KR101209833B1 - 핵 형태에 기초하여 줄기 세포를 동정하는 방법 - Google Patents
핵 형태에 기초하여 줄기 세포를 동정하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 줄기 세포 및 배아형성 및 종양발생에 특이적인 다른 세포를 동정하는 방법, 조직 샘플을 분류하는 방법, 전암 및 암 또는 죽상경화증 병변을 진단하는 방법. 항암제의 가치를 시험하는 방법. 특정 세포 유형으로 특수하게 발현되는 거대분자를 발견하는 방법, 조직 회복 치료에 줄기 세포를 이용하는 방법, 및 이형 핵 형태를 본래대로 유지하는 조직 샘플을 제조하는 방법에 관한 것이다.
Description
동물 배아, 태아, 신생아 및 소아에서 성장 및 분화를 초래하는 과정은 종양을 선도하고 생성시키는 세포 유형의 성장 및 분화를 초래하는 과정과 일정한 특징을 공유한다. 종양 및 태아에서 항원성 분자를 인식하는 방법으로부터 태아 및 종양 둘 모두에서 관찰될 수 있으며 성인 기관에서는 관찰되지 않는 수많은 분자들이 존재함이 밝혀졌다. 19세기에, 종양은 성인의 잔류성 배아 세포로부터 발생할 수 있다고 논의되었다. 현재의 견해는 유전적 변화가 배아로부터 종양을 발생시키는 종양 줄기 세포를 생성시키는 성체 줄기 세포를 통해 직계 비속에서 나타나는 자가-신생 줄기 세포의 존재를 지적한다. 개요된 논의를 보면 단일의 정상적인 조직 줄기 세포가 차례로 종양에 대한 근거 줄기 세포를 생성시키고 차례로 클론 전이 및 이식된 종양에 대한 근거 줄기 세포를 생성시키는 전암 병변의 선조가 될 수 있다는 것이다. 전암 병변, 종양 및 전이에서 조직학적으로 분화가능한 세포 유형의 명백한 실존에 근거하고, 발생학적 성장 및 발달에 대한 유추에 의해, 조직, 전암 병변, 종양 및 전이의 근원이 되는 줄기 세포는 분화될 뿐만 아니라 자가-신생 성장될 수 있어야 한다고 추리될 수 있다. 종양 성장의 줄기 세포 이론이 맞다면, 종양 줄기 세포를 동정하고, 가려내고, 분류하고, 조작할 필요성이 매우 커진다. 그러나, 상기 세포의 동정 또는 단리에 대해서 당 분야에 기술된 바는 없다.
발명의 개요
본 발명은 세포 배양액, 조직, 전암 병변 또는 종양 샘플에서 기관-특이적 및/또는 종양 줄기 세포 및 다른 특이적 세포 형태를 동정하는 과정 및 이들을 분류하는 방법으로부터 유도된다. 본 발명은 세포 배양액, 조직, 전암 병변 또는 종양 샘플의 모든 세포 중에서 핵 형태(morphotypes), 핵 분열의 방식 및 다세포 응집체 및 다핵 융합체의 특정 형태의 핵의 포함을 결정하는 방법 및 특정 핵 형태 단독에 기초한 기관-특이적 또는 종양 줄기 세포의 동정에 관한 것이다. 태아 조직, 전암 병변(결장의 샘종) 및 신생물 병변 또는 종양(결장의 샘암종, 췌장의 암종)에서 다양한 형태(핵 형태)의 명확하고 재생가능한 비-구상 핵이 관찰되었으며 이들은 결장 크립트(crypt) 또는 간 실질과 같은 정상적인 성체 조직에는 없는 것들이다. 본원에 기술된 상기 형태들은 사람 조직의 조직학 또는 병리학의 기록에서 이전에 보고된 바 없는 크기 및 형상의 핵을 포함하였다.
태아 및 신생물 조직에서 핵 형태 또는 형태형은 성체 조직에서 일반적으로 관찰되는 구상 및 난형 핵 형태를 포함하나, 또한 40 미크론의 "소세지-형상"으로부터 짧은(~8-20 미크론) "시가-형상", "탄알-형상" 및 "신장-형상"을 거쳐 약 4 미크론 직경의 "응축된 구상" 핵에 이르는 여러 가지의 재생가능한 형태를 나타낸다. 이전에 보고되지 않은 현저한 것으로는, 핵 형태가 "벨-형상"이라고 명시되는 "입"을 벌린 컵 또는 벨의 형태를 지녔다는 것이다. 이러한 벨-형상의 핵은 두 개의 쌓아 올린 종이 컵을 분리시키는 것과 닮은 대칭적인 핵 분열에서 관찰되었다.
또한 이러한 "컵-프롬-컵(cup-from-cup)" 분열은 이들이 무사분열이고, 예컨대 유사분열에서와 같이 모든 사람 염색체의 응축 및 분리를 수반하지 않았다는 점에서 주목할 만하다. 이들은 두 개의 명백히 동일한 벨-형상의 핵이 컵-프롬-컵 분열로부터 초래되는 한에 있어서는 대칭적인 핵 분열이었다. 또한 상기 벨-형상의 핵이 무사분열 비대칭 핵 분열을 겪는 것으로 관찰되었으며, 이 때 벨-형상의 핵이 다른 핵 형태 중 하나의 밀폐된 핵을 발생시키는 것으로 나타났다. 본래의 벨-형상 핵 및 상이한 형태의 핵의 이러한 생성이 비대칭 핵 분열의 처음 공지된 가시화이다. 벨-형상의 핵을 포함하는 비대칭적 무사분열 세포 분열에서 벨-형상의 핵과 구별되는 이형 핵 형태의 출현은 벨-형상의 핵을 지니는 세포의 표현형과 구별되는 이형 핵 형태를 지니는 세포를 별개로 정의하기 위해 본원에 기술된다.
비대칭적 핵 분열은 정상적인 발달에 있어서 줄기 세포의 필수적인 특징으로서 널리 고려된다. 태아 조직, 전암 및 신생물 모두에 공통인 핵 형태의 발견은 종양이 배아 표현형, 특히 유래된 분화 세포의 표현형을 지니는 클론 개체를 형성하는 줄기 세포의 재발현이라는 가설을 지지한다. 줄기 세포를 규명하는 핵 형태는 벨- 또는 컵-형상의 핵으로서 나타나며, 이 때 염색된 DNA는 태아 조직 또는 종양 샘플에서 모든 다른 핵 형태로부터 용이하게 분화되는 공동 구조를 생성하고 염색된 DNA 이미지는 DNA-함유 구조에 의해 완전히 에워싸인 핵을 나타낸다.
추가의 관찰은 샘암종 및 배아가 유사분열 장치의 출현 없이 벨-형상 핵의 대칭적 및 비대칭적 핵 분열의 동일한 과정으로 여겨지는 작용으로부터 야기된 별개의 핵 형태를 지니는 세포 계대를 부분적으로 공유한다는 발견을 확인시키고 확대시켰다. 조기 배아로부터 태아 및 소아 성장을 통한 성체 기관에서 상기 핵 형태의 출현 및 소멸 및 발암에 있어서의 재현의 상황이 불완전하다고는 하나, 암 예방 및 치료에 있어서 상기 발견의 잠재적인 가치는 암, 및 모노클로날 콜로니가 느리게 성장하는 것으로부터 발생되는 죽상경화증과 같은 다른 질병의 진단 및 치료에 있어서 중요한 잇점을 제공할 것이 명백하다. 상기 잇점은 복잡한 조직 및 기관의 회복 치료와 같은 적용과 독립적으로 이러한 벨-형상의 핵의 성장으로부터 예상된다.
정상 조직 및 종양 조직에서 이전에 인식되지 않은 상기 세포들의 핵 형태, 핵 분열 방식 및/또는 다핵 구조의 포함에 의해 이러한 세포들을 특이적으로 줄기 세포로서 규명하기 위한 본원에 기술된 방법의 가치는 명백하다. 청구된 방법으로 줄기 세포 및 다른 태아 및 종양-특이적 핵 형태를 특이적으로 인식할 수 있고, 이들을 단리 및 연구할 수 있으며, 암에 대해 효과적인 수많은 가능성 있는 예방 또는 치료 섭생을 발견하기 위한 시험에 이들의 사용을 제공할 수 있다. 본원에 기술된 방법은 또한 사람 조직 및 기관을 위한 재생 및 이식용의 특정 줄기 세포를 발견하는 수단을 제공한다 (예컨대, 조직 회복 치료).
일 구체예에서, 본 발명은 a) 약 50 미크론 이하의 최대 직경을 지니는 실질적으로 모든 핵의 구조의 완전성을 실질적으로 보존하는 방법에 의해 제조된 조직 샘플의 전체에 걸쳐 분포된 세포 핵을 가시화하는 단계; 및 b) 핵 형태의 부류 또는 부류들의 존재 및/또는 부재를 결정하는 단계로서, 특정 부류의 존재 및/또는 부재가 발달 단계 또는 병리학 단계를 나타내게 되는 단계를 포함하여, 병리학의 발달 단계와 관련된 핵 구조에 근거하여 세포 또는 조직 샘플의 특징을 나타내는 (예컨대 분류하는) 방법에 관한 것이다. 일 구체예에서, 조직 샘플을 외과적 절제에 의해 수득한다. 특정 구체예에서, 조직 샘플을 물리적으로 (예컨대, 동결) 또는 화학적으로 고정한다 (예컨대 알코올, 알데히드, 유기산 및 이들의 조합물, 예컨대 메탄올 및 아세트산으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 화학적 고정제로 처리한다). 특정 구체예에서, 조직 샘플을 핵의 세포 분해 이전에 고정한다. 또 다른 구체예에서, 조직 샘플의 세포를 조직 물렁화(maceration) 및 스프레딩(spreading)에 의해 부분적으로 분리시킨다. 일 구체예에서, 조직 샘플의 세포 또는 거대분자를 염색함에 의해 핵을 가시화한다. 또 다른 구체예에서, DNA를 염색함에 의해 핵을 가시화한다. 또 다른 구체예에서, 조직 샘플을 외과적 제거한 지 30분 이내에 고정한다.
또 다른 구체예에서, 조직 샘플을 다세포 동물 (예컨대, 포유동물, 영장류, 설치류, 개, 고양이, 돼지, 양, 소 및 토끼와 같은 척추동물)로부터 수득한다. 특정 구체예에서, 포유동물은 사람이다.
특정 구체예에서, 핵 형태의 특정 부류 또는 부류들의 존재 또는 부재는 특정 발달 단계 (예컨대, 배아, 태아(기관발생), 신생아, 소아 및 성체 발달 단계)를 나타낸다. 또 다른 구체예에서, 핵 형태의 특정 부류 또는 부류들의 존재 또는 부재는 정상, 전암, 신생물 및 전이로 구성된 군으로부터 선택된 조직 샘플을 표시한다. 핵 형태의 부류 또는 부류들은 벨-형상, 시가-형상, 응축된 구상, 구상, 달걀형, 소세지-형상, 신장-형상 및 탄알-형상으로 구성된 군으로부터 선택된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 조직 샘플내에서 핵 형태의 하나 이상의 부류의 공간적 또는 수적 분포를 결정하는 것을 추가로 포함하며, 이 때 핵 형태의 하나 이상의 부류의 공간적 또는 수적 분포는 조직 샘플의 추가의 특징이다. 특정 공간적 또는 수적 분포는 정상, 전암, 신생물 또는 전이 조직을 표시한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 핵은 다핵 융합체 또는 단핵 세포에 함유되어 있으며, 이 때 조직 샘플은 성체 조직이다. 일 구체예에서, 벨-형상, 시가-형상 또는 탄알-형상 핵의 존재는 전암, 신생물 또는 전이를 나타낸다. 또 다른 구체예에서, 다핵 융합체의 출현은 신생물 또는 전이를 나타낸다. 일 구체예에서, 무사분열의 대칭적인 핵 분열을 나타내는 구조는 신생물 또는 전이를 표시한다. 또 다른 구체예에서, 벨-형상 핵의 존재 및 다핵 융합체의 부재는 전암을 나타낸다. 여전히 또 다른 구체예에서, 혈관벽 조직의 비-구상 및 비-달갈형 핵의 존재는 죽상경화증 초기 상태를 나타낸다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 세포 배양액 또는 조직 샘플에서 관심있는 세포 또는 관심있는 다핵 융합체를 동정하는 방법에 관한 것이고, 이 때 관심있는 세포 또는 관심있는 융합체는 핵 형태를 가시화함에 의해 동정되고, 관심있는 세포는 이형 핵 형태를 포함한다. 특정 구체예에서, 세포 또는 다핵 융합체를 조직 샘플로부터 단리시킨다. 또 다른 구체예에서, 세포 또는 다핵 융합체를 압력-보조된 레이져 미세절개와 같은 미세절개에 의해 단리시킨다. 일 구체예에서, 관심있는 세포 또는 다핵 융합체를 배양액 중 세포의 개체로부터 동정한다. 또 다른 구체예에서, 관심있는 세포 또는 다핵 융합체를 조직 샘플로부터 동정한다. 또 다른 구체예에서, 관심있는 세포 또는 관심있는 융합체는 하나 이상의 무사분열 핵 분열 복합체를 포함한다. 여전히 또 다른 구체예에서, 관심있는 세포는 세포의 다세포 응집체내에 존재한다. 특정 구체예에서, 관심있는 세포는 다세포 응집체의 클러스터내에 존재한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 본원에 기술된 방법에 의해 단리되거나 동정된 관심있는 세포에 관한 것이다. 일 구체예에서, 본 발명은 관심있는 세포에 특이적인 하나 이상의 거대분자 마커를 동정하기 위해 본원에 기술된 방법에 의해 단리되거나 동정된 관심있는 세포를 이용하는 방법에 관한 것이며, 이 때 마커는 발달 또는 병리학의 특정 단계를 나타낸다. 특정 구체예에서, 거대분자 마커는 항원, 세포-표면 마커, 핵산, 단백질, 인산화된 단백질 또는 글리코사미노글리칸이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 하나 이상의 거대분자 마커의 동정을 포함하여 전암 또는 신생물을 진단하는 방법에 관한 것이고, 이 때 성체 조직에서 하나 이상의 거대분자 마커의 동정은 전암 또는 신생물을 나타낸다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 a) 하나 이상의 후보 작용제로 종양을 지닌 포유동물을 치료하는 단계; b) 포유동물로부터 수득한 종양 샘플내에 함유된 세포의 핵 형태를 결정하는 단계; 및 c) 후보 항-종양원성 작용제로 치료된 포유동물로부터의 세포의 핵 형태를 후보 항-종양원성 작용제로 치료되지 않은 종양을 지닌 포유동물로부터 수득한 세포와 비교하는 단계를 포함하여, 하나 이상의 항-종양원성 작용제를 동정하는 방법에 관한 것이며, 이 때 신생물 핵 형태를 포함하는 세포의 제거는 작용제의 항-종양원성 작용제로서의 유효성을 나타낸다. 특정 구체예에서, 신생물 핵은 벨-혈상 핵, 시가-형상 핵 및 탄알-형상 핵으로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 핵 형태의 변경은 벨-형상 핵의 제거를 포함한다. 일 구체예에서, 포유동물은 설치류 (예컨대, 래트 또는 마우스)이다. 특정 구체예에서, 핵은 융합체에 배열되고, 신생물 핵 형태의 제거는 융합체의 붕괴를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 배양된 종양 조직 또는 세포 샘플을 하나 이상의 후보 작용제로 처리하고, 종양 샘플에 함유된 세포의 핵 형태를 평가하는 것을 포함하여, 하나 이상의 항-종양원성 작용제를 동정하는 방법에 관한 것이고, 이 때 세포는 이형 핵 형태를 포함하고, 항-종양원성 작용제의 부재시, 배양된 종양 세포는 이들의 이형 핵 형태를 유지하며, 신생물 핵 형태의 제거는 작용제의 항-종양원성 작용제로서의 유효성을 나타내며, 전암 핵 형태의 제거는 종양 예방제임을 나타낸다. 특정 구체예에서, 변경된 핵 형태는 벨-형상 핵, 시가-형상 핵 및 탄알-형상 핵으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵 형태의 제거를 포함한다. 일 구체예에서, 핵 형태의 변경은 벨-형상 핵의 제거를 포함한다. 일 구체예에서, 핵은 융합체에 배열되고, 신생물 핵 형태의 제거는 융합체의 붕괴를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 a) 조직 샘플의 세포판의 세포 부착을 붕괴시키는 단계; 및 b) 붕괴된 부착을 지니는 세포를 경질 표면상에 스프레딩시키는 단계를 포함하여, 약 50 미크론 이하의 최대 직경을 지니는 핵을 포함하는 세포를 동정하기에 적합한 포유동물 조직 샘플을 제조하는 방법에 관한 것이고, 이 때 세포 핵의 구조적 완전성은 본래대로 유지되므로 샘플은 이형 핵 형태 세포의 동정에 적합하다. 일 구체예에서, 조직 샘플은 층들로 분할되고, 여기서 수득된 층들은 세포의 두께를 초과한다. 또 다른 구체예에서, 조직 샘플은 현미경 슬라이드상에 약 0.5 밀리미터의 층을 형성한다. 특정 구체예에서, 조직 샘플은 약 50 미크론 보다 큰 층을 형성한다. 또 다른 구체예에서, 조직 샘플의 세포 부착은 화학적으로 붕괴된다 (예컨대, 45% 아세트산 처리에 의해). 특정 구체예에서, 스프레딩 이전에 고정된, 화학적으로 붕괴된 조직 샘플은 약 1 mm2의 면적을 지닌다. 특정 구체예에서, 조직 샘플은 사람의 조직 샘플이다. 특정 구체예에서, 세포판의 면적은 약 1 mm2이다. 또 다른 구체예에서, 경질 표면은 현미경 슬라이드이다.
도면의 간단한 설명
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도 1은 사람 배아 창자, 정상 결장 점막, 샘종 및 샘암종에서 간기 및 초기 전기 (E.P.) 세포에서 관찰된 핵 형태를 도시한다. *벨-형상의 핵은 성인 결장에서 거의 관찰되지 않는다. 스케일 바, 5 ㎛.
도 2A-2C는 배아 창자의 현미경 이미지를 도시한다. 도 2A는 염색된 핵 (좌측 이미지) 및 상이한 창자 섹션의 상 대조/자동형광 이미지 (우측 이미지)를 지니는 5-7주 태아 창자를 낮은 배율 (140x)로 도시한다. 별개로 비-구상 핵이 상 대조 이미지에서 "튜브-같은" 구조로 정의된 선형 순서로 (점선으로 표시됨) 배열되는 것으로 보인다. 상기 튜브-같은 구조는 튜브를 따라 산재된 다른 세포 그룹을 지니는 것으로 관찰된 창자 섹션을 통털어 나타난다. 도 2B는 겹쳐진 동일한 창자 섹션(우측)의 상 대조 이미지(좌측 프레임) 및 염색된 핵 이미지(중간)를 도시하며, 이는 핵의 뚜렷한 선형 배향이 자체의 직경이 약 50 미크론인 튜브-같은 구조에 의해 실제로 구속됨을 입증한다. 핵(중간 프레임)의 확대(280x)는 이들 비-구상 핵이 컵 또는 벨의 형태로 보여짐을 도시한다. 도 2C는 핵의 확대된 이미지(1400x)를 선형 정렬로 도시한다. 이렇게 정렬된 핵은 명백하게 속이 빈 재생가능한 벨 형상을 지닌다. 벨의 "헤드 투 토우(head to toe)" 배향은 관찰된 모든 배아 튜브에서 보존되나, 튜브는 뒤와 앞으로 구불구불하여 평행 튜브가 국부적으로 반-평행 벨-형상의 핵 배향을 지닐 수 있다. 스케일 바는 낮은 배율에서 100 ㎛ 및 높은 배율에서 5 ㎛이다.
도 3A-3F는 벨-형상의 핵 배아 창자의 무사분열을 도시한다. 도 3A: 대칭적 무사분열: 벨-형상의 핵이 벨-형상의 핵으로부터 뚜렷하게 나타난다. 다양한 벨-형상의 형태가 관찰되나 이들의 무사분열은 이러한 세 개의 실시예에서 보여지는 대로 벨 입구의 폭/길이 비와 같은 분별할 수 없는 벨-형상 형태의 특징을 나타낸다; 도 3B: 비대칭적 무사분열: 고체 핵 형태가 벨-형상의 핵내에서부터 뚜렷하게 나타난다. 응축된 구상 핵이 벨에서 깊게 형성되는 것이 보여지며, 이것이 명백하게 완전한 분리 이전에 벨에 핵질 연결되며 나타나는 네 개의 이미지를 도시한다; 도 3C: 응축되지 않은 구상 핵이 벨-형상의 입구에서 나온다; 도 3D: 계란-형상 ("달걀")의 핵이 벨로부터 나타난다; 도 3E: 콩-형상 ("신장-형상")의 핵이 벨로부터 나타난다; 도 3F: 시가-형상의 핵이 벨로부터 나타난다. 스케일 바, 5 ㎛.
도 4A-4C는 정상적인 성인 결장 크립트를 도시한다. 도 4A는 크립트(오른쪽 코너: 핵의 확대된 이미지)의 바닥에 위치한 인식가능한 벨-형상의 핵(좌측 하단 코너에 있는 화살표)을 종종 (<1/100) 함유하는 약 2000개의 구상 및 달걀형 핵의 크립트를 도시한다. 도 4B는 기부 특유의 다른 핵 형태 중에서 또 다른 벨-형상의 핵을 지니는 크립트 기부를 도시한다. 도 4C는 간기의 다양한 형태 및 잘-확산된 크립트에서 벽 및 관 표면의 유사분열 핵을 도시한다. 확대된 이미지는 (i) 구상 및 달걀형 간기 핵, (ii, ii) 구상 및 달걀-형상 핵의 초기 전기, 및 (iv) 말기-후 핵을 도시한다. 스케일 바, 낮은 배율 이미지에 대하여 100 ㎛ 및 높은 배율 이미지에 대하여 5 ㎛.
도 5A-5E는 샘종의 확대된 이미지를 도시한다. 도 5A는 샘종의 큰 분기를 지닌 크립트 특징을 도시한다. 크립트 기부 및 관 개구는 정상적인 결장 섹션과 유사한 방식으로 규칙적으로 배열된다. 도 5B는 샘종 샘플 전반에서 또한 관찰되는 불규칙적인 유사 크립트 구조를 도시한다. 통상적으로, 2개, 그러나 때로는 1개, 4개 또는 심지어 8개의 벨-형상 핵(삽입)이 이렇게 큰 (>4000 세포) 불규칙한 크립트의 기부에서 나타난다. 도 5C는 하나의 벨-형상 핵을 함유하는 유사한 핵 형태의 세포 클러스터를 도시한다. 이렇게 단순한 클러스터는 총 16, 32, 64 및 128개의 세포를 함유한다. 좌측 패널: 포일겐-지엠사(Feulgen-Giemsa) 염색. 우측 패널: 상 대조 자동형광 이미지. 도 5D는 샘종에서 벨-형상의 핵이 나타나는 상이한 경위를 설명한다: (i) 31개의 달걀형 핵 및 하나의 벨-형상 핵을 지니는 클러스터, (ii) "숄더-투-숄더(shoulder-to-shoulder)" 배열에서 다수의 벨-형상의 핵, (iii) 보다 큰 "원(circle)"에서 "숄더-투-숄더" 패턴(화살표)으로 배열된 벨-형상의 핵, (iii) 샘종 전체에 산재되어 발견되는 발생기 크립트 기부를 암시하는 여러 개의 벨-형상 핵의 ~250개 핵의 불규칙한 혼합물. 도 5E는 기부에 하나의 벨-형상 핵(화살표)을 지니는 5개의 상이한 핵 형태의 세포의 뚜렷한 클론 패치를 함유하는 불규칙한 유사 크립트 구조를 도시한다. 스케일 바, 낮은 배율 이미지에 대하여 100 ㎛ 및 높은 배율 이미지에 대하여 5 ㎛.
도 6A-6C는 샘암종의 확대된 이미지를 도시한다. 도 6A는 빈번한 분기점의 가지를 지니는, 매우 큰 유사 크립트 구조(>8000개 세포)를 도시한다. 상기 구조의 기부는 두 개의(통상적으로) 벨-형상 핵의 존재를 제외하고는 샘종에서와 같이 정상적인 결장 크립트의 것들로부터 구분될 수 없다. 샘종에 보존된 유사 크립트 구조의 루멘에 대한 기부 배향은 크립트 배향이 임의적인 것처럼 보이는 샘암종에서는 관찰되지 않는다. 화살표는 일반적으로 종양의 표면에 가깝게 발견되는 작은 ~250개 세포의 유사 크립트 구조를 나타낸다. 도 6B는 종양 내부를 통털어 발견되는 벨-형상 핵의 숄더 투 숄더 그룹을 도시한다. 도 6C는 숄더 투 숄더 및 헤드 투 토우 둘 모두의 배열로 국부적으로 배향된 벨-형상 핵의 다양한 예를 지니는 내부 종양 매스를 도시한다. 헤드 투 토우 배향은 종양 내부에서만 발견되며, 숄더-투-숄더 배향은 유사 크립트 구조 중에서도 내부 및 종양 표면 근처 둘 모두에서 발견된다. 벨-형상의 핵은 종양 내부의 모든 핵의 ~0.2%를 설명한다. 스케일 바, 낮은 배율 이미지에 대하여 100 ㎛ 및 높은 배율 이미지에 대하여 5 ㎛.
도 7A-7E는 샘암종에서의 무사분열을 나타내는 확대된 이미지이다. 도 7A는 불규칙한 크립트에서 별개 형태의 2개의 벨-형상 핵을 생성시키는 대칭적인 무사분열을 도시한다. 좌측 이미지의 화살표는 새롭게 나타나는 핵의 벨 바닥을 나타낸다. 도 7B는 구상 핵을 생성시키는 비대칭적인 무사분열을 도시한다. 도 7C는 달걀-형상의 핵을 생성시키는 비대칭적인 무사분열을 도시한다. 도 7D는 "시가"-형상의 핵을 형성하는 대칭적인 무사분열을 도시한다. 도 7E는 벨-형상 핵의 입술에서 응축된 염색체로 나타난 것 (하단 화살표)과 다르게 특이한 검은 염색 엘리먼트(상단 화살표)를 지니는 "소세지"-형상의 핵을 생성시키는 비대칭적인 무사분열을 도시한다. 스케일, 5 ㎛.
도 8은 사람 결장 상피의 포일겐-DNA 염색된 핵을 도시한다: a, b: 배아 창자의 벨-형상 핵; c: 결장 샘종의 핵; d: 창자에서 벨-형상 핵의 대칭적인 핵 분열; e: 비대칭적인 핵 분열; f: 결장 샘암종에서 비대칭적인 핵 분열 (응축된 구상 핵이 벨-형상의 핵으로부터 나타난다); g: 크립트를 나타내는 정상적인 바닥의 벨-형상의 핵(화살표) 및 h: 샘종의 전체 "초기" 크립트; i: 창자에서 핵 형태의 변화. 세포 스프레드에서 화살표로 표시된 "시가"-형상의 핵은 샘종(k) 및 결장 샘암종(l)에서 수득되었다. "j"에서, 정상적인 성체 결장 크립트에 통상적인 구상의 핵이 나타났다. 바 크기는 5 ㎛이다.
도 9는 중요한 이미지의 개요를 도시한다. (a) 사람 태아 창자, 정상적인 결장 점막, 샘종 및 샘암종에서 간기 및 초기 전기(E.P.)에 관찰된 핵 형태의 예. (H-벨-형상의 핵이 성체 결장에서 거의 관찰되지 않는다) (b) 태아 창자의 벨-형상 핵의 고 해상도 이미지 (1400x). 응축된 DNA는 속이 빈 벨 구조로의 개구를 유지하는 고리를 생성시키는 것처럼 보인다. 스케일 바, 5 ㎛.
도 10은 5-7주된 배아 창자의 섹션을 도시한다: (a) 상 대조 이미지 (좌측 프레임) 및 염색된 핵 이미지 (중간) 및 융합된 이미지 (우측)는 ~50 미크론 직경의 관 융합체내에서 핵의 선형 정렬을 나타낸다; (b) 핵의 고 해상도 이미지는 속이 빈 벨-형상의 구조를 도시한다. 벨의 "헤드 투 토우" 배향은 관찰된 모든 배아 튜브에서 보존되나, 튜브는 뒤와 앞으로 구불구불하여 평행 튜브가 국부적으로 반-평행 벨-형상의 핵 배향을 지닐 수 있다. 스케일 바는 낮은 배율에서 50 ㎛ 및 높은 배율에서 5 ㎛이다.
도 11은 태아 창자에서 벨-형상 핵의 핵 분열을 도시한다. a,b: 대칭적인 핵 분열: 벨-형상의 핵이 유사한 형상의 벨-형상 핵으로부터 나타난다. c,d: 비대칭적인 핵 분열: 구상 핵, 및 시가-형상의 핵이 벨-형상의 핵으로부터 나타난다. 스케일 바, 5 ㎛.
도 12는 정상적인 성인 결장 크립트를 도시한다: (a) 크립트의 바닥에 위치한 인식가능한 벨-형상의 핵 [화살표]을 종종 (<1/100) 함유하는 약 2000개의 회전타원체, 구상 또는 원반형 핵의 크립트; (b) 또 다른 벨-형상의 핵을 도시하는 크립트 기부; (c) 웰-스프레드 크립트에서 간기 및 유사분열 핵의 벽 및 관 표면의 형태. 확대된 이미지는 [i] 구상 및 달걀형 간기 핵, [ii, iii] 구상 및 달걀-형상 핵의 초기 전기, 및 [iv] 말기-후 핵을 도시한다. 스케일 바, 낮은 배율 이미지에 대해 100 ㎛ 및 높은 배율 이미지에 대해 5 ㎛.
도 13은 샘종을 도시한다. (a) 샘종의 특징적인 큰 분기 크립트. (b) 샘종을 통털어 발견되는 불규칙한 유사 크립트 구조. 통상적으로, 2, 때때로 1, 4 또는 심지어 8개의 벨-형상 핵 (삽입)이 상기 큰 (>4000 세포) 불규칙한 유사 크립트 구조의 기부에서 나타난다. (c) 하나의 벨-형상 핵을 함유하는 유사한 핵 형태의 세포의 클러스터. 상기 형태의 클러스터는 정확히 16, 32, 64 및 128개의 총 세포를 함유한다. 좌측 패널, 포일겐-지엠사 염색. 우측 패널, 상 대조 자동형광 이미지. (d) 벨-형상 핵이 샘종에서 나타나는 상황: (i) 31개의 난형 핵 및 하나의 벨-형상 핵을 지니는 클러스터, (ii) 숄더 투 숄더 배열에서 다수의 벨-형상 핵, (iii) 나란히 있는 패턴으로 배열된 벨-형상 핵 (화살표), (iii) 초기 크립트 기부를 시사하는 여러 개의 벨-형상 핵을 지니는 ~250개 핵의 불규칙한 혼합물. (e) 기부에서 하나의 벨-형상 핵 [화살표]를 지니는 5개의 상이한 핵 형태의 세포의 클론 패치를 명백하게 함유하는 불규칙한 유사 크립트 구조. 스케일 바. 100 ㎛ ('a,b') 및 5 ㎛ ('e').
도 14는 샘암종을 도시한다. (a) 빈번한 분기점의 가지를 지니는 매우 큰 유사 크립트 구조 (>8000개 세포). 화살표는 종양 표면 근처에서 주로 발견되는 ~250개 세포의 유사 크립트 구조의 예를 나타낸다. (b) 다수의 벨-형상 핵 (모든 핵 형태 중 2x10-3개)을 지니는 종양 매스 내부. (c) 헤드-투-토우 융합체 및 비-융합성의 나란히 있는 배열로 배향된 (b)에서 벨-형상의 핵. (d) 샘암종에서 대칭적인 핵 분열. (e) 샘암종에서 시가-형상 핵을 생성시키는 벨의 비대칭적인 핵 분열. 유사한 구조가 간으로의 결장 전이에서 관찰되었다. 스케일 바, 5 ㎛.
도 15는 (a) 배아 창자, (b) 결장 샘암종, (c) 결장 종양의 간 전이, (d) 췌장 종양의 사람 조직에서 나타난 벨-형상 핵 (자줏빛으로 포일겐 DNA 염색됨)의 형태적 유사성을 도시한다. 'd'에서 벨의 절반 아래쪽에 보여지는 응축된 염색질 줄무늬는 모든 결장 종양에서 나타나는 것은 아니나 췌장으로부터의 모든 벨-형상 핵에서 보여진다. 바 스케일, 5 미크론.
도 16은 본원에 기술된 조직학적 공정 (포일겐 염색)에 의해 용이하게 검출되고 5 미크론 섹션의 박절기 섹션을 생성시키는 조직학적 표준 공정 (헤마톡실린 및 에오신 염색 (H&E))에 의해 거의(이제껏 실시예만) 검출되지 않는 벨-형상의 핵을 도시한다. 동일한 종양, 재분할 30분내에 고정.: (a) 수많은 비대칭적으로 분할된 세포 (화살촉)를 함유하는 췌장 종양의 에지에서 콜로니로서 존재하는 시가-형상 핵 (좌측으로 x 100 배율 이미지)을 생성시키는 벨-형상 핵. (b) 최근의 비대칭적인 핵 분열을 제안하는 병렬의 표준 조직 섹션 슬라이드에 대해 가시적인 벨- 및 달결-형상 핵의 지금까지 발견된 단일 실시예. 벨-형상의 핵은 여전히 달걀-핵 (화살표)에 부착하여 유지된 염색질을 지니는 것으로 보인다. (c) 상기 설명을 나타내는 원 그림의 밑그림.
도 17은 종양에서 비분할 및 분할 벨-형상 핵을 조사하기 위한 FISH의 적용에서 "관심있는 표적"의 도해이다: (a) 핵에서 제곱 미크론 당 높은 농도의 DNA로 인해 짙게 염색된 염색질은 벨-형상 형태의 일부로서 독특한 구조를 생성하고, 이는 두 평행한 원으로 배열된 전기 염색체와 유사하다. 도면(상기)에 삽입된 이들 원은 특정 염색체가 결장 종양의 벨-형상 핵의 이러한 특정 부위에서 발견될 수 있다는 예측을 설명한다, (b) 벨-형상 핵의 비대칭적인 분열에 걸쳐 발생하는 가상의 변형으로서 (여기서 벨-투-달걀 형상의 핵) 염색질 변형 및 특정 염색체 정위 변경.
도 18은 TK-6 사람 세포의 구상 핵에서 염색체 11의 동일계내 형광 하이브리드화의 결과를 도시한다. (a) 전기 염색체 스프레드에서 두 쌍의 염색체, (b) 구상 핵 DAPI 핵 염색, (c) FITC 형광 프로브와 하이드리브화된 동일 염색체 쌍, (d) DAPI 및 FITC 간기 염색체 염색의 융합된 이미지.
도 19는 레이져 압력 투석 시스템 ("레이져 압력 미세절개")에 의해 수집물 중 "표적"으로서의 벨-형상 핵을 도시한다: (a) 현미경과 커플링된 펄싱된 UV-A 레이져의 앞에 정위된 세포 스프레드를 지니는 현미경 슬라이드, (b) 단일 핵이 가시화된 벨-형상 핵을 지니는 결장 종양 조직의 세포 스프레드에 대해 보여지는 대로 현미경을 통해 관찰될 수 있다; (c) 염색되지 않은 슬라이드에서 인식가능한 벨의 형태를 지니는 동일한 핵.
발명의 상세한 설명
본 발명은 태아 창자 (5-7주), 결장 샘종, 및 샘암종 전반에 걸쳐서 독특한 형태를 지니는 큰 세포 핵의 예상치 못한 발견에 관한 것이며, 이들 중 몇몇은 정상적인 (비-신생물) 성체 결장에는 존재하지 않는다. 이러한 "이형 핵 형태" (예컨대, 성체 기관에서 정상적인 회전타원체 또는 달걀형 핵과 상이한 핵 형태)가 배아 조직에서 관찰되었고 성인 조직에서는 거의 관찰되지 않았다. 하나의 두드러진 핵 형태는 속이 빈 벨과 같은 형상의 핵을 지닌다 (높이가 대략 10-15 미크론이고 벨 입구의 직경이 대략 7-12 미크론이다). 이러한 벨-형상의 구조는 두 개의 종이컵의 분리와 같은 무사분열 과정에 의해 대칭적으로 분할되는 것처럼 보인다. 더욱이, 7개 이상의 다른 핵 형태가 비대칭적인 무사분열에서 벨-형상의 핵으로부터 나타나는 것이 관찰되었다. 이렇게 유래된 핵 형태를 함유하는 세포는 후속하여 배아, 샘종 및 샘암종에서 동일한 핵 형태의 클론 개체를 형성하는 유사분열에 의해 분할된다. 따라서 벨 형상의 핵을 지니는 세포가 배아 창자, 샘종 및 샘암종의 전체 성장 및 분화 둘 모두를 책임지며, 배아형성 및 발암에서 발생적인 다중유력한 줄기 세포에 대한 요건을 충족하는 것으로 보인다. 성체 조직과 반대로 배아/태아 조직 샘플의 전체 줄기 세포 성장 및 분화에 이론적으로 요구되는 대칭적 및 비대칭적 둘 모두의 무사분열을 입증하는 세포에서 벨-형상 핵의 특이적인 발생은 현미경 조직학/병리학 분야의 당업자가 세포를 이들의 핵 형태에 따라서 줄기 세포 또는 비-줄기 세포로 구별할 수 있게 해 준다.
발생학 및 종양학 둘 모두에서 공유하는 개념은 특정 기관으로부터 유래된 기관 및 종양에서 관찰된 복잡한 세포 유형이, 세포 분열이 두 동일한 전구 "줄기" 세포를 생성하는 대칭적인 세포 분열에 의해 전체 성장할 수 있고 하나의 전구 "줄기" 세포 및 하나의 분화된 세포를 생성시키는 비대칭적인 세포 분열에 의해 분화될 수 있는 전구 "줄기" 세포로부터 발생한다는 것이다. 이렇게 분화된 세포는 이후 추가의 수많은 시간 동안 분할되어 실질적으로 비-분할 말단 단계에 이어 프로그래밍된 세포 치사에 이르는 많은 수의 분화된 세포를 생성시킬 수 있다. "사멸" 분할은 세포가 두 번 더 고도로 분화된 세포로 분화될 때 발생한다.
"줄기 세포"란 용어는 과학 문헌에서 많은 상이한 레벨의 정의를 지닌다. 일반적으로, 이것은 분화되지 않거나 부분적으로 분화된 표현형을 유지하나 특정 상황에서 상이한 표현형을 지니는 세포를 생성시킬 수 있는 일련의 세포를 포함하도록 의도된다. 본원에 사용된 일반적인 용어 및 보다 특수한 용어의 사용은 본원에 개시된 교시를 포함하는 과학적인 관찰에 근거한 줄기 세포의 유형과 구별된다.
본원에 사용된 "배아 줄기 세포"란 용어는 보통의 유사분열에 의해 분할되고, 자궁 환경으로 이식되는 경우 완전한 태반 및 태아를 발생시킬 수 있는 조기 포유동물 배아의 일련의 세포를 포함한다. 따라서, 이들은 "분화전능(totipotent)"을 특징으로 한다. 이러한 세포는 생체외에서 배양되고 유사분열에 의해 분할되어, 매우 많은 수의 배아 줄기 세포를 형성할 수 있고 - 각각은 태반 및 태아를 발생시킬 수 있다. 임의의 배아 줄기 세포가 성장하고 있는 포유동물 태아, 신생아, 소아 또는 성체 동물에서도 이와 같은지에 대해서는 알려져 있지 않다. 성체 포유동물의 조직에 걸쳐 발견되는 미분화된 세포의 특정 클러스터는 분화전능성 배아 줄기 세포의 콜로니를 대표할 수 있다. 핵 형태와 관련하여, 이러한 형태의 줄기 세포는 구상 또는 거의 구상의 핵을 함유한다.
본원에 사용된 "태아-소아 줄기 세포"라는 용어는 임신 15주차의 사람 태아 및 벨-형상의 핵을 함유하는 사람 전암, 신생물 및 전이 병변에서 관찰된 일련의 세포 및 다핵 융합체를 포함한다. 본원에서 사용된 대로, "융합체"는 세포 격벽이 결여된 다핵 구조이다. 다중 핵이 존재하여도 이들은 융합체내에서 막에 의해 개개의 구획으로 분리되지 않는다. 태아 소아 줄기 세포는 대칭적인 핵 분열을 진행하여 두 개의 동일한 벨-형상 핵을 생성하고, 비대칭적인 핵 분열을 진행하여 하나의 벨-형상 핵 및 조직 및 종양 샘플에서 관찰되는 여러 개의 이형 핵 형태 중 하나의 핵, 예컨대 후속하여 유사분열에 의해 수가 증가하는 신장-형상, 시가-형상, 소세지-형상, 달걀형 또는 구상 핵을 생성시킨다. 벨-형상 핵의 대칭적이고 비대칭적인 핵 분열 둘 모두는, 수 세기 동안 관찰되고 본래 포유동물 세포 (포유동물 종양을 포함함)의 핵 분열의 관련 형태로서만 여겨지는 대로, 염색체와 같은 게놈의 일반적인 응축이 없고, 유사분열 스핀들이 형성되지 않으며, 전기, 중기, 후기 및 말기에서와 같이 염색체의 응축 또는 분리가 없는 한 무사분열이다. 대칭적인 분열은 태아-소아 줄기 세포의 전체 성장을 가능하게 하고, 아마도 태아, 신생아 및 소아의 일생에 걸쳐 조직 및 기관의 성장을 설명한다. 태아-소아 줄기 세포의 비대칭적인 분열은 표현형을 교체하는 세포의 생성을 가능하게 하고, 아마도 발달하고 성장하는 기관의 실질을 포함하는 분화된 세포 유형을 설명한다. 핵 형태가 세포 및/또는 핵의 인식가능한 특징이 되는 한, 핵 형태가 상이한 세포는 핵 형태 이외의 특징과 무관하게 세포 또는 핵 형태가 상이함을 특징으로 할 수 있다.
본원에서 사용된 "성체 유지 줄기 세포"란 용어는 규칙적인 비대칭 세포 분열에 의해 첫번째 과도적인 세포를 생성하고, 후속적인 유사분열 및 최종적으로 프로그래밍된 세포 치사에 의해 분화된 세포 조직, 예컨대 결장 크립트의 분화된 전환 유닛을 정의하는 세포의 이론적인 형태를 포함한다. 성체 유지 줄기 세포의 동일한 비대칭적인 분열이 또한 신규한 성체 유지 줄기 세포를 생성시킬 것이다. 매우 적은 수의 결장 크립트가 크립트의 기부에서 관찰된 태아-소아 줄기 세포의 특징인 벨-형상의 핵을 지니는 것으로 관찰되었기 때문에, 태아-소아 줄기 세포가 소아 기관의 전체 성장의 중지 및 일생의 성체 단계의 개시를 구분하는 변형을 경험하는 것으로 고려하는 것이 타당하다. 성체 유지 줄기 세포의 비대칭적인 분열이 자연에서 유사분열인지 무사분열인지는 알려져 있지 않다.
본원에서 사용된 "전암 줄기 세포"란 용어는 샘종의 결장 크립트의 기부에서 발견된 관찰된 벨-형상의 핵을 포함하는 단핵 세포를 나타낸다. 이러한 세포는 클러스터를 생성시키는 각 응집체가 동일한 형태의 핵을 함유하고, 상이한 응집체가 상이한 형태의 핵을 함유하는 상기 응집체의 큰 클러스터에서, 및 결장 전암 병변의 서브영역에서 동일한 핵 형태의 세포의 소형 응집체에서 관찰된다. 상기 세포는 "숄더-투-숄더" 관계로 배열된 핵을 지닐 수 있다. 벨-형상의 핵을 함유하는 융합체는 사람 결장 전암 병변에서 관찰되지 않고, 대칭적인 핵 분열에서 관찰된 개개의 벨-형상의 핵을 지니지도 않으며, 이 상태는 대략 이들이 유래된 소아 조직의 성장 속도에서 전암 병변의 느린 성장과 일치하는 것으로 해석된다.
본원에서 사용된 "신생물 줄기 세포" 또는 "종양 줄기 세포"라는 용어는 암성 종양, 예컨대 사람 결장의 샘암종, 결장 종양의 전이 및 사람 췌장의 종양에서 발견된 벨-형상의 핵을 포함한다. 이러한 신생물 줄기 세포는 모든 관찰된 전암의 다세포 응집체에서 이들의 존재에 의해 전암 줄기 세포로부터 분화되나, 또한 다핵 관 융합체에서 발견되고 무사분열의 대칭적인 핵 분열에 의해 분할되는 것으로 발견된다. 종양에서 발견된 융합체는 조기 태아 창자 조직에서 관찰된 것 보다 덜 광대하나, 대칭적인 핵 분열을 겪는 융합체 및 벨-형상의 구조는 전암 및 신생물 조직간에 명확한 구별 특징인 것으로 보인다.
본원에 기술된 이형 핵 형태는 또한 예를 들어, 조직 샘플 또는 배양액에서 성장한 세포로부터 유래된 세포 및 융합체에서 발견될 수 있다. 본원에 기술된 방법은 이형 핵 형태를 함유하는 세포 또는 융합체를 동정하기 위해 임의의 조직 샘플에 적용될 수 있다. 특히, 종양 조직 샘플을 이형 핵 형태를 동정하고 열거하기 위해 이용할 수 있다.
본원에서 사용된 "종양"은 담체에 이로운 생리적 작용을 하지 않는 세포의 진행성 증식으로부터 초래된 조직의 비정상적인 성장을 언급한다 (또한 "신생물"로서 언급됨). '양성' 종양은 주변 조직을 침습하지 않고 원 부위에 제한된 종양이다. 악성 종양은 주변 조직을 침습할 수 있거나 확산될 수 있으며 전이될 수 있는 것들인 한편, 양성 종양은 침습하거나 전이되지 않는다. 본원에서 사용된 "신생물"은 양성이든 악성이든 간에 치명적인 종양을 발생시키는 속도가 빠른 전체 세포 성장의 세포 질환을 언급한다. 신생물 세포는 반드시 침습적이거나 전이 종양은 아니지만 종양을 초래한다. "암"은 신체 기능을 방해하여 사망을 초래하는 하나 이상의 빠르게 성장하는 세포 콜로니의 질병이다. 암 세포는 일차 종양으로부터 벗어나서 림프액 및 혈관으로 침투하고, 혈류를 통해 순환되며, 신체의 다른 정상적인 조직의 새로운 부위(전이)에서 성장할 수 있다.
본원에서 사용된 "전암 질환"은 발견되지 않았으나 암을 발생시킬 가능성이 있는 (예컨대, 신생물 종양) 느리게 성장하는 콜로니를 특징으로 한다. 이러한 질환은, 예를 들어 결장의 폴립과 같은 비정상적인 미세해부학적 구조 또는 구조들 또는 성체 조직 샘플내 벨-형상 핵의 존재를 특징으로 한다.
"전체 줄기 세포 성장 속도"는 조직, 기관 또는 유기체의 전체 성장을 설명하는 대칭적인 태아-소아 줄기 세포 분열의 속도 (시간 유닛 당 분열)이다. 일반적으로, 줄기 세포 전체 성장 속도는 태아, 신생아 및 소아 수명을 통털어 유기체의 증가된 발달에 따라 감소하여 성체에서 0이 된다.
종양은 복잡한 다세포 구조, 예컨대 결장의 샘암종에서 결장 크립트의 형성을 포함하여 이들이 유래된 성체 기관/시스템의 많은 특징들을 나타낸다. 종양이 전체 성장 및 분화 둘 모두의 능력을 지니는 단일 전구체 세포로부터 유래되는 한, "종양 줄기 세포"는 존재해야만 하고 기관-특이적 줄기 세포 (특정 기관 세포 및 조직을 발생시킬 수 있는 부분적으로 미분화된 세포)의 많은 특징들을 공유한다고 추론된다. 예를 들어, 백혈병이 발생한 골수 세포의 경우, 이식시에 완전한 혈액 세포계를 발생시킬 수 있는 하나 또는 소수의 세포를 함유하는 골수 세포 서브-개체를 동정할 수 있는 특정 항원이 인식되었다. 유사하게, 종양 세포의 서브분획이 몇몇 종양 세포에 의해 발현되는 특정 항원에 의해 인식될 수 있다. 이러한 논리에 따르면, 이렇게 인식된 서브-개체 중 하나의 세포는 종양 세포 혼합물의 실험적인 이식의 경우에 새로운 분화된 종양을 발생시킨다. 이러한 추론을 계속해 보면, "기관-특이적 줄기 세포" 및 "종양 줄기 세포"는 서브-개체를 발현시키는 상기 항원 중에 존재한다. 이러한 항원을 하나 이상의 다중유력한 줄기 세포를 함유하는 세포 개체를 동정 및 단리시키는데 이용하나, 또한 줄기 세포로서 작용할 수 없는 대다수의 세포를 동정할 것이다. 단리된 이러한 개체 중 어떠한 세포도 진정한 줄기 세포 또는 기관 및 종양의 "시볼레스(shibboleth)"로서 고려되는 비대칭적인 세포 분열을 진행하지 않는 것으로 발견되었다.
"기관-특이적 줄기 세포" 또는 "종양 줄기 세포"가 부화된 기관 또는 종양의 서브분획에 대하여 실제로 "기관 특이적 줄기 세포" 또는 "종양 줄기 세포"인 세포를 동정하는 방법이 본원에 제시된다. 동정은 본원에 기술된 이형 핵 형태 및 핵 분열 및/또는 배열에 근거한다. 이러한 방법을 이용하여 상기 줄기 세포를 단리시키고, 기관 재생을 허용하는 세포를 단리시키고, 전암성 병변의 성장을 방해하고/거나 치료 시도 후 특히 종양 성장 및 재발의 원인이 되는 세포를 치사시킬 목적으로 이들의 특정 생화학 및 분자 생물학을 밝혀낼 수 있을 것이다.
이러한 기관-특이적 및 종양 줄기 세포는 두 특이적인 이전에 보고되지 않은, 현미경으로 보이는 형태의 핵 분열의 부류로서의 이들의 관여에 의해 추가로 태아 기관, 종양 및 종양 전이에서 동정된다. 상기 두 형태의 핵 분열 중 첫번째에서, 염색체의 일반적인 응축 및 유사분열 장치의 형성은 존재하지 않는다; 대신 하나의 벨-형상 핵이 두 종이컵의 분리와 유사한 방식으로 동일한 벨-형상의 핵을 발생시키는 것으로 보인다. 이러한 대칭적인 무사분열은 태아 및 종양 샘플에서 줄기 세포의 전체 성장을 제공한다. 줄기 세포-특이적인 핵 분열의 두번째 형태에서, 또한 염색체의 일반적인 응축 및 유사분열 장치의 형성은 존재하지 않는다; 대신 하나의 벨-형상 핵이 벨-형상의 핵 및 태아 조직 및 종양 샘플에서 관찰된 여러 개의 핵 형태 중 하나를 지니는 핵을 발생시키는 것으로 보인다 (도 3). 이러한 비대칭적인 무사분열은 태아 조직 및 종양에서 줄기 세포에 의해 분화된 세포의 생성을 규정한다. 벨-형상의 핵이 아닌 핵의 유사분열이 상기 샘플의 총 세포 중 대부분을 생성시키는 태아 조직 및 종양 샘플에서 관찰된다. 따라서, 줄기 세포의 동정 방법은 기관-특이적인 및 종양-특이적인 줄기 세포로서 분류하기 위해 필요한 대칭적 및 비대칭적인 핵 분열 둘 모두를 겪는 벨-형상의 핵을 지니는 세포의 직접적인 관찰을 가능하게 한다.
상기 기관-특이적인 및 종양 줄기 세포는 긴 튜브와 닮은 이전에 보고되지 않은 특이적인 다핵 구조의 부류로서의 이들의 관여에 의해 태아 기관, 종양 및 종양 전이에서 추가로 동정되며, 이 때 벨-형상의 핵은 쌓아 올린 컵 세트에서와 같이 헤드-투-토우 관계를 보유하는 분리된 일련의 종이컵과 유사한 방식으로 규칙적으로 정렬된다.
이러한 줄기 세포-특이적인 핵 형태(벨-형상), 핵 분열의 특정 형태(대칭적 및 비대칭적 무사분열 핵 분열) 및 다핵 구조에서 특정 형태의 관여(긴 다핵 튜브)는 성체 기관에는 본질적으로 존재하지 않는다. 그러나, 줄기 세포-특이적인 핵 형태는 전암 병변의 세포에서 관찰되며 성체 기관에 널리 분산된 단일 핵으로서 거의 관찰되지 않는다 (예를 들어, 성체 결장 크립트에서 2백만 분의 1개 보다 더 적은 수의 핵이 벨-형상의 핵인 것으로 발견되었다).
줄기 세포, 정상적인 성체 조직 및 종양 조직에서 이러한 이형 핵 형태 및 이들의 특이한 발생의 예상치 못한 발견으로 당업자는 이들의 핵 형태에 따라 세포를 분류할 수 있게 되었다. 또한. 줄기 세포는 이들의 핵 형태에 기초하여 단리될 수 있고, 항-종양원성 작용제는 종양-특이적인 형태의 출현 또는 소멸에 근거하여 스크리닝되거나 동정될 수 있으며, 조직 샘플은 조직의 세포에 존재하는 형태를 결정함에 의해 분류될 수 있다 (예컨대, 정상 또는 비정상; 신생물 또는 비신생물). 이러한 세포 분류의 결과로서, 개체가 암 또는 전암성 병변을 지녔는지에 관한 진단이 이루어질 수 있다. 실시예에서 특정 방법(하기 참조)을 사용하여 상기 신규한 형태를 가시화할 수 있으나, 핵 형태를 동정 및 평가할 수 있는 임의의 방법이 세포, 조직 및 샘플의 분류, 및 후속하는 질병의 진단에 적합할 뿐만 아니라 항-종양원성 작용제(예컨대, 종양원성 세포 성장을 억제하거나 감소시키는데 효과적인 작용제)를 동정하는데 이용되는 검정에 대한 기초를 제공한다. 상기 방법으로는 상 대조 현미경, 공초점 현미경, 2 전자 또는 2 파장 현미경 및 작은 각 산란 흐름 세포 측정이 있다.
본 발명의 목적을 위하여, 하기 실시예에 기술된 현미경 관찰을 위해 정상적인 성인 결장 상피, 결장 샘종, 결장 샘암종 및 태아 창자의 두꺼운 ~0.5mm 절편을 제조하였다. 조직 시트층의 두께는 적어도 완전한 세포 (세포의 절편 또는 슬라이스가 아님)의 두께여야 한다. 모든 샘플에서 나타난 큰 회전 타원체 및 비-회전 타원체 핵 형태의 정렬이 도 1에 요약되어 있다. 모든 샘플은 성체 결장 크립트의 조직학적 절편에서 정상적으로 관찰되는 구상 및 달걀형 핵을 함유하나 또한 예외적인, 이전에 보고되지 않은 핵 형태를 함유하였다. 배아 조직은 벨, 테이퍼링 시가, 신장 콩, 소세지 및 소형 구체 같은 형상의 핵을 함유하였다. 정상적인 성체 결장 크립트는 크립트 기부에서 때로 벨-형상의 핵을 함유하나 거의 대부분은 큰 구체 및 달걀형 구조였다. 몇몇 관찰에서, 크립트 기부에 가까운 세포 핵은 "원반형"일 수 있다. 샘종 및 샘암종에서, 구체 및 달걀형 핵 이외의 핵 형상으로는 테이퍼링 시가 및 시가의 끝을 뭉툭하게 잘라낸 것처럼 보이는 "탄알-형상"이 있다.
크립트 구조는 준비 공정에 의해 보존되며 정상적인 결장, 샘종 및 샘암종에서 명백하게 관찰되었다. 적용된 ~0.5 mm의 샘플 절편은 관찰된 가장 큰 핵 형태, 길이가 ~40 미크론인 소세지-형상 보다 더 두꺼웠다. 4 미크론의 "응축된 구상 핵"을 제외하고, 모든 핵 구조는 병리학적 평가에 일반적으로 적용되는 5 미크론의 절편보다 긴 하나 이상의 내부 축을 지녔다. 더욱이, "벨-형상" 또는 "시가-형상" 등으로 분류될 수 있는 핵 중에서도 상당한 정도의 형태적인 변화가 존재하며, 이는 독립적인 계통 및 생리학적 작용성을 시사한다.
벨-형상 핵의 현상, 이들의 대칭적 및 비대칭적 무사분열 형태, 또는 본원에 기술된 성체, 전암, 신생물 및 배아 조직에서 핵 형태의 수집은 이전에 보고된 바 없었다 (참조 실시예 2). 또한 배아 및 샘암종에서 선형으로 정렬된 벨-형상 핵의 관 포장도 명백히 새로이 관찰된 것이다. 이들이 이전에 관찰되지 않았던 이유로는 표준 조직학적 관례와 본원에서 적용되고 개시된 것들과의 차이를 들 수 있다. 두 명백한 공정상의 차이점은 분명하다. 먼저, 고정을 위한 모든 조직이 단시간 (예를 들어, 30분내) 내의 외과적 제거로 절편화되고 고정되었다. 신중한 조직 제조가 분해를 억제할 수 있으나, 제조물은 30분 후 핵 형태의 분해를 나타내기 시작할 수 있다. 둘째는 의학적 병리학에서 실행되는 얇은 절편 공정과 본원에 개시된 두꺼운 절편 고정 프로토콜 간의 차이이고, 후자는 상기 핵 형상을 유지하는 구조/조건을 보존하며, 전자는 명백하게 이를 파괴한다.
현상으로서의 무사분열은 수많은 원생동물 및 원시 후생동물에서 보고된 바 있다 (Orias, E., 1991, J. Protozool, 38:217-221; Prescott, D., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 92:136-140). 그러나, 이러한 무사분열은 원생동물 무사분열성 핵 분열이 핵 중열(cleft)의 형성에 의해 발생하고 두 분리된 거의 동일한 핵을 핀칭 오프(pinching off)시키는 한 본원에 보고된 것과 다르다 (Fujiu, K. and Numata, O., 2000, Cell Motil. Cytoskeleton, 46: 17-27). 그러나, 원생동물에서 보여지는 것과 유사한 종류의 무사분열은 수많은 상이한 종양에서 보고되었다 (Okuyama, S. 1991, Tohoku J. Exp. Med., 164:247-249; Okuyama, S., 1992, Tohoku J. Exp. Med, 168:445-448; Elias, H. and Fong, B., 1978, Hum. Pathol, 9:679-684; Elias, H. and Hyde, D., 1982, Hum. Pathol, 3:635-639).
유사분열 세포의 초기 전기 핵 중 염색체의 배열이 간기 핵의 형상을 유지하는 것을 보여주는 관찰이 또한 주목할 만하다. 상이한 염색체는 세포의 표현형을 정의하는데 중요한 영향을 줄 수 있는 고도로 구조화된 모자이크를 형성하는 것으로 보인다. 간기 핵의 염색체의 공간적 배열 및 세포 병리학간의 관계는 활발한 탐구 영역이다 (Misteli, T., 2001, Science, 291:843-847; Thomas, C. et al, 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:1972-1977; Parada, L. et al, 2004, Exp. Cell Res., 296:64-70).
하기 인용된 관찰에 근거하여, 벨-형상의 핵을 지니는 세포는 종양 및 전암 병변, 예컨대 직결장 종양, 샘종 및 샘암종을 발달시키고 성장시키는 발생 세포를 나타내는 다중유력한 세포이다. 따라서, 벨-형상의 핵 형태는 다중유력한 줄기 세포를 나타내며, 이는 성체 조직 샘플에서 전암 및 신생물 조직에 대한 진단적 특징으로서 사용될 수 있다. 또한, 벨-형상 핵의 편성 (예컨대, 튜브-같은 구조 또는 거미줄-같은 구조로)은 추가로 종양 발달의 진행을 나타낼 수 있다 (예컨대, 신생물 또는 전이 종양).
벨-형상 핵의 다중유력성은 비대칭적인 무사분열에서 벨-형상의 핵으로부터 나타나는 다양한 형태의 핵의 이미지에 의해 입증된다. 달걀-, 소세지, 신장-, 탄알- 및 시가-형상의 핵이 벨-형상의 핵으로부터 나타나는 것으로 관찰되고 다른 핵 형태가 관찰되지 않는 한, 이들은 이들이 존속을 위해 주재하는 조직에 필수적인 일련의 작용을 나타낸다. 실제로 관찰된 벨-형상의 핵 중에서 형태학적 변화에 의해 제안된 대로 벨-형상의 핵을 지니는 다양한 세포 형태가 존재할 수 있다.
벨-형상의 핵을 지니는 세포의 수 및 대칭적인 무사분열 빈도는 상기 가설의 발생적인 엘리먼트와 일치한다. 이들은 배아에서 많은 수로 관찰되며 신생물이 없는 정상적인 성체 결장에서 거의 관찰되지 않고, 소수 입방 밀리미터의 샘종에서 소수(예를 들어, 약 1000)로 및 수 입방 센티미터의 샘암종에서 많은 수(예를 들어, 약 1,000,000 미만)로 존재한다. 배아 및 샘암종에서 이들의 분열 속도는 1년에 약 20회 분열로 예측되며, 이는 결장 샘암종의 추정된 전체 성장 속도와 일치한다 (Herrero-Jimenez, P. et al, 1998, Mutat. Res., 400:553-578). 샘종에서 이들의 대칭적인 무사분열 분획은 1/1000 미만이고, 지금까지 나타난 바 없다. 이렇게 음성적인 관찰은 그 자체로 중요하다. 사람 결장 전암 병변에서 발생적인 세포 또는 "촉진의 위험이 있는 세포"에 대한 세포 분열의 빈도는 6년에 약 1회의 추정에 의해 조사되었다 (Herrero-Jimenez, P. et al, 2000, Mutat. Res., 447:73-116). 진행된 무사분열은 3시간 동안 인식될 수 있었으며, 6/100,100 미만의 빈도로 예상될 것이다. 따라서, 샘종의 매우 낮은 대칭적인 무사분열 속도가 결장 전암의 발생적인 세포에 대한 예상과 일치한다.
벨-형상의 핵을 지니는 세포는 소아 성장의 끝에서 점차 제거될 수 있다. 망막모세포는 조기 유년기에 망막세포로 투입되며 망막모세포종 유전자 이형접합체에서 망막모세포종의 위험을 제거한다 (Knudson, A., 1971, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 68:820-823). APC와 같은 유전자의 변이에 의해 결장 종양 "개시"가 이러한 제거 과정을 억제할 수 있었다. 그렇다면, 벨-형상의 핵은 신생아 및 소아의 결장 크립트의 기부에서 발견되어야 한다.
배아 및 발암성 조직 중 벨-형상 핵의 출현으로부터, 배아형성 및 암종형성간의 관계가 추론될 수 있다. 암 연구자들은 종양이 일 세기 이상 동안 배아의 특징을 반영한다고 고려하였다. Erenpresia, J. and Helmtrud, I. (1999, Mech. Aging and Develop., 108:227-238) cited J. Cohnheim (1875, Virchows Arch., 65:64; 1877-1880, Vorelesungen uber allgemeine Pathologie. Ein Handbuch fur Artzte und Studierende. Berlin, Hirchswald 1-2 691S) 첫번째 가설로서 종양은 성체 조직에 부적절하게 존속된 태아 세포로부터 발생한다. 종양에서 암-배아 항원의 발현, 및 또한 배아에서 발견되는 넓은 스펙트럼의 유전자 생성물, mRNA 및 단백질의 종양에서의 출현은 종양형성이 유사 배아 성질을 지니는 세포의 출현을 수반한다는 폭넓은 가설을 보충한다. 샘암종 및 배아 결장 세포에서 형태가 본질적으로 무사분열 및 유사분열 거동과 동일한 형태학적 세포 유형의 발견은 명확히 콘하임(Chonheim)을 밀접하게 반영하고 종양 줄기 세포의 존재를 입증하는 보다 최근의 논의 및 실험적 입증을 이용하는 암-배아 가설의 보다 특이적인 재진술을 필요로 한다 (Pardal et al, 2003, Nature Rev., 3:895-902).
암 연구의 실체 및 지난 130여년의 인식으로 통합된 이러한 새로운 관찰은 기원 및 지발성 결장 샘종 및 샘암종의 특징에 대한 단순한 가설을 제안한다: 종양 개시 변이, 예컨대 APC 유전자 분활성화는 상기 세포 형태가 소아기 동안 또는 소아기의 끝에서 제거되기 전에 벨-형상 핵을 지니는 세포에서 발생한다. 이렇게 개시된 벨-형상의 핵을 지니는 세포는 단순히 이들이 소아에서 활동했던 것과 동일한 속도로 지속적으로 신규한 결장 크립트를 분할하고 생성시킬 것이다 (Herrero- Jimenez, P. et al, 1998, Mutat. Res., 400:553-578; Herrero- Jimenez, P. et al, 2000, Mutat. Res., 447:73-116). 생성된 국소 집단은 "폴립"을 생성한다. 추가의 유전자 변화 또는 변화들 (유전자 각인의 변화 포함)에 의해 눙동적으로, 또는 성장하는 샘종내에서 발생하는 생화학적 변화에 의해 수동적으로, 벨-형상의 핵을 지니는 단일 세포는 보다 이른 배아 상태로 복귀하여 배아에서와 같이 배아 조직으로부터 거의 구분될 수 없는 빠르게 성장하는 세포의 정렬을 발생시킨다. 처치되지 않으면, 이러한 지속적인 성장은 결장 폐색 및/또는 전이 및 사망을 초래한다.
가장 일반적인 의미에서, 이러한 관찰은 종양발생의 고도로 정연한 본질을 시사하며, 이 때 별개의 무질서하지 않은 거동은 느리긴 해도 소아의 일정한 성장 속도를 보존하는 샘종 및 배아발생 동안 관찰되는 세포 유형의 정연한 총체 및 성장 속도를 재현하는 샘암종에서 관찰된다. 현존하는 생물학적 형태가 무수한 퇴화 가능성으로부터 선택된다는 의미에서 ("모든 조합의 시도"), 사람에서의 종양발생이 희박하나 단순한 소아 성장의 중단 실패 및 후속적으로 정연한 배아 세포 상태로의 드문 복귀를 대표할 수 있다는 것은 아마도 놀라운 것이 아니다.
상기 관찰들은 벨-형상의 핵을 지니는 세포가 보다 특이적이고 따라서 보다 효과적인 형태의 종양 억제 및 치료를 위한 표적일 것임을 시사한다. 전암 콜로니의 전체 성장 속도를 50%까지 낮출 수 있고, 가장 지발성인 암 유형은 100년이라는 사람의 수명 동안 나타나지 않을 것이다 (Herrero- Jimenez, P. et al, 1998, Mutat. Res., 400:553-578; Herrero- Jimenez, P. et al, 2000, Mutat. Res., 447:73-116). 벨-형상의 핵과 같은 이형 핵 형태를 지니는 세포가 결장의 샘종 및 샘암종에서 종양 줄기 세포라고 여겨지는 것은 타당하며, 유사분열에 의해 분할되는 세포 및 종양 매스의 벌크를 제공하는 비대칭적인 분열 또는 전체 성장의 대칭적인 분열에서 DNA 합성 및 분리 중 이들의 특수한 특징을 부여하는 메커니즘을 표적으로 할 수 있다. 상기 세포 유형 또는 관을 가진 벨-형상의 핵은 상이한 생화학적 방식하에 작동하며, 이해에 따라 이들은 종양 억제 및/또는 치료를 위해 탐구될 수 있다 (참조, 예를 들어, 배아, 성체 기관 및 암 조직 중에서 미토콘드리아 생화학의 현저한 차이를 발견한 오토 바르부르그(Otto Warburg)의 발견 (Warburg, O., 1956, Science, 123:309- 314; Warburg, O. et al., 1960, Z. Naturforsch B., 15B:378-379)).
무척추동물에 대한 기본적인 정보를 참조하면 큰 소세지-형상의 핵은 페르티리치 보르티셀라(Vorticella) 및 헤테로트리치 "스텐터는 구슬의 스트링과 유사한 현저한 유형의 큰 핵을 지닌다"와 같은 섬모가 있는 원생동물 중에 존재한다 (Buchsbaum, R. et al, 1971, Animals Without Backbones, 3rd ed., University of Chicago Press, Chicago, IL). 핵 메타발달방식의 이러한 특수성은 세포가 배아, 샘종 및 신생-혈관발달에 앞서 불충분한 산소가 예상되는 국소 환경의 샘종에서 성장하는 것으로 나타나는 한에 있어서는 심지어 진화 기간 중 프리-옥식(pre-oxic) 환경에서 살아남은 세포의 생화학과 관련될 수 있다. 아미노산이 배아 및 종양에서 ATP 생성을 위해 산소 감소 동치를 제공한다는 바르부르그의 발견은 산소를 제한적인 영양소로서 간주하는 표현형의 선택을 제안한다.
따라서 이형 핵 형태 (예컨대, 벨-형상의 핵)는 진화 생물학, 배아발생 및 종양발생을 결합시키는 3중의 생리학적 연합을 나타내는 것으로 보인다. 감수분열 및 유사분열의 유전적 주기에 대하여, 수정 후 기간의 유사분열 및 동물의 대부분의 세포 매스를 생성시키는 유사분열 간에 선형 하강의 대칭적 및 비대칭적인 무사분열 단계가 여기에 추가되어야 한다.
본 발명은 특히 핵의 형태에 근거하여 세포 유형을 분류하는 방법, 및 대칭적 및 비대칭적 무사분열에서 이들의 관계 및 다세포 응집체에서 이들의 관련에 관한 것이다. 예를 들어, 포유동물로부터 수득된 조직 샘플을 이형 핵 형태의 존재 또는 부재에 따라 분류할 수 있다 (예컨대, 벨-형상의 핵, 시가-형상의 핵 및 탄알-형상의 핵). 도 1에서 입증된 대로, 이형 핵 형태는 상이한 발달 단계 및 또한 상이한 종양 발단 단계에 존재한다. 예를 들어, 벨-형상의 핵은 태아 샘플에서 발견되며, 성체 샘플에서는 거의 발견되지 않고, 샘종 및 샘암종 샘플에서 널리 발견된다. 이는 이형 핵 형태가 성체 조직에서 태아 소아 줄기 세포 뿐만 아니라 신생물 줄기 세포를 동정하는데 사용될 수 있음을 시사한다. 이러한 결과는 이전에 증명되지 않은 태아 줄기 세포 및 암 줄기 세포 간의 관계를 입증한다. 따라서, 태아에서 태아 소아 줄기 세포를 나타내는 이형 핵 형태는 또한 성체 조직에서 암 줄기 세포를 나타낸다.
또한, 도 2A-2C는 이형 핵 형태가 튜브-같은 구조로 정렬됨을 도시한다. 이러한 튜브-같은 구조가 태아 샘플에 존재하고 이형 핵 형태를 함유하기 때문에 (예컨대, 벨-형상의 핵, 시가-형상의 핵 및 탄알-형상의 핵), 튜브-같은 구조는 그 자체로 성체 조직 중 태아 소아 줄기 세포 또는 신생물 (예컨대, 종양 또는 암) 줄기 세포의 표지로서 사용될 수 있다.
대안적으로, 도 5A-5E에 도시된 대로 이형 핵 형태의 융합체로의 정렬은 샘종 및 샘암종 간의 차이를 나타낸다. 따라서, 조직 샘플 중 다핵 구조의 핵 형태의 정렬은 질병의 상이한 단계에서 신생물 샘플을 구별하는데 사용될 수 있다.
이형 핵 형태가 다른 성체 조직 및 종양 샘플에서 관찰되었기 때문에 (예컨대, 간), 당업자는 임의의 성체 조직에서 이형 핵 형태의 존재에 근거하여 전암 또는 신생물 병변을 인식할 것이다.
본 발명은 또한 전암 또는 신생물 조직과 특히 관련된 이형 핵 형태 (예컨대, 벨-형상의 핵, 시가-형상의 핵 및 탄알-형상의 핵)의 출현 또는 소멸에 기초하여 항-종양원성 작용제를 동정하는 방법에 관한 것이다. 후보 항-종양원성 작용제를 예를 들어 생체내, 특히 동물 모델 (예컨대, 포유동물 모델, 예컨대 마우스 또는 래트와 같은 설치류)에서 스크리닝할 수 있다. 후보 항-종양원성 작용제를 예를 들어 임상적 연구에서 스크리닝하여, 시도된 섭생이 종양에서 세포의 >99%를 구성하는 비-줄기 세포 개체에 대하여 종양 줄기 세포 성분을 실제로 파괴하는지를 밝혀낼 수 있다. 본원에 개시된 방법에 따라, 후보 항-종양제 또는 종양 억제제가 사람 종양 또는 실험 동물에서 새로이 발생하는 종양으로부터의 이식을 이용하여 실험 동물에서 스크리닝될 수 있다. 따라서, 세포 배양액에서 벨-형상의 핵을 지니는 세포의 대칭적 또는 비대칭적인 분열을 없애거나 방해하는 작용제가 종양 억제 또는 환자를 치료하기 위한 후보로서 인식될 것이다.
대안적으로, 항-종양원성 작용제는 시험관내 또는 생체외에서 스크리닝될 수 있다 (예컨대, 핵 형태가 유지된 배양된 샘플). 연장된 기간 동안 일차 배양액의 조직을 보존하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 항-종양원성 작용제는 이형 핵 형태가 보존된 배양된 샘플에서 동정될 수 있다. 따라서, 이러한 배양된 샘플을 후보 항-종양원성 작용제로 처리하여 이형 핵 형태의 보급이 감소된 경우, 후보 항-종양원성 작용제는 환자의 생체내에서 종양을 치료하는데 유용한 것으로 예상될 것이다.
본 발명을 하기 비제한적인 실시예를 참조로 하여 추가로 설명할 것이다. 모든 특허, 특허 출원 및 모든 다른 공개문헌 및 본원에 개시된 웹사이트의 교시의 전체 내용이 참조로서 포함된다.
실시예 1: 실험 과정
세포 및 조직의 공급원
모든 성인 조직 및 종양 샘플을 암 연구를 위한 병리학부 및 MGH 센타를 통해 메사츄세츠 종합병원에서의 수술 폐기물로서 수득하였다. 각 조직 섹션을 즉시 새로운 얼음-냉각 고정액에 배치하고 추가 분석을 위해 MIT 세포유전학 실험실로 옮겼다. 익명의 폐기된 섹션의 사용은 MGH 및 MIT 둘모두의 임상시험심사위원회(Institutional Review Board)에 의해 승인되었다. 분석되는 태아의 소화관 섹션은 본 연구를 위해 수득하지 못했으나 1985년 체르노빌(Chernobyl, Ukraine)에서 핵 반응기의 노심용해 후에 태아 및 어린이의 발달시에 유전자 조사 손상의 표시를 발견하는 업무의 책임을 맡았던 체르노빌 과학 탐험대(Chernobyl Scientific Expedition)의 기록 슬라이드 수집으로부터 추론하였다. 암과 관련이 없는 외과 수술후에 폐기된 두개의 정상 성인 결장(두개의 FAPC 결장, 네개의 결장 종양, 한개의 췌장 종양 및 두 부모로부터의 수개의 독립적인 결장직장 전이 중 5개의 직경 ~2 내지 10 mm의 용종)을 분석하였다.
조직 절제, 고정, 스프레딩(spreading) 및 DNA 염색
이러한 과정은 두께가 0.5 mm인 고정되고 염색된 조직 섹션을 사용하였으며, 세포 접착을 현미경 슬라이드 상에 조직을 정렬되게 스프레딩할 수 있을 정도로 화학적으로 분열되었다. 이러한 기술은 세포가 이들 핵의 구조적 보전을 유지하도록 하기 위하 것이다. 조직 스프레딩에서 고유한 일부 최소의 염좌를 지님에도 불구하고 염색된 핵과 같은 작은 형태학적 구조 및 결장 크립트선과 같은 보다 큰 구조가 관찰될 수 있다.
핵 형태는, 결장 수술 폐기물이 절제되자 마자 제공되는 곳에서 상세히 볼 수 있다(예를 들어, 절제 후 1 시간 이내, 더욱 바람직하게는, 절제 후 약 30분 또는 30 분 이내). 벗겨진 결장 점막의 시트(~1 ㎠) 또는 1 mm 두께의 샘종 또는 샘암종의 섹션을 절개 직후에 새롭게 제조된 4℃ 카르노이 고정액(Carnoy's fixative); 3:1, 메탄올:빙초산)에 배치하였다. 고정액의 부피는 조직 샘플 부피의 적어도 3배이다. 총 3 시간의 고정 동안 45분 마다 3 차례 새로운 고정액으로 교체하였다. 이후 카르노이 고정액을 4℃, 70% 메탄올로 교체하고, -40℃에서 최대 일년동안 저장할 수 있다.
약 1 ㎟ 단편(섹션 두께로부터 별도의 길이×폭)을 스프레딩 및 DNA 염색을 위해 전체 고정된 조직 샘플로부터 절개하였다. 각 단편을 증류수로 린싱하고 거대분자의 부분 가수분해 및 DNA 탈퓨린화(depurination)를 위해 60℃, 정확하게 8분 동안 2 ml의 1N HCl 중에 배치하였다. 차가운 증류수에서 빠르게 린싱하여 가수분해를 종결시켰다. 린싱된 샘플을 45% 아세트산(실온)에서 15 내지 30분 동안 담궜다. 이러한 마지막 단계는 조직 세포 스프레딩 및 현미경 슬라이드 상에서 적당한 압력으로 식물 조직 섹션의 관찰을 연속적으로 수행하는 "조직 침연"으로서 식물세포유전학에 공지된 것이다[Gostev, A. and Asker, S., 1978, Hereditas, 101:98-104; Gostjeva, E., 1998, Genetika, 32:17-21]. 이러한 "침연된" 고정된 조직 샘플을 현미경 슬라이드 상에 스프레딩시키기 위하여 즉시 사용하였다. 각각의 ~1 ㎟ 침연된 섹션을 이등분하여 2개의 ~0.5 × 1 mm 단편의 고정되고 침연된 조직을 형성시켰다. 각 단편을 깨끗한 현미경 슬라이드 상의 ~5 ㎕의 아세트산으로 옮기고 22 × 22 mm 커버 슬립으로 덮었다. 가장자리의 약한 압력으로 커버 슬립을 잡고 조직 샘플 상에 적용하여 슬라이드 중앙에 위치시켰다.
스프레딩 단계를 위해, 5층의 여과지를 접고 커버 슬립이 제거되지 않도록 최대한 조심스럽게 커버 슬립 상에 위치시켰다. 핀셋 핸들을 여과지를 따라 한 방향으로 지속적으로 이동시켜 약하고 고른 압력으로 커버 슬립을 덮었다. "약한"은 염색체를 "짓누르는"데 사용되는 것 보다 현저하게 낮은 압력을 의미한다. 스프레딩의 특성을 각각의 개개 샘플에 대해 20배의 상-반전 대물렌즈를 사용하여 체크하였다. 양호한 결장 조직 스프레딩의 표시는 전체 조직 스프레딩의 가장자리에 손상된 핵이 존재하지 않으며 음와(crypt)를 필수적으로 단일층으로 가압하여 음와의 형태학적 보전성을 보존하였다. 각각의 잘 스프레딩된 샘플 슬라이드를 드라이 아이스 표면 상에 즉시 배치시켰다. 2 분 후에, 스프레딩된 조직 샘플이 완전히 동결될 때, 면도칼날을 천천히 때어낼 커버 슬립의 가장자리 아래에 삽입하였다. 슬라이드를 한시간 이상 먼지부재 환경에서 건조시켰다.
염색 과정을 실온에서 수행하였다. 슬라이드를 코플린 병(Coplin jar)에 배치시키고 쉬프 시약(Schiff's reagent)(Art. 9033, Merck)으로 충전하여 핵의 부분적으로 탈퓨린화된 DNA를 염색하였다. 슬라이드를 1 시간 동안 염색 용액에 담그고, 동일한 코플린 병에서 2×SSC(트리나트륨 시트레이트, 8.8 g/L, 나트륨 클로라이드 17.5 g/L)로 2회 린싱하였으며, 이중 한번은 30초 동안 수행하고 나머지 한번은 신속히 수행하였다. 이후 슬라이드를 증류수로 린싱하였다. 본 단계에서 슬라이드는 정량적 이미지 분석에 의해 핵 또는 축합된 염색체 중 포일겐(Feulgen) DNA 양의 측정을 포함하는 핵 중 DNA 분포의 관찰을 위해 적합하다[Hardie, D. 등 2002, J. Histochem. Cytochem., 50:735-749].
간기의 우수한 분해능 및 이미지를 얻기 위하여, 핵 슬라이드를 기엠사(Giemsa)로 추가 염색할 수 있다. 2×SSC 슬라이드로 린싱한 직후에 1% 기엠사 용액(Giemsa, Art. 9204, Merck)에 5 분 동안 배치시킨 후 먼저 쇠랜쌘 완충액(Soerenssen buffer; 디나트륨 수소 포스페이트 이수화물 11.87 g/L, 칼륨 이수호 포스페이트 9.07 g/L)으로 빠르게 린싱한 후 증류수로 린싱하였다. 염색의 침식을 방지하기 위해 온도계로 흔들어주어 물방울을 슬라이드에서 흔들어 떨어뜨렸다. 슬라이드를 먼지부재 환경에 배치시켜 실온에서 1시간 동안 건조시켰다. 이후 이를 크실렌으로 채워진 코플린 병에 3 시간 이상 배치시켜 지방을 제거하였다. 커버 슬립을 DePex 마운팅된 매질을 구비한 슬라이드에 접착시키고, 이들이 높은 분해능 스캐닝을 위해 준비되는 시간인 3 시간 동안 건조시켰다.
현미경 및 이미지 처리 시스템
KS-400 이미지 분석 시스템(KS-400 Image Analysis System™, Version 3.0, (Zeiss, Germany))을 사용하여 핵 치수 및 DNA 함량의 정량적 분석을 위해 이미지를 관찰하고 기록하였다. 이러한 시스템은 자동화된 광 현미경, 액시오스코프(Axioscope™), 칼라 CCD 카메라, 개인용 컴퓨터에 연결된 액시오캠(AxioCam™(Zeiss, Germany))으로 구성되어 있다. 포일겐 염색만을 사용할 경우 이미지를 현미경으로부터 가시광선 및 560 nm(녹색) 필터를 사용하여 1.4/100 배율의 평면 색지움 대물렌즈에 투과하였다. 포일겐-기엠사 염색을 사용하는 경우 필터를 사용하지 않았다. 프레임 포착기 및 최적의 광노출을 각 스캐닝 전에 조절하였다. 핵 이미지를 픽셀 크기 0.0223×0.0223 ㎛로 기록하였다. 배율, 분해능 및 광노출과 같은 스캐닝 파라미터를 동일한 슬라이드의 재현성 스캔을 허용하기 위해 저장하였다.
실시예 2: 벨-모양 핵의 검출
태아의 후장(hindgut)
두개의 독립적인 배아 소화관 섹션으로부터 본원에 기술된 관찰을 도 1, 2A 내지 2C 및 3A 내지 3F에 나타내었다. 세개의 관찰로 이루어져 있다. 먼저, 도 1에 개략된 별도의 7개 핵 형태의 정렬이 있다. 두번째로, 도 2A 내지 2C에 나타낸 바와 같이 긴(~20 내지 50 마이크론 직경) 튜브에 구조화된 벨-모양 핵의 규칙적인 선형 전신(head to toe) 배열이 있다. 세째로, 도 3A 내지 3F에 나타낸 바와 같이 벨-모양 핵을 포함하는 대칭 및 비대칭 무사분열(amitoses)의 특별한 형태가 있다.
겹쳐질때(오른쪽 프레임, 도 2C), 상반전 이미지(왼쪽 프레임, 도 2B) 및 동일한 후장 섹션의 염색된 핵 이미지(중간 프레임, 도 2B)는 선형으로 지향된 핵이 약 20 내지 25 마이크론의 직경을 갖는 종래 보고되지 않은 튜브-유사 구조에 함유됨을 나타내었다. 핵의 280 배율(중간 프레임, 도 2B)은 이러한 비구형 핵이 컵 또는 벨의 형태일 수 있음을 나타낸 것이다. 선형 정렬에서 핵의 보다 높은 분해능 이미지(1400배)는 명확하게 공동을 갖는 재현성 벨 모양을 갖음을 나타낸다. 벨의 "전신(head to toe)" 지향은 관찰된 모든 배아 튜브에서 보존되지만 평행한 튜브가 벨 모양 핵의 국부적 비평행 지향을 갖을 수 있도록 튜브는 앞뒤로 꿈들거린다.
벨-모양 핵은 튜브-유사 구조내에서만 대칭적 또는 비대칭적 무사분열을 수행하는 것으로 관찰되었다. 벨 모양 핵의 대칭적 무사분열은 두개의 적층된 종이컵의 단순한 분리를 닮았다. 가장 높은 분해능에서, 분할중 벨(bells-in-division)의 상단 입구(lip)는 한쌍의 축합되거나 부분적으로 축합된 염색분체(도 2 화살표 참조)를 갖으며, 아마도 도 3A 및 3B에 나타낸 바와 같이, 벨의 외부 가장자리의 3/4를 에워싸는 것으로 나타났다. 여러 상이한 벨 모양은 다양한 튜브내에서 발견되었으며, 이러한 형태학적 변형체는 대칭적 무사분열에서 정확하게 재생산되었다(도 3A).
물론 종래 발견되지 않은 벨-모양 핵의 무사분열 핵 분할의 형태는 놀라운 것이다. 그러나, 태아 섹션은 이 보다 더욱 놀라운 것이다. 소화관 섹션에서 튜브 구조물내의 벨-모양 핵은 명확하게 핵을 "낳는 것임(giving birth)"을 발견하였 다. 모든 핵 모양의 형태의 예는 태아 섹션에서 발견되었으며, 도 1에 나타낸 바와 같이 벨-모양 핵으로부터 나타남을 발견하였다. 핵 분할의 비정상적인 무사분열 비대칭 형태는 도 3C에 나타내었다.
벨-모양과 다른 핵 형태과 관련하여, 모두는 유사분열을 수행하여 동일한 핵 형태의 국소적 콜로니를 형성하는 것으로 나타났다. 이러한 유사분열 분할은 항상 벨-모양 핵을 함유한 긴 튜브의 외측에 발생하였다. 이상하게도, 특정 핵 형태학은 전기에서 유지되었으며, 도 1에 나타낸 바와 같이, 마지막 후종기에서 염색체의 결합에 의해 다시 생산되었다.
정상 결장 상피
~0.5 mm 섹션의 조합, 조직 침연(하기 참조) 및 적당한 스프레딩은 DNA-특이적 염색과 조합하여 삼차원 특징의 인식이 가능한 구체적으로 깨끗한 핵 이미지를 생성하였다. 음와에서 모든, 또는 거의 모든 핵은 음와 베이스에서 구경 표면까지 관찰될 수 있다. 많은 음와는 개개 핵 모양이 분별될 수 있는 방식으로 균열되거나 분산되었다. 난형체 또는 구형 핵을 갖는 세포는 상피 연장에 대한 상기 베이스로에서 루멘까지 음와를 채운다. 그러나, 첫번째 ~25 세포의 음와 베이스 자체에서 "폐기되는" 것으로 특징될 수 있는 핵 형태(~2 내지 3 마이크론 두께 및 ~10 마이크론 직경)가 지배적이었다. 세포가 벨-모양 핵으로 잘 분리되는 1% 미만의 음와 베이스에서 폐기 핵 중에 식별되었다. 유사한 낮은 횟수의 벨-모양 핵이 성인 간의 제조물에서 관찰되었다. 종양형성 또는 사전종양형성의 임의의 지시가 없는 성인 결장에서 다른 핵 형태학적 변이체가 약 800 웰 스프레드 음와의 세포 스캔에 의해 세포에서 발견되지 않았다.
샘종
샘종은 각각 ~2000 세포를 갖는, 정상 결장 음와로부터 구별되지 않을 수 있는 수많은 음와를 함유하였다. 이는 도 5A에 나타낸 바와 같이 가지형(branching form)으로 자주 발견되었다. 동일한 구형 및 난형 핵이 일반적인 결장 음와에서와 같이 음와 벽에 존재하지만, 음와 베이스에 하나 또는 두개의 벨-모양 핵이 종종 나타났다. 불규칙 음와-유사 구조는 또한 ~8000 세포 이하를 함유하는 것으로 관찰되었으며, 조직 침연에 의해 더욱 용이하게 분산되었다(도 5B). 또한, 많은 다른 세포 및 기는 음와 및 음와-유사 구조 중에 산재되었다(도 5C). 일부 구조물은 ~250, ~500 또는 ~1000 세포를 함유한 전체 크기의 일반 음와로 성장되는 것으로 나타났다(사용되는 분산 기술은 대개 수백개 이하의 세포의 구조물에서 정확하게 세포를 계수하였다). 많은 세포군은 각각 정확하게 8, 16, 32, 64 및 128개의 세포의 "고리"로 보여졌다(도 5D). 보다 높은 배율의 시험에서는, 음와-유사 구조물 벽의 대부분의 세포가 정상 성인 결장 음와에서와 같이 구형 또는 타원형 핵을 지니며 타원형, 시가(cigar)-모양, 또는 탄환-모양 핵을 갖는 세포의 콜로니가 음와벽 틈에서 나타남이 밝혀졌다. 타원형 및 시가-모양 핵을 갖는 콜로니가 태아 소화관에서 관찰될 수 있으나, "탄환-모양" 핵 형태는 단지 샘종 및 샘암종에서 확인되었다(도 5E).
"탄환-모양" 핵 형태는 또한 먼저 드러나는 불규칙한 말단("bitten off")을 갖는 비대칭적 무사분열에 의해 벨-모양 핵으로부터 발생하는 것으로 나타났다. 탄환-모양 핵을 갖는 세포의 작은 콜로니가 관찰되며 통상적인 유사분열을 수행하는 세포를 함유한 이러한 콜로니는 복잡한 핵 형태학이 후말기를 통해 초기 전기로부터 유지된다는 흥미로운 사실을 나타내었다.
정상 성인 결장에서 드물지만 벨-모양 핵은 샘종에서 분명히 중요한 역할을 수행하였다. 이들은 많은 샘종 환경에서 나타났다. 몇몇은 도 5D에 나타낸 바와 같이 음와-유사 구조물 중의 공간들에서 한개 내지 10개 이상의 "벨"로서 발견되었다. 다른 일부는 한개의 벨 핵이 도 5C 및 5D와 같이 구형 또는 다른 형태의 2n-1 세포를 갖는 고리에서 항상 관찰되는 다세포 고리 구조물에서 단일 "벨"로서 발견되었다. 정상 결장 음와와 같이 분산 조건하에서 결합되는 전체 크기의 구조물 보다 작은 것에서 벨-모양 핵은 단일 벨로서 나타나며, 더욱 자주 한 쌍의 벨 또는 때때로 음와-유사 구조물 기부 컵내에서 4개 또는 8개의 벨로서 나타났다. 매우 큰 불규칙 음와-유사 구조물에서, 벨-모양 핵은 다른 핵 형태의 세포와 혼합된 변종 구조물의 벽에 해부학적으로 통합되었다. 이러한 보다 큰 불규칙 음와-유사 구조물이 각각 이의 형태를 갖는 다수의 상이한 종류의 클러스터의 모자이크인 것으로 나타났다.
샘종의 벨-모양 핵은 배아 중 다른 핵 형태 및 벨-모양 핵으로부터 다른 두드러진 방법과 상이하지만, 천개 이상의 벨-모양 핵은 개개 샘종에서 관찰되었으며 임의의 샘종 중 단일 벨-모양 핵은 태아 섹션에서 발견된 대칭 무사분열 형태에서 발견되지 않았다. 또한 농축핵으로서 기술될 수 있는 상태에서 벨-모양 핵이 스캔된 샘종 중에서 관찰되지 않는다는 것이 주목할 만하다. 모든 다른 형태학 형태의 핵은 전체 섹션을 스캔할 때 대략적으로 동일한 횟수(약 1-5/1000 전체 핵)로 유사분열 또는 농축핵에서 발견되었다. 작은 서브섹션은 유사분열 및 농축핵 계수와 관련하여 매우 다양하다. 본원에서 사용된 "농축핵"은 염색 세포를 지시하는 불규칙한 세균 덩어리에서 핵 분열 및 크로마틴 축합의 상태를 칭한다.
샘암종
샘암종이 매우 큰 질량을 지니며 많은 개개 섹션이 온화한 압력에 의한 분산을 방해하지만, 음와, 보다 큰 불규칙한 음와-유사 구조물 및 16, 32, 64 및 128 세포의 음와간 고리의 존재의 배합물은 필수적으로 매우 작은 샘종에서와 동일하다. 음와-유사 구조물 벽의 틈은 축합된 전기 염색체의 3차원 분포로 존재하는 동일한 핵 형태를 갖는 세포 콜로니와 결합되어 있다. 벨-모양 핵은 음와의 기저 컵에 단일항, 한 쌍 또는 보다 큰 수로 발견되었으며, 보다 큰 변종의 음와-유사 구조물 벽에 복잡한 나선부에 박혀있다. 도 6A 내지 6C는 일련의 샘암종에서 볼 수 있는 모든 통상적인 벨-모양 핵을 나타내고 있다. 샘암종에서의 핵 형태 세트는 샘종에서 나타낸 세트와 동일하게 나타났다. 특히, 태아 섹션 또는 성인 결장에서 관찰되지 않는 "탄환-모양" 핵 형태는 자주 관찰되었다.
샘종과 샘암종 간의 인식할 수 있는 차이는 음와-유사 구조물의 지향이 베이스와 함께 종양 표면과 관련하여 명확하게 무작위적으로 지향된 루멘 방향으로 일정치 않는 것이다. 또한 음와 및 불규칙한 음와-유사 구조물은 종양 내부에서 자주 발견되지 않으며, 이는 절충적인 것으로서 특징되지만 보다 작은 국소적으로 유기화된 구조물의 무질서한 수집으로서 특징되는 것은 아니다. 이러한 상이한 핵 형태를 갖는 상호분산된 세포의 콜로니가 공생 사회를 나타낼 수 있다.
샘암종이 샘종과 상이하다는 중요한 특징은 수백의 벨-모양 핵의 명확하게 유기화된 군을 종종 나타내며, 대부분은 종종 대칭적 무사분열을 포함한다(~1%). 낮은 배율에서 이들은 음와-유사 구조물 중의 공간에서 나타나며 거미줄 또는 엽맥 골격과 유사하다. 보다 높은 배율에서 얇은 "정맥"은 축으로부터 90°, 즉 숄더-투-숄더(shoulder-to-shoulder) 방향과 동일한 방향으로 지향된 이들의 "입"을 갖는 특이한 특징을 갖는 벨-모양 핵을 구비한 세포의 부분적으로 정렬된 가닥인 것으로 발견되었다(도 6C). 더욱이, "헤드-투-토우(head-to-toe)" 방향에서 벨-모양 핵을 덮지 않은 샘암종의 다중 섹션을 통한 스캐닝은 태아 소화관에서 관찰되지만 샘종에서는 관찰되지 않았다. 이러한 선형 정렬된 핵은 또한 태아에서 보여지는 튜브형 구조물(다핵세포질체)에 싸여져 있다. 벨-모양 핵을 갖는 특별한 농축핵 그림이 관찰되었지만 벨-모양 핵 중 대칭적 무사분열 보다 매우 낮은 빈도를 갖는다.
추가 확인 사항
간에서의 결장직장 종양의 전이는 외관상 샘암종과 구별할 수 없는 핵 형태형, 크립트(crypt) 및 크립트 유사 구조의 패턴을 재현한다. 성체 사람 간 부분의 스캔 부분으로부터, 성체 결장 크립트로부터 확인되었던 임시의 벨 형상 핵이 나타났다. 성체 마우스 결장의 스캔으로부터도 유사하게 성체 사람에서와 같이 크립트 기재의 벨 형상 핵을 지닌 세포가 확인되었다. 벨 형상 핵을 지닌 배양된 세포의 성장 및 연구를 위한 잠재적으로 중요하게 여겨지고 있는 관찰로부터, 낮은 빈도, 약 1/10,000 세포가, 줄기 유사 거동이 가정되며 대칭적이고 비대칭적인 세포 분열 운동학에 대해 연구된 바 있는 마우스 세포 배양물에서 동정되었다 [참조: Sherley, J. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 92: 136-140; Merok, J. et al., 2002, Cancer Res., 62: 6791-6795].
실시예 3
태아 결장의 후-배아 기질화 줄기 세포는 입 벌린, 벨 형상 핵 형태형(open-mouth, bell-shaped nuclear morphotype)에 의해 구체적으로 동정되었다. 이러한 독특한 핵에 대해, 일반적인 크로모좀 축합 없이 대칭적이고 비대칭적인 핵 분열 모두가 이루어진다. 핵 분열은 성체 유지 줄기 세포로의 최종 변형 전에 태아, 신생아 및 소아 생애 전체에 걸쳐 순 성장 및 분화를 유도한다. 이들 벨 형상 핵 형태형은 성체 결장 크립트에서는 거의 확인되지 않으나, 종양전구체 및 종양에서는 두드러지게 재출현하며, 결장 샘종, 샘암종 및 전이부에서의 순 성장 및 분화를 유도하는 것으로 보인다.
이러한 확인 사항을 과거의 연령 특이적인 결장직장 암 비율의 분석으로부터 유도된 추론 내용과 결합시키면, 현재의 일일 연령 특이적인 결장 샘종 유병율 및 사람 조직에서의 유전 변화의 직접적인 측정으로부터, 결장 및 아마도 기타 부위에서의 후기발병 암 발생에 대한 디폴트 가설이 제안된다: 종양 개시에 필요한 종양돌연변이는 이들의 독특한 DNA 생화학성 및 분리 방법 때문에 성체 유지 줄기 세포에서보다 소아 줄기 세포에서 현저히 더 높은 비율로 발생된다. 이러한 보다 더 높은 소아 돌연변이 비율은 종양 개시를 소아 기로 제한시키는 효과를 갖는다. 개시된 소아 줄기 세포는 폴립으로서 결장에서 종국적으로 확인된 소아 조직의 국소 패치를 계속하여 형성시키며, 이들 세포는 소아 세포로 인해 "돌연변이" 표현형을 유지한다. 종양전구체 콜로니의 느리지만 비유동적인 성장 동안의 부가적인 종양돌연변이 및/또는 국소적인 생화학적 조건은, 종양전구체인 소아 줄기 세포를, 치사 종양 물질을 급속하게 생성하는 태아 줄기 세포 표현형으로 전환시킨다.
기관형성
기관형성이 대칭적인 분열에서 자가 증폭에 의해 순 성장할 수 있으며 줄기 세포 및 대안적인 세포 형태를 야기하는 비대칭적인 분열에 의한 분화를 담당하는 줄기 세포의 선형 캐스캐이드에 의해 수행된다는 생각은, 일반적으로 진보적인 생물학자들에 의해 유지되고 있다. 이식 시에 살아있는 배아를 발생시킬 수 있는 주머니배의 초기 배아 줄기 세포로부터의 세포, 및 조혈 시스템을 재형성할 수 있는 동물의 골수 및 가능하게는 기타 기관으로부터 분리된 것과 같은 줄기 세포로부터의 세포의 다양한 형태 및 잠재력의 동일성 및 기능을 분화시키기 위해 시도가 이루어진 경우에 혼란이 야기된다. 성체 줄기 세포 또는 유지 줄기 세포는 결장과 같은 기관에서 전환되는 다수의 조직 요소의 재형성을 담당하도록 위치한다. 성체에서는 당업자라면 요구시에 조직 및 기관을 재형성할 수 있는 줄기 세포의 작은 저장소를 가정할 수 있다. 당업자는 또한 2차 변이 세포, 궁극적으로는 분화된 말단 세포까지로의 후속하는 이중 분열에 의해 소실되는 초기 변이 세포를 생성하는 간헐적인 비대칭적인 분열에 의해 클론성 전환 유닛을 형성하는 다양한 형태의 성체 유지 줄기 세포를 가정할 수 있다.
대칭적이며 비대칭적인 핵 분열 모두가 일어나는 것으로 보이는 용이하게 동정가능한 핵 형태를 함유하는 구조가 본원에 개시되어 있다. 이들 형태는, 5 내지 7주 태아에서의 사람 창자의 모든 핵의 30%를 포함하나, 성체 결장 크립트의 1% 미만에서는 기저 정점에서 확인되는 벨 형상 핵 형태형에 의해 동정된다.
암발생
암발생이 대칭적인 분열에서의 자가 증식에 의한 순 성장할 수 있으며 비대칭적인 분열에 의한 분화를 담당하여 샘암종에서 확인되는 이질성을 형성하는 줄기 세포의 선형 캐스캐이드에 의해 수행된다는 생각은, 그다지 폭넓게 지지되고 있지는 않다. 초기 배아발생에서 발현되는 것과 같은 유전자의 외관상 무작위적인 발현에 의해 수반된 "세포 조절 손실"로서 암발생이 일어난다는 착상은 상당히 널리 보급되어 있다. 그러나, 혈내백혈구형성에서 기관 기관 복원 줄기 세포의 물리적 존재를 입증하는 것과 유사한 희석 및 이식 시험은, 다양한 세포 유형을 함유하는 성장중인 종양을 발생시키는 능력을 지닌 매우 작은 분획의 종양 세포의 존재를 확립하였다. 종양 줄기 세포 존재의 이러한 실제적인 증명은, 매우 변질된 상태이며 기관형성과 같이 암이 정상 줄기 세포로부터 종양 줄기 세포로의 경로를 형성하는 구체적인 변화의 발현이라는 가능성을 탐구하는 암에 대한 그러한 생각을 반영하고 있어야 한다. 이러한 맥락의 사상과 관련되는 것이, 결장 폴립 (샘종, 종양전구체 병변) 및 종양 (샘암종, 종양) 모두에서의 결장 배아형성 및 후속하는 전이부에서 확인되는 것과 동일한 벨 형상 핵의 발견이다. 이러한 핵 형태의 예비적인 열거 및 대칭적인 핵 분열의 빈도에 의해, 종양전구체의 예상되는 낮은 분열 속도와 종양의 신속한 분열을 비교할 수 있게 된다.
연령 특이적인 암 비율에 대한 줄기 세포 생물학의 관련성
개시된 줄기 세포가 근접한 소아 비율로 성장하여 종양전구체 콜로니 (샘종, 폴립)를 형성하고,이로부터 근접한 태아 비율로 성장하여 치사 종양을 형성하는 종양 줄기 세포가 나타난다는 가설을 추론하는 것은 합리적이다. 종양이 태아 표현형의 재발현이라는 가설은 본 발명자들에 의해 최초로 제시된 것이 아니며, 이는 콘하임(Cohnheim)과 같은 19세기 중반의 병리학자에 의해 제시된 것이다 [참조: 1875, Virchows Arch., 65: 64; 1877-1880, Vorelesungen uber allgemeine Pathologie. Ein Handbuch fur Artzte und Studierende. Berin, Hirchswald 1-2 691S]. 사람 결장에서의 종양전구체, 샘종 또는 폴립이 소아 결장 표현형의 단순한 연장선 상에 있다는 가설이 제시된다.
종양전구체의 성장율에 대한 데이터 및 유도된 추론은 연령의 함수로서 유아체중의 성장율에 대한 예기치 않은 발견에 의해 논의되었다: 남자 및 여자 소아는, 여자 소아에게서는 약 1.5살에서 14.5살로의 그리고 남자 소아에게서는 약 1.5살에서 약 16.5살로의 약 6년의 이중배가(doubling) 시간을 지니면서 평균 질량이 기하급수적으로 증가한다. 이러한 연령 간격 동안의 성장율은 남자에 대해서는 0.158이며, 여자에 대해서는 0.167이다. 결장의 성장율을 성장중인 구체 내부의 실린더 표면적을 모델링하는 데 필요한 체 질량의 성장율과 관련시키면, 상기 질량2/3 만큼 증가하였거나, 이 경우에는 결장 종양전구체의 성장율에 대해 추정된 성장율과 동일한 값인 약 0.162/3 = 약 0.11 만큼 증가할 것이다.
결장의 종양전구체 병변의 추정된 성장율이 대략 소아 결장의 추정된 성장율 과 동일하기 때문에, 종양전구체가 일부 방식으로 소아 성장 조건을 재형성시킨다는 가설이 제시되었다 [참조: Herrero-Jimenez et al., 2000]. 소아 줄기 세포의 순 성장이 소아 조직 성장을 위해 필요할 것으로 추정되기 때문에, 기관화된 결장의 다수의 과거특성을 함유하는 샘종이 사실상 비성장중인 성체 크립트의 배경에서 소아 조직 확장 패치와 동등할 것이라는 생각이 비롯되었다. 이러한 가설은 개시 연령을 최대 체 질량을 갖는 연령으로 제한하고, 개시 과정이 소아 시기에 한정되는 경우에 연령 특이적인 결장직장 암 비율과 조화되는 파라미터 세트를 진정으로 도출할 수 있는 것으로 확인된 평가 방법에 의해 시험되었다. 개시가 5살 이하의 연령으로 제한되는 경우에 암 비율 데이터와 일치되는 진정한 파라미터가 도출될 수 있다. 그러한 계산법은, 소아 시기 이내로 개시 시기를 제한하는 가설이 연령 특이적인 암 비율 데이터와 일치됨을 증명하긴 하지만, 가설의 타당성을 증명하는 것은 아니다.
샘종의 연령 특이적인 검출
이러한 이론적 개념은, 종양 개시가 소아 시기에 의해 경계지어진다는 가설과 직접 관련되는 것으로 보이는 중요한 셋트의 임상 관찰 사항이 아니라면, 시험불가능한 가설 영역에 남아있을 것이다. 최적 연령을 정의하도록 고안된 연구, 및 종양 결장 샘종을 잠재적으로 검출하고 제거하는 다수의 직장경 검사에서, 유연한 구불결장경에 의해 검출가능한 샘종을 지닌 사람의 분획은 대략 60세의 연령에서 최대 안정점에 도달하는 것으로 확인되었다. 일치되는 높은 샘종 검출율을 갖는, 직장경 시술자에 의해 확인된 관찰 사항을 분석하였더니, 남자의 약 15% 및 여자의 약 10%가 평균 둘 이상의 샘종을 지니고 있었다. 이러한 임상 데이터로부터, 하기 사항이 마땅히 추론될 수 있다: 첫째, 서서히 성장하는 종양전구체 샘종은 60세보다 훨씬 더 이른, 생애에서의 이들의 기원을 지녀야 한다 (성장율이 0.11이면, 제 1세에서 개시된 조직 줄기 세포는 63세까지 단지 27 = 128 종양전구체 줄기 세포로만 증가될 것이다. 그러한 샘종에서 총 세포 수는 총 백만개의 세포 정도로 훨씬 더 클 것이다); 둘째, 폴립을 지닌 남성 분획, 약 15%와, 결장 암의 평생 위험을 지닌 남성의 추정된 최소 분획 (1890 코호트), 18 내지 20% 사이에서의 유사성으로부터, 60세에 샘종을 지닌 개인과 평생 위험을 지닌 개인이 동일할 수 있음이 제안된다 (이러한 추론이 추가 분석에서 확인된다면 이는 하기한 두 가지 이유에서 중요할 것이다: (a) 결장에서의 종양전구체 병변이 종양 병변으로 최종 변형되는 데 있어서 유전적인 위험 요소에 대한 임의의 역할이 제거될 것이며, (b) 결장직장암을 공유한 위험 요소로 인한 사망율 형태를 완성하는 데 대한 임의의 중요한 역할이 제거될 것이다); 셋째, 폴립을 지닌 개인에게서 평균 둘 이상의 폴립이 나타났다는 것은, 남성 집단이, 종양 개시 및 종양전구체의 성장이 일어난 일부 20%의 서브집단, 및 종양 개시 및/또는 종양전구체 성장이 일어나지 않은 일부 80%의 개별의 구분되는 서브집단으로 구성됨을 의미한다; 넷째, 남자 및 여자에서 종양전구체의 성장율 계산으로부터 동일한 결과가 얻어지는 한에 있어서는, 폴립을 지닌 60세에 대한 폴립을 지닌 개인의 남자/여자 비율, 및 폴립의 평균 수/폴립이 있는 개인에서의 성 차이에 의해, 암 발병율에 있어서의 성 차이는 전적으로 소아 또는 소아기 이전 시기에 개시됨으로써 형성된 개시된 결장 줄기 세포의 수에 기인할 수 있다는 가설이 지지된다 (예를 들어, 종양돌연변이 비율이 남자 및 여자에게서 동일한 경우, 소아 시기에 형성된 예상된 종양전구체 콜로니의 비율은 단순히 여자에게서는 대략 14.5년 및 남자에게서는 16.5년에 성숙할 때까지의 경험된 줄기 세포 년수의 비일 것이다.
조직병리학
20세기 전반에 걸쳐서, 분자, 생화학적 및 조직병리학적 분석 방법이 종양 및 배아의 유사하나 독립적인 연구에 적용되어 왔다. 얻어진 풍부하고 광범위한 데이터로부터, 사람의 성장 및 발달과 관련한 다수의 정상적인 개체발생 특성은 비정상적인 병리학적 성장, 즉 암과 같이 생애에서 훨씬 뒤에 재발함이 밝혀졌다. 21세기 초기에 과학자들은, 배아 및 종양 사이에서의 유사성(이들 양자 모두, 기원에 있어서는 단클론성이며, 또한 세포 집단에서 뚜렷한 이질성을 나타내고 있음)이 단일 관점으로부터 설명될 수 있다는 가설, 즉 줄기 세포와 같은 매우 특이적인 세포가 전체 배아, 기관, 및 배아 및 더 큰 종양의 조직을 야기할 수 있다는 가설을 제안하고 있다.
표 1은, 사람의 이른 발달에서의 줄기 세포 집단을 나타낸다. 2주의 임신 주수 (주머니배 및 창자배 형성 단계)와 5 내지 12주의 임신 주수 (기관형성 단계) 사이에는, 이른 태아 발달의 각각의 특정 단계에 상응하게 하는 줄기 세포의 캐스캐이드가 존재한다.
표 1
개체발생
표 1: 개체발생을 통해 그리고 암 줄기 세포가 되는 줄기 세포의 "블록킹" 및 "역전" 돌연변이 유발을 통해 야기되는 줄기 세포의 계급
개체발생적으로 상이한 줄기 세포 중에서의 식별은 사람 태아 및 성체 조직의 개시된 세포유전학적 평가로부터 중요시되었다.
이식전 배아에서의 어느 것에도 위임되지 않는 세포인 배아덩이위판(epiblast)의 배아 줄기 세포는 유사분열에 의해 분할되고, 이들 핵의 형태는 단순한 구체이다. 이들은 세포의 유지가능한 극성 또는 핵에 대한 어떠한 증거도 지니고 있지 않다. 체제가 정교해지고 기관형성되는 단계에서, 세포는, 사람의 양측 대칭적인 신체를 형성시키는 세포 및 세포 층의, 내부 기관의 체강 내로의 개략적인 위치로의 공간적으로 "지시된" 이동을 개시하는 데 필수적인 것으로 여겨지는 극성을 획득한다.
소화계의 거의 대부분이 발생되게 될 창자의 기관형성의 중간 단계 (5 내지 7주)는, 단지 구형이 아니나 다양한 핵 형태형을 갖는 핵을 포함하는 세포를 포함한다. 이들 세포 일부의 핵은 별개의 극성을 지니며, 유사분열에 의해서가 아니라 "컵으로부터의 컵 (cup-from-cup)" 핵 분열과 더욱 관련된 과정에 의해 분열된다 (도 8). 이러한 상세한 확인 사항으로부터, 기관형성 줄기 세포가 배아의 할구에서 확인된 것과는 매우 상이할 수 있다는 결론이 도출되었다.
유아 및 이후의 소아의 출생이후 성장에 있어서, 상피 조직은, 양 특성이 성체의 전 생애에 걸쳐서 유지된 기관 특이적인 크기에 도달할 때까지, 줄기 세포의 증식에 의해 계속적으로 성장하여 기관 당 전환 유닛의 수, 및 전환 유닛 당 세포의 수를 증가시킨다. 이를 위해, 소아에서의 기관 성장 및 기능을 모방하는 줄기 세포는 태아 성장 및 발달의 줄기 세포로부터 소아 줄기 세포로서 구별되어야 한다. 배아, 태아 및 성체 줄기 세포는 이들 능력이 상이하다: 배아 줄기 세포는 다양한 세포 계통을 조합시킴으로써 전체 기관 또는 조직을 형성시킬 수 있는 (전분화능) 한편, 성체 줄기 세포는 단지 전환 유닛의 "조직-위임된(tissue-commited)" 특이적인 세포를 발생시킬 수 있다 (다중분화능).
암 줄기 세포의 분화 단계와 종양 유형 사이의 관련성에 관한 셀의 가설이 정확하다면, 이의 "성체", "소아", "태아" 또는 "배아" 형태의 단일 줄기 세포를 동정하는 능력은 암의 정량적이고 정성적인 특성을 분석하는 데 있어서 현저한 돌파점이 될 것이다 [참조: Sell, S., 2004, Crit. Rev. Oncol. Hematol., 51:1-1:28]. 시험 튜브 내의 동일한 유형의 줄기 세포의 순수한 집단을 동정하고 수집하기 위한 기술적 도구는 분명히 유용하다.
태아 창자를 발달시키는 세포 내의 핵은 중공 상태의 벨 (도 8: a, b)로서 기관화될 수 있다. 그러한 핵을 지닌 세포는 태아 창자 내에서 약 30%로 존재할 뿐만 아니라, 상기 세포는 창자 조직에서 매우 독특한 배열 패턴을 지닌다: 핵은 "벨 위의 벨" 형태로서 한 방향으로 배향된다. 이들은 또한 관형 융합체(syncytia)와 유사한 구조로 둘러싸여 있다. 성체 결장 상피의 정상적인 크립트에서, 벨 형상 핵을 지닌 세포는 드물게 존재하며, 만약 이들이 존재하는 경우라면 이들의 수는 크립당 1개 이하이다. 동일한 벨 형상의 핵을 지닌 세포가 샘종에서는 더 많은 수로 모든 크립트에서는 정상적인 것 또는 비정상적인 것으로 나타난 이후 (도 8: g, h), 샘암종의 비정상적인 크립트 및 종양 물질에서 높은 빈도로 재출현한다 [표 1 참조].
벨 형상의 핵을 지닌 세포는 태아에서는 다수로 확인되며, 종양이 없는 정상의 성체의 결장에서는 드물며, 몇몇 ㎣의 샘종에서는 소수 (1000 미만)로, 그리고 다수의 ㎤의 샘암종에서는 다수 (1,000,000 초과)로 존재한다.
이들 세포가 줄기 세포일 수 있다는 논의는 또 다른 비범한 벨 형상의 핵 분열의 관찰에 의해 지지되었다. 관형 융합체 내에서, 벨 형상의 핵은, 마치 모형 대상물의 제록스 복제물과 같이, 놀랍게도 동일한 이들 자신의 3D 복제물을 형성시 켰다. 유사분열 크로모좀을 형성시키는 핵 축합 및 전형적인 유사분열 장치의 부재로 인한, 본원에서 "핵 분열"로 지칭되는 벨 형상 핵의 필연적인 분리 (2개의 종이 컵의 분리로서)의 모든 단계가 검출되었다 (도 8: d). 이러한 발견은, 항상 일방향으로의 (벨의 입 밖으로의), 벨 형상 핵으로부터 나타나듯이 발달중인 사람 창자 (도 8: e, i)에서 이미 확인된 모두 7개의 핵 형태형의 확인에 의해 후속되었다. 다양한 핵 형태형을 지닌 세포는 표현형이 상이하며, 당업자라면 유전자 발현에서의 차이점, 및 다양한 핵 형태형을 지닌 세포 사이에서의 단백질 합성 프로파일의 검출을 예상할 수 있다.
배아 할구의 세포는 중공 벨로서 형상화된 핵을 함유하지 않으며; 이들은 구형 핵을 지니며 이들은 "배아 줄기 세포"이다. 동시에, 중공 벨 형상의 핵은 임신 약 5주에서와 같이 이른 시기에 이미 확인된다. 벨 형상 핵을 지닌 세포가 다량으로 재출현하는 태아 창자 발달 이후의 사람 생애에서의 후속 단계는 성체 결장의 병리학적 상태, 즉 결장 샘종이다. 핵 형태형의 뚜렷한 다양성은 또한 결장 종양에서도 확인될 수 있으며, 이는 태아 결장에서의 다양성과 매우 유사하다. 세포 및 핵 형태형의 다양성은 종양에서의 세포 "이질성"을 또 다르게 반영하는 것이다. 종양은 또한 미성숙 세포를 함유함으로써 조직병리학자들에 의해서 특성화된다. 다양한 종양 발달 단계에서, 종양전구체에서의 단일 소아 줄기 세포 및 종양에서의 단일 태아 줄기 세포는 미성숙 세포의 다양한 분획을 지니나 양자의 이중 표현형에 기여할 수 있다 (표 2).
표 2: 결장의 조직병리학적 견본에서 확인된 배아형성 및 암발생에 있어서의 줄기 세포 및 이들의 품질
실시예 4
핵 구조, DNA 함량 및 세포의 벨 형상 핵 및 융합체에서의 크로모좀의 공간 분포를 정량적인 이미지 세포계 및/또는 동일초점 현미경에 의해 특성화하는 방법이 본원에 기술되어 있다. 상기 방법은, 형태, 종양 유형 (결장 대 췌장) 및 종양 내 니치(nitches)를 달리하는 벨 형상 핵 중에서 달라지는 DNA 함량 및/또는 크로 모좀 분포를 발견하게 해준다. 이들은 또한, 대칭적이며 다수 형태의 비대칭적인 핵 분열 동안에 밸 형상 핵에서의 유사분열과 관련된 단백질의 DNA 합성 과정 및 존재를 특성화할 수 있게 해준다.
본원에는 또한, 벨 형상 핵을 지닌 세포 및 융합체를 균일 샘플로서 분리시키는 데 있어서 유용한 방법이 기술되어 있다. 그러한 방법에는, 대사물질 및 거대분자를 분석하는 데 적용될 수 있는 핵 형태와 동질인 세포의 샘플을 형성하기 위해 "캐터펄트(catapult)" 압력 활성화된 레이저 미세 절제술을 사용하는 것이 포함된다. 단일 세포를 분리시키는 방법은, 비고정된 종양 제조물에서 핵 형태를 인지하는 수단을 확인하게 하여, 벨 형상 핵을 지닌 살아있는 세포 및 융합체의 동질 제조물이 생체외적으로 연구될 수 있도록 해준다. 그런 다음, 살아있는 벨 형상 핵 또는 이들을 함유하는 세포는 이들의 독특한 DNA 합성 및 분리 메커니즘을 더 잘 이해하도록 연구될 수 있고, 암 치료에서 이들 과정을 방해하는 수단을 제안할 수 있다.
본원에는, 벨 형상 핵이 어떻게 공간적으로 기관화되는 지, 염색질이 어떻게 핵 내에 분산되는 지, 특정 크로모좀이 핵 층의 내부 전반에 걸친 특정 영역을 점유하는 지 아닌지에 대한 탐구가 더욱 구체적인 치료 목표를 제안하며, 핵 형태형 (형상) 및 유전자 발현 사이의 관련성에 대한 추가 이해가 제공될 수 있음이 기술되어 있다. 그러한 탐구는 현존하는 면역세포화학, 분자 생물학 및 관련되는 과학적인 방법에 의해 수행될 수 있다.
개별의 폐쇄된 핵 형태의 어레이가, 벨 형상 핵으로부터의 비대칭적인 핵 분 열로부터 최초로 발생되는 것으로 보이나 후속하여 유사분열에 의해 분할되어 아포토시스에 의해 치사되는 태아 뒷창자, 결장 샘종 및 샘암종에서 확인되었다. 성체 조직에서는 나타나지 않는 태아 및 종양에서의 공유된 셋트의 핵 형태는 종양이 성체 기관에서 "배아" 성장한다는 19세기의 가설을 지지한다 [도 9 참조]. 이미지 분석 및 레이저 보조된 미세 절단에 기초하여 컴퓨터를 사용하여 결합된 이러한 발견에 의해 특이적인 핵 형상을 지닌 다수의 세포를 인식하고 수집할 수 있게 되었다. 벨 형상 핵 뿐만 아니라 종양에 비해 독특한 다른 핵 형태형을 지닌 세포에서의 분자 및 생화학적 성분의 어레이의 특성화는, 종래에는 예상치 못했던 셋트의 잠재적인 치료 목적을 제공해야 한다.
종양발생은 줄기 세포 셋트의 확장을 통하여 수직 계통에 의해 진행되는 것으로 보인다. 사람 종양으로부터의 단지 소형 분획의 세포만이, 면역억제시킨 설치류에서 이종이식으로서 새로운 종양을 형성시키는 능력을 지니고 있다. 희석 이종이식 실험을 억제시킴으로써, 잠정적인 종양발생 세포가 이들이 추가 줄기 세포를 함유하는 새로운 종양을 발생시킬 수 있을 뿐만 아니라 최초 종양에 존재하는 표현형 측면에서 혼합된 세포 집단을 재생시킬 수 있다는 점에서 줄기 세포와 유사한 특징을 나타내었음이 확인되었다 [참조: Singh, S. et al., 2004. Oncogene, 23: 7267-7273; Clarke, M., 2005. Biol. Blood Marrow Transplant., 11: 14-26].
후기 발병 암의 거의 모든 형태는 종양전구체의 확장된 시기를 통과하며, 상기한 종양전구체 콜로니는 배엽 DNA로부터의 둘 이상의 드문 유전 돌연변이로부터 야기되는 단클론성이다. 21세기 초까지, 이식/희석 실험을 위해 줄기 세포를 지닌 종양 세포 집단을 강화시키려는 직접적인 노력이 실시되었고, 이로부터 조직 줄기 세포는 종양전구체의 기원을 갖는 유사한 세포이며 종양 자체가 줄기 세포를 함유하고 있음이 입증되었다 [참조: Pardal, R. et al., 2003. Nature Rev., 3: 895-902]. 종양이 사실상 꽤 잘 정립된 이종 태아 구조라는 가설의 현대적인 재진술이 고찰되고 확장되었다 [참조: Sell, S., 2004. Crit. Rev. Oncol. Hematol., 51: 1-28]. "암배아" 줄기 세포는 그 수가 증가할 것이며 종양 물질 내에서 매우 이종인 니치를 형성하는 분화된 세포 유형을 야기할 것으로 예측될 것이다.
줄기 세포 분야의 전반에 걸쳐 사용된 다양한 항원성 마커는 조직 또는 종양을 종종 높은 정도로 재생시킬 수 있는 세포를 강화시키는 데 사용되어 왔으나, 이들 강화된 집단 내에 있는 어떠한 세포도, 이들을 줄기 세포로서 마아킹하는 임의의 현미경적인 형태 세포 특성을 나타내지 않았다. 종양이 정말로 단일 줄기 세포로부터 발생되는 것이 사실이라면, 이들을 동정하여, 분자 및 생화학적 분석물을 분석하기에 충분한 줄기 세포의 동종 집단으로서 수거하기 위한 수단이 필요하다.
상기 목표를 달성하기 위한 하나의 방법으로는, 거대분자 정렬 분석을 위해 필요하며 종양 줄기 세포를 동정하는 미세과거 특성에 대해 동종인 수백만의 세포를 선택하고 수집하는 레이저 미세 절단 기술 (LCM: laser capture microdissection)이 있다. 대안적으로, 종양의 줄기 세포 관련된 표면 마커를 이용하여 분산된 세포는 유 세포분석기(flow cytometry)에 의해 그리고 이종 세포 집단으로부터의 세포 분류에 의해 강화되었다 [참조: Morrison, S. et al., 1999. Cell, 96: 737-749; Suzuki, A. et al., 2004. Diabetes, 53: 2143-2152].
현존하는 암 치료 방법의 주요 목표는 세포 주기를 변이시키는 세포에 대한 것이다 [참조: Gomez-Vidal, J. et al., 2004. Curr. Top. Med. Chem., 4: 175-202; Fischer, P. and Gianella-Borradori, A., 2005. Expert Opin. Investig. Drugs, 14: 457-477]. 분열되어 프로그래밍된 세포 치사에 의해 소실된 말단 세포의 소실량을 대체하는 변이 세포를 제공하는 성체 유지 줄기 세포와 종양 줄기 세포 사이에서 전이되는 세포 간에는 구분이 어렵다. 치료법은, 모체를 죽이지 않고 모든 종양 줄기 세포를 죽이는 좁은 범위의 치료 계획에 촛점을 맞추고 있으나, 성체 유지 줄기 세포는 순 세포 성장율이 제로인 특성을 가지나, 종양 줄기 세포는 태아 줄기 세포와 같이 급속한 순 세포 성장과 관련된 정의에 의한 것임이 논리적으로 예측될 것이다. 성체 유지 줄기 세포 분열은 본질적으로 비대칭이어서, 이로부터 새로운 유지 줄기 세포 및 제 1 분화된 변이 세포가 발생될 것으로 보인다. 종양 줄기 세포는 순 종양 성장을 지지하는 연속적인 대칭 핵 분열을 요할 것이다. 이러한 요구사항은, 세포증식 억제성 또는 세포파괴성 치료법에 대한 구체적인 목표가 동정된 종양에서의 대칭적인 "컵으로부터의 컵" 핵 분열을 수행하는 벨 형상 핵의 발견에 의해 해소된다.
이를 지지하는 하나의 차용되는 이론은, 종양이 혈관형성을 방해함으로써 기절될 수 있다는 이론이다 [참조: Folkman, J. and Ingber, D., 1992. Sem. Cancer Biol., 3: 88-96]. 저산소증을 유발시키면 종양 줄기 세포에 관한 한 초기 배아형성 조건을 재현할 수 있으며, 이는 항-혈관형성 방법을 경감시키기는 하나 이를 치유하지는 않는 수준의 효과를 설명할 수 있다. 종양에서의 분화를 블록킹하면 바 람직하지 않은 결과를 지니는 정상 조직에서의 분화를 블로킹할 수 있다. 현재의 암 치료법은 줄기 세포가 단시간 내에 종양을 재형성할 수 있기 때문에 단지 최소한으로만 효과적이라는 이해는, 성체 유지 줄기 세포와는 반대되는 종양 줄기 세포에 대해 독특한 분자 및 생화학적 특성을 연구하기 위한 매우 효력있는 자극제가 된다. 종양 줄기 세포의 그러한 분자 및/또는 생화학적 특성은 암 치료에서의 목표로서 작용한다.
그러한 이론을 시험하고 종양 줄기 세포 및 기타 종양 세포 유형을 특성화 (분자 및 생화학적 특징면에서)하는 데 있어서 핵심적인 특징은, 이들을, 정량적인 화학적 및 생화학적 분석을 수행하기에 충분한 수 및 순도로 분리시키는 것이다. 그러한 세포 분리물을 얻기 위해 다수의 수단의 사용될 수 있다. 예를 들어, 레이저 미세 절단 기술은 당업계에 공지된 방법으로서, 이 방법에 의해 당업자가 결장 및 췌장 종양의 미분화된 니치로부터 10,000개의 벨 형상 핵의 배치를 수작업으로 선택하고 미세절단할 수 있게 된다. 수용되는 바이알 내로 "포획된" 세포는 현미경 슬라이드 상에 펴발라지며, 형태를 기초로 "벨 형상", "벨 형상이 아님", 또는 "그 중간 수준"으로서 평가된다. 합리적인 수준 ("벨"로서 평가된 분리된 핵의 75% 초과)으로 강화가 이루어지면, 추가 분석을 위해 mRNA, 단백질 등을 보존하기 위해 절차를 달리한다.
살아있는 결장 상피 세포를 분리하는 현재의 프로토콜은, 구조 및 기능적 특성을 보존하는 새포 배양물에 있어서의 연속적인 확인을 위해 구성되었다 [참조: Stich, M. et al., 2003, Pathol. Res. Pract., 199: 405-409; Micke, P. et al., 2004. J. Pathol., 202: 130-138]. 벨 형상 핵을 지닌 분리된 세포 또는 융합체를, 초기 배아 및 비혈관화된 종양 니치에서 예측된 산소 수준과 유사한 산소 농도로 변화하는 완속 교반형 마이크로캐리어 플라스크 내에 위치시킬 수 있다. 글루타민이 공급되어 있고 "표준" 세포 배양 매질 제형보다는 글루코스 농도가 더 낮은 배지를 또한, 이들을 조절된 실험실 조건 하에서 연구할 수 있도록, 상기한 벨 형상 핵을 지닌 세포 및 융합체의 성장을 자극하는 데 사용한다. 이러한 방법을 적용하면, 핵 형태, 분열 방법, 및/또는 특수한 형태의 다세포 응집물 또는 융합체의 존재에 대한 동종 세포 제조물을 생성시키는 것으로 합리적으로 예측된다. 이들 세포는 또한 이들이 세포 또는 조직 배양물에서 증폭되고 연구될 수 있도록 하는 방식으로 분리될 수도 있다.
본 발명을 이의 바람직한 구체예를 참조로 하여 상세히 예시하고 기술하였으나, 첨부된 특허청구범위에 의해 포함된 본 발명의 범주를 이탈하지 않고 형태 및 세부사항에 있어서의 다양한 변화가 이루어질 수 있음이 당업자에게는 이해될 것이다.
Claims (59)
- a) 50 미크론 이하의 최대 직경을 지니는 핵에서 핵 구조의 완전성을 보존하는 방법에 의해 제조된 조직 샘플의 전체에 걸쳐 분포된 세포 핵을 가시화하는 단계; 및b) 하나 이상의 벨-형상 핵을 포함하고 발달 단계 또는 병리학(pathology) 단계와 관련된 핵 형태의 부류 또는 부류들의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하여, 핵 형태의 특정 부류 또는 부류들의 존재 또는 부재에 근거하여 조직 샘플의 특징을 나타냄으로써 조직 샘플의 발달 단계 또는 병리학 단계의 특징을 나타내는 방법.
- 제 1항에 있어서, 조직 샘플이 외과적 절제에 의해 수득됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 조직 샘플이 물리적 또는 화학적으로 고정됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 3항에 있어서, 조직 샘플이 동결됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 3항에 있어서, 조직 샘플을 알코올, 알데히드, 유기산 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 화학적 고정제로 처리함을 특징으로 하 는 방법.
- 제 5항에 있어서, 고정제가 메탄올 및 아세트산을 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 3항에 있어서, 조직 샘플이 핵의 세포 분해 이전에 고정됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 조직 샘플의 세포가 조직 물렁화(maceration) 및 스프레딩(spreading)에 의해 부분적으로 분리됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 조직 샘플의 세포 또는 거대분자를 염색하여 핵이 가시화되게 함을 특징으로 하는 방법.
- 제 9항에 있어서, DNA를 염색하여 핵이 가시화되게 함을 특징으로 하는 방법.
- 제 2항에 있어서, 조직 샘플이 외과적 제거한 지 30분 이내에 고정됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 조직 샘플이 다세포 동물로부터 수득됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 12항에 있어서, 다세포 동물이 척추동물임을 특징으로 하는 방법.
- 제 13항에 있어서, 척추동물이 포유동물임을 특징으로 하는 방법.
- 제 14항에 있어서, 포유동물이 영장류, 설치류, 개, 고양이, 돼지, 양, 소 및 토끼로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 14항에 있어서, 포유동물이 사람임을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 발달 단계가 배아, 태아, 신생아, 소아 및 성체 발달 단계로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 특정 부류 또는 부류들의 핵 형태의 존재가 정상, 전암(preneoplastic), 신생물(neoplastic) 및 전이로 구성된 군으로부터 선택된 조직 샘플을 나타냄을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 핵 형태의 부류 또는 부류들이 시가-형상, 응축된 구상, 구상, 달걀형, 소세지-형상, 신장-형상 또는 탄알-형상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서,(c) 조직 샘플내에서 핵 형태의 하나 이상의 부류의 공간적 또는 수적 분포를 결정하는 것을 추가로 포함하며, 이 때 핵 형태의 하나 이상의 부류의 공간적 또는 수적 분포가 조직 샘플의 특징을 추가로 나타냄을 특징으로 하는 방법.
- 제 20항에 있어서, 특정 공간적 또는 수적 분포가 정상, 전암, 신생물 또는 전이 조직을 나타냄을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 핵이 다핵 융합체 또는 단핵 세포에 함유됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 22항에 있어서, 벨-형상, 시가-형상 또는 탄알-형상 핵의 존재가 전암, 신생물 또는 전이를 나타냄을 특징으로 하는 방법.
- 제 22항에 있어서, 다핵 융합체의 출현이 신생물 또는 전이를 나타냄을 특징으로 하는 방법.
- 제 23항에 있어서, 무사분열의 대칭적인 핵 분열을 나타내는 구조가 신생물 또는 전이를 나타냄을 특징으로 하는 방법.
- 제 22항에 있어서, 벨-형상 핵의 존재, 무사분열의 대칭적인 핵 분열의 부재 및 다핵 융합체의 부재가 전암을 나타냄을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 혈관벽 조직의 벨-형상 핵의 존재가 죽상경화증 초기 상태를 나타냄을 특징으로 하는 방법.
- 관심있는 세포 또는 관심있는 다핵 융합체를 동정하는 방법으로서, 세포 또는 융합체가 세포 배양액 또는 조직 샘플로부터 수득되거나 여기에 함유되어 있고, 관심있는 세포 또는 관심있는 융합체가 핵 형태를 가시화함에 의해 동정되며, 세포 또는 관심있는 융합체가 하나 이상의 벨-형상 핵을 포함하는 이형 핵 형태를 포함하는, 관심있는 세포 또는 관심있는 다핵 융합체를 동정하는 방법.
- 제 28항에 있어서, 세포 또는 다핵 융합체가 조직 샘플로부터 단리됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 29항에 있어서, 세포 또는 다핵 융합체가 압력-보조된 레이져 미세절개에 의해 단리됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 28항에 있어서, 세포 또는 다핵 융합체가 배양액 중 세포의 개체에서 동정됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 28항에 있어서, 세포 또는 다핵 융합체가 조직 샘플에서 동정됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 28항에 있어서, 세포 또는 융합체가 하나 이상의 무사분열 핵 분열 복합체를 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 28항에 있어서, 세포가 세포의 다세포 응집체내에 존재함을 특징으로 하는 방법.
- 제 28항에 있어서, 세포가 다세포 응집체의 클러스터내에 존재함을 특징으로 하는 방법.
- 제 28항에 있어서, 세포 배양액 또는 조직 샘플이 벨-형상, 시가-형상, 응축된 구상, 구상, 달걀형, 소세지-형상, 신장-형상 및 탄알-형상으로 구성된 군으로부터 선택된 이형 핵 형태들을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- a) 하나 이상의 후보 작용제로 종양을 지닌 사람을 제외한 포유동물을 치료하는 단계;b) 사람을 제외한 포유동물로부터 수득한 종양 샘플내에 함유된 세포의 핵 형태를 결정하는 단계; 및c) 후보 항-종양원성 작용제로 치료된 사람을 제외한 포유동물로부터의 세포의 핵 형태를 후보 항-종양원성 작용제로 치료되지 않은 종양을 지닌 사람을 제외한 포유동물로부터 수득한 세포와 비교하는 단계를 포함하며, 이 때 하나 이상의 벨-형상 핵을 포함하는 신생물 핵 형태를 포함하는 세포의 제거가 작용제의 항-종양원성 작용제로서의 유효성을 나타내는, 하나 이상의 항-종양원성 작용제를 동정하는 방법.
- 제 37항에 있어서, 신생물 핵 형태가 시가-형상의 핵 및 탄알-형상의 핵을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 38항에 있어서, 핵 형태의 변경이 벨-형상 핵의 제거를 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 37항에 있어서, 포유동물이 설치류임을 특징으로 하는 방법.
- 제 40항에 있어서, 설치류가 래트 또는 마우스임을 특징으로 하는 방법.
- 제 37항에 있어서, 핵이 융합체에 배열되고, 신생물 핵 형태의 제거가 융합체의 붕괴를 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 배양된 종양 조직 또는 세포 샘플을 하나 이상의 후보 작용제로 처리하고, 샘플에 함유된 세포의 핵 형태를 평가하는 것을 포함하며, 이 때 세포가 하나 이상의 벨-형상 핵을 포함하는 이형 핵 형태를 포함하고, 항-종양원성 작용제의 부재시, 배양된 종양 세포가 이들의 이형 핵 형태를 유지하며, 벨-형상 핵을 포함하는 신생물 핵 형태의 제거가 작용제의 항-종양원성 작용제로서의 유효성을 나타내고, 벨-형상 핵을 포함하는 전암 핵 형태의 제거가 종양 예방제임을 나타내는, 하나 이상의 항-종양원성 작용제를 동정하는 방법.
- 제 43항에 있어서, 변경된 핵 형태가 시가-형상의 핵 및 탄알-형상의 핵으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵 형태의 제거를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 44항에 있어서, 핵 형태의 변경이 벨-형상 핵의 제거를 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 45항에 있어서, 핵이 융합체에 배열되고, 신생물 핵 형태의 제거가 융합체의 붕괴를 포함함을 특징으로 하는 방법.
- a) 조직 샘플의 세포판의 세포 부착을 붕괴시키는 단계; 및b) 붕괴된 부착을 지니는 세포를 경질 표면상에 스프레딩시키는 단계를 포함하며, 이 때 세포 핵의 구조적 완전성은 본래대로 유지되므로 샘플은 벨-형상 핵을 포함하는 이형 핵 형태들을 포함하는 세포의 동정에 적합한, 50 미크론 이하의 최대 직경을 지니는 핵을 포함하는 세포를 동정하기에 적합한 포유동물 조직 샘플을 제조하는 방법.
- 제 47항에 있어서, 조직 샘플이 층들로 분할되고, 여기서 수득된 층들은 세포의 두께를 초과함을 특징으로 하는 방법.
- 제 48항에 있어서, 조직 샘플이 현미경 슬라이드상에 0.5 밀리미터 이하의 층을 형성함을 특징으로 하는 방법.
- 제 48항에 있어서, 조직 샘플이 50 미크론 보다 큰 층을 형성함을 특징으로 하는 방법.
- 제 47항에 있어서, 세포 부착이 화학적으로 붕괴됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 51항에 있어서, 세포 부착의 화학적 붕괴가 45% 아세트산 처리를 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 47항에 있어서, 조직 샘플이 사람의 조직 샘플임을 특징으로 하는 방법.
- 제 47항에 있어서, 세포판의 면적이 1 mm2임을 특징으로 하는 방법.
- 제 47항에 있어서, 경질 표면이 현미경 슬라이드임을 특징으로 하는 방법.
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