DE112005001530B4

DE112005001530B4 - Verfahren zur Spektralidentifikation von Mikroorganismen

Info

Publication number: DE112005001530B4
Application number: DE112005001530T
Authority: DE
Inventors: Ashraf Ismail; Jonah Kirkwood; Jacqueline Sedman; Andrew Ghetler; Tom Pinchuk; John Austin; Lorraine Gour
Original assignee: CA MINISTER HEALTH & WELFARE; McGill University; Canada Minister of National Health and Welfare
Current assignee: Canada, As Re Ca; McGill University
Priority date: 2004-07-01
Filing date: 2005-06-30
Publication date: 2013-02-28
Anticipated expiration: 2025-07-01
Also published as: US20080132418A1; US9551654B2; US20170167973A1; CA2572342A1; WO2006002537A1; DE112005001530T5

Abstract

Verfahren zum Charakterisieren eines Mikroorganismus, wobei das Verfahren umfasst: a) Erhalten von mindestens einem mehrere Pixel aufweisenden Spektralbild des Mikroorganismus; b) Auswählen von einem oder mehreren Spektren aus dem Spektralbild mit mehreren Pixeln auf der Basis von vorbestimmten Spektraleigenschaften, wobei die ausgewählten Spektren Spektralinformationseigenschaften des Mikroorganismus aufweisen.

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Mikroorganismenidentifikation unter Verwendung von Spektraldaten.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Fouriertransformations-Infrarot-(FTIR)Spektroskopie ist ein bekanntes Verfahren für die Identifikation von Mikroorganismen (Mariey et al., 2001 Vibr. Spectrosc, 26: 151). Die Infrarot-(IR)Spektroskopie misst die Schwingungen von chemischen Bindungen innerhalb aller biochemischen Bestandteile von Zellen, d. h. Proteinen, Lipiden, Polysacchariden und Nukleinsäuren, und liefert eine quantitative Information über die gesamte biochemische Zusammensetzung des intakten gesamten Mikroorganismus. Da die IR-Spektren von Mikroorganismen aus unterschiedlichen und eindeutigen Mustern bestehen, dienen die Spektren ferner effektiv als ”Fingerabdrücke”, die ihre Verwendung bei der taxonomischen Unterscheidung ermöglichen. Tatsächlich wurde über die Verwendung der IR-Spektroskopie als Mittel zum Unterscheiden und Identifizieren von Bakterien nicht später als in den 50-er Jahren umfangreich berichtet. Es wurde jedoch zu dieser Zeit gefolgert, dass, obwohl einzelne Stämme von Bakterien definitiv eindeutige IR-Spektren aufweisen, die Identifikation von Bakterien durch die IR-Spektroskopie nicht als nützliches Verfahren betrachtet werden konnte, da die Prozedur zu zeitaufwändig und unpraktisch war. Tatsächlich wurden Berichte über die Untersuchung von Mikroorganismen durch IR-Spektroskopie in den 60-er Jahren weniger häufig und endeten praktisch in der Mitte der 70-er Jahre.
Das Interesse an diesem Verfahren lebte in den frühen 90-er Jahren wieder auf, als die Entwicklung der FTIR-Spektroskopie in Kombination mit dem Auftreten von chemometrischen Verfahren für die Analyse von FTIR-Daten einen breiten Bereich von neuen Anwendungen für die IR-Spektroskopie eröffnete (Griffiths und Chalmers Hrsg., 2001 Handbook of vibrational spectroscopy, John Wiley & sons, New-York, Band 5). Beginnend mit der Pionierarbeit von Naumann und Mitarbeitern in Deutschland (Naumann et al., 1991 Nature, 351: 81; Helm et al., 1991, J. Gen. Microbiol. 137: 69) wurde die FTIR-Spektroskopie innerhalb der letzten Dekade als für die mikrobielle Analyse nützlich demonstriert (Naumann, 2000 infrared spectroscopy in microbiology, in: R. A. Meyers (Hrsg.) encyclopedia of analytical chemistry, Wiley, Chichester S. 102–131). Das Verfahren ist einheitlich auf theoretisch alle Mikroorganismen anwendbar, die in einer Kultur gezüchtet werden können.
Vorgeschlagene potentielle mikrobiologische Anwendungen der FTIR-Spektroskopie umfassen (i) die Identifikation von lebensbedrohlichen Pathogenen im klinischen Labor; (ii) epidemiologische Untersuchungen, Durchführung von Fallstudien, Selektion von Pathogenen, Hygienekontrolle, Erklärung von Infektionsketten, Therapiekontrolle und Erfassung von wiederkehrenden Infektionen; (iii) die Charakterisierung und Selektion von Mikroorganismen von der Umwelt; (iv) die Überwachung von biotechnologischen Prozessen; (v) mikrobiologische Qualitätskontrolle in den Nahrungsmittel- und pharmazeutischen Industrien; und (vi) Pflege von Stammsammlungen.
Die Grundanforderung für die FTIR-Identifikation von Mikroorganismen besteht darin, dass die Varianz innerhalb der Spektren eines Taxons kleiner sein muss als die Varianz unter Spektren verschiedener Taxone. Obwohl die Variationen in einer biochemischen Zusammensetzung unter verschiedenen Taxonen zu Unterschieden in ihren IR-Spektren führen, können diese Unterschiede sehr geringfügig sein (z. B. zwischen verschiedenen Stämmen). Folglich erlegt die obige Anforderung der spektralen Reproduzierbarkeit strenge Bedingungen auf, und das Interesse an der IR-Bakterienidentifikation nahm in den 60-er Jahren weitgehend ab, da diese Bedingungen mit der zu der Zeit zur Verfügung stehenden IR-Instrumentenausrüstung nicht erreicht werden konnten.
Die Reproduzierbarkeit des Probenhandhabungsverfahrens, das verwendet wurde, um die FTIR-Spektren von Bakterien zu erfassen, ist auch von entscheidender Bedeutung. Die Analyse von IR-Spektren, um die Identifikation von Mikroorganismen zu ermitteln, indem ein Fingerabdruck bereitgestellt wird, wurde in der Vergangenheit verwendet. Solche Analysen haben jedoch eine relativ schlechte Reproduzierbarkeit und Identifikationserfolgsrate ergeben. FTIR-Spektren von Bakterien werden normalerweise durch Ablagern von Zellen, die in Salzlösung suspendiert sind, auf einem optischen Fenster (z. B. ZnSe) und Trocknen der Probe, um einen Bakterienfilm zu bilden, aufgezeichnet. Die spektrale Variabilität ergibt sich aus Unterschieden in der Verteilung der Zellen auf dem IR-Fenster, der Dicke des Bakterienfilms, dem Feuchtigkeitsgehalt des Films und dergleichen.
FTIR-Spektren von Mikroorganismen werden üblicherweise im Durchlassmodus erfasst, obwohl verschiedene andere Verfahren wie z. B. abgeschwächte Totalreflexion (ATR) und Remissionsspektroskopie (DRIFT) auch verwendet wurden. Für Spektren, die im Durchlassmodus erfasst werden, hängt die spektrale Reproduzierbarkeit hauptsächlich von der Gleichmäßigkeit der Probe (Probenhomogenität, Teilchengröße) und der Probendicke (oder Weglänge) ab. Die Probenungleichmäßigkeit führt zu Grundlinienschwankungen infolge der Streuung, Beugung und Brechung, die auftreten, wenn der IR-Strahl durch die Probe hindurchtritt, wohingegen Schwankungen der Probendicke zu Schwankungen der Bandintensität führen, obwohl eine Konsistenz in den relativen Peakintensitäten aufrechterhalten wird.
Herkömmliche IR-Verfahren für die Bakterienidentifikation weisen eine Anzahl von zusätzlichen Nachteilen auf. Bakterienzellen müssen beispielsweise vor der FTIR-Analyse ausgedehnt kultiviert werden, um die gesamte Biomasse zu erhöhen, und dann von den Wachstumsmedien auf ein für IR transparentes optisches Fenster, ein IR reflektierendes Substrat oder ein Element mit interner IR-Reflexion für die Spektralsammlung im Durchlassmodus, im Durchlass-Reflexions- bzw. abgeschwächten Totalreflexionsmodus überführt werden. Diese beiden Schritte stellen Engpässe dar, die verhindert haben, dass die Geschwindigkeitsvorteile der FTIR-Bakterienidentifikation vollständig ausgenutzt werden. Ferner machen sie den Aufbau einer spektralen Bibliothek zu einem mühseligen und zeitaufwändigen Prozess, der wahrscheinlich teilweise den Mangel an kommerziellen bakteriellen Infrarotspektren-Datenbanken erklärt, die erforderlich wären, damit die FTIR-Bakterienidentifikation in einer mikrobiologischen Routineanalyse implementiert wird.
Das US-Patent Nummer 5 660 998 , Naumann und Labischinski, beschreibt ein Verfahren zum Identifizieren von Bakterien durch Erhalten von IR-Spektren von kleinen Kolonien. Die Kolonien mit zwischen 50 und 4000 Zellen werden auf einer Oberfläche abgelagert, mit einem Mikroskop lokalisiert und ein Spektrum von jeder Kolonie wird erhalten. Wenn jedoch Mikroorganismen für die Erfassung von Spektraldaten auf einer Oberfläche abgelagert oder in einer Lösung suspendiert werden, ergibt sich gewöhnlich eine inhomogene Verteilung der Mikroorganismen innerhalb der Probe. Die herkömmliche Erfassung von Spektraldaten unterscheidet nicht Bereiche von Inhomogenitäten und stellt daher ein ”mittleres” Signal bereit, das Signalbeiträge umfassen kann, die die Spektralinformation für die Identifikation von Mikroorganismen weniger zuverlässig machen. Ferner können Bakterienkolonien, selbst wenn sie von einem reinen Stamm stammen, eine physiologische und biochemische Variabilität aufweisen, die die Reproduzierbarkeit der Spektraldaten beeinflussen kann.
Daher besteht ein Bedarf für verbesserte Verfahren zum Identifizieren von Mikroorganismen unter Verwendung von Spektraldaten.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren für die Identifikation von Mikroorganismen bereit, das die Begrenzung des Standes der Technik beseitigt. Bei einem Ausführungsbeispiel wird ein Verfahren zum Charakterisieren eines Mikroorganismus bereitgestellt, wobei das Verfahren das Erhalten mindestens eines Spektralbildes des Mikroorganismus mit mehreren Pixeln und das Auswählen von einem oder mehreren Spektren aus dem Spektralbild mit mehreren Pixeln auf der Basis von vorbestimmten Spektraleigenschaften umfasst, wobei die ausgewählten Spektren Spektralinformationseigenschaften des Mikroorganismus umfassen.
Bei einem weiteren Ausführungsbeispiel stellt das Verfahren ferner die Identifikation von Mikroorganismen durch Vergleichen der ausgewählten Spektren des Mikroorganismus mit Spektren von Bezugsmikroorganismen in einer Datenbank, um seine Identität zu ermitteln, bereit.
Bei noch einem weiteren Ausführungsbeispiel stellt das Verfahren auch die Erstellung einer Datenbank bereit, durch: Erhalten von mindestens einem Spektralbild mit mehreren Pixeln für jeden von einer Vielzahl von Bezugsmikroorganismen, wobei jedes Pixel ein Signal aufweist, das einem Spektrum eines Bezugsmikroorganismus entspricht; und Auswählen von Spektren aus den Spektralbildern mit mehreren Pixeln auf der Basis von vorbestimmten Spektraleigenschaften, um die Datenbank zu erstellen, wobei die Datenbank mindestens ein Spektrum für jeden der Bezugsmikroorganismen umfasst.
Bei einem weiteren Aspekt der Erfindung werden Unterdatenbanken bereitgestellt, die partielle oder transformierte Spektraldaten umfassen, um den Datenraum zu verringern und eine schnellere Analyse der unbekannten Probe zu ermöglichen.
Das Verfahren ermöglicht eine schnelle und sehr zuverlässige Identifikation von unbekannten Mikroorganismen für den Zweck der medizinischen Diagnose, Nahrungsmittel- und Umweltkontrolle und dergleichen.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden ausführlichen Beschreibung in Kombination mit den beigefügten Zeichnungen ersichtlich, in denen gilt:
1 ist ein FPA-FTIR-Bild einer bakteriellen Probe, das auch die zugehörigen Pixel und einige beispielhafte Spektren zeigt;
2 ist ein Ablaufplandiagramm eines Ausführungsbeispiels des Verfahrens der Erfindung für die Spektralcharakterisierung eines Mikroorganismus;
3 ist ein Ablaufplandiagramm eines Ausführungsbeispiels des Verfahrens der Erfindung für die Spektralidentifikation eines Mikroorganismus;
4 ist ein Ablaufplandiagramm eines Ausführungsbeispiels des Verfahrens der Erfindung für die Erstellung einer Datenbank unter Verwendung von Bezugsmikroorganismen;
5 ist ein repräsentatives IR-Spektrum einer Bakterienzelle;
6 zeigt die IR-Spektren von verschiedenen Bakterien in 1130–1085 cm^–1;
7 ist ein Dendrogramm, das die Trennung von 46 Bakterienproben auf der Basis des Spektralbereichs von 1000 bis 1530 cm^–1 zeigt;
8 ist ein Dendrogramm, das die Anhäufung von aus Nahrung stammenden Pathogenen zeigt;
9 ist ein Dendrogramm, das die Anhäufung für Proben von Clostridium botulinum zeigt;
10 zeigt fünf repräsentative Spektren von jedem Stamm von C. botulinum im Spektralbereich: 1180 bis 980 cm^–1, wobei die Spektren hinsichtlich der Grundlinie korrigiert und auf die Einheitspeakhöhe normiert wurden;
11 zeigt das Ergebnis der Hauptkomponentenanalyse unter Verwendung einer kommerziellen Software im Spektralbereich: 1180–980 cm^–1; und
12 ist ein Dendrogramm, das aus Stämmen von C. botulinum im Spektralbereich: 1180–980 cm^–1 erzeugt wurde; Abstandsmessung: euklidisch; Kopplungsverfahren: vollständig.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Identifizieren von Mikroorganismen unter Verwendung von Spektraldaten mit mehreren Pixeln.
In dieser Anmeldung ist mit einem Mikroorganismus irgendein einzelliger oder mehrzelliger Mikroorganismus gemeint, wie z. B., jedoch nicht begrenzt auf Bakterien, Viren, einzellige Eukaryoten und dergleichen.
Die vorliegenden Erfinder haben ein Verfahren entdeckt, das die Spektralcharakterisierung von Mikroorganismen ermöglicht und das im Wesentlichen die Probleme, die mit der Probeninhomogenität in Zusammenhang stehen, beseitigt. In einem breiten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum spektralen Charakterisieren von Mikroorganismen bereitgestellt. Ferner verringert das Verfahren signifikant die Auswirkung der Spektralinhomogenität einer Mikroorganismenprobe auf die Zuverlässigkeit der Identifikation des Mikroorganismus. Bei einem Ausführungsbeispiel der Erfindung wird eine Probe des Mikroorganismus auf einer Oberfläche abgelagert und Spektraldaten werden von einer Vielzahl von Bereichen innerhalb der Probe mit einer räumlichen Auflösung erfasst, die ausreicht, um Spektralschwankungen innerhalb der Probe zu unterscheiden. Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird die Erfassung für die Vielzahl von Bereichen unter Verwendung eines Matrixdetektors gleichzeitig durchgeführt, wobei die Auflösung durch die Matrixgröße festgelegt ist. Es wurde festgestellt, dass die Zuverlässigkeit der Charakterisierung des Mikroorganismus durch Auswählen von Bereichen, die Signale erzeugen, die vorbestimmte Spektraleigenschaften aufweisen, signifikant erhöht werden kann.
Die Erfassung der Signale von verschiedenen Bereichen einer Probe wird vorzugsweise durch Erhalten eines Spektralbildes mit mehreren Pixeln durchgeführt. Das Bild wird durch Beleuchten der Probe mit Licht mit einer oder mehreren Wellenlängen erhalten und das Dämpfungssignal wird an einer Vielzahl von Erfassungspunkten erfasst, die verschiedenen Bereichen der Probe entsprechen. Bei einem speziellen Ausführungsbeispiel wird das Dämpfungssignal unter Verwendung eines Matrixdetektors wie z. B. eines Linearmatrix- oder Mehrfachmatrixdetektors wie z. B. einer Kamera, beispielsweise einer CCD-Kamera, erfasst. Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird das Bild unter Verwendung von Infrarotlicht aufgezeichnet und bei einem bevorzugteren Ausführungsbeispiel wird das Bild unter Verwendung von Brennebenenmatrix-Fouriertransformations-Infrarotspektroskopie (FPA-FTIR) erhalten.
Bei der FPA-FTIR-Spektroskopie wird die Probe auf einer für IR transparenten Oberfläche wie beispielsweise Zinkselenid abgelagert und ein IR-Spektrum wird aus dem Signal erhalten, das bei jedem Pixel eines Detektors mit mehreren Pixeln erfasst wird. Die Ablagerung der Probe auf der Oberfläche wird vorzugsweise automatisch durchgeführt, sie kann jedoch auch manuell durchgeführt werden. Vorteilhafterweise ist nur eine sehr kleine Menge des Mikroorganismus erforderlich und kann aus einer beliebigen geeigneten Quelle, wie beispielsweise von einer auf einem geeigneten Medium gezüchteten Kolonie, erhalten werden. Die Probe wird auf die Oberfläche derart aufgebracht, dass eine Fläche bedeckt wird, die vorzugsweise nicht größer ist als die Oberfläche, die von einem Einzelmatrixdetektor erfasst werden kann. Ein typisches Spektralbild mit mehreren Pixeln ist in 1 mit einer schematischen Darstellung der Matrix von Pixeln und Beispielen von Spektren, die von jedem Pixel erhalten werden können, gezeigt.
Die Ablagerung der Probe kann manuell oder automatisch durchgeführt werden. Ein Zahnstocher kann beispielsweise verwendet werden, um eine kleine Probe von einer Bakterienkolonie zu sammeln. Alternativ kann eine Mikroorganismenlösung auf die Oberfläche pipettiert werden. Automatisierte Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, oder Verfahren, die verwendet werden, um eine kleine Menge einer Probe abzulagern, wie z. B. in US 5 660 998 beschrieben, können auch für die Probenablagerung verwendet werden. 1 veranschaulicht die Tatsache, dass die Ablagerung eines Mikroorganismus auf einer Oberfläche, in diesem Fall einer für IR transparenten Oberfläche, eine sehr heterogene räumliche Verteilung der Probe erzeugen kann.
Nach der Ablagerung der Probe auf der Oberfläche und mit Bezug auf 2 werden Daten vorzugsweise unter Verwendung eines FFA-FTIR-Spektrometers erfasst, um ein Bild mit mehreren Pixeln aufzuzeichnen, wobei jedes Pixel ein Spektrum eines Bereichs der Probe erzeugt. In einem zweiten Schritt werden Spektren ausgewählt, um nur diejenigen Spektren beizubehalten, die vorbestimmte Spektraleigenschaften aufweisen, um eine Spektralcharakterisierung des Mikroorganismus bereitzustellen. Die vorbestimmten Spektraleigenschaften, auf denen die Auswahl von Spektren (entsprechend gegebener Pixel) basiert, sind diejenigen, die die Qualität des Spektrums beeinflussen. Die Auswahl kann beispielsweise auf dem Rauschabstand, der Spektralintensität bei einer oder mehreren spezifischen Wellenlängen, der Qualität der Grundlinie und dergleichen basieren. Obwohl Absolutwerte der vorbestimmten Spektraleigenschaften zum Feststellen, ob ein Spektrum beibehalten wird, dienen können, kann die Auswahl auch auf der relativen Abweichung von den Eigenschaften eines Bezugsspektrums basieren.
Die Charakterisierung der Probe kann die Identifikation eines Mikroorganismus durch Vergleichen von einem oder mehreren der ausgewählten Spektren mit Spektren von Bezugsmikroorganismen, die in einer Datenbank gespeichert sind, umfassen (3). Obwohl die Datenbank aus Spektren bestehen kann, die unter Verwendung von bekannten Verfahren erfasst werden, umfasst sie vorzugsweise Spektren von Bezugsmikroorganismen, die unter Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung erhalten werden (4). Das heißt, die Datenbank wird durch Erfassen von Bildern von bekannten (Bezugs-)Mikroorganismen und Auswählen von Spektren von Pixeln dieser Bilder, die gewünschte vorbestimmte Spektraleigenschaften aufweisen, aufgebaut. Für jede Bezugsprobe kann eine große Anzahl von Spektren mit einem Bild mit mehreren Pixeln erfasst werden.
Wahlweise können die ausgewählten Spektren verarbeitet werden, um die Charakterisierung oder Identifikation des Mikroorganismus zu erleichtern. Die Verarbeitung kann beinhalten, ist jedoch nicht begrenzt auf: Erhalten einer Ableitung des Spektrums, Entfaltung, Grundlinienkorrektur, Normierung der Peakhöhe oder Peakfläche und dergleichen.
