MX2011004696A - Tratamiento con anticuerpos anti-integrina alfa2. - Google Patents

Tratamiento con anticuerpos anti-integrina alfa2.

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Abstract

La invención se relaciona con el tratamiento del cáncer. Más específicamente la invención se relaciona con métodos de tratamiento del cáncer seleccionado del grupo que consiste de cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón, y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer de estómago o gástrico incluyendo cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepaotma, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer colorectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de las glándulas salivales, cáncer renal o del riñón, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de la vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuelo, así como linfoma de células B incluyendo linfoma no de Hodgkin folicular/ grado bajo (NHL); NHL linfocítico pequeño (SL); NHL folicular/grado intermedio ; NHL difuso de grado intermedio ; NHL inmunoblástico de grado alto; NHL linfoblástico de grado alto; NHL de células no hendidas pequeñas de grado alto; NHL con enfermedad de gran carga tumoral; linfoma de células del manto; linfoma relacionados con el SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom; leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crónica; y trastorno linfoproliferativo post-trasplante (PTLD), así como proliferación vascular anormal asociadas con facomatosis, edema tal como that asociadas con tumores cerebrales, síndrome de Meigs, melanoma, mesotelioma, mieloma múltiple, fibrosarcoma, osteosarcoma y carcinoma epidermoide, por la administración de anticuerpos dirigidos a la integrina a2ß1.

Description

TRATAMIENTO CON ANTICUERPOS ANTI-INTEGRINA ALFA2 CAMPO TÉCNICO La presente invención se relaciona con el tratamiento del cáncer. Más específicamente la invención se relaciona con métodos de tratamiento del cáncer por la administración de anticuerpos dirigidos a la integrina a2ß1.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La integrina a2ß1 (antígeno de activación tardía 2; VLA-2) se expresa en una variedad de tipos de células que incluyen plaquetas, células endoteliales vasculares, células epiteliales, monocitos/macrófagos activados, fibroblastos, leucocitos, linfocitos, neutrófilos activados y mastocitos. (Hemler, Annu Rev Immunol 8:365:365-400 (1999); Wu and Santoro, Dev. Dyn. 206:169-171 (1994); Edelson y otros, Blood. 103(6): 2214-20 (2004); Dickeson y otros, Cell Adhesión and Communication. 5: 273-281 (1998)). Los ligandos más típicos para a2ß1 incluyen colágeno y laminina, ambos se encuentran en la matriz extracelular. Típicamente, el dominio I de la integrina <x2 se une al colágeno de una manera dependiente del catión divalente mientras que el mismo dominio se une a la laminina a través de mecanismos dependientes e independientes del catión divalente. (Dickeson y otros, Cell Adhesión and Communication. 5: 2/3-281 (1998)). La especificidad de la integrina a2ß1 varía con el tipo de célula y sirve como un receptor de colágeno y/o laminina para tipos de células particulares, por ejemplo la integrina a2ß1 se conoce como un receptor de colágeno para las plaquetas y un receptor de laminina para las células endoteliales. (Dickeson y otros, J Biol. Chem. 272: 7661-7668 (1997)) Echovirus-1 , decorina, cadherina E, metaloproteinasa de la matriz I (MMP-I), endorepelina y múltiples colectinas y la proteína del complemento C1q son además ligandos para la integrina a2ß1. (Edelson y otros, Blood 107(1): 143-50 (2006)) La integrina a2ß1 se ha implicado en varios procesos biológicos y patológicos que incluyen la agregación plaquetaria inducida por colágeno, migración celular en colágeno, reorganización de las fibras de colágeno dependiente de las células así como respuestas celulares dependientes de colágeno que resultan en aumentos en la expresión y proliferación de citoquina, (Gendron, J. Biol. Chem. 278:48633-48643 (2003); Andreasen y otros, J. Immunol. 171:2804-281 1 (2003); Rao y otros, J. Immunol. 165(9):4935-40 (2000)), aspectos de células T, mastocitos, y función neutrófila (Chan y otros, J. Immunol. 147:398-404 (1991); Dustin and de Fougerolles, Curr Opin Immunol 13:286-290 (2001 ), Edelson y otros, Blood. 103(6):2214-20 (2004), Werr y otros, Blood 95:1804-1809 (2000), aspects of delayed type hyersensitivity contact hypersensitivity and artritis inducida por colágeno (de Fougerolles y otros, J. Clin. Invest. 105:721- 720 (2000); Kriegelstein y otros, J. Clin. Invest. 1 10(12): 1773-82 (2002)), morfogénesis ductal de la glándula mamaria (Keely y otros, J. Cell Sci. 108:595-607 (1995); Zutter y otros, Am. J. Pathol. 155(3):927-940 (1995)), curación de heridas de la epidermis (Pilcher y otros, J. Biol. Chem. 272:181457-54 (1997)), y procesos asociados con la angiogénesis inducida por VEGF (Senger y otros, Am. J. Pathol. 160(1 ): 195-204 (2002)).
Las interacciones integrina/ligando pueden facilitar la extravasación leucocitaria en los tejidos inflamados (Jackson y otros, J. Med. Chem. 40:3359-3368 (1997); Gadek y otros, Science 295(5557): 1086-9 (2002), Sircar y otros, Bioorg. Med. Chem. 10:2051-2066 (2002)), y juegan un papel en los eventos corriente abajo después de la extravasación de leucocitos inicial de la circulación en los tejidos en respuesta a estímulos inflamatorios, que incluyen migración, reclutamiento y activación de células pro-inflamatorias en el sitio de la inflamación (Eble J.A., Curr. Phar. Des. 1 1 (7):867-880 (2005)). Algunos anticuerpos que bloquean la integrina a2ß1 se reportaron por mostrar impacto en las respuestas de hipersensibilidad retardadas y eficacia en un modelo murino de artritis reumatoide y un modelo de enfermedad inflamatoria del intestino (Kriegelstein y otros, J. Clin. Invest. 110(12): 1773-82 (2002); de Fougerolles y otros, J. Clin. Invest. 105:721- 720 (2000) y se reportaron por atenuar la proliferación celular endotelial y migración in vitro (Senger y otros, Am. J. Pathol. 160(1 ): 195-204 (2002), sugiriendo . que el bloqueo de la integrina a2ß1 puede prevenir/inhibir la angiogénesis anormal o mayor que la normal, como se observó en varios cánceres.
La integrina a2ß1 es la única integrina unida al colágeno expresada en las plaquetas y se ha implicado para jugar algún papel en la adhesión plaquetaria al colágeno y la hemostasis (Gruner y otros, Blood 102:4021-4027 (2003); Nieswandt y Watson, Blood 102(2):449-461 (2003); Santoro y otros, Thromb. Haemost. 74:813-821 (1995); Siljander y otros, Blood 15:1333-1341 (2004); Vanhoorelbeke y otros, Curr. Drug Targets Cardiovasc. Haematol. Disord. 3(2): 125-40 (2003)). Adicionalmente, las plaqueta a2ß1 pueden jugar un papel en la regulación del tamaño del agregado plaquetario (Siljander y otros., Blood 103(4): 1333-1341 (2004)).
La integrina 2ß1 se ha mostrado también como una integrina unida a laminina expresada en las células endoteliales (Languino y otros, J Cell Bio. 109:2455-2462 (1989)). Se piensa que las células endoteliales se unen a la laminina a través de un mecanismo mediado por la integrina, sin embargo se sugirió que el dominio a2 I puede funcionar como una secuencia ligando-específica involucrada en mediar las interacciones celulares endoteliales (Bahou y otros, Blood. 84(11):3734-3741 (1994)).
Se anticipó que un anticuerpo terapéutico que se une a la integrina a2ß1 , que incluyen la integrina a2ß1 en las plaquetas, pudiera resultar en complicaciones de sangramiento. Por ejemplo, los anticuerpos dirigidos a otros receptores plaquetarios tales como GPIb (Vanhoorelbeke y otros., Curr. fármaco Targets Cardiovasc. Haematol. Disord. 3(2): 125-40 (2003) o GP llb/llla (Schell y otros., Ann. Hematol. 81 :76-79 (2002), Nieswandt and Watson, Blood 102(2):449-461 (2003), Merlini y otros., Circulation 109:2203-2206 (2004)) se han asociado con trombocitopenia, aunque los mecanismos detrás de esto no se comprenden bien. Se ha formulado la hipótesis de que la unión de un anticuerpo a un receptor plaquetario puede alterar su estructura tridimensional, y exponer los epítopos normalmente no expuestos lo cual conduce después a la eliminación de las plaquetas (Merlini y otros, Circulation 109:2203-2206 (2004). Claramente, las complicaciones de sangramiento asociadas con dosis orales de antagonistas de GP lla/lllb se describieron como el "lado oscuro" de esta clase de compuestos (Bhatt and Topol, Nat. Rev. Drug Discov. 2(1): 15-28 (2003)).
La integrina a2ß1 anti-humana que bloquea el anticuerpo BHA2.1 se describió primero por Hangan y otros, (Cáncer Res. 56:3142-3149 (1996)). Otros anticuerpos anti- integrina a2ß1 se conocen y se han usado in vitro, tales como los anticuerpos AK7 comercialmente disponibles (Mazurov y otros, Thromb. Haemost. 66(4):494-9 (1991), P1 E6 (Wayner y otros, J. Cell Biol. 107(5):1881-91 (1988)), 10G11 (Giltay y otros, Blood 73(5):1235-41 (1989) y A2-11E10 (Bergelson y otros, Cell Adhes. Commun. 2(5):455-64 (1994). Hangan y otros., (Cáncer Res. 56:3142-3149 (1996)) usaron el anticuerpo BHA2.1 in vivo para estudiar los efectos de bloquear la función de la integrina a2ß1 en la extravasación de células tumorales humanas en el hígado, y la capacidad de estas células tumorales para desarrollar focos de metástasis bajo tratamiento del anticuerpo. El anticuerpo Ha1/29 (Mendrick and Kelly, Lab Invest. 69(6):690-702 (1993)), especifico para la integrina a2ß1 de rata y murina, se usó in vivo para estudiar la regulación ascendente de la integrina a2ß1 en células T después de la activación viral de LCMV (Andreasen y otros, J. Immunol. 171 :2804-2811 (2003)), para estudiar las respuestas de hipersensibilidad de tipo retardado inducida por SRBC y hipersensibilidad de tipo de contacto inducida por FITC y artritis inducida por colágeno (de Fougerolles y otros, J. Clin. Invest. 105:721- 720 (2000)), para estudiar el papel de la integrina a2ß1 en angiogénesis regulada por VEGF (Senger y otros, Am. J. Pathol. 160(1): 195-204 (2002); Senger y otros, PNAS 94(25): 13612-7 (1997)), y para estudiar el papel de la integrina a2ß1 en locomoción PMN en respuesta a factor activador de plaquetas (PAF) (Werr y otros, Blood 95:1804-1809 (2000)).
El uso de anticuerpos monoclonales murino, tal como aquellos descritos anteriormente, como agentes terapéuticos humanos en pacientes no inmunocomprometidos se ha limitado por las respuestas inmunes robustas dirigidas contra los anticuerpos murinos administrados, particularmente en administración repetida. Esta respuesta puede no solamente acortar la vida media efectiva del anticuerpo murino en circulación sino también puede conducir a respuestas anafilácticas y/o sitio de inyección profundo (Shawler y otros, J. Immunol. 135(2). 530 (1985)). Adicionalmente, las funciones efectoras de los roedores asociadas con las regiones constantes (Fe) son mucho menos efectivas que su contraparte humana cuando se administran a humanos, resultando en una pérdida de activación del complemento potencialmente deseable y actividad citotóxica mediada por la célula, dependiente del anticuerpo (ADCC) .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1 : Efecto de GBR500 en AsPC-1 crecimiento de xenoinjerto de cáncer pancreático humano en ratones atímicos hembras BALBA; desnudos (nu/nu) inmunodeficientes.
Figura 2: Efecto de GBR500 en xenoinjerto de carcinoma de colon humano HT29 en ratones atímicos nu/nu.
Figura 3: Análisis de inmunotransferencia de la expresión de CD49b y GAPDH en líneas celulares humanas.
Figura 4: Imágenes con el microscopio confocal de la línea celular teñida HT1080.
Figura 5: Imágenes con el microscopio confocal de la línea celular teñida BxPC-3.
Figura 6: Imágenes con el microscopio confocal de la línea celular teñida MIA PaCa2.
Figura 7: Imágenes con el microscopio confocal de la línea celular teñida HT-29.
Figura 8: Imágenes con el microscopio confocal de la línea celular teñida SW480.
Figura 9: Efecto de GBR500 contra el xenoinjerto de cáncer de pulmón de células no pequeñas A549 en ratones atímicos nu/nu.
Figura 10A y 10 B: Curvas de concentración de grupo de dosis de 100 mg GBR500 para monos machos y hembras.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención concierne a los métodos de usar los anticuerpos anti-integrina (oc2) alfa 2 humanizados para el tratamiento de cánceres. En particular, la invención proporciona una aproximación efectiva para el tratamiento de cánceres seleccionados del grupo consistente de cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón que incluyen cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón, y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer de estómago o gástrico que incluye cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer colorectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de las glándulas salivares, cáncer renal o del riñón, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de la vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello, así como linfoma de células B que incluyen linfoma no de Hodgkin (NHL) folicular/ grado bajo; NHL linfocítico pequeño (SL); NHL folicular/grado intermedio; NHL difuso de grado intermedio; NHL inmunoblástico de grado alto; NHL linfoblástico de grado alto; NHL de células no hendidas pequeñas de grado alto; NHL con enfermedad de gran carga tumoral; linfoma de células del manto; linfoma relacionados con el SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom; leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crónica; y trastorno linfoproliferativo post-trasplante (PTLD), así como proliferación vascular anormal asociada con facomatosis, edema tal como el asociado con tumores cerebrales, síndrome de Meigs, melanoma, mesotelioma, mieloma múltiple, fibrosarcoma, osteosarcoma, y carcinoma epidermoide. Esta invención se basa en resultados inesperados que los anticuerpos anti-integrina(a2) alfa 2 que se unen específicamente a la integrina a2ß1 inhiben crecimiento tumoral a un grado comparable con los anticuerpos anti-VEGF. Los factores VEGF activan o sobrerregulan la expresión de las integrinas como a1ß1 , a2ß1 , a4ß1, a5ß1 y a?ß3 en los vasos sanguíneos y a4ß1, a9ß1 , a2ß1 y a1ß1 en vasos linfáticos (Avraamidas y otros, Nat Rev Cáncer. 2008 Ago;8(8):604-17). Es por lo tanto sorprendente que el antagonismo de solamente a2ß1 conduzca a un resultado similar que el tratamiento con un anticuerpo VEGF.
En correspondencia en un aspecto, la invención proporciona un método de tratamiento de cáncer seleccionado del grupo consistente de cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón que incluyen cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón, y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer de estómago o gástrico que incluye cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer colorectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de las glándulas salivares, cáncer renal o del riñón, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de la vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello, así como linfoma de células B que incluyen linfoma no de Hodgkin (NHL) folicular/ grado bajo; NHL linfocítico pequeño (SL); NHL folicular/grado intermedio; NHL difuso de grado intermedio; NHL inmunoblástico de grado alto; NHL linfoblástico de grado alto; NHL de células no hendidas pequeñas de grado alto; NHL con enfermedad de gran carga tumoral; linfoma de células del manto; linfoma relacionados con el SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom; leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crónica; y trastorno linfoproliferativo post-trasplante (PTLD), así como proliferación vascular anormal asociada con facomatosis, edema tal como el asociado con tumores cerebrales, síndrome de Meigs, melanoma, mesotelioma, mieloma múltiple, fibrosarcoma, osteosarcoma, y carcinoma epidermoide, que comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-cc2 integrina humanizado que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, sec. con núm. de ident.:2), (b) HCDR1 (GFSLTNYGIH, sec. con núm. de ident.:1), HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, sec. con núm. de ident.:2) y HCDR3 (ANDGVYYAMDY, sec. con núm. de ident.:3), o (c) sec. con núm. de ident.:40 y/o una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) una LCDR1 seleccionada de SANSSVNYIH (sec. con núm. de ident.:4) o SAQSSVNYIH (sec. con núm. de ident.:112), (b) LCDR2 (DTSKLAS; sec. con núm. de ¡dent.:5) y (c) LCDR3 (QQWTTNPLT, sec. con núm. de ident.:6).
En otro aspecto, la invención proporciona un método de tratamiento de cáncer seleccionado del grupo consistentede cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón que incluyen cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón, y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer de estómago o gástrico que incluye cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer colorectal carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de las glándulas salivares, cáncer renal o del riñon, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de la vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello, así como linfoma de células B que incluyen linfoma no de Hodgkin (NHL) folicular/ grado bajo; NHL linfocítico pequeño (SL), NHL folicular/grado intermedio; NHL difuso de grado intermedio; NHL inmunoblástico de grado alto; NHL linfoblástico de grado alto; NHL de células no hendidas pequeñas de grado alto; NHL con enfermedad de gran carga tumoral; linfoma de células del manto; linfoma relacionados con el SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom; leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crónica; y trastorno linfoproliferativo post-trasplante (PTLD), así como proliferación vascular anormal asociadas con facomatosis, edema tal como el asociado con tumores cerebrales, síndrome de Meigs, melanoma, mesotelioma, mieloma múltiple, fibrosarcoma, osteosarcoma, y carcinoma epidermoide, que comprende administrar a un sujeto una composición que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti- integrina a2 humanizado que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, sec. con núm. de ident.:2), (b) HCDR1 (GFSLTNYGIH, sec. con núm. de ident.:1), HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, sec. con núm. de ident.:2) y HCDR3 (ANDGVYYAMDY, sec. con núm. de ¡dent.:3), o (c) sec. con núm. de ident.:40 y/o una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) una LCDR1 seleccionada de SANSSVNYIH (sec. con núm. de ident.:4) o SAQSSVNYIH (sec. con núm. de ident.:112), (b) LCDR2 (DTSKLAS; sec. con núm. de ident.:5) y (c) LCDR3 (QQWTTNPLT, sec. con núm. de ident.:6) y un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones para uso terapéutico pueden-ser estériles y pueden ser liofilizadas.
En otro aspecto, la invención proporciona un método de tratamiento de cáncer seleccionado del grupo consistentede cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón que incluyen cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón, y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer de estómago o gástrico que incluye cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer colorectal carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de las glándulas salivares, cáncer renal o del riñon, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de la vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello, así como linfoma de células B que incluyen linfoma no de Hodgkin (NHL) folicular/ grado bajo; NHL linfocítico pequeño (SL); NHL folicular/grado intermedio; NHL difuso de grado intermedio; NHL inmunoblástico de grado alto; NHL linfoblástico de grado alto; NHL de células no hendidas pequeñas de grado alto; NHL con enfermedad de gran carga tumoral; linfoma de células del manto; linfoma relacionados con el SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom; leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crónica; y trastorno linfoproliferativo post-trasplante (PTLD), así como proliferación vascular anormal asociadas con facomatosis, edema tal como el asociado con tumores cerebrales, síndrome de Meigs, melanoma, mesotelioma, mieloma múltiple, fibrosarcoma, osteosarcoma, y carcinoma epidermoide, que comprende administrar a un sujeto una composición que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti- integrina a2 humanizado que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, sec. con núm. de ident.:2), (b) HCDR1 (GFSLTNYGIH, sec. con núm. de ident.:1), HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, sec. con núm. de ident.:2) y HCDR3 (ANDGVYYAMDY, sec. con núm. de ident.:3), o (c) sec. con núm. de ident.:40 y/o una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) una LCDR1 seleccionada de SANSSVNYIH (sec. con núm. de ident.:4) o SAQSSVNYIH (sec. con núm. de ident.:112), (b) LCDR2 (DTSKLAS; sec. con núm. de ident.:5) y (c) LCDR3 (QQWTTNPLT, sec. con núm. de ident.:6) y un portador farmacéuticamente aceptable, mientras que el régimen de dosificación es una vez cada dos semanas.
En aún otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti- integrina a2 humanizado que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, sec. con núm. de ¡dent.:2), (b) HCDR1 (GFSLTNYGIH, sec. con núm. de ident.:1), HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, sec. con núm. de ident.:2) y HCDR3 (ANDGVYYAMDY, sec. con núm. de ident.:3), o (c) sec. con núm. de ident.:40 y/o una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) una LCDR1 seleccionada de SANSSVNYIH (sec. con núm. de ident.:4) o SAQSSVNYIH (sec. con núm. de ident.:112), (b) LCDR2 (DTSKLAS; sec. con núm. de ident.:5) y (c) LCDR3 (QQWTTNPLT, sec. con núm. de ident.:6) o una composición que comprende dicho anticuerpo anti- integrina al humanizado y un portador farmacéuticamente aceptable para su uso en un método para el tratamiento de cáncer seleccionado del grupo que consiste de cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón que incluyen cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón, y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer de estómago o gástrico que incluyen cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer colorectal, carcinoma endometrial o uterino , carcinoma de las glándulas salivares, cáncer renal o del riñon, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de la vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello, así como linfoma de células B incluyendo linfoma no de Hodgkin folicular/ grado bajo (NHL); NHL linfocítico pequeño (SL); NHL folicular/grado intermedio ; NHL difuso de grado intermedio; NHL inmunoblástico de grado alto; NHL linfoblástico de grado alto; NHL de células no hendidas pequeñas de grado alto; NHL con enfermedad de gran carga tumoral; linfoma de células del manto; linfomas relacionados con el SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom; leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crónica; y trastorno linfoproliferativo post-trasplante (PTLD), así como proliferación vascular anormal asociadas con facomatosis, edema tal como el asociado con tumores cerebrales, síndrome de Meigs, melanoma, mesotelioma, mieloma múltiple fibrosarcoma, osteosarcoma, y carcinoma epidermoide.
En un aspecto adicional la invención proporciona un kit para el tratamiento de cáncer seleccionado del grupo que consiste de cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón, y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer de estómago o gástrico incluyendo cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer colorectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de las glándulas salivares, cáncer renal o del riñon, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de la vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello, así como linfoma de células B incluyendo linfoma no de Hodgkin folicular/ grado bajo (NHL); NHL linfocítico pequeño (SL); NHL folicular/grado intermedio ; NHL difuso de grado intermedio; NHL inmunoblástico de grado alto; NHL linfoblástico de grado alto; NHL de células no hendidas pequeñas de grado alto; NHL con enfermedad de gran carga tumoral; linfoma de células del manto; linfoma relacionados con el SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom; leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crónica; y trastorno linfoproliferativo post-trasplante (PTLD), así como proliferación vascular anormal asociada con facomatosis, edema tal como el asociado con tumores cerebrales, síndrome de Meigs, melanoma, mesotelioma, mieloma múltiple, fibrosarcoma, osteosarcoma, y carcinoma epidermoide en un paciente humano que comprende un empaque que comprende un anticuerpo anti- integrina a2 humanizado que comprende una composición de anticuerpo anti- integrina a2 humanizado que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, sec. con núm. de ident.:2), (b) • HCDR1 (GFSLTNYGIH, sec. con núm. de ident.:1), HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, sec. con núm. de ¡dent.:2) y HCDR3 (ANDGVYYAMDY, sec. con núm. de ident.:3), o (c) sec. con núm. de ident.:40 y/o una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) una LCDR1 seleccionada de SANSSVNYIH (sec. con núm. de ident.:4) o SAQSSVNYIH (sec. con núm. de ident.:112), (b) LCDR2 (DTSKLAS; sec. con núm. de ident.:5) y (c) LCDR3 (QQWTTNPLT, sec. con núm. de ident.:6) e instrucciones para usar dicho anticuerpo anti- integrina a2 humanizado para dicho tratamiento.
En otro aspecto adicional, la invención proporciona un artículo de fabricación que comprende un anticuerpo anti- integrina a2 humanizado que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, sec. con núm. de ident.:2), (b) HCDR1 (GFSLTNYGIH, sec. con núm. de ident.:1), HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, sec. con núm. de ident.:2) y HCDR3 (ANDGVYYAMDY, sec. con núm. de ident.:3), o (c) sec. con núm. de ident.:40 y/o una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) una LCDR1 seleccionada de SANSSVNYIH (sec. con núm. de ident.:4) o SAQSSVNYIH (sec. con núm. de ident.:112), (b) LCDR2 (DTSKLAS; sec. con núm. de ident.:5) y (c) LCDR3 (QQWTTNPLT, sec. con núm. de ident.:6) un contenedor y una etiqueta que indica el uso de dicho anticuerpo anti- integrina a2 humanizado para el tratamiento de cáncer seleccionado del grupo que consiste de cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón, y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer de estómago o gástrico incluyendo cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer colorectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de las glándulas salivares, cáncer renal o del riñon, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de la vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello, así como linfoma de células B incluyendo linfoma no de Hodgkin folicular/ grado bajo (NHL); NHL linfocítico pequeño (SL); NHL folicular/grado intermedio ; NHL difuso de grado intermedio ; NHL inmunoblástico de grado alto; NHL linfoblástico de grado alto; NHL de células no hendidas pequeñas de grado alto; NHL con enfermedad de gran carga tumoral; linfoma de células del manto; linfoma relacionados con el SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom; leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crónica; y trastorno linfoproliferativo post-trasplante (PTLD), así como proliferación vascular anormal asociada con facomatosis, edema tal como el asociado con tumores cerebrales, síndrome de Meigs, melanoma, mesotelioma, mieloma múltiple, fibrosarcoma, osteosarcoma, y carcinoma epidermoide.
En ciertas modalidades, el anticuerpo anti- integrina a2 incluye una o más regiones constantes humanas (por ejemplo., CL y/o CH) y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.:19 y/o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.:21 o variantes de secuencias de aminoácido de éstas Varias formas del anticuerpo se contemplan en la presente. Por ejemplo, el anticuerpo anti- integrina a2 puede ser un anticuerpo de longitud completa (por ejemplo, comprendiendo regiones constantes de inmunoglobulina humana) o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo fragmentos Fab o F(ab')2 o Fab' o Fv o scFv). Además, el anticuerpo se puede etiquetar con una etiqueta detectable, inmobilizar en una fase sólida y/o conjugar con un compuesto heterólogo (tal como un agente citotóxico).
En una modalidad, la región variable de cadena pesada anteriormente mencionada comprende la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.:185.
En una modalidad adicional, región variable de cadena pesada antes mencionada comprende la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.:185 en la cual la posición 30 es Thr y/o la posición 31 es Asn .
En una modalidad adicional, la región variable de cadena pesada antes mencionada comprende la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.: 185 en la cual (a) la posición 71 es Lys, (b) la posición 73 es Asn, (c) la posición 78 es Val, o (d) cualquier combinación de (a)-(c).
En una modalidad adicional, la región variable de cadena pesada antes mencionada comprende una secuencia de aminoácido seleccionada de las sec. con núm. de ident.:70-79 y sec. con núm. de ident: 109-111.
En una modalidad adicional, la región variable de cadena pesada antes mencionada comprende una secuencia de aminoácido seleccionada de sec. con núm. de ident. :70-75, sec. con núm. de ident.:77-79 y sec. con núm. de ident.:109-111.
En una modalidad, la región variable de cadena pesada antes mencionada comprende además, una región FW4 que comprende la secuencia de aminoácidos WGQGTLVTVSS (sec. con núm. de ident.: 13 En una modalidad, la región variable de cadena pesada antes mencionada comprende la secuencia de aminoácidos de HCDR1 (sec. con núm. de ident. :1), HCDR2 (sec. con núm. de ident.:2) y HCDR3 (sec. con núm. de ident.:3).
En una modalidad adicional, el anticuerpo anti- integrina a2 humanizado antes mencionado comprende una cadena pesada que comprende la sec. con núm. de ident.: 187.
En una modalidad, la región variable de cadena ligera antes mencionada comprende la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.:186.
En una modalidad, la región variable de cadena ligera antes mencionada comprende la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.: 186 en la cual la asparagina (N) en la posición 26 del aminoácido se reemplaza por glutamina (Q).
En una modalidad, la región variable de cadena ligera antes mencionada comprende la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.:186 en la cual (a) la posición 2 es Phe, (b) la posición 45 es Lys, (c) la posición 48 es Tyr, o (d) cualquier combinación de (a)-(c).
En una modalidad, la región variable de cadena ligera antes mencionada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de la sec. con núm. de ident. :41 , sec. con núm. de ident.:80-92 y sec. con núm. de ident.: 108.
En una modalidad, la región variable de cadena ligera antes mencionada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de la sec. con núm. de ident. :90-92.
En una modalidad, la región variable de cadena ligera antes mencionada comprende además una región FW4 que comprende la secuencia de aminoácidos FGQGTKVEIK (sec. con núm. de ident.:38).
En una modalidad, la región variable de cadena ligera antes mencionada comprende la secuencia de aminoácidos de LCDR1 (sec. con núm. de ident.:4), LCDR2 (sec. con núm. de ident.:5) y LCDR3 (sec. con núm. de ident.:6).
En una modalidad, la región variable de cadena ligera antes mencionada comprende la secuencia de aminoácidos de LCDR1 (sec. con núm. de ident. 112), LCDR2 (sec. con núm. de ident.:5) y LCDR3 (sec. con núm. de ident.:6).
En una modalidad adicional, el anticuerpo anti- integrina ot2 humanizado antes mencionado comprende una cadena ligera que comprende la sec. con núm. de ident.:188.
En una modalidad adicional el anticuerpo anti- integrina a2 humanizado antes mencionado comprende: (i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, sec. con núm. de ident.:2), (b) HCDR1 (GFSLTNYGIH, sec. con núm. de ident.:1), HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, sec. con núm. de ident.:2) y HCDR3 (ANDGVYYAMDY, sec. con núm. de ident.:3), o (c) sec. con núm. de ident.:40; y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) una LCDR1 seleccionada de SANSSVNYIH (sec. con núm. de ident.:4) o SAQSSWNYIH (sec. con núm. de ident.:112), (b) LCDR2 (DTSKLAS; sec. con núm. de ident.:5) y (c) LCDR3 (QQWTTNPLT, sec. con núm. de ident.:6).
En una modalidad adicional el anticuerpo anti- integrina ct2 humanizado antes mencionado comprende: (i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) HCDR1 (GFSLTNYGIH, sec. con núm. de ¡dent.:1 ), HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, sec. con núm. de ident.:2) y HCDR3 (ANDGVYYAMDY, sec. con núm. de ident.:3), o (b) sec. con núm. de ident.:40; y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) una LCDR1 seleccionada de SANSSVNYIH (sec. con ????. de ident.:4) o SAQSSVNYIH (sec. con núm. de ident.:1 12), (b) LCDR2 (DTSKLAS; sec. con núm. de ident.:5) y (c) LCDR3 (QQWTTNPLT, sec. con núm. de ident.:6).
En una modalidad adicional el anticuerpo anti- integrina a2 humanizado antes mencionado comprende: (i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de HCDR1 (GFSLTNYGIH, sec. con núm. de ident.:1), HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, sec. con núm. de ident.:2) y HCDR3 (ANDGVYYAMDY, sec. con núm. de ident.:3); y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de LCDR1 (SAQSSVNYIH, sec. con núm. de ident.:112), LCDR2 (DTSKLAS; sec. con núm. de ident.:5) y LCDR3 (QQWTTNPLT, sec. con núm. de ident.:6).
Se proporciona también el método antes mencionado que comprende el anticuerpo anti-integrina a2 humanizado, en donde (a) la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.: 185, (b) la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.: 186, o (c) ambas (a) y (b).
Se proporciona también el método antes mencionado que comprende el anticuerpo anti-integrina a2 humanizado, en donde (a) la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.:185 en la cual la posición 30 es Thr y/o la posición 31 es Asn; (b) la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.:186 en la cual la asparagina (N) en la posición 26 del aminoácido se reemplaza por glutamina (Q); o (c) ambas (a) y (b).
Se proporciona también el método antes mencionado que comprende el anticuerpo anti-integrina a2 humanizado, en donde (i) la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.:185 en la cual (a) la posición 71 es Lys, (b) la posición 73 es Asn, (c) la posición 78 es Val, o (d) cualquier combinación de (a)-(c); (ii) la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.: 186 en la cual (a) la posición 2 es Phe, (b) la posición 45 es Lys, (c) la posición 48 es Tyr, o (d) cualquier combinación de (a)-(c); o (iii) ambas (i) y (ii).
Se proporciona también el método antes mencionado que comprende el anticuerpo anti-integrina a2 humanizado, en donde (a) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácido seleccionada de las sec. con núm. de ident.:70-79 y sec. con núm. de ident.: 109-111 ; (b) la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácido seleccionada de sec. con núm. de ident. :41 , sec. con núm. de ident. :80-92 y sec. con núm. de ident.:108; o (c) ambas (a) y (b).
Se proporciona también el método antes mencionado que comprende el anticuerpo anti-integrina cc2 humanizado, en donde (a) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácido seleccionada de las sec. con núm. de ident. :70-75, sec. con núm. de ident.:77-79 y sec. con núm. de ident..109-111 ; (b) la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácido seleccionada de las sec. con núm. de ident.:90-92; o (c) ambas (a) y (b).
Se proporciona también el método antes mencionado que comprende el anticuerpo anti-integrina a2 humanizado, en donde el anticuerpo anti- integrina a2 humanizado comprende una cadena pesada que comprende sec. con núm. de ident: 187 y una cadena ligera que comprende sec. con núm. de ident.:188.
Se proporciona también el método antes mencionado que comprende el anticuerpo anti-integrina a2 humanizado, en donde el anticuerpo anti- integrina a2 humanizado comprende una cadena pesada que comprende la sec. con núm. de ident.:174 o sec. con núm. de ident.:176 y una cadena ligera que comprende sec. con núm. de ident.:178.
En una modalidad, el anticuerpo anti- integrina a2 antes mencionado reconoce el dominio I de integrina a2 humana.
En una modalidad, el anticuerpo anti- integrina <x2 antes mencionado se une a la integrina a2ß1.
En una modalidad, el anticuerpo anti- integrina a2 antes mencionado se une a un epítopo de la integrina <x2, el epítopo comprende: (a) un residuo de Lys que corresponde a la posición 19 de la secuencia de aminoácido de la integrina a2 expuesta en la sec. con núm. de ident.:8 o la posición 40 de la secuencia de aminoácido del dominio I de la integrina a2 expuesta en la sec. con núm. de ident.:11 ; (b) un residuo Asn que corresponde a la posición 225 de la secuencia de aminoácido de la integrina a2 expuesta en la sec. con núm. de ident.:8 o la posición 73 de la secuencia de aminoácido del dominio I de la integrina a2 expuesta en la sec. con núm. de ident.:11 ; (c) un residuo Gln que corresponde a la posición 241 de la secuencia de aminoácido de la integrina a2 expuesta en la sec. con núm. de ident.:8 o la posición 89 de la secuencia de aminoácido del dominio I de la integrina a2 expuesta en la sec. con núm. de ident.:11 ; (d) un residuo Tyr que corresponde a la posición 245 de la secuencia de aminoácido de la integrina <x2 expuesta en la sec. con núm. de ident.:8 o la posición 93 de la secuencia de aminoácido del dominio I de la integrina a2 expuesta en la sec. con núm. de ident.: 1 1 ; (e) un residuo Arg que corresponde a la posición 317 de la secuencia de aminoácido de la integrina <x2 expuesta en la sec. con núm. de ident.:8 o la posición 165 de la secuencia de aminoácido del dominio I de la integrina a2 expuesta en la sec. con núm. de ident.:11 ; (f) un residuo Asn que corresponde a la posición 318 de la secuencia de aminoácido de la integrina a2 expuesta en la sec. con núm. de ident.:8 o la posición 166 de la secuencia de aminoácido del dominio I de la integrina a2 expuesta en la sec. con núm. de ident.:1 1 ; o (g) cualquier combinación de (a) a (0- En una modalidad, el anticuerpo anti- integrina ot2 humanizado antes mencionado es un anticuerpo de longitud completa.
En una modalidad, el anticuerpo anti- integrina a2 humanizado antes mencionado es un fragmento de unión al antígeno.
En una modalidad, el anticuerpo anti- integrina a2 humanizado antes mencionado inhibe la unión de a2 o integrina a2ß1 a un ligando de integrina a2ß1.
En una modalidad, el ligando de integrina a2ß1 antes mencionado se selecciona de colágeno, laminina, Echovirus-1 , decorina, cadherina E, metaloproteinasa de la matriz I (MMP-I), endorepelina, colectina y proteína del complemento C1q.
En modalidades, el método antes mencionado no se asocia con (a) activación plaquetaria, (b) agregación plaquetaria, (c) una disminución del conteo de plaquetas circulantes, (d) complicaciones de sangramiento, o (e) cualquier combinación de (a) a (d).
En una modalidad, el anticuerpo anti- integrina cc2 antes mencionado inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo que comprende la región UL de la sec. con núm. de ident.:19 y la región VH de la sec. con núm. de ident.:21 a la integrina a2ß1 humana o el dominio I de la misma.
Los anticuerpos preferidos se unen al dominio I de la integrinaa2ß1 humana. En particular, ' los anticuerpos preferidos son capaces de bloquear la adhesión dependiente de a2 de las células a la matriz extracelular (ECM), particularmente a al menos una o ambas de colágeno y laminina. Los anticuerpos humanizados se proporcionan, incluyendo anticuerpos basados en un anticuerpo referido en la presente como TMC-2206. Se proporcionan anticuerpos anti- integrina a2 que son muy específicos para la integrina 2ß1 humana, y cuya administración no se asocia con efectos indeseables tales como complicaciones de sangramiento o complicaciones debidas a la activación celular. La especificidad de unión (por ejemplo, especificidad del epítopo) de estos anticuerpos se asocia con su perfil no hemorrágico inesperado.
El anticuerpo anti- integrina a2ß1 humanizado usado en la presente invención puede tener una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de HCDR1 (GFSLTNYGIH; sec. con núm. de ident.:1) y/o HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS; sec. con núm. de ident.:2) y/o HCDR3 (ANDGVYYAMDY; sec. con núm. de ident.:3). El anticuerpo anti- integrina a2ß1 humanizado puede tener una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de LCDR1 (SANSSVNYIH; sec. con núm. de ident.:4 o SAQSSVNYIH; sec. con núm. de ident.:112) y/o LCDR2 (DTSKLAS; sec. con núm. de ident.:5) y/o LCDR3 (QQWTTNPLT; sec. con núm. de ident.:6). En ciertas modalidades, el anticuerpo anti- integrina a2ß1 humanizado tiene una cadena pesada que comprende HCDR1 (GFSLTNYGIH; sec. con núm. de ident.:1) y/o HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS; sec. con núm. de ident.:2) y/o HCDR3 (ANDGVYYAMDY; sec. con núm. de ident.:3) y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de LCDR1 (SANSSVNYIH; sec. con núm. de ident.:4 o SAQSSVNYIH; sec. con núm. de ident.:112) y/o LCDR2 (DTSKLAS; sec. con núm. de ident.:5) y/o LCDR3 (QQWTTNPLT; sec. con núm. de ident.:6). En otras modalidades, el anticuerpo comprende una variante de secuencia de aminoácido de una o más de esas CDR, cuya variante comprende una o más insersiones de aminoácidos dentro o adyacente a un residuo de CDR y/o deleción(es) dentro o adyacente a un residuo de CDR y/o sustitución(s) de residuo(s) CDR (con sustitución(s) siendo el tipo preferido de alteración de aminoácido para generar tales variantes).
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención proporciona métodos de tratamiento del cáncer seleccionados del grupo que consiste de cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón, y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer de estómago o gástrico incluyendo cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer colorectal, carcinoma endometrial o uterino , carcinoma de las glándulas salivares, cáncer renal o del riñon, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de la vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello, así como linfoma de células B incluyendo linfoma no de Hodgkin folicular/ grado bajo (NHL); NHL linfocítico pequeño (SL); NHL folicular/grado intermedio; NHL difuso de grado intermedio ; NHL inmunoblástico de grado alto; NHL linfoblástico de grado alto; NHL de células no hendidas pequeñas de grado alto; NHL con enfermedad de gran carga tumoral; linfoma de células del manto; linfoma relacionados con el SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom; leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crónica; y trastorno linfoproliferativo post-trasplante (PTLD), así como proliferación vascular anormal asociadas con facomatosis, edema tal como that asociadas con tumores cerebrales, síndrome de Meigs, melánoma, mesotelioma, mieloma múltiple, fibrosarcoma, osteosarcoma, y carcinoma epidermoide usando anticuérpos específicamente reactivos con integrina alfa 2 (<x2) humana, incluyendo anticuerpos humanizados. Los anticuerpos humanizados pueden tener regiones marco humanas (FW) y regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo no humano, típicamente un ratón, específicamente reactivo con integrina ot2 humana. En modalidades preferidas, una o más de las regiones CDR se derivan de o se basan en el anticuerpo murino secretado por el hibridoma BHA2.1 (Hangan y otros, Cáncer Res., 56(13): 3142-9 (1996)). Este anticuerpo se une a la integrina a2ß1 humana y de rata, pero no se une a la contraparte murina. El anticuerpo producido de esa manera por el hibridoma BHA2.1 se refiere en la presente como TMC-2206 y está comercialmente disponible de Chemicon (ahora parte de Millipore, catálogo número MAB1998). Se proporcionan además métodos de tratamiento del cáncer seleccionados del grupo que consiste de cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón, y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer de estómago o gástrico incluyendo cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastomá, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer colorectal, carcinoma endometrial o uterino , carcinoma de las glándulas salivares, cáncer renal o del riñon, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de la vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello, así como linfoma de células B incluyendo linfoma no de Hodgkin folicular/ grado bajo (NHL); NHL linfocítico pequeño (SL); NHL folicular/grado intermedio; NHL difuso de grado intermedio ; NHL inmunoblástico de grado alto; NHL linfoblástico de grado alto; NHL de células no hendidas pequeñas de grado alto; NHL con enfermedad de gran carga tumoral; linfoma de células del manto; linfoma relacionados con el SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom; leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crónica; y trastorno linfoproliferativo post-trasplante (PTLD), así como proliferación vascular anormal asociadas con facomatosis, edema tal como that asociadas con tumores cerebrales, síndrome de Meigs, melanoma, mesotelioma, mieloma múltiple, fibrosarcoma, osteosarcoma, y carcinoma epidermoide usando anticuerpos con propiedades de unión similares y anticuerpos (u otros antagonistas) con similar funcionalidad que los anticuerpos descritos en la presente. Los anticuerpos anti-integrina a2 incluyen los que (a) se unen al dominio I de integrina a2, (b) inhiben la función de la integrina al {por ejemplo, unión al colágeno o laminina), (c) se unen a la integrina ct2 en plaquetas restantes sin inducir activación plaquetaria y (d) reconocen el epítopo de unión de TMC-2206 {por ejemplo, compiten con TMC-2206 por la unión a la integrina a2). Tales anticuerpos pueden unirse preferentemente a la configuración inactiva o cerrada de la molécula de integrina ot2 objetivo sin competir por el sitio de unión al ligando. Las ventajas de los anticuerpo anti- integrina a2 como los descritos en la presente que se unen preferentemente a la configuración cerrada de la integrina a2ß1 y/o se unen a la integrina a2ß1 sin competir por el sitio de unión al ligando {por ejemplo, no son un mimético del ligando) incluyen prevenir la activación plaquetaria potencial, agregación plaquetaria, disminución del conteo de plaquetas circulantes y/o complicaciones de sangramiento en un sujeto tratado.
Las "complicaciones de sangramiento" como se usa en la presente se refiere a cualquier efecto adverso en la fisiología y niveles de sangre, incluyendo respuestas trombóticas de las plaquetas, trombocitopenia, tiempo de coagulación aumentado, tiempo de sangramiento aumentado y pérdida de sangre que limita el uso terapéutico del anticuerpo anti- integrina a2.
La integrina a2ß1 es una molécula comprendida de una subunidad de integrina a2 (ver, por ejemplo, sec. con núm. de ident.:7, para la secuencia de ADN y sec. con núm. de ident.:8 para la secuencia de proteína de cc2 humano) de la familia de integrinas alfa, y una subunidad de integrina ß1 (ver, por ejemplo, sec. con núm. de ident.:9 para la secuencia de ADN y sec. con núm. de ident.:10 secuencia de proteína de ß1 humano) de la familia de integrinas beta, y puede ser de cualquier sujeto incluyendo un mamíferos, pero de preferencia es de un humano. La integrina 2ß1 se puede purificar a partir de cualquier fuente natural, o se puede producir sintéticamente (por ejemplo, por uso de la ingeniería genética). La secuencia codificante de ácido nucleico para la integrina a2 y para la integrina ß1 se describen en Takada y Hemler J. Cell Biol. 109(1 ):397 -407 (1989; GenBank submission X17033; posteriormente actualizada para entrar NM 002203) y Argraves, W.S, J. Cell. Biol. Sep 105(3): 1183-90 (1987; presentación Genbank X07979.1 y secuencias relacionadas que representan variantes alternativamente emplamadas), respectivamente.
El dominio T de la molécula de integrina a2ß1 se refiere a una región de esta molécula de integrinac^l dentro de la subunidad a2, y se describe, por ejemplo, en Kamata y otros., J Biol. Chem. 269:9659-9663 (1994); Emsley y otros., J. Biol. Chem. 272:28512 (1997) y Cell 101 :47 (2000). La secuencia de aminoácidos de un dominio I humano de la integrina a2 se muestra como la sec. con núm. de ident.:1 1 (ver además, por ejemplo. , sec. con núm. de ident.: 107). El dominio I de la integrina cc2 contiene un tipo MIDAS de sitio de unión al ligando (Metal ion Dependent Adhesión Site, por sus siglas en inglés) que tiene una necesidad y una especificidad por un catión divalente dado para soportar la unión del ligando. La secuencia de aminoácidos para un dominio I de la integrina a2 en rata se muestra como la sec. con núm. de ident.:93 (ver además, por ejemplo., sec. con núm. de ident.:113) y en ratón se muestra como la sec. con núm. de ident.:94 (ver además, por ejemplo., sec. con núm. de ident.:114). Las secuencias de dominio I del mono cynomolgus y mono rhesus se clonaron a partir de la fracción de leucocitos derivada de sangre completa y se proporcionan en. la sec. con núm. de ident.:103 (ADN), sec. con núm. de ident. :171 (aminoácido) para cynomolgus y sec. con núm. de ident.:104 (ADN), sec. con núm. de ident. :172 (aminoácido) para rhesus, respectivamente.
Un epítopo TMC-2206 (BHA2.1) se refiere a una región del dominio I de la integrina a2 humana a la cual se une el anticuerpo TMC-2206. Este epítopo abarca una región de 127 aminoácidos que abarca los residuos de aminoácidos, K40, N73, Q89, Y93, R165, y N166, los quecontribuyen a la unión y opcionalmente, otros residuos de aminoácidos del dominio I de la integrina ct2 como es descrito en WO2007/056858.
El término "cáncer" se refiere a o describe la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular no regulado. En esta definición se incluyen los cánceres benignos y malignos, cánceres metastásicos así como adenomas o adenocarcinomas. "Tumor" se refiere a todo crecimiento celular neoplásico y proliferación, sea benigno y maligno, y todos los tejidos y células pre-cancerosas y cancerosas. "Tumor benigno" o "cáncer benigno" se refiere a un tumor que se mantiene localizado en el sitio de origen y no tiene la capacidad de infiltrarse, invadir, o hacer metástasis en un sitio distante. "Tumor maligno" se refiere a un tumor que invade y daña otros tejidos alrededor del mismo. El tratamiento de cáncer se refiere al uso terapéutico y profiláctico o uso preventivo del anticuerpo anti- integrina a2 descrito en la presente. Aquellos con necesidad de tratamiento incluyen aquellos ya diagnosticados con el cáncer así como aquellos en los cuales la aparición del trastorno se previene o retarda.
Los cánceres se pueden seleccionar del grupo que consiste de cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón, y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer de estómago o gástrico incluyendo cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer colorectal, carcinoma endometrial o uterino , carcinoma de las glándulas salivares, cáncer renal o del riñon, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de la vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello, así como linfoma de células B incluyendo linfoma no de Hodgkin folicular/ grado bajo (NHL); NHL linfocítico pequeño (SL); NHL folicular/grado intermedio ; NHL difuso de grado intermedio ; NHL inmunoblástico de grado alto; NHL linfoblástico de grado alto; NHL de células no hendidas pequeñas de grado alto; NHL con enfermedad de gran carga tumoral; linfoma de células del manto; linfoma relacionados con el SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom; leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crónica; y trastorno linfoproliferativo post-trasplante (PTLD), así como proliferación vascular anormal asociadas con facomatosis, edema tal como that asociadas con tumores cerebrales, síndrome de Meigs, melanoma, mesotelioma, y mieloma múltiple. Los cánceres que se tratan preferentemente usando el anticuerpo anti- integrina a2 descrito en la presente se seleccionan del grupo que consiste de cáncer de mamas, cáncer colorectal, rectal cáncer cáncer de pulmón de células no pequeñas, linfoma de no- Hodgkins (NHL), cáncer de células renales, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer pancreático, sarcoma de tejido blando, sarcoma de kaposi, carcinoma carcinoide, cáncer de cabeza y cuello, melanoma, cáncer de ovario, mesotelioma, y mieloma múltiple. Las afecciones cancerosas corregibles para tratamiento de la invención incluyen cánceres metastásicos. Así, los cánceres más preferidos son los seleccionados del grupo que consiste de cáncer de mamas, cáncer colorectal, rectal cáncer cáncer de pulmón de células no pequeñas, linfoma de no- Hodgkins (NHL), cáncer de células renales, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer pancreático, sarcoma de tejido blando, sarcoma de kaposi, carcinoma carcinoide, cáncer de cabeza y cuello, melanoma, cáncer de ovario, mesotelioma, mieloma múltiple, cáncer de mamas metastásico y colorectal metastásico. Los cánceres particularmente preferidos se seleccionan del grupo que consiste de cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer colorectal, cáncer de riñon, cáncer de próstata, mesotelioma, fibrosarcoma, osteosarcoma, carcinoma epidermoide, cáncer colorectal metastásico, de próstata metastásico y de mamas metastásico. Los cánceres más particularmente preferidos se seleccionan del grupo que consiste de cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer de hígado, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer colorectal, cáncer de riñon, cáncer de próstata, mesotelioma, fibrosarcoma, cáncer colorectal metastásico, de próstata metastásico y de mamas metastásico. Los cánceres aún más particularmente preferidos se seleccionan del grupo que consiste de cáncer pancreático, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer colorectal, cáncer de pulmón de células no pequeñas, fibrosarcoma, cáncer colorectal metastásico y de mamas metastásico. Los cánceres más particularmente preferidos se seleccionan del grupo que consiste de cáncer pancreático, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer colorectal, cáncer de pulmón de células no pequeñas, y fibrosarcoma. Los cánceres más preferidos son el cáncer pancreático, cáncer de mamas o cáncer de mamas metastásico, con particular preferencia a cáncer pancreático. "Cáncer de mamas" como se refiere en la presente incluyen adenocarcinoma mamario. El método de la presente invención es particularmente adecuado para el tratamiento de tumores vascularizado.
Un sujeto, incluido para propósitos de tratamiento, se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, y zoo, de deportes o mascotas tales como perros, caballos, gatos, vacas etc. de preferencia, el sujeto es un humano.
El término anticuerpo o inmunoglobulina se usó en el sentido más amplio, y cubre los anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos, y fragmentos de anticuerpo en la medida que exhiban la actividad biológica deseada. Los fragmentos de anticuerpo comprenden una porción de un anticuerpo de longitud completa, en general un unión al antígeno o región variable de los mismos. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, y Fv, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo de cadena sencilla, anticuerpos de dominio sencillo (por ejemplo, de camélidos), anticuerpos de dominio sencillo NAR de tiburón, y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo se pueden referir además a las porciones de unión que comprenden las CDR o dominios de unión al antígeno incluyendo, pero sin limitarse a, regiones VH (VH, VH-VH), anticalina, PepBodies™, fusiones epítopo de células T-anticuerpo (Troybodies) o Peptibodies. "Fragmento de anticuerpo" y "fragmento de unión al antígeno" tienen el mismo significado y se usan equivalentemente en la presente.
Un anticuerpo monoclonal se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos prácticamente homogéneos, por ejemplo, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por las posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en menor cantidad. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, y se dirigidos contra un sitio antigénico único. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpo convencionales (por ejemplo, policlonal) que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (por ejemplo, epítopos) en un antígeno, cada anticuerpo monoclonal se dirige contra al menos un único determinante en el antígeno. El "monoclonal" modificador indica el carácter del anticuerpo que se obtiene a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, y no se construye como requiriendo la producción del anticuerpo por cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden preparar por el método del hibridoma descrito primero por Kohler y otros, Nature 256:495 (1975), o se pueden preparar por métodos de ADN recombinante (ver, por ejemplo, patente de US No.4,816,567). Los anticuerpos monoclonales se pueden aislar también a partir de librerías de anticuerpos fagos, por ejemplo, usando las técnicas descritas en Clackson y otros, Nature 352:624-628 (1991 ) y Marks y otros, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991). Los anticuerpos monoclonales se pueden aislar también usando las técnicas descritas en las patentes de US Nos. 6,025,155 y 6,077,677 así. como la publicación de las solicitudes de patente de US Nos. 2002/0160970 y 2003/0083293 (ver además, por ejemplo, Lindenbaum, y otros, ácidos nucleicos Research 32 (21):0177 (2004)).
Los anticuerpos monoclonales pueden incluir anticuerpos quiméricos en los cuales una porción de la cadena ligera y/o pesada es idéntica con u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la cadena(s) es idéntica con u homologa a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de esos anticuerpos, en la medida que ellos exhiban la actividad biológica deseada {ver, por ejemplo, la patente de US No. 4,816,567; y Morrison y otros, Proc. Nati. Acad Sci. USA 81 : 6851-6855 (1984) para anticuerpos quiméricos de ratón-humano).
Una región hipervariable se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que es responsable para la unión al antígeno. La región hipervariable comprende residuos de aminoácidos a partir de una región determinante de complementariedad o CDR (por ejemplo, residuos 24-34 (L1 ), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en la dominio variable de cadena ligera y 31-35 (H1 ), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabat y otros, secuencias of Proteins of Immunological Interest, 5ta Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) y/o los residuos a partir de un lazo hipervariable {por ejemplo, residuos 26-32 (L1 ), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (H1 ), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Los residuos FR o marcos son aquellos residuos de dominio variable distintos de los residuos de región hipervariable. Para los anticuerpos descritos en la presente descripción, las regiones marco y CDR se identifican en base al sistema de numeración de Kabat excepto que la CDR1 de la cadena pesada se define por la definición AbM de Oxford Molecular como abarcando los residuos 26 a 35. El software de modelaje del anticuerpo AbM de Oxford Molecular (http://people.cryst.cck.ac.uk/~ubc07s/) (Martin y otros, Proc. Nati Acad. Sci. Estados Unidos, 86, 9268-9272 (1989); Martin y otros., Methods Enzymol., 203, 121-153 (1991); Pedersen y otros, Immunomethods, 1 , 126 (1992); y Rees y otros, en Stemberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172. (1996)) combina sistemas de numeración de la CDR de Kabat y la región hipervariable de Chothia para definir las CDR.
Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos {por ejemplo, murino) pueden ser anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor o aceptor) en cuya región hipervariable los residuos del receptor se reemplazan por los residuos de la región hipervariable a partir de una especie no humana (anticuerpo dador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano con la especificidad, afinidad, y capacidad deseada. Adicionalmente, uno individual o grupos de residuos de región marco (FR) Fv de la inmunoglobulina humana se pueden reemplazar por los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo dador. Estas modificaciones se hacen para retinar después el rendimiento del anticuerpo. Generalmente, el anticuerpo humanizado comprenderá prácticamente todo de al menos uno, y típicamente dos, regiones o dominios variables, en los que todos o prácticamente todos los lazos hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todos o prácticamente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente además comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (por ejemplo, Fe), típicamente aquella de una inmunoglobulina humana {ver, por ejemplo, Queen y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:10029 (1989), y Foote y Winter, J. Mol. Biol. 224: 487 (1992)).
Los fragmentos de anticuerpo de Fv de cadena sencilla o scFv pueden comprender las regiones o dominios de anticuerpo VH y VL, en donde esos dominios se presentan en una cadena de polipéptido sencilla. Generalmente, el polipéptido Fv comprende además un enlazador de polipéptido entre los dominios VH y VL que permite que scFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno (para una revisión, ver, por ejemplo, Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 1 13, Rosenburg y Moore eds. Springer-Verlag, Nueva York, pp. 269-315 (1994)).
Diacuerpo se refiere a los fragmentos pequeños del anticuerpo con dos sitios de unión antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Al usar un ligando que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se ven obligados a parear con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión al antígeno. Los diacuerpos se describen más detalladamente en, por ejemplo, EP 404,097; WO 93/1 1161 ; y Hollinger y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993).
Anticuerpo lineal se refiere a anticuerpos tales como los descritos en Zapata y otros, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 ( 995). En resumen, estos anticuerpos comprenden un par de Fd en tándem (VH -CH1- VH -CH1) los cuales forman un par de regiones de unión al antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.
Un anticuerpo aislado se refiere a uno que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que pudieran interferir con el uso terapéutico o de diagnóstico para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteinaceos o no proteinaceos. En modalidades preferidas, el anticuerpo se purificará (1) más de 95% en peso del anticuerpo determinado por el método de Lowry, y con la máxima preferencia mayor que 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácido interna o N-terminal por el uso de un secuenciador de copa centrífugo, o (3) hasta la homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o, preferentemente, tintura de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Ordinariamente, sin embargo, el anticuerpo aislado será preparado por al menos una etapa de purificación.
Un anticuerpo etiquetado con epítopo se refiere a uno donde el anticuerpo de la invención se fusiona a una etiqueta del epítopo. El polipéptido etiqueta del epítopo tiene suficientes residuos para proporcionar un epítopo contra el cual se pueda preparar un anticuerpo contrario, y es lo suficientemente corto de manera que no interfiere con la actividad del anticuerpo de anti-integrina a2ß1. La etiqueta del epítopo preferentemente es suficientemente única para que el anticuerpo en contra no reaccione prácticamente de manera cruzada con otros epítopos. Los polipéptidos etiqueta adecuados generalmente tienen al menos 6 residuos de aminoácidos y usualmente entre aproximadamente 8-50 residuos de aminoácidos (preferentemente entre aproximadamente 9-30 residuos). Los ejemplos incluyen el polipéptido etiqueta flu HA y su anticuerpo 12CA5 (Field y otros, Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165 (1988)); la etiqueta c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 de ellos (Evan y otros, Mol. Cell. Biol. 5(12):3610-3616 (1985)); y la etiqueta de glicoproteína D (gD) del virus de Herpes Símplex y su anticuerpo (Paborsky y otros, Protein Engineering 3(6): 547-553 (1990)). En ciertas modalidades, la etiqueta del epítopo es un epítopo de unión al receptor salvaje el cual es un epítopo de la región Fe de una molécula de IgG (por ejemplo, IgG^ lgG2, lgG3, o lgG4) que es responsable de aumentar la vida media en suero en vivo de la molécula de IgG .
Un agente citotoxico se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de las células y/o causa destrucción de las células. Este puede incluir isótopos radiactivo (por ejemplo, 1311, 125l, 90Y y 186Re), agentes quimioterapéuticos, y toxinas como las toxinas enzimáticamente activas de origen de bacterias, fúngico, plantas o animal, o fragmentos de éstas. Un agente no citotoxico se refiere a una sustancia que no inhibe o previene la función de las células y/o no provoca destrucción de las células. Un agente no citotoxico puede incluir un agente que se puede activar para hacerse citotoxico. Un agente no citotoxico puede incluir una perla, liposoma, matriz o partícula (ver, por ejemplo, las publicaciones de patente de US 2003/0028071 y 2003/0032995 las que se incorporan como referencia en la presente descripción). Esos agentes se pueden conjugar, acoplar, enlazar o asociar con un anticuerpo anti- integrina a2ß1 como es descrito en la presente descripción.
Un agente quimioterapéutico se refiere a un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen pero sin limitarse a Adriamicina, Doxorubicina, 5-Fluorouracil, Arabinósido de citosina ("Ara-C"), Ciclofosfamida, Tiotepa, Taxotere (docetaxel), Busulfan, Citoxina, Taxol, Metotrexato, Cisplatino, Melfalano, Vinblastina, Bleomicina, Etoposido, Ifosfamida, Mitomicina C, Mitoxantrona, Vincreistina, Vinorelbina, Carboplatino, Teniposido, Daunomicina, Carminomicina, Aminopterina, Dactinomicina, Mitomicinas, Esperamicinas (ver Pat US No. 4,675,187), Melfalano y otras mostazas de nitrógeno relacionadas.
Un profármaco se refiere a un . precursor o forma de derivado de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica para las células tumorales comparado con el fármaco original y es capaz de activarse enzimáticamente o convertirse en la forma original más activa (ver, por ejemplo, Wilman, "Prodrugs in Cáncer Chemoterapia" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615va Meeting Belfast (1986) y Stella y otros, "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt y oíros, (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985). Los profármacos incluyen, pero no se limitan a, profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptidos, profármacos modificados de D-aminoácido, profármacos glicosilados, fármacos que contienen ß-lactama, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituidos o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituidos, 5-fluorocitosina y otros profármacos de 5-fluorouridina que se pueden convertir en el fármaco libre citotóxico más activo. Los ejemplos de fármacos citotóxicos que se pueden derivar en una forma de profármaco pueden ser los agentes quimioterapéuticos descritos anteriormente.
Una marcador se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga o acopla directamente o indirectamente al anticuerpo. La marca se. puede detectar por sí misma (por ejemplo, los marcadores de radioisótopos o marcadores de fluorescencia) o, en el caso de un marcador enzimático, que puede catalizar la modificación química de un compuesto o una composición de sustrato que se detecta.
La fase sólida se refiere a un matriz no acuosa a la cual el anticuerpo de la presente invención puede adherirse. Los ejemplos de fases sólidas abarcados en la presente descripción incluyen aquellas formadas parcialmente o enteramente de vidrio (por ejemplo, vidrio de poro controlado), polisacáridos (por ejemplo, agarosa), poliacrilaminas, poliestireno, alcohol polivinílico y siliconas. En ciertas modalidades, dependiendo del contexto, la fase -sólida puede comprender el pocilio de una placa de ensayo; en otros es una columna de purificación (por ejemplo, una columna de cromatografía de afinidad). Este término además incluye una fase sólida discontinua de partículas distintas, tal como, las descritas en la patente de US No.4,275,149.
Los términos "régimen de dosificación una vez cada dos semanas", "dosificación una vez cada dos semanas", y "administración una vez cada dos semanas", como se usa en la presente descripción, se refiere al curso de tiempo de la administración de una sustancia (por ejemplo, anticuerpo anti-ct2 integrina) a un sujeto para alcanzar un objetivo terapéutico (por ejemplo, el tratamiento de un cáncer). El régimen de dosificación una vez cada dos semanas no pretende incluir un régimen de dosificación semanal. Preferentemente, la sustancia se administra cada 9-19 días, con mayor preferencia, cada 11-17 días, aún con mayor preferencia, cada 13-15 días, y con la máxima preferencia, cada 14 días.
Un liposoma se refiere a una vesícula pequeña compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolipidos y/o surfactante el cual es útil para suministrar un fármaco (tal como los anticuerpos de la invención y, opcionalmente, un agente quimioterapéutico) a un mamífero. Los componentes del liposoma se disponen comúnmente en una formación bicapa, similar al arreglo de lípidos de las membranas biológicas.
Una molécula de ácido nucleico aislada se refiere a una molécula de ácido nucleico que es identificada y separada a partir de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la cual se asocia ordinariamente en la fuente natural del ácido nucleico del anticuerpo. Una molécula de ácido nucleico aislada es distinta de la forma o arreglo en el cual se encuentra en la naturaleza.
Las moléculas de ácido nucleico aisladas por lo tanto se distinguen de la molécula de ácido nucleico que existe en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en las células que expresan ordinariamente el anticuerpo donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una ubicación del cromosoma diferente' de aquel de las células naturales.
Un vector viral se refiere a un vehículo para la transferencia de un ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN) a las células a través de la transducción o infección viral. Los ejemplos de vectores virales incluyen retrovirus, adenovirus, pox virus, y baculovirus.
Un vector no viral se refiere a un vehículo de ácido nucleico tal como un CAN, plásmido o cromosoma que se entrega a las células por métodos no virales como electroporacion, inyección, y transfección mediada por un reactivo catiónico.
Las secuencias de control de la expresión se refieren a las secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante operablemente unida en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para los organismos procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente un secuencia operadora, y un sitio de unión al ribosoma. Se conoce que las células eucariotas usan promotores, señales de poliadenilacíón, y potenciadores.
Un ácido nucleico está operablemente unido cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o guía secretora está operablemente unido al ADN para un polipéptido si se expresa como un preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operablemente unido a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está operablemente unido a una secuencia codificante si se posiciona para facilitar la traducción. Generalmente, las secuencias de ADN operablemente unidas son contiguas, y, en el caso de una guía secretora, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. El enlazamiento se realiza por ligación en los sitios de restricción convenientes. Si esos sitios no existes, los adaptadores o enlazadores del oligonucleótido sintético se usan de acuerdo con la práctica convencional.
La célula, línea celular, y cultivo de célula son a menudo usados intercambiablemente y todas esas designaciones incluyen a la progenie. Las células transformantes y transformadas (por ejemplo, obtenidas por transfección, transformación o transducción de ácidos nucleicos, vectores, virus, etc.) incluyen la célula sujeto primaria y los cultivos derivados de ahí sin importar el número de transferencias. Se entiende además que toda la progenie no tiene que ser precisamente idéntica en el contenido de ADN, debido a las mutaciones deliberadas o inadvertidas. La progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la seleccionada en la célula originalmente transformada se incluye. Donde se usen distintas designaciones, quedará claro del contexto.
Los anticuerpos humanizados como los descritos en la presente descripción incluyen los anticuerpos que tienen marcos de región variable derivados de una molécula de anticuerpo aceptora humana, secuencias hipervariables o CDR de un anticuerpo dador murino, y regiones constantes, si están presentes, derivadas de secuencias humanas.
Los anticuerpos humanizados usados en la presente invención se construyeron comprendiendo las CDR de las regiones variables de cadena pesada y variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal murino clon BHA2.1 (Hangan / otros, Cáncer Res. 56:3142-3149 (1996)). Los materiales de partida para construir los anticuerpos son los anticuerpos anti-integrinas ct2 tales como los secretados por el hibridoma BHA2.1 {por ejemplo, TMC-2206) que son anticuerpos que bloquean la función dirigidos contra la integrina a2 humana y son dependientes de la unión y actividad en presencia de un dominio intacto dentro de la integrina a.2 marcada. Son preferidos los anticuerpos humanizados con la especificidad del epítopo de TMC-2206 (o BHA2.1), incluyendo anticuerpos que se unen a la configuración inactiva de la molécula de la integrina oc2, y/o no actúan como miméticos de ligandos. Son preferidos los anticuerpos humanizados con la especificidad del epítopo de TMC-2206 (o BHA2.1 ) que, aunque ellos interactuan con la integrina a2ß1 presente en los leucocitos y plaquetas, no causan activación plaquetaria, agregación defectuosa de las plaquetas activadas en colágeno, tienen efecto mínimo o no tienen efecto en sangrado y/o no se asocian con complicaciones de sangramiento a concentraciones administradas, incluyendo dosis terapéuticas in vivo.
Los anticuerpos se pueden construir en donde la molécula aceptora humana para la región variable de cadena ligera se selecciona en base a las consideraciones de homología entre las regiones variables de la molécula aceptora potencial y con la región variable de cadena ligera del anticuerpo murino. Las moléculas aceptoras humanas candidatas de línea germinal se prefieren para reducir antigenicidad potencial. Las bases de datos de líneas germinales se hacen de secuencias de anticuerpo que se leen a través del extremo de la región FW3 de cadena pesada y parcialmente en la secuencia CDR3. Para la selección de una región FW4, se prefiere buscar en bases de datos de secuencias de anticuerpo madura que se deriven de la molécula de línea germinal seleccionada, y además se prefiere seleccionar una región FW4 razonablemente homologa para usar en la molécula de anticuerpo recombinante. Las moléculas aceptoras humanas son preferentemente seleccionadas de la misma clase de cadena ligera que la molécula donante murina, y de la misma clase estructural clásica de la región variable de la molécula donante murina. Consideraciones secundarias para la selección de la molécula aceptora humana para la región variable de cadena ligera incluye homología en la longitud CDR entre la molécula donante murina y la molécula aceptora humana. Las moléculas de anticuerpo aceptoras humanas son preferentemente seleccionadas por búsqueda de homología con la base de datos V-BASE, y se pueden usar también otras bases de datos tales como las bases de datos de Kabat y la NCBI pública. Para los anticuerpos anti- integrina a2 humanizados con una especificidad del epítopo igual o similar y/o propiedades funcionales como TMC-2206, una molécula aceptora humana de cadena ligera preferida es la sec. con núm. de ident.:37 con la secuencia de anticuerpo de línea germinal A14 para la región FW 1-3 y la secuencia FGQGTKVEIK para FW4 (sec. con núm. de ident.:38) que representa una FW-4 común de cadenas ligeras maduras kappa 1 {por ejemplo, secuencia de cadena ligera AAB24132 (NCBI entrada gi/259596/gb/AAB24132).
Los anticuerpos se pueden construir en donde la molécula aceptora humana para la región variable de cadena pesada se selecciona en base a las consideraciones de homología entre las regiones variables de la molécula aceptora potencial y la región variable de cadena pesada del anticuerpo murino. Las moléculas aceptoras humanas candidatas de línea germinal se prefieren para reducir antigenicidad potencial. Las bases de datos de líneas germinales se hacen de secuencias de anticuerpo que se leen a través del extremo de la región FW3 de cadena pesada y parcialmente en la secuencia CDR3. Para la selección de una región FW4, se prefiere buscar en bases de datos de secuencias de anticuerpo madura que se deriven de la molécula de línea germinal seleccionada, y además se prefiere seleccionar una región FW4 razonablemente homologa para usar usar en la molécula de anticuerpo recombinante. Las moléculas aceptoras humanas son preferentemente seleccionadas de la misma clase de cadena pesada que la molécula donante murina, y de la misma clase estructural clásica de la región variable de la molécula donante murina. Consideraciones secundarias para la selección de la molécula aceptora humana para la región variable de cadena pesada incluye homología en la longitud CDR entre la molécula donante murina y la molécula aceptora humana. Las moléculas de anticuerpo aceptoras humanas son preferentemente seleccionadas por búsqueda de homología con la base de datos V-BASE, aunque se pueden usar también otras bases de datos tales como las bases de datos de Kabat y la NCBI pública. Para los anticuerpos anti- integrina al con igual o similar especificidad del epítopo y/o propiedades funcionales que TMC-2206, una molécula aceptora de cadena pesada preferida es la sec. con núm. de ident.:39 con la secuencia de anticuerpo de la línea germinal 4-59 para la región FW 1-3 (sec. con núm. de ident.:12) y anticuerpo, CAA48104.1 (NCBI entrada, gi/33583/emb/CAA48104.1) un anticuerpo maduro derivado de la secuencia de la línea germinal 4-59 para la región FW4 (sec. con núm. de ident.:13) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
Los métodos para humanizar un anticuerpo al integrina no humano se conocen por las personas expertas y se describen por ejemplo en WO2007/056858. Para humanizar un anticuerpo anti-a2 integrina, el material de partida del anticuerpo no humano se obtiene, incluyendo por preparación a partir de inmunización o por compra de anticuerpos comercialmente disponibles. Las técnicas ilustrativas para generar anticuerpos usadas en la presente invención se describen en WO2007/056858.
El antígeno a2ß1 integrina que se usa para la producción de anticuerpos puede ser, por ejemplo, una forma soluble dea2pi integrina u otro fragmento de a2ß1 integrina (por ejemplo, un fragmento a2ß1 integrina que comprende un dominio I de al integrina humana (sec. con núm. de ident.:11); ver además, por ejemplo., sec. con núm. de ident.: 107). Otras formas de al integrina útil para generar anticuerpos resultará evidente a aquellos con experiencia en la materia en base a la secuencia de integrina al (por ejemplo, una integrina al humana como en la sec. con núm. de ident.:8).
Los anticuerpos policlonales son preferentemente elevados en los animales por inyecciones múltiples subcutáneas (se), intravenosas (iv) o intraperitoneal (ip) del relevante antígeno con o sin un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante a una proteina que es inmunogénica en las especies a ser inmunizadas, por ejemplo, hemocianina modificada de lapa, albúmina sérica, tiroglobulina bovina, o inhibidor de tripsina de soya usando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de los residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de los residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCI2, o R1N=C=NR, donde R y R1 son grupos alquilo diferentes.
Los animales se pueden inmunizar contra el antígeno, conjugados inmunogénicos, o derivados al combinar el antígeno o conjugado (por ejemplo, 100 g para conejos o 5 pg para ratones) con 3 volúmenes del adyuvante completo de Freund e inyectando la solución intradérmicamente en múltiples sitios. Un mes después, los animales se estimulan con el antígeno o conjugado (por ejemplo, con 1/5 a 1/10 de la cantidad original usada para inmunizar) en adyuvante completo de Freund por inyección subcutánea en múltiples sitios. Siete a 14 días después los animales se desangran y el suero se ensaya para el titulo del anticuerpo. Los animales se estimulan hasta la meseta del titulo. Preferentemente, para inmunizaciones del conjugado, el animal se estimula con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado para una proteína diferente y/o a través de un reactivo de entrecruzamiento diferente. Los conjugados además se pueden preparar en cultivo de células recombinantes como fusiones de proteína. Además, los agentes de agregación tales como alumbre son usados adecuadamente para mejorar la respuesta inmune.
Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando el método del hibridoma descrito primero por Kohler y otros, Nature, 256: 495 (1975), o se pueden preparar por métodos de ADN recombinantes (por ejemplo, patente de US No. 6,204,023). Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar también usando las técnicas descritas en las patentes de US Nos.. 6,025,155 y 6,077,677 así como la publicación de las solicitudes de patente de US Nos. 2002/0160970 y 2003/0083293 (ver también, por ejemplo, Lindenbaum, y otros, Nucleic Acids Research 32 (21):0177 (2004)).
En el método del hibridoma, un ratón o cualquier otro animal huésped adecuado, tal como una rata, hámster o mono, es inmunizado (por ejemplo, como se describió anteriormente en la presente) para obtener linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al antígeno usado para inmunización. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro. Los linfocitos después se fusionan con las células del mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (ver, por ejemplo, Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).
Las células de hibridoma así preparadas se siembran y cultivan en un medio de cultivo adecuado que preferentemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma, parentales, no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT), cuyas sustancias evitan el crecimiento de células deficientes en HGPRT.
Las células de mieloma preferidas son aquellas que se fusionan eficazmente, soportan la producción de anticuerpo de alto nivel estable por las células seleccionadas que producen anticuerpo, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Entre estas, las líneas celulares de mieloma preferidas son las líneas de mieloma murinas, tal como las derivadas de MOP-21 y de tumores de ratón M.C.-11 disponibles de Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif.
Estados Unidos, y las células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles de la American Type Culture Collection, Rockville, d. Estados Unidos. Las líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma humano-ratón también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (por ejemplo, Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur y otros, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)).
El medio de cultivo en el cual las células de hibridoma crecen se ensayó para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferentemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o por un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).
La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal se puede determinar, por ejemplo, por el análisis Scatchard de Munson y otros, Anal. Biochem., 107: 220 (1980).
Después que las células de hibridoma se identifican que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad, y/o actividad deseada, los clones pueden subclonarse al limitar los procedimientos de dilución y crecimiento por métodos estándares (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies y Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma se pueden cultivar in vivo como tumores ascitis en un animal.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, fluido ascitis, o suero por procedimientos convencionales de purificación de immunoglobulina incluyendo, por ejemplo, cromatografía de la proteína A, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, y/o cromatografía de afinidad.
El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aisla fácilmente y es secuenciado usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos monoclonales). Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de tal ADN. Una vez aislados, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, los cuales son después transfectados en células huésped tal como las células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO), o células de mieloma, incluyendo las que no producen de otra forma proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. La producción recombinante de los anticuerpos se describe con más detalle a continuación.
En ciertas modalidades, pudiera ser deseable generar variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo humanizado, particularmente donde estas mejoren la afinidad de unión u otras propiedades biológicas del anticuerpo humanizado.
Las variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-integrina a2ß1 humanizado se preparan introduciendo cambios de nucleótidos adecuados en un ADN del anticuerpo anti-integrina a2ß1 humanizado, o por síntesis de péptidos. Esas variantes incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de, residuos de las secuencias de aminoácidos mostradas para el anticuerpo anti-a2 integrina TMC-2206 (por ejemplo, derivado de o basado en las secuencias de región variable como se muestra en la sec. con núm. de ident: 19 y 21). Cualquier combinación de deleción, inserción, y sustitución de aminoácido se hace para llegar al constructo final, siempre que el constructo final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácido además pueden alterar los procesos de post-traducción del anticuerpo anti-a2 integrin humanizado, tal como modificar el número o la posición de sitios de glicosilación.
Existe un número de métodos usados para preparar anticuerpos humanos o similares a los humanos (por ejemplo, "humanización"). Los enfoques para humanizar los anticuerpos han variado a lo largo de los años. Un enfoque fue generar regiones variables murinas fusionadas a regiones constantes humanas, llamadas quimeras Fe murina-humana (ver, por ejemplo, Morrison y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 81 :6851-6855 (1984); Patente U.S. No, 5,807,715). Otro enfoque explotó el hecho de que las CDR se pudieran identificar fácilmente en base a su naturaleza hipervariable (Kabat y otros, J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977)), Kabat, Adv. Protein Chem. 32:1-75 (1978)) y estructura canónica (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196(4):901-17 (1987); Lazakani y otros, J. Mol. Biol. 272:929 (1997) y humanizar por injerto justo en las regiones CDR no-humanas (referido como CDR dador) en un marco humano (referido como marco aceptor) como se muestra, por ejemplo por Jones y otros, Nature 321 (6069):522-5 (1986); (ver, por ejemplo, patente de US No.5,225,539; patente de US No.6,548,640). Los seis lazos CDR se presentan en un grupo, y basado en el análisis cristalográfico, marcos residuos críticos dentro de la llamada zona "Vernier" flanquean las CDR o en la inferíase de cadena ligera-pesada pueden ser fácilmente identificados {ver, por ejemplo, Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196(4):901- 7 (1987); Chothia y otros, J. Mol. Biol. 186(3):651-63 (1985); Chothia y otros, Nature 342(6252):877-83 (1989)). Esos residuos pueden ser retro-mutados al residuo murino para restaurar la orientación correcta relativa de las seis CDR (ver, por ejemplo, Verhoyen y otros, Science 239(4847): 1534-6 (1988); Reichman y otros, Nature 332(6162):323-7 (1988); Tempest y otros, Biotechnology (NY) 9(3):266-71 (1991)). Ya que las regiones variables se pueden clasificar en familias que portan una homología relativamente alta entre ratón y humano (revisado en por ejemplo, Pascual y Capra Adv. Immunol. 49:1-74 (1991)), estos tempranos estudios también indicaban que el potencial para las pérdidas de afinidad se pudiera minimizar en el anticuerpo injertado seleccionando la secuencia de la línea germinal humana con la más alta homología para el anticuerpo murino de interés para usar como la molécula aceptora humana {ver, por ejemplo, patente de US No.5,225,539; Verhoyen y otros, Science 239(4847): 1534-6 (1988)).
Las homologías de familia y relaciones estructurales entre marcos que impactan la correcta presentación de un tipo dado de estructura canónica CDR se reportaron {ver, por ejemplo, Al-Lazakani y otros., J. Mol. Biol. 273(4):927-48 (1997) y las referencias que encontramos en éste). Preferentemente, se escoge un mejor ajuste de la secuencia de la línea germinal o humana. Las bases de datos disponibles de las secuencias de la línea germinal del anticuerpo se pueden usar para determinar el subtipo de familia de una cadena ligera y pesada murina dada y para identificar el mejor ajuste de secuencias útil como marcos aceptores humanos dentro de esa subfamilia humana. La homología de aminoácidos lineal de los marcos dador y aceptor, así como la estructura canónica de CDR son preferentemente tomados en cuenta.
Ejemplos de residuos de cadena pesada que puede ser sustituidos en un anticuerpo anti-<x2 integrina humanizado incluye cualquiera de uno o más de los siguientes números de marcos residuo: H37, H48, H67, H71 , H73, H78 y H91 (sistema de numeración de Kabat). Preferentemente, al menos cuatro de estos marcos residuos son sustituidos. Un conjunto de sustituciones particularmente preferidas para la cadena pesada en anticuerpos anti-a2 integrina humanizados como se ejemplifica en la presente descripción es H37, H71 , H73 y H78. Similarmente, los residuos en la cadena ligera se pueden sustituir también. Ejemplos de residuos de cadena ligera para la sustitución incluyen cualquiera de uno o más de los siguientes números de residuos: L1 , L2, L4, L6, L46, L47, L49 y L71. Preferentemente al menos tres de estos residuos marcos se sustituyen. Un conjunto particularmente preferible de sustituciones para la cadena ligera en anticuerpos anti-o 2 integrina humanizados como se ejemplifica en la presente descripción es L2, L46 y L49.
Un método útil para la identificación de ciertos residuos o regiones de un anticuerpo anti-a2 integrina humanizado que son localizaciones preferidas para la mutagénesis se llama "mutagenesis por barrido con alanina" {ver, por ejemplo, Cunningham y Wells Science, 244: 1081-1085 (1989)). Aquí, un residuo o grupo de residuos objetivos se identifican (por ejemplo, residuos cargados como arg, asp, his, lys, y glu) y se reemplazan por un aminoácido cargado neutro o negativamente (preferentemente alanina o polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con-antígeno de integrina a2ß1. Las localizaciones de aminoácido que demuestran sensibilidad funcional para las sustituciones después se refinaron por introducción posterior de otras variantes en, o para, los sitios de sustitución. Así, mientras que el sitio para introducir una variación en la secuencia de aminoácido se predetermina, la naturaleza de la mutación per se no necesita ser predeterminada. Por ejemplo, para analizar el desempeño de una mutación en un sitio dado, