CN108351287B - 用于调整细胞仪测量的***和方法 - Google Patents

Abstract

用于操作流式细胞仪的方法和***可包括用于未染色样本的事件的前向散射值、侧向散射值和荧光强度值，以及将荧光强度值与前向散射‑侧向散射图区相关联。用于操作流式细胞仪的方法和***还可包括：对染色样本的事件的前向散射值、侧向散射值和荧光强度值进行测量；确定染色样本的事件的前向散射‑侧向散射图位置；以及针对染色样本的每个事件，将与包含染色样本事件的前向散射‑侧向散射图位置的前向散射‑侧向散射图区相关联的荧光强度值，从该前向散射‑侧向散射图位置处的染色样本事件的测量出的荧光强度值减去。

Description

用于调整细胞仪测量的***和方法

技术领域

本公开总体上涉及流式细胞仪领域，并且更具体地涉及用于减少样本分析中的误差的方法。

背景技术

如流式细胞仪和扫描细胞仪的粒子分析仪为如下的分析工具，即，该分析工具以光学参数(如光散射和荧光)为基础来实现粒子的表征。在流式细胞仪中，例如，使流体悬浮液中的粒子(诸如分子、分析物结合珠或单个细胞)通过检测区并且对粒子的光散射和荧光性质进行测量，其中，在检测区中粒子暴露于激励光，而激励光通常来自一个或多个激光器。例如细胞的细胞表面蛋白组分的标记可通过试剂来识别，其中，细胞的细胞表面蛋白组分的存在可用作区分特性，并且试剂包含荧光染料以促进检测、鉴定和表征。每种试剂可包含与检测分子缀合的标注(label)，该标注通常为荧光分子或“染料”，并且检测分子将选择性附着至特定标记，例如单克隆抗体。多种不同的粒子或组分可通过使用光谱不同的荧光染料对标记进行标注来区分开。在一些实现方式中，分析仪中包括有多个光电检测器。当使粒子通过激光束时，前向散射(FSC，forward scatter)和侧向散射(SSC，side scatter)检测器上将发生时间相关脉冲，并且荧光发射检测器上也可能发生时间相关脉冲。这就是“事件”，并且对于每个事件，每个检测器、FSC、SSC和荧光发射检测器的检测器输出的量级被存储。所获得的数据包括针对光散射参数和荧光发射中的每个测量的信号。

细胞仪还可包括用于存储检测器输出以及用于分析数据的部件。例如，数据存储和分析可使用与检测电子设备连接的计算机来执行。例如，数据可逻辑性地以表格形式存储，其中每行对应于针对一个粒子(或一个事件)的数据，而列对应于所测量的参数中的每个参数。使用用于存储来自流式细胞仪的数据的标准文件格式(如“FCS”文件格式)以方便使用单独的程序和/或机器来分析数据。使用当前的分析方法，通常将数据显示在二维(2D)图中以便于可视化，但是也可使用其它方法来使多维数据可视化。

使用流式细胞仪测量的参数通常包括从光谱的一个或多个通道(频带)中的荧光分子发射的光、SSC以及FSC，其中，FSC指示由粒子沿着大致前向方向散射的激励光，SSC指示由粒子在大致侧向方向上散射的激励光，其中从荧光分子发射的光被指示为FL1、FL2等或者由主要在该通道中发射的荧光染料命名。不同的细胞类型可通过散射参数以及用染料标注的抗体对各种细胞蛋白质进行标注而产生的荧光发射来识别。

流式细胞仪和扫描式细胞仪均可从例如BD生物科学(San Jose，CA)购买。流式细胞仪描述于以下文献中，例如Landy等人(编)，临床流式细胞仪，纽约科学院年鉴第677(1993)卷；Bauer等人(编)，临床流式细胞仪：原理和应用，威廉姆斯和威尔金斯(1993)；Ormerod(编)，流式细胞仪：实践方法，牛津大学出版社(1997)；Jaroszeski等人(编)，流式细胞仪协议，分子生物学方法第91号，Humana出版社(1997)；以及Practical Shapiro，流式细胞仪，第4版，威利-利斯(2003)；上述全部通过引用并入本文。荧光成像显微镜描述于例如Pawley(编)，生物共聚焦显微镜手册，第2版，Plenum出版社(1989)，其通过引用并入本文。

发明内容

根据本发明的一个方面，提供了用于流式细胞仪实验的方法。

在一个实施方式中，提供了用于操作流式细胞仪的方法，其中，流式细胞仪具有前向散射检测器、侧向散射检测器和多个荧光发射检测器，其中，每个荧光发射检测器对应于荧光通道。该方法包括针对未染色样本的一个或多个事件，使用流式细胞仪对前向散射检测器处的一个或多个前向散射值、侧向散射检测器处的一个或多个侧向散射值以及多个荧光发射检测器中的一个或多个荧光发射检测器处的一个或多个荧光强度值进行测量。该方法还包括至少部分地基于对未染色样本的一个或多个事件的测量，将多个荧光发射检测器中的一个或多个荧光发射检测器的一个或多个荧光强度值与一个或多个前向散射-侧向散射图区相关联。该方法还包括针对染色样本的一个或多个事件，使用流式细胞仪对一个或多个前向散射值、一个或多个侧向散射值以及多个荧光发射检测器中的一个或多个荧光发射检测器处的一个或多个荧光强度值进行测量。该方法还包括确定染色样本的一个或多个事件的前向散射-侧向散射图位置。该方法还包括针对染色样本的一个或多个事件中的每个事件，对于染色样本的一个或多个事件中的每个事件，将与包含对于多个荧光发射检测器中的至少一个荧光发射检测器的、染色样本事件的前向散射-侧向散射图位置的前向散射-侧向散射图区相关联的荧光强度值，从多个荧光发射检测器中的至少一个荧光发射检测器测量的该前向散射-侧向散射图位置处的、染色样本的事件的经测量的荧光强度值减去。

在另一个实施方式中，提供了流式细胞仪。流式细胞仪包括激励激光器、流体***、一个或多个检测器以及处理电路，其中，流体***配置为将来自一个或多个样本的粒子输送到激励激光器的束路径中。一个或多个检测器配置为针对未染色样本的一个或多个事件，对一个或多个前向散射值、一个或多个侧向散射值以及一个或多个荧光强度值进行测量，并且针对染色样本的一个或多个事件，对一个或多个前向散射值、一个或多个侧向散射值以及一个或多个荧光强度值进行测量。处理电路配置为至少部分地基于未染色样本的一个或多个事件的一个或多个前向散射值、一个或多个侧向散射值和一个或多个荧光强度值，将一个或多个荧光强度值与一个或多个前向散射-侧向散射图区相关联。处理电路还配置为确定染色样本的前向散射-侧向散射图位置。处理电路还配置为对于染色样本的一个或多个事件中的每个事件，将与包含染色样本的事件的前向散射-侧向散射图位置的前向散射-侧向散射图区相关联的荧光强度值，从该前向散射-侧向散射图位置处的、染色样本的事件的经测量的荧光强度值减去。

附图说明

图1描绘了根据本发明的示意性实施方式的流式细胞仪。

图2描绘了示出根据本发明的光电检测器的标注物和滤窗的发射光谱的示例的图表。

图3描绘了示出根据本发明的数个细胞群体的前向散射强度和侧向散射强度的2-D前向散射-侧向散射点图的示例。

图4描绘了显示根据本发明的数个细胞群体的平均自发荧光光谱的直方图的示例。

图5描绘了根据本发明的数个图区的示例。

图6A描绘了根据本发明的自发荧光强度图的示例。

图6B描绘了根据本发明的事件密度图的示例。

图7A描绘了根据本发明的染色样本的前向散射-侧向散射图的示例。

图7B描绘了示出图6A的染色样本的标注物的侧向散射强度和经测量的荧光强度的点图的示例。

图7C描绘了示出根据本发明的图6B的数据在去除自发荧光噪声信号之后的点图的示例。

图8描绘了根据本发明被规定尺度为覆盖染色样本的前向散射-侧向散射点图的、用于未染色样本的前向散射-侧向散射点图的示例。

图9描绘了根据本发明的示意性实施方式的用于操作流式细胞仪的过程的流程图。

具体实施方式

本发明提供了用于进行流式细胞仪实验的***和方法。在过去几年中，期望数量上增加对流式细胞仪实验的事件的测量，并且仪器制造商已开发出具有检测***和数据分析能力的、且复杂性和性能得到增加的流式细胞仪仪器。生物化学的发展已增加了对荧光标注的选择。尽管这些进步使流式细胞仪比以前更有用，但利用这种用处仍然是一个挑战。标注物选择和仪器配置是更复杂的，同时实验成功更依赖于适当的实验设计。例如，选择在细胞仪实验中所使用的荧光染料对于从所测量的数据得出结论的准确性而言是重要的，因为来自一种荧光染料的发射光谱可能与多个检测器的检测带重叠。标注物之间的相对亮度上的差异和在实验中进行标注的标记的相对密度上的差异也会影响事件表征的准确性。

图1示出了根据本发明的示意性实施方式的用于流式细胞仪的***100。***100包括流式细胞仪110、控制器/处理器190和存储器195。流式细胞仪110包括一个或多个激励激光器115a-c、聚焦透镜120、流动室125、前向散射检测器130、侧向散射检测器135、荧光收集透镜140、一个或多个分束器145a-g、一个或多个带通滤波器150a-e、一个或多个长通(“LP”)滤波器155a-b以及一个或多个荧光发射检测器160a-f。

激励激光器115a-c以激光束的形式发射光。在图1的示例性***中，从激励激光器115a-c发射的激光束的波长分别是488nm、633nm和325nm。激光束首先被引导通过一个或多个分束器145a和145b。分束器145a使488nm的光透射并且使633nm的光反射。分束器145b使UV光(波长范围为10至400nm的光)透射并且使488nm和633nm的光反射。

然后在流动室125内使激光束引导至聚焦透镜120，聚焦透镜120将光束聚焦到流体流的定位有样本粒子的部分上。流动室是流体***的一部分，其将流体流中的粒子(通常一次一个)引导到聚焦的激光束以用于询问。流动室可包括台式细胞仪中的流动池或空气流式细胞仪中的喷嘴端。

根据粒子的特性，诸如其尺寸、内部结构以及是否存在有附着于或天然存在于粒子上或粒子中的一个或多个荧光分子，来自激光束的光通过衍射、折射、反射、散射和在各种不同波长处通过再发射进行吸收，来与样本中的粒子相互作用。荧光发射以及衍射光、折射光、反射光和散射光可通过分束器145a-g、带通滤波器150a-e、长通滤波器155a-b和荧光收集透镜140中的一个或多个被路由到前向散射检测器130、侧向散射检测器135和一个或多个荧光发射检测器160a-f中的一个或多个。

荧光收集透镜140收集从粒子-激光束相互作用所发射的光并将该光引导成朝向一个或多个分束器和滤波器。带通滤波器(如带通滤波器150a-e)允许窄范围的波长穿过滤波器。例如，带通滤波器150a是510/20滤波器。第一个数字代表光谱带的中心。第二个数字提供了光谱带的范围。因此，510/20滤波器在光谱带的中心的每一侧上延伸10nm，或从500nm至520nm。短通滤波器透射等于或短于指定波长的光的波长。长通滤波器(如长通滤波器155a-b)透射等于或长于光的指定波长的光的波长。例如，作为670nm长通滤波器的长通滤波器155a使等于或长于670nm的光透射。滤波器通常被选择为优化检测器对特定荧光染料的特异性。滤波器可配置为使得透射到检测器的光谱带接近于荧光染料的发射峰值。

分束器在不同的方向上引导不同波长的光。分束器可通过如短通和长通的滤波器特性来表征。例如，分束器145g是620SP分束器，这意味着分束器145g使620nm或更短的光的波长透射，并且使长于620nm的光的波长在不同的方向上反射。在一个实施方式中，分束器145a-g可包括光学镜，如分色镜。

前向散射检测器130定位成稍微偏离引导光束通过流动池的轴线，并且配置为检测衍射光、主要在前向方向上通过或围绕粒子行进的激励光。由前向散射检测器检测到的光的强度取决于粒子的整体尺寸。前向散射检测器可包括光电二极管。侧向散射检测器135配置为检测来自粒子的表面和内部结构的折射光和反射光，并且倾向于随着结构的粒子复杂性增加而增加。来自与粒子相关联的荧光分子的荧光发射可由一个或多个荧光发射检测器160a-f检测。侧向散射检测器135和荧光发射检测器可包括光电倍增管。前向散射检测器130、侧向散射检测器135和荧光发射检测器处检测到的信号可由检测器转换成电子信号(电压)。这种数据可提供关于样本的信息。

本领域技术人员将认识到，根据本发明实施方式的流式细胞仪不限于图1中所描绘的流式细胞仪，而是可包括本领域已知的任何流式细胞仪。例如，流式细胞仪可具有各种波长和各种不同配置的任意数量的激光器、分束器、滤波器和检测器。

在操作中，细胞仪操作由控制器/处理器190控制，并且来自检测器的测量数据可存储在存储器195中并由控制器/处理器190处理。虽然未明确示出，但是控制器/处理器190耦合到检测器以接收来自检测器的输出信号，并且也可耦合到流式细胞仪100的电气部件和机电部件以控制激光器、流体流动参数等。输入/输出(I/O)能力197也可被提供在***中。存储器195、控制器/处理器190和I/O 197可整体地被提供作为流式细胞仪110的组成部分。在这种实施方式中，显示器也可形成I/O能力197的一部分，以用于向细胞仪100的用户呈现实验数据。可选地，存储器195和控制器/处理器190以及I/O能力中的一些或全部可为一个或多个外部设备(如通用计算机)的一部分。在一些实施方式中，存储器195和控制器/处理器190中的一些或全部可与细胞仪110无线或有线通信。与存储器195和I/O 197结合的控制器/处理器190可配置为执行与流式细胞仪实验的准备和分析相关的各种功能。

图1的***包括六个不同的检测器，其中六个不同的检测器检测如由从流动池125到每个检测器的光束路径中的滤波器和/或分束器的配置限定的、六个不同的波长带(其在本文中可被称为用于给定检测器的“滤窗”或“荧光通道”)中的荧光。用于流式细胞仪实验的不同的荧光分子在它们自己的特性波长带中发射光。用于实验的特定荧光标注物及其相关联的荧光发射带可被选择为与检测器的滤窗大致一致。然而，随着提供更多的检测器以及使用更多的标注物，滤窗和荧光发射光谱之间的完美对应是不可能的。通常情况下，尽管特定荧光分子的发射光谱的峰值可落入一个特定检测器的滤窗内，但该标注物的一些发射光谱也会与一个或多个其它检测器的滤窗重叠。这可被称为溢出(spillover)。

I/O 197可配置为接收与具有一组荧光标注物的流式细胞仪实验以及具有多个标记的多个细胞群体相关的数据，其中，每个细胞群体具有多个标记的子集。I/O 197还可配置为接收将一个或多个标记分配给一个或多个细胞群体的生物数据、标记密度数据、发射光谱数据、将标注物分配给一个或多个标记的数据以及细胞仪配置数据。流式细胞仪实验数据(诸如标注物光谱特性和流式细胞仪配置数据)也可存储在存储器195中。控制器/处理器190可配置为对标注物至标记的一个或多个分配进行估计。

图2示出了通过使不同的标注物的发射光谱重叠而引起的溢出的示意性示例。图2示出了用FITC标注的标记的发射光谱，其由从约475nm延伸到650nm的波长的曲线和“FITC检测器”的滤窗表示。一个或多个滤波器(如图1中所描绘的带通滤波器150b)可放置在检测器的前方，从而限制可到达检测器的波长的范围、构成滤窗的波长的范围。FITC检测器的滤窗为530/30，这意味着滤窗从515nm延伸到545nm。FITC滤窗由从515nm延伸到545nm的阴影矩形表示。图2还示出了用PE标注的标记的发射光谱，其由从约525nm延伸到约725nm的曲线表示。一个或多个滤波器(如图1中所示的带通滤波器150c)可放置在检测器的前面。PE检测器的滤窗是585/42，这意味着滤窗从564nm延伸到606nm。PE滤窗由从564nm延伸到606nm的阴影的矩形表示。图2示出了FITC的发射光谱中与PE检测器的滤窗重叠的部分，其标注为“FITC溢出到PE”。因此，FITC标注物的荧光发射中的一些在PE检测器中检测到，并且与PE标注物的荧光发射一同被测量出。溢出可能导致与粒子上存在的标注物的丰度相关地得出不准确的结论。由于利用了更多的标注物和检测器，而这减少了荧光峰值和滤窗的分离，所以这个问题对流式细胞仪最近的使用可能是特别尖锐的。也鉴于具有各种峰值波长、发射强度和能量的可用的荧光标注物数量增加(实验者通常可使用数十种选择)、谱宽特性、对被表征的细胞的各种标记的密度以及在一些情况下可选择的滤窗，为流式细胞仪实验设计合适的设置是非常具有挑战性的。另外的复杂问题是被表征的细胞或其它粒子的自发荧光。这种自发荧光信号也将使一个或多个滤窗重叠，从而导致测量中的噪声。自发荧光噪声信号还可依赖于被询问(interrogated)的粒子/细胞的类型。

荧光发射检测器处捕获到的信号可包括来自一个或多个荧光标注物、***背景信号和自发荧光噪声信号的贡献。通常称为“基线”的***背景可通过基线恢复过程从经测量的信号中去除，其中基线信号可从没有发生事件的细胞仪实验中的时间间隔中估计出，并且然后从经测量的信号减去。为了补偿自发荧光，在常规补偿技术中，针对待在细胞仪实验中使用的每个荧光染料，可测量“阴性”或未染色样本和“阳性”样本，其中的一个含有用单一染料染色的细胞。对于每种染料，可从未染色样本中限定单个总体阴性群体。单个总体阴性群体的中值荧光强度(MFI)可被当作样本的自发荧光噪声信号，并且可从阳性样本的数据减去，以计算出自发荧光溢出值。然而，当感兴趣的标记在样本中的多于一个细胞类型上表达时，由于每种细胞类型的自发荧光噪声信号可能在强度上不同，所以常规方法可能无法准确地去除自发荧光噪声信号。因此，自发荧光可能被错误地表征为一个或多个标记的荧光发射，即使在给定细胞类型上没有这种标记的情况下也如此。这种错误表征可能使得难以区分开不表达特定标记的群体与具有弱标记表达的群体。

根据本文中所描述的实施方式，自发荧光噪声信号估计可适应于细胞散射特性。具有相似的尺寸和复杂性的细胞更可能具有相似的自发荧光。因为粒子的尺寸和复杂性可与分别由前向散射检测器和侧向散射检测器测量到的强度相关，所以与基于单个中值荧光强度来估计自发荧光噪声信号相比，对于前向散射-侧向散射图的小区域的自发荧光噪声信号的估计可导出更精确的值。前向散射强度和侧向散射强度测量可与相关联的荧光强度值结合使用以提供多个经估计的自发荧光噪声信号，其中，每个信号与前向散射-侧向散射图的区域相关联。然后，可至少部分地基于与自发荧光噪声信号相关联的前向散射-侧向散射图的区域，从针对相应的染色样本由荧光发射检测器捕获的信号减去经估计的自发荧光噪声信号值，以使得经测量的数据将更直接地关联到感兴趣的标记和标注物。

图3示出了2-D前向散射-侧向散射点图的示意性示例。前向散射强度和侧向散射强度的相关测量可允许在异质细胞群体中区分细胞类型。基于由前向散射检测器和侧向散射检测器测量到的值，流式细胞仪实验中的每个事件具有前向散射-侧向散射图中的位置。因此，图3中所示的每个点表示一个或多个事件的前向散射和侧向散射的测量值。相同类型的细胞可能具有相似的前向散射和侧向散射测量，这意味着在2-D前向散射-侧向散射图上的数据点集群可代表单个细胞群体。图3示出了使用流式细胞仪测量的包含多个细胞群体、淋巴细胞、单核细胞和粒细胞的未染色样本的前向散射-侧向散射点图。代表淋巴细胞测量的数据点描绘为红色。代表单核细胞测量的数据点描绘为绿色。代表粒细胞测量的数据点描绘为蓝色。代表淋巴细胞测量的数据点标注为“Lymphs”。代表单核细胞测量的数据点标注为“Monos”。代表粒细胞测量的数据点标注为“Grans”。颜色以及每个群体周围绘制的框仅出于说明性目的而示出。

图4示出了显示使用流式细胞仪从400-800nm范围内的未染色样本测量到的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞的平均自发荧光光谱的直方图的示意性示例。如图4中所描绘，针对每个细胞群体，自发荧光强度值是不同的，并且差异横跨荧光通道而变化。如上所述，针对包含多个细胞类型的未染色样本的前向散射强度和侧向散射强度测量(诸如针对图3中的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞示出的测量)可与相关联的荧光强度值(如图4中所描绘的那些)结合使用，以提供多个估计出的自发荧光噪声信号，其中，每个信号与前向散射-侧向散射图区相关联。

前向散射-侧向散射图区可至少部分地基于未染色样本的事件的测量而与一个或多个自发荧光强度值相关联。在一个实施方式中，前向散射-侧向散射图区可包括前向散射强度值和侧向散射强度值的非重叠范围的集合。与图区相关联的自发荧光强度值可包括与位于图区中的未染色样本的事件相关联的、经测量的强度的中值或平均值。图5示出了若干图区的示意性示例：区510、区520和区530。每个图区可与每个荧光通道的自发荧光强度值相关联。例如，通过图1中所描绘的流式细胞仪处理未染色样本可产生与每个图区相关联的六个自发荧光强度值，一个针对六个荧光发射检测器中的每个。对于图1的与荧光通道FL1对应的荧光发射检测器160a，存在与图区510相关联的自发荧光强度值δ₁、与图区520相关联的自发荧光强度值α₁以及与图区530相关联的自发荧光强度值β₁。对于图1的与荧光通道FL2对应的荧光发射检测器160b，存在与图区510相关联的自发荧光强度值δ2、与图区520相关联的自发荧光强度值α2以及与图区530相关联的自发荧光强度值β2。荧光发射检测器160c-f也可各自具有与每个图区相关联的自发荧光强度值。在一些实施方式中，图区可为正方形形状。图区的尺寸可至少部分地基于事件的前向散射-侧向散射图中的不同位置处事件的密度来选择。因此，单个未被染色样本的图区可具有若干不同的尺寸。例如，具有高事件密度的位置处的图区可小于相对低事件密度的位置处的图区。

在一个实施方式中，通过自发荧光强度图，针对未染色样本测量的荧光强度值与前向散射强度和侧向散射强度测量相关联。图6B中示出了事件密度图的示意性示例。图6A示出了从图6B的事件导出的自发荧光强度图。自发荧光强度图示出了对于给定的前向散射强度和侧向散射强度的荧光通道处的经测量的荧光强度。该图可配置为使得每个前向散射-侧向散射位置与图区相关联。每个图区可与来自该区中的事件的中值或平均自发荧光强度相关联。

可从FSC-SSC图的所选区中的染色样本的荧光强度测量减去针对FSC-SSC图的相同所选区中的未染色样本测量的中值或平均自发荧光强度值，以补偿经测量的数据上的荧光噪声信号。针对染色样本测量的每个事件，事件的前向散射-侧向散射位置可与未染色样本的前向散射-侧向散射区相关联，然后可例如通过使用可存储作为查找表或其它数据格式的自发荧光强度图(如图6A中所示的图)来为该区找到自发荧光强度值。然后可从相关联的图位置处的染色样本的经测量的强度减去相应的前向散射-侧向散射区处的自发荧光强度值。例如，参照图5，如果针对染色样本测量出事件并且使事件的前向散射-侧向散射位置与图区510相关，则经测量的数据上的自发荧光噪声信号的效果可通过：分别从每个检测器处针对染色样本测量出的经测量的强度值减去与每个检测器的该区相关联的自发荧光强度值来补偿。因此，可从荧光发射检测器160a处的事件的经测量的强度值减去自发荧光强度值δ₁，并且可从荧光发射检测器160b处的事件的经测量的强度值减去自发荧光强度值δ₂。也可从与那些检测器的区510相关联的自发荧光强度值减去荧光发射检测器160c-f处的事件的经测量的强度值。

图7A-C示出了根据上述原理处理的一组点图的示意性示例。图7A描绘了用荧光染料BV510染色的样本的前向散射-侧向散射图，该荧光染料可用作CD4标记的标注物。为了说明的目的，样本中的数据点通过框和颜色示出，其中，淋巴细胞示出为红色，单核细胞示出为绿色，并且粒细胞示出为蓝色。在图7A中，淋巴细胞、单核细胞和粒细胞分别标注为“Lymphs”、“Monos”和“Grans”。图7B示出了使用常规数据分析描绘图7A的样本的BV510的侧向散射强度和经测量的荧光强度的点图。如图7B所示，存在着淋巴细胞、单核细胞和粒细胞群体的经测量的强度值，意味着CD4被表达在那些群体中的每个上。图7C示出了描绘根据本发明的图7B的数据在去除自发荧光噪声信号之后的点图。在去除后，非表达细胞应具有接近于零的中值荧光强度值。图7C示出了两组淋巴细胞，其中，第一组具有接近于零的经测量的强度值，而第二组淋巴细胞具有10⁴至10⁵之间的经测量的强度值。大多数粒细胞也具有接近于零的经测量的强度值。因此，可得出结论，第一组的淋巴细胞和大部分粒细胞不表达CD4。