Aufgrund seiner hohen räumlichen Auflösung stellt das Verfahren der Erfindung auch vorteilhafterweise die Charakterisierung von Proben und die Erstellung von Datenbanken bereit, die chemische Inhomogenitäten widerspiegeln. Mit chemischen Inhomogenitäten sind chemische Schwankungen innerhalb einer Probe, die in den Spektren widergespiegelt werden, gemeint. Die chemischen Schwankungen können infolge der Anwesenheit einer Mischung von Mikroorganismen oder der Anwesenheit von chemischen ”Verunreinigungs”-Spezies oder chemischen Spezies, die von den Mikroorganismen abgesondert werden, auftreten. In dieser Hinsicht kann eine Mikroorganismenprobe biochemische/molekulare Schwankungen aufweisen, die dem Mikroorganismus eigen sein können. Solche chemischen Inhomogenitäten können beispielsweise durch die Synthese von bestimmten Molekülen in bestimmen Phasen des Koloniewachstums oder unter bestimmten Wachstumsbedingungen entstehen. Diese chemischen Inhomogenitäten können in den zur Erstellung der Datenbank verwendeten Proben vorhanden sein oder nicht und sie können ebenso in den unbekannten Proben vorhanden sein oder nicht. Mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ist es möglich, Spektren zu identifizieren, die chemische Inhomogenitäten umfassen (oder nicht), und zu identifizieren, ob sie vorhanden sind. In Abhängigkeit von den Bedürfnissen können chemische Inhomogenitäten in die Analyse eingeschlossen oder aus dieser ausgeschlossen werden. Das heißt, chemische Inhomogenitäten können ausgenutzt werden, um eine Vielzahl von Organismen gleichzeitig zu identifizieren oder um zusätzliche spektrale Merkmale vorzusehen, um bei der Charakterisierung oder Identifikation eines speziellen Mikroorganismus zu helfen. Das Verfahren der Erfindung vermeidet daher den Bedarf für die Verwendung von komplexen und ermüdenden Reinigungsprotokollen, um solche chemischen Inhomogenitäten zu beseitigen.
Zusätzlich zur Verbesserung der Spektralcharakterisierung und -identifikation von Mikroorganismen durch Beseitigen von Signalbeiträgen, die das Spektrum verzerren können, kann das Verfahren der Erfindung folglich auch die chemischen Inhomogenitäten einer Probe ausnutzen, um innewohnende Probenschwankungen zu nutzen, die in den Spektren von den verschiedenen Bereichen der Probe widergespiegelt werden, und dadurch zusätzliche Spektralinformationen für die Charakteristisierung und Identifikation von Mikroorganismen vorsehen.
Bei einem weiteren Ausführungsbeispiel können Unterdatenbanken erzeugt werden, die partielle oder transformierte Spektraldaten umfassen, die aus den ausgewählten oder verarbeiteten ausgewählten Spektren erhalten werden, um die Dimensionalität des Datenraums zu verringern und die zum Analysieren der Daten erforderliche Zeit zu verringern. Beispiele von Verfahren der Datenraumverringerung umfassen, sind jedoch nicht begrenzt auf: (i) Hauptkomponentenanalyse und (ii) direkte Anwendung von Bereichsauswahlalgorithmen auf die Spektraldaten, um die relevantesten Spektralinformationen für die Unterscheidung der Bakterien in der Datenbank zu identifizieren. Der Vergleich einer unbekannten Probe mit Bezugsproben kann daher unter Verwendung von mindestens einer Unterdatenbank oder einer Kombination von einer oder mehreren Unterdatenbanken oder einer Datenbank mit vollständigen Spektren durchgeführt werden.
Der Rauschabstand (SNR) eines Spektrums, das aus einem an einem einzelnen Pixel eines FPA-Detektors aufgezeichneten Signal erhalten wird, wurde als für eine zuverlässige Mikroorganismenidentifikation angemessen festgestellt. Es ist jedoch zu erkennen, dass mehrere Spektren zusammenaddiert werden können, um ein Spektrum mit einem höheren SNR zu erzeugen. Ferner können bei dem Ausführungsbeispiel, bei dem ein unbekannter Mikroorganismus identifiziert wird, einzelne Spektren oder Teilmengen von Spektren von dem Bild der zu identifizierenden Probe mit Spektren von Bezugsmikroorganismen in der Datenbank verglichen werden. Durch Vergleichen von verschiedenen Teilmengen von Spektren mit Bezugsspektren ist es möglich, ein Vertrauensniveau für die Genauigkeit des Vergleichs festzulegen.
Vorteilhafterweise können mehrere Proben unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung aus einem einzelnen FPA-FTIR-Bild gleichzeitig analysiert werden. In dieser Hinsicht können mehrere Proben auf einer für IR transparenten Oberfläche derart abgelagert werden, dass die Proben gleichzeitig in den IR-Strahldurchmesser eingeschlossen werden. Obwohl die Proben vorzugsweise getrennt werden sollten, um eine räumliche Überlappung zu vermeiden, kann die räumliche Unterscheidungsleistung des Verfahrens genutzt werden, um Spektren von jeder einzelnen Probe zu erhalten, selbst wenn eine teilweise Überlappung besteht. Das Verfahren stellt daher einen hohen Durchsatz bereit, der eine schnelle Identifikation von mehreren Proben ermöglicht. Aufgrund der kleinen Anzahl von erforderlichen Zellen wird ferner die für das Züchten der Proben erforderliche Zeit im Vergleich zu anderen Verfahren, die größere Probenmengen erfordern, beträchtlich verringert.
Algorithmen zum Vergleichen der Spektren von unbekannten Proben wie beispielsweise organischen Chemikalien mit Bezugsspektren in Datenbanken sind auf dem Fachgebiet bekannt. Diese Algorithmen können zum Vergleichen der Spektren von Bakterien verwendet werden. Der Algorithmus der K nächsten Nachbarn, künstliche neurale Netzwerke, eine mehrdimensionale Statistik, Unterstützungsvektormaschinen und eine hierarchische Datenbankverteilung und eine Kombination von diesen können beispielsweise für die Bakterienidentifikation durch Spektralvergleich mit einer Datenbank verwendet werden.
Ferner sind auch Verfahren zum Minimieren der Suchzeiten auf dem Fachgebiet bekannt und können auf das vorliegende Verfahren angewendet werden. Bei einem Ausführungsbeispiel wird eine hierarchische Datenbankverteilung verwendet, um Suchzeiten zu minimieren, und ermöglicht, dass das Spektrum einer Unbekannten mit einer Datenbank von über 300000 Spektren in einigen Sekunden verglichen wird. Die Identifikation eines unbekannten Bakteriums kann beispielsweise durch zuerst Identifizieren, ob es grampositiv oder gramnegativ ist, beginnen. Dies kann durch Vergleichen von Spektralbereichen mit Merkmalen, die die zwei Arten von Organismen unterscheiden (beispielsweise Spektralbänder, die Komponenten der äußeren Membran entsprechen), erreicht werden. Dann wird die Gattung identifiziert, gefolgt von der Identifikation der Spezies und schließlich des Stamms. In jedem Schritt wird eine Teilmenge von Spektren (beispielsweise von einer Unterdatenbank) verwendet, um die Suchzeit zu minimieren.
Beispiele:
Beispiel 1
Bei diesem Experiment wurden 80 Bakterienproben durch FPA-FTIR charakterisiert. Alle Spektren wurden an einem Abbildungsspektrometer Digilab FastIR, das mit einem Infrarotmikroskop Digilab UMA-600 und einem 16×16 MCT-Brennebenen-Matrixdetektor (Digilab, Randolph, MA, USA), der unter Win-IR Pro 3.3 (Digilab) arbeitete, ausgestattet war, durch Zusammenaddieren von 256 Abtastungen mit einer Auflösung von 8 cm^–1 gesammelt. Um ein Absorptionsvermögen zu erzeugen, wurden alle Einzelstrahlspektren und Brennebenenmatrix-Abbildungsspektren gegen das offene Strahlspektrum der Probe ins Verhältnis gesetzt. Ein konstanter Strom von trockener Luft wurde verwendet, um das Spektrometer und das Mikroskop von Kohlendioxid und Wasserdampf zu reinigen. Insgesamt (für die 80 Bakterienproben) wurden über 200000 Spektren von Bakterien und Bakterienzellextrakten aus den Spektralbildern aufgezeichnet, was im Durchschnitt 250 gute Pixel aus möglichen 256 Pixeln pro Bild ergab (jedes Pixel erzeugt ein eindeutiges Spektrum). Ein steriler Holzzahnstocher wurde in isolierte Kolonien von Bakterien eingeführt, um einige von der Züchtungsplatte sanft abzukratzen. Die Bakterien wurden dann auf der Oberfläche eines ZnSe-Kristalls in einer Fläche von einem Millimeter im Quadrat abgelagert. Um eine Kreuzverunreinigung der Bakterienflecken auf dem Zinkselenidkristall zu verhindern, wurden die Flecken auf ein Gitter mit einer Fläche von 1 Millimeter gelegt und leere Vertiefungen wurden immer zwischen Bakterienproben auf dem Kristall belassen. Die Bakterien wurden auf dem Träger für 10 Minuten luftgetrocknet und mit Ultraviolettlicht für anschließende 10 Minuten bestrahlt, um eine Bakterienzellenfixierung sicherzustellen.
Der hohe Grad der spektralen Ähnlichkeit von Bakterienspezies innerhalb derselben Gattung und die Tatsache, dass jede der acht analysierten Proben Tausende von Absorptionsvermögensmessungen für jede Probe hatte, benötigt computerisierte Verfahren zur Klassifizierung. Das Hauptverfahren der Bakterienklassifizierung wurde unter Verwendung einer hierarchischen Clusteranalyse (HCA) unter Verwendung einer kommerziellen Software (MINITAB^TM) durchgeführt. Das bevorzugte Verfahren der Bakterienidentifikation in dieser Studie war ein unüberwachtes Verfahren zur Klassifizierung, das auf ausgewählten Kombinationen von Spektralbereichen des Infrarotspektrums beruhte. Eine mehrdimensionale statistische Analyse betrachtet zahlreiche Eigenschaften der Spektren gleichzeitig, wohingegen eine eindimensionale statistische Analyse nur einen einzelnen Parameter des Objekts auswertet (d. h. ein einzelner Absorptionsvermögenswert bei einer bestimmten Wellenzahl). Mehrdimensionale Analyseverfahren ermöglichen die Untersuchung, Behandlung und graphische Darstellung von komplexen Datenkonfigurationen in Form von hierarchischen Graphen, die als Dendrogramme bekannt sind. Vor der mehrdimensionalen Analyse wurden die Rohdaten von den Spektren normiert (z. B. durch Peakhöhe oder -fläche) und anschließend gefiltert (z. B. indem die erste oder zweite Ableitung genommen wurde). Ferner wurden die interessierenden Spektralbereiche vorgewählt, um eine korrekte hierarchische Anhäufung zu ermöglichen.
Die hierarchische Clusteranalyse kann verwendet werden, um Datensätze relativ zu ihren innewohnenden Ähnlichkeiten zu gruppieren. Dieses Verfahren kann verwendet werden, wenn die Gruppen von Spektren anfänglich unbekannt sind und wenn keine äußere Information über die Gruppierung besteht. Durch FTIR auf die Bakterienidentifikation angewendet, gibt es zahlreiche Bereiche des MID-IR-Spektrums, die verwendet werden können, um verschiedene Dendrogramme (graphische Darstellungen der hierarchischen Cluster) zu erzeugen, daher ist die Wahl der Endgruppierung gewöhnlich datenspezifisch und wird nach dem Betrachten der Clusterstatistik festgelegt. An sich werden Bereiche der IR-Spektren (oder gegebenenfalls das ganze Spektrum) ausgewählt, um sicherzustellen, dass die erzeugten Dendrogramme den untersuchten Parameter widerspiegeln. Das Prinzip von Clusterbeobachtungen ist ein Verfahren, das einen hierarchischen Anhäufungsgraphen erzeugt, der so beginnt, dass alle Beobachtungen separat sind, wobei jede ihren eigenen Cluster bildet. Die MINITAB^TM-Software beginnt mit der Verarbeitung der Daten durch Verbinden der zwei Beobachtungen (oder Spektralbereiche in diesem Fall), die einander am ähnlichsten sind. Es wird erwartet, dass Spektren derselben Spezies Spektren aufweisen, die einander am meisten ähneln, da ein Infrarotspektrum eine Darstellung der gesamten biochemischen Zusammensetzung der Bakterienprobe ist. Durch Kontrollieren der Wachstumsmedien und Probenablagerung kann daher eine hierarchische Anhäufung zwei Spektren vom gleichen Stamm im ersten Schritt miteinander verbinden. Anschließend schließt sich entweder eine dritte Beobachtung an die ersten zwei an (wenn es sich um ein Spektrum von derselben Spezies wie oben handelt) oder der erste Schritt wird wiederholt, um zwei weitere Beobachtungen zu einem zweiten Cluster (eine zweite Spezies) miteinander zu verbinden. Der Anhäufungsprozess fährt fort, bis alle ähnlichen Spektralbereiche zu einem angehäuft sind. Wenn die Proben von verschiedenen Stämmen stammen und eindeutige Infrarotspektralbereiche aufweisen, die ihre Klassifizierung ermöglichen, würden wir erwarten, dass sie dieselbe Anzahl von Gruppen (oder Clustern) wie die Anzahl von eindeutigen Stämmen aufweisen. Die Größe jeder Gruppe wäre zur Anzahl von Spektren von jeder Art von Probe proportional. Die letztliche Gruppierung von Clustern (auch als Endverteilung bekannt) hängt von dem Verfahren zur Messung von Ähnlichkeiten (z. B. euklidische oder Pearson-Abstände sowie das Kopplungsverfahren) zwischen den Spektren ab und identifiziert Gruppen, deren Beobachtungen sich gemeinsame Eigenschaften teilen. Wenn die zweckmäßigen Infrarotbereiche ausgewählt werden und die Proben akribisch gezüchtet und verarbeitet werden, stellt das vollständige Dendrogramm eine graphische Darstellung der Klassifizierung von jeder Art von Bakterienstamm dar. Um eine spezielle Unbekannte zu identifizieren, kann man daher ihr Infrarotspektrum analysieren und anschließend feststellen, in welchen Cluster sie sich abtrennt.
5 zeigt die typische Bandzuweisung von Absorptionsbändern von Bakterien. 6 zeigt das Infrarotspektrum (im Bereich zwischen 1130 und 1080 cm^–1) von vier verschiedenen Bakterienproben. Feine Unterschiede in der Intensität und Frequenz der Absorptionsbänder ermöglichen die Klassifizierung von jedem Bakterienstamm.
7 ist ein Diagramm eines Dendrogramms, das aus 46 verschiedenen Bakterienproben erzeugt wurde. Diese Figur demonstriert die Fähigkeit der Infrarotspektroskopie, zwischen Bakterienspezies zu unterscheiden.
Beispiel 2
Für diese Auswertung der FPA-FTIR-Spektroskopie wurden zwei Digilab-Stingray-Systeme, eines mit einem 16×16- und das andere mit einem 32×32-Matrixdetektor ausgestattet, verwendet.
Versuchsprotokolle
Wachstum von Bakterien. Spektren von Bakterien können von intakten Zellen aufgezeichnet werden, die direkt von Kulturplatten genommen werden. Nicht später als in den 50-er Jahren wurde erkannt, dass die IR-Spektren von lebenden Bakterienzellen stark von der Zusammensetzung des Wachstumsmediums und der Wachstumszeit abhängen. Folglich ist eine äußerst genaue metabolische Kontrolle und strenge standardisierte Handhabung aller Proben bevorzugt, um eine ausreichende spektrale Reproduzierbarkeit zum Vergleich der IR-Spektren von Bakterien zu ergeben. Um die Verwendung der FTIR-Spektroskopie in der mikrobiologischen Routineanalyse zu erleichtern, wurde ein ”universelles Medium” (UM^TM) verwendet. Bis heute hat dieses Medium das Wachstum von theoretisch allen Bakterien und Hefen unterstützt, die getestet wurden. Alle 100 Stämme, die in der vorliegenden Arbeit verwendet wurden, wurden auf UM^TM-Agarplatten (von Quelab Laboratories Inc. bereitgestellt) für 16 h bei 37°C gezüchtet.
Probenablagerung. Ein steriler Holzzahnstocher wurde in isolierte Kolonien von Bakterien eingeführt, um einige von der Agarplatte sanft abzukratzen. Die Bakterien wurden dann auf der Oberfläche eines ZnSe-Kristalls mit 38 × 19 mm² in Flecken von ~ 1 mm² abgelagert. Um eine Kreuzverunreinigung zu verhindern, wurden die Flecken um Lücken von ~ 1 mm getrennt. Für jede Probe wurden 3–5 Kopien abgelagert. Die abgelagerten Bakterien wurden für 10 Minuten luftgetrocknet und dann für anschließende 10 Minuten mit Ultraviolettlicht bestrahlt, um das optische Fenster zu sterilisieren.
Spektralerfassung. In der ersten Studie wurden Spektren an einem Abbildungsspektrometer Digilab Stingray FTS-6000 gesammelt, das mit einem Infrarotmikroskop UMA-500 und einem 16×16 MCT-FPA-Detektor ausgestattet war, der unter Win-IR Pro 3.3 arbeitete. Das Mikroskop (in einer Saran-Umhüllung eingewickelt) wurde kontinuierlich mit trockener Luft von einem Balston-Trockner gespült. Für jeden Fleck von Bakterien auf dem Fenster wurden fünf Bilder von verschiedenen Stellen gesammelt. Alle Bilder wurden durch Zusammenaddieren von 256 Abtastungen mit einer Auflösung von 8 cm^–1 gesammelt und wurden gegen einen Hintergrund ins Verhältnis gesetzt, der von einer blanken Stelle auf dem optischen Fenster aufgezeichnet wurde. Unter den für jedes Bild gesammelten 256 Spektren wurden 3–5 zufällig für die Datenanalyse ausgewählt.
Mehrere Monate später wurde eine zweite Studie mit demselben System, das mit einem 32×32-Detektor ausgestattet war, durchgeführt. Bilder wurden von frischen Kulturen derselben Bezugsstäme, wie in ersten Studie untersucht, erfasst, um festzustellen, ob die Spektralbilder von Bakterien, die mit dem Stingray aufgezeichnet wurden, reproduzierbar waren. Zusätzliche Stämme, die in dieser Studie verwendet wurden, umfassten 31 Stämme, die aus verschiedenen Nahrungsmittel- und Wasserquellen isoliert wurden.
Datenanalyse. Die Unterscheidungsleistung der FPA-FTIR-Spektroskopie für die Unterscheidung von Bakterienstämmen wurde unter Verwendung der hierarchischen Clusteranalyse (HCA) unter Verwendung der MINITAB^TM-Software ausgewertet. Diese unüberwachte Methode wurde ausgewählt, da sie auf innewohnenden Gruppenstrukturen innerhalb der Spektraldaten basiert. Vor der HCA wurden alle Spektren normiert (z. B. durch Peakhöhe oder -fläche) und in Spektren der ersten oder zweiten Ableitung transformiert. Eine Gruppierungsanhäufung (d. h. beginnend durch Kombinieren der zwei ähnlichsten Beobachtungen zu einem Cluster und Vorgehen auf diese Weise, bis alle Beobachtungen einen einzelnen Cluster bilden) wurde unter Verwendung des Ward-Kopplungsalgorithmus mit dem euklidischen Abstand als Metrik durchgeführt. Die Spektraldaten von einzelnen Spektralbereichen, die eine Information enthielten, die für die Unterscheidung von Bakterien nützlich war, wurden in verschiedenen Permutationen kombiniert, um die hierarchische Anhäufung zu optimieren.
Ergebnisse und Auswertung von Technologiepotential
Das Hauptziel der vorstehend beschriebenen Experimente bestand darin, festzustellen, ob das Digilab-FPA-FTIR-System eine ausreichende spektrale Reproduzierbarkeit bereitstellt, um das Grundkriterium für eine genaue FTIR-Bakterienidentifikation zu erfüllen, nämlich, dass die Unterschiede unter Spektren desselben Stammes viel kleiner sein müssen als Unterschiede unter Spektren verschiedener Stämme. Die analysierten Bakterien umfassen Bezugsstämme von den meisten der üblichen aus der Nahrung stammenden Pathogene sowie 31 Stämme, die aus verschiedenen Nahrungsmittel- oder Wasserquellen isoliert wurden. Die Auswertung der Unterscheidungsleistung der FPA-FTIR-Spektroskopie für die Unterscheidung dieser Bakterienstämme basierte auf der Untersuchung von Dendrogrammen, die durch HCA erzeugt wurden. Ein typisches Dendrogramm, das für Proben verschiedener Gattungen, Spezies und Stämme erhalten wurde, ist in 8 dargestellt, und ein Dendrogramm, das die Anhäufung auf der Stammebene deutlicher darstellt, ist in 9 gezeigt. Die durch HCA erhaltenen Ergebnisse gaben an, dass eine erfolgreiche Unterscheidung unter allen Stämmen, die in Tabelle 2 aufgelistet sind, insofern erreicht werden konnte, als Kopiespektren derselben Proben in allen Fällen zusammen angehäuft wurden. Folglich waren die euklidischen Abstände unter Kopiespektren alle enger als diejenigen unter Spektren verschiedener Proben, was das vorstehend angegebene Kriterium für eine genaue Bakterienidentifikation erfüllte. Die mit den zwei verschiedenen in diesen Studien verwendeten Matrixdetektoren erhaltenen Ergebnisse waren vergleichbar.
Die spektrale Reproduzierbarkeit über die Zeit und zwischen Instrumenten wurde auch auf dieselbe Weise untersucht. Während der ersten Studie wurden die Spektren von ausgewählten Proben nach einer Woche und einem Monat erneut abgetastet und alle diese Proben wurden durch HCA unter Verwendung der spektralen Datenbank, die aus den anfänglich gesammelten Spektren erzeugt wurde, korrekt klassifiziert. Versuche wurden auch unternommen, um diese spektrale Datenbank für die Klassifizierung von ausgewählten Proben von der zweiten Studie zu verwenden, für die das System mit einem anderen Detektor sowie einer neuen Quelle ausgestattet und optisch neu ausgerichtet wurde. Obwohl diese Proben auf der Gattungsebene (z. B. Salmonella gegen Listeria) alle korrekt klassifiziert wurden, konnten einige auf der Speziesebene (z. B. Listeria welshimeri gegen Listeria murrayi) nicht unterschieden werden. Dies ist kein ungewöhnliches Phänomen bei der FTIR-Bakterienidentifikation, da die spektralen Unterschiede unter verschiedenen Spezies derselben Gattung im Allgemeinen kleiner sind als jene unter verschiedenen Gattungen und sehr geringfügig sein können, was folglich der spektralen Reproduzierbarkeit strenge Anforderungen auferlegt.
Im Hinblick auf die spektrale Reproduzierbarkeit und daher Genauigkeit der Bakterienidentifikation besitzt das FPA-FTIR-System einen Hauptvorteil gegenüber einem herkömmlichen FTIR-Spektrometer, wie z. B. dem FTIR-Bakterienanalysator, infolge der Minimierung der Probeninhomogenität aufgrund der ~ 10⁶-fachen Verringerung der Größe der Probe, aus der jedes Spektrum aufgezeichnet wird. Ferner kann die Homogenität der Probe aus dem aufgezeichneten Bild auf der Basis einer Reproduzierbarkeit von Pixel zu Pixel ausgewertet werden und die Daten von irgendwelchen nicht-repräsentativen Teilen der Probe können verworfen werden. Da wir festgestellt haben, dass das von jedem Pixel erfasste Spektrum einen ausreichenden SNR aufweist, um die Bakterienidentifikation zu ermöglichen, besteht überdies eine ungeheure ”eingebaute” Redundanz im System, die die Zuverlässigkeit der Bakterienidentifikation weiter erhöht.
Beispiel 3
MATERIALIEN UND VERFAHREN
Mikrobiologische Proben
Insgesamt 8 Stämme von C. botulinum (CK2 A, 2 B, 17 B, 13983 B, Bennett E, Russ E, H461297 F und 602 F) wurden in dieser Studie verwendet. Diese Untersuchung betraf nur Stämme von C. botulinum in den Gruppen A, B, E und F, da nur diese Serotypen Vergiftungen bei Menschen verursachen. Die Isolate wurden aufgrund der Erzeugung von charakteristischen Botulinum-Neurotoxinen als C. botulinum bestätigt.
FTIR-Spektroskopieverfahren
Probenvorbereitung
Vor der FTIR-Spektralerfassung wurden alle Stämme für 48 Stunden sowohl auf Hirn-Herz-Infusions-(BHI)Medien als auch Medien von McClung Toabe mit Eigelb (MTEYE) inkubiert. Um die Wachstumsbedingungen zu optimieren, wurden proteolytische Stämme bei 35°C gezüchtet, während nicht-proteolytische Stämme bei 25°C gezüchtet wurden. Die Bakterien wurden auf ein Infrarot durchlassendes Fenster (ZnSe) überführt. Die Bakterien wurden für 10 Minuten auf dem IR-Fenster luftgetrocknet und dann für mehrere Stunden in Formaldehyddämpfen inkubiert, um eine Inaktivierung des Botulinum-Neurotoxins sicherzustellen.
FTIR-Spektralerfassung
Alle Spektren wurden an einem Abbildungsspektrometer Digilab Stingray FTS-6000 gesammelt, das mit einem Infrarotmikroskop Digilab UMA-500 und einem 32×32-MCT-Brennebenen-Matrixdetektor (Digilab, Randolph, MA, USA), der unter der Software Win-IR Pro 3.3 (Digilab) arbeitete, ausgestattet war. 1024 Spektren wurden gleichzeitig von jeder Analyse durch Zusammenaddieren von 256 Abtastungen mit einer Auflösung von 8 cm^–1 gesammelt. Dies führte zur Erfassung von über 24000 Spektren von den acht Stämmen von C. botulinum. Um Absorptionsvermögensspektren zu erzeugen, wurden die Rohspektren gegen das Spektrum von einem sauberen Teil des IR-Fensters ins Verhältnis gesetzt. Ein konstanter Strom von trockener Luft wurde verwendet, um das Spektrometer und das Mikroskop zu spülen, um spektrale Beiträge von Kohlendioxid und atmosphärischem Wasserdampf zu begrenzen.
Mehrdimensionale Datenverarbeitung
Der hohe Grad der spektralen Ähnlichkeit von Bakterienstämmen innerhalb der Spezies C. botulinum und die Tatsache, dass jedes Spektrum über eintausend Datenpunkte enthält, benötigt computerisierte Verfahren zur Klassifizierung. Die Hauptverfahren der Bakterienklassifizierung waren die Hauptkomponentenanalyse (PCA) und die hierarchische Clusteranalyse (HCA). Die HCA-Ergebnisse wurden durch die Erzeugung von Dendrogrammen unter Verwendung der Software MINITAB graphisch angezeigt. Dendrogramme sind hierarchische Graphen, die innewohnende Gruppenstrukturen innerhalb komplexer Datenkonfigurationen von Spektren darstellen. Vor der mehrdimensionalen Analyse wurden die Rohdaten von den Spektren auf die Einheitspeakhöhe normiert und anschließend in Spektren der ersten Ableitung transformiert, um die Trennung von teilweise überlagerten IR-Bändern zu verbessern und um Probleme zu minimieren, die durch unvermeidbare Grundlinienverschiebungen entstehen. Ferner wurden die interessierenden Spektralbereiche vorgewählt, um eine zweckmäßige hierarchische Anhäufung zu ermöglichen.
ERGEBNISSE
Spektralmerkmalsauswahl und -zuweisung
Die acht Stämme wiesen signifikante Unterschiede in verschiedenen Spektralbereichen des Infrarotspektrums auf. Die signifikantesten Divergenzen traten im Bereich zwischen 1180 und 980 cm^–1 auf und an sich wurden die Datenpunkte in diesem Bereich in die PCA und die HCA eingeschlossen. Die visuelle Untersuchung der Spektren von 1180–980 cm^–1 bestätigte, dass merkliche Unterschiede in den Absorptionsbändern der acht Stämme von C. botulinum bestanden (10). Die Bänder in diesem Bereich entstehen aus Beiträgen von Proteinen, Lipiden, Polysacchariden und Nukleinsäuren, die überlappen, um ein Profil zu erzeugen, das für einen speziellen Stamm eindeutig ist.
Die Unterscheidung zwischen den acht Stämmen basierte auf den Spektraldaten im Bereich von 1180–980 cm^–1.
PCA: Acht unterschiedliche Cluster wurden auf einem Punktdiagramm von PC1 gegen PC2 beobachtet (11) und wurden als vollständige Trennungen der acht Stämme darstellend bestätigt.
HCA: Eine mehrdimensionale Clusteranalyse wurde verwendet, um alle Spektren im Bereich von 1180–980 cm^–1 zu analysieren. Die spektrale Ähnlichkeit wurde unter Verwendung des euklidischen Abstandes und eines vollständigen Kopplungsverfahrens ermittelt (12).
Die Fähigkeit, zwischen den Stämmen von Clostridium botulinum durch FTIR-Spektroskopie zu unterscheiden, hängt von der geeigneten Verarbeitung der Spektraldaten, von der akribischen Probenhandhabung und der Optimierung der Spektralbereiche ab.
Selbst wenn verblüffende visuelle Unterschiede in den Spektren von den acht Stämmen im Bereich von 1180–980 cm bestehen, gibt es genügend Konsistenz, um die Unterscheidung von proteolytischen und nicht-proteolytischen Stämmen zu ermöglichen.
Durch die systematische Analyse der IR-Spektren wurde festgestellt, dass die acht Stämme von C. botulinum am signifikantesten im Spektralbereich divergierten, in dem charakteristische Absorptionsbänder von Kohlehydraten vorherrschend sind. Folglich kann die Unterscheidung zwischen den Stämmen hauptsächlich auf strukturellen und biochemischen Unterschieden in der Zellwand basieren.
Obwohl die Erfindung in Verbindung mit speziellen Ausführungsbeispielen derselben beschrieben wurde, ist es selbstverständlich, dass sie zu weiteren Modifikationen in der Lage ist, und diese Anmeldung beliebige Änderungen, Verwendungen oder Anpassungen der Erfindung abdecken soll, die im Allgemeinen den Prinzipien der Erfindung folgen und solche Abweichungen von den vorliegenden Offenbarungen umfassen, die in die bekannte oder übliche Praxis innerhalb des Fachgebiets fallen, das die Erfindung betrifft, und die auf die vorher dargelegten wesentlichen Merkmale angewendet werden können und wie sie sich aus dem Schutzbereich der beigefügten Ansprüche ergeben.

Claims

Verfahren zum Charakterisieren eines Mikroorganismus, wobei das Verfahren umfasst: a) Erhalten von mindestens einem mehrere Pixel aufweisenden Spektralbild des Mikroorganismus; b) Auswählen von einem oder mehreren Spektren aus dem Spektralbild mit mehreren Pixeln auf der Basis von vorbestimmten Spektraleigenschaften, wobei die ausgewählten Spektren Spektralinformationseigenschaften des Mikroorganismus aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 1, welches ferner den Schritt des Identifizierens des Mikroorganismus durch Vergleichen des einen oder der mehreren ausgewählten Spektren des Mikroorganismus mit Spektren von Bezugsmikroorganismen in einer Datenbank, um eine Identität des Mikroorganismus festzustellen, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Datenbank erstellt wird durch: a) Erhalten von mindestens einem Spektralbild mit mehreren Pixeln für jeden einer Vielzahl von Bezugsmikroorganismen, wobei jedes Pixel ein Signal aufweist, das einem Spektrum eines Bezugsmikroorganismus entspricht; und b) Auswählen von Spektren aus den Spektralbildern von mehreren Pixeln auf der Basis von vorbestimmten Spektraleigenschaften, um die Datenbank zu erstellen, wobei die Datenbank mindestens ein Spektrum für jeden der Bezugsmikroorganismen aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–3, wobei die vorbestimmten Spektraleigenschaften ausgewählt sind aus: dem Rauschabstand, der spektralen Intensität und der spektralen Variabilität.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–4, wobei der Schritt des Auswählens das Identifizieren von chemischen Inhomogenitäten und das Verwenden der chemischen Inhomogenitäten als Basis für das Auswählen umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–5, wobei der Schritt des Auswählens das Vergleichen der vorbestimmten Spektraleigenschaften mit Spektraleigenschaften eines Bezugsspektrums umfasst.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Bezugsspektrum ein mittleres Spektrum ist, das durch Mitteln von Spektren von ausgewählten Pixeln des mehrere Pixel aufweisenden Spektralbildes des Bezugsmikroorganismus erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die ausgewählten Pixel alle Pixel von dem Bild umfassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–8, welches ferner den Schritt des Verarbeitens der ausgewählten Spektren, um den Spektralvergleich zwischen Spektren der Datenbank und dem einen oder den mehreren Spektren des unbekannten Mikroorganismus zu optimieren, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Schritt des Verarbeitens aus dem Einstellen einer Grundlinie, dem Erhalten einer spektralen Ableitung, dem Normieren der Spitzenhöhe oder Intensität, dem Glätten, der Dateninterpolation, der Auflösungsverbesserung und einer Kombination von diesen ausgewählt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3–8, welches ferner den Schritt des Erzeugens von mindestens einer Unterdatenbank mit teilweisen oder transformierten Spektraldaten aus den ausgewählten Spektren oder den verarbeiteten ausgewählten Spektren umfasst, um die Dimensionalität des Datenraums zu verringern, und wobei der Schritt des Vergleichens unter Verwendung der mindestens einen Unterdatenbank durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die teilweisen Spektraldaten auf der Basis von unterscheidenden Spektralmerkmalen der Bezugsmikroorganismen ausgewählt werden.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die unterscheidenden Spektralmerkmale unter Verwendung eines Verfahrens identifiziert werden, das ausgewählt wird aus: Hauptkomponentenanalyse, Wavelet-Transformation, Clusteranalyse, einer mehrdimensionalen Statistik, künstlichen neuralen Netzwerken, Unterstützungsvektormaschinen, genetischen Algorithmen und Grid- und Greedy-Suchalgorithmen oder Kombinationen von diesen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2–13, wobei der Schritt des Vergleichens ferner das Zusammenaddieren von Spektren von den ausgewählten Spektren, um Teilmengen von Spektren zu erzeugen, und das Vergleichen von einer oder mehreren der Teilmengen mit Spektren des Bezugsmikroorganismus umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–14, wobei die Mikroorganismen aus Bakterien, Viren und einzelligen Eukaryoten ausgewählt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–15, wobei die ausgewählten Spektren aus vorbestimmten Pixeln erhalten werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2–16, wobei der Schritt des Vergleichens unter Verwendung eines Verfahrens durchgeführt wird, das aus einem Algorithmus der K nächsten Nachbarn, künstlichen neuralen Netzwerken, einer mehrdimensionalen Statistik, Unterstützungsvektormaschinen und einer hierarchischen Datenbankverteilung und einer Kombination von diesen ausgewählt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–17, wobei das Spektralbild mit mehreren Pixeln unter Verwendung eines Matrixdetektors erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei der Matrixdetektor aus einem Linearmatrix- und einem Mehrfachmatrix-Detektor ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Matrix eine Infrarot-Brennebenenmatrix ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–20, wobei mehrere Proben von Mikroorganismen gleichzeitig in einem Bild enthalten sind.
Datenbank, hergestellt durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 3–21, umfassend mindestens eine spektrale Bibliothek mit Bezugsspektren von Mikroorganismen.