있는지를 측정하는 시험이다. 여태까지의 많은 진단 시험들은 낮은 정확도의 민감성과 특이성 때문에 좋은 평판을 얻지 못하였다.

민감도는 우리가 검출하고자 하는 질병을 얼마나 정확하게 측정할 수 있는가 하는 시험의 능력을 측정하는 것이다. 낮은 민감도를 가지는 시험은 높은 수치의False Negatives를 갖는다. 이것은 질병을 가진 사람이 병이 없는 것으로 잘못 확인된 것을 의미한다. False Negative가 가지는 잠재적인 위험은 질병을 가지고 있는 사람이 얼마간 진단과 치료를 받지 못하게 되는 경우가 발생할 수 있다는 것이다. 이에 질병이 더욱 더 진행하여 치료가 효과가 없게 될 수도 있다. 낮은 민감도를 가지는 시험예는 단백질을 바탕으로 한 HIV에 대한 혈액 검사가 있다. 이 검사는 혈류 내에 상당한 수의 바이러스가 침입해 있거나 그 질병이 완연하게 퍼진 상태가 아니면 바이러스의 존재를 검출해 낼 수가 없어서 낮은 민감도를 갖게 된다. 반대로, 높은 민감도를 가지는 시험예는 연쇄중합반응(PCR)을 이용한 바이러스 적재 검출시험이 있다. 이 검사는 아주 적은 양의 바이러스도 검출해 낼 수가 있어 높은 민감도를 가지게 된다(see Lewis, D.R. et al. "Molecular Diagnostics: The Genomic Bridge Between Old and New Medicine: A White Paper on the Diagnostic Technology and Services Industry" Thomas Weisel Partners, June 13, 2001).

한편, 특이성은 질병을 가지고 있지 않는 환자들을 정확하게 판별할 수 있는 시험의 능력을 측정하는 것이다. 낮은 특이성을 가지는 시험은 높은 수치의 False Positives를 갖는다. 이것은 질병이 없는 사람이 질병을 가진 것으로 잘못 확인된 것을 의미한다. False Positives의 단점은 질병이 없는 사람을 불필요한 의료절차와 치료를 받게 해 이에 따르는 위험과 감정적, 경제적인 스트레스를 주어 환자의 건강에 오히려 역효과를 주게된다. 높은 특이성을 가지는 진단시험을 전개하는 데 어려움을 주는 병은 바로 그 질병의 기작이 다수의 유전자와 단백질과 관계되어 있는 경우이다. 덧붙여, 어떤 단백질들은 질병과 관계없는 이유로도 그 수가 증가할수도 있다. 높은 특이성을 가지는 시험예로는 유전자를 바탕으로 한 p53 돌연변이를 검출할 수 있는 시험 방법이 있다. p53 돌연변이는 암세포들이 존재하지 않으면 검출되지 않는다(see Lewis, D.R. et al. "Molecular Diagnostics: The Genomic Bridge Between Old and New Medicine: A White Paper on the Diagnostic Technology and Services Industry" Thomas Weisel Partners, June 13, 2001).

세포 마커(Cellular markers)는 세포 안에서 발견되는 자연적으로 형성되는 분자 구조로서 건강하거나 병든 세포를 특징화하거나 분별하는 데 사용된다. 세포 마커는 인간이 개발해 낸 프로브(probe)라는 것에 의해 검출할 수가 있는데, 이것은 마커에 결합하므로 이 마커에 결합된 프로브를 영상시스템을 이용하여 시각적으로 또는 수량적으로 우리가 확인할 수가 있는 것이다. 세포를 바탕으로 한 마커 검출 기술에 대한 분야로서 세포병리학, 세포측정학, 세포유전학 그리고 프로테오믹스의 네 종류가 있다. 하기에 상세히 기술한다.

세로병리학은 염색된 전체 세포 개체군 안의 세포형태학적 변화에 대한 시각적인 자료들에 의존한다. 한 예로 세포기술학자들의 세포학적 스크리닝(screening)과 세포병리학자들의 Papanicolaou-stained cervical-vaginal specimens의 세포진단이 있다. 세포유전학과는 달리, 프로테오믹스와 세포측정학, 세포병리학은 양적으로 이용할 수 있는 도구는 아니다. 이러한 학문들이 임상 진단세포학에 있어서 최첨단의 기술이긴 하지만, 이것은 주관적인 견해이며, 특히 암의 초기단계에서 진단결과도 종종 민감도가 높지 않거나 혹은 변화할 수도 있다(ASCUS, LSIL).

형태학적인 분석에 의존하는 시험은 현미경으로 환자세포의 샘플을 관찰한다. 즉, 세포의 이상, 핵 크기나 모양, 염색될 때의 움직임 등을 관찰하는 것이다. 현미경 관찰시, 정상적으로 성숙된 상피세포들은 응축된 핵을 가지고, 크고 확실하게 분화된 모습을 보이는데 반해, 형성장애에 의한 세포들은 몇 개의 세포들이 아주 미성숙하고 많은 분화단계를 거치게 된다. 결과적으로, 암종이 침입한 세포들은 종종 덜 분화되어있고, 세포질이 적고 상대적으로 큰 핵을 가지게 된다.

형태학적인 분석에 의존하는 시험의 단점은 느린 방법이라는 것이다. 형태는 기능을 따라가기 때문에, 종종 형태적인 분석에 의해 질병이라는 것이 확연해 지기 전에 이미 질병이 진전하여 위독한 단계까지 가기 일수이다. 질병의 초기단계는 분자수준에서의 화학적 변화에 관계하는 단계이다. 그렇기 때문에, 단지 현미경으로 세포의 특징적인 변화를 관찰하여 질병을 확인하는 것은 질병이 더 진행되기 전까지는 불확실하다. 따라서, 분자수준에서 화학적인 변화를 감지하는, 소위, "분자적 진단 시험"은 형태적인 분석에만 의존하는 시험법에 비해 질병의 초기 검출을 더욱 더 용이하게 한다.

세포측정학은 용액에서 한 줄로 이동하는 형광 염색된 세포들을 유동-마이크로형광측정 기구를 이용하는 분석방법(flow cytometry)과 현미경의 슬라이드 글라스 위의 염색된 세포들을 컴퓨터와 연결된 현미경을 이용하는 분석방법(image cytometry)이 있다. 유동 세포측정법의 적용은 백혈병과 임파종의 이뮤노피노타이핑(immunophenotyping)을 포함한다. 영상 세포측정법의 적용은 DNA 배수성, MACs(Malignancy-Associated Changes), S-phage 분석을 포함한다. 유동 및 영상 세포측정법의 접근은 현탁액이나 슬라이드 글라스의 세포로 특징지워지는 정량적인데이터를 산출해 낸다. 유동 및 영상 세포측정법은 세포 균주의 민감도와 특이성 및 여기에서 사용된 유동/영상 측정법에 기인하여 양질의 마커 검출 결과 또는 분화 결과를 가져올 수 있다.

MACs는 1900년대 초기부터 중반이후로 정량적인 면의 관점에서 관찰되었고, 문헌상으로도 계속 보고되어져 왔다(OC Gruner: "Study of the changes met with leukocytes in certain cases of maligant disease" in Brit J Surg 3:506-522, 1916)(HE Neiburgs, FG Zak, DC Allen, H Reisman, T Clardy: "Systemic cellular changes in material from human and animal tissues" in Transactions, 7^thAnn Mtg Inter Soc Cytol Council, pp 137-144, 1959). 1900년대 중반부터 1975년까지, MACs는 각각 독립적으로 구강의 점막 및 도말 표본(Nieburgs, Finch, Klawe), 십이지장(Nieburgs), 간(Elias, Nieburgs), 메가케리오사이트(megakaryocytes), 목(Nieburgs, Howdon), 피부(Kwitiken), 피와 골수(Nieburgs), 단량체와 백혈구(van Hass, Matison, Clausen), 그리고 폐와 타액(Martuzzi and Oppen Toth)의 정성 조직학 및 세포학 연구의 문헌상에 개시되어있다. 1975년 이전의 이러한 정성분석 연구는 MAC를 바탕으로 한 특정 질병에 대한 민감도가 76%에서 97%, 특이성은 50%에서 90%로 보고 되어있다. 1975년에 Oppen Toth는 타액의 정성 분석 연구에서 76%의 민감도와 81%의 특이성을 발표한 바 있다.

MAC를 바탕으로 한 프로브 분석에 관계된 정량적인 관찰은 지금으로부터 이삼십 년 전에 시작되었다(H Klawe, J Rowinski: "Malignancy associatedchanges(MAC) in cells of buccal smears detected by means of objective image analysis" in Acta Cytol 18:30-33,1974)(GL Wied, PH Bartels, M Bibbo, JJ Sychra: "Cytomorphometric markers for uterine cancer in intermediate cells" in Analyt Quant Cytol 2: 257-263, 1980)(G Burger, U Jutting, K Rodenacker: "Changes in benign population in cases of cervical cancer and its precursors" in Analyt Quant Cytol 3: 261-271, 1981). MACs는 각각 독립적으로 구강의 점막 및 도말 표본(Klawe, Burger), 목(Wied, Burger, Bartels, Vooijs, Reinhardt, Boon, Katzke, Haroske, Zahniser), 가슴(King, Bibbo, Susnik), 방광과 전립선(Sherman, Montironi), 결장(Bibbo), 폐와 타액(Swank, MacAulay, Payne), 코의 점막(Reith)의 정량 조직학 및 세포학 연구의 문헌상에 개시되어있다. 이들은 MAC를 바탕으로 한 민감도가 70%에서 89%, 특이성이 52%에서 100%로 개시되어 있다. Marek과 Nakhosteen은 두가지 정량적인 폐질환 연구에서 (a) 89%의 민감도와 92%의 특이성, 그리고 (a) 91%의 민감도와 100%의 특이성을 나타내는 것을 발표하였다(1999, American Thoracic Society annual meeting).

MACs는 명백히 잠재적으로 유용한 프로브이며, 이는 영상 세포측정 마커 검출기술의 결과물이다. DNA가 염색된 핵을 기초로 하는 MAC의 특성들은 다른 분자적 진단 프로브들과 함께 사용되어 폐암이나 다른 질병들을 식별하거나 검출하는데 최적의 분자적 진단 패널(panel)을 만들어 낸다.

세포유전학은 예를 들어 ISH(in situ hybridization) 기술 등을 이용해 특정한 염색체의 세포내 변화를 감지해 낸다. ISH 기술은 FISH(fluorescence ISH), M-FISH(multi-color fluorescence ISH), 또는 흡광 CHRISH(chromogenics imaging ISH) 기술을 근간으로 한다. ISH 기술군은 복제된 박테리아 세포나 배양된 진핵세포 등에서 상보적인 염기서열의 유무를 확인하기 위해 DNA나 RNA 프로브를 사용한다. FISH 기술은 예를 들어, 암과 관련된 유전적 이상을 검출하는 쓰일 수 있다. 그 예로 Trisomy 8과 HER-2 neu에 대한 프로브를 포함한다. 연쇄중합반응(PCR)과 같은 다른 기술들은 B세포와 T세포의 유전자 배열을 식별하는 데 이용될 수 있다. 세포유전학은 병변 이상의 원인 및 분자적 시발점을 감지해 낼 수가 있기에 고도로 발전된 특정 마커 검출 기술이다. 이것은 현재 우리가 감지할 수 있는 이상이 많이 존재하지 않아서 다른 마커 검출 기술 보다 덜 민감할 수도 있다. ISH는 분자적 진단 방법으로서, 유전자를 기초로 한 분석을 이용하여 돌연변이, 염색체 이상 혹은 특정 병원균에 의해 삽입된 유전물질같은 유전자적 수준에서의 이상유무를 검출해 낸다. 예를 들어, ISH는 환자의 세포 샘플을 특정 mRNA와 결합되기 위해 제작된 표지된 프라이머로 처리하여 상기 특정 mRNA의 농도를 측정하는데, 이때 결합되지 않은 프라이머들은 씻겨 나가게 되어 표지된 부분의 신호를 읽을 수 있게 된다. 유전자 서열의 독특한 성질 때문에 유전자 서열의 식별에 관련된 시험은 아주 적은 false positives의 높은 특이성을 가질 확률이 높다. 하지만, 세포 샘플안의 유전물질의 양이 아주 적을 수도 있기 때문에, 극히 적은 양의 신호가 얻어질 수도 있다. 따라서 미리 서열을 증폭시키는 과정을 포함하지 않는 ISH 시험은 낮은 특이성을 가지게 되어, 다수의 false negatives를 내게 된다.

프로테오믹스(proteomics)는 정상 혹은 비정상 세포형의 개체군에서 특정 혹은 특이 단백질의 유무, 과다발현, 과부족발현 등으로부터 결정된 세포의 특성이나 차이점등에 의존한다. 프로테오믹스는 단백질의 식별 및 정량 뿐만 아니라, 이들의 귀착점(localization) 결정, 변화, 상호작용, 화학적 활성 및 세포 내외 기능들을 포함한다. 면역화학(세포에서의 면역세포화학과 조직에서의 면역조직화학)은 항체를 이용하여 정성 혹은 정량적으로(QIHC) 항원(예로 프로테옴)을 염색시키는 기술이다. 면역 병리 염색(immunostaining) 절차는 검출 지시자로서 염료를 이용한다. IHC(immunohistochemistry:면역조직화학)의 적용예로서는 ER(에스트로젠 수용체) 분석, PR(프로게스테론 수용체) 분석, p53 암 억제 유전자분석, EGRF 예후 마커를 이용한 분석을 포함한다. 프로테오믹스는 전형적으로 세포유전학보다 더욱 민감한 마커 검출 기술이다. 그 이유는 세포유전학을 이용해 검출해 내는 세포유전적 돌연변이 혹은 유전자 서열 변이들보다 프로테오믹스를 이용해 식별해 내는 단백질들이 크기에 있어서 순서가 있기 때문이다. 하지만, 프로테오믹스는 여러 가지 병변들이 단백질의 과다발현 혹은 과부족발현중의 한가지로의 비슷한 변화로 귀착되는 경우가 있기 때문에 세포유전학의 방법보다는 낮은 특이성을 가질 수도 있다. 면역화학은 조직이나 세포 안의 면역성 반응 물질들의 조직학적 혹은 세포학적 국지성(localization)에 관련되며, 프로브 시약으로서 표지된 항체를 이용한다. 면역화학은 질병 마커의 항원결정기에 특이성이 있는 표지된 항체(프로브)를 가지는 병원균을 가지고 세포를 처리하여 세포 샘플의 질병 마커(특정한 단백질)의 농도를 측정하는데, 이때 결합되지 않은 항체들은 씻겨 나가게 되어 표지된 부분의 신호를 읽을 수 있게 된다. 면역화학은 건강한 세포보다 더 다양한 농도의 질병 마커를 가지는 암세포의 성질에 기반한다. 암세포에서의 질병 마커의 농도는 일반적으로 높아서 큰 신호를 내기에 충분하다. 그러므로, 면역화학에 의존하는 시험들은 높은 민감도를 가질 수 있어, 적은 false negative를 내게 된다. 그러나 질병에 관련된 여러 다른 부가적인 요인들 때문에 질병 마커의 농도가 더 높아지거나 낮아질 수가 있으며, 따라서 특정 질병 마커에 대한 면역화학적 분석 시험 방법 또한 높은 수치의 false negatives를 가지는 낮은 특이성을 가질 수가 있다.

본 발명은 높은 민감도와 특이성을 가지는 noninvasive한 질병 검출 및 식별법을 제공한다. 이 방법은 감염된 세포를 함유할 것이라고 의심되는 세포 샘플을 특정 질병 마커와 정량적으로 결합된 다수의 병원균으로 구성된 프로브로 처리하여 감염세포를 식별하며, 이것을 프로브 병원균의 결합 형태를 보고 분석하는 기술에 관련된 것이다. 본 발명은 또한 특정 질병을 검출해 내고, 그 질병의 여러 타입들을 식별해내는 데 이용되는 프로브의 패널을 구성하고 비준하는 방법을 제공한다. 실례가 되는 폐암을 검출하고 폐암의 여러 타입을 식별해 내는 패널도 또한 제공한다.

인간의 병은 몸의 세포, 조직, 기관 혹은 그 시스템들의 구조나 기능에 이상을 야기하는 내적, 외적인 손상을 무력화시키는 인간의 환경에 대한 적응 기작에 문제가 생겨 발생하게 된다. 질병은 표 1에 나타난 것처럼 공통된 원인 기작에 따라 다음과 같이 분류될 수 있다.

질병은 세포이하, 세포, 조직, 기관 또는 인간의 해부학적 혹은 생리학적 시스템의 수준에 비정상적인 변화로부터 야기되며 또한 이로부터 비정상적인 결과를 초래하게 된다. 많은 질병들은(예로 폐암) 세포이하 혹은 세포수준에서의 비정상적인 변화에 의해 특징 지워진다. 표본들(예를 들어, cervical PAP 도말, voided urine, 혈액, 타액, colonic washings)은 질병을 가지고 있을거라 의심되는 환자로부터 수집하여 그 질병의 타입과 유무를 진단하게 된다. 분자적 수준의 병변은 세포수준의 질병과 관련된 분자적인 변화를 확인하고 진단과 관련해 탐구하는 시도에 있어서 기본 틀이 된다.

폐암을 질병의 실례로 도시하였다. 진단시험(예를 들어 분자적 진단 패널 분석법)을 이용하여 질병의 존재 유무를 확인하여 높은 위험성에 처한 개체군과 위험한 상태에 있는 개체군으로 나뉘어 선발하였다. 또한 상기 방법에 의해 검출된 폐암 혹은 다른 질병이 있는 환자에 대해서, 각 질병에 대한 타입이나 혹은 같이 일어날 수 있는 병을 식별할 수 있는 관련 진단 시험법을 도입할 수도 있다. 예를 들어, 여기에 도시된 폐암에 경우, 부가적으로 분자적 진단 패널 분석법을 이용하여 다음의 폐암의 여러 타입과 비교하여 일치하는지에 대해서 가능성을 짚어볼 수가 있다: (a) squamous cell carcinoma (b) adenocarcinoma (c) large cell carcinoma (d) small cell carcinoma (e) mesothelioma 여기서 우리는 세포 질병의 조기 발견과 그 타입들을 식별하는 것이 환자의 상태를 호전시키는 수단이라고 가정할 수 있다.

암은 그 결과가 치명적인 신생 질병이다. 암세포는 다른 양성 종양세포들과는 달리 침투와 전이시키는 성질을 지니며, 급속도로 퇴화한다. 암은 크게 암종과 육종으로 나뉘지만 일반적으로 암종으로 동일시하여 일컫는다. 세계보건기구(WHO)에 따르면, 한 해에 암에 걸리는 사람이 천 만명이며 이중 620만 명 이상이 목숨을 잃는 것으로 보고되었다.

암은 사실상, 신체 어느 부위에서든 발생할 수 있는 이종의 질병들의 집합이다. 이러한 결과로, 여러 치료 방법들이 모든 형태의 암에 있어서 똑같이 효과가 있지는 않거나 혹은 어느 한 특정한 암의 종류의 단계에서조차도 효과를 장담할 수는 없다. 어느 경우에 있어서는, 진보된 진단법(예를 들어, mammography, cervicalcytology, and serum PSA testing)들은 다수의 치료 옵션을 가지고 있기 때문에 초기단계인 암을 발견할 수가 있고, 치료법들 또한 보다 효과적이다. 종양이 작고 국소적인 경우 외과수술만으로도 충분한 치료를 할 수가 있지만, 종양이 넓게 퍼진 경우는 외과수술은 제한적인 효과만 있을 따름이다. 이러한 경우, 부가적으로 화학적 및/또는 방사선 치료를 같이 하게 되면 병의 전이는 막을 수 있다. 하지만 이것은 다소간 생명 연장을 할 수는 있지만, 병의 전이만을 막는 치료는 궁극적으로 병을 치료할 수는 없다. 비록 이러한 치료가 처음에 어떤 진전을 보인다 할지라도, 병이 진전되면 그 환자는 결국 항암 치료의 부작용 및 그 효과 때문에 결국은 죽게 된다.

증명된 것은 아니지만, 일반적으로 암을 초기에 발견하여 치료할 경우 암으로 인한 치료비용 및 사망률, 치사율이 낮아진다고 받아들여지고 있다. 많은 경우에 있어서 조기 발견은 암이 전이되기 전에 치료를 시작할 수가 있다. 게다가, 조기 발견했을 경우에는 치료 가능한 옵션들이 더 많아지기 때문에 장기간 생존 가능성과 완치의 가능성도 더욱더 높아진다.

위험한 상태에 있는 개체군을 선별해내는 데 이용될 수 있는 시험법을 개발해 내는 것이 의료업계 종사자의 오랜 목적이었다. 유방암의 mammography, 전립선 암의 PSA testing, 후두암의 PAP smear 분야에서는 어느 정도 조기 발견의 업적을 달성하였으나, 거의 대부분의 암의 경우에 환자에게 있어서 암의 징후가 나타나고 이미 치명적이 된 상태의 말기에 발견된다. 거의 대부분의 암의 경우에 있어서, 그 어떤 시험이나 시험들의 조합도 질병의 초기 단계에서 만족할 만한 병의 확인이나필요 민감도 및 특이성을 나타내지 못하였다.

암 선별 프로그램이 성공적이면서도 환자나 의사, 그리고 제삼자 지불인에게 모두 인정을 받기 위해서는 그 시험이 효과가 있어야 하고, 광범위하게 이용될 수 있어야 할 뿐만아니라, 일반적인 의료 절차 안에서 즉시 수행될 수 있어야 한다. 이 시험은 상대적으로 건강에 침해를 주지 않으면서도, 적절하게 탄력적인 면을 가져야 하며, 높은 민감도와 적당한 특이성과 다른 시험들에게도 전조가 될 수 있는 가치를 지녀야 한다. 덧붙여 그 시험은 상대적으로 저렴한 가격에 이용될 수 있어야 한다.

암에 걸렸을거라 의심되는 환자들에 있어서 의사들은 암의 단계에 따라 세포학적인 그리고 임상적인 치료를 순서대로 적절히 치료를 해 주어야 한다. 몇 종류의 검사들이 암 진단 검사에 이용되고 있기는 하지만, 충분한 민감도와 특이성을 가지고 못할 경우 오히려 번거롭고 너무 비싸기 때문에 개체군 선별 시험으로 이용하기에는 그 적절성이 입증되지 못하고 있다. 아래 표2와 표3을 통해서 폐암의 발견과 진단시험에 대한 예상 비용 및 예상되는 민감도 및 특이성에 대해서 나타내었다.

표2, 표3

흉부 방사선사진(X-ray) 촬영은 낮은 비용과 적절한 민감성 및 높은 특이성을 가지고 있어 암을 감지하고 암에 의한 손상부위를 국지화시키는 데 종종 이용된다. 하지만, 암에 의해 감염된 부위가 작을 경우에는 감지하기가 쉽지 않고, 큰 종양은 가슴 방사선 사진에 의해 쉽게 감지된다 하더라도 발견된 시기가 이미 종양이 많이 전이된 상태이다. 따라서 흉부 방사선 사진은 암의 조기발견을 위한 우리가 필요한 민감도에서 부족한 점이 있다.

컴퓨터 단층 촬영(CT)은 폐의 작은 혹을 감지하고 확인하는데 유용하며, 일반적인 흉부 방사선사진으로 감지할 수 없었던 잠재적인 이상들을 확인하는데 쓰인다[2]. CT나 척추 CT 촬영 방법은 특히, 이미 악성 담 세포 결과(malignant sputum cytology result)나 성대 마비 증세가 있는 환자들에게 선택할 수 있는 시험이다.CT는 종래의 흉부 방사선 사진보다 향상된 민감도를 가지고 있어, 기도의 사진을 촬영하는 주요한 수단으로 자리잡았다[3]. CT는 넓은 부위에 대해서 진찰할 수 있는 반면에, iodinated contrast material의 사용을 통해 향상된 해상도를 가질 수 있음에도 불구하고, 심장과 호흡기 계통의 움직임에 의한 영향을 많이 받는다.

척추 CT는 보다 고감도이며 민감한 형태의 CT로서, 종래의 CT나 X-ray에 비해 조기에 암 손상부위를 감지해 낼 수 있는 잠재성을 가지고 있어 보다 신빙성이 있다. 척추 CT는 병을 조기 진단하는 있어서 크게 향상된 민감도를 보인다. 하지만, 이 방법은 20% false positives의 상대적으로 낮은 특이성을 가진다[4]. 척추 CT는 또한 모든 폐암의 1/3을 차지하는 중요 손상 부위를 감지하는데 덜 민감한 편이다. 게다가, 이 방법은 초기 비용은 $300로 상대적으로 낮지만, 이후에 많은 비용이 들 수도 있다. 분자적 진단 패널 분석법을 이용한 세포학은 척추 CT와 관련하여 부속적으로 중요하게 이용될 수가 있다. 이유인 즉, 척추 CT로부터 의심되는 폐의 작은 혹에 대한 FNAs(fine needle aspirations) 혹은 FNBs(fine needle biopsies)의 평가를 통해서 false positives를 최소화하여 척추 CT 시험법의 특이성을 향상시킬 수가 있기 때문이다.

형광 기관지 검사법은 종래의 백광 기관지 검사법에 비해 기도안의 작은 손상 부위까지 감지하는 능력이 뛰어나 크게 향상된 민감도를 가진다[5]. 하지만 이 형광 기관지 검사법은 말초 부위를 감지할 수가 없어서 환자의 기도를 검사하는 데 상당한 시간이 걸리며, 비용도 비싸다. 게다가, 이 방법은 invasive 하기 때문에 개체군 선별 시험에 이용에 어려운 단점이 있다.

PET(positron Emission Tomography)는 방사능 포도당을 이용하여 폐안에 암세포의 존재유무를 확인하는 높은 민감도를 가지는 시험이다[6-8]. 이 시험 기자재의 설치에는 상당한 비용이 들며, 현장에 혹은 주위에 사이클로트론(cyclotron)이 필요하다. 이러한 비싼 비용과 기자재 설치의 제한점 때문에 PET 방법은 질병을 조기 발견한다기 보다 폐암 환자들의 병의 단계를 알아내는 데에만 사용이 제한되고 있다.

Sputum cytology는 얼마간 폐암을 확인하는 수단으로 사용해 왔었으나, 낮은 민감도와 병의 치사율을 감소시키는데 실패하여 제한적인 결과만을 가져왔을 뿐이었다. 종래의 sputum cytology에서 병리학자들은 세포의 형태를 관찰하여 특징적인 변화를 이용하여 악성세포를 확인하여 암의 진단법을 만들었다. 오늘날에는 암에 걸릴 위험에 처한 혹은 암에 걸렸다고 의심되는 환자들의 15%만이 sputum cytology 시험 검사를 받고, 이중 5%도 채 안되는 환자들이 이에 따른 다중 검사를 받는다. 종양의 크기, 위치, 분화 정도, 세포 덩어리, 외부환경으로 세포와 타액을 내보내는 세척 기작의 비효율성, 타액안의 세포의 불안정성 등을 포함하는 많은 요인들이 이 시험의 전체적인 효율성을 떨어뜨린다.

암의 진단은 전통적으로 한 개의 분자 마커를 감지하는 것으로 의존해 왔다. 하지만 불행히도, 암이라는 것은 하나의 마커로 암의 여러 병증을 감지하고 그 타입들을 식별하기에는 애초부터 어려운 질병이다. 따라서 단 하나의 마커를 인식하는 프로브는 비효율적인 것으로 보여진다. 이러한 이유로, "매직 블릿(magic bullet)" 이라 불리는 만능적이며 보편적인 프로브를 아직 찾아지지 않았음에도 불구하고 "매직 블릿(magic bullet)" 진단 시험법에 대한 연구는 계속되고 있다.

본 발명의 주요한 전제는 세포를 대상으로 하는 암 진단법, 선별법, 여러 가지 암의 타입을 검출하는 법 등의 일련의 과정들이 다중으로 표지된 프로브의 키트(kit)가 아닌 한 개의 마커/프로브를 이용한 최신의 분석법들보다 크게 발전, 향상될 것이라는 것이다. 이런 복합적인 분석 접근은 암이 단순한 질병이 아니기 때문에 특히 암 진단에 적절하다. 게다가, 다중 요인들을 "패널"로서 분석하기 때문에, 복합적인 암의 성질에 대해서 세포학적으로나 임상적으로 접근하기에 알맞다.

세포를 대상으로 하는 진단 시험의 패널을 이용한 접근법을 성공적으로 수행하기 위해서는 많은 질병의 타입을 식별하고 특징화할 수 있는 마커들의 패턴을 화학적으로 인식할 수 있는 최적의 프로브 패널을 디자인하고 개발하는 것이 중요하다. 본 특허는 이러한 새롭고 최적의 패널을 디자인하고 개발하는 효율적이고 독특한 방법론을 제시하고 있는 것이다.

표본 수집(예를 들어, point-of-care mixers for sputum cytology)과 준비(예를 들어, new cytology prservation and transportation fluids, and liquid-based cytology prparation instruments)에 대한 향상된 방법은 현재 개발중이며 상업적으로 이용가능 하게끔 준비되어 가고 있다. 종래의 그리고 지금 현재 개발중인 방법들과 관련하여, 이 세포를 대상으로 한 분자적 패널 분석 진단법의 성공적인 수행은 앞으로 (a) 악성 종양이나 다른 질병들에 대한 분자적인 윤곽의 특징화 (b) 암의 조기 발견과 다른 질병의 감지와 식별에 대한 향상된 방법 (c) 임상진단,예지, 환자의 주문에 따른 치료, 그리고 치료에 대한 모니터링 등으로 발전될 것이다.

본 발명은 환자에게 나타나는 일반적인 여러 질병의 조기 발견에 대한 것이다. 또한 본 발명은 특정한 질병에 대하여 그 초기 단계에서 식별할 수 있는 방법에 대한 것이다.

도 1은 폐암의 다른 세포 유형(histologic type)을 확인하기 위한 패널에 포함되는 바람직한 지표인 분자지표(molecular marker)를 보여준다. "%"로 라벨된 컬럼은 특정한 지표(particular marker)를 발현하는 종양 검체의 퍼센트를 가리킨다.

도 2는 다른 지표들이 폐암의 특이적인 유형들을 식별하는데 사용될 수 있다는 가능성을 보여준다. SQ는 편평세포암(扁平細胞癌, squamous cell carcinoma)이고, AD는 선암(腺癌, adenocarcinoma)이며, LC는 대세포암(大細胞癌, large cell carcinoma)이고, SC는 소세포암(small cell carcinoma)이며, ME는 중피종(mesothelioma)이다. 각각의 세포에서 나타나는 숫자는 하나의 세포 유형에 대한 또 다른 세포 유형에서 지표 변화의 빈도를 나타낸다. 표에 포함되는 비율은 2.0이상 또는 0.5 이하이어야만 한다. 일반적으로 100 이상의 숫자는 두 번째 지표가 발현되지 않았음을 의미한다. 이러한 경우 분석 목적에 따라 분모를 0.1로 맞춘다. 최종적으로 공세포(empty cell)는 발현에서의 차이 또는 발현 데이터의 부재 모두를 의미한다.

도 3은 대조조직과 악성조직 내에서 프로브 7과 프로브 15 간의 H-스코어(H-scores)를 비교한 것이다. X축은 H-스코어를 Y축은 증상(case)의 %를 보여준다.

도 4는 다양한 프로브의 쌍 사이에 1차 결합량을 측정한 상관행렬(correlation matrix)을 보여준다. 50% 또는 그 이상의 상관수(correlation number)를 가지는 이러한 행렬에서 모든 지표들은 서로 상호 관련된 지표로 간주한다.

도 5는 검출 패널 조성물, 쌍식별(pair-wise discrimination) 패널 조성물 및 접합(joint) 식별 패널 조성물을 보여준다. 의사결정 나무분석(Decision tree Analysis), 순차적 LR(stepwise LR) 및 순차적 LD를 사용하는 패널 조성물을 보여준다.

도 6은 프로브 7을 프로브로 포함하지 않는다. 의사결정 나무 분석, 순차적 LR 및 순차적 LD를 사용하는 패널 조성물을 보여준다.

도 7은 통상적으로 바람직한 프로브만을 사용한 검출 패널 조성물을 보여준다. 의사결정 나무분석, 순차적 LR 및 순차적 LD를 사용하는 패널 조성물을 보여준다.

발명의 요약

본 발명은 세포기저 진단(cell-based diagnosis)을 사용하여 일반 질병 형태를 검출하거나 또는 특이 질병 형태별로 식별하기 위한 패널(panel)에 관한 것이다. 이 패널은 일반 또는 특이 질병 형태와 결합된 지표에 특이적으로 각각 결합하는 다수의 프로브(probe)를 포함한다. 여기에서 세포 검체에서 패널을 구성하는 프로브가 세포에 결합하는 패턴은 상기 질병 형태의 존재 또는 특이성을 진단한다. 또한 본 발명은 세포기저 진단을 사용하여 환자의 질병 형태를 검출하거나 또는 특이 질병 형태별로 식별하기 위한 패널을 형성하는 방법에 관한 것이다. 이러한 패널 형성 방법은 질병 형태와 결합된 지표의 라이브러리 일부에 특이적으로 결합하는 각각의 프로브의 결합 민감도 및 특이성을 결정하는 방법 및 상기 질병 형태의 존재 또는 특이성을 진단하는 결합 패턴을 가지는 상기 프로브의 한정된 다수를 선택하는 방법을 포함한다. 또한 본 발명은 질병을 검출하거나 또는 질병 형태별로 식별하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 청구항 1에 의한 패널과 질병 형태의 비정상적인 세포 특성을 가지는 것으로 추정되는 세포 샘플이 접촉하는 방법 및 상기 질병 형태의 존재 또는 특이성을 진단하는 상기 프로브가 결합하는 패턴을 검출하는 방법을 포함한다.

1. 도입

본 발명은 비침습성(noninvasive) 질병 형태 검출 및 높은 민감성 및 특이성을 가지는 식별 방법을 제공한다. 본 발명에서는 각각의 질병 지표에 정량적으로 결합하는 다수의 작용제를 포함하는 패널과 질병 세포를 가지는 것으로 추정되는 세포 검체와 접촉하는 방법 및 작용제의 결합 패턴을 검출하는 방법을 제공하는 것을 포함하고 있다. 상기 패턴은 패널을 구성하는 프로브가 결합하는 부위 및 밀도/농도를 포함한다. 또한 본 발명은 질병을 검출하기 위한 패널 및 초기 단계에서 폐암을 검출하는 것은 물론 폐암을 다른 유형별로 식별하는, 질병 형태별로 식별하기 위한 패널을 제조하는 방법을 제공한다. 패널 검사는 혈청분석(blood serum analysis)과 같이 의학분야에서 사용되어 왔다. 그러나, 세포 분석은 각각의 세포와 조직 내에 특이 지표들의 형상화 및 부위를 포함하기 때문에, 종래에는 패널 접근이 세포 샘플에 효과가 있다고 판단되지 않았다. 부가적으로, 어떠한 통계적 분석이 최적화된 프로브의 세포기저 진단 패널을 제작 및 개발하는데 적용될 수 있다고도 판단하지 못했다.

세포기저 스크리닝 프로그램 중에 하나가 자궁경부암(Cervical Cancer)을 스크린하는 자궁경부 세포진검사(PAP Smear)이다. 이 방법은 50년 이상 실시되어 왔으며, 오늘날 규칙적인 PAP smear를 실시해온 대부분의 여성은 자궁경부암으로 인해 사망하지 않는다는 사실에 대단히 기여하고 있다. 그러나 이러한 PAP smear 스크리닝 프로그램에는 결점이 있었다. 예를 들면, PAP smear는 노동 집약적이고, 전반적으로 접근이 쉽지 않다. 본 발명에 의한 프로브 패널을 사용하는 분자 진단 세포기저 스크리닝법은 이러한 결점을 갖지 않는다. 이 방법은 전자동화 될 수 있고,그로 인해 비용이 절감되어 이러한 유형을 검사하기 위한 접근이 증대된다.

본 발명은 질병 형태 검출 및 질병 형태별로 식별하기 위해 높은 민감도 및 높은 특이성을 모두 가지는 방법을 제공한다. 본 발명은 암 및 전염병과 같은 세포기저 질병 형태에 적용된다.

상기 패널은 질병 형태의 존재 또는 특이성을 진단하는 것이다. 본 발명에서는 알려진 질병 형태 검출법의 한계 및 결점을 신속하고, 정확하게, 상대적으로 비침습성이며, 쉽게 검출할 수 있고, 저렴한 비용으로 세포 샘플에서 질병 세포를 식별할 수 있다.

본 발명의 패널을 제조하기 위한 방법의 특징은 패널이 개발될 수 있는 신속함이다.

질병 형태를 검출하기 위한 방법 및 질병 형태의 유형별 식별을 위한 방법에서 작용제의 패널을 사용하는 것은 여러 가지 이점이 있다. 하나의 이점은 작용제의 패널이 질병 형태의 검출 및 특징 부여를 가능하게 하는 충분한 여유를 가지고 있다는 것으로, 그로 인해 검사의 민감도 및 특이성을 증가시킨다. 많은 질병 형태의 이질성(heterogeneous nature)이 주어지는 단일 작용제는 광범위한 대다수의 증상과 일치할 수 없다.

패널을 사용하면서 부가되는 이점은 패널의 사용이 발현의 특이 패턴(프로브 부위 및 밀도/농도)을 기초로 하는 질병 형태의 다양한 유형별로 식별할 수 있도록 해주는 것이다. 질병의 다양한 유형이 그들의 진행율, 치료에 대한 반응률 및 치사율에서 극적인 차이를 보이기 때문에, 특이 유형의 인식이 의사들에게 최적의 치료적 접근을 선택하는데 도움을 줄 수 있다.

2. 패널(Panel)

본 발명의 패널은 질병의 지표에 정량적으로 결합하는 각각의 작용제를 다수 포함한다. 여기에서 패널을 구성하는 작용제가 결합하는 패턴(부위 및 밀도/농도)으로 질병 형태의 존재 또는 특이성을 진단한다. 따라서, 패널에는 검출 패널 또는 식별 패널이 있다. 검출 패널은 일반 질병 형태가 세포 샘플 내에 존재하는지 여부를 검출하는 반면에, 식별 패널은 다른 질병 유형을 포함하는 질병 형태에 의해 영향을 받는 것으로 알려진 세포 검체 내에서 다른 특이 질병 형태별로 식별한다. 상기 검출 패널과 식별 패널의 차이점은 패널이 포함하고 있는 특이 작용제에서 찾을 수 있다. 검출 패널은 질병 형태의 존재를 진단하기 위해 결합하는 패턴을 가지는 작용제들을 포함하는 반면에, 식별 패널은 질병 형태의 특이성(각 유형별)을 식별하기 위해 결합하는 패턴을 가지는 작용제들을 포함한다.

상기에서 정의한 패널은 하나 이상의 작용제를 함유한다. 일반 질병 형태를 검출하거나 또는 특이 질병 형태별로 식별하기 위하여 단지 하나의 지표를 단독으로 사용하는 것보다는 지표들의 패널을 사용하는 것이 유익한 데에는 여러 가지 이유가 있다. 한가지 이유는 모든 질병 세포 내에서는 존재하지만 건강한 세포에서는 존재하지 않고, 정확한 검사 결과를 수득하여 높은 특이성 및 민감도로 측정될 수 있는 작용을 하는 단일 지표를 위한 적절한 프로브가 존재하지 않는 것이다. 만약 이러한 단일 프로브가 높은 민감성 및 특이성으로 특정한 질병을 검출하기 위해 존재한다면, 이미 임상 실험에 사용되어지고 있을 것이다. 반대로 모두 임상적으로 충족시키는 검사를 보증하는 검출 가능 범위를 제공할 수 있는 다수의 프로브로 이루어진 각각의 패널 검사를 직접 선택하는 것이다.

그럼에도 불구하고, 하나 또는 매우 적은 프로브를 포함하는 패널 검사를 설계하는데 하나를 선택한다면, 생물체간 변이성으로 인한 검체 세포의 감소된 반응성; 다량의 프로브 시약들 간에 고유의 변이성; 약한, 진부하거나 또는 결핍된 반응 시약; 해당 프로브에 적절하지 못한 반응 시간 또는 조건과 같이 어떠한 이유에 대한 그것의 라벨링 기능을 수행하기 위해 어떤 단일 지표/프로브 결합의 실패는 표적 질병을 검출 또는 식별하기 위한 검사를 비극적 실패하게 되는 결말을 갖게 될 것이다. 각 패널 검사에서 다수의 함유물 및 과잉의 프로브조차도 어떤 단일 프로브의 실패가 검사의 비극적 실패를 유도하지 않도록 하는 가능성을 높인다.

프로브는 질병 지표에 결합하는 어떤 분자 구조 또는 하부구조(substructure)이다. 본 발명에서 사용한 "작용제"라는 용어 또한 질병 지표에 결합하는 분자 구조 또는 부분구조를 말한다. 분자 프로브들은 생물학자 및 임상 의학자들이 특이 질병 형태를 나타내는 지표를 검출 및 장착하기 위해 사용하는 자동 유도장치(homing devices)이다. 예를 들면, 소세포암(小細胞癌, small cell lung cancer)의 지표로 미리 확인된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체들을 제조할 수 있다. 이러한 항체 프로브는 적절한 면역화학적 프로토콜(protocol)을 사용하여 배양함으로써 질병을 가지는 것으로 추정되는 환자의 세포 및 조직 내에 표적 단백질 지표를 알아내는데 사용할 수 있다. 항체 프로브가 화학량론적 방법(정량적으로)에서 항체의 표적 지표와 결합하면 색소생산성(chromogenic) 또는 채색된 "태그(tag)"로 라벨된 다음, 광학 현미경 및 이미지 세포계측 기술(image cytometry technology)을 사용하여 프로브 및 항체의 표적 지표의 부위 및 정량을 간접적으로 수행하게 된다.

본 발명에서는 당업계에 알려진 통상적인 방법을 사용하여 DNA, RNA 또는 단백질 수준에서 분자 지표 발현으로 인한 검출 변화를 관찰한다. 대표적인 프로브로는 다클론 또는 단클론 항체 또는 그들의 단편 또는 패널에서 분자 지표를 암호화하는 핵산 서열과 상보적인 핵산 서열 등이 있다. 또한 프로브는 DNA 염색 등과 같이 염색된다. 본 발명에서 사용하는 많은 항체들은 지표 기질로 세포 표면 또는 세포내의 다양한 항원에 대해 특이적이다. 이러한 항체들은 당업계에 알려진 통상적인 기술을 사용하여 합성한다. 예를 들면, 지표에 항체를 초기 양성한 이후에 항체들을 서열화하고 이어서 재조합 기술에 의해 제조한다. 선택적으로 항체를 구입할 수 있다.

본 발명의 실시에서 프로브는 라벨을 포함한다. 본 발명에서는 라벨을 포함하는 프로브를 "라벨된 프로브"라고 한다. 라벨은 프로브가 지표에 결합할 때 신호를 방출하기 위해서 또는 라벨된 프로브가 인간 관찰자 또는 분석 기기를 통해 검출될 수 있도록 하기 위해 프로브에 부착할 수 있는 기질을 말한다. 또한 상기 라벨은 "태그"라고도 할 수 있다. 라벨은 판독기를 사용하여 시각화할 수 있다. 용어 "판독기(reader instrumentation)"는 프로브 검출에 사용되는 분석용 기구를 말한다. 본 발명에 의한 라벨은 검체 내에서 신호를 방출하고 구성성분을 확인할 수 있는 라벨을 말한다. 바람직한 라벨로는 방사성, 형광발색적, 색소생산성 또는 효소성분 등을 들 수 있다. 따라서, 검출 가능한 방법은 면역 염색법(Immunocytochemistry), 면역조직화학(Immunohistochemistry), 원위치 잡종화(in situhybridization), 형광성 원위치 잡종화(fluoresenctin situhybridization), 흘림세포계측법(flow cytometry) 및 이미지 세포계측법을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 라벨된 프로브에 의해 발생되는 신호는 의사가 검출할 수 있는 충분한 강도가 된다.

"지표(marker)", "질병 지표(disease marker)" 또는 "분자 지표(molecular marker)"는 질병 형태 또는 병원체와 상관관계에 있는 분자 구조 또는 하부구조이다. 용어 "항원"은 "지표"와 교체할 수 있도록 사용되는 것을 말한다. 지표는 특이 조건, 결과 또는 기질의 존재 또는 빈도 및/또는 양을 시현(示現), 검출 또는 측정하는 관찰자 또는 기기로 사용되는 생물학적 지표라고 대략적으로 정의한다. 예를 들면, 뉴클레오티드 염기들의 특이 서열 및 단일 서열은 개체 사이에서 및 집단을 통한 유전적 특성(genetic inheritance)의 패턴을 추정하는 유전자 지표로 사용된다. 유사하게, 분자 지표는 특정 질병 형태를 나타내는 세포 또는 조직 내에 존재하는 단백질 또는 단백질 단편과 같은 특이 분자를 말한다. 예를 들면, 증식하는 암세포는 같은 유형의 정상세포에서는 발견되지 않는 신규한 세포 표면 단백질에서 발현되거나 또는 증가된 또는 감소된 단백질 수량(각각 과잉발현 또는 과소발현)이 특정 질병 형태의 지표를 제공할 수 있는 특이 분비 단백질이 과잉발현된 것이다.

세포 패널을 위한 적절한 지표는 핵, 세포질 또는 세포막의 내부 또는 표면에 존재하는 기질을 들 수 있다. 또한 지표는 세포 내에 이들 위치에서 존재하는 세포조직 내에 존재할 수도 있다. 핵 안에 존재하는 지표의 예로는 망막모세포종(網膜母細胞腫, Retinoblastoma) 유전자 생성물(Rb), 사이클린 A, 뉴클레오사이드 디포스페이트 키나아제/nm23(nucleoside diphosphate kinase/nm23), 텔로머라제(Telomerase), Ki-67, 사이클린 D1, 증식세포 핵 항원(proliferating cell nuclear antigen; PCNA), p120(증식과 관련되 핵 항원) 및 갑상선 전사조절인자(TTF-1)를 들 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 세포질에 존재하는 지표의 예로는 VEGF, 표면활성제 아포단백질 A(surfactant apoprotein A; SP-A), 뉴클레오사이드 nm23, 멜라노마 항원-1(melanoma antigen-1; MAGE-1), 뮤신 1(Mucin 1), 표면활성 아포단백질 B(surfactant apoprotein B; SP-B), ER 관련 단백질 p29 및 멜라노마 항원-3(MAGE-3)을 들 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 세포막 내에 존재하는 지표의 예로는 VEGF, 트롬보모둘린(thrombomodulin), CD44v6, E-카데린(E-Cadherin), 뮤신 1, 인간 상피세포와 관련된 항원(HERA), 섬유아세포 성장인자(FGF), 헵토사이트 성장인자 수용체(heptocyte growth factor receptor; C-MET), BCL-2, N-카데린, 표피세포 성장인자 수용체(EGFR) 및 글루코오스 운반체-3(GLUT-3)를 들 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 세포질의 세포기관 내에 존재하는 지표의 예로는 미토콘드리아막에 위치하는(일부분) BCL-2가 있다. 핵의 세포기관 내에 존재하는 지표의 예로는 핵소체(nucleoli) 내에 위치하는 p120(증식과 관련된 핵 항원)이 있다.

바람직하게는 발현시 변화하는 지표는 질병 진행의 초기 단계에서 발생하고,대다수의 질병 세포로 인해 전시되며, 주어진 질병 유형의 75%를 초과하여 검출되고, 보다 바람직하게는 주어진 질병 유형의 90%를 초과하고 및/또는 질병 형태의 다른 유형의 특성별로 식별할 수 있다.

본 발명에 의한 패널이 프로브 패널 또는 지표 패널이 될 수 있다고 언급하는 것은 프로브가 지표에 결합하기 때문이다. 따라서, 상기 패널은 많은 지표들을 포함하고 있거나 또는 특이 지표에 결합하는 많은 프로브들을 포함하고 있다. 견고성을 위하여, 본 발명에 의한 패널은 프로브 패널로 언급한다; 그러나, 이것은 또한 지표 패널을 언급하는 것이기도 하다.

또한 지표는 세포 핵 내에서 악성종양과 관련된 변화(malignancy-associated changes; MACs)와 같은 특징 또는 암환자의 가족사와 관련된 특징을 포함한다. 악성종양과 관련된 변화 또는 MACs는 암세포 부근에 존재하고 정상적으로 출현하는 세포에서 발생하는 전형적인 눈에 띄지 않는 변화(sub-visual change)이다. 세포핵 내에서 이러한 매우 희박한 변화는 생물학적으로 핵기질 및 염색질(chromatin) 분배 패턴에서의 변화로 인해 생물학적으로 발생한 것이다. 이들은 개별 세포의 시각적 관찰을 통한 관찰에 의해서만 평가될 수는 없으며, 고도로 자동화되고, 컴퓨터처리된 고속 이미지 세포계측을 이용하여 세포집단(cell population)의 통계적 분석으로 결정된다. MACs의 검출 기술은 다음과 같은 자료들에 의해 당업계에 잘 알려져 있다: Gruner, O.C.Brit J. Surg. 3506-522(1916); Neiburgs, H.E.et al., Transaction, 7 ^th Annual Mtg. Inter. Soc. Cytol. Council137-144(1959); Klawe,H.Acta. Cytol. 1830-33(1974); Wied, G.L.,et al., Analty. Quant. Cytol. 2257-263(1980); 및 Burger, G.,et al., Analyt. Quant. Cytol. 3261-271(1981).

본 발명에서는 질병 형태와 서로 연관이 있는 지표들을 포함한다. 개별 지표 자체는 본 발명의 수단에 지나지 않는다. 따라서 본 발명은 특이 지표에만 한정되는 것이 아니다. 지표를 분류하는 하나의 방법은 다른 분자와 그들의 기능적 연관성에 의한 것이다. 본 명세서에서 사용한 것과 같이, "기능적으로 연관된" 지표는 논쟁이 되는 지표로서 같은 생물학적 과정 또는 경로의 구성성분이며, 논쟁이 되는 지표와 함께 비정상적으로 발현되는 것임이 당업계에 알려져 있다. 예를 들면, 섬유아세포 성장인자(FGF), VEGF(vascular endothelial growth factor), 사이클린 A 및 사이클린 D1과 같이 많은 지표들은 세포 증식 경로에 관여하고 있다. Glut-1 및 Glut-3과 같은 다른 지표들은 글루코오스 운반체이다.

당업계에서 통상적인 기술을 가진 사람은 기능적으로 연관된 지표를 결정하기 위한 설비를 잘 갖추고 있으며, 다양한 지표를 조사하거나 또는 지표의 기능적 작용을 결정하는 실험을 수행한다. 비제한적인 예로써, 지표는 혈관형성(angiogenesis), 막횡단 당단백질(transmembrane glycoprotein), 세포 표면 당단백질, 폐 표면활성 단백질(pulmonary surfactant protein), 핵 DNA에 결합하는 인단백질(phosphoprotein), 막횡단 Ca²⁺의존 세포 부착 분자, 사이클린 의존 키나아제들(CDK's)의 조절 단위(regulatory subunit), 뉴클레오사이드 디포스페이트 키나아제, 리보핵단백질(ribonucleoprotein) 효소, 증식하는 정상 세포 및 종양세포에서 발현되는 핵단백질, DNA 중합효소 델타의 보조인자, 자가의, 종양으로 유도된 및 특이 세포독성 T 세포(CTL's)에 의해 인지되는 악성종양에서 발현되지만 아직은 정상인 조직 내에 잠재된 유전자, 당화 분비 단백질(glycosylated secretory protein), 위장관(gastrointestinal tract) 또는 비뇨생식기관(genitourinary tract), 폐 표면활성제(pulmonary surfactant), 막횡단 당단백질, 증식, 분화 및 혈관형성과 관련된 분자, 원형 암유전자(proto-oncogene), 동종도메인(homeodomain) 전사 인자, 미토콘드리아 막 단백질, 급속히 증식하는 세포의 핵소체(nucleoli)에서 발견되는 분자, 글루코오스 운반체 또는 에스트로겐(estrogen)과 연관된 열충격 단백질(heat shock protein)을 포함하는 분자로 분류된다.

생체지표 및 프로브의 종류로는 (a) DNA 배수체, MACs 및 전암성 병변(premalignant lesions)을 포함하는 형태적 생체지표; (b) DNA 부가체, DNA 돌연변이체 및 자가사멸 지수(apoptotic indices)를 포함하는 유전적 생체지표; (c) 세포의 증식, 분화, 조절 분자 및 자가사멸 지표를 포함하는 세포주기 생체지표; (d) 암유전자, 종양 억제 유전자, 종양 항원, 성장인자 및 수용체, 효소, 단백질, 프로스타글란딘(prostaglandin) 수준 및 부착 분자를 포함하는 분자적 및 생화학적 지표 등을 들 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

"질병 형태(disease state)"는 어떤 세포-기저 질병을 말한다. 일부 예시에서 질병 형태는 암을 의미한다. 다른 예시에서 질병 형태는 전염성 질병을 의미한다. 상기 암으로는 폐, 비뇨기, 위장 및 비뇨생식기에서의 상피세포-기저 암;육종(sarcomas), 유방암, 췌장암, 간암, 신장암, 갑상선암 및 전립선암과 같이 고형 및/또는 분비 종양-기저 암; 백혈병 및 림프종과 같이 혈액-기저 암 등을 들 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 의해 검출되는 암의 예로는 폐암, 방광암, 위암, 자궁경부암, 유방암 또는 전립선암을 들 수 있다. 검출되는 전염성 질병의 예시로는 바이러스, 세균, 원생동물, 기생충 또는 곰팡이와 같은 전염성 유기체에 의한 세포-기저 sieases를 들 수 있다. 상기 전염성 질병의 구체적인 예로는 HIV, 간염, 독감, 수막염, 단핵증(mononucleosis) 및, 클라미디아(chlamydia), 편모충(trichomonas), 임질(gonorrhea), 음부 포진(herpes) 및 매독(梅毒, syphilis)과 같은 성 감염 질환(sexually transmitted diseases; STDs)을 들 수 있다.

본 발명의 명세서에서 사용한 용어 "일반적인 질병 형태"는 폐암, 성 감염 질환 및 면역-기저 질병과 같은 특이 질병의 여러 가지 유형을 포함하는 질병을 말한다. 또한 특이 질병 형태는 질병의 조직적 유형을 말한다. 예를 들면, 용어 "폐암"은 편평세포암(扁平細胞癌, squamous cell carcinoma), 선암(腺癌, adenocarcinoma), 대세포암(大細胞癌, large cell carcinoma), 소세포 폐암 및 중피종(mesothelioma) 등의 여러 가지 특이 질병을 포함한다. 용어 "성 감염 질환(sexually transmitted diseases; STDs)"은 임질, 인체유두종바이러스(Human Papilloma Virus; HPV), 음부 포진 및 매독(梅毒, syphilis) 등의 여러 가지 특이 질병을 포함한다. 용어 "면역-기저 질병"은 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus; Lupus), 류마티스 관절염 및 악성빈혈(pernicious anemia) 등의 여러 가지 특이 질병을 포함한다.

본 발명에서 사용하는 용어 "고위험군(high-risk population)"은 집 또는 작업장에서 발암물질과 같이 질병을 유발하는 작용제에 노출되어 있는 개체의 그룹을 말한다(즉, 폐암에 대한 고위험군은 흡연, 간접 흡연 및 직업상의 노출 등에 노출되어 있는 것이다). 또한 고위험군에 속하는 개체는 유전적 소인(genetic predisposition)을 가질 수도 있다.

가족사 또는 상당한 노출이 질병 형태로 발전하는 상당한 위험이 되기 때문에, 용어 "위험상태(at-risk)"는 점근적인 개체들을 말한다(즉, 폐암에 대한 위험상태의 개체는 30년 이상의 흡연력 역사를 가진다; 여기에서, "흡연력(pack-year)"은 이 노출에 대한 날짜, 시간, 년수당 피운 담배팩(pack)의 수를 곱하여 산출한 측정단위이다).

암은 변형된 유전자 발현과 같이 세포 분할을 조절하지 못해서 발생하는 질병이다. 본 발명에 의한 패널 및 진단방법에서, 암은 어떤 기관에서 악성으로 성장한다. 예를 들면, 폐암, 방광암, 위암, 자궁경부암, 유방암 또는 전립선암이 될 수 있다. 각각의 암은 질병의 수집 또는 암의 조직적 유형을 포함한다. 용어 "조직적 유형(histologic type)"은 다른 조직에서 발생하는 암을 말한다. 암에 따라서 결정되는 하나 또는 여러 가지의 조직적 유형이 존재할 수 있다. 예를 들면, 폐암은 편평세포암, 선암, 대세포암, 소세포 폐암 및 중피종 등을 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니다. 환자에게 영향을 주는 암의 조직적 유형의 식별은 의사가 질병의 부위 및 특성을 파악하고 최적의 치료법을 결정하는데 매우 유용하게 사용된다.

전염성 질병은 바이러스, 세균, 원핵생물, 기생충 및 곰팡이와 같은 전염성 유기체의 세포-기저 질병을 포함한다.

패널의 검출 및 식별을 위한 예시로는 폐암 및 일반적인 질병 형태를 검출하는 패널이 있고, 단일 폐암 유형, 특이 질병 형태, 폐암 이외의 모든 다른 유형 및 허위양성(虛僞陽性, false positive)을 식별하는 패널이 있다. 허위양성은 전이된 간암, 신장암 또는 췌장암과 같이 다른 유형의 전이암(metastatic cancer)을 포함한다.

3. 패널의 제조방법

환자의 일반 질병 형태를 검출하거나 또는 특이 질병 형태별로 식별하기 위한 패널의 제조방법은 유전적 또는 특이적 질병 형태와 관련이 있는 지표의 라이브러리에서 프로브가 결합하는 민감성 및 특이성을 결정하고, 프로브의 결합 패턴으로 질병 형태의 존재 또는 특이성을 진단할 수 있는 상기 프로브의 다수를 선택하는 과정을 포함한다. 일부 실시예에서는 선택적 예비 전지(preliminary pruning) 및 준비 단계가 수행된다. 본 발명에 의한 패널의 제조방법은 gold standard와 같이 알려진 조직적 병리 샘플에서 지표에 결합하는 프로브의 패턴을 분석하는 과정을 포함한다. 분류기는 gold standard 데이타로 설계된 다음 세포계측을 위한 선별기로, 특히 자동화된 세포계측기로 설계하여 사용할 수 있다. 따라서, 병리 분석에서 선택된 지표 프로브의 세트는 객담(喀痰, suptum), 미세침흡인(fine needle aspiration), 소변 등의 세포 샘플로부터 얻은 새로운 시험 데이터 세트로 제조되어 사용된다. 특정한 손상으로 인한 세포는 gold standard와 유사한 방법으로 염색한다. gold standard 병리 샘플를 기본으로 한 진단의 보전이 높기 때문에, 본 발명에 기재한 방법에서는 가장 기능적인 세트를 선택하여 오류를 없앤다. 대체로 패널을 제조하는데 세포 샘플을 이용하는 것이 가능하긴 하지만, 세포 샘플이 조직파편(debris)을 함유하므로 바람직하지 못하고, 세포 샘플 내에서 세포가 악화되고, 병리 진단이 임상적으로 확인하기 어려워진다.

지표의 라이브러리는 지표의 그룹이다. 라이브러리는 많은 지표를 포함한다. 그러나, 라이브러리 내의 일부 예시적인 지표의 수에서, 검체 크기와 같이 기술적 및/또는 산업적 이용이 제한된다. 예를 들면, 일부 실시에서 각 검체는 패널 내에서 모든 지표에 대하여 검사하게 된다. 따라서, 지표의 수는 검체가 분리된 샘플의 수보다 많지 않아야 한다. 또 다른 기술적 이용은 시간이다. 일반적으로 라이브러리는 60 이하의 지표들을 함유한다. 바람직하게는 라이브러리가 50 이하의 지표를 함유하는 것이 좋다. 보다 바람직하게는 라이브러리가 40 이하를 지표를 함유하는 것이 좋다. 가장 바람직하게는 라이브러리가 10-30 지표를 함유하는 것이 좋다. 패널의 실행을 최적화하기 위하여 잠재적 패널 일원들의 라이브러리가 10 이상의 지표를 함유하는 것이 바람직하다. 본원 명세서 내에서 사용한 용어 "대략(about)"은 3 지표를 가감한 것(± 3 지표)을 의미한다.

일부 실시에서 라이브러리는 대략 다양한 지표들의 정보 및 지표들과 일반적/특이적 질병 형태 사이의 상호관계를 포함하는 컨설팅 소스(consulting source)로 획득한다. 상기 컨설팅 소스의 예로는 실험 결과, 이론상 또는 예상되는분석 및 저널, 서적, 카탈로그 및 웹사이트와 같은 저작물 소스를 포함한다. 이러한 다양한 소스는 조직학 또는 세포학이 이용되고, 원위치 잡종화와 같은 세포유전학; 면역조직화학과 같은 단백체학(proteomics); MACs 또는 DNA 배수체와 같은 세포계측법; 및/또는 형태학과 같은 세포병리학(cytopathology)에 의존한다. 지표는 세포 내부 또는 표면에 어디에든 위치하고 있다. 예를 들면, 지표는 핵, 세포질 또는 세포막의 내부 또는 표면에 위치한다. 또한 지표는 앞서 말한 어떠한 부위 안의 세포기관 내에 위치하기도 한다.

일부 실시에서 라이브러리는 부적절한 크기가 된다. 따라서, 기본적인 패널의 제조방법을 개시하기 전에 하나 또는 그 이상의 전지 단계(pruning step)가 요구된다. 상기 전지 단계는 하나 또는 여러 개의 연속적인 전지 단계를 포함한다. 예를 들면, 하나의 전지 단계는 민감성 및/또는 특이성에 대한 임의의 문턱값을 세팅하는 것을 포함한다. 따라서, 실험적 또는 예상되는 민감성 및/또는 특이성이 문턱값 이하로 떨어지는 지표는 라이브러리에서 삭제된다. 단독으로 또는 차례로 다른 전지 단계들을 수행하는 다른 예시적 전지 단계는 검출 기술 요건, 접근 제약조건 및 보고된 결과의 비재현성(irreproducibility)에 의존한다. 검출 기술 요건에 관해서는 독특한 지표를 검출하기 위해 필요한 장치를 이용할 수가 없다. 접근 제약조건에 관해서는 허가 제한(licensing restriction)이 독특한 지표에 결합하는 프로브를 얻는데 어려움을 주거나 또는 불가능하게 할 수 있다. 일부 실시에서는 각 지표에 대한 실사 연구를 수행한다.

일부 실시에서는 기본적인 패널의 제조방법을 개시하기 전에 준비 단계를 수행할 필요가 있다. 상기 준비 단계의 예로는 라이브러리 내에 목표로 하는 지표를 정량적으로 검출하기 위한 프로토콜을 최적화하고, 조직 검체를 수집하는 과정을 포함한다. 목표로 하는 지표를 정량적으로 검출하기 위한 프로토콜의 최적화는 당업계에 알려진 통상적인 기술 내에서 수행한다. 예를 들면, 완충액, 시약, 소프트웨어 및 설비와 같이 필요한 시약 및 준비물을 획득해야 한다. 시약의 농도는 조절될 필요가 있다. 예를 들면, 비특이적 결합이 관찰될 경우, 당업자가 프로브 용액의 농도를 희석할 수 있다.

일부 실시에서 조직 검체는 gold standard이다. 용어 "gold standard"는 당업계자라면 알 수 있는 검체의 조직적 및 임상적 진단 방법을 말한다. gold standard는 종종 "시험(training)" 데이터라고 칭한다. gold standard는 식별 과정에 기여하는 모든 특성의 측정 세트 또는 신뢰할 수 있는 평가를 포함한다. 이러한 특성들은 검체로부터 수집되고, 질병 형태를 가진 것으로 알려진 환자들의 표본수로부터 수집된다. 표준 샘플은 세포 샘플이 될 수 있으나, 패널 선택을 위해 요구되지는 않는다.

조직 샘플은 생체검사와 같이 당업계에 잘 알려진 기술로 획득한다. 일부 실시에서 환자당 검체 크기는 필요한 만큼의 조직 부분이 라이브러리에서 각 지표 검사에서 획득할 수 있도록 충분히 커야한다.

일부 실시에서 검체는 각 특이 질병 형태로 진단된 다수의 환자로부터 획득한다. 환자당 하나의 검체를 획득하거나, 또는 환자당 다수의 검체를 획득할 수 있다. 개별 환자들로부터 다수의 검체들을 획득하는 실시에서, 외과의 전문 기술은단일 환자로부터 획득한 각 검체를 그 환자로부터 얻은 다른 검체와 유사하게 확립하는데 의존한다. 또한 검체는 환자들의 조절 그룹으로부터 획득한다. 환자들의 조절 그룹은 건강한 환자 또는 검사된 일반적 또는 특이적 질병 형태를 겪지 않은 환자들로 이루어진 그룹이다.

본 발명의 기본적 방법의 첫 번째 단계는 요구되는 질병 형태와 결합된 지표의 라이브러리에 프로브가 결합하는 민감성 및 특이성을 결정하는 것이다. 이 단계에서, 라이브러리 내의 각 지표에 대하여 특이성을 갖는 프로브를 환자의 검체 샘플에 적용하게 된다. 따라서, 일부 실시에서, 예를 들어 라이브러리 내에 30 지표가 있다면, 각 환자의 검체는 30 샘플로 나뉘게 될 것이고, 각 샘플에는 상기 30 지표 중 하나와 특이성을 가지는 프로브가 처리될 것이다. 상기 프로브는 시각화되는 라벨을 함유한다. 따라서, 프로브가 지표에 결합하는 패턴 및 수준이 검출될 수 있다. 상기 결합하는 패턴 및 수준은 분석 기기를 이용하여 정량적으로 또는 병리학자 등과 같은 인간에 의해 정성적으로 검출될 수 있다.

일부 실시에서 목표로 하는 및/또는 정량적인 점수 측정법(scoring method)은 지표에 결합하는 프로브의 패턴 및 수준을 검출하기 위해 전개한다. 이 점수 측정법은 발견적으로 설계된다. 점수 측정법은 병리학자들에 의해 주관적 판단을 객관화하는데 이용된다. 당업계에 잘 알려진 통상적인 기술 안에서 적당한 점수 측정법을 결정한다. 일부 실시에서 점수 측정법은 지표 프로브 염색의 밀도를 없음, 약함, 보통, 강함으로 분류하는 특징을 포함한다. 다른 실시에서 이들 특징들은 현미경 슬라이드 이미지를 연산 운영(algorithms operating)하여 측정된다. 점수 측정법의 예로는 비율 및 밀도를 다음과 같은 강도 등급매기기로 획득한 단일 "H 점수(H Score)"로 통합한다: 없음 = 0, 약함 = 1, 보통 = 2, 강함 = 3, 및 세포 백분율은 0-5% = 0, 6-25% = 2, 26-50% =2, 51-75% = 3, >75% = 4 로 표시한 다음 두 등급을 곱한다. 예를 들면, 50% 약하게 염색된 것에 50% 보통으로 염색된 것을 더하면 점수는 (1×2)+(2×2) = 6 이 된다. 이 "H 점수"는 근래에 본 발명의 발명자 중의 한 명인 Kenneth Hirsch가 수행했다.

당업자는 병리학자 및 샘플과 연관된 잠재적 선입견을 최소화하기 위해 관련된 어드레싱(addressing) 간행물을 이용할 수 있다. 예를 들면, 무작위화는 시스템적 오류를 가지는 기회를 최소화하는데 사용된다. 블라인딩(blinding)은 실험을 수행하는 사람에 의해 실험적 선입견을 제거하는데 사용된다. 예를 들면, 일부 실시에서 병리학자 대 병리학자의 변화는 이중 맹검법(double-blind study)을 수행하여 최소화된다. 본 명세서에서 사용한 용어 "이중 맹검법(double-blind study)"은 데이터 수집 및 분석을 독립적으로 수행하여 선입견을 피하기 위한 방법을 잘 수립한다. 다른 실시에서 샘플 대 샘플의 변화는 샘플을 무작위화하여 최소화한다. 예를 들면, 샘플은 그들의 병리 분석 전에 무작위화 된다. 또한 상기 무작위화 과정은 실험적 프로토콜에 포함된다. 일부 실시에서 각 샘플은 적어도 두명 이상의 병리학자에 의해 분석된다. 각 환자에 대하여, 지표에 결합하는 프로브에서 블라인딩의 신뢰할 수 있는 평가를 얻는다. 하나의 실시에서 신뢰도를 체크하기 위해 환자당 두 명의 병리학자가 진단하는 방법으로 적격의 병리학자에 의해 진단하게 된다.

충분한 샘플의 수는 신뢰할 수 있는 설계 및 신뢰할 수 있는 통계적 시험 평가를 제공하기 위해 수집된다. 당업자라면 신뢰할 수 있는 설계 및 신뢰할 수 있는 통계적 시험 평가를 제공하기에 충분한 많은 샘플들을 결정할 수 있다. 시험 평가의 신뢰도 및 샘플 크기를 결정하는 방법을 가지는 대분분의 표준 분류기 설계 패키지는 신뢰할 수 있는 평가에 도달할 때까지 점진적으로 증가되어야 한다. 예를 들면, 신뢰할 수 있는 설계를 제공하는 충분한 평가는 수집된 200개의 샘플 및 각 샘플로부터 평가된 다른 특성으로 달성한다.

두 번째 단계는 제한된 다수의 프로브를 선택하는 것이다. 이 선택하는 단계에서는 통계적 분석 및/또는 패턴 인식 기술을 사용한다. 선택하는 단계를 수행하기 위하여, 데이터를 데이터베이스에 통합한다. 일부 실시에서 프로브는 그들의 유효성을 분석하는 동안 즉석에서 그들의 활성법을 표현하고 나아가 선입견을 최소화하도록 계산된다. 많은 양의 데이터가 이 방법으로 일반화되기 때문에 정확한 통계적 기술이 사용된다. 임의의 통계적 방법이 사용될 수 있으며, 당업자라면 적당한 많은 방법으로 확인할 수 있을 것이다.

통계적 분석 및/또는 패턴 인식 방법이 임의의 수로 사용된다. 데이터의 구조가 초기에 알려져 있지 않고 다른 분류기 설계 방법이 다른 구조에 대하여 보다 잘 수행할 수 있기 때문에, 데이터에 적어도 두 개 이상의 설계 방법을 사용하는 것이 바람직하다. 일부 실시에서 세 개의 다른 방법론이 사용된다. 당업계에서 통상적으로 사용하는 통계적 분석 및/또는 데이타 세트의 패턴 인식 중 하나는 어떤 통계적 방법이 다른 것들보다 효율적인 결과를 얻을 수 있을 만한 데이터 세트 구조의 특성을 인식하는 것이며, 이 경우에 효율은 원하는 프로브의 수와 민감성 및특이성이 어떤 수준에 도달하는 것을 의미한다. 당업자라면 통계적 분석 및/또는 방법의 효율을 데이터에 의존하여 알 수 있을 것이다.

통계적 분석 및/또는 패턴 인식 방법의 예는 다음과 같다:

a) C4.5. C4.5로 알려진 의사결정 나무 분석법은 http://www.cse.unsw.edu.au/~quinlan/에서 ftp를 통해 이용할 수 있는 공개된 도메인 소프트웨어이다. 이것은 차례로 구체적인 특성에 의사결정 문턱값을 연속해서 적용하여 가장 적절하게 분류될 수 있는 데이터에 매우 적당하다. 이것은 상호연관되지 않은 데이터에서 작업하기에 가장 적절하다; 또한 변화된 차이를 제공하는 유사한 방법으로 얻은 데이터로 대처한다. 상기 C4.5 패키지는 본 명세서에 기재된 실시예를 제공하기 위해 사용하였다.

b) 선형판별 분석기법(Linear Discriminant Analysis). 이것은 종류별로 가장 적절하게 분리하는데 주어지는 특성의 가중 조합(weighted combination)을 발견하는 과정을 포함한다. 이러한 방법들은 상호연관된 데이터에서 작업하기에 가장 적절하지만, 변화된 차이를 제공하는 유사한 방법으로 얻은 데이터에는 적절하지 못하다. 요구되는 시행 평가 및 그래프식 산출에 의존하여 여러 가지 통계적 패키지가 사용되었다(SPSS, SAS 및 R). Fisher의 선형판별 분석기법은 오류 비율을 최소화한 분류기를 얻기 위해 사용되었다. 인정받은 판별 기능은 변화된 의사결정 문턱값으로 민감성 및 특이성 사이의 균형을 보여주는 컴퓨터 반응자 작용특성(receiver operating characteristic, ROC) 곡선으로 사용되었다.

c) 로지스틱 회귀분석(Logistic Regression). 이것은 선형 회귀분석 모델을비선형으로 변형한 것이다: 의존하는 변수는 로그-승산비(log odds ratio, logit)로 대체된다. 판별 분석기법과 같은 선형 회귀분석은 선형 모델에 기초한 통계적 방법의 종류에 속한다. 이러한 모델은 설명변수(explanatory variable) 사이의 선형 관계를 기본으로 한다.

충분한 샘플의 수는 상기 기술들과 소프트웨어 패키지들을 사용하여 종류별로 잘 판별할 수 있는 특성의 조합을 조사할 수 있게 해준다. 통계적 분석 및/또는 패턴 인식 방법의 다른 예로는 SPSS의 선형 식별 기능법(linear discriminant function method) 및, R 및 SAS의 로지스틱 회기분석법이 있다. SPSS는 완제품의 명칭이며, SPSS, Inc.(SPSS, Inc., 본사 주소는 233 S. Wacker Drive, 11th floor, Chicago; Illinois 60606에 위치하고 있다)로부터 입수할 수 있다(www.spss.com). SAS는 완제품의 명칭이며, SAS Institute, Inc., 100 SAS Campus Drive, Cary, NC 27513-2414, USA(www.sas.com)로부터 입수할 수 있다. R은 완제품의 명칭이며, 자유 소프트웨어 재단(Free Software Foundation)의 GNU(General Public License)에서 무료 소프트웨어로 입수할 수 있다(http://www.r-project.org/).

일부 실시에서 상관행렬(correlation matrix)이 얻어진다. 상관은 한쌍의 변수 사이에 선형 결합의 양을 측정한다. 상관행렬은 하나의 지표에서 얻어진 데이터와 또 다른 지표에서 얻어진 데이터의 상호관계에 의해 얻어진다. 예를 들면, 문턱값 상관수는 50% 상관에 세트된다. 이 경우, 50% 또는 그 이상의 상관수를 가지는 모든 지표는 상관 지표로 간주된다.

본 발명의 일부 실시에서 가중인자(weighting factor)를 공급받은 사용자는최적화된 패널을 획득하여 사용한다. 가중은 어떤 인자와 연관된다. 예를 들면, 어떤 지표들은 비용, 상업적 고려, 오분류(misclassification) 또는 오류 비율, 지리적 위치에서 특이 질병 형태의 보급, 프로브의 과잉 및 유효성으로 인해 다른 지표들보다 가중치가 높아진다. 다른 지표들보다 높은 가중치의 지표로 사용자에게 장려하는 비용과 관련된 일부 인자들로는 프로브의 비용 및 라이센스 기한 및 조건과 같은 상업적 접근 간행물이 있다. 다른 지표들보다 높은 가중치의 지표로 사용자에게 장려하는 상업적 고려와 관련된 일부 인자들로는 Research and Development(R&D) time, R&D cost, R&D risk가 있으며, 즉, 프로브로 작업할 확률, 최종 분석 기기의 비용, 시장에 대한 최종 시행 및 시간이 될 것이다. 예를 들면, 검출 패널에서 다른 지표들보다 높은 가중치의 지표로 사용자에게 장려하는 오분류 또는 오류 비율과 관련된 일부 인자들은 허위음성(false negative)을 최소화하는데 요구되는 것이다. 다른 한편으로, 식별 패널에서 그것은 허위양성을 최소화하는데 요구되는 것이다. 다른 지표들보다 높은 가중치의 지표로 사용자에게 장려하는 것으로, 지리적 영역에서 일반적 또는 특이적 질병 형태의 보급과 관련된 인자로는 어떤 지리적 위치에서 어떤 일반적 또는 특이적 질병의 발생이 더 이상 보급되지 않는 것이다. 과잉에 관해서 일부 실례에서 패널이 과잉되는 것이 요구된다. 예를 들면, 패널에서 지표의 생물학적 변이성으로 인한 것과 같이 어떠한 이유로 하나의 프로브를 검출하는 것이 실패한다면, 질병 형태는 다른 지표들에 의해서도 검출되지 않을 것이다. 일부 예시에서 바람직한 과잉 지표가 되는 지표들은 보다 많이 가중된다.

본 발명은 비용 또는 공급 문제가 가장 적합한 조합을 허용하지 못할 경우 특성의 유효성에 대하여 적응할 수 있도록 하는 융통성이 있다. 하나의 실시예에서 본 발명은 선택적인 조합으로 발견한 유리한 특성을 간단하게 적용할 수 있었다. 또 다른 실시에서 연산이 최소 비용 용액에 도달하기 위한 선택 과정에 포함되는 비용 가중치를 허용하는 특성들을 선택하는데 이용된다. 실시예들에서는 수집된 모든 지표들로부터 선택된 조합 또는 상업적으로 바람직한 프로브의 그룹만을 위한 지표 시행 평가들을 보여준다. 또한 실시예들은 C4.5 패키지가 그들의 높은 비용을 기본으로 하는 어떤 프로브를 낮은 가중치로 사용할 수 있음을 증명한다. 이들 프로브 조합들은 최적의 조합만이 수행되는 것은 아니지만, 비용이 중요한 인자라는 상황에서 받아들일 수 있는 실시가 된다.

사용된 방법의 일부는 종류에 적용되는 가중치를 허용한다. 이는 비용을 최적화할 수 있는 나무 설계를 하는 C4.5에서 가능해진다. 또한 식별 기능법은 요구되는 허위양성 또는 허위음성 확률을 줌으로써 사용할 수 있는 단일 매개변수를 산출해 준다. 다른 문턱값 세팅에 의한 이들 매개변수의 구분은 반응자 작용특성(ROC) 곡선으로 알게 된다. ROC 곡선은 분류기의 다른 문턱값 수준의 실제 양성 점수에 대하여 허위양성의 평가된 백분율을 보여준다.

많은 일반적인 질병 형태의 이질성을 부여하는 패널들은 집단-기저 스크린(population-baed screen)으로 그것의 사용을 정당화하기 위해 충분한 민감성, 특이성, 양성 예상값(양성 예상값 = 실제 양성/(실제 양성 + 허위양성)) 및 음성 예상값(음성 예상값 = 실제 음성/(허위음성 + 실제 음성)을 가지는 검사를 확보하기 위한 과잉의 등급으로 구성된다. 그러나, 국부적(local) 및 국소적(regional) 차이들은 세계 시장의 다른 부분에서 검사의 특정한 사용을 규명하고, 따라서 주어진 시장을 위한 최종 패널 검사를 구성하는데 사용되는 기준에 중대한 영향을 준다. 반면에, 임상적 이용의 최적화는 입수성(affordability, 비용), 기술적 능력, 실험실 및 건강케어 제공 수단, 공동작업 간행물(workflow issue), 소요인력(manpower requirement), 및 프로브의 유효성 및 최종적으로 기여될 라벨, 패널에서 사용된 지표의 국부적 선택을 포함하는 국부적 인자가 가장 중요하다. 잘 알려진 선형 판별 기능 분석은 각 국부적 인자가 방정식에서 기한으로 표현되고, 각 인자가 국부적으로 결정된 중요성에 따라서 가중되는 모든 잠재된 선택 인자들을 포함하고 평가하는데 사용된다. 이러한 방법에서, 한 지역에서 사용하기 위해 최적화된 패널 검사는 다른 지역에서 사용하기 위해 최적화된 패널 검사와는 다르다.

검출 또는 식별 패널을 상기에 기재된 방법으로 사용하도록 설계하고 나면, 다음 단계는 알려진 세포 샘플을 사용하여 패널을 확인하는 것이다. 확인하기 전에 선택적 최적화 단계를 수행한다. 일부 실시예에서 세포 샘플을 수집하기 위한 방법을 이용한다. 이것은 세포 샘플을 혼합하는 방법은 물론 환자로부터 샘플을 획득하는 방법을 포함한다. 다른 실시에서 세포 보존 방법이 이용된다. 예를 들면, 최적의 정착액(보존 유체) 또는 유체 운송과 같은 조직 표출 방법을 이용한다.

gold standard 조직 샘플을 사용하여 제조된 패널을 확인하는데 사용하는 상기 세포 샘플은 알려진 진단방법들로 진단한 세포 샘플이다. 이들 샘플들은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 수집한다. 예를 들면, 객담 샘플은 자발적인 제조, 유도된 제조 및 객담의 제조를 증가시키는 작용제의 사용을 통해서 수집할 수 있다. 이 샘플은 패널 내에서 각 프로브와 접촉하게 되고 프로브와 결합하는 패턴은 패널의 실행을 결정하여 분석하게 된다. 일부 실시예에서는 패널을 더욱 최적화하는데 그것이 필요하다. 예를 들면, 패널로부터 프로브를 삭제하기 위해 그것이 필요하다. 또는, 패널에 부가적 프로브를 첨가하는데 필요하다. 부가적으로, 그것은 패널에 하나의 프로브를 또 다른 프로브로 교환하는데 필요하다. 새로운 프로브를 첨가한다면, 이 프로브는 상관 행렬로 결정되는 상호관련된 지표가 될 것이다. 선택적으로, 프로브는 기능적으로 유사한 지표가 된다. 패널이 최적화되면, 그 패널은 임상적 연구에서 더욱 검사하기 위한 과정에 착수하게 된다.

다른 실시예에서는 그것이 패널을 최적화하는데 필요하지 않다. 세포 샘플로 인한 결과가 조직 샘플로 인한 결과와 상호관련이 있다면, 패널을 최적화하는 과정 및 임상적 연구에서 더욱 검사하기 위한 착수 과정에서 필요하지 않게 된다.

4. 사용 방법

패널을 상기에 기재된 방법으로 획득하고 나서, 그것을 조직 샘플에 적용한다. 사용방법을 설명하기 위해 암, 특히 폐암을 예로 들것이다. 유사한 단계 및 절차들은 다른 질병 형태에도 적용될 것이다. 특정한 손상으로 인한 세포가 패널에서 획득하여 사용되는 조직 병리 샘플과 유사한 방법으로 염색될 것이고, 미세침흡인, 객담, 소변과 같은 세포 샘플로 보여질 것이다.

본 발명에 의한 기본적인 방법은 일반적으로 두개의 단계를 포함한다. 첫 번째는 질병 세포를 함유하는 것으로 의심되는 세포 샘플을 각각 질병 지표에 정량적으로 결합하는 작용제의 다수를 함유하는 패널과 접촉시킨다. 그런 다음, 각 작용제가 지표에 결합하는 수준 또는 패턴을 검출한다. 이 검출 결과는 일반적인 질병의 존재를 진단하거나 또는 특이 질병 형태별로 식별하는데 사용된다. 선택적 예비 단계는 세포 검체 내에서 질병의 검출 또는 질병 형태별 식별을 돕는 작용제의 최적화된 패널을 확인하는 것이다.

세포 검체는 혈액, 소변, 척수액(spinal fluid) 및 임파계(Lymphatic system)와 같은 체액(body fluid)에서 수집한 세포 샘플; 폐객담 등의 폐혈관, 방광 세척액 등의 요로(urinary tract), 자궁경부 세포진검사(PAP smear) 등의 생식기 및 결장 세척액 등의 위장관과 같은 상피세포-기저 기관계(organ system); 유방, 췌장, 간, 신장, 갑상선, 골수, 근육, 전립선 및 폐와 같은 기관 및 계통내 고형 조직 부위로부터의 미세침흡인; 유방, 췌장, 간, 신장, 갑상선, 골수, 근육, 전립선 및 폐와 같은 기관 및 계통내 고형 조직 부위로부터의 생체검사; 및 외과적 생체검사로 인한 조직과 같은 조직 검체를 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 의한 작용제의 실례가 되는 패널은 세포 샘플에서 악성 세포를 정확하게 검출하기 위해 허용되는 어떤 작용제의 수를 포함한다. 본 발명에서 구상된 분자 지표는 악성 세포의 검출을 돕는 어떤 분자이다. 지표들은 지표의 발현 수준 또는 패턴 변화와 연관된 여러개의 다른 기준을 기본으로 하는 패널내 함유물에서 선택된다. 분자 지표는 발현 과정에서 변화하는 것이 바람직하다: 초기 종양 진행에서 발생하여 대부분의 종양 세포에서 나타나고, 주어진 종양 유형의 75%를 초과하여 검출되며, 가장 바람직하게는 주어진 종양 유형의 90%를 초과하고, 및/또는 암의 병리 유형별로 식별된다.

기본적 방법의 첫 번째 단계는 세포 샘플에서 작용제를 함유한 패널의 발현 수준 또는 패턴에서의 변화를 검출하는 것이다. 일반적으로 이 단계는 라벨된 다클론 또는 단클론의 항체 또는 그들의 단편 또는 핵산 프로브 및 개별 세포에서의 신호 관찰과 같이 작용제와 세포 검체가 접촉하는 과정을 포함한다. 신호가 변화하는 세포의 검출은 라벨 프로브를 지시하는 분자 지표의 발현 수준에서 변화된 것임을 나타낸다. 이러한 변화는 검사가 시작된 조직 또는 부위로부터 얻은 비악성 세포와 연관된 발현 수준에서 증가 또는 감소하는 것을 기본으로 한다.

작용제를 함유하는 패널의 발현 수준 또는 패턴에서의 변화 분석은 당업자라면 악성 세포가 세포 샘플 내에 존재하는지를 높은 민감성 및 높은 특이성으로 결정할 수 있게 해준다. 용어 "민감성(sensitivity)"은 질병에 걸린 사람이 임상적인 검사로 정확하게 확인하게 되는 조건부 확률을 말한다(실제 양성 결과의 수를 실제 양성수와 허위음성 결과로 나눈다). 따라서, 암 검출 방법이 높은 민감성을 가진다면, 검출되는 암의 백분율이 80% 정도로 높으며, 바람직하게는 90% 이상이 된다. 용어 "특이성(specificity)"은 질병에 걸리지 사람이 임상적인 검사로 정확하게 확인하게 되는 조건부 확률을 말한다(실제 음성 결과의 수를 실제 음성수와 허위양성 결과로 나눈다). 따라서, 암 검출 방법이 높은 특이성을 가진다면, 80%정도, 바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95%가 되며, 제조방법에서 허위음성의 백분율이낮아야 한다. "세포 샘플(cytologic sample)"은 질병 세포를 함유하는 환자로부터 수집한 샘플을 포함한다. 본 발명에 의해 구상된 세포 샘플의 예로는 체액, 상피세포-기저 기관계 세척액, 부스러기(scrapings), 브러싱(brushing), 도말 표본(smears), 미세침흡인 및 생체검사를 들 수 있다.

본 발명에서 기재한 지표를 사용할 경우, 적당한 세포 샘플을 정기적으로 획득하는 것이 가능하며 상기 샘플을 연속적인 평가를 위해 적절하게 보존할 수 있다. 상기 세포 샘플은 가공되고 적당한 방부제를 사용하여 저장된다. 바람직하게는 상기 세포 샘플은 방부제를 함유하는 바이얼(vial)에서 수집한다. 상기 방부제는 세포 형태를 유지하고 세포 단백질 및 핵산의 분해를 억제하거나 차단하는 분자 또는 분자들의 조합이다. 고유의 고착을 확실하게 하기 위하여, 샘플을 분해하는 고속의 수집 사이트에서 샘플을 혼합하고 및/또는 점액과 같은 불명료한 물질을 분쇄하여, 그로 인해 방부제에 세포를 노출시킨다.

검체를 획득하고 나서, 적당한 혼합 장치를 사용하여 검체를 균질화하는 과정이 필요하다. 이것은 여러가지 목적을 위한 분취량(aliqouts)을 사용하고, 준비하는 다수의 슬라이드 및/또는 슬라이드 위의 다수 유입물은 물론 하나 이상의 검사 부위에서 보내는 분취량의 가능성을 포함할 수 있다. 사용 전에 검체 및 각 분취량의 초기 균질화 과정은 각각의 개별 슬라이드가 세포의 같은 분배를 실제로 가지게 되고, 그러므로 하나의 슬라이드와 또 다른 슬라이드와의 결과 비교는 의미를 갖게 된다.

분석을 위한 검체의 제조는 세포 단층의 도말 표본, 원심분리 또는 유입물을포함하는 방법(이에 한정되는 것은 아니다)을 사용하여 현미경 슬라이드에 샘플을 도포하는 과정을 포함한다. 이러한 방법은 수동화(manual), 반자동화 또는 전자동화되어 있다. 세포 현탁액은 필터 및 다음 평가를 진행하기 위해 제조된 슬라이드에서 옮겨진 세포 단층으로 세포를 침적하여 흡인된다. 이러한 슬라이드 부가 과정을 반복하여 필요한 것을 제조한다. 본 발명은 슬라이드당 하나의 분자 지표의 검출하는 것을 포함한다. 또한 슬라이드당 여러개의 분자 지표를 검출하는 것을 구상한다. 바람직하게는 1-6개의 지표들이 슬라이드당 검출된다. 일부 실시에서는 2개의 지표들이 슬라이드당 검출된다. 다른 실시에서는 3개의 지표들이 슬라이드당 검출된다.

본 발명은 당업계에 알려진 많은 방법을 사용하여 DNA, RNA 또는 단백질 수준에서 분자 지표 발현의 변화를 검출하는 방법에 관한 것이다. 세포 샘플에서 분자 지표의 발현 수준 또는 패턴의 변화 검출은 일반적으로 다클론 또는 단클론 항체 또는 그들의 단편 또는 총체적으로 "프로브"라고 칭하며, 패널에서 분자 지표를 암호화하는 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열과 세포 샘플이 접촉하는 것을 포함한다. 일반적으로, 프로브 및 라벨된 구성성분은 프로브가 분자 지표와 반응할 때 신호를 보내기 위하여("라벨된 프로브") 효과적으로 연결되어 있다. 본 발명에 의해 구상된 라벨은 신호를 보내거나 또는 허가할 수 있고 샘플내 구성성분의 확인을 위해 허용된 라벨이다. 바람직한 라벨은 방사성, 형광발색적, 색소생산성 또는 효소성분을 포함한다. 따라서, 검출 가능한 방법은 면역 염색법(Immunocytochemistry); 면역조직화학(Immunohistochemistry)과 같은 단백체학(proteomics); 원위치잡종화(in situhybridization) 및 형광성 원위치 잡종화(fluoresenctin situhybridization)와 같은 세포유전학; MACs 및 DNA 배수체(자동화로 산출된 세포계측법을 사용하여 화학량론적으로 염색된 핵 DNA의 정량)와 같은 무선검출(radiodetection), 세포계측법 및 전계 효과(field effects); 및 형태학을 기초로 한 정량적인 세포병리학과 같은 세포병리학을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 라벨된 프로브에 의해 발생되는 신호는 의사 또는 전문가에 의해 검출될 수 있는 충분한 강도가 된다.

상기 슬라이드를 준비하고 나서, 의사는 암 진단의 지표 발현 특성의 변화를 나타내는 세포를 확인하기 위하여 슬라이드를 현미경으로 재조사한다. 의사는 관련 세포를 확인하기 위해 이미지 분석 시스템 및 자동화된 현미경을 사용한다. 데이터 분석은 의사가 결정적인 진단방법을 만들 수 있도록 도움을 주는 정보 관리 시스템 및 연산을 사용하여 최적의 치료적 접근을 선택하도록 해준다. 또한 의사는 라벨된 작용제의 존재하에 검출할 수 있는 기구 플랫폼(instrument platform)을 사용하여 샘플을 조사한다.

분자 진단 패널 분석은 라벨된 세포 및/또는 조직 부분이 있는 하나 또는 그 이상의 유리 현미경 슬라이드에서 결과를 얻는다. 임상적으로 의미심장한 결과로 이들 (세포)병리 복합라벨된 세포 준비를 객관적으로 평가하기 위한 숙련가의 도전은 어떤 인간 생존에 대하여 실질적으로 능가할 수 없는 검출 및 인지에 관한 문제가 있다.

컴퓨터-지원 이미지 시스템(Photonic Microscopes^TM)은 프로브로 라벨된 세포 및 조직의 양 및 위치를 정량적으로 또는 생식적으로 평가하기 위하여 개발되고 사용된다. 상기 Photonic Microscopes^TM는 세포-기저 프로브 함유량 및 민감성 및 정확성에 비교되는 인간 시각화에 의해 얻을 수 없는 위치 측정을 검출하고 보고하기 위한 로봇식 슬라이드-운용 능력, 데이터 관리 시스템(medical informatics) 및 정량적인 디지털(광학 및 전자) 이미지 분석 하드웨어 및 소프트웨어 모듈(modules)을 겸비한다. 이들 프로브 데이터는 다양한 질병 형태를 위한 그들 각각의 세포-기저 지표들 내에서 그들과 연관된 특성 및 차이를 기본으로 세포 샘플에 특성을 부여하고, 차별화하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 방법론은 세포-기저 검체 및 샘플에 적용되는 분자 진단 패널에 의한 것이고, 계속해서 정량에 사용되며 분자 진단 패널 검사의 결과를 보고하는 컴퓨터-지원 이미지 시스템에 의한 방법론이다. 상기 이미지 시스템은 프로브들이 현미경의 세포 또는 조직 슬라이드에서 색상으로 인해 차별화되기 때문에, 다수의 프로브가 주어진 슬라이드-기저 샘플에 동시에 사용되고, 프로브가 단독으로 분석, 정량 및 보고될 수 있어 세포-기저 샘플을 평가하는데 사용될 수 있다.

샘플 내에서 라벨된 작용제에 의해 발생되는 신호가 적당한 유형 및 충분한 강도가 될 경우, 표준 현미경 또는 Computer-Aided Mcroscope[167]을 사용하여 평가자(예를 들면, 병리학자)에 의해 검출된다. Computer-Aided Mcroscope는 환경공학적이며, 주요 기능(예를 들면, 슬라이드 스캐닝 패턴)의 산출된 자동화로 현미경운영(예를 들면, 단계 이동, 초점맞춤)의 mouse-driven control을 통합한 컴퓨터-인터페이스(computer-interfaced) 현미경 워크스테이션(workstation)이다. 집중된 데이터 관리 시스템은 모든 검체 스크리닝 결과 및 병리학 재조사는 물론 관련 환자 정보를 저장하고, 인식하고, 전시한다. 바코드가 찍혀 있는 각 샘플 슬라이드에 첨부된 확인 숫자는 데이터베이스의 각 샘플을 독특하게 확인하고, 원본 검체 및 환자와 관련이 있다.

바람직한 실시예에서 샘플 내에 라벨된 작용제로 인해 발생하는 신호는 자동화된 이미지 분석 시스템 또는 Photonic Microscope, 사용하여 검출 및 정량될 수 있으며, 집중적 데이터 관리 시스템에 결부된다. Photonic Microscope는 현미경 운영이 전자동화된 소프트웨어 컨트롤을 제공하고 평가자에 의해 검출되지 않는 매우 약한 신호 또는 방사성 동위원소로 라벨된 부분에서의 신호와 같이 신호의 정량에 적당한 검출기 및 다른 구성성분을 포함한다. 검출된 신호의 위치는 자동화된 기구에 의해 빠르게 재배치되고, Computer-Aided Mcroscope[168]을 사용하여 사람이 재조하여 전자 저장된다.

집중된 데이터 관리 시스템은 바코드로 확인한 모든 환자 및 샘플 데이터를 보관한다. 상기 데이터는 부위의 다양성으로부터 비동기적으로 취득하고, 세포학자 및/또는 자동화된 분석기로 분석한다. 이들 데이터는 미리 균질화된 단일 환자 검체로부터 분취량을 나타내는 다수의 샘플 슬라이드에서 얻은 결과들을 포함한다. 데이터의 일부 또는 전부는 병원의 실험실 정보 시스템(Laboratory Information System)에서 보고 집회(meet reporting), 파일보관(archiving), 선전(billing) 또는 규정요구(regulatory requirement)로 전달된다. 패널 조사 및 평가자 재조사를 통합한 결과로 단일, 포괄적인 보고서가 작성되고, 의사에게 하드카피(hardcopy) 또는 컴퓨터 또는 인터넷 네트워크을 통해 전자문서로 배달된다.

일부 실시에서 암의 다른 조직 유형과 같이 다른 질병의 차별적인 식별을 위해 즉석적인 방법이 허용된다. 용어 "조직적 유형"은 특이 질병 형태를 말한다. 일반 질병 형태에 의존하여 하나 또는 여러 개의 조직적 유형이 될 수 있다. 예를 들면 폐암은 편평세포암, 선암, 대세포암, 소세포 폐암 및 중피종을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 환자에게 영향을 주는 암의 조직 유형의 인식은 의사가 질병의 부위를 제한하고 특성화하고 광처리법(optical treatment strategy)을 결정하는데 도움을 주기 때문에 매우 유용하다.

특이 질병 형태를 결정하기 위하여 지표의 패널은 특이 질병 형태별로 식별되어 선택된다. 예를 들면, 분자 지표의 패널 안에서 발현 패턴이 암의 특정한 조직 유형을 나타내는 것이 확인된다. 분자 지표의 패널 발현 수준의 검출은 상기에 기재된 방법으로 완수된다. 바람직하게는, 1-20개 분자 지표의 패널이 폐암의 여러 가지 조직 유형 사이를 식별하는데 사용된다. 그러나 가장 바람직하게는 4-7개 지표가 사용된다. 의사결정 나무는 지표 발명의 패턴을 기본으로 하는 다른 조직 유형 사이에서 식별하는 것을 돕기 위해 개발된다.

세포 샘플에서 악성 세포의 검출을 위해 허용하는 것외에도 즉석적 발명은 질병 형태의 분자 특성에서 유용성을 가진다. 이러한 정보는 종종 중요한 예후가 되고, 의사가 특정한 환자를 위한 최적의 치료적 접근을 선택하는데 도움을 줄 수있다. 게다가, 본 발명에서 기재한 지표의 패널은 재발 또는 질병 치료에 사용되는 치료요법의 효능을 측정하기 위해 환자를 모니터링하는데 유용성을 가진다.

비제한적 실시의 방법으로, 폐암의 백분율은 폐암 검출 패널에 의해 검출되고, 폐암의 특이 유형은 식별 패널에 의해 검출된다. 의사가 세포 샘플에서 악성 종양이 존재한다고 결정하면, 더 나아가 폐암의 조직 유형의 분석을 수행하게 된다. 본 발명에 의해 포함되는 폐암의 조직 유형은 편평세포암, 선암, 대세포암, 소세포 폐암 및 중피종을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 도 1은 폐암의 다른 조직 유형을 확인하기 위한 패널에서 포함된 바람직한 지표인 분자 지표를 보여준다. 컬럼 라벨된 "%"는 특정한 지표로 발현하는 종양 검체의 백분율을 나타낸다.

폐암의 여러 가지 조직 유형을 결정하기 위하여 관련된 지표의 발현 수준을 분석한다. 도 2는 다른 지표들이 암의 다른 조직 유형별로 식별하는데 어떻게 사용되는지를 보여준다. 이 표에서 SQ는 편평세포암(扁平細胞癌, squamous cell carcinoma)이고, AD는 선암(腺癌, adenocarcinoma)이며, LC는 대세포암(大細胞癌, large cell carcinoma)이고, SC는 소세포암(small cell carcinoma)이며, ME는 중피종(mesothelioma)이다. 각각의 세포에서 나타나는 숫자는 하나의 세포 유형에 대한 또다른 세포 유형에서 지표 변화의 빈도를 나타낸다. 표에 포함되는 비율은 2.0이상 또는 0.5 이하이어야만 한다. 일반적으로 100 이상의 숫자는 두 번째 지표가 발현되지 않았음을 의미한다. 이러한 경우 분석 목적에 따라 분모를 0.1로 맞춘다. 최종적으로 공세포(empty cell)는 발현에서의 차이 또는 발현 데이터의 부재 모두를 의미한다.

수집된 데아타를 분석하기 위한 한가지 방법으로 의사결정 나무를 구성한다. 구조식 1-4는 발현 패턴을 사용하여 폐암의 조직 유형의 차별적인 결정을 할 수 있도록 구성된 의사결정 나무의 실시예들이다. 본 발명은 구조식 1-4로 존재하는 의사결정 나무에만 한정되는 것은 아니다. 관련된 지표의 발현 수준은 다른 조직 유형의 악성 세포에서 분자 지표의 발현 수준 보다 높거나, 낮거나 또는 같을 수도(ND) 있다. 각 구조식은 분자 지표의 표시된 패널의 사용을 통하여 폐암의 다섯 가지 조직 유형 가운데 식별할 수 있다.

예를 들면, 구조식 1에서 패널은 HERA, MAGE-3, 트롬보모둘린(Thrombomodulin) 및 사이클린 D1으로 구성된다. 첫번째 샘플은 HERA 쪽으로 향하여 라벨된 프로브와 접촉하게 된다. HERA의 발현이 대조군보다 낮다면, 검사결과는 폐암의 조직 유형이 중피종(ME)임을 나타낸다. 반대로, HERA의 발현이 대조군보다 높거나 같다면, 이 샘플은 MAGE-3 쪽으로 향하여 프로브와 접촉하게 된다. MAGE-3의 발현이 대조군보다 낮다면, 이 샘플은 사이클린 D1 쪽으로 향하여 라벨된 프로브와 접촉하게 되고, 소세포암(SC) 또는 선암(AD)으로 결정될 것이다. MAGE-3의 발현이 대조군보다 높거나 같으면, 이 샘플은 트롬보모둘린 쪽으로 향하여 라벨된 프로브와 접촉하게 되고, 편평세포암(SQ) 또는 대세포암(LC)으로 결정될 것이다.

구조식 1

구조식 2에서 패널은 E-카데린, 폐 표면활성제 B(Pulmonary Surfactant B) 및 트롬보모둘린으로 구성된다. 첫 번째 샘플은 E-카데린 쪽으로 향하여 라벨된 프로브와 접촉하게 된다. E-카데린의 발현이 대조군보다 낮으면, 검사결과는 폐암의 조직 유형이 중피종(ME)임을 나타낸다. 반대로, E-카데린의 발현이 대조군보다 높거나 같다면, 이 샘플은 폐 표면활성제 B 쪽으로 향하여 프로브와 접촉하게 된다. 폐 표면활성제 B의 발현이 대조군보다 낮다면, 이 샘플은 사이클린 D1 쪽으로 향하여 라벨된 프로브와 접촉하게 되고, 편평세포암(SQ) 또는 대세포암(LC)으로 결정될 것이다. 폐 표면활성제 B의 발현이 대조군보다 높거나 같으면, 이 샘플은 CD44v6 쪽으로 향하여 라벨된 프로브와 접촉하게 되고, 선암(AD) 또는 소세포암(SC)으로 결정될 것이다(의사결정 나무의 보다 구체적인 예로 구조식 3 및 구조식 4 참조).

구조식 2

구조식 3

구조식 4

바람직한 방법은 발현 패턴에서의 차이가 폐암의 여러 가지 조직 유형 사이에서 식별을 가능하게 하는 분자 지표의 패널을 사용하는 과정을 포함하는 것이다.

많은 다른 의사결정 나무들이 지표 발현의 패턴을 분석하기 위해 구성되어진다. 이 정보는 의사 또는 다른 건강케어 제공자가 환자 관리를 결정하고 최적의 치료법을 선택하는데 사용될 것이다.

5. 패널 분석의 결과보고

패널 분석으로 인한 결과는 여러 가지 방법으로 보고된다. 예를 들면, 결과들은 간단한 "네 또는 아니오" 결과로 보고된다. 선택적으로, 결과는 검사 결과들이 정확해지는 확률로 보고된다. 예를 들면, 검출 패널 연구의 결과는 환자가 일반적인 질병 형태에 있는지 아닌지를 나타낸다. 또한 특이성 및 민감성으로 보고된패널에서도 역시 결과는 환자가 일반적인 질병 형태에 있는지에 대한 확률로 보고된다. 식별 패널 분석의 결과는 특이 질병 형태별로 식별될 것이다. 이 결과는 특이 질병 형태가 존재하는지에 대하여 "네 또는 아니오"로 보고될 것이다. 선택적으로, 결과는 특이 질병 형태가 존재하는지에 대한 확률로 보고된다. 또한 한 명의 환자로부터 얻은 검체에서 여러 가지 식별 패널 분석을 수행하는 것 및 질병 형태의 존재가 다른 가능성을 가지는 특이 질병 형태일 가능성의 윤곽을 보고하는 것도 가능하다.

각 특이 질병이 존재할 가능성의 윤곽을 제공하는 실시예에서 여러 가지 가능한 결과들이 있다. 예를 들면, 모든 가능성이 매우 작은 가능성이 될 수 있다. 이 경우에, 의사는 환자의 검체 진단을 허위양성으로 결론 내릴 수 있다. 또한 모든 가능성이 80-90%를 넘는 하나를 제외하고 낮을 수 있다. 이 경우에, 의사는 환자가 높은 가능성으로 나타나는 특이 질병 형태임을 검사에서 검증하여 결론 내릴 수 있다. 또한 대부분의 가능성 낮아지는데, 두 개의 특이 질병 형태에 대해서만 유사하게 높은 가능성들이 보고된다. 이 경우에, 의사는 정확한 질병 형태를 확인하여 확실하게 하기 위해 보다 광범위한 패널로 검사할 것을 추천한다. 또 다른 가능성은 보고된 모든 가능성들 중 하나가 나머지 보다 약간 높아지는데, 80-90% 비율이 될 정도로 높지는 않게 낮아지는 것이다. 이 경우에, 의사는 정확한 질병 형태를 확인하여 확실하게 하기 위해 및/또는 다른 암 유형의 원격 원발성 종양(remote primary tumor)으로부터 전이암(metastatic cancer)을 제외하기 위해 보다 광범위한 패널로 검사할 것을 추천한다.

이어지는 실시예는 질병을 스크린하고 질병의 다른 특수형(subtype) 별로 식별하기 위해 진료소에서 질병 검출 패널, 질병 식별 패널, 패널의 확인 및 패널의 사용을 선택하기 위한 본 발명의 방법을 설명하는 것이다. 본 발명의 실시예를 설명하기 위해서 일부분에서 세계 건강에서 중요시하는 폐암을 선택하였으나, 앞서 기재한 일반적인 개시에 의하여 유사한 방법으로 암, 전염성, 퇴행성 및 자가면역 질병 등의 다른 유형에도 적용할 수 있음을 당업자라면 이해할 수 있을 것이다.

본 방법은 단순 폐암형의 구별 패널 뿐만 아니라, 폐암 판별 패널의 발전에 사용되어졌다. 폐암은 두개의 주류로 분리될 수 있는 질병의 복잡한 집합체이다. 전체 폐암 중 대략적으로 70 내지 80%을 차지하는 비소세포성 폐암(Non-small cell lung carcinoma; NSCLC)는 편평세포함(squamous cell carcinoma), 선암(adenocarcinoma), 및 대세포함(large cell carcinoma)을 포함하는 세개의 조직학적 형태로 더 세분화될 수 있다. 나머지 폐암환자의 20 내지 30%는 소세포성 폐암(small cell lung carcinoma; SCLC)이다. 게다가, 늑막의 악성 중피종 (mesothelioma)은 석면에 노출된 개체들로 발전할 수 있으며, 종종 다른 흉곽구조로 침입할 수 있도록 넓게 퍼질 것이다. 폐암의 다른 형태들은 폐의 다른 부위에 집중하고, 다른 예후들을 나타낼 수 있으며, 치료의 다양한 형태에 다르게 반응하기도 한다.

세계보건기구(Globocan 2000)의 최근 통계에 따르면, 폐암은 남녀 모두 한해에 약 124만명의 새로운 경우들이 나타나고 110만명이 사망하는 가장 치명적인 악성종양이다. 미국 한 나라에서 약 186,000의 폐암의 새로운 경우들이 나타나고 1년에 모든 암 관련 질병의 25%에 해당하는 162,000명이 사망한다고 국립암 기구는 보고하고 있다. 그러나, 미국에서 폐암으로 1년 이상을 사는 환자가 40%이지만, 5년을 사는 환자는 단지 14%정도에 불과하다. 세계 다른 나라에서, 5년을 사는 생존자는 매우 낮은 수준(영국은 5%)이다. 폐암의 높은 사망율은 대부분의 환자들(85%)이 치료 선택들이 제한되고, 질병이 전이되었을때 진행된 질병으로 진단받기 때문이다. 이러한 환자들에서, 5년동안의 생존자는 진단시기에 따라 2~30%이다. 상기 경우는 조기 진단된 환자들이 5년을 사는 생존자가 75%이상인 것과는 매우 대조적이다. 많은 새로운 화학용법 제제가 진행된 폐암의 치료를 위해 치료과정에 도입하는 것은 사실이지만, 장기간의 생존에 중요한 향상을 가져오는 것은 아니다. 초기단계 질병의 환자들은 수술로 치료받을 수 있지만, 제 2의 악성종양으로 발전할 수 있는높은 확율과 같은 중요한 위험은 남아있다. 따라서, 폐암환자들을 위해, 적극적인 관찰에 따른 조기 발견과 치료는 사망율 및 비용을 절감하면서 장기간 생존에 큰 향상을 얻을 수 있는 최고의 기회를 제공한다.

현재에, 환자는 X-ray를 통한 의심스러운 병부(lesion) 또는 환자가 느끼는 증후로 폐암인지를 의심한다. 그 결과, 대부분의 환자들이 상대적으로 늦게 질병을 진단받게 된다. 게다가, 대게의 방법들이 조기 단계의 질병의 진단에 충분한 감도가 부족하기 때문에, 미국 국립암기구, 국제보건기구의 현 정책은 위험에 처한 환자들의 인구들에서 폐암을 감별하는 것을 추천한다. 그러나, 본 발명의 실시예에서 객담세포질검사(sputum cytology)를 폐암의 조기진단에 상대적으로 간접적 검사이면서 보다 효율적이면서도 비용면서도 효과적인 수단으로 제공한다.

객담세포질검사의 특이성은 상대적으로 높다. 최근 연구에서 숙련된 세포검사자들은 악성 또는 심한 형성이상의 세포를 높은 정확도 및 신뢰성으로 감지할 수 있는 것으로 나타나 있다[10]. 비교적 진행된 질병을 갖고 있는 환자로부터 시료를 수집할 경우 진단율이 80 내지 90%정도로 높은 반면, 객담세포질검사는 단지 30~40%의 감도를 나타낸다. 객담세포질검사의 낮은 감도는 상대적으로 비싼 견본을 얻고 준비하는 것이 매우 중요하다. 게다가, 악성종약을 감지하는데 실패하는 것은 치료을 지연시키고 그로 인해 치유를 할 수 있는 기회를 감소시키게 한다.

또한, "위험에 처한" 집단의 선택은 감지 기술로써 객담세포질검사의 가치에 영향을 줄 수 있다. 심각한 위험에 있는 개인들은 폐암 진단의 전에 있는 사람들을 포함할 수 있고, 장기간 흡연자 또는 과거의 흡연자를 포함하며, 장기간 석면 또는폐질병의 발암물질에 노출된 개인들이 포함된다. 또한, 유전적인 경향이나 가족 특유의 계보를 갖는 사람들도 "위험에 처한"집단에 포함된다. 각 개인들은 테스트로 유익하게 된다. 낮은 위험을 갖는 개인들의 포함이 감지되는 환자들이 증가하는 반면, 건강치료비용면에서 실질적인 증가를 판단하기는 어렵다.

종래의 객담세포질검사의 저조한 실행에 기여한 다른 인자들은 손상의 위치, 종양크기, 조직형태 및 시료의 질을 포함한다. 편평세포암은 전체 폐 종양의 31%를 차지한다. 상기 종양의 대부분은 구역기관지(segmental bronchi)로부터 발생되고, 기부의 폐엽기관 및 말단의 세부기관으로 확장된다. 상기와 같은 이유로, 객담세포질검사는 상기 병부들을 감지하는데 효율적(79%)이다. 최근에는, 편평세포암은 탈피세포가 평가의 유용한 것과 같이,in situ및 방사학적 오컬트(occult) 단계의 세포검사로 인식되는 폐암의 한 형태로 인식된다. 한 연구에서, 전체 폐암의 23%를 세포검사 단독으로 진단하지만, 환자들이 X-ray 및 객담세포질검사 모두를 하는 경우에는 종양이 초기단계이고 방사학적으로 오켈트임을 제공한다. 다른 연구에서, 객담세포질검사는 방사학적으로 관측되지 않는 종양을 갖는 환자의 76%를 진단된다.

선암의 경우, 종양의 70%는 악성세포가 종래의 타액시편에서 관측되지 않는 폐의 표면에서 관측된다. 상기와 같은 이유로, 선암은 객담세포질검사로 거의 관측(45%)되지 않아 선암의 발생이 증가, 특히 여성에게 증가하는 추세이다.

또한, 종양크기는 자각 증상이 없는 개인들에서 질병을 관측하기 위해 스크린 테스트를 할때 특별히 중요한 인자인 정확한 진단의 가능성에 영향을 받을 수있다. 24㎜이하의 종양을 관측할 수 있는 기회는 단지 50%인 반면, 큰 병부를 관측하는 확율을 84%를 초과한다.

또한, 최근 연구는 시편의 세포질이 객담세포질검사의 감도에 영향을 미치는 것으로 보고되어 있다. 일반적으로, 편평세포암을 갖는 환자들은 다수의 종양세포를 시편을 제공하여 정확한 진단의 가능성을 높힌다. 선암을 갖고 있는 환자의 경우, 타액시편에서 종양 세포의 존재는 시편의 95%에서 10%미만이고 시편의 75%에서 2%미만이므로, 진단을 더 어렵게 한다.

또한, 구별의 정도는 특히 선암의 경우는 악성 세포를 감지하는 병리학자의 능력에 영향을 받을 수 있다. 잘 감별된 종양세포는 신 종양이 아닌 호흡상피세포와 유사하다. 소세포성폐암의 경우, 타액시료가 구별되는 특징을 갖는 성긴 집합세포의 세포소를 함유한다. 그러나, 현재의 타액시료의 과정에 사용되는 기술들은 세포를 분해하는 경향이 있어 진단을 더 어렵게 한다.

시료의 질은 객담세포질검사의 감도를 낮게하는 또 다른 인자이다. 최근 보고서는 물질의 70~85%로부터 적당한 시료를 얻을 수 있다고 제안하고 있다. 그러나, 상기 측정을 성공하기 위해서는 환자들이 많은 시편을 제공하는 것이 요구된다. 상기의 과정은 불편하고 시간 및 비용이 소비적이다. 또한, 환자들을 모집하는데 여러날이 걸리는 것과 같이 일반적으로 환자 참여가 낮다. 폐암으로 발전할 수 있는 과거의 흡연자들은 적절한 시편을 생산하는데 실패는 것도 동등히 중요한 인자이다. 시료 보존 및 과정은 진단 테스트로서 객감세포질검사의 가치에 영향을 줄 수 있는 또 다른 중요인자이다.

최근에, 적당한 시료를 얻을 수 있고 적절히 처리할 수 있다 하더라도, 일반적으로 세포검사자는 시료당 2~4개의 슬라이드로 관찰하고 각각 4분이상의 시간을 소요하여야 한다. 저 감도를 나타내는 것은 종래 객담세포질검사의 기술적 복잡성 및 노동 강도가 높기 때문이며, 이러한 테스트가 전반적으로 폐암의 조기진단의 예방으로써 거분된다는 것을 놀라운 것이 아니다.

상기의 기술적 문제가 해결되다 하더라도, 객담세포질검사의 저 감도는 중요한 문제로 남아있다. 정확하지 않은 부적정인 결과의 발생이 높은 것은 환자들이 잠재적인 치유 치료를 할 수 있는 것을 연기시키게 한다. 좀더 높은 감도를 갖는 테스트를 발전할 수 있는 가능성이 있는 반면, 이러한 향상은 특이성의 소비가 될 수 없다. 정확하지 않은 긍정적인 결과의 증가는 환자들에게 불필요하고 종종 비용적으로 침해적이며, 환자들의 삶의 질에 부정적인 영향을 가져다 준다. 본 발명은 폐암의 조기진단을 위한 객담세포질검사의 사용과 관련된 것을 포함하여 암의 조기진단의 종래 방법들과 관련된 많은 제한점들을 극복하는 것이다.

폐암은 질병의 이질적인 집합체이다. 예방으로 테스트의 사용을 정당화하도록 테스트의 감도 및 특이성을 필요한 수준으로 확신하기 위해, 본 발명은 구체적인 예로 10 내지 30 세포지표들의 라이브러리를 사용하여 패널들로 발전하도록 계획한다. 본 발명의 집합체의 선택은 예후를 갖는 발현들과 연계된 폐암의 환자들로부터 추출된 생체조직 시편에서 측정된 지표 발현을 과학적 문헌의 재분석과 재관찰을 바탕으로 한다.

예를 들어, 환자의 타액에서 조기 진단을 위한 바람직한 패널, 특성 및/또는폐암의 모니터링은 발현의 변화가 종양 시편의 최소 75%에서 발생하는 분자 지표를 포함한다. 전형적인 패널은 VEGF, Thrombomodulin, CD44v6, SP-A, Rb, E-Caldherin, cyclin A, nm23, telomerse, Ki-67, cyclin D1, PCNA, MAGE-1, Mucin, SP-B, HERA, FGF-2, C-MET, Thyroid Transcription Factor, Bcl-2, N-Cadherin, EGFR, Glut-1, ER-related(p29), MAGE-3 및 Glut-3에서 선택된 지표들을 포함한다. 가장 바람직한 패널은 발현 변화가 종양시편의 85%이상 발생하는 분자 지표를 포함하는 것이다. 전형적인 패널은 Glut-1, HERA, Muc-1, Telmerase, VEGF, HGF, FGF, E-Caldherin, cyclin A, EGF Receptor, Bcl-2, cyclin D1, 및 N-Cadherin에서 선택된 분자 지표들을 포함한다. Rb 및 E-cadherin를 제외하고는 폐암 진단은 지표 발현의 증가와 관련된다. 본 실시예에서 사용되는 프로브/지표의 라이브러리의 간단한 기재는 하기 표 4에서 제공한다. 하기 표에서 항체의 번호는 본 실시예에 걸쳐 항체/프로브/지표의 번호와 일치한다.

바람직한 패널에서 각 분자의 지표는 하기에 나타낸다. 폐암의 각 형태의 조직에서 지표의 발현 퍼센트를 나타내는 표 5는 이 부분의 끝에 제공한다.

Glucose Transporter Protein(Glut 1 및 Glut 3)

Glucose Transporter-1(Glut 1) 및 Glucose Transporter-3(Glut 3)은 편재하도록 발현되는 높은 친화성을 갖는 글루코스 전달체이다. 종종 종양 세포들은 보통 세포보다 높은 호흡율, 글루코스 이용율, 및 글루코스 대사율을 나타내며, 종양 세포에서 글루코스의 상승 이용율은 글루코스 전달체에 의한 중개로 인한 것으로 여겨진다. GLUT isoform의 명백한 형태의 과발현(overexpression)이 폐암으로 보고되어 졌다. Glut 1의 세포 위치는 세포 박막에 있다. Glut 1 및 Glut 3은 질병상태의 진단에 유용한 질병 지표들이다.

악성 종양은 Glucose Transporter Protein(Gluts)과에 의해 전달되어 나타나는 글루코스 이용율의 증가율로 나타난다. 암유전자 및 성장 인자들은 활성 뿐만 아니라 상기 단백질의 발현이 조절되는 것으로 나타난다. 단밸질의 Glut 과들은 다양한 사람 조직에서 분배의 다양한 패턴을 나타내고, 빠른 분열(proliferation)은 과발현과 관련된 것이다. 최근 자료는 Glut 1는 NSCLS의 대부분 및 SCLC의 대부분에 의해 발현되는 것으로 제안한다.

Glut 3의 발현이 NSCLS 및 SCLC에서 상대적으로 낮게 나타나는 반면, 대세포암의 큰 퍼센트(39.5%)는 단백질로 발현한다. stageⅠ종양에서 환자의 25% 중 세포염색의 75~100%의 범위로 83%가 Glut 1으로 발현한다. 이러한 데이터는 Glut 1 과발현이 종양 진행에 비교적 조기에 나타나는 사건임을 나타내는 것이다. 또한, Glut 1 면역반응성(immunoreactivity)은 stage Ⅱ 및 ⅢA 암의 90%이상에서 관측된다. 또한, Glut 1 및 Glut 1 면역반응성(immunoreactivity) 및 종양 분화사이에는 역 상호관계를 갖는 것으로 나타난다. Glut 1의 높은 수준으로 발현하는 종양은 저조한 예후와 관련된 것으로 나타난다. 종양이 음성인 환자이 경우가 생존율이 더 높은 거으로 나타난다.

Human Epithelial Related Antigen(HERA)

HERA는 아직 밝혀지지 않은 작용을 갖는 당단백질이다. HERA는 보통 상피 및 악성 상피에 존재한다. 최근 연구는 HERA 발현이 관측 지표로 유용한 NSCLC의 모든 조직형태에서 높은 것으로 제안한다. 반대로, HERA 발현은 중피종(mesothelioma)에는 없으며, 따라서 판별 지표로 유용성을 갖고 있는 것으로 제안하고 있다. HERA의 세포 위치는 세포 표면이다.

Basic Fibroblast Growth factor(FGF)

Basic Fibroblast Growth factor(FGF)는 헤파린(heparin) 및 다른 글루코스아미노글리칸(glycosaminoglycans)에 높은 친화성을 갖는 폴리펩티드 성장인자이다. 암에서 세포성장촉진제(potent mitogen)로서 FGF 기능은 혈관신생 (angiogenesis), 분화, 및 분열에서 작용하고, 종양 진행 및 전이(metastasis)에 관여한다. FGF의 과발현은 SCLC 및 편평세포암에서 종종 발생한다. 또한, 많은 경우(62%)에 세포는 autocrine loop의 존재를 알리는 FGF receptor로 발현한다.stage Ⅰ종양의 48%가 FGF로 과발현한다. stage Ⅱ 폐암에서 FGF의 빈도는 84%이다. 성장인자 또는 리셉터의 발현은 낮은 예후와 관련된다. FGF이 음성인 사람들이 80%에 대하여 FGF를 발현하는 사람에서 stage Ⅰ 질병을 갖는 환자들의 5년 생존율은 73%였다. 세포 위치는 세포막이다.

Telmerase

Telmerasesms은 진핵 크로모좀(eukaryotic chromosome)의 telmeres을 유지하는 리보핵단백질(ribonucleoprotein) 효소이다. 이는 역 전사효소(transcriptase)활성을 갖는 촉매단백질 서브유닛(subunit), 역 전사효소 활성을 갖는 RNA 서브유닛 및 telmerase 확장에 템플릿(template)으로 제공하는 RNA 서브유닛으로 이루어진다. telmerase로 발현하지 않는 세포들은 chromosomal instability를 발생시키는 각 세포분할, 세포 노화 및 사멸로 telmerase가 성공적으로 단축된다. telmerase의 세포위치는 핵이다.

telmerase의 발현은 영구적인 세포에서 발생하는 것으로 나타나고, 효소활성은 악성 표현형의 일반적인 특징이다. 폐 종양의 약 80~94%는 높은 수준의 telmerase 활성을 갖는 것으로 나타난다. 게다가, 증생(hyperplasia)의 71%, 변질 (metaplasia)의 80% 및 형성이상(dysplasia)의 82%가 효소활성으로 발현한다. 모든 암종의 본질내 시편은 효소활성을 나타낸다. 전암성(premaligant) 조직에서 발현의 낮은 수준은 시료중 세포의 낮은 퍼센트(5 내지 20%)가 효소활성으로 발현하는 사실과 관련된다. 이는 세포의 20~60%가 효소 활성으로 발현되는 종양과 반대되는 것이다. 또한, 시료의 제한적인 수에 기초하여 telmerase 활성의 발현은 SCLC에서 일반적으로 나타내는 것이다.

Proliferating Cell Nuclear Antigen(PCNA)

PCNA는 DNA 중합효소(polymerase) 델타의 보조인자로 작용한다. PCNA는 세포순환의 S 상 및 DNA 회복(repair)와 관련된 DNA 합성기간 동안에 발현된다. PCNA는 보통 및 악성 종양의 넒은 범위에서 세포 분열로 발현된다. PCNA의 세포위치는 핵이다.

PCNA의 발현은 세포가 급속히 분열되는 세포의 일반적인 특징이며, 종양의 98%에서 관측된다. 면역조직화학적 염색(immunohistochemical staining)은 NSCLC의 83%에서 관측되는 강한 염색에 적당한 핵이다. 강한 PCNA 염색은 p-53 음성 종양의 51%에서 관측된다. 그러나, PCNA(50%이하의 세포염색) 및 p-53이 과발현(10%이하의 세포염색)될 때, 예후는 진행에 시간이 점점 짧아지면서 약해지는 경향이 있다. 폐암의 모든 단계에서 종종 관측되기는 하지만, PCNA을 위한 강한 염색은 전이성 질병에 일반적이다. 또한, CIS의 31%가 PCNA로 발현한다.

CD44

CD44v6는 세포유착물질(cell adhesion molecule)로 작용하는 세포표면 당단백질이다. 이는 상피(epithelial), 중피(mesothelial) 및 조혈(hematopoietic) 조직에서 보통 및 악성세포의 넓은 범위에서 발현된다. 특정 CD44 접합 변형의 발현은 전이 및 인간 악성종양의 낮은 예후와 관련된 것으로 나타난다. 이는 편평세포암 및 선암의 관측 및 구별에 유용할 것으로 기대된다. CD44는 종양침해 및 전이에 작용하는 세포유착물질이다. 스피리싱(splicing)은 여러 변형 이소폼(isoform)의발현으로 나타난다. 일반적으로 CD44 발현은 SCLC에서 부족하고 NSCLC에서 다양하게 발현된다. 발현의 최고 수준은 편형세포암에서 발생하므로, 종양 형태를 구별하는데 가치있는 일이다. 비종양 조직에서, CD44 염색은 기관지 상피세포, 대식세포 (macrophages), 림프구증가(lympocytes) 및 alveolar pneumocytes에서 관측된다. 과발현이 조기 질병단계에 발현될 경우, CD44 발현과 종양 단계, 재발생 또는 생존율 사이의 중요한 상관관계는 없다. 전이성 병부에서, 편평세포암의 100% 및 선암의 75%는 강한 CD44v6 양성을 나타낸다. 상기 데이타는 CD44 발현의 변화가 조기 관측 지표로 가치를 제한할 수 있는 종양 전이에서 비교적 늦게 나타날 수 있음을 가리키는 것이다. 최근 발견은 CD44v8-10 변수가 지표가 될 수 있는 NSCLC의 대부분에 의해 발현되는 것으로 제안한다.

Cyclin A

Cyclin A는 세포 순환의 특이 상에서 전이점을 조절하는 cyclin dependent kinases(CDK's)의 조절 서브유닛이다. 이는 S 상 및 진행과정에서 G2 상으로 관측된다. Cyclin A의 세포위치는 핵이다.

cyclin 및 cyclin dependent kinases으로 이루어진 단백질 복합체는 세포순환 진행을 조절하는 작용을 한다. cyclin 발현에서 변화는 CCDN1 유전자에 영향을 미티는 유전적 변이와 관련된다. cyclin이 조절물질(regulatory molecule)로 작용하는 반면, cyclin dependent kinases는 Rb를 활성 및 비활성시키는 촉매 서브유닛으로 작용한다.

면역조직화학적 분석은 cyclin의 과발현은 높은 Ki-67 labeling index로 나타내어지는 세포분열의 증가와 관련된 것으로 나타낸다. cyclin 과발현은 NSCLC의 75%에서 발생하고, 종양 진행의 비교적 초기에 발생하는 것으로 나타난다. 최근 연구는 stage Ⅰ/Ⅱ 종양의 66.7% 및 stage Ⅲ 종양의 70.9%가 Cyclin A로 과발현하는 것으로 나타난다. 핵염색은 저조하게 분화된 종양에 일반적이다. Cyclin A의 발현은 생존시간의 감소 및 약제내성(drug resistance)의 증가하는 경향과 관련된다. 그러나, 증가되는 발현은 doxorubicin에 대한 반응의 증가와 관련되어 있다.

Cyclin D1

Cyclin A와 마찬가지로, Cyclin D1은 세포 순환의 특이 상에서 전이점을 조절하는 cyclin dependent kinases(CDK's)의 조절 서브유닛이다. Cyclin D1은 세포순환의 S상으로 세포들의 출입을 조절한다. 상기 유전자는 확대 및/또는 종종 인간의 악성종양의 넓은 범위에서 발현이 불규칙적으로 된다. Cyclin D1의 세포위치는 핵이다.

Cyclin A와 마찬가지로, Cyclin D1은 세포순환 진행을 조절하는 작용을 한다. Cyclin D1의 염색은 세포질에 우세적이고 조직형태에 독립적이다. 연구는 Cyclin D1 발현이 NSCLC의 40~70% 및 SCLC의 80%에서 발생하는 것으로 밝힌다. Cyclin D1의 염색은 stage Ⅰ의 37.9%, stage Ⅱ의 60% 및 stage Ⅲ 종양의 57.9%에서 관측되는 것으로 나타났다. 또한, Cyclin D1 발현은 상기 변화가 종양진행세 비교적 조기에 발생하는 증거로 제공되는 형성이상 및 과형성(hyperplastic) 조직에서 관측되어진다. Cyclin D1이 과발현하는 환자들은 생존시간이 짧아지고 5년 생존율이 낮아짐을 나타낸다.

Hepatocyte Growth factor Receptor(C-MET)

C-MET는 HGF의 막관통 수용체 티로신 키나제(transmembrane receptor tyrosine kinase)를 암호화하는 원형 암유전자(proto-oncogene)이다. HGF는 간세포 (hepatocyte) 및 내피세포(endothelial cell)의 마이토젠(mitogen)이며, 상피세포의 여러 세포형태에 다형질 발현(pleitrophic)의 활성에 영향을 미친다. C-MET의 세포위치는 세포 표면이다.

간세포 성장인자/분산인자(HGF/SF)는 분열, 이동 및 혈관신생을 포함하는 복잡한 분화(differentiation)의 수행을 야기하는 상피세포의 넓은 스펙트럼을 자극한다. HGF/SF는 C-MET 발암유전자에 의해 암호화된 수용체에 결합되어 있다. 보통 및 악성 조직 모두는 HGF 수용체로 발현되는 반면, HGF/SF의 발현은 악성 조직에서 한정되어 나타난다.

일반적으로 인간 폐는 HGF/SF의 낮은 수준으로 발현하는 반면, NSCLC에서는 발현이 증가한다. Western blot analysis을 사용하여 폐암의 88.5%가 단백질 발현이 증가하는 것으로 나타났다. 종양의 모든 조직형태는 증가된 농도에서 단백질로 발현하였다. 질병의 모든 단계에서 단백질의 증가가 발생하는 반면, 최근 연구에서는 암세포, 지방전구세포(stromal cell) 및/또는 염증세포의 첨가로 성장인자 생산을 반응된다고 제안한다.

Mucin-MUC-1

MUC-1은 기관지계(tracheobronchial), 소화기계통(gastrointestinal), 비뇨계계(genitourinary)를 보호하는 점액젤의 구성성분인 단백질로 이루어진 글리코실레이트화 분비단백질(secretory protein)에서 유래한다. MUC-1의 세포 위치는 세포질 및 세포표면이다.

뮤신(Mucin)은 세포막에 접합되거나 분비되는 다양한 분비상피세포에 의해 합성되는 고분자 당단백질(glycoprotein)과이다. 호흡기내에서, 상기 단백질들은 기관기계통을 보호하는 점액성 젤을 제공한다. 일반적으로 뮤신발현에서 변화는 폐암을 포함한 악성 변질과 접합되어 발생한다. 상기 변화는 세포성장조절, 면역시스템에 의한 인지(recognition) 및 종양의 전이능력(metastatic potential)에 변조(alteration)를 제공하는 것으로 나타난다.

일반적인 폐 조직이 MUC-1으로 발현하지만, 발현의 높은 수준은 선암에서 나타나는 최고 수준의 폐암에서 나타난다. 염색은 단계와는 독립적으로 나타나고, 과거 흡연자 또는 비흡연자 보다 흡연자에서 보다 일반적으로 발생한다. 또한, 전암상태(premalignant) 병부에서도 MUC-1의 발현이 증가되는 것으로 나타난다.

Thyroid Transcription Factor-1(TTF-1)

TTF-1는 티로이드-특이성 및 폐(pulmonary)-특이성 분화유전자를 활성화하는 homeodomain 전사(transcription)인자 과에 속한다. TTF-1의 세포위치는 핵이다.

TTF-1는 기원적으로 티로글로부린(thyroglobulin)의 전사를 중재하는 단백질이다. 최근, TTF-1 발현도 간뇌(diencephalon) 및 bronchioloalveolar 상피조직에서 발견되었다. 폐내에서 TTF-1는 surfactant 단백질 및 클라라(clara) 분비단백질의 합성을 조절하는 전사인자로 작용한다. TTF-1의 과발현은 페 선암의 대부분에서 발생하고, 초기 폐암 및 폐로 전이하는 암을 구별하는데 이용할 수 있다. TTF-1로발현하고 양성 시토케라틴(cytokeratin 7) 및 음성 시토케라틴 20인 선암은 95%의 감도로 관측될 수 있다.

Vascular Emdothelial Growth Factor(VEGF)

VEGF는 종양 진행 및 전이를 촉진하는 혈관신생에서 중요한 역할을 한다. VEGF의 여러 형태가 있으며; 두개의 작은 이소폼(isoform)은 분비된 단백질이고 확산제로 활동하며, 나머지 큰 두개의 세포는 결합되어 있다. VEGF의 세포위치는 세포질, 세포표면 및 세포밖 기질이다.

Vascular Emdothelial Growth Factor(VEGF)는 중요한 혈관신생 인자이고, 내피세포-특이성 미토겐이다. 혈관신생은 발암의 마지막 단계, 종양 진행에서 중요한 과정이며, 특히 오랜 전이의 발전에 중요하다. VEGF는 autocrine 고리(loop)의 존재를 제안하는 종양발현 성장인자에서 종종 존재하는 Flt 특이 수용체에 결합한다.

면역화학적 분석은 VEGF로 발현하는 세포는 분화되고 세포질의 염색 패턴을 나타내는 것으로 나타낸다. 비종양 세포에 의해 발현되지 않을 경우, VEGF는 NSCLC에 대부분 존재하고 SCLC에는 소량 존재한다. 여러 보고서에서 폐암의 조긴단계에서 VEGF가 높은 수준으 나타난 것으로 기재하고 있다.

VEGF의 발현은 전이의 증가된 빈도와 관련되어 있다. 연구들은 VEGF 발현은 저조한 예후 및 편평세포암이 아닌 선암에서 질병이 없는 기간이 짧아짐을 나타낸다고 보고하였다. VEGF가 높은 수준으로 발현하는 그룹에서 3년 및 5년 생존율은 VEGF가 낮은 수준인 그룹에서 각각 90.9% 및 77.9%인 것과 비교하여 50% 및 16.7%였다.

Epidermal Growth Factor Receptor(EGFR)

Epidermal Growth Factor Receptor(EGFR)은 다양한 리간드에 의해 결합되고 활성화될 수 있는 투과막(transmembrane) 당단백질이다. 결합은 DNA 합성, 세포 분열 및 세포분화의 결과인 사슬로 시작한다. EGFR는 일반 조직에서 넓은 스펙트럼으로 설명되어졌으며, EGFR 과발현은 여러 종양에서 발견되어진다. 증가된 발현은 소세포성 폐암이 아니라 폐의 선암 및 대세포암에서 발견되어 졌다. EGFR의 세포위치는 세포 표면이다.

EGFR는 세포성장 및 분화에 중요한 역할을 한다. EGFR는 기관지 상피조직의 표면층이 아니라, 기저세포(basal cell)에 균일하게 존재한다. 상기를 제외하고는, 일반조직의 염색은 존재하지 않는다. 최근 연구에서는 EGFR 수용체의 과발현은 폐암의 발전에 절대적으로 요구되는 조건은 아니라고 주장하고 있다. 그러나, EGFR 과발현이 발생하는 경우 질병이 진행된 경우의 염색강도보다 더 크게 비교적 조기에 발생함을 나타낸다.

치명적인 암을 갖고 있는 환자에게는 종양의 50~77%가 EGF로 염색한다. EGFR의 과발현은 선암에서 보다 편평세포암에서 보다 일반적이며, SCLC에서 일반적이다. EGFR의 최고 수준은 stage Ⅰ/Ⅱ 종양에서 보여진 EGFR의 약 2배 농도를 갖는 마지막 단계 및 전이성 질병과 관련하여 발생한다. 평가들은 stage Ⅰ종양에서 관측된 EGFR의 수준은 일반 조직에서 관측된 것보다 약 2배정도라고 주장한다. 게다가, 기관지 손상의 48%는 변질(metaplasia), 이형성(atypia), 상피이형증 (Displasia) 및 CIS를 함유하는 EGFR 염색을 나타낸다. 동일한 암 환자의 "보통"기관지 점막(mucosa)에서, EGFR의 과발현은 환자의 39%에서 관측되었지만, 비-암의 기관지 상피조직에서는 발견되지 않았다. 게다가, EGFR의 과발현은 비흡연자보다 흡연자의 종양에서, 특히 편평세포암의 경우에서 보다 빈번하게 발생한다.

여러 연구에서 EGFR의 과발현은 저조한 예후와 관련된 것으로 주장하는 반면, 다른 연구에서는 상기 상호관계를 규명하는데 실패하였다.

Nucleoside Diphosphate Kinase/nm23

Nucleoside Diphosphate Kinase(NDP kinase)/nm23은 nucleoside diphosphate kinase이다. 높은 전이능력을 갖는 종양세포는 nm23 단백질의 낮은 함량을 나타내거나 부족하므로, nm23 단백질은 전이 억제(suppressor) 단백질로 기재되어 왔다. nm23의 세포위치는 핵 및 세포질이다.

nm23/nucleoside diphosphate/kinase A(nm23)의 발현은 발현 및 전이능력의 역 관계인 종양 전이의 지표이다. stage Ⅰ종양이 nm23으로 과발현할 경우, 평균 35달동안 전이의 증거는 발견되지 않았다. 면역조직화학적 분석으로 분화하고 세포질 및 일반적으로 악성 세포로 한정된 염색으로 알려졌다. 또한, 폐포큰포식세포 (alveolar macrophage)는 단백질로 발현한다. 발현의 높은 수준은 저(low) 전이능력과 관련되어 있으며, 현재로는 보통의 상피세포에서 nm23으로 발현하지 않는지에 대한 설명을 할 수 없다.

강한 염색은 NSCLC의 높은 퍼센트에서 관측되었으며, 특히 대세포암 및 SCLC의 74%에서 관측되어 상기 단백질은 종양 진행에 중요한 역할을 하고 있음을 나타낸다. 편평세포암을 제외하고는, 염색강도는 단계의 증가에 영향을 미친다. nm23은SCLC 및 NSCLC 모두에서 예후 인자임을 나타내는 것이다.

Bcl-2

Bcl-2는 사멸(apoptosis)의 억제에 중심 역할을 하는 미토콘드리아 박막 단백질(membrane protein)이다. bcl-2의 과발현은 예정된 세포 사멸(Programmed Cell Death)이 저지된 세포의 일반적인 특징이다. Bcl-2의 세포위치는 세포표면이다.

Bcl-2는 세포의 분화, 비순환세포의 생존 연장 및 순환세포에서 사멸 방어를 촉진하는데 중요한 역할을 하는 것으로 여겨지는 발암유전자이다. Bcl-2는 Bax와 동형이합체(homodimer)로 존재하거나, Bax와 이형이합체(heterodimer)로 형성할 수 있다. 동형이합체로, Bax는 사멸을 유발하도록 하는 작용을 한다. 그러나, Bax-bcl-2 복합체의 형성은 사멸을 방어한다. 사멸의 방어에 의해, bcl-2 발현은 영향받는 세포에 생존 이득을 주는 것으로 나타난다. 또한, bcl-2 발현은 약제내성의 발전에 중요한 역할을 한다. bcl-2의 발현은 p53에 의해 음성적으로 조절된다.

bcl-2의 면역조직화학적 분석은 세포질 염색의 이형유전적 패턴을 나타낸다. 선암에서, bcl-2의 발현은 소 종양(〈2㎝) 및 저 증식(proliferative)활성과 중요한 관련이 있다. bcl-2의 발현은 신경내분비(neuroendocrine)의 분화와 밀접하게 관련된고, SCLC의 대부분에서 발생하는 것으로 나타난다.

bcl-2의 과발현은 bcl-2의 변화가 종양진행에 상대적으로 늦게 발생하는 것을 제시하는 전암병변(preneoplastic lesion)에 존재하는 것이 아니다. 또한, 종암 세포에 첨가하여 bcl-2 면역 염색은 기저세포 및 일반 기관지의 내강표면(luminal surface)에서 발생하고, 일반적으로 분화된 세포 형태에서 관측되지 않는다.

NSCLC에서 진보된 예후와 bcl-2의 면역활성과 관련은 논쟁적이다. bcl-2 발현하는 종양을 갖는 환자들이 우세한 예후 및 재발에 장시간이 걸린다는 것을 제시하는 여러 보고들이 있다. 여러 보고들은 bcl-2 발현은 전이성 질병으로 발전하는 환자들에게 더 낮아지는 경향이 있다고 지적한다. 편평세포암을 갖는 환자들은 bcl-2의 발현이 5년 생존율의 향상과 관련이 있다. 그러나, 세개의 큰 연구들은 특히 조기 단계의 질병을 갖는 환자들에게는 bcl-2 발현이 생존율과 연관이 없다고 나타낸다.

Estrogen Receptor-related Protein(p29)

단백질 p29와 관련된 ER은 에스트로겐-수용체의 발현과 상호관련있는 것으로 발견되어진 에스트로겐 관련 열충격단백질(Heat Shock Protein)이다. p29의 세포위치는 세포질이다.

에스트로겐-종속 세포내 과정은 일반 조직의 성장조절에 중요하며 악성종양의 조절에 중요한 역할을 한다. 한 연구에서 p29의 발현은 111 폐암 중 109(98%)에서 발견되었다. p29 발현과 생존 시간사이의 관계는 여성과 남성의 경우가 상이하였다. p29이 발현은 특히 stage Ⅰ/Ⅱ 질병을 갖는 여성의 경우 저조한 생존과 관련이 있었다. 남성의 경우는 p29 발현과 장기간 생존율사이에는 상호관련이 없었다.

Retinoblastoma Gene Product(Rb)

Retinoblastoma Gene Product(Rb)은 핵 DNA-결합 인단백질(phosphoprotein)이다. 인산화된 Rb는 DNA 종양 바이러스의 암단백질(oncoprotein) 및 유전자 조절단백질과 결합하여 DNA 복제를 억제한다. Rb 단백질은 전이 조절로 활동하고; Rb 기능의 손실은 세포성장을 조절하지 못하게된다. Rb의 세포위치는 핵이다.

Retinoblastoma protein(pRb)은 망막아세포 유전자에 의해 암호화되는 단백질이고 세포순환 종속적 방식으로 인산화 및 탈인산화된다. pRb는 G0/G1에서 세포순환을 조절하는 기능을 하는 중요한 종양 억제 유전자로 간주된다. 저인산화상태에서, pRb는 G1으로부터 S로 전이되는 것을 억제한다. G1에서 pRb의 성장억제성의 비활성은 cyclin dependent kinases(CDK's)가 단백질로 인산화할때 발생한다. pRb의 저인산화는 DNA합성에 요구되는 전이인자 단백질로 작용하는 E2F와 복합체를 형성하는 것을 억제한다.

Retinoblastoma(Rb) 유전자의 비활성은 폐암을 포함하여 암의 다양한 형태에서 입증되어졌다. 소세포암은 Rb 기능의 손실을 지적하는 pRb의 염색에 실패하였다. 전체적으로, 종양의 17.6%가 단계 또는 중심상태에 관련하여 나타나는 상호관계와 아무런 관련없이 pRb 발현은 실패하였다. 또한, 염색의 감소는 31% 형성이상 기관지 생체검사에서 발견되었다. 그러나, pRb 발현과 형성이상의 엄정사이에는 상호관련이 없는것으로 드러났다. 반대로, 보통의 기관지 상피세포 및 종양에 근접한 부근의 세포들은 pRb 양성 핵으로 발현하였다. 상기 결과는 Rb 단백질 발현의 변조가 폐암의 발전에 조기에 발생하는 것을 제시한다.

Rb 양성 암을 갖는 환자들은 차이는 크지 않지만 약간 큰 예후를 갖고 있는 경향이 있다. 그러나, pRb 음성 및 p53 또는 라스(ras) 양성 종양인 선암을 갖는 환자들은 5년 생존율이 감소하는 것으로 나타난다. 유사한 관계는 편평세포암에서는 발생하지 않는다. pRb 음성종양은 pRb 양성종양보다 독소루비신(doxorubicin)에 좀 더 강한 저항성을 갖는 것으로 보고되었다.

Thrombomodulin

Thrombomodulin은 투과박막 당단백질이다. 단백질 C(단백질 S 및 트롬빈에 결합되어 anticoagulant로 작용하는)의 활성이 가속되지만, TM의 합성은 내피세포 표면에서 클로트(clot) 형성을 감소하는데 중요한 여러 메카니즘 중 하나이다. 트롬보모듈린(Thrombomodulin)의 세포위치는 세포표면이다.

종양세포의 순환에 의한 혈소판의 집합은 전이과정에 중용한 역할을 하는 것으로 나타난다. 트롬보모듈린은 트롬빈에 의한 anticoagulant 단백질 C의 활성에 중요한 역할을 하고, 혈관내 응결(intravascular coagulation)의 중요한 조절자이다. 보통의 편평상피(squamous epithelium)에서 발현에 더하여, 트롬보모듈린의 발현은 편평 변질, 암 내, 및 편평세포암에서 발생한다. 초기 편평암세포의 74%에 존재하지만, 변질 변부의 44%만이 트롬보모듈린에 염색된다. 상기 결과는 진행과정에서 트롬보모듈린 발현이 감소함을 나타낸다. 발현의 높은 수준은 저조하게 분화된 종양과 비교할 경우, 적절하게 잘 분화된 종양에서 발생하는 경향이 있다.

트롬보모듈린-음성 편평세포암을 갖는 환자들은 나쁜 예후를 갖는 경향이 있다. 단백질에 양성으로 염색된 종양을 갖는 환자들이 60%인것과 비교하여 트롬보모듈린-음성을 갖는 환자의 18%만이 5년 생존율을 나타낸다. 또한, 전이성 질병으로의 진행은 트롬보모듈린-음성 종양에 보다 일반적(69% vs. 37%)이고, 상기 종양이 흉곽외 부위에서 발전하는 경향이 크다. 따라서, 트롬보모듈린 발현의 손실은 편평세포암 환자에서 예후가 나타난다. 트롬보모듈린 발현에서 변화가 NSCLC의 마지막 단계에서 발생하고 단백질은 조기진단의 지표로 유용성에 제한적인 경향이 있는 보통 기관지 상피세포에 의해 발현된다. 그러나, 중피종(mesotheliomas)의 대다수 및 선암의 작은 부분이 트롬보모듈린으로 발현하기 때문에, 지표는 상기 종양의 형태사이에서 구별하는데 유용하다.

E-cadherin & N-cadherin

E-cadherin은 투과박막 Ca2+ 종속 세포 유착물질이다. 이는 조직구조의 조절 메카니즘 및 조직 특질의 유지에 의하여 세포의 성장 및 발전에 중요한 역할을 한다. E-cadherin은 상피세포의 세포내 유착, 상피 극성의 성립, 선(glandular) 분화 및 층리(stratification)에 기여한다. E-cadherin 발현의 저-조절은 많은 암에서 관측되고, 일반적으로 진보된 단계 및 진행에 관련된다. E-cadherin의 세포위치는 세포표면이다.

E-cadherin은 칼슘-종속 상피세포 유착물질이다. E-cadherin 발현의 감소는 종양 탈분화(dedifferentiation) 및 전이와 관련되어 있으며, 생존율이 감소한다. 감소된 발현은 적당하게 및 저조하게 분화된 편평세포암 및 SCLC에서 관측되어졌다. 선암에서는 E-cadherin 발현에 변화가 없다. 게다가, 선암은 E-cadherin로 발현하는 반면, 상기 종양은 E-cadherin이 아닌 N-cadherin으로 발현하는 중피종 (mesotheliomas)에 반대되는 N-cadherin으로 발현하는데 실패한다. 따라서, 상기 지표는 선암 및 중피종을 구별하는데 사용할 수 있다.

또한, E-cadherin의 발현은 편평세포암을 갖는 환자들의 예후를 평가하는데사용될 수 있다. E-cadherin으로 발현하는 종양을 갖는 환자 중 60%가 3년간 생존하는 반면, 발현이 감소하는 것으로 나타난 환자의 36%만이 3년을 생존한다.

MAGE-1 및 MAGE-3

Melanoma antigen-1(MAGE-1) 및 Melanoma antigen-3(MAGE-3)은 악성종양에서 발현될 때 자가조직, 종양 및 특정 살상세포(cytotoxic T cells;CTL's)에서 인식되지만, 일반 조직에서는 인식되지 않은 유전자들이다. MAGE-1 및 MAGE-3의 세포위치는 세포질이다.

MAGE-1, MAGE-3 및 MAGE-4 유전자는 살상세포에 의해 인식되는 항원 관련 종양이다. 그 결과, NSCLC에서 면역치료를 위한 지표로 유용성을 갖고 있다. 또한, MAGE 단백질은 일반 세포에 의해서가 아니라 SCLCs에 의해 발현된다. MAGE 발현의 빈도가 감지 지표로 사용하기에 필요한 수준으로 떨어질 경우, 조직 형태사이의 발현 패턴에서 분화는 MAGE 발현은 분화 지표로 유용성을 갖고 있음을 제시한다. 또한, 상기 유용성은 종양 세포의 90% 이상인 편평세포소암의 50%에서 세포 중 최소 50%에서 과발현을 나타내는 종양에 30%로 MAGE-3 과발현이 나타냄을 관측함으로써 뒷받침된다.

Nucleolar Protein(p120)

p120은(증식 관련 핵 항원)은 초기 G1 단계동안 급속히 증식하는 핵 세포에서 발견된다. p120의 세포위치는 핵이다. 핵산 단백질(Nucleolar Protein) p120은 아직 규명되지 않은 기능을 갖는 증식 관련 단백질이다. 강한 염색은 대식세포 또는 일반 조직에서가 아니라 종양 조직에서 관측되어진다. p120의 과발현은 선암 또는 대식세포암 보다 편평세포암에서 일반적이므로, 종양 형태를 구별하는데 유용한 지표가 된다.

Pulmonary Surfactants

Pulmonary Surfactants는 폐포(alveolar) 액상계면에서 표면장력을 감소시키는 작용을 하는 인지질 혼합물이므로, 환기를 위해 필요한 폐포 안정성을 제공한다. surfactant 단백질은 통풍로에서 유일하게 발현하는 것으로 나타나며, alveolar 형 Ⅱ세포에 의해 생산되어진다. 비-종양 폐에서, 프로-surfactant-B 면역활성도는 일반적 및 증식 alveolar 형 Ⅱ세포, 및 비-섬모충 기관상피 세포에서 관측된다. 선암의 60%는 환자의 대다수가 염색을 나타내는 종양 세포의 10~50%에서 강한 세포질 면역활성을 함유한다. 편평세포암 및 대세포암은 프로-surfactant-B에 염색에 실패하였다.

Surfactant Apoprotein B(SP-B)는 폐포세포 Ⅱ에 의해 분비되는 인지질 및 단백질 복합체이고, Pulmonary Surfactant를 구성하는 4개의 소수성 단백질 중 하나이다. 폐의 편평세포 및 대세포암 및 비폐성 선암은 SP-B로 발현하지 않는다. SP-B의 세포위치는 세포질이다.

SP-A는 종결 말미에서 붕괴로부터 폐포(alveoli)를 유지하는 중요한 역할을 하는 Pulmonary Surfactant 단백질이다. SP-A는 plumonary 폐포 상피세포(typeⅡ pneumocytes)의 유일한 분화지표이며; 항원은 종양단계에서 유지된다. SP-A의 세포위치는 세포질이다.

Pulmonary Surfactant A는 뮤신 형태에 나타나지 않는 것과 비교하여 비-뮤신 기관지 폐포성암에 100% 염색으로 특이성을 나타낸다. Pulmonary Surfactant 능력은 폐로 전이되는 다른 암으로부터 폐암을 구별하는데 유용성을 갖고 있다. 폐암 세포에 더하여, 비-종양 pheumocytes는 Pulmonary Surfactant A에 염색된다. Pulmonary Surfactant A에 염색되는 Pulmonary Surfactant B는 NSCLC 또는 SCLC의 다른 형태가 아니라 선암에서 상대적으로 일반적이다.

또한, 중피종은 Pulmonary Surfactant A가 선암 및 중피종에 구별하는데 유용성을 갖는 제안을 하는 Pulmonary Surfactant A로 발현하는데 실패한다.

Ki-67

Ki-67은 증식 일반 세포 및 종양세포에서 발현되고, quiescent 세포에서 저-조절되는 핵산 단백질이다. 세포순환에서 G1, S, G2 및 M 단계에서 존재하고, G0 단계에는 존재하지 않는다. 일반적으로 증식의 지표로 사용하며, Ki-67의 세포위치는 핵이다.

a. 적당한 크기의 지표 라이브러리를 얻는 방법

예비 삭감(pruning) 단계는 폐암과 관련된 지표의 적당한 크기의 라이브러리를 얻기위해 요구된다. 폐암과 관련된 100개 이상의 지표들이 문헌에 공개되어 있다. 문헌에서 확인되고 패널 테스트에 능력으로 평가된 프로브의 부분적인 리스트는 하기의 항체들을 함유한다: bax, Bcl-2, c-MET(HEFr), CD44S, CD44v4, CD44v5, CD44v6, c아2 kinase, CEA(carcino-embryonic antigen), Cyclin A, Cyclin D1(bcl-1), E-cadherin, EGFR, ER-related(p29), erbB-1, erbB-2, FGF-2(bFGF), FOS,Glut-1, Glut-2, Glut-3, Glut-4, Glut-5, HERA(MOC-31), HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-51, interin VLA2, interin VLA3, interin VLA6, JUN, keratin 7, keratin 8, keratin 10, keratin 13, keratin 14, keratin 16, keratin 17, keratin 18, keratin 19, A형 lamins(A;C), B형 lamin(B1;B2), MAGE-1, MAGE-1, MAGE-3, MAGE-4, melanima-관련 항체 클론 NKI/C3, mdm2, mib-1(Ki-67), mucin 1(MUC-1), mucin 1(MUC-1), mucin 1(MUC-1), mucin 1(MUC-1), mucin 2(MUC-2), mucin 3(MUC-3), mucin 4(MUC-4), MYC, N-cadherin, NCAM(neural cell adhesion molecule), nm120, p120, p16, p27, p53, P-cadherin, PCNA, Retinoblastoma, SP-A, SP-B, Telombomodulin, Thyroid Transcription Factor, VEGF, vimenti 및 wafl. 지표들의 초기 리스트는 조기단계 암세포를 감지하는 프로브의 효율성을 평가하고, 상이한 암 단계의 세포들을 구분하고, 목표 암세포에 라벨을 배치한것에 의해 프루닝(pruning)되어진다. 지표들의 리스트는 생산이나 얻기가 어렵기 때문에 실용성이 감소된 지표들을 제거하여 감지 기술적 요건이나 저조한 재생산성에 적절하지 않다. 프룬(prune) 단계의 모두가 완료된 후, 27개 지표의 라이브러리가 얻어졌다.

b. 프로토콜(protocol)를 최적화 및 표준지침(Goldstandard) 폐암 시료를 얻는 단계.

예비 제조단계는 패널을 얻기 전에 요구되어졌다. 적절한 라벨을 함유하는 프로브는 상업적인 벤더로부터 얻어졌다. 프로브의 프로토콜은 최적의 목적하는 양질의 관찰을 위해 분석되어졌다. 구체적인 예로, PCNA의 농도는 매우 낮게 결정되어졌다. 근본적으로, PCNA는 S809 버퍼에서 1:4000으로 희석되어졌다. 2차 희석액은 S809에서 1:3200로 제조되어졌다. 각 지표의 최적화된 프로토콜은 하기에 나타낸다. 2차 컬럼은 "항체 이름(antibody name)으로 라벨되어진다. MOC-31를 제외하고는, 상기 리스트에서 프로브는 벤더의 대다수가 지표 이름에 의한 항체로부터 나오는 것이기 때문에 지표이름으로 리스트된다. 상기 시약들은 선택적 방법, 예를 들면 anti-VEGF, anti-Thrombomodulin, anti-CD44v6 등으로 리스트되어진다.

표준지침 조직 시표들은 UCLA로 얻어졌다. 조직 시편은 2개의 소스로부터 얻어졌다. hematoxylin 및 eosin(H&E) 및 clinical history의 리뷰를 포함한 표준 과정을 사용하여 환자들을 진단하여왔다. 시편 슬라이드는 의학 진단 및 항체 지표에 대한 병리학자 연구와 결합되고, 환자의 신뢰성을 보호하기 위해 임의의 것들을 코드화하였다.

발암 및 비 발암(대조군)의 조직부분의 시편 슬라이들을 사용하였다. 환자 175명 전체를 분석하였다. 이와 같은 조건에서 진단을 하여 표 6에 나타내었다.

c. 분자 지표 패널의 발현 수준 결정(determination of the level of expression of the panel molecular markers)

충분한 시편 슬라이드는 각 슬라으드당 단지 한개의 프로브를 테스트하기 위해 각 환자에게서 제조하였다. 일반적으로, 특정 분자지표에서 직접적인 한개 이상의 프로브와 접촉된 세포 시료를 함유하도록 현미경 슬라이드를 준비하였다. 독립적으로, 각 병리학자들은 각 환자들을 진단하기 위해 H&E 염색 슬라이드를 연구하고, 각 프로브 반응을 관찰하여 면역화학적으로 염색된 슬라이드로 프로브 바인딩을 평가하여 표준 결과로 기록하였다.

일반적인 설명에서, 면역조직화학적 염색은 포르말린, paraffin embedded (FFPE) 조직에서 수행하였다. 조직 부분을 poly-L-Lysine위에 4 마이크론 두께로 절편하여 상온에서 하룻밤동안 건조하였다. 조직 절편의 deparaffinization 및 재수화(rehydration)를 하기와 같이 수행하였다; 시편 슬라이드로부터 embedding medium의 모두를 제거하기 위해, 두개의 연속적인 크실렌-치환체(Histoclear) 조에 각 5분동안 배양하였다. 모든 액체를 각 3분동안 100%급 알콜 시약의 2개 연속조에 서 배양하기 전에 슬라이드로부터 제거하였다. 다시한번, 각 3분동안 95%급 알콜 시약의 마지막 2개 조에서 배양하기 전에 슬라이드로부터 제거하였다. 95%의 최종 조에 슬라이드를 수돗물로 헹구고 세척 버퍼(DAKO Autostainer Wash Buffer, code S3306의 1:10희석액에 해당하는 0.05% Tween 20를 함유하는 tris-buffered saline 세척버퍼)에 놓았다. 하기 표 7에는 생산 코드 넘버에 대응하는 본 연구에서 사용된 시약들의 리스트를 나타낸다. 연구에 사용된 관측기기는 DAKO En Vision+HRPmose(code K4007) 또는 rabbit(code K4003) 및 LASAB+HRP(code K0690)이었다. 면역측정을 위한 프로토콜은 package insert에 따라 하기와 같다. 키트는 액체 2개 성분 DAB+ 기질 색소원(code K3468)을 함유한다.

폐 조직의 상기 항체들을 최적화하기 위해 예비처리는 중요하다. 효소 소화에 요구되는 항체에 DAKO Proteinase K(code S3020)을 상온에서 5분동안 사용하였다. DAKO Target Retrival Solution(code S 1700) 또는 DAKO High pH Target Retrival Solution을 사용하여 열이 요구되는 항체를 예비처리하고 프로토콜 특성에 따라 20 또는 40분동안 95℃ 수조에서 배양하였다. 다음, 조직 시편을 20분 동안 상온에서 냉각하였다.

deparaffinization, 재수화 및 조직 예비처리 후, 모든 시편들을 내인성 페록시다제 활성을 제거하기 위해 3% 과산화수소 용액에 배양하였다. 비특이성 배경을 최소화하기 위해 FGF 및 Telmerase 두개의 항체에 블로킹 시약을 특이적으로 사용하였다.

하기 표 8에서 보는 바와 같이, 조직 시편들은 희석 primary antibody의 200마이크로리터의 길이로 배양하였다. 표 8에서 지표/항체의 넘버링은 본 명세서에 걸쳐 항체 프로프 및 지표의 넘버링과 일치하는 것이다. 항체에 따라, 정확한 관측기기를 적용하였다. DAKO En Vision+HRP 및 LASAB+HRP의 배양 시간 및 단계를 하기 표 9에 나타내었다. 색깔 반응은 3,3'-디아미노벤지딘(DAB)를 사용하였으며, 반응에서 갈색 침전이 나타났다.

모든 면역염색 슬라이드에 따라 DAKO Hematoxylin(code S3302)에서 3분동안 배양하고 DAKO Mount Mounting Media(S3025)를 사용하여 덮었다. 모든 프로토콜을 IHC 소프트 버전 3.0.2를 사용하여 DAKO Autostainers(serial#'s 3400-6612-03 & 3400-6142R-03)으로 수행하였다.

면역염색이 대조군에 정확히 염색되었는지 조직이 손상되지 않았는지를 결정하기 위해 투과현미경으로 관찰하였다. 슬라이들을 라벨링하고 포장하여 결과 해석을 위해 지정 병리학자에서 전송하였다. 능숙한 병리학자들은 시료에서 암의 형태 또는 다른 병부를 구분하였다. 능숙한 병리학자들은 염색밀도 및 염색된 세포의 비율을 확인하기 위해 지표 프로브의 감도를 평가하였다. 상기 평가는 환자를 위해 결과시트에 입력하였다. 병리학자들은 면역염색에 사용한 종래 진단 및 항체 지표를 잘 알지 못하였다. 각 슬라이드를 최소 2명의 병리학자가 판독하여 결과 수집에기록하였다. 좀더 정확히 하기 위해, 방법들을 2명 또는 3명 병리학자들이 반복적으로 수행하였다. 얻어진 결과들은 입력 실수를 구별하기 위해 확인하였다. 또한, 결과들은 좀더 명학하게 시행하였다.

각 경우에서 27개 이상이 슬라이드를 분석하고, 지표로 염색된 각각은 1~17, 19~28로 코드화하였다. 지표 18(C-MET) 염색은 최적화할 수 없으며, 지표/프로브로 사용될 수 없다. 병리학자 1은 모든 175명 환자들의 슬라이드를 평가하였다. 병리학자 2는 99명 환자들의 슬라이드를 평가하였다. 병리학자 3은 80명 환자들의 슬라이드를 평가하였다.

하기 표 10은 슬라이드당 각 병리학자들이 각 진단을 결과로 나타낸 것이다.

선택된 통계 분석기술을 목적으로, 모두 27개 슬라이드에서 평가된 경우들을 고려해야하는 필요가 있었다. 하기 표 11은 27개의 모든 슬라이드의 결과로부터 완성한 각 진단 결과를 나타낸 것이다.

상기 표로부터, 각 병리학자들이 전체 환자에 대하여 평가한 것을 계산할 수 있었다. 병리학자 1은 119명 환자에서 모두 27개의 슬라이드를 평가하였으며, 병리학자 2는 83명 환자에서 모두 27개 슬라이드를 평가하였다. 병리학자 3은 23명 환자에서 27 슬라이드를 평가하였다.

암 결과의 전체수는 172이다. 이는 병리학자 1의 113 데이터, 병리학자 2의 60데이터이다. 대조군의 전체수는 101데이터이다. 이것은 병리생리학자 1로부터의 62데이터와 병리생리학자 2로부터의 39데이터로 구성된다.

그림3은 대조군 조직과 암발생 조직에서 프로브 7과 15에 대한 H-score사이의 비교를 보이고 있다. x축은 H-score를 나타내고 있는 반면 y축은 특정한 H-score를 가진 경우의 퍼센트를 나타내고 있다. H-score에서 차이점은 명백하다.

각각의 환자에 대한 스코어는 진단, 염색된 세포의 분포, 염색 밀도를 함께 환자확인을 보이는 데이터베이스내에 스코어를 통합한 병리생리학 재조사 Form내로 전기적으로 입력되었다. 분포와 밀도는 none=0, weak=1, moderate=2, intense=3와 같이 강도를 나누었고, percentage 세포는 0-5%=0, 6-25%=1, 26-50%=2, 51-75=3,>75%=4, 단일 "H-score"로 통합되었고, 다음 두가지 등급을 서로 곱하였다. 예를 들어, 50% 약한 염색(weakly stained) 더하기 50% 적정염색(moderate stained)은 스코어 10=2x2+2x3이 될 것이다. 이것은 section 3(f), 그것은 선택적인 채점시스템을 조사하는 아래의 명시된 "다른(non-H-score) 목적 채점 파라미터를 이용하는 것의 효과"를 제외한 분석을 통한 표준 스코어 시스템이다.

표준 분류법 절차는 프로브의 최상의 조합을 찾기위해 사용되었다. 전형적으로 이것은 최상의 특징의 분류체계를 찾고 분별능력의 테스트에 따른 순위를 매기고 중요도의 테스트에 따른 불완전성을 찾기 위한 "Branch and Bound Algorithm"같은 조사 절차를 사용한다. 이러한 프로세스는 또한 결정 법칙 또는 최상의 분류를 위한 법칙으로 정의된다.

데이터수집과 분석시험의 디자인은 데이터 수집과 데이터 분석이 독립적으로 행해지는 곳에서 이중 블라인드(blind) 절차를 잘 성립시키는 것을 통한 편견(선입견)을 피하도록 선택되어 졌다.

첫 번째 경우에서 병리생리학자는 진단을 하기위해 전통적인 염색을 가진 슬라이드를 재조사했다. 진단은 병리생리학 재조사 형태가 채택되었다. 병리생리학자는 염색된 세포의 퍼센트와 염색의 상대적인 강도의 점수를 매기는 것을 랜덤한 순서에서 지표 프로브에 의해 염색된 슬라이드를 가지고 제출되었다. 슬라이드는 병리생리학으로부터 프로브에 대해서 정보를 배재하도록 갯수가 세어졌다. 두명의 병리생리학자에 의해 체크된 데이터 보전을 행하기 위해 모든 환자가 재조사되었다.

데이터는 통계팀에 의해 재조사된 데이터베이스내에서 통합되었다. 프로브는그것들의 유효성의 분석을 하는 동안 즉석으로 그것들의 방법을 넘겨주도록 숫자가 매겨진다.

분석의 첫 번째 단계는 각각의 환자에 대해 목록을 비교하는 것으로 데이터의 보전을 체크하도록 했다. 큰 차이점이 발견된 곳에서 데이터 목록은 체크되었고 어떤 명백한 오류는 선택되었다. 설명되지 않는 차이점을 데이터내에 남겨두었다.

그러고 나서 데이터는 네명의 통계자에 의해 다른 통계적 방법론들이 데이터에서 차별적인 정보의 다른 형태에 적합하다는 사실에 입각한 서로 다른 기술을 이용하여 분리되어서 분석되었다.

최상의 프로브 조합을 선택하는 과정에서 첫 번째 단계는 수개의 세트로 데이터를 구분하는 것이다. 하나는 분류물질을 디자인하기 위한 것이고 또 하나는 c분류물질의 수행을 테스트하기 위한 것이다. 테스트 세트로 평가되어진 최상의 수행을 보이는 디자인 세트로 만들어진 디자인을 선택하기 위해 분류물질은 데이터의 구조를 개괄했고, 시행 세트(training set)에서 보인 특별한 경우는 채택되지 않았다는 확신을 가지고 결론되어질 수 있었다.

신뢰하는 테스트를 하기 위해서 분석은 전형적으로 수행 데이터와 테스트 데이터의 많은 랜덤하게 선택된 세트로 반복되었다. 이러한 접근은 일반적으로 분류물질 수행의 좋은 평가를 주는 것으로 인정된다. 이러한 테스트가 프로브 선택과 같은 프로브의 모순된 선택이 보이는 곳은 신뢰할 수 없다고 제외되었다.

d. 통계 분석 및/또는 패턴 인식

1. 데이터 분석 서론

a. 입력 데이터

ⅰ. 가공되지 않은 데이터

각각의 환자에 대한 스코어(score)는 병리학 재평가 양식(Pathology Review Form)으로 전자적으로 입력되어, 그 스코어를 진찰, 오염된 세포의 수 및 오염된 밀도에 따른 환자의 식별자를 보여주는 데이터베이스로 통합 정리한다.

ⅱ. 계산된 데이터

통계에 사용되는 각각의 탐침을 위한 스코어의 효율은 강도/확률 표로부터 계산된다. 비율 및 밀도는 단순한 룰, H=오염된 비율 × (3(심하게 오염), 2(보통), 1(약하게 오염))을 사용하여 단일 "H-스코어"로 통합 정리된다. 이것은 탐침과 관련된 특징값이다.

ⅲ. 택일적으로 계산된 데이터 변수

앞에서 설명된 H-스코어는 H-스코어(섹션 3(f), (H-스코어가 아닌) 다른 객관적인 스코어링 변수를 이용한 효과)에 대한 중요한 개선을 보여주지 못한 확률 및 강도를 결합하여 더 좋은 방법을 발견하기 위한 단순한 분석 방법을 발견하는데 도움이 되게 한다. 더 큰 데이터베이스는 미래에 더 좋은 규칙을 추출하는 것을 가능하게 해줄 수 있다.

ⅳ. 마커(marker) 당 칭량 기준에 공급되는 이용자

본 발명은 비용 또는 공급 문제가 최선의 조압을 허락하지 않을 경우 특징의 이용가능성에 유연하게 적용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명은 조합을 발견하고 선택하기 위하여 사용가능한 특징들에 단순하게 적용될 수 있다. 선택적으로, 특징을 선택하는데 이용되는 알고리즘은 최소한의 비용 솔루션(solution)에 도달하기 위한 선택 절차에 포함되는 비용 측정을 가능하게 한다. 마커 형성 평가는 수집된 모든 마커로부터 선택된 조합 또는 하나의 공급자로부터 선택된 조합으로 보여진다. 그것은 또한 고 비용의 기초 하에서 C4.5 패키지가 어떻게 특정 탐침을 아래에서 칭량하는데 이용하는지를 보여준다. 이 탐침 조합은 최적 조합을 형성하지는 못하지만, 비용이 중요한 요소인 환경에 적용가능하다.

ⅴ. 분류 당 칭량 기준에 공급되는 이용자

이용된 방법의 일부는 분류에 적용되는 칭량을 가능하게 한다. 이것은 계통도 디자인(tree design)이 비용을 최적화할 수 있는 C4.5에 사용가능하다. 또한, 판별식 함수(Discriminant Function) 법은 소정의 잘못된 양성 또는 잘못된 음성의 개연성을 제공하는데 이용될 수 있는 단일 변수 출력을 제공한다. 다른 최저한계 세팅을 위한 이 변수들의 플롯(plot)은 수신 운영 곡선(Receiver Operating Curve)으로 알려져 있다.

ⅵ. 감지 패널-가정

(재촬영을 요구받은 잘못된 양성 환자가 증가하는 것을 비용면에서 놓치는 양성 환자를 피하기 위하여) 잘못된 음성의 개연성이 낮은 것은 암 감지 절차에 바람직한 것으로 간주된다. 또한 (잘못된 치료를 받는 환자를 최소화하기 위하여) 암 식별 절차는 잘못된 양성 스코어를 줄일 것이 요구된다.

수용 가능한 성능을 얻기 위하여 6개 이상의 탐침을 요구하는 감지 페널이 비용면에서 효과적이지 않은 것으로 간주된다. 잘못된 부정 오류 비율이 5% 이상인 감지 패널도 수용될 수 없다. 이 박스의 외부에 있는 패널은 수용되지 않는다. 이 가정은 세포 계산 패널이 여기서 분석되는 패널에 기초한 조직학보다 열등한 성능을 가질 것으로 인지하고 있다. 궁극적인 목적은 20%의 오차율보다 더 좋은 성능을 갖는 세포 계산 패널을 제공하는 것이고, 경부(cervical) PAP 표본 정선기의 성능과 근사하다.

ⅶ. 식별 패널-가정

6개 이상의 탐침을 요구하는 패널은 비용면에서 효과적이지 않고, 20% 보다 좋은 오차율이 필요한 것으로 간주된다. 이 박스의 밖에 있는 패널은 수용되지 않는다.

b. 출력 데이터

본 분석에 의하여 제공되는 출력은 다음의 것들을 포함한다:

· 테스트 세트로부터 어떻게 데이터가 참된 양성, 잘못된 양성, 참된 음성및 잘못된 음성으로 분류되는 지를 보여주는 혼동 매트릭스. 이것은 실제 계수 또는 확률로 표시된다. 혼동 매트릭스는 "성능 매트릭스(performance matrix)"로 명명된 섹션 2(d)에서 토론된다. 혼동 매트릭스는 테스트로 세트로부터 어떻게 데이터가 참된 양성, 잘못된 양성, 참된 음성 및 잘못된 음성으로 분류되는 지를 보여준다. 계통도를 결정함으로서 분석되는 데이터로부터 얻어지는 본보기인 혼동 매티릭스는 선암종(adenocarcinoma), 편형 세포(squamous cell) 암종; 거대 세포(large cell) 암종, 중피(mesothelioma) 및 소형 세포(small cell) 암종의 동시 식별법(simultaneous discrimination)으로 다음의 표 12에 도시된다.

· 모든 잘못된 분류의 합계를 모든 분류의 개수로 나눈 값으로 확률로 표시되어 혼동 매트릭스에서 데이터를 요약하는 오차율

· 수신 운영 특성(receiver operating characteristic; ROC) 곡선. 이것은 선별기에서 유관 임계 레벨(threshold level)에 대하여 잘못된 양성 및 잘못된 음성의 추정 확률(또는 유닛 당 가능성)을 보여준다. 임의 선택보다 더 우수하게 식별할 수 없는 무관 선별기는 동등한 참 및 거짓 기록으로 ROC 곡선을 제공한다. 이 곡선 아래의 영역은 50%(확률 0.5)이다.

· 곡선 아래 영역(Area Under Curve; AUC). 이것은 선별기 성능의 전체적인추정에 종종 이용되고, 대부분의 표준 인식 기능 패키기가 이 AUC 그림을 제공한다. 완벽한 선별기는 100% AUC를 갖고, 이용불가능한 식별기는 50%(0,5)에 근사한 AUC를 갖는다.

· 민감도 및 특이성(혼동 매트릭스로부터 유도 가능한). "민감도 및 특이성"으로 명명된 섹션 2(d)를 참고하라.

· 마커 상관 매트릭스. 도 4를 참조하라.

ⅰ. 감지 패널: 조합

이 패널은 다섯 가지 암 중의 하나를 갖는 환자와 암을 갖지 않는 환자의 두 분류로 분할된 데이터로 처리된다. 모든 탐침이 모든 환자에게 제공되는 것은 아니다. 한 개 이상의 탐침이 특정한 분석을 놓친 경우, 이 케이스가 데이터로부터 실행된다. 따라서 분석이 탐침의 수가 줄어드는 것을 보증하는 경우, 데이터 세트는 약간 많은 케이스들을 포함할 수 있다.

분석에 사용되는 탐침의 수는 27이다. 많은 경우 잘못된 탐침으로 입력되는 데이터가 임의의 개수로 있어서 잘못된 탐침이 입력되더라도, 발생기는 균일하게 0에서 12 사이의 숫자를 발생시킨다. 이 잘못된 탐침은 탐침 선택 절차에서 무결성을 확인하기 위하여 많은 조기 분석에 포함되어 있다. 이 잘못된 탐침은 또한 분석으로부터 진행적으로 탐침을 추정하기 위한 하나의 접근에 이용된다. 잘못된 탐침보다 더 작은 정보를 제공하는 탐침은 선택 절차에서 즉시 인식되어 제거될 수 있다. 그러한 탐침의 조기 제거는 분석을 빠르게 하고, 이러한 탐침으로 인하여 야기되는 변동에 덜 영향을 받는 분석을 제공한다.

ⅱ. 감지 패널 성능

이 연구로부터의 출력으로, 다른 방법론에 의하여 선택되는 탐침 조합 및 혼동 매트릭스, % 오차율, 및 AUC의 관점에서 그 성능 추정이 기록된다.

ⅲ. 감지 패널-택일적 조합

감지 패널은 또한 줄어든 세트의 탐침으로부터 선택된다. 한 개의 패널 세트에서, 상업적으로 바람직한 마커로 칭량된 패널의 성능 측정이 얻어진다. 최고의 탐침이 식별 탐침의 새로운 조합을 찾기 위한 분석으로부터 제거 될 때 얻어지는 성능이 또한 분석된다. 그 자신이 행동하는 단일 탐침의 성능은 매우 높게(탐침 7) 발견된다. 하지만, 아래의 성능 다이어그램인 표 13에서 도시되듯이, 더 많은 마커가 첨가되면 성과도 향상된다는 것이 선형 식별 분석을 이용하여 평가되었다. 탐침의 가장 우수한 부세트는 최고의 부세트 로지스틱 회귀(logistic regression)를 이용하여 결정된다. 개선은 통계적으로 중요하다.

(최고 부세트 로지스틱 회귀를 사용하여 결정된) 최고 및 두 번째 탐침 부세트 및 로지스틱 회귀를 이용한 결과가 아래에 도시된다. AUC는 ROC 곡선의 아래 영역이다. 평균 AUC는 임의의 열의 100번의 시험의 평균 및 테스트 분할(70%:30%)이다. 그 결과가 다음의 표 14에 도시된다.

ⅳ. 식별 패널-조합

본 연구의 이 부분을 위하여, 다섯 식별기가 설계되고, 테스트되었고, 각각은 암을 갖는 모든 환자로부터 하나의 암의 존재를 감지하기 위하여 설계되었다. 이 다섯가지 방식의 쌍-방식 시스템의 적용은 의심스러운 케이스가 분석에서 한번 이상 나타나도록 한다. 이러한 케이스는 식별되어 밀접한 정밀조사, 재시험 또는 택일적 시험 관리(regime)의 대상이 된다.

연구에 사용된 탐침의 수는 여전히 27이고, 분석의 수를 줄이기 위하여 조기 단계에 사용된 잘못된 탐침을 포함한다.

ⅴ. 식별 패널-성능

위에서 설명된 성능 추정자는 다른 기술에 의하여 발견된 최고의 탐침 조합의 성능을 보여주는데 이용된다.

ⅵ. 식별 패널-택일적 조합

분석은 상업적으로 바람직한 탐침을 포함하는 탐침 조합을 얻기 위하여 반복된다. 몇몇 감소된 세트 식별자는 이용이 불가능한 것은 아니지만 성능은 떨어진다. 아래의 도 15에 (가장 우수한 부세트 로지스틱 회귀를 이용하여 결정된) 탐침 7을 포함하지 않는 가장 우수한 탐침의 부세트가 도시된다. 데이터는 선형 식별 분석을 이용하여 평가되었다.

(가장 우수한 부세트 로지스틱 회귀를 이용하여 결정된) 탐침 7을 포함한 최고, 및 두 번째로 우수한 탐침 부세트 및 로지스틱 회귀를 이용한 평가가 다음에 도시되었다. AUC는 ROC 곡선 아래의 영역이다. 평균 AUC는 임의의 열의 100번의 시험의 평균 및 테스트 분할(70%:30%)이다. 그 결과가 아래의 표 16에 도시된다.

2. 데이터 분석 및 방법론

이번 섹션에서는 이용된 다른 방법론으로부터 결과를 해석하는데 안내서로서 데이터의 구조의 초기 이해를 얻는 절차가 설명된다.

a. 변수의 분석

ⅰ. 병리학자 대 병리학자 변동성 및 풀링(pooling) 병리학자 스코어

(1) t-테스트

두 병리학자가 이 의료 시험에서 각각의 환자의 슬라이드를 재평가하였다. 병리학자 1은 모든 환자를 재평가하였고, 병리학자 2는 이 세트의 약 절반의 환자를 재평가하였고, 병리학자 3은 나머지 환자를 재평가하였다. 병리학자의 수행의 일관성은 두개의 독립적인 H-스코어의 추정으로 시험될 수 있다.

즉시 이용가능한 통계 도구가 병리학자 사이의 변동성을 시험하는데 이용될 수 있다. 이것이 쌍-샘플 t-테스트이다. 이것은 전체적인 다양성의 비율로서 각각의 쌍의 추정, 이들의 평균 사이의 차이를 취하고, 전체적인 평균의 비율로 표현한다. t-테스트는 이 비율을 두 개의 샘플 세트가 동일한 확률(P-값)로부터 도출되는 가능성을 추정하는 확률로 변환시킨다.

이 테스트는 각각의 병리학자 1 및 병리학자 2에 의하여 재평가된 모든 케이스 및 각각의 병리학자 1 및 병리학자 2에 의하여 재평가된 모든 케이스에 대하여 각각의 마커 탐침용 스코어를 인가하였다. (모든 탐침을 포함하기 위하여) 인가된 27개의 테스트가 있기 때문에, P=0.01의 낮은 값이 "중요한 임계값(significant threshold)"으로 선택되었다. 그 결과, 각각의 탐침 및 두 쌍의 병리학자에 대한 P 스코어가 다음의 표 17, 18, 19 및 20에 되시되었다. 병리학자 1 및 2가 병리학자 1 및 3보다 더욱 일관성이 있다는 점이 명백하다.

H 스코어는 주관적이기 때문에, 스케일 요소의 차이와 한계 케이스에서 노이즈가 발생하는 경향이 있다. 병리학자 1과 병리학자 2 사이의 통계적으로 다른 스코어를 보여주는 세 개의 특징에도 불구하고, 이 결합된 데이터는 대표적인 측정수단으로 수용될 수 있다. 병리학자 1과 병리학자 2는 분석 절차에서 단일 데이터 세트로 결합되었다. 병리학자 3에 대한 결과는 독립적인 테스트 목적으로 보류되었다. 병리학자 3의 데이터를 이용한 이러한 테스트는 중요한 차이점 때문에 하부-성능을 도시하는데 편견이 된다.

병리학자 1 및 병리학자 2로부터 나온 데이터는 그들을 각각의 경우에 대한 결과 사이의 독립성의 정도를 제공하는 변환성을 이용하여 분리된 케이스로 간주하여 결합되었다. 상기 데이터로 테스트할 때, 성능 추정은 더욱 낙관적인 값 쪽으로 편견을 갖게 된다. 이것은 동일한 환자로부터 발생하는 샘플은 테스트 부세트의 처리 시 동시에 발생하기 때문이다. 하지만, 이것이 특징들의 가장 최적의 조합을 발견하는데 이용된 절차를 무의미한 것으로 하는 것은 아니고, 성능의 추정에 대하여 편견을 갖게 하는데 불과하다.

(2) H-스코어의 편차의 분석

(a) 배경

많은 이유로 인하여 각각의 탐침에서 H-스코어는 다양할 수 있다. 그들이 질병의 종류로 인하여 일관적으로 다양한 한도에서, 그 변화는 유용하고, 임의의 편차가 편차의 이전의 두 소스를 감지하는데 한계를 설정하는데 반하여, 병리학자가 슬라이드를 읽음으로 발생한 편차는 유용하다.

편차의 분석(Analysis of Variance; ANOVA)은 데이터에서 편차의 소스를 분할하고, 통계적인 중요성을 테스트하기 위한 표준 기술이다. ANOVA는 편차의 특정한 소스 또는 원인이라고 생각될 수 있는 용어의 합으로서 데이터의 세트의 전체 편차를 요약한다.

ANOVA는 많은 통계 패키지에 사용가능하다. 공공 영역 패키지 "R"(통게적 계산을 위한 R 프로젝트, http://www.R-project.org/)이 선택되었다.

(b) 목적

병리학자 1 및 2로부터 H-스코어 데이터에 대한 ANOVA 분석을 수행하고, 이 데이터가 패널의 선택을 위한 또 다른 분석용으로 하나의 일관된 세트로 안정하게 병합될 수 있는지의 여부를 고려하기 위한 것이다.

(c) 방법론

이 데이터베이스로부터, 병리학자 1과 병리학자 2로부터 데이터가 선택되었다. 주어진 탐침용으로 완성된 유일한 데이터는 탐침용으로 ANOVA에 이용되었다.

기종(Emphysema), 그라뉼로포이에틴 질환(Granulomatous Disease) 및 간질성 폐 질환(interstitial lung disease)의 통제 범주는 함께 분류되어, 요소 질환 안에서 6개의 레벨을 제공하는 "노르말(normal)"로 불린다.

병리학자는 두 개의 레벨(병리학자 1 및 병리학자 2)을 갖는 요소로 기호화된다.

R 스크립트는 다음의 요소들: 질병, 병리학자, 및 상호 한계 질병(interaction term disease): 병리학자를 이용하여 순서대로 각각의 탐침에 대하여 표준 ANOVA 분석을 수행한다. 그 결과가 아래의 표 21에 도시된다. "Df"는 자유도의 정도로 정의된다. 평균에서 n-1 만큼 벗어난 것으로 알려진 n 관찰의 데이터세트에서, n번째는 자동으로 결정된다. N-1은 자유도의 숫자이다. 합계 Sq(Sum Sq) 및 평균 Sq(Mean Sq)는 편차를 측정한 것이다. F는 F 분산에 따른 두개의 편차의 평균에 관한 데스트 통계이다. Pr(>F)는 변동성이 통계적으로 중요한지 아닌지를 결정하는데 이용되는 확률이다. 표 21은 H-스코어의 변수의 분석이다.

(d) 결과의 분석

모든 경우(탐침 21은 예외)에서 탐침의 반응은 질병과 관련되었다. 탐침은 이러한 목적으로 그럴듯하게 선택된 것이기 때문에 놀라운 일은 아니다. 어떤 경우에도 탐침의 반응이 병리학자(p=0.05 레벨에서)와 관련되지 않았다. 이것은 이 데이터의 병합이 안전하고, 데이터 상의 두개의 측정으로 두 병리학자를 이용할 수 있다는 것을 의미한다.

탐침 7, 14, 17의 몇몇 케이스에서, 상호 한계 이득 중요성에 때한 일부 증거가 있다. 이것은 일부 질병의 스코어에서 병리학자들 사이의 일부 차이가 존재한다는 것을 의미한다. 이 케이스의 일부는 데이터에서 우발적인 옥외자로 인한 것일 가능성이 많다.

(e) 결론

이 결과는 추가 분석을 위하여 이 데이터를 병합하는 것이 안전함을 알려준다. 데이터는 병리학자와 질병 사이의 일부 케이스에서의 미소한 상호 작용이 임의의 소스에 기인한다고 생각되도록 나타난다는 것을 알려준다.

ⅱ. 환자 대 환자 변동성

환자에서 환자로의 변동성은 질병에 의하여 측정된다. 섹션 2(a)(ⅰ)(2)의 질병의 변동성("H-스코어의 편차의 분석을 참고하라).

ⅲ. 마커 대 마커 변동성

통제 대 암(Control vs. Cancer)을 위하여 각각의 탐침에 있어서 마커의 분포를 도시하는 도수 분포표가 도시되었다(PathologistData.xls, 워크시트(worksheet): 도수분포표(histogram)).

b. 마커 상관 매트릭스 분석

모집단 상관 계수("Applied Multivariate Statistical Analysis", R. A. Johnson and D. W. Wichern, 2nd Ed, 1988, Prentice-Hall, N.J.)는 한 쌍의 임의 변수 사이의 선형 연관성의 합을 측정한다. 전형적으로 임의의 변수의 분산 및 연관 계수는 알려져 있지 않고, 모집단 상관 계수는 직접 계산될 수 없다. 이 경우, 샘플 데이터로부터 샘플 상관 계수를 계산하는 것은 가능하다. 도 4를 참고하라.하지만, 샘플 상관 계수는 모집단 상관 계수의 추정에 불과하다. 더욱이, 샘플 데이터를 기초로 계산되기 때문에, 실제로는 대응하는 임의의 변수 사이의 실질적인 관계가 없다고 하더라도, 강한 긍정 또는 강한 부정의 상관관계를 가리킬 가능성이 존재한다("Modern Elementary Statistics", J. E. Freund, 6th Ed, 1984, Prentice-Hall, N. J.).

상관 계수는 다른 것을 예상하기 위하여 하나의 변수의 가능성을 측정한다. 하지만, 강한 선형의 연관성은 우연한 관계를 포함한다. 상관 계수의 제곱은 측정의 계수(coefficient of determination)를 요구한다. 이변량(bivariate) 데이터 세트용으로 계산되는 측정의 계수는 선형 관계에 의하여 계산될 수 있는 하나의 변수에 대한 다른 변수의 변동성의 비율을 측정한다. 다양한 변수들을 처리할 경우, 상관 계수는 차례대로 각각의 쌍에 대하여 계산될 수 있고, 계수의 세트는 상관 매트릭스로 알려진 행렬로 기록될 수 있다. 도 4를 보라.

개개의 마커를 위한 H-스코어는 임의의 변수로 설계될 수 있다. 이 다중변수 데이터 세트를 위한 샘플 상관 매트릭스는 위의 "입력 데이터"로 명명된 섹션에서 설명된 입력 데이터로부터 계산될 수 있다.

c. 패턴 인식

통계적 패턴 인식은 신호의 분류 또는 분량적 측정의 기초에 기하학적 목적으로의 접근이다. 통계적 패턴 인식은 필수적으로 카테고리 또는 흥미의 종류에 대응하는 영역에서 n-차 특징 공간을 분할하는 문제로 감소한다.

본 연구에서 채택된 이러한 다른 분석 방법론은 데이터 내에서 다른 구조 형태에 민감하다.

결정트리법(decision tree method)에서, 다른 데이터 조합의 우선 분석은 감지 패널용으로 C4.5에 의하여 결코 이용되지 않는 마커를 식별한다. 이것은 이 분석에서 제외되고, 선택 절차에서 노이즈를 제공하는 남겨진 탐침의 증상을 내타내는 더욱 일관성 있는 결과로 귀착된다.

유사하게, 감지 패널에 이용되는 탐침의 우선 분석은 세부 분석에 앞서서 제거용인 노이즈 탐침을 식별하였다.

SPSS에서 선형 판별함수법(Linear Discriminant Function method)은 분석에서 마커의 수를 줄이기 위하여 고유한 점차적인 절차를 갖는다. 전형적으로, 이것은 2 미 7 사이에 있는 분석에 이용되는 탐침을 줄였다.

R 및 SAS에서 로지스틱 회귀법은 점차적인 변수 선택을 위한 절차를 실행한다. 또한, SAS에서, 최고의 부세트 변수 선택권이 제공된다. R에서, 점차적인 방법론이 변수를 선택하기 위한 발견에 도움이 되는 방법을 발전시키기 위하여 다중 임의의 시도와 결합하여 이용된다. 주어진 특징은 임의의 열의 100번의 선택과 테스트 데이터(분할 70%:30%)에 이용된다. 인위적인 임의의 특징을 위한 카운트(count) 비교가능한 카운트(count)를 갖는 특징은 특징의 최소한의 일관성 세트가 100회 이상의 실행을 얻을 까지 점진적으로 제거되었다.

ⅰ. 통계적 방법

다중 변수 통계 분석의 관점으로부터, 문제는 고차원 공간( 및 공간을 관심있는 영역으로 분할하는 것)의 밀도 함수를 추정하는 것의 하나이다. 임의의 (특징) 벡터의 분포가 알려져 있다고 가정하면, 이론적으로 최고의 분류기는 분류 오류의 가능성을 최소한으로 하는(K. Fukunaga, "Statistical Pattern Recognition", 2nd Ed., Academic Press 1990, p.3), 베이어스(Bayers) 분류기이다. 불행하게도 베이어스 분류기는, 특히 특징 공간의 차원이 높을 때, 복잡함 때문에 그 실행이 어렵다. 실제로, 단순한 변수 분류기가 이용된다. 변수 분류기는 기본적인 밀도 또는 식별 함수에 관한 가정에 기초를 둔다. 가장 일반적인 분류기는 선형 이차 부류기이다. 다중 변수 통계 분석에서 이러한 분류기는 식별 분석의 침로(heading)에 위치한다. 식별 분석 기술은 다중 선형 회귀 모델에 밀접하게 연관되고, 선형 모델(로지스틱 및 다항 회귀)을 보편화한 것이다.

(1) 이항 응답을 갖는 로지스틱 회귀

(a) 배경

감지 패널에 사용되는 마커의 세트를 선택하는데 문제는 이항 응답을 갖는 로지스틱 회귀의 문제로 공식화될 수 있다. 응답 변수는 일반적인(암이 아닌) 경우 및 일반적이지 않은(암인) 경우의 두개의 레벨을 갖는 요소이다. 설명을 위한 변수는 마커 H-스코어이다.

또한, 암 감지 패널에 이용되는 마커의 세트를 선택하는데 문제도 이항 응답을 갖는 로지스틱 회귀의 문제로 공식화될 수 있다. 응답 변수는 일반적인(관심의대상인 암이 아닌) 경우와 일반적이지 않은 경우(관심의 대상인 암인) 경우의 두 개의 레벨을 갖는 요소이다. 설명을 위한 변수는 마커 H-스코어이다.

점차적인 변수 선택이 두개의 분류 사이의 식별에 이용되기 위하여 원래의 변수(마커)의 부세트를 선택하는데 이용된다. 이것은 계산적으로 비싼 실험이고, 컴퓨터에 가장 적합하다. 여러 상업적이고 공적인 도메인 소프트웨어(domain software) 패키지-예를 들면, R, S-플러스, 및 SAS-가 점차적인 로지스틱 회귀를 제공한다.

R 및 SAS에서 발견되는 점차적인 변수 선택 절차에 기초한 특징적인 선택을 위한 두개의 다른 접근이 연구되었다.

(b) 실험 데이터

본 분석에 사용된 데이터는 병리학자 1 및 병리학자 2에 의하여 실험된 케이스로서 마커 17, 및 19 내지 28을 위한 H-스코어로 구성되고, 본 발명의 다른 곳에서도 설명되었다. 또한, 더미(dummy) 마커는 균일한 분포로부터 임의로 선택된 0에서 12까지의 정수로 구성된다.

(c) 방법 1: R 패키지(버젼 1.4.1)를 사용

컴퓨터로 처리된 모델 피팅(fitting) 절차는 일반적으로 분실 자료를 이용할 수 없다. 이것은 R에 이용되는 glm(glm은 일반화도니 선형모델을 의미한다)을 이용한 케이스이다. 결과적으로 glm을 이용하여 모델을 피팅할 때, 하나 이상의 분실정보가 있는 모든 케이스는 제외해야 한다. 27개의 실재 마커 및 한개의 더미 마커를 포함하는 초기 전체 모델을 피팅할 때, 이것은 단지 202 케이스로 데이터 세트를 줄인다. 몇 번의 관찰에서 변수 선택을 수행하고 선택된 변수를 이용하여 분류기를 다루고, 그 성능을 평가하기 위한 가장 좋은 방법은 데이터의 임의의 위치에서 100개의 열을 열 및 테스트 세트로 관리하는 것이다.

(ⅰ) 데이터를 열 및 테스트 세트로 분할

각각의 시도의 시작 시, 데이터는 테스트 세트 및 열 세트로 분할된다. 이것은 테스트 세트를 형성하기 위하여 임의로 30%의 비정상인 것과 30%의 정상적인 것을 선택하고, 열 세트를 형성하기 위하여 나머지의 관측을 이용하여 이루어진다.

(ⅱ) 변수(마커) 선택

각각의 시도의 시작 시, 모든 변수(마커)를 포함하는 전체 모델은 열 데이터로 피팅된다. R에서 로지스틱 회귀 모델은 glm을 이용하여 피팅된다. 이용되는 파편은 다음과 같다:

stepAIC 절차는 아카이케의 정보 기준(Akaike Information Croteria; AIC)에기초한 점차적인 변수 선택을 수행하는데 이용된다. 이 절차는 공적으로 이용가능한 MASS 도서관의 일부이다. 도서관 및 절차는 "Modern Applied Statistics with S-PLUS"(W. N. Venables and B. D. Ripley, Springer-Verlag, Pathologist Yew York, 1999)에 설명되어 있다. 이것을 하는 R-code 파편은 다음과 같다.

결과 모델은 테스트 데이터로 평가된다. 이용된 코드 파편은 다음과 같다.

분류기의 성능은 오분류의 실제 에러율(actual error rate of misclassification; AER) 및 ROC 곡선 아래의 영역(AUC)으로 기록된다. 100회의 시도 후, 100개의 모델과 연관된 AER 및 AUC는 잔류한다. 빈도표는 100개의 모델에서 각각의 변수가 몇 번 발생했는지를 기록하도록 구성된다. 예가 표 22에 도시된다.

이 표는 어떤 마커가 폐기되는 지를 결정하는데 이용된다. 첫째, 10 이하의 빈도를 갖는 모든 마커는 폐기된다. 다음으로, 탈락되는 빈도는 더미 마커의 빈도(일반적으로 더미 마커의 1 또는 1.5배)에 기초해서 선정된다. 이 탈락 값보다 작은 빈도를 갖는 모든 마커는 폐기된다. 더미 마커와 함께 모든 마커는 다른 100회의 시도를 위한 전체 모델로 이용되고, 삭감 절차가 반복된다. 필요하다면, 삭감의 엄격함이 하나 이상의 머커가 모델을 벗어나게 강제하도록 삭감의 엄격함이 증가될 수 있다. 필요하다면, 남은 마커가 다른 100회의 시도를 위한 전체 모델로 이용될 수도 있다. 삭감은 패널 부재의 수가 원하는 정도에 도달하였거나, 현재 모델의 평균 AUC가 진행된 모델의 평균 AUC보다 적을 때 중지된다.

삭가 절차를 설명하기 위하여 상기 표를 참고한다. 상기 표는 감지 패널 데이터를 이용하여 얻어졌다. 그늘진 기재는 삭감 후에 잔류한 마커를 가리킨다. 다른 100회의 시도가 다음의 전체 모델을 이용하여 수행된다.

다시, 빈도 표 23이 구성된다:

그늘진 기재는 (47의 탈락을 이용한) 삭감 후에 잔류한 마커를 가리킨다. 다른 100회의 시도가 다음의 전체 모델을 이용하여 수행된다.

다시, 빈도 표 24가 구성된다.

이 지점에서 50의 탈락이 선택된다. 그늘진 기재는 5 부재 패널을 이용한 잔류 마커를 가리킨다. 각각의 단계에서 AUC는 증가한다: 94.37% -> 95.45% -> 95.78%.

(ⅲ) 패널의 성능 평가

패널의 성능을 평가하기 위하여, 앞에서 보듯이 점차적인 선택 절차없이 100회의 시도가 수행되었다. 각각의 시도에 대하여, AUC, 민감도, 및 특이성이 기록된다. 위의 감지 패널 예에 대한 결과는 다음과 같다:

요약하면, 패널은 97.37%의 민감도 및 97.49%의 특이성을 갖는다. ROC 이하의 영역은 96.01%이다.

(d) 모델 2: SAS(버젼 8.2)를 이용

로지스틱 회귀가 LOGISTIC 절차를 이용하는 SAS에서 수행될 수 있다. 응답 변수가 두개의 레벨 요소일 때, 절차는 이항 로짓 모델(binary logit model; equivalent to glm in R with family = binomial and link = logit)을 적합하게 한다. SAS는 특정된 모델에 대하여 모든 분실된 다중 변수 관찰값을 자동으로 제외시킨다. R과 달리, SAS는 최고의 부세트 변수 선택 절차를 수행하는데 이용될 수 있다. 이를 수행하는데 필요한 SAS의 코드 파편은 다음과 같다:

이 절차는 전체 데이터 세트에 적용된다. 변수 BEST=28은 최고의 28 단일 변수 모델, 최고의 28 이중 변수 모델, 최고의 28 삼중-변수 모델에서 최고의 28, 28-변수 모델을 찾기 위한 SAS를 가리킨다.

(ⅰ) 패널의 성능을 평가

방법 1에 설명된 절차는 각각의 패널의 성능을 평가하느데 이용된다. 다음의 표 25는 인식 패널 데이터로부터 발생하였다. 두개의 최고의 1-, 2-, 3-, 4-, 5 마커 패널을 위한 결과를 보여준다.

(2) 선형 판별 분석법

(a) 배경

상업적으로 유통되는 통계 패키지 SPSS는 간단한 선형 판별 해석 기능을 디자인하고 시험할 수 있는 과정이 있다.

흔히 사용되는 방법은 Fisher의 선형 판별 함수이다. 이 방법으로 feature space의 hyper-plane을 찾아낼 수 있다. 이것은 클래스의 분류를 확실히 할 수가 있다. 두 가지 클래스의 분류에 대해서는, 여기서 두가지의 클래스 분포가 다르기는 하지만, 비슷한 다변수의 가우스 분포 때문에, 이 분류자가 최적의 일을 수행하게 된다. 이 방법은 다중 클래스의 문제로까지 볼 수도 있는데 이 연구에서는 적용되지 않았다.

이 방법은 그 접근에 있어서 극단적으로 단순화한 것이지만 많은 수의 feature를 포함하는 데이터 세트의 경우에 관련된 문제들에 대한 접근은 인내를 요하게 된다(여기에서는 프로브 27번, 200개의 예로 구성된 데이터 세트에 관련된 문제).

상기 패키지는 feature들을 확인하는 절차를 포함하고 있어 나중에 분류에 도움을 준다. 이런 "순차적 방법"은 먼저 가장 대표적인 분별 feature를 찾는다. 다른 feature들은 그 이후 순차적으로 추가되고 분류자에 의해 평가된다. 이러한 feature들의 조합은 최종 해결점이 최초로 선택된 feature를 제외할 수 있는 더 낳은 조합을 찾을 때까지 계속된다. Feature의 수는 통계적 시험이 남은 feature들이 더 이상 분류 절차에 도움을 주지 못한다는 것을 보여줄 때까지 점진적으로 계속증가한다.

수행정도의 평가는 leaving one out method에 의해 이루어진다. 이 방법은 training 세트를 만들기 위해 전체 데이터 세트로부터 하나의 샘플을 제거한다. 제거된 샘플은 테스트 세트로서 남겨지고 이것을 분류자와 오분류 행렬(confusion matrix)에 축적된 분류에 적용시킨다. 이 절차는 데이터 내의 경우에 대해서 계속 반복된다. 이것은 공평한 절차이기는 하나, 높은 편차를 가질 수 있다.

방법

SPSS 프로그램에서, 분석을 위한 적절한 데이터 세트를 선택한 후, "Analyze", "Classify", "Discriminant...", "Fishers method", "leave one out testing" 그리고 "use stepwise method"를 선택한다. grouping 변수로서 진단법을 입력하고, 독립수로서 feature를 입력한다. "OK"를 입력하여 분석을 완료한다. 다른 매개변수들에 의한 수치가 세트로서 보존되어 있기 때문이다.

분석 결과는 분석에서 사용된 feature들의 목록 및 정규 판별 함수(canonical discriminant function), 오분류 행렬 및 정분류율(correct-classification rate)를 포함한다(1-error rate).

ROC 곡선을 나타내기 위해서는 정규 판별 함수를 선택된 feature들에 적용하여 새로운 feature를 만들어 내야한다. SPSS에서는 이 곡선을 만들기 위해 Graphs, ROC를 선택한다.

ii. 계층적 방법: 의사결정나무분석(Decision trees)

(1) 배경

의사결정나무분석(Decision trees) 학습은 귀납적 추리에 가장 널리 이용되고 실용적인 방법이다. 이 방법은 분류가 쉽지 않은 noisy 데이터를 위한 방법이며 선언(disjunctive) 명제들을 학습할 수 있다(Tom M. Mitchell, "Machine Learning", McGraw-Hill, New York, NY, 1997.).

가장 널리 읽히고, 손쉽게 이용할 수 있는 기계 학습 패키지는 "C4.5"라는 것이다(J. Ross Quinlan, "C4.5 : Programs for Machine Learning", Morgan Kaufmann, San Mateo CA, 1993).

의사결정나무를 training data에 적용시키면, 이 알고리즘은 최선의 결정을 내리기 위해서 의사결정나무의 각 결절(node)에서 어떤 데이터의 속성을 어느 결절에서 사용할 것인지를 결정하게 된다. 본 발명에서는, 의사결정나무를 이용하여, 분자 프로브로부터 얻어진 양을 측정하고, 효과적으로 프로브의 패널을 선택하며, 데이터의 분류를 잘 나타낼 수 있는 프로브 score들을 조합하는 방법을 선택하게 된다. 공평한 패널의 수행 평가를 산출하기 위해서는 resulting tree는 training시 사용되지 않았던 데이터를 포함하는 선상에서 평가가 이루어져야 한다. 이러한 평가를 수행하기 위한 표준적인 기법으로서 cross-validation이 있다. 여기서는 10-fold cross-validation이 사용되었다.

Cross-validation 기법은 제한된 데이터를 최대한 이용하는 방법이다. 10-fold cross-validation에서는 데이터가 랜덤하게 10개의 가장 비슷한 크기의partition들로 나누어져, 각 partition들에 대해 한 클래스에 거의 동수의 case들을 관리하게 된다. 그 후, 의사결정나무가 적용되어, 2-9의 partition 조합과 partition 1에 대해서, 그 다음엔 1,3-9의 partition의 조합과 partition 2에 대해서, 이런 식으로 전체데이터에 대한 held-out test를 10회를 실시한다. 이러한 시험 방법에서는 held-out data에 대해서만 시험이 행해지기 때문에 공평하지가 않고, 시험이 단 한번만 수행되기 때문에 오류가 꼬리에 꼬리를 무는 경향이 있다(aggregate error).

Tree는 training data에 아주 적합할 때까지 계속 만들어지게 되며, 이후 "noisy"한 가지들과 잎들을 잘라냄으로써 "가지친(pruned)" 상태로 되어진다. 이 가지치기를 거침으로써 보여지지 않았던 데이터들에 대해서도 일반화 능력을 향상시킬 수 있고, 또 이것은 좋은 수행결과를 얻어내는 데 필수적이다. C4.5 패키지는 pruning tree의 방법으로서 a standard tree pruning algorithm과 a rule extraction algorithm이 있다. 일반적으로 tree를 대상으로 한 방법은 이 데이터에 대해 월등한 결과를 낳는다. 따라서 여기에서는 rule을 대상으로 한 방법에 대해서는 언급하지 않았다.

(2) 자료 준비

여러 개의 프로브의 보통 조직(tissue)과 다섯가지 다른 종류의 암(Adenoarcinoma, Large Cell Carcinoma, Mesothelioma, Small Cell Lung Cancer, and Squamous Cell Carcinoma)에 대한 반응에 대한 결과가 언급한 바와 같이 얻어졌다. 프로브 1-28에 대한 H-scores와 병변 Pathologist 1과 Pathologist 2를 데이터베이스로부터 추출해 flat data file에 넣었다. 의사결정나무 분석시, 각 데이터 포인트(같은 physical slide에 대한 두가지 병변에 의한 것일지라도)는 염색에 의한 질병의 효과에 대한 독립적인 관찰로 취하였다. 이것은 분류의 수행의 명백히 편향됨을 가져올 수는 있으나 패널 선별에 영향을 주지는 않는다.

·대조군 목록으로 Emphysema, Granulomatous Disease, 그리고 Interstitial Lung Disease가 같이 그룹화 되었으며, "Normal"로 부른다.

·검출패널(detection panel)로서 모든 암이 그룹화 되어 "Abnormal"로 부르며, 2-클래스 problem을 만들었다.

·single discrimination panel로서 데이터로부터 Normal case들을 제거하여 5-클래스 problem을 만들었다.

·hold-out discrimination panel로서 각 암들은 차례로 hold out 되었고, 남아있는 암들에 대해서는 "other"로 그룹화시켜 5개의 2-클래스 problem을 만들었다.

C4.5는 본 분석에 포함될 데이터와 그 속성에 대해서 기술해줄 수 있는 ".names" file 이 필요하다. discrimination panel에 대한 names file의 예는 표 26에 나타나 있다.

표 26

프로브 18이 데이터로부터 빠져있어 "ignore"로 설정되었다. names file에서 속성을 "ignore"로 설정하는 것은 패널들로부터 프로브를 정리할 수 있는 쉽고도 효율적인 방법이라 데이터 분석에서 사용된다.

(3) 데이터 분석

C4.5. 표준(default) 패키지 parameter가 제공된 "xval.sh" script를 이용하여 각 데이터 세트에 대해서 Ten-fold cross validation을 실행하였다. cross validation은 작은 데이터 세트에 대한 분류자의 training이나 testing을 위해 개발된 기법이다. 이 기법은 데이터를 랜덤하게 N개의 같은 크기의 partition으로 나누게 된다. 이후 분류자는 N-1 partition들에 대해서 train을 실시하게 되고, 남아있는 partition들에 대해서 test하게 된다. 이것은 N번 반복된다.

하나의 cross-validation(CV) 시도에서 train된 의사결정나무가 다른 CV(선택된 프로브와 나무계수(tree coefficients)가 다른)에서 얻어진 나무와 다를 수도 있기 때문에, 각 프로브가 나무에 의해 10번의 시도로 선택되는 횟수까지 포함하여 계산된다.

가지친(pruned) 나무 5번에서 일어나지 않는 프로브를 "ignore"로 세팅시켜 첫 번째 프로브의 추림(cull)을 수행하고, 10번의 CV 시도중에서도 횟수를 증가시킨다.

그후, 더 작은 수의 후보 프로브들에 대해서 CV를 반복한다. 두 번째 추림을 가지친(pruned) 나무 5번에서 일어나지 않는 프로브를 "ignore"로 세팅시켜 수행하고, 10번의 CV 시도중에서도 횟수를 증가시킨다. 그래도 프로브의 누락이 생기지 않는다면 세 번째의 프로브 추림을 실시한다.

패널들은 다양한 실행을 통해 선정되었고, 추정되는 수행 에러율 또한 아래 결과표에 나타내었다. 의사결정나무에 대한 패널 수행 결과가 아래 표 27에 나타나 있다.

표 27

Small Cell Lung Cancer와 다른 남아있는 4가지의 암의 타입에 대한 식별에 대한 의사결정나무구조가 하래 표 28과 29에 나타나있다.

C4.5 output format:

표 28

표 29

순차적 선형 판별에 대한 패널 수행결과가 아래 표 30에 나타나 있다.

표 30

순차적 로지스틱 회귀 분석법(stepwise logistic regression)에 대한 패널 수행 결과가 표 31에 나타나 있다.

표 31

iii. 신경망과 대체기법

인공신경망 ANN's는 본 발명과 관련하여 feature를 선택하고 분류자를 디자인하는데 곧바로 적용될 수 있는 대체적으로 쓰이는 패턴 인식 기법이다. 하지만, 이러한 기법은 데이터의 구조를 파악하는데 깊은 통찰력을 줄 수가 없고 LDF가 부여하는 방법의 특정한 프로브의 영향도 줄 수가 없다. 이러한 이유로, 본 연구에서는 사용하지 않는다. LDF는 linear discriminant function(선형 판별 함수)의 약자로, feature들의 선형 조합으로 분류를 결정하는 데 이들의 결과가 시발점이 된다.

이 기법은 Multi-Layer Perceptron MLP, Back-Prop, Kohonen's Self_organizing Maps, Learning Vector Quantization, K-nearest neighbors 그리고 Genetic Algorithms 등의 알고리즘을 포함한다.

iv. 특수 주제

(1) 가정

·선형 판별 분석

·두 클래스에 대한 공분산 행렬(covariance matrices)이 같다고 가정한다.

·두 클래스가 다변수 정규 분포를 따를때만 오분류의 비용을 최소화한다고 가정한다.

·설명 변수(explanatory varibles)들은 분류하여 정리할 수 있다기 보다는 연속적인 것으로 가정한다(이 연구에서는 H-score는 분류될 수 있는 반면, 사실상(예를 들어 자동시스템인 경우) intensity는 연속적인 의미로 측정할 수 있다).

·회귀 분석(이항식 일반 선형 모델: binomial generalized linear models)

(2) Marker rejection(de-selection)

판별 분석법과 회귀분석의 컴퓨터를 이용한 수행 절차는 예를 들어 stepAIC in R같이 순차적인 변수 선별 절차이다. 이들 절차는 설명 변수로서 사용하기 위해 가장 최적의 변수들의 부분집합을 선택을 디자인하는 과정이다. 사실상, 이러한순차적인 과정의 성질 때문에, 예측을 위한 최적의 변수들이 선택되리라는 보장은 없다(Johnson and Wichern, p.299). 그럼에도 불구하고 이 절차는 마커를 선별하고 제거하는 과정에 있어서 기초를 제공한다.

(3) Pairwise tests

다중클래스의 분류자를 디자인하는데 있어서 고질적인 문제점이 "Applied Multivariate Statistical Analysis", R.A. Johnson and D. W. Wichern, 2nd Ed, 1988, Prentice Hall, N. J.에 논의되어 있다. 이것은 여러 가지 분리된 두 클래스의 분류자를 개발하는 데 있어서 모티브가 되었다.(판별 패널)

(4) 패널 조합에서의 잉여 제고(Redundancy consideration in panel composition)

"선형 모델은 전통적인 통계학의 핵심을 이루며, 아직까지도 현 통계학의 많은 기초를 이루고 있다" ("Modern Applied Statistics with S-PLUS", W. N. Venables and B. D. Ripley, Springer-Verlag, New York, 1999). 선형 모델은 분산분석(ANOVA : analysis of variance), 회귀 분석 및 판별 분석을 포함한 여러 종류의 다중 분산법과 같은 시험의 기초가 되었다. 설명 변수는 이 모델에 일차 용어로 포함될 수도 있고 아닐수도 있다. 이것은 비선형 방법인 로지스틱 회귀 분석에도 해당한다. 이 로지스틱 회귀 분석 모델은 단순히 선형 회귀 모델을 비선형으로 변환시킨 것이다 : 종속 변수가 대수승산비율(log odds ratio : logit)에 의해 대치된 것이다. 요약하면, 이 통계적 방법은 설명 변수들간의 일차 관계들에 기반한 방법이다. 결과적으로, 패널에서 잉여분을 찾아내는 한가지 방법은 다른 것들과 연관성이 높은 변수(마커)를 확인하는 것이다. 같은 수행결과를 얻어내기 위하여 한 패널에서 하나의 마커와 다른 마커를 대치시키는 일은 가능하다.

한 패널에서 잉여분을 찾아내는 또 다른 방법은 "부분집합" 회귀 분석을 시행하는 것이다. 관심이 가는 모든 설명 변수들을 출발 모델로서 주어진 후, 단수 변수 회귀 모델(single-variable regression model), 이 변수 회귀 모델(two-variable regression) 등을 찾는 방법으로 가장 최적의 모델을 찾는 것이 이 방법의 목적이다. 이 방법은 SAS 통계 패키지에서 수행된다.

(5) Weighting score의 사용

(a) 상업적, 임상적 제고

전략적, 상업적 요인; 비용; 유용성; 편의성 등을 포함하는 여러 가지 이유들 때문에, 한 패널에서 몇 프로브를 선택하면 다른 프로브들은 패널 크기와 수행정도에 따라서 번갈아 사용되는 것이 권장된다.

(b) Attribute costing

의사결정나무에서 attribute를 weighting하는 방법은 배경지식의 조합에 관련된 배경과 관련하여 기계 학습 문헌에서 많이 제안되어 왔고(M. Nunez, "The Use of Background Knowledge", Machine Learning 6:231-250, 1991.), 로봇 센서 정보로부터의 얻어지는 다른 가격의 차이(M. Tan, "Cost-sensitive Learning ofClassification Knowledge and its Application in Robotics", Machine Learning. 13: 7-33, 1993.)에서도 제안되어 왔다.

이들 cost-sensitive 알고리즘은 "C4.5(J. Ross Quinlan, "C4.5 : Programs for Machine Learning", Morgan Kaufmann, CA, 1993)."로 알려진 기계 학습 소프트웨어 패키지에 대해 약간의 변화를 주어 많은 문헌들에서 수행되고 있다. 편의상, 이것은 Nunez의 "EG2" 알고리즘을 수행하기 위해 이용된다.

C4.5 의사결정나무 구성 단계에서는, 알고리즘이 각 attribute을 비교하여 나누고, 그중Gi(Information gain)를 최대화 할 수 있는 하나를 고르게 된다. EG2 알고리즘에서,Ci가 일체화된 식 (2 ^Gi -1)/(Ci+1)은 최대화된다. weight의 벡터는 사용자의 의해 앞서 세팅되는 것이 필요하다.

(i) Code 수정

C4.5 source code는 M. Nunez에 의해 제안된 "EG2(economic generalizer)" 알고리즘을 수행하기 위하여 수정되었다.

C4.5 패키지에 대한 정확한 수정은 다음과 같다.

파일 "R8/Src/contin.c"의 다음 라인에(J. Ross Quinlan, "C4.5 : Programs forMachine Learning", Morgan Kaufmann, CA, 1993)

위와 같이 새 라인이 삽입된다. attribute cost의 벡터가 있는 곳은 사용자에 의해 유지된 텍스트 파일로부터 이전에 읽혀졌다.

(ii) 실험적 방법

상업적으로 권장되는 프로브들은 : 2,4,5,6,8,10,11,12,16,19,20,22,23,28 이다.

예를 위해서, 비용 때문에 상기 프로브들이 상업적으로 권장된다고 가정하면, 비용을 고려해서 검출 패널(detection panel)를 재선택하는 것이 바람직하다.

수정된 C4.5 의사결정나무 소프트웨어는 상업적으로 권장되는 프로브에게 벌점 0점을 주고, 비상업적으로 권장되는 프로브에게는 벌점 2점을 주었다. 그리고 10-fold CV panel selection 방법이 이 수정된 C4.5 알고리즘을 이용하여 수행되었다.

(iii) 결과

표준적인 의사결정나무 검출 패널은 프로브 3,7,19,25,28로 구성되어 있다. Resulting 패널 구성은 2,6,7,10,19,25,28로 상업적으로 권장되는 패널로 사용된 것은 P7, P25의 두가지 밖에 없다. 여기에 선택된 프로브들은 비싼 비용에도 불구하고 데이터들에 대한 월등한 수행 능력 때문에 선택되었다는 것을 주시하자. 패널은 원 패널 5개에 비해 7개로 더 커졌다. 이 수행이 비용이 절감된 프로브를 사용하는 것보다 준 최적의 수행임에도 불구하고, 이 데이터의 패널 수행에서 설명가능한 drop은 없다.

(iv) 결론

비용을 고려한 프로브를 이용하여 패널 선별 방법에 적용시키는 수월한 방법이 성립되었다.

(c) Misclassification costing

(i) 배경

많은 이유 때문에. 여러 다른 종류의 분류 에러의 비용이 다르다는 것을 염두에 두고 최적의 패널을 선택하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 한 가지 질병(예를 들어, Large Cell Carcinoma)에 대한 증진된 민감도를 가지는 패널을 선택하는 것이 바람직하며, 오분류 행렬 어딘가에 감소된 특이성과 민감도를 가지는 것을 교체해서 사용해야 한다.

misclassification cost의 행렬 이론에서는(오분류 행렬과 같은 차원) 모든 가능한 비용의 조합을 고려하는 것이 요구된다. 사실상, 단지 non unity(default) 된 비용들만 입력된다.

상업적으로 유통되는 의사결정나무 소프트웨어 See5(RuleQuest Research Pty Ltd, 30 Athena Avenue, St Ives Pathologist 3SW 2075, Australia.(http://www.rulequest.com))는 상기 특성을 조합하여 하기에 사용되었다.

(ii) 목적

표준 조합 판별 패널(The standard joint discrimination panel)은 다음과 같이 구성된다: P2,3,4,5,12,14,16,19,22,23,28. 그리고 다음과 같은 오분류 행렬의 경우가 가능할 것이라 본다.

Large Cell Carcinoma의 민감도는 26%로 낮다. 새롭게 디자인된 패널에서 이에 대한 민감도를 높이기 위해서는 다음과 같은 방법이 이용된다.

(iii) 방법

다음과 같은 비용 파일이 생성된다.

이 파일은 10이라는 요인에 의한 다른 암 종류와 같이 Large Cell Carcinoma의 misclassification을 upweight 하고 있다. 이것은 이 클래스에서는 감지 민감도를 높여주는 경향은 있을 것이나(다른 곳에서는 수행도 감소가 일어날 수 있다), 어떤 weighting도 완전한 분류를 장담할 수는 없다.

표준 의사결정나무 패널 selection 방법이 적용되었다(C4.5를 대신해 See5가 이용됨).

(iv) 결과

새로운 패널 구성은 다음과 같다: P2,3,4,5,6,9,12,14,16,17,25,28. 이것은 다음과 같은 수행결과를 가져온다고 예측한다.

상기에서 보이는 바와 같이 추정되는 Large Cell Carcinoma의 민감도는 이제 48%로 향상되었다.

(v) 결론

패널 selection 방법에 여러 다른 비용의 misclassification을 조합하는 수월한 방법이 성립되었다.

d. Performance metrics

각 방법의 수행 결과를 보여주는 분석에 의한 결과들은 다음을 포함한다.

i.ROC analyses

반응자 작용 특성(ROC : Receiver Operating Characteristic) 곡선은 분류자에서 각기 다른 threshold level의 false positive와 false negative score의 추정 퍼센트(혹은 per unit probability)를 보여준다. 무작위 선별보다 식별력이 좋지못한 indifferent한 분류자는, 같은 값의 참값과 거짓값을 가지는 ROC 곡선을 나타내곤 한다. 이 곡선 아래 부분은 50%(0.5 probability)이다.

AUC(Area Under the Curve)는 분류자의 수행 결과를 전체적으로 추정하는 데 종종 이용되고, 가장 상업적으로 많이 유통된느 판별 함수 패키지가 이 수치를 계산한다. 완벽한 분류자는 100%의 AUC를 가지고, 무용한 분류자의 경우 50% 근처의 AUC를 가진다.

ii.Confusion matrices : counts and percentages

Confusion matrices는 그 시험 세트의 데이터가 어떻게 분류되었는지를 보여준다. Pairwise test의 경우에는 이것은 true positive, false positive, true negative 또는 false negative score의 실제 수치이다. 이들은 실제 수치로 혹은 퍼센트로 나타낼 수 있다. multi-way 패널의 경우에는, 이 패널은 단 하나의 패널에 하나의 독특한 진단을 부여함을 시도하기 때문에 confusion matrix는 각각의 올바른 분류에 대한 수를 보여준다. 예를 들면, Small Cell carcinoma가 검출될 때마다 행렬의 한 항에 입력된다. 부정확한 score에 대해서 예를 들면, small cell carcinoma가 얼마나 자주 squamous cell cancer로 잘못 확인되는지가 행렬의 적절한 off-diagonal 원소에 입력된다. 에러율은 confusion 행렬의 데이터를 정리하는데 사용되는데, 잘못된 분류의 개수를 수행된 분류의 총 개수로 나누어진 값으로 퍼센트로 표현된다.

iii.민감도와 특이성

특이성은 어떤 정의에 대하여 유효하지 않은 경우를 제외시키는 정도를 일컫는다. 어느 한 정의가 낮은 특이성을 가지고 있다면, 그것은 false negative가 높다고 한다. 이것은 질병을 가지고 있지 않은 사람이 질병에 걸린 것으로 확인되는 것을 의미한다. 민감도는 어떤 정의에 대하여 유효한 모든 경우를 포함할 수 있는 정도를 일컫는다. 어떤 정의가 낮은 민감도를 가지고 있다면, 그것은 false negative가 높다고 한다(질병을 가지고 있는 사람이 질병이 없는 것으로 잘못 확인되는 경우).

3. 데이터 분석 및 결과

a. 시료크기 및 가변도(variability)

·결합된 패톨러지스트(병리상태; Pathologist) 1과 패톨러지스트 2의 데이터 세트에서의 354개의 경우 중, 202개의 경우만이 모든 마커에 대하여 H 값(H score)을 가졌다(variable 또는 feature).

·완벽한 관찰의 수가 적고 가변(variable)적인 수가 많아지면 예측에 문제가 있다 (수치의 장애; curse of dimensionality). 따라서, 분류기(classifier)를 생성하기 위하여 사용되었던 가변의 수를 다시 제거할 필요가 있다.

·관찰된 수가 적기 때문에, 데이터들을 별개의 트레이닝(training)과 테스팅(testing) 세트로 나누는 것은 신중하지 못하다(변환기 실해의 대략적인 예측을 위해 필요하다). 이러한 이유로, 재표본추출(resampling) 방법[예를 들어, 교차입증(cross-validation) 및 다중 임의시도(multiple random trial)]을 사용하는 것이 필요하다.

·각각의 암에 대한 관찰이 매우 적기 때문에, 암 분류(cancer discrimination)를 위하여 다부류 분류기(multiclass classifier)를 설계하는 것은 용이하지 않다.

b. De-selected 마커(디-실렉트 된 마커)

상기 설명된 방법에 따라 마커들을 디-실렉트 되었다. 디-실렉트된 마커들은 패널에서 비선택(non-selection)으로 표시된다.

c. 검출 패널 조성(Detection panel composition)

i. 선택된 마커 프로브(selected marker probes)

세가지의 모든 방법을 위한 선택된 마커 프로브는 도 5에 요약되어 있다.

ii. 최소의 선택된 마커 프로브(minimum selected marker probes)

검출 패널을 위해서는 프로브 7이 단독 마커에 대하여 가장 좋은 검출수행을 제공하는 것이 분명하다. 더 많은 프로브에 의하여 믿을만한 프로브를 얻을 수 있는지 확인하기 위하여 프로브의 결합을 분석하였다.

(1) 방법

수행 측정의 관점에서, 로지스틱 리그레션 방법(Logistic Regression method)이 최선의 부분조합이 등급매겨지도록 한다(Fisher' score). 이러한 분석은 1부터 5까지의 프로브의 조합(combination)을 선택하는데 사용되었다. 이러한 조합의 수행을 설명하기 위하여 피셔의 선형 판별 함수(Fishers linear discriminant function) 및 로짓(logit) 모델(로지스틱 리그레션; logistic regression)이 사용되었다. 결과는 위에 나타나 있다.

(2) 결론

프로브 7은 분류기로서는 잘 수행하지만, 프로브 7을 단독으로 사용하는 것의 단점은 프로브 7이 높은 잘못된 반대 점수(false negative score)를 갖는다는 것이다. 피셔의 선형 판별 함수(Fishers linear discriminant function)를 분류기(classifier)로 사용할 때 가장 좋은 것은 프로브 7 및 16을 사용하는 것이다. 다른 조합을 사용하는 패널 사이의 결과의 가변성은 더 많은 특징들(features)에 의해 추가된 노이즈(noise)는 분류 점수를 향상시킬 어떤 잠재력보다 더 중요함을 시사한다. 적은 수의 부정확하게 점수 매겨진 시료들은 이러한 아주 드문 사건의 통계의 대표성이 희박함을 나타낸다. 많은 수의 경우(case)에 의해 설계된 분류기는 더 좋은 분류기가 설계되도록 한다. 다른 분류기를 사용하여 가장 좋은 프로브의 조합을 선택하는 기술은, 데이터의 구조에 따라, 다른 가장 좋은 패널을 만들수도 있다.

iii. 보충 마커(suplemental markers)

패널들은 다른 프로브의 유용성을 맞추기 위하여 설계될 수 있음이 보여졌다. 이러한 대상을 선택하기 위하여 다른 방법론(methodologies)이 사용될 수도 있다: Decision Trees, 로지스틱 리그레션, 및 선형 판별 함수. 데이터는 위에 나타나 있다.

방법

접근 강제(access constraint) 때문에 강제(constrains)가 적용된 패널에서 얻어딘 점수에 대하여 SPSS를 사용하는 피셔의 선형 판별 함수(Fisher's LinearDiscriminant Function)이 적용되었다. 예를 들어, 모든 프로브는 하나의 매매자(vendor)에서 유래된다. 또한, 가장 좋은 특징의 조합을 찾기 위하여 정방향 쪽이 선택되었다. 수행결과는 Leave-One-Out cross validation 테스트를 사용하여 예측되었다.

iv. 택일적인 마커(alternative markers): 동작의 생물학적 메커니즘

(기능에 있어서 동등한 마커)

이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 기능에 있어서 균등한 마커를 결정할 수 있다. 패널에 사용된 마커의 기능적 거동은 본 문건 전체에 걸쳐 설명되어 있다.

v. 마커 위치선정(marker localization)

본 연구에서 사용되는 다양한 마커들의 위치선정은 본 문건의 다른 곳에 설명되어 있다.

vi. 패널 수행

세 가지 방법의 수행에 대하여는 위에 설명되어 있다.

vii. 패널 수행의 해석에 대한 제한

·적은 데이터 세트 및 재시료 방법을 적용할 필요 때문에, 분류기들이 과도 훈련될 위험(데이터를 너무 정확하게 맞추기 위한) 있다.

·세포학적인 예를 사용하는 패널 수행은, 객담(sputum) 세포의 시료가 해부학적인 타당성 연구에서 분석되는 세포들을 대표할 만한 충분한 수의 세포를 포함하고 있는지의 여부가 불명확하기 때문에 정확한 예측을 하기가 어렵다. 그럼에도불구하고, 정확한 세포 시료의 크기가 주어진다면, 최적화된 패널이 세포학적인 예시와 동일하게 거동할 것이라고 기대할 수 있다.

d. 판별실 패널 조성(Discriminant Panel Composition)

i. 모든 암에 대한 단일의 5-가지 패널(a single 5-way panel)

세 가지 분석기술 중에, 디시젼 트리(decision tree)만이 단일의 5가지 패널에 잘 적용된다. 따라서, 단일의 디시젼 트리는 모든 종류의 폐암을 동시에 분류하도록 구성되었다. 패널 멤버들은 도 5에 나타나 있다. 패널 수행은 상기 패널 수행 테이블(표)에 나타나 있다.

ii. 다른 것들에 대한 단일 종류의 폐암을 판별하기 위한 패널

선형 판별 함수들은 다분류 판별을 동시에 수행하도록 잘 맞추어져 있다. 모든 암들의 세트로부터 한가지 암을 판별하도록 설계된 다섯 개의 분리된 분류기가 분석되었다. 그러한 조합은 어떤 경우도 후보 암들 중 하나를 가지고 있지 않다고 분리할 가능성이 있거나 또는 하나의 경우가 두 개 이상의 후보 암을 가지고 있다고 분류할 수도 있다. 이는 더 폭넓은 고려를 위한 일관성 없는 경우를 구별하는 데 잠재적인 장점이 있다.

모든 암의 경우에 대한 단일 판별 패널의 전체 에러율은 비교적 높은 에러율을 가지고 있다는 것이 이미 보여졌다(a five way classifier). 상기 보여진 패널 수행 데이터에서, 네 개의 다른 암으로부터 하나의 암을 식별하기 위해 설계된 다섯 개의 쌍으로 된 분류기의 실행이 보여진다. 이러한 접근은 디시젼 트리 및 선형 판별 함수를 사용하는 분석에서만 유용하다. 상기 기술이 적용될 경우, 하나의패널에 대하여 두 개 이상의 진단방법이 주어지고, 더 많은 병리학적 탐구를 다시 하는 경우, 애매한 발견을 제공하는 잠재력이 있다. 상기 기술은 더 많은 병리학적 탐구를 다시 하는 경우, 아무것도 발견하지 못할 가능성도 있다(검출 패널과의 재 시험에서).

iii. 검출 패널로부터 잘못된 긍정의 가능성을 계산하기 위한 패널

잘못된 긍정의 경우(검출 패널로부터) 및 다섯가지 암의 경우 중에서 판별하기 위여 더 많은 패널이 훈련될 수 있다. 이는, 비정상으로 잘못 분류된 검출 패널로부터 그러한 각각의 경우를 선택하는 것을 포함한다. 이는 이러한 특별한 경우를 검출하는 더 힘든 문제에 대하여 지정된 분류기를 훈련한다. 그러나, 이는 이론적으로 적절한 일이지만, 이러한 네가지 경우에 대해서만 데이트 세트가 얻어졌으며 개체군은 분석을 위하여 대표되고 있는 중인 것으로 보여진다.

iv. 선택된 마커들

세가지 모든 방법에 대하여 선택된 마커 프로브들은 도 5에 요약되어 있다.

v. 최소한의 선택된 마커 세트

이 문제는 하기의 "다른 방법을 사용한 유사한 결과에 의한 예증된 접근의 견고성(Robustness of Approach Demonstrated by Similar Results Using Different Methods)"에 나타나 있다.

vi. 보충 마커

이 문제는 하기의 "다른 방법을 사용한 유사한 결과에 의한 예증된 접근의 견고성(Robustness of Approach Demonstrated by Similar Results Using DifferentMethods)"에 나타나 있다.

vii. 양자택일적인 마커: 행동의 생물학적 메카니즘

이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 기능에 있어서 균등한 마커를 결정할 수 있다. 패널에 사용된 마커의 기능적 거동은 본 문건 전체에 걸쳐 설명되어 있다.

viii. 마커 위치선정(marker localization)

본 연구에서 사용되는 다양한 마커들의 위치선정은 본 문건의 다른 곳에 설명되어 있다.

ix. 패널 수행

세 가지 방법의 수행에 대하여는 도 5에 요약되어 있다.

e. 무게변수(weighting parameter)의 효과

이미 언급된 것처럼, 마커와 병리상태(classes; 분류군)에 대한 사용자 공급 무게 영역(user-supplied weighting criteria)에 더하여, 쌍으로 된 무게 계획을 사용할 수도 있다. 예를 들어, 모든 비-다코(non-DAKO) 제공된 프로브들은 무게가 "0"이고, 모든 다코(DAKO) 제공된 프로브들은 무게가 "1"이 나간다며, 최적화되니 패널은 다코 제공된 프로브만 포함하고 있을 것이다. 그들만의 공급을 사용하는 분자 진단 패널을 발전시키고 시장화하려는 사람에게 있어, 이는 중요한 생산 설계 능력이다.

f. 점수를 매기는 다른 (비 H-점수; non H-score) 변수 대상을 사용하는 효과

i. 배경

병리학적 개관 용지는 하기 표 32에 나타난 박스들을 갖는다.

강도0-5%6-25%26-50%51-75%＞75%

없음□ 0□ 1□ 2□ 3□ 4

약합□ 0□ 1□ 2□ 3□ 4

보통□ 0□ 1□ 2□ 3□ 4

강함□ 0□ 1□ 2□ 3□ 4

표준 점수 시스템은 강도를 하기와 같이 측정하는 "H 점수(H score)"를 사용하고: 없음=0, 약함=1, 보통=2, 강함=3, 또한 세포의 퍼센트는 하기와 같으며: 0-5%=0, 6-25%=1, 26-50%=2, 51-75%=3, ＞75%=4, 이어 상기 두 가지 등급을 곱한다. 예를 들어, 50%로 약하게 얼룰진 것 더하기 50% 보통으로 얼룩진 것은 10 = 2×2 + 2×3 과 같은 점수를 얻는다.

ii. 방법

다른 점수 채점 방법은 하기와 같이 응답을 낮음(low), 중간(medium) 및 높음(high)로 구별하는 것이다:

(a) 50% 보다 많은 세포들이 보통 또는 상기 얼룩을 가짐 →높음

(b) 50%보다 많은 세포들이 얼룩이 없음 →낮음

(c) 그 밖의 경우 →중간

디시젼 트리 검출 패널 선택 방법은 상기 H-점수 대신 3-단계 인자를 사용하여 반복되었다.

iii. 결과

선택된 패널은: 프로브 3, 7, 10, 11, 16, 19, 20, 28

대략적인 실행은:

분류	(a)	(b)
대조군 (a)	79	22	특이성=78%
암 (b)	24	149	감도=86%

이는 H-점수에 의한 하기 참고자료와 비교되어야 한다.

분류	(a)	(b)
대조군 (a)	85	6	특이성=93%
암 (b)	5	120	감도=96%

iv. 결론

·상기 제안된 택일적인 점수 시스템을 사용할 경우 수행에 있어서 실질적인 손실이 있다(더 많은 패널, 낮은 감도 및 낮은 특이성).

·H 점수를 연속 가변(continuous variable) (0에서 12의 범위에서)으로 처리하는 것은 시험된 데이터에서 최선의 패널 선택에 가까운 것으로 보인다.

·다른 가능한 점수 시스템을 연구하였지만, 방법론적으로 설계되고 발전된 실험적인 테스트 패널에 대하여만 실행할 수 있고 적용할 수 있다.

4. 폐암 검출 및 판별 패널

하기 리스트는 상기 예시된 시험에 의하여 결정된 실험적인 폐암 검출 및 판별패널이다. 하기 패널들은 특이적인 프로브를 인용하고 있지만, 각각의 특이적인 프로브는 관련성 있는 프로브 또는 기능적으로 관련된 프로브로 치환할 수 있다.

검출(강제 없음; No Constraints)

·anti-Cyclin A combined with one or more additional probes

·anti-Cyclin A, anti-human epithelial related antigen (MOC-31)

·anti-Cyclin A, anti-ER-related P29

·anti-Cyclin A, anti-mature surfactant apoprotein B

·anti-Cyclin A, anti-human epithelial related antigen (MOC-31), anti-VEGF

·anti-Cyclin A, anti-human epithelial related antigen (MOC-31), anti-mature surfactant apoprotein B

·anti-Cyclin A, anti-mature surfactant apbprotein B, anti-human epithelial related antigen (MOC-31), anti-VEGF

·anti-Cyclin A, anti-mature surfactant apoprotein B, anti-human epithelial related antigen (MOC-31), anti-surfactant apoprotein A

·anti-Cyclin A, anti-mature surfactant apoprotein B, anti-human epithelial related antigen (MOC-31), anti-VEGF, anti-surfactant apoprotein A

·anti-Cyclin A, anti-mature surfactant apoprotein B, anti-human epithelial related antigen (MOC-31), anti-VEGF, anti-Cyclin D1

·anti-Cyclin A, anti-human epithelial related antigen (MOC-31) combined with one or more additional probes

·anti-Cyclin A, anti-ER-related P29 combined with one or more additional probes

·anti-Cyclin A, anti-mature surfactant apoprotein B combined with one or more additional probes

·anti-Cyclin A, anti-human epithelial related antigen (MOC-31), anti-VEGF combined with one or more additional probes

·anti-Cyclin A, anti-human epithelial related antigen (MOC-31), anti-mature surfactant apoprotein B combined with one or more additional probes

·anti-Cyclin A, anti-mature surfactant apoprotein B, anti-human epithelial related antigen (MOC-31), anti-VEGF combined with one or more additional probes

·anti-Cyclin A, anti-mature surfactant apoprotein B, anti-human epithelial related antigen (MOC-31), anti-surfactant apoprotein A combined with one or more additional probes

·anti-Cyclin A, anti-mature surfactant apoprotein B, anti-human epithelial related antigen (MOC-31), anti-VEGF, anti-surfactant apoprotein A combined with one or more additional probes

·anti-Cyclin A, anti-mature surfactant apoprotein B. anti-human epithelial related antigen (M0C-31), anti-VEGF, anti-Cyclin D1 combined with one or more additional probes

검출 (W/O 항-시클린 A; anti-Cyclin A)

·anti-Ki-67 combined with one or more additional probes.

·anti-Ki-67 combined with any one probe selected from the groupconsisting of anti-VEGF, anti-human epithelial related antigen (MOC-31), anti-TTF-1, anti-EGFR, anti-proliferating cell nuclear antigen and anti-mature surfactant apoprotein B.

·anti-Ki-67 combined with any two probes selected from the group consisting of anti-VEGF, anti-human epithelial related antigen (M0C-31), anti-TTF-1, anti-EGFR, anti-proliferating cell nuclear antigen and anti-mature surfactant apoprotein B.

·anti-Ki-67 combined with any three probes selected from the group consisting of anti-VEGF, anti-human epithelial related antigen (MOC-31), anti-TTF-1, anti-EGFR, anti-proliferating cell nuclear antigen and anti-mature surfactant apoprotein B.

·anti-Ki-67 combined with any four probes selected from the group consisting of anti-VEGF, anti-human epithelial, related antigen (MOC-31), anti-TTF-1, anti-EGFR, anti-proliferating cell nuclear antigen and anti-mature surfactant apoprotein B.

·anti-Ki-67 combined with any five probes selected from the group consisting of anti-VEGF, anti-human epithelial related antigen (MOC-31), anti-TTF-1, anti-EGFR, anti-proliferating cell nuclear antigen and anti-mature surfactant apoprotein B.

·anti-Ki-67, anti-VEGF, anti-human epithelial related antigen (MOC-31), anti-TTF-1, anti-EGFR, anti-proliferating cell nuclear antigen and anti-mature surfactant apoprotein B

·anti-Ki-67 combined with any one probe selected from the group consisting of anti-VEGF, anti-human epithelial. related antigen (MOC-31), anti-TTF-1, anti-EGFR, anti-proliferating cell nuclear antigen and anti-mature surfactant apoprotein B, and with one or more additional probes.

·anti-Ki-67 combined with any two probes selected from the group consisting of anti-VEGF, anti-human epithelial related antigen (M0C-31), anti-TTF-1 anti-EGFR, anti-proliferating cell nuclear antigen and anti-mature surfactant apoprotein B, and with one or more additional probes.

·anti-Ki-67 combined with any three probes selected from the group consisting of anti-VEGF, anti-human epithelial related antigen (MOC-31), anti-TTF-1, anti-EGFR, anti-proliferating cell nuclear antigen and anti-mature surfactant apoprotein B, and with one or more additional probes.

·anti-Ki-67 combined with any four probes selected from the group consisting of anti-VEGF, anti-human epithelial related antigen (MOC-31), anti-TTF-1, anti-EGFR, anti-proliferating cell nuclear antigen and anti-mature surfactant apoprotein B, and with one or more additional probes.

·anti-Ki-67 combined with any five probes selected from the group consisting of anti-VEGF, anti-human epithelial related antigen (MOC-31),anti-TTF-1, anti-EGFR, anti-projiferating cell nuclear antigen and anti-mature surfactant apoprotein B, and with one or more additional probes.

·anti-Ki-67, anti-VEGF, anti-human epithelial related antigen (MOC-31), anti-TTF-1, anti-EGFR, anti-proliferating cell nuclear antigen, anti-mature surfactant apoprotein B 및 하나 이상의 프로브들.

상업적으로 유용한 프로브에 의한 검출

·anti-Ki-67 combined with one or more additional probes.

·anti-TTF-1 combined with one or more additional probes.

·anti-EGFR combined with one or more additional probes.

·anti-proliferating cell nuclear antigen combined with one or more additional probes.

·two probes selected from the group consisting of anti-Ki-67, anti-TTF-1, anti-EGFR and anti-proliferating cell nuclear antigen.

·three probes selected from the group consisting of anti-Ki-67, anti-TTF-1, anti-EGFR and anti-proliferating cell nuclear antigen.

·anti-Ki-67, anti-TTF- I. anti-EGFR and anti-proliferating cell nuclear antigen

·two probes selected from the group consisting of anti-Ki-67, anti-TTF-1, anti-EGFR and anti-proliferating cell nuclear antigen, 및 하나 이상의프로브들.

·three probes selected from the group consisting of anti-Ki-67, anti-TTF-1, anti-EGFR and anti-proliferating cell nuclear antigen, 및 하나 이상의 프로브들.

·anti-Ki-67, anti-TTF-1, anti-EGFR, anti-proliferating cell nuclear antigen, 및 하나 이상의 프로브들.

아데노칼시노마(Adenocarcinoma)와 다른 폐암 사이의 판별

·anti-mucin 1 and anti-TTF-1

·anti-mucin 1 and anti-TTF-1 combined with any one probe selected from the group consisting of anti-VEGF, anti-surfactant apoprotein A, anti-BCL2, anti-ER-related P29 and anti-Glut 3

·anti-mucin 1 and anti-TTF-1 combined with and two probes selected from the group consisting of anti-VEGF, anti-surfactant apoprotein A, anti-BCL2, anti-ER-related P29 and anti-Glut 3

·anti-mucin 1 and anti-TTF-1 combined with any three probes selected from the group consisting of anti-VEGF, anti-surfactant apoprotein A, anti-BCL2, anti-ER-related P29 and anti-Glut 3

·anti-mucin 1 and anti-TTF-1 combined with any four probes selected from the group consisting of anti-VEGF, anti-surfactant apoprotein A, anti-BCL2, anti-ER-related P29 and anti-Glut 3

·anti-VEGF, anti-surfactant apoprotein A, anti-mucin 1, anti-TTF-1, anti-BCL2, anti-ER-related P29 and anti-Glut 3

·anti-mucin 1, anti-TTF-1 및 하나 이상의 프로브들

·anti-mucin 1 and anti-TTF-1 combined with any one probe selected from the group consisting of anti-VEGF, anti-surfactant apoprotein A, anti-BCL2, anti-ER-related P29 and anti-Glut 3, and with one or more additional probes

·anti-mucin 1 and anti-TTF-1 combined with and two probes selected from the group consisting of anti-VEGF, anti-surfactant apoprotein A, anti-BCL2, anti-ER-related P29 and anti-Glut 3, and with one or more additional probes

·anti-mucin 1 and anti-TTF-1 combined with any three probes selected from the group consisting of anti-VEGF, anti-surfactant apoprotein A, anti-BCL2, anti-ER-related P29 and anti-Glut 3, and with one or more additional probes

·anti-mucin 1 and anti-TTF-1 combined with any four probes selected from the group consisting of anti-VEGF, anti-surfactant apoprotein A, anti-BCL2, anti-ER-related P29 and anti-Glut 3, and with one or more additional probes

·anti-VEGF, anti-surfactant apoprotein A, anti-mucin 1, anti-TTF-1,anti-BCL2, anti-ER-related P29, anti-Glut 3 및 하나 이상의 프로브들

스쿠아무스(Squamous) 세포 칼시노마(Carcinoma)와 다른 폐암의 판별

·anti-CD44v6 combined with one or more additional probes

·anti-CD44v6 combined with any one probe selected from the group consisting of anti-VEGF, anti-thrombomodulin, anti-Glut 1, anti-ER-related P29 and anti-melanoma-associated antigen 3

·anti-CD44v6 combined with any two probes selected from the group consisting of anti-VEGF, anti-thrombomodulin, anti-Glut 1, anti-ER-related P29 and anti-melanoma-associated antigen 3

·anti-CD44v6 combined with any three probes selected from the group consisting of anti-VEGF, anti-thrombomodulin, anti-Glut 1, anti-ER-related P29 and anti-melanoma-associated antigen 3

·anti-CD44v6 combined with any four probes selected from the group consisting of anti-VEGF, anti-thrombomodulin, anti-Glut 1, anti-ER-related P29 and anti-melanoma-associated antigen 3

·anti-CD446, anti-VEGF, anti-thrombomodulin, anti-Glut 1, anti-ER-related P29 and anti-melanoma-associated antigen 3

·anti-CD44v6 combined with any one probe selected from the group consisting of anti-VEGF, anti-thrombomodulin, anti-Glut 1, anti-ER-relatedP29 and anti-melanoma-associated antigen 3, and with one or more additional probes

·anti-CD44v6 combined with any two probes selected from the group consisting of anti-VEGF, anti-thfombomodulin, anti-Glut 1, anti-ER-related P29 and anti-melanoma-associated antigen 3, and with one or more additional probes

·anti-CD44v6 combined with any three probes selected from the group consisting of anti-VEGF, anti-thrombomodulin, anti-Glut 1, anti-ER-related P29 and anti-melanoma-associated antigen 3, and with one or more additional probes

·anti-CD44v6 combined with any four probes selected from the group consisting of anti-VEGF, anti-thrombomodulin, anti-Glut 1, anti-ER-related P29 and anti-melanoma-associated antigen 3, and with one or more additional probes

·anti-CD44v6, anti-VEGF, anti-thrombomodulin, anti-Glut 1, anti-ER-related P29, anti-melanorna-associated antigen 3 및 하나 이상의 프로브들

대 세포 칼시노마(Large cell Carcinoma)와 다른 폐암의 판별

·anti-VEGF combined with one or more additional probes.

·anti-VEGF and anti-p120

·anti-VEGF and anti-Glut 3

·anti-VEGF, anti-p120 and anti-Cyclin A

·anti-VEGF, anti-p120 및 하나 이상의 프로브들

·anti-VEGF, anti-Glut 3 및 하나 이상의 프로브들

·anti-VEGF, anti-p 120, anti-Cyclin A and one or more additional probe

메소텔리오마(Mesothelioma)와 다른 폐암의 판별

·anti-CD44v6 combined with one or more additional probes.

·anti-proliferating cell nuclear antigen combined with one or more additional probes.

·anti-human epithelial related antigen(MOC-31) combined with one or more additional probes.

·two probes selected from the group consisting of anti-CD44v6, anti-proliferating cell nuclear antigen and anti-human epithelial related antigen (MOC-31), combined with one or more additional probes

·anti-CD446, anti-proliferating cell nuclear antigen, anti-human epithelial related antigen (MOC-3 1) 및 하나 이상의 프로브들.

소세포(Small cell)와 다른 폐암의 판별

·anti-proliferating cell nuclear antigen combined with one or more additional probes.

·anti-BCL2 combined with one or more additional probes.

·anti-EGFR combined with one or more additional probes.

·two probes selected from the group consisting of anti-proliferating cell nuclear antigen, anti-BCL2 and anti-EGFR anti-proliferating cell nuclear antigen, anti-BCL2, anti-EGFR

·two probes selected from the group consisting of anti-proliferating cell nuclear antigen, anti-BCL2 and anti-EGFR, combined with one or more additional probes

·anti-proliferating cell nuclear antigen, anti-BCL2, anti-EGFR 및 하나 이상의 프로브들

아데노칼시노마(Adenocarcinoma), 스쿠아무스(Squamous) 세포 칼시노마(Carcinoma), 대 세포 칼시노마, 메소텔리오마 및 소세포(Small cell) 칼시노마의 동시 판별

·two or more probes selected from anti-VEGF, anti-thrombomodulin, anti-CD44v6, anti-surfactant apoprotein A, anti-proliferating cell nuclear antigen, anti-mucin 1, antihuman epithelial related antigen (MOC-31), anti-TTF-1, anti-N-cadherin, anti-EGFR and anti-proliferatifig cell nuclear antigen

·anti-VEGF, anti-thrombomodulin, anti-CD44v6, anti-surfactantapoprotein A, antiproliferating cell nuclear antigen, anti-mucin 1, anti-human epithelial related antigen (MOC-3 1). anti-TTF-1, anti-N-cadherin, anti-EGFR and anti-proliferating cell nuclear antigen

·two or more probes selected from anti-VEGF, anti-thrombomodulin, anti-CD44v6, anti-surfactant apoprotein A, anti-proliferating cell nuclear antigen, anti-mucin 1, antihuman epithelial related antigen (MOC-31), anti-TTF-1, anti-N-cadherin, anti-EGFR and anti-proliferating cell nuclear antigen, combined with one or more additional probes

·anti-VEGF, anti-thrombomodulin, anti-CD44v6, anti-surfactant apoprotein A, antiproliferating cell nuclear antigen, anti-mucin 1, anti-human epithelial related antigen (MOC-31). anti-TTF-1, anti-N-cadherin, anti-EGFR and anti-proliferating cell nuclear antigen, combined with one or more additional probes

5. 결론

a. 분자 진단에 대한 패널 접근의 유용성

i. 직관이 아닌(non-intuitive) 솔루션

대조군과 암의 각각의 프로브의 마커 점수를 분포를 보여주는 히스토그램(PathologistData.xls, worksheet: Histograms)을 플롯으로 그렸다. 이러한 히스토그램으로부터, 특이적인 패널을 위한 직관적인 프로브의 선택이 분명하지 않고, 상기 설명된 발명은 명확한 방법이 없는 상태에서 효과적인 조합이 발견되도록 한다는 것이 분명하다.

ii. 다양한 산물을 적용하기 위한 최적화

iii. 다른 방법을 사용하는 비슷한 결과에 의해 예증된 접근의 경건성

이 보고서의 다양한 분석에 의해 얻어진 결과 및 표 및 도면에 요약되어 있는 정밀한 조사는 다음 사항을 발견한다.

1. 각각의 프로브의 수행을 주의깊게 조사하는 것은 프로브 하나를 이용하여 수행하는 것보다 좋은 결과를 수행할 프로브의 명백한 조합을 만들지는 않는다.

2. 모든 분류 방법론은 비슷한 세트의 특징에서 평가의 기초다. 작은 차이는 어떤 분류기를 다른 분류기보다 선호하는 데이테 구조에 기인한다.

3. 이러한 방법 중 하나에 의하여 설계된 모든 분류기들은, 독립적인 병리학자에 의한 데이터로부터 시험된, 설계과정에서 보지 못한 좋은 실행결과를 가져온다. 이러한 점이 본 발명에 신뢰감을 준다.

4. 프로브 7 단독에 기초한 검출 패널은 높은 수행성을 나타낸다.

5. 프로브 7이 프로브 16 또는 25와 결합하면 보다 좋은 결과를 얻는다.

6. 프로브 7과 다른 프로브가 결합하면 보다 좋은 수행성을 향상시키지만, 예외의 경우가 너무 낮아서, 이들은 대표성이 없으며 그렇게 설계된 분류기는 일반적이지 않다.

7. 프로브 7을 제외한 프로브로부터 선택된 패널의 수행은, 사람을 사용하는 스크리닝을 사용하는 현재의 수행과 비교되기에 충분히 좋은 소정의 판별성을 제공한다. 그러나, 장래에 사용될 병리학적 진단 세포학의 세계에서 자동 측정되는 것만큼 좋지는 않다.

8. 프로브의 다른 조합은 유용하지만 덜 좋은 수행 능력을 제공한다.

9. 어떤 프로브들을 이 발명에서 이용할 수 없게 되면, 본 발명은 다른 프로브의 조합을 선택한다. 이는 상업적으로 유용한 프로브 세트를 기초해서 설계된 분류기에 의하 예증된다. 도 7 참조.

10. 본 발명은 웨이팅이 비싼 프로브에 대응하여 적용될 수 있도록 한다. 이들을 이 분석에서 전체적으로 제외하는 것보다, 이는, 그들의 공헌이 중요하다면 그들이 패널에 포함되는 것을 허락한다.

11. 다른 암으로부터 폐암의 타입을 판별할 수 있는 단독의 폐암 특이적인 판별의 설계를 가능하게 한다.

12. 다섯가지 암을 분류하는 하나의 패널의 수행 분석은, 판별은 가능하지만 전체적인 에러율은 각각 다른 암으로부터 하나의 암을 판별하도록 하는 설계된 다섯 개의 패널보다 나쁘다.

13. 다섯개의 두가지 분류기를 조합함으로써 보다 유용한 판별을 할 수 있다.

14. 다섯 개의 판별 패널에 대한 세 개의 분류 방법론에 의해 공통의 프로브 세트가 선택되었는데 이는 다시 그 결과에 신뢰를 준다.

15. 아데노칼시노마의 분리된 경우를 위한 프로브는 1, 14, 19, 20, 25 및 27이다.

16. Squamous Cell cancer의 분리된 경우를 위한 프로브는 1, 2, 3, 24, 25, 및 26이다.

17. Large Cell cancer의 분리된 경우를 위한 프로브는 7 또는 1, 및 21이다.

18. Mesothelioma의 분리된 경우를 위한 프로브는 3, 12, 및 16이다.

19. Small Cell cancer의 분리된 경우를 위한 프로브는 12, 20 및 23이다.

20. 모든 암을 동시에 인식하기 위한 프로브는 1, 2, 3, 4, 12, 14, 19, 22, 23, 및 28이다.

21. 본 발명에 의해 정의된 복수의 쌍으로 된 패널을 사용하는 장점은 의심스러운 경우는 다섯 개의 패널 중 어디에도 점수가 가지 않고, 또한 혼한스러운 경우는 두 개 이상의 패널에 보여질 것이다. 이러한 변칙적인 리포트는 더 많은 분석이 지적한 세포학에 경종을 울린다.

iv. 리스크 처리 연구

본 연구에서 적용된 테스트들은 본질적으로 통계적이다. 실행에 있어서 작은 발전에 기초하여 선택된 프로브들은 새로운 데이터에 의해 테스트될 경우 통계적인 가변성이 있다는 위험이 있다. 결과에 신뢰를 주기 위하여, 병리학 1 및 병리학 2의 데이터에 대한 선형 판별 분석으로부터 도출되는 가장좋은 분류기가 측정되었다. 병리학 3의 데이터는 통계학적으로 병리학 1 및 병리학 2의 데이터와는 다르다는 것을 명심해야 하며, 따라서, 병리학 3의 데이터를 이용하는 테스트에서좋은 수행결과가 얻어지면 이는 실제상에서도 좋을 것이다.

(1) 보이지 않는 데이터에 대한 보고-검출 패널

(a) 방법

상기 "검출 패널 조성"이라고 이름붙여진 부분에서 대상 7 및 16에서 좋은 분류가 얻어지는 것을 보았다. SPSS를 사용하여, H 값이 모두 7 및 16으로 보고된 모든 병리학 3의 데이터를 선택하였다. 이어, 트랜스폼과 컴퓨터를 이용하여, 정규의 판별 함수가 새로운 특징으로 생성되었다. 이러한 특징의 수행은 단독으로 나중에 테스트되었다.

(b)결과

이들은 병리학 1 및 병리학 2에서 설계된 분류기의 테스트 및 병리학 3의 결과에 대한 테스트의 결과이다. 상기 분류기는 프로브 7 및 16에 대하여 선형 판별 함수를 이용하여 설계되었다. 정규의 병리학 2 함수는 =0.965*프로브7-0.298*프로브16 이다.

이는 하기 보는 바와 같이 프로브 7에 대한 병리학 3의 데이터를 분류하는것보다 더 좋다.

(c) 결론

이는, 7 및 16에 기초한 두 개의 프로브 분류기가 프로브 7에만 기초한 분류기보다 더 좋다는 것을 확신시켜준다.

(2) 보이지 않는 데이터에 대한 보고 - 판별 패널

(a) 배경

하기 보고된 것은 LDF를 사용하고 보이지 않은 병리학 3의 데이터로 테스트된 병리학 1 및 병리학 2의 데이터로 설계된 분류기의 실행을 보여준다. 설계단계에서 경우(case) 수는 비교적 작았고, 테스트 데이터에서의 수도 작았다. 따라서, 처음 세트 및 두 번째 세트에 대한 수행사이에서 좋은 정도의 가변도를 기대할 수 있다.

(b) 방법

SPSS에서, 상기 "패턴 인식" 부분에서 유도된 정규분포함수가 설립되고, 모든 다섯 개의 암에 대하여 병리학 3의 데이터를 테스트하였다.

(c)결과

작은세포 암 LDF=프로브12*0.575-프로브20s*0.408-프로브22s*0.423+프로브23s* 0.344

스쿠아무스 세포 암 LDF= -프로브1sc*0.328-프로브2sc*0.295+프로브3sc*0.741+프로브24s*0.490+프로브25s*0.393+프로브26s*0.426

대세포 암 LDF=프로브1sc*0.847+프로브7sc*0.452

더 낮지만 더 유용한 수행이 설계된 분류기에서 수행되고, 대세포 암의 작은 경우 수에 대하여 테스트 되었는 바, 이 결과는 매우 고무적이다.

Adenocarcinorna, LDF= - probe4sc* .515 + probe5sc* .299 - probel4s*.485 - probel9s* .347 + Probe20s * .723 + probe25s* .327 + probe27s* .327

(d) 결론

이러한 분류기들의 수행정도가 보이지 않는 데이터를 적용하는 테스트까지 도달하는 것을 주목하는 것은 고무적이다. 이는 각각의 암을 검출하는데 매우 높은 신뢰도를 준다.

(3) 다른 환자 및 병리학으로부터 데이터에 대한 훈련 및 테스트

최종의 마지막 확실성 테스트로서, 병리학 1 및 병리학 2 양쪽에 의해 검토된 LDF가 수행되었다. 이는, 병리학 3에 검토된 데이터는 제거한다. 따라서, 병리학 3 더하기 병리학 1의 데이터 양쪽에 의해 검토된 데이터에 대한 테스트는 한쪽으로 치우치지 않는다. 먼저 테스트 과정은 테스트 및 훈련을 위한 동일한 환자로부터의 데이터를 이용하여 바이어스 되었다.

LDF는 포함되어 있지 않은 프로브 4를 제외한 특징의 세트와 동일한 세트를 생산했다. LDF는= probe1sc * .288 + probe7sc .846 - probel5s *.249 -probel6s* .534 였다.

병리학 3만의 데이터에 대한 프로브 7 단독으로, 여전히 타당성 있는 결과이지만, 유사한 결과, 그러나 커브 아래의 더 적은 영역이 얻어졌다.

참고문헌

[1]Goldberg-Kahn, B., Healy, J.C. and Bishop, J.W. (1997) The cost of diagnosis: a comparison of four different strategies in the workup of solitary radiographic lung lesions. Chest 111, 870-6

[2] O'Donovan, P.B. (1997) The radiologic appearance of lung cancer. Oncology (Huntingt) 11, 1387-402; discussion 1402

[3] Worrell, J.A. (1995) Radiology of the central airways. Otolaryngol Clin North Am 28, 701

[4] Henschke, C.I., Miettinen, O.S., Yankelevitz, D.F., Libby, D.M. and Smith, J.P. (1994) Radiographic screening for cancer. Proposed paradigm for requisite research. Clin Imaging 18,16

[5] Lam, S., Kennedy, T., Unger, M., Miller, Y.E., Gelmont, D., Rusch, V., Gipe, B., Howard, D., LeRiche, J.C., Coldinan, A. and Gazdar, A.F. (1998) Localization of bronchial intraepithelial neoplastic lesions by fluorescence bronchoscopy. Chest 113, 696-702

[6] Sazon, D.A., Santiago, S.M., Soo Hoo, G.W., Khonsary, A., Brown, C., Mandelkern, M., Blahd, W. and Williams, AJ. (1996) Fluorodeoxyglucose-positron emission tomography in the detection and staging of lung cancer. Am J Respir Crit Care Med 153, 417-21

[7] Lowe, V.J., DeLong, D.M., Hoffinan, J.M. and Coleman, R.E. (1995) Optimum scanning protocol for FDG-PET evaluation of pulmonary malignancy. JNucl Med 36, 883-7

[8] Lowe, V.J., Fletcher, J.W., Gobar, L., Lawson, M., Kirchner, P., Valk, P., Karis, J., Hubner, K., Delbeke, D., Heiberg, E.V., Patz, E.F. and Coleman, R.E. (1998) Prospective investigation of positron emission tomography in lung nodules. J Clin Oncol 16, 1075-84

[9] Raab, S. S., Hornberger, J. and Raffin, T. (1 997) The importance of sputum cytology in the diagnosis of lung cancer: a cost-effectiveness analysis. Chest 1 12, 937-45

[10] Franklin, W.A. (1998) New molecular and cellular approaches to lung cancer detection. In: Biology of Lung Cancer, pp. 529-570

[11] Kern, W.H. (1988) The diagnostic accuracy of sputum and urine cytology. Acta Cytol 32, 651-4

[12] Mehta, A.C., Marty, J.J. and Lee, F.Y. (1993) Sputum cytology. Clin Chest Med 14, 69

[13] Gledhill, A., Bates, C., Henderson, D., DaCosta, P. and Thomas, G. (1997) Sputum cytology: a limited role. J Clin Pathol 50, 566

[14] Steffee, C.H., Segletes, L.A. and Geisinger, K.R. (1997) Changing cytologic and histologic utilization patterns in the diagnosis of 515 primary lung malignancies. Cancer 81, 105

[15] Zaman, M.B. (1991) Pulmonary cytology. Clin Lab Med 11, 293

[16] Flehinger, B.J. and Melamed, M.R. (1994) Current status of screening for lung cancer. Chest Surg Clin N Am 4,1 31.1

[17] Koss, L.G., Melanied, M.R. and Goodner, J.T. (1964) Pulmonary cytology: A brief survey of diagnostic results from July lst, 1952 until December 31st, 1960. Acta Cytol 8, 104.

[18] Saccomanno, G., Saunders, R.P., Ellis, H., Archer, V.E., Wood, B.G. and Beckler, P.A. (1963) Concentration of carcinoma or atypical cells in sputum. Acta Cytol 5, 305

[19] Miura, H., Konaka, C., Kawate, N., Tsuchida, T. and Kato, H. (1 992) Sputum cytology-positive, bronchoscopically negative adenocarcinoma of the lung [see comments]. Chest 102, 1328

[20] Valatis, J., WaVens, D. and Gamble, D. (1981) Increased incidence of adenocarcinoma of the lung. Cancer 47, 1042

[21] Baldini, E.H. and Strauss, G.M. (1997) Women and lung cancer: waiting to exhale. Chest 112, 229S-234S.

[22] Caldwell, C.J. and Berry, C.L. (1996) Is the incidence of primary adenocarcinoma of the lung increasing Virchows Arch 429, 359

[23] Risse, E.K., Vooijs, G.P. and van't Hof, M.A. (1987) Relationship between the cellular composition of sputum and the cytologic diagnosis of lung cancer. Acta Cytol 31, 170

[24] Holiday, D.B., McLarty, J.W., Farley, M.L., Mabry, L.C., Cozens, D., Roby, T., Waldron, E., Underwood, R.D., Anderson, E., Culbreth, W. and et al. (1995) Sputum cytology within and across laboratories. A reliability study. Acta Cytol 39, 195

[25] Eddy, D.M. (I 989) Screening for lung cancer [see comments]. Ann Intern Med 1 1 1, 232

[26] Younes, M., Brown, R.W., Stephenson, M., Gondo, M. and Cagle, P.T. (1997), Overexpression of Glutl and Glut3 in stage 1 nonsmall cell lung carcinoma is associated with poor survival. Cancer 80, 1046-5 1.

[27] Ogawa, J., Inoue, H. and Koide, S. (1997) Glucose-transporter-type-l-gene amplification correlates with sialyl- Lewis-X'synthesis and proliferation in lung cancer. Int J Cancer 74, 189

[28] Ito, T., Noguchi, Y., Satoh, S., Hayashi, H., hiayama, Y. and Kitarnura, H. (1998) Expression of facilitative glucose transporter isoforms in lung carcinomas: its relation to histologic type, differentiation grade, and turnor stage [see comments]. Mod Pathol 119 437

[29] Sosolik, R.C. , McGaughy, V.R. and De Young, B.R. (I 997) Amti-MOC-3 1: a pptential addition to the pulmonary adenocarcinoma versus mesothelioma immunohistochemistry panel. Mod Pathol 10, 716

[30] Ordonez, N.G. (I 998) Value of the MOC-31 monoclonal antibody indifferentiating epithelial pleural mesothelionia from lung adenocarcinoma. Hum Pathol 29, 166

[31] Takanami, L, Tanaka, F., Hashizurne, T., Kikuchi, K., Yamamoto, Y., Yamamoto, T. and Kodaira, S. (1996) The basic fibroblast growth factor and its receptor in pulmonary adenocarcinomas: an investigation of their expression as prognostic markers. Eur J Cancer 32A, 1504

[32] Takanami, I., hnamura, T., Hashizume, T., Kikuchi, K., Yamamoto, Y., Yamamoto, T. and Kodaira, S. (1996) Immunohistochemical detection of basic fibroblast growth factor as a prognostic indicator in pulmonary adenocarcinoma. Jpn J Clin Oncol 26, 293

[33] Ohta, Y., Endo, Y., Tanaka, M., Shimizu, J., Oda, M., Hayashi, Y., Watanabe, Y. and Sasaki, T. (1996) Significance of vascular endothelial growth factor messenger RNA expression in primary lung cancer. Clin Cancer Res 2, 1411-6 1996.

[34] Volm, M., Koomagi, R., Mattern, J. and Stammler, G. (1997) Prognostic value of basic fibroblast growth factor and its receptor (FGFR-1) in patients with non-small cell lung carcinomas. Eur J Cancer 33, 691

[35] Hiyama, K., Hiyania, E., Ishioka, S., Yamakido, M., Inai, K., Gazdar, A.F., Piatyszek, M.A. and Shay, J.W. (1995) Telomerase activity in small-cell and non-small-cell lung cancers [see comments]. J Nad Cancer hist87, 895

[36] Yashima, K., Litzky, L.A., Kaiser, L., Rogers, T., Lam, S., Wistuba, 111, Milchgrub, S., Srivastava, S., Piatyszek, M.A., Shay, J.W. and Gazdar, A.F. (1997) Telomerase expression in respiratory epithelium during the multistage pathogenesis of lung carcinomas. Cancer Res 57, 2373

[37] Ahrendt, S.A., Yang, S.C., Wu, L., Westra, W.H., Jen, J., Califano, J.A. and Sidransky, D. (1997) Comparison of oncogene mutation detection and telomerase activity for the molecular staging of non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res 3, 1207

[38] Albanell, J., Lonardo, F., Rusch, V., Engelhardt, M., Langenfeld, J., Han, W., Klimstra, D., Venkatranian, E., Moore, M.A. and Dmitrovsky, E. (1997) High telomerase activity in primary lung cancers: association with increased cell proliferation rates and advanced pathologic stage. J Natl Cancer Inst 89, 1609

[39] Hiyama, K., Ishioka, S., Shay, J.W., Taooka, Y., Maeda, A., Isobe, T., Hiyama, E., Maeda, H. and Yamakido, M. (1998) Telomerase activity as a novel marker of lung cancer and immune- associated lung diseases. Int J Mol Med 1, 545

[40] Yahata, N., Ohyashiki, K., Ohyashiki, J.H., Iwaina, H., Hayashi, S., Ando, K., Hirano, T., Tsuchida, T., Kato, H., Shay, J.W. and Toyama, K.(1998) Telornerase activity in lung cancer cells obtained from bronchial washings, J Natl Cancer Inst 90, 684

[41] Lee, J. C., Jong, H. S., Yoo, C. G., Han, S.K., Shim, Y. S. and Kim, Y.W. (1 99 8) Telomerase activity in lung cancer cell lines and tissues. Lung Cancer 21, 99

[42] Arai, T., Yasuda, Y., Takaya, T., Ito, Y., Hayakawa, K., Toshima, S., Shibuya, C., Yoshimi, N. and Kashiki, Y. (1998) Application of telomerase activity for screening of primary lung cancer in broncho-alveolar lavage fluid. Oncol Rep 5, 405-8

[43] Fujii, M., Motoi, M., Saeki, H., Aoe, K. and Moriwaki, S. (1993) Prognostic significance of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) expression in non-sniall cell lung cancer. Acta Med Okayama 47, 103

[44] Kawai, T., Suzuki, M., Kono, S., Shinomiya, N., Rokutanda, M., Takagi, K., Ogata, T. and Tamai, S. (1994) Proliferating cell nuclear antigen and Ki-67 in lung carcinoma. Correlation with DNA flow cytometric analysis. Cancer 74, 2468

[45] Ogawa, J., Tsurumi, T., Yamada, S., Koide, S. and Shohtsu, A. (1994) Blood vessel invasion and expression of sialyl Lewisx and proliferating cell nuclear antigen in stage I non-small cell lung cancer. Relation to postoperative recurrence. Cancer 73, 1177

[46] Ebina, M., Steinberg, S.M., Mulshine, J.L. and Linnoila, R.I. (1994) Relationship of p53 overexpression and up-regulation of proliferating cell nuclear antigen with the clinical course of non-small cell lung cancer. Cancer Res 54, 2496

[47] Fontanini, G., Vignati, S., Bigini, D., Merlo, G.R., Ribecchini, A., Angeletti, C.A., Basolo, F., Pingitore, R. and Bevilacqua, G. (1994) Human non-small cell lung cancer: p53 protein accumulation is an early event and persists during metastatic progression [see comments]. J Pathol 174, 23 -3 1.

[48] Wiethege, T., Voss, B. and Muller, K.M. (1995) P53 accumulation and proliferatingcell nuclear antigen expression in human lung cancer. J Cancer Res Clin Oncol 121, 371

[49] Esposito, V., Baldi, A., De Luca, A., Micheli, P., Mazzarella, G., Baldi, F., Caputi, M. and Giordano, A. (1997) Prognostic value of p53 in non-small cell lung cancer relationship with proliferating cell nuclear antigen and cigarette smoking. Hum Pathol 285 233

[50] Caputi, M., Esposito, V., Groger, A.M., Pacilio, C., Murabito, M., Dekan, G., Baldi, F., Wolner, E. and Giordano, A. (1998) Prognostic role of proliferating cell nuclear antigen in lung cancer: an immunohistochemical analysis. In Vivo 12, 85

[51] Hirata, T., Fukuse, T., Naiki, H., Hitomi, S. and Wada, H. (1998) Expression of CD44 variant exon 6 in stage I non-small cell lung carcinoma as a prognostic factor. Cancer Res 58, 1108

[52] Ariza, A., Mate, J.L., Isamat, M., Lopez, D., Von Uexkull-Guldeband, C.,. Rosell, R., Femandez-Vasalo, A. and Navas-Palacios, J.J. (1995) Standard and variant CD44 isoforms are commonly expressed in lung cancer of the non-small cell type but not of the small cell type. J Pathol 177, 363

[53] Fasano, M., Sabatini, M.T., Wieezorek, R., Sidhu, G., Goswami, S. and Jagirdar, J. (1997) CD44 and its v6 spliced variant in lung tumors: a role in histogenesis of Cancer 80, 34

[54] Miyoshi, T., Kondo, K., Hino, N., Uyarna, T. and Monden, Y. (1997) The expression of the CD44 variant exon 6 is associated with lymph node metastasis in non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res 3, 1289

[55] Tran, T.A., Kallakury, B.V., Sheehan, C.E. and Ross, J.S. (1997) Expression of CD44 standard form and variant isoforrns in non-small cell lung carcinomas. Hum Pathol 28, 809

[56] Takigawa, N., Segawa, Y., Mandai, K., Takata, 1. and Fujimoto, N. (1997) Serum CD44 levels mi patients with non-small cell lung cancer and their relationship with clinicopathological features. Lung Cancer 18, 147

[57] Kondo, K., Miyoshi, T., Hino, N., Shimizu, E., Masuda, N., Takada, M., Uyarna, T. and Monden, Y. (1998) High frequency expressions of CD44 standard and variant forms in non- small cell lung cancers, but not in small cell lung cancers. J Surg Oncol 6% 128

[58] Sasaki, J.I., Tanabe, K.K., Takahashi, K., Okamoto, I., Fujimoto, H., Matsumoto, M., Suga, M., Ando, M. and Saya, H. (1998) Expression of CD44 splicing isofonns in lung cancers: dominant expression of CD44v8-10 in non-small cell lung carcinomas. Int J Oncol 12, 525 131.1 @31.1

[72] Kurasono, Y., Ito, T., Kameda, Y., Nakamura, N. and Kitamura, H. (1998) Expression of cyclin D 1, retinoblastoma gene protein, and p 1 6 MTS 1 protein in atypical adenomatous hyperplasia and adenocarcinonia of the lung.An immunohistochemical analysis. Virchows Arch 432, 207

[73] Tanaka, H., Fujii, Y., Hirabayashi, H., Miyoshi, S., Sakaguchi, M., Yoon, H.E. and Matsuda, H. (1998) Disruption of the RB pathway and cell-proliferative activity in non- small-cell lung cancers. Int J Cancer 79, 111

[74] Ofivero, M., Rizzo, M., Madeddu, R., Casadio, C., Pennacchietti, S., Nicotra, M.R., Prat, M., Maggi, G., Arena, N., Natali, P. G.,, Comoglio, P.M. and Di Renzo, M.F. (1996) Overexpression and activation of hepatocyte growth factor/scatter factor in human non-small-cell lung carcinomas. Br J Cancer 74, 1862

[75] Harvey, P., Wam, A., Newman, P., Perry, L.J., Ball, R.Y. and Wam, R.M. (1996) Immunoreactivity for hepatocyte growth factor/scatter factor and its receptor, met, in human lung carcinomas and malignant mesotheliomas. J Pathol 180, 389

[76] Takanami, I., Tanana, F., Hashizume, T., Kikuchi, K., Yamamoto, Y., Yamamoto, T. and Kodaira, S. (1996) Hepatocyte growth factor and c-Met/hepatocyte growth factor receptor in pulnionary adenocarcinomas: an evaluation of their expression as prognostic markers. Oncology 53, 392

[77] Siegfried, J.M., Weissfeld, L.A., Luketich, J.D., Weyant, R.J., Gubish, C.T. and Landreneau, R.J. (1998) The clinical significance of hepatocyte growth factor for nonsmall cell lung cancer. Ann Thorac Surg 66,1915

[78] Nguyen, P.L., Niehans, G.A., Cherwitz, D.L., Kim, Y.S. and Ho, S.B. (1996) Membrane-bound (MUC I) and secretory (MUC2, MUC3, and MUC4) mucin gene expression in human lung cancer. Tumour Biol 17, 176

[79] Yu, C.J., Yang, P.C., Shun, C.T., Lee, Y.C., Kuo, S.H. and Luh, K.T. (1996) Overexpression of MUC5 genes is associated with early post-operative metastasis in non-small-cell lung cancer. Int J Cancer 69, 457

[80] Yu. C.J., Shun, C.T., Yang, P.C., Lee, Y.C., Shew, J.Y., Kuo, S.H. and Luh, K.T. 1997) Sialomucin expression is associated with erbB-2 oncoprotein overexpression, early recurrence, and cancer death in non-small-cell lung cancer [published erratum appears in Am J Respir Crit Care Med 1997 Aug; 156(2 Pt 1):677-8]. Am J Respir Crit Care Med 15 5, 1419

[81] Jarrard, J.A., Linnoila, R.I., Lee, H., Steinberg, S.M., Witschi, H. and Szabo, E. (1998) MUC 1 is a novel marker for the type II pneumocyte lineage during lung carcinogenesis. Cancer Res 58, 5582

[82] Oligami, A., Tsuda, T., Osaki, T., Mitsudomi, T., Morimoto, Y., Higashi, T. and Yasumoto, K. (1 999) MUC 1 mucin mRNA expression in stage I lung adenocarcinoma and its association with early recurrence. Ann Thorac Surg 67, 8 1 04.

[83] Bejarano, P.A., Baughman, R.P., Biddinger, P.W., Miller, M.A.,Fenoglio-Preiser, C., al-Kafaji, B., Di Lauro, R. and Whitsett, J.A. (1996) Surfactant proteins and thyroid transcription factor- I in pulmonary and breast carcinomas. Mod Pathol 9, 445

[84] Harlamert, H.A., Mira, J., Bejarano, P.A., Baughman, R.P., Miller, M.A., Whitsett, J.A. and Yassin, R. (1998) Thyroid transcription factor-1 and cytokeratins 7 and 20 in pulnionary and breast carcinoma. Acta Cytol 42, 1382 )31.1

[85] Fontanini, G., Vignati, S., Lucchi, M., Mussi, A., Calcinai, A., Boldrini, L., Chine, S., Silvestri, V., Angeletti, C.A., Basolo, F. and Bevilacqua, G. (1 997) Ncoangiogenesis and p53 protein in lung cancer: their prognostic role and their relation with vascular endothelial growth factor (VEGF) expression [see comments]. Br J Cancer 75, 1295301.

[86] Shibusa, T., Shijubo, N. and Abe, S. (1998) Tumor angiogenesis and vascular endothelial growth factor expression in stage I lung adenocarcinoma. Clin Cancer Res 4, 1483

[87] Giatromanolaki, A., Koukourakis, MI, Kakolyris, S., Turley, H., O'Byrne, K., Scott, P.A., Pezzella, F., Georgoulias, V., Harris, A.L. and Gatter, K.C. (1998) Vascular endothelial growth factor, wild-type p53, and angiogenesis in early operable nonsmall cell lung cancer. Clin Cancer Res 4, 3017

[88] Fontanini, G., BoldrinL L., Vignati, S., Chine, S., Basolo, F., Silvestri, V., Lucchi, M., Mussi, A., Angeletti, C.A. and Bevilacqua, G. (1998) BcI2 and p53 regulate vascular endothelial growth factor (VEGF)- mediated angiogenesis in non-small cell lung carcinoma. Eur J Cancer 34, 718

[89] Takahama, M., Tsutsumi, M., Tsujiuchi, T., Kido, A., Okajima, E., Nezu, K., Tojo, T., Kushibe, K., Kitamura, S. and Konishi, Y. (1998) Frequent expression of the vascular endothelial growth factor in human non-small-cell lung cancers. Jpn J Clin Oncol 28, 176

[90] Sozzi, G., Miozzo, M., Tagliabue, E., Calderone, C., Lombardi, L., Pilotti, S., Pastorino, U., Pierotti, M.A. and Della Porta, G. (1 99 1) Cytogenetic abnon-nalities and overexpression of receptors for growth factors in normal bronchial epithelium and tumor samples of lung cancer patients. Cancer Res 51, 400

[91] Volm, M., Efferth, T., Mattern, J. and Wodrich, W. (1992) Overexpression of c-fas and c-erbBl encoded proteins in squarnous cell carcinomas of the lung of smokers. Int J Oncol 1, 69-71 1992.

[92] Wodrich, W. and Volm, M. (1993) Overexpression of oncoproteins in non-small cell lung carcinomas of smokers. Carcinogenesis 14, 1121

[93] Pastorino, U., Sozzi, G., Miozzo, M., Tagliabue, E., Pilotti, S. and Pierotti, M.A. (1993) Genetic changes in lung cancer. J Cell BiochemSuppl 17F, 237

[94] Gorgoulis, V., Sfikakis, P.P., Karameris, A., Papastamatiou, H., Trigidou, R., Veslemes, M., Spandidos, D.A, Sfikakis, P. and Jordanoglou, J. (1995) Molecular and immunohistochemical study of class I growth factor receptors in squamous cell lung carcinomas. Pathol Res Pract 191, 973

[95] Rusch, V., Klimstra, D., Linkov, 1. and Dmitrovsky, E. (1995) Aberrant expression of p53 or the epidermal growth factor receptor is frequent in early bronchial neoplasia and coexpression precedes squamous cell carcinoma development. Cancer Res 55, 1365

[96] Rusch, V.W. and Dmitrovsky, E. (1995) Molecular biologic features of non-small cell lung cancer. Clinical implications. Chest Surg Clin N Am 5, 39

[97] Fontanini, G., Vignati, S., Bigini, D., Mussi, A., Lucchi, H., Angeletti, C.A., Pingitore, R., Pepe, S., Basolo, F. and Bevilacqua, G. (1995) Epidermal growth factor receptor (EGFr) expression mi non-small cell lung carcinomas correlates with metastatic involvement of hilar and mediastinal lymph nodes in the squamous subtype. Eur J Cancer 3 IA, 178

[98] Pflug, B. and Djakiew, D. (1996) Expression of the low affinity nerve growth factor receptor in prostate epithelial cells negatively regulates nerve growth factor- mediated growth via induction of apoptosis(Meeting abstract). Proc Annu Meet Am Assoc Cancer Res 37, A262 1996.

[99] Rusch, V., Klimstra, D., Venkatraman, E., Langenfeld, J., Pisters, P. and Dmitrovsky, E. (1996) Overexpression of EGFR and TGF-alpha is frequent in early stage nonsmall cell lung cancer, but does not predict tumor progression (Meeting abstract). Proc Annu Meet Am Assoc Cancer Res 37, Al 314 1996.

[100] Fujino, S., Enokibori, T., Tezuka, N., Asada, Y., Inoue, S., Kato, H. and Mori, A. (1996) A comparison of epidermal growth factor receptor levels and other prognostic parameters in non-small cell lung cancer. Eur J Cancer 32A, 2070

[101] Pastorino, U., Andreola, S., Tagliabue, E., Pezzella, F., hicarbone, M., Sozzi, G., Buyse, M., Menard, S., Pierotti, M. and Rilke, F. (1997) Immunocytochemical markers in stage I lung cancer: relevance to prognosis. J Clin Oncol 15, 2858

[102] Sekine, I., Takami, S., Guang, S.G., Yokose, T., Kodama, T., Nisbiwaki, Y., Kinoshita, M., Matsumoto, H., Ogura, T. and Nagai, K. (1998) Role of epidermal growth factor receptor overexpression, K-ras point mutation and c-myc amplification in the carcinogenesis of non-small cell lung cancer. Oncol Rep 5, 351

[103] Pfeiffer, P., Nexo, E., Bentzen, S.M., Clausen, P.P., Andersen,K., Rose, C. and Nex, E. (1998) Enzyme-linked immunosorbent assay of epidermal growthfactorreceptor, in lung cancer: comparisons with immunohistochemistry, clinicopathological features and prognosis. Br J Cancer 78, 96

[104] D'Amico, T.A., Massey, M., Hemdon, J.E., 2nd, Moore, M.B. and Harpole, D.H., Jr. (1999) A biologic risk model for stage I lung cancer: immunohistochemical analysis of 408 patients with the use of ten molecular markers. J Thorac Cardiovasc Surg 117, 736

[105] Engel, M., Theisinger, B., Seib, T., Seitz, G., Huwer, H., Zang, K.D., Welter, C. and Dooley, S. (1993) High levels of =23-111 and =23-112 messenger RNA in human squamous- cell lung carcinoma are associated with poor differentiation and advanced tumor stages. Int J Cancer 55, 375

[106] Ozeki, Y '., Takishima, K. and Mamiya, G. (1994) hnmunohistochemical analysis of nrn23/NDP kinase expression in human lung adenocarcinoma: association with tumor progression in Clara cell type. Jpn J Cancer Res 85, 840

[107] Lai, W.W., Wu, M.H., Yan, T.J. and Chen, F.F. (1996) Immunohistochemical analysis of nm23-H1 in stage I non-small cell lung cancer: a useful marker in prediction of metastases. Ann Thorac Surg 62, 1500

[108] Gazzeri, S., Brambilla, E., Negoescu, A., Thoraval, D., Veron,M., Moro, D. and Brambilla, C. (1996) Overexpression of nucleoside diphosphate/kinase A/mn23-H1 protein in human lung tumors: association with tumor progression in squamous carcinoma. Lab Invest 74, 158

[109] MacKinnon,M.,Kerr,K.M.,King,G.,Kennedy,M.M.,CockbumJ.S.andJeffrey, R.R. (1997) p53, c-erbB-2 and nm23 expression have no prognostic significance in primary pulmonary adenocarcinoma. Eur J Cardiothorac Surg 11, 838 )31.1

[110] Bosnar, M.H., Pavelic, K., Krizanac, S., Slobodnjak, Z. and Pavelic, J. (1997) Squamous cell lung carcinomas: the role of mri23-HI gene. J Mol Med 75 '609

[111] Kawakubo, Y., Sato, Y., Koh, T., Kono, H. and Kameya, T. (1997) Expression of nm23 protein in pulmonary adenocarcinomas: inverse correlation to tumor progression. Lung Cancer 17, 103

[112] Ritter, J.H., Dresler, C.M. and Wick, M.R. (1995) Expression of bel-2 protein in stage T 1NOMO non-small cell lung carcinoma. Hum Pathol 26, 1227

[113] Kitagawa, Y., Wong, F., Lo, P., Elliott, M., Verburgt, L.M., Hogg, J.C. and Daya, M. (1996) Overexpression of Bcl-2 and mutations in p53 and K-ras in resected human non-small cell lung cancers. Am J Respir Cell Mol Biol 15, 45

[114] Rao, S.K., Krishna, M., Woda, B.A., Savas, L. and Fraire, A.E. (1996) Immunchistochemical detection of bcl-2 protein in adenocarcinorna and nonneoplastic cellular compartments of the lung. Mod Pathol 9, 555

[115] Boers, J.E., ten Velde, G.P. and Thunnissen, F.B. (1996) P53 in squamous metaplasia. a marker for risk of respiratory tract carcinoma. Am J Respir Crit Care Med 153, 41 16.

[116] Coppola, D., Clarke, M., Landreneau, R., Weyant, R.J., Cooper, D. and Yousem, S.A. (1996) Bcl-2, p53, CD44, and CD44v6 isoform expression in neuroendocrine tumors of the lung. Mod Pathol 9, 484

[117] Higashiyama, M., Doi, O., Kodama, K., Yokouchi, H. and Tateishi, R. (1996) Bcl-2 oncoprotein expression is increased especially in the portion of small cell carcinoma within the combined type of small cell lung cancer. Tumour Biol 17, 341

[118] Strauss, G.M. (1997) Prognostic markers in resectable non-small cell lung cancer. Hematol Oncol Clin North Am 11, 409

[119] Anton, R. C., Brown, R.W., Younes, M., Gondo, M.M., Stephenson, M.A. and Cagle, P.T. (1997) Absence of prognostic significance of bcl-2 immunopositivity in nonsmall cell lung cancer: analysis of 427 cases. Hum Pathol 28, 1079

[120] Ishida, H., Irie, K., Itoh, T., Furukawa, T. and Tokunaga, 0.(1997) The prognostic significance of p53 and bcI-2 expression in lung adenocarcinoma, and its correlation with Ki-67 growth fraction. Cancer 80, 1034

[121] Stefanaki, K., Rontogiannis, D., Vamvouka, C., Bolioti, S., Chaniotis, V., Sotsiou, F., Vlychou, M., Delidis, G., Kakoly-fis, S., Georgoulias, V. and Kanavaros, P. (1998) Immunohistochemical detection of bcl2, p53, mdrn2 and p2l/wafl proteins in smallcell lung carcinomas. Anticancer Res 18, 1167

[122] Brambilla, E., Gazzeri, S., Lantuejoul, S., Coll, J.L., Moro, D., Negoescu, A. and Brambilla, C. (1998) p53 mutant immunophenotype and deregulation of p53 transcription pathway (Bcl2, Bax, and Wafl) in precursor bronchial lesions of lung cancer. Clin Cancer Res 4, 1609

[123] Salgia, R. and Skarin, A.T. (1998) Molecular abnormalities in lung cancer. J Clin Oncol 16,1207

[124] Kim, Y.C., Park, K.O., Kern, J.A., Park, C.S., Lim, S.C., Jang, A.S. and Yang, J.B. (1998) The interactive effect of Ras, IIER2, P53 and Bcl-2 expression in predicting the survival of non-small cell lung cancer patients. Lung Cancer 22, 181 )31.1

[125] Groeger, A.M., Caputi, M., Esposito, V., De Luca, A., Salat, A., Murabito, M., Giordano, G.G., Baldi, F., Giordano, A. and Wolner, E. (1999)Bcl-2 protein expression correlates with nodal status in non small cell lung cancer. Anticancer Res 19, 821-4

[126] Vargas, S.O., Leslie, K.O., Vacek, P.M., Socinski, M.A. and Weaver, D.L. (1998) Estrogen-receptor-related protein p29 in primary nonsmall cell lung carcinoma pathologic and prognostic correlations. Cancer 82, 1495

[127] Higashiyama, M., Doi, O., Kodarna, K., Yokouchi, H. and Tateishi, R. (1994) Retinoblastoma protein expression in lung cancer: an immunohistochemical analysis. Oncology 51, 544

[128] Xu, H.J., Quinlan, D.C., Davidson, A.G. and et.al. (1994) Altered retinoblastoma protein expression and prognosis in early stage non-small cell lung carcinoma. J. Natl. Cancer Inst. 86, 695

[129] Lee, J.S., Kalapurakal, S., Ro, J.Y. and Hong, W.K. (1995) Prognostic significance of retinoblastoma protein expression in non- small cell lung cancer (Meeting abstract). Proc Annu Meet Am Assoc Cancer Res 36, A3787 1995.

[130] Dixon, G., Salisbury, J. and Walker, C. (1995) Expression of the retinoblastoma protein in normal and dysplastic bronchial epithelium and lung cancer (Meeting abstract). J Pathol 176, 32A 1995.

[131] Shapiro, G.I., Edwards, C.D., Kobzik, L., Godleski, J., Richards, W., Sugarbaker, D.J. and Rollins, B.J. (I 995) Reciprocal Rbinactivation and p 1 6 expression in lung cancer (Meeting abstract). Proc Annu Meet Am Assoc Cancer Res 36, A164 1995.

[132] Volm, M. and Stamniler, G. (1996) Retinoblastoma (Rb) protein expression and resistance in squamous cell lung carcinomas. Anticancer Res 16, 891

[133] Dosaka-Akita, H., Hu, S.X., Kinoshita, I., Fujino, M., Harada, M., Kawakami, Y. and Benedict, W.F. (1996) Prognostic significance of Rb protein expression in non-small cell lung cancer (NSCLC) (Meeting abstract). Proc Annu Meet Am Assoc Cancer Res 37@ A1401 1996.

[134] Kinoshita, I., Dosaka-Akita, H., Akie, K., Mishina, T., Hirounii, H. and Kawakami, Y. (1996) Significance of abnormal p16INK4 and RB protein expression in nonsmall cell lung cancer (NSCLC) (Meeting abstract). Proc Annu Meet Am Assoc Cancer Res 37, A3979 1996.

[135] Kratzke, R.A., Greatens, T.M., Rubins, J.B., Maddaus, M.A., Niewoehner, D.E., Niehans, G.A. and Geradts, J. (I 996) Rb and p 1 6INK4a expression in resected nonsmall cell lung tumors. Cancer Res 56, 3415

[136] Sakaguchi, M., Fujii, Y., Hirabayashi, H., Yoon, H.E., Komoto, Y., Oue, T., Kusafuka, T., Okada, A. and Matsuda, H. (1996) Inversely correlated expression of p 1 6 and Rb protein in non-small cell lung cancers: an immunohistochemical study. Int J Cancer 65, 442

[137] Xu, H.J., Cagle, P.T., Hu, S.X., Lti, J. and Benedict, W.F. (1996) Altered retinoblastoma and p53 protein status in non-small cell carcinoma of the lung potential synergistic effects on prognosis. Clin Cancer Res 2, 1169-76 1996.

[138] Dosaka-Akita, H., Hu, S.X., Fujino, M., Harada, M., Kinoshita, I., Xu, H.J., Kuzumaki, N., Kawakami, Y. and Benedict, W.F. (1997) Altered retinoblastoma protein expression in nonsmall cell lung cancer: its synergistic effects with altered ras and p53 protein status on prognosis. Cancer 79, 1329

[139] Cagle, P.T., el-Naggar, A.K., Xu, H.J., Hu, SX and Benedict, W.F. (1997) Differential retinoblastoma protein expression in neuroendocrine tumors of the lung Potential diagnostic implications. Am J Pathol 150, 393

[140] Kashiwabara, K., Oyarna, T., Sano, T., Fukuda, T. and Nakajima, T. (1998) Correlation between methylation status of the p 1 6/CDKN2 gene and the expression of p16 and Rb proteins in primary non-small cell lung cancers. Int J Cancer 79, 215

[141] Caputi, M., Esposito, V., Groger, A.M., De Luca, A., Pacilio, C., Dekan, G., Giordano, G.G., Baldi, F., Wolner, E. and Giordano, A. (1998) RB growth control evasion in lung cancer. Anticancer Res 18, 2371

[142] Tamura, A., Matsubara, O., Hirokawa, K. and Aoki, N. (1993)Detection of thrombomodulin in human lung cancer cells. Am J Pathol 142, 79

[143] Tamura, A., Komatsu, H., Hebisawa, A., Kurashima, A., Mori, M. and Katayama, T. (1996) Is thrombomodulin useful as a tumor marker of a lung cancer Lung Cancer 15, 189

[144] Collins, C.L., Ordonez, N.G., Schaefer, R., Cook, C.D., Xie, S.S., Granger, J., Hsu, P.L., Fink, L. and Hsu, S.M. (1992) Thrombomodulin expression in malignant pleural mesothelioma and pulmonary adenocarcinoma. Am J Pathol 141, 827

[145] Hamatake, M., Ishida, T., Mitsudomi, T., Akazawa, K. and Sugimachi, K. (1996) Prognostic value and clinicopathological correlation of thrombomodulin in squamous cell carcinoma of the human lung. Clin Cancer Res 2, 763-6 1996.

[146] Ordonez, N.G. (I 997) Value of thrombomodulin immunostaining in the diagnosis of mesothelioma. Histopathology 31, 25

[147] Tolnay, E., Wiethege, T. and Muller, K.M. (1997) Expression and localization of thrombomodulin in preneoplastic bronchial lesions and in lung cancer. Virchows Arch 430, 209

[148] Bohm, M., Totzeck, B. and Wieland, 1. (1994) Differences of E-cadherin expression levels and patterns in human lung cancer. Ann Hematol 68, 81

[149] Bohm, M., Totzeck, B., Birchmeier, W. and Wieland, I. (1994) Differences of Ecadherin expression levels and patterns in primary and metastatic human lung cancer. Clin Exp Metastasis 12, 55

[150] Peralta Soler, A., Knudsen, K.A., Jaurand, M.C., Johnson, K.R., Wheelock, M.J., Klein-Szanto, A.J. and Salazar, H. (1995) The differential expression of N-cadherin and E-cadherin distinguishes pleural mesotheliomas from lung adenocarcinomas [see comments]. Hum Pathol 26, 1363

[151] Han, A.C., Peralta-Soler, A., Knudsen, K.A., Wheelock, M.J., Johnson, K.R. and Salazar, H. (1997) Differential expression of N-cadherin in pleural mesotheliomas and E- cadherin in lung adenocarcinomas in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues [see comments]. Hum Pathol 28, 641

[152] Weynants, P., Lethe, B., Brasseur, F., Marchand, M. and Boon, T.(1994) Expression of mage genes by non-small-cell lung carcinomas. Int J Cancer 56, 826-9

[153] Shichijo, S., Hayashi, A., Takamori, S., Tsunosue, R., Hoshino, T., Sakata, M., Kuramoto, T., Oizumi, K. and Itoh, K. (1995) Detection of MAGE-4 protein in lung cancers. Int J Cancer 64, 158

[154] S akata, M. (I 996) Expression of MAGE gene family in lung cancers. Kurume Med J 43@ 55

[155] Fischer, C., Gudat, F., Stulz, P., Noppen, C., Schaefer, C.,Zajac, P., Trutmann, M., Kocher, T., Zuber, M., Harder, F., Heberer, M. and Spagnoli, G.C. (1997) High expression of MAGE-3 protein in squamous-cell lung carcinoma [letter]. Int J Cancer 71, 1119

[156] Gotoh, K., Yatabe, Y., Sugiura, T., Takagi, K., Ogawa, M., Takahashi, T. and Mitsudorni, T. (1998) Frequency of MAGE-3 gene expression in HLA-A2 positive patients with non-small cell lung cancer. Lung Cancer 20, 117

[157] Uchiyama, B., Saijo, Y., Kuniano, N., Abe, T., Fujimura, S., Ohkuda, K., Handa, M., S atoh, K. and Nukiwa, T. (1997) Expression of nucleolar protein p 1 20 in human lung cancer: difference in histological types as a marker for proliferation. Clin Cancer Res 3, 1873

[158] Singh, G., Scheithauer, B.W. and Katyal, S.L. (1986) The pathobiologic features of carcinomas of type R pneurnocytes. An immunocytologic study. Cancer 57, 994

[159] Mizutani, Y., Nakajima, T., Morinaga, S., Gotoh, M., Shimosato, Y., Akino, T. and Suzuki, A. (1988) Irnmunohistochemical localization of pulmonary surfactant apoproteins in various lung tumors. Special reference to nonmucus producing lung adenocarcinomas. Cancer 61, 532

[160] Noguchi, M., Nakajima, T., Hirohashi, S., Akiba, T. and Shimosato, Y. (1989) Immunohistochemical distinction of malignantmesotheliorna from puhnonary adenocarcinoma with anti-surfactant apoprotein, anti- Lewisa, and anti-Tn antibodies. Hum Pathol 20, 53

[161] Linnoila, R.I., Jensen, S.M., Steinberg, S.M., Mulshine, J.L., Eggleston, J.C. and Gazdar, A.F. (1992) Peripheral airway cell marker expression in non-small cell lung carcinoma. Association with distinct clinicopathologic features [see comments]. Am J Clin Pathol 97, 233

[162] Shijubo, N., Tsutahara, S., Hirasawa, M., Takahashi, H., Honda, Y., Suzuki, A., Kuroki, Y. and Akino, T. (I 992) Pulmonary surfactant protein A in pleural effusions Cancer 69, 2905

[163] Shijubo, N., Honda, Y., Fujishima, T., Takahashi, H., Kodama, T., Kuioki, Y., Akino, T. and Abe, S. (1995) Lung surfactant protein-A and carcinoembryonic antigen in pleural effusions due to lung adenocareinoma and malignant mesothelioma. Eur Respir J 8, 403

[164] Nicholson, A.G., McCormick, C.J., Shirnosato, Y., Butcher, D.N. and Sheppard, M.N. (1995) The value of PE- 1 0, a monoclonal antibody against puh-nonary surfactant, in distinguishing primary and metastatic lung tumours. Histopathology 27, 57

[165] Khoor, A., Whitsett, J. A., Stahhnan, M. T. and Halter, S.A. (1997) Expressionof surfactant protein B precursor and surfactant protein B mNA in adenocarcinoma of the lung. Mod Pathol 10, 62

[166] Saitoh, H., Shimura, S., Fushimi, T., Okayama, H. and Shirato, K. (1997) Detection of surfactant protein-A gene transcript in the cells from pleural effusion for the diagnosis of lung adenocarcinoma. Am J Med 103, 400

[167] Grohs et al., Acta Cytologica, 1996, 40(l):26

[168] Grohs et al., Acta Cytologica, 1997, 41(l):144-152

Claims (47)

1. 일반적인 또는 특이적인 질병상태와 연관된 마커에 각각 특이적으로 결합하는 프로브를 포함하는 세포에 기초한 진단을 이용하여 일반적인 질병상태를 검출하거나 또는 특이적인 질병 상태들 사이를 판별하기 위한 패널로서, 패널의 구성요소인 프로브가 세포학적 견본에서 세포에 결합하는 패턴이, 상기 질병상태의 존재 또는 특성을 진단하는 것임을 특징으로 하는 패널.
2. 제 1항에 있어서, 상기 일반적인 질병상태는 암 및 감염성 질병으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 패널.
3. 제 2항에 있어서, 상기 암은 상피세포에 기인한 암, 고형 종양에 기초한 암, 분비기관 종양에 기초한 암 및 혈액에 기초한 암으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 패널.
4. 제 2항에 있어서, 상기 감염성 질병은 감염원이 바이러스, 박테리아, 원생동물, 기생동물 및 균류로 이루어진 군에서 선택된, 세포에 기초한 질병인 것을 특징으로 하는 패널.
5. 제 1항에 있어서, 상기 패널은 비용, 지리적인 위치에서 일반적인 질병 상태의 분포도, 지리적인 위치에서 특이적인 질병 상태의 분포도, 프로브의 유용성 및 상업적 고려로 이루어진 군에서 선택된 가중 인자를 사용하여 최적화 되는 것을 특징으로 하는 패널.
6. 제 1항에 있어서, 상기 프로브는 검출가능한 라벨을 포함하는 것을 특징으로 하는 패널.
7. 제 6항에 있어서, 상기 프로브는 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 패널.
8. 제 6항에 있어서, 상기 라벨은 크로모포어, 플루오로포어, 염색, 방사성동위원소 및 효소로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 패널.
9. 제 8항에 있어서, 상기 라벨은, 베타선, 감마선, Xtjs, 자외선, 가시광선, 적외선 및 마이크로파로 이루어진 군에서 선택된 전자기 방사를 이용하여 검출되는 크로모포어인 것을 특징으로 하는 패널.
10. 제 1항에 있어서, 상기 결합의 패턴은 포토닉 마이크로스코피를 이용하여 검출되는 것을 특징으로 하는 패널.
11. 제 10항에 있어서, 상기 포토닉 마이크로스코피는 베타선, 감마선, Xtjs, 자외선, 가시광선, 적외선 및 마이크로파로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 전자기 방사를 이용하는 것을 특징으로 하는 패널.
12. 제 3항에 있어서, 상기 검출은 폐암을 위한 것이고, 상기 판별은 스쿠아무스 세포 칼시노마, 아데노칼시노마, 대세포 칼시노마, 작은 세포 칼시노마 및 메소텔리오마 사이의 판별인 것을 특징으로 하는 패널.
13. 제 1항에 있어서, 상기 검출은 성적으로 전이된 질병에 대한 것이고, 상기 판별은 클라미디아(chlamydia), 트리고모나스, 임질, 포진 및 매독 사이의 판별인 것을 특징으로 하는 패널.
14. (a) 질병의 상태와 관련이 있는 마커의 라이브러리의 하나와 각각 특이적으로 결합하는 프로브의 감도 및 결합 특이성을 결정하는 단계; 및

    결합 패턴이, 상기 질병 상태의 존재 또는 특이적 특성을 진단하는 제한된 복수개의 프로브를 선택하는 단계;

    를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포에 기초한 진단을 이용하여 환자에게서 질병상태를 검출하거나 질병 상태들 사이의 판별을 위한 패널을 형성하는 방법.
15. 제 14항에 있어서, 상기 결정은:

    (a) 상기 질병을 앓고 있는 환자로부터의 조직학적 또는 세포학적 시료를 상기 각각의 프로브와 접촉시키는 단계;

    (b) 상기 시료의 세포에 존재한다고 알려진 상기 마커의 자리에서 상기 각각의 프로브가 그 상보적인 질병의 마커와 특이적으로 결합한 양을 측정하는 단계; 및

    상기 양을 상기 질병의 존재 또는 특성이적인 특성과 연관시키는 단계;

    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제 14항에 있어서, 상기 선택은 하나 이상의 통계적인 분석방법, 패턴 인식방법 및 신경네트워크 분석을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제 14항에 있어서, 상기 선택은 가중 요소를 이용하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 질병상태와 특이적인 비정상 세포를 포함하는 것으로 생각되는 세포학적 시료를 제 1항에 의한 패널과 접촉시키는 단계; 및

    상기 질병상태의 존재 또는 특이적인 특성을 진단하는 상기 프로브와 결합된 패턴을 검출하는 단계;

    를 포함하는 질병을 검출하거나 또는 질병 상태 사이를 판별하는 방법.
19. 제 18항에 있어서, 상기 세포학적 시료는 체액, 상피세포에 기초한 기관, 파인니들 아스피레이션 또는 생체 조직편에서 얻어진 세포 시료인 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제 19항에서, 상기 세포학적 시료는 객담인 것을 특징으로 하는 방법.
21. 세포에 기초한 진단을 이용하여 일반적인 질병상태를 검출하거나 특이적인 질병의 상태들을 판별하기 위한 패널로서, 상기 패널은 제 14항에 의한 방법에 의하여 형성되는 것을 특징으로 하는 패널.
22. 제 21항에 있어서, 상기 질병상태는 폐암인 것을 특징으로 하는 패널.
23. 제 1항에 있어서, 상기 질병의 마커는 형태학적 바이오마커, 유전적 바이오마커, 세포 사이클 바이오마커, 분자 바이오마커 및 생화학적 바이오마커로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 패널.
24. 제 3항에 있어서, 상기 상피세포에 기초한 암은, 폐의, 비뇨기의, 위장의 또는 생식기의 관에서부터 유래된 것임을 특징으로 하는 패널.
25. 제 3항에 있어서, 상기 종양에 기초한 암은 육종(sarcoma), 유방암, 췌장암, 간암, 신장암, 갑상선암 및 전립선암으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로하는 패널.
26. 제 3항에 있어서, 상기 분비계 종양에 기초한 암은 육종(sarcoma), 유방암, 췌장암, 간암, 신장암, 갑상선암 및 전립선암으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 패널.
27. 제 3항에 있어서, 상기 혈액에 기초한 암은 백혈병 및 림포마로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 패널.
28. 제 24항에 있어서, 상기 질병상태는 폐암이며, 상기 프로브는 Glutl, HERA, FGF, telomerase, PCNA, CD44v6, cyclin A, HGF, NWC-1, 갑상선 전이인자, VEGF, EGF receptor, PCNA, nm23, E-cadherin, Bel-2, cyclin Dl, RB, N-Cadherin, thrombomodulin 및 이들의 기능적 동등체로 이루어진 군에서 선택된 마커와 결합하는 것을 특징으로 하는 패널.
29. 제 19항에 있어서, 상기 체액은 피, 오줌, 척수액 및 림프로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 패널.
30. 제 19항에 있어서, 상기 상피 세포에 기초한 기관은 폐의 관, 비뇨기의 관, 위장관의 또는 생식기의 관으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 패널.
31. 제 19항에 있어서, 상기 파인니들 아스피레이션은 기관 및 시스템에서 견고한 조직 타입에서 유래됨을 특징으로 하는 패널.
32. 제 19항에서 상기 생체 조직편은 기관 및 시스템에서 견고한 조직 타입에서 유래됨을 특징으로 하는 패널.
33. 제 32항 또는 33항에 있어서, 상기 기관 및 시스템은 유방, 췌장, 간, 신장, 갑상선, 골수, 전립선 및 허파로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 패널.
34. 제 23항에 있어서, 상기 형태학적 바이오마커는 DNA 플로이디, MACs 및 프리멜리그넌트 병변으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 패널.
35. 제 23항에 있어서, 유전적 바이오마커는 DNA 내전, DNA 돌연변이 및 아포토틱 인덱스로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 패널.
36. 제 23항에 있어서, 상기 세포 사이클 바이오마커는 세포상의 증식 마커, 분할 마커, 레귤러터리 분자 및 아폽토시스 마커로 이루어진 군에서 선택된 것임을특징으로 하는 패널.
37. 제 23항에 있어서, 상기 분자 바이오마커 또는 생화학적 바이오마커는 옹코진, 종양 억제 유전자, 종양 항원, 성장인자, 수용기(receptor), 효소, 단백질, 프로스타글란딘 및 점착분자로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 패널.
38. 제 24항에 있어서, 폐의 암은 폐암인 것을 특징으로 하는 패널.
39. 제 38항에 있어서, 폐암을 검출하기 위하여, 상기 복수개의 프로브는 cyclin A와 결합하는 프로브 또는 관련된 마커 또는 기능적으로 관련된 마커를 포함하는 것을 특징으로 하는 패널.
40. 제 39항에 있어서, 상기 복수개의 프로브는 SP-B, HERA 또는 ER-관련(p29)된 것과 결합하는 하나 이상의 프로브 또는 관련된 마커 또는 기능적으로 관련된 마커를 포함하는 것을 특징으로 하는 패널.
41. 제 38항에 있어서, 다른 폐암에서 아데노칼시노마를 판별하기 위하여, 상기 복수개의 프로브는 뮤신(Musin) 1 및 갑상선 전이 인자와 결합하는 프로브 또는 관련된 마커 또는 기능적으로 관련된 마커를 포함하는 것을 특징으로 하는 패널.
42. 제 41항에 있어서, 상기 복수개의 프로브는 VEGF, SP-A, BCL-2, ER-관련된 (p29) 및 Glut 3와 결합하는 결합하는 프로브 또는 관련된 마커 또는 기능적으로 관련된 마커를 포함하는 것을 특징으로 하는 패널.
43. 제 38항에 있어서, 다른 폐암에서 스쿠아무스 세포 칼시노마를 판별하기 위하여, 상기 복수개의 프로브는 CD44v6 및 ER-관련된 (p29)의 하나 또는 모두와 결합하는 프로브 또는 관련된 마커 또는 기능적으로 관련된 마커를 포함하는 것을 특징으로 하는 패널.
44. 제 43항에 있어서, 상기 복수개의 프로브는 VEGF, thrombomodulin, Glut I 및 MAGE 3와 결합하는 프로브 또는 관련된 마커 또는 기능적으로 관련된 마커를 포함하는 것을 특징으로 하는 패널.
45. 제 38항에 있어서, 다른 폐암에서 대 세포(large cell) 칼시노마를 판별하기 위하여, 상기 복수개의 프로브는 CVEGF, cyclin A 및 P120와 결합하는 하나 이상의 프로브와 결합하는 프로브 또는 관련된 마커 또는 기능적으로 관련된 마커를 포함하는 것을 특징으로 하는 패널.
46. 제 38항에 있어서, 다른 폐암에서 메소텔리오마를 판별하기 위하여, 상기 복수개의 프로브는 CD44v6, PCNA 및 HERA와 결합하는 하나 이상의 프로브와 결합하는프로브 또는 관련된 마커 또는 기능적으로 관련된 마커를 포함하는 것을 특징으로 하는 패널.
47. 제 38항에 있어서, 다른 폐암에서 작은 세포(small cell) 칼시노마를 판별하기 위하여, 상기 복수개의 프로브는 PCNA, BCL-2 및 EGFR와 결합하는 하나 이상의 프로브와 결합하는 프로브 또는 관련된 마커 또는 기능적으로 관련된 마커를 포함하는 것을 특징으로 하는 패널.