当组合未染色FSC-SSC区的自发荧光强度时，染色样本和未染色样本的测量之间的散射增益差异可导致染色实验与未染色实验之间的相同细胞类型的不同FSC-SSC事件位置。这可能导致染色样本的一个或多个事件的前向散射-侧向散射位置与未染色样本的前向散射-侧向散射区之间的不正确的相关性。在一些实施方式中，可至少部分地基于针对未染色样本测量的事件与针对染色样本测量的事件之间的比较，对在未染色样本中测量的事件的前向散射-侧向散射图位置进行调整。未染色样本的前向散射-侧向散射测量的尺度可被调整，以使得散射密度图案与染色样本的更好地匹配。图8中描绘了这种调整的示意性示例。图8示出了红色的拟合未染色前向散射-侧向散射图与示出为黑色的染色样本的前向散射-侧向散射图的叠加。例如，这种调整可通过将比例因子应用于未染色样本数据来执行。

在一个实施方式中，比例因子的确定包括基于密度将未染色样本和染色样本两者的前向散射-侧向散射图转换成灰度图像。然后可执行形态学图像打开以去除小的对象(即，散射图)。然后可对结果图像进行阈值处理以创建二进制图像。然后可为每个图像确定一个或多个最大连接区，并且可计算一个或多个区的图心。然后可使用未染色图像与染色图像的每个维度中的图心位置的比例来计算比例因子。然后可使用确定出的比例因子对前向散射-侧向散射数据进行调整。

图9示出了根据本发明的实施方式的操作流式细胞仪的过程900的一个实施方式的流程图。过程900始于步骤910，在步骤910中，针对未染色样本的一个或多个事件，使用流式细胞仪(如图1中描绘的流式细胞仪110)对一个或多个前向散射值、一个或多个侧向散射值和一个或多个荧光强度值进行测量。一个或多个前向散射值、一个或多个侧向散射值和一个或多个荧光强度值可由一个或多个检测器(如前向散射检测器130、侧向散射检测器135和荧光发射检测器160a-f)来测量。

在针对未染色样本的事件对前向散射、侧向散射和荧光强度值进行测量之后，过程900移动到步骤920，在步骤920中，至少部分地基于对未染色样本进行的测量，使一个或多个荧光强度值与一个或多个前向散射-侧向散射图区相关联。荧光强度值可通过处理电路(如图1中描绘的控制器/处理器190)来与前向散射-侧向散射图区相关联。图3描绘了根据本发明的实施方式的前向散射-侧向散射图的示例。荧光强度值可与自发荧光强度图(如图6A中描绘的自发荧光强度图)中的一个或多个前向散射-侧向散射图区相关联。可选地，相关联的数据可在不生成自发荧光强度图的情况下被存储。

在使荧光强度值与前向散射-侧向散射图区相关联之后，过程900移动到步骤930，在步骤930中，针对染色样本的一个或多个事件，使用流式细胞仪对一个或多个前向散射值、一个或多个侧向散射值和一个或多个荧光强度值进行测量。染色样本可用单个荧光染料来染色，并且可来自与作为未染色样本的相同供体。

在针对染色样本的事件对前向散射、侧向散射和荧光强度值进行测量之后，过程900移动到步骤940，在步骤940中，针对染色样本的一个或多个事件，通过处理器确定前向散射-侧向散射图位置。

在确定前向散射-侧向散射图位置之后，过程900移动到步骤950，在步骤950中，针对染色样本的事件中的每个事件，从与前向散射-侧向散射图位置相关联的染色样本的经测量的荧光强度值，减去与包含染色样本事件的该前向散射-侧向散射图位置的前向散射-侧向散射图区相关联的、未染色样本的荧光强度值。

如本文所使用的措辞“确定(determine)”或“确定(determining)”涵盖各种各样的动作。例如，“确定(determining)”可包括算出、计算、处理、导出、调查、查找(例如，在表格、数据库或其它数据结构中查找)、求取等。而且，“确定(determining)”可包括接收(例如，接收信息)、访问(例如，访问存储器中的数据)等。而且，“确定(determining)”可包括解析、选择、选取、建立等。

如本文所使用的措辞“提供(provide)”或“提供(providing)”涵盖各种各样的动作。例如，“提供(providing)”可包括将值存储在用于后续获取的位置中、将值直接传输给接收者、传输或存储对值的参照等。“提供(providing)”还可包括编码、解码、加密、解密、证实、验证等。

如本文所使用的，称为一列项目中的“至少一个”的短语是指那些项目的任意组合，包括单个构件。作为示例，“a、b或c中的至少一个”旨在覆盖a、b、c、a-b、a-c、b-c和a-b-c。

本领域技术人员将理解，信息和信号可使用各种不同的科技和技术中的任意一种来表示。例如，在整个上述描述中可引用的数据、指令、命令、信息、信号、比特、符号和芯片可通过电压、电流、电磁波、磁场或粒子、光场或粒子或者它们的任意组合来表示。

本领域技术人员将进一步认识到，结合本文公开的实施方式描述的各种示意性逻辑块、模块、电路和算法步骤可被实现为电子硬件、计算机软件或两者的组合。为了清楚地说明硬件和软件的可互换性，上文中已根据其功能一般性地描述了各种示意性部件、块、模块、电路和步骤。这种功能是以硬件还是以软件来实现取决于施加在整个***上的特定应用和设计约束。本领域技术人员可针对每个特定应用以各种方式实现所描述的功能，但是这种实施决定不应被解释为导致背离本发明的范围。

本文所描述的技术可以硬件、软件、固件或其任意组合来实现。这种技术可在如通用计算机、无线通信装置或具有多种用途(包括在无线通信装置手持装置和其它装置中的应用)的集成电路装置的各种装置中的任意装置中实现。被描述为模块或部件的任意特征可一起实现在集成逻辑器件中或者作为分立但可互操作的逻辑器件单独实现。如果以软件来实现，则该技术可至少部分地通过包括程序代码的计算机可读数据存储介质来实现，其中，程序代码包括在执行时执行上述方法中的一个或多个方法的指令。计算机可读数据存储介质可形成计算机程序产品的一部分，该计算机程序产品的一部分可包括封装材料。计算机可读介质可包括存储器或数据存储介质，诸如同步动态随机存取存储器(SDRAM)的随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、非易失性随机存取存储器(NVRAM)、电可擦除可编程只读存储器(EEPROM)、闪存、磁或光学数据存储介质等。计算机可读介质可为非暂时性存储介质。该技术附加地或替代性地可至少部分由计算机可读通信介质实现，该计算机可读通信介质以指令或数据结构的形式承载或传输程序代码并且可由计算机(诸如传播的信号或波)访问、读取和/或执行。

程序代码可由处理器执行，该处理器可包括一个或多个处理器，诸如一个或多个数字信号处理器(DSP)、通用微处理器、专用集成电路(ASIC)、现场可编程逻辑阵列(FPGA)或其它等同的集成或离散逻辑电路。这种处理器可配置为执行本公开中所描述的技术中的任一种。通用处理器可为微处理器；但是可选地，处理器可为任何常规的处理器、控制器、微控制器或状态机。处理器还可实现为计算装置的组合，例如，DSP和微处理器的组合、多个微处理器、与DSP内核的结合的一个或多个微处理器、或者任何其它这种配置。因此，如本文所使用的措辞“处理器”可指示前述结构中的任一种、前述结构的任意组合、或者适用于实施本文中所描述的技术的任何其它结构或设备。另外，在一些方面中，本文中所描述的功能可被提供在配置为用于编码和解码的专用软件模块或硬件模块内、或者并入到经组合的视频编码器-解码器(CODEC)中。

本文中所公开的方法包括用于实现所描述方法的一个或多个步骤或动作。方法步骤和/或动作可在不背离权利要求的范围的情况下彼此互换。换言之，除非指定了步骤或动作的特定顺序，否则在不背离权利要求的范围的情况下可对具体步骤和/或动作的顺序和/或使用进行修改。

已描述了本发明的各种实施方式。这些和其它实施方式落入随附权利要求书的范围内。

Claims (16)

1.用于操作流式细胞仪的方法，所述流式细胞仪具有前向散射检测器、侧向散射检测器和多个荧光发射检测器，每个荧光发射检测器对应于荧光通道，所述方法包括以下步骤：

对于对象的未染色样本的多个第一细胞群体的一个或多个事件，使用所述流式细胞仪对所述前向散射检测器处的一个或多个前向散射值、所述侧向散射检测器处的一个或多个侧向散射值以及所述多个荧光发射检测器中的一个或多个荧光发射检测器处的一个或多个荧光强度值进行测量；

至少部分地基于对所述未染色样本的所述多个第一细胞群体的所述一个或多个事件的所述一个或多个前向散射值、所述一个或多个侧向散射值以及所述一个或多个荧光强度值的测量，针对所述多个荧光发射检测器中的一个或多个荧光发射检测器，生成多个前向散射-侧向散射图区中的每个前向散射-侧向散射图区的平均荧光强度值；

对于所述对象的染色样本的多个第二细胞群体的一个或多个事件，使用所述流式细胞仪对一个或多个前向散射值、一个或多个侧向散射值以及所述多个荧光发射检测器中的一个或多个荧光发射检测器处的一个或多个荧光强度值进行测量；

确定所述染色样本的所述多个第二细胞群体的所述一个或多个事件的前向散射-侧向散射图位置；以及

对于所述染色样本的所述多个第二细胞群体的所述一个或多个事件中的每个事件，将与包含对于所述多个荧光发射检测器中的至少一个荧光发射检测器的、所述染色样本的所述多个第二细胞群体的事件的前向散射-侧向散射图位置的前向散射-侧向散射图区相关联的平均荧光强度值，从所述多个荧光发射检测器中的至少一个荧光发射检测器测量的该前向散射-侧向散射图位置处的、所述染色样本的所述多个第二细胞群体的事件的经测量的荧光强度值减去。

2.如权利要求1所述的方法，还包括：

至少部分地基于针对所述未染色样本测量的事件与针对所述染色样本测量的事件之间的比较，调整针对所述未染色样本测量的事件的前向散射-侧向散射图位置。

3.如权利要求2所述的方法，其中，所述调整的步骤包括：

调整所述未染色样本的事件的所述前向散射-侧向散射图的尺度，以使所述未染色样本的事件位置与所述染色样本的事件位置更紧密地匹配。

4.如权利要求1所述的方法，其中，前向散射-侧向散射图区限定为前向散射强度值和侧向散射强度值的非重叠范围的集合。

5.如权利要求4所述的方法，其中，所述区为正方形。

6.如权利要求4所述的方法，其中，所述区的尺寸至少部分地基于事件的所述前向散射-侧向散射图中的不同位置处的事件密度来选择。

7.如权利要求1所述的方法，其中，在所述多个荧光发射检测器处执行对未染色样本的一个或多个事件的一个或多个荧光强度值的测量，其中，对染色样本的一个或多个事件的一个或多个荧光强度值的测量是在用于测量所述未染色样本的所述一个或多个荧光强度值的相同的所述多个荧光发射检测器处执行的。

8.如权利要求7所述的方法，包括以下步骤：

对于所述染色样本的一个或多个事件中的每个事件，将与包含对于所述多个荧光发射检测器的、所述染色样本的事件的前向散射-侧向散射图位置的所述前向散射-侧向散射图区相关联的多个荧光强度值，从所述多个荧光发射检测器测量的该前向散射-侧向散射图位置处的、所述染色样本的事件的多个经测量的荧光强度值减去，

其中，从所述染色样本的经测量的荧光强度值减去的、与包含所述染色样本的事件的所述前向散射-侧向散射图位置的所述前向散射-侧向散射图区相关联的每个荧光强度值、作为所述染色样本的经测量的所述荧光强度值与相同的荧光发射检测器相关联。

9.如权利要求1所述的方法，其中，所述未染色样本和所述染色样本包括多个细胞类型。

10.流式细胞仪，包括：

激励激光器；

流体***，所述流体***配置为将来自一个或多个样本的粒子输送到所述激励激光器的束路径中；

一个或多个检测器，其中，所述检测器配置为：

对于对象的未染色样本的多个第一细胞群体的一个或多个事件，对一个或多个前向散射值、一个或多个侧向散射值以及一个或多个荧光强度值进行测量；以及

对于所述对象的染色样本的多个第二细胞群体的一个或多个事件，对一个或多个前向散射值、一个或多个侧向散射值以及一个或多个荧光强度值进行测量；以及

处理电路，其中，所述处理电路配置为：

至少部分地基于所述未染色样本的所述多个第一细胞群体的所述一个或多个事件的所述一个或多个前向散射值、所述一个或多个侧向散射值和所述一个或多个荧光强度值的测量，生成多个前向散射-侧向散射图区中的每个前向散射-侧向散射图区的平均荧光强度值；

确定所述染色样本的所述多个第二细胞群体的所述一个或多个事件的前向散射-侧向散射图位置；以及

对于所述染色样本的所述多个第二细胞群体的所述一个或多个事件中的每个事件，将与包含所述染色样本的所述多个第二细胞群体的事件的前向散射-侧向散射图位置的所述前向散射-侧向散射图区相关联的平均荧光强度值，从该前向散射-侧向散射图位置处的、所述染色样本的所述多个第二细胞群体的事件的经测量的荧光强度值减去。

11.如权利要求10所述的流式细胞仪，其中，所述处理电路还配置为：至少部分地基于针对所述未染色样本测量的事件与针对所述染色样本测量的事件之间的比较，调整针对所述未染色样本测量的事件的前向散射-侧向散射图位置。

12.如权利要求11所述的流式细胞仪，其中，所述处理器配置为调整所述未染色样本的事件的所述前向散射-侧向散射图的尺度，以使所述未染色样本的事件位置与所述染色样本的事件位置更紧密地匹配。

13.如权利要求10所述的流式细胞仪，其中，所述一个或多个检测器配置为在一个或多个荧光通道处进行测量。

14.如权利要求11所述的流式细胞仪，其中，所述未染色样本和所述染色样本包括多个细胞类型。

15.如权利要求10所述的流式细胞仪，其中，所述一个或多个检测器包括多个荧光发射检测器，其中每个检测器配置为对未染色样本的一个或多个事件的荧光强度值进行测量，其中，每个荧光发射检测器还配置为对染色样本的一个或多个事件的荧光强度值进行测量。

16.如权利要求15所述的流式细胞仪，其中，对于所述染色样本的一个或多个事件中的每个事件，所述处理电路配置为：

将与包含对于所述多个荧光发射检测器中的每个荧光发射检测器的、所述染色样本的事件的前向散射-侧向散射图位置的所述前向散射-侧向散射图区相关联的荧光强度值，从对于所述多个荧光发射检测器中的每个荧光发射检测器的、该前向散射-侧向散射图位置处的所述染色样本的事件的经测量的荧光强度值减去，

其中，从所述染色样本的经测量的荧光强度值减去的、与包含所述染色样本的事件的所述前向散射-侧向散射图位置的所述前向散射-侧向散射图区相关联的每个荧光强度值、作为所述染色样本的经测量的所述荧光强度值是与相同的荧光发射检测器相关联的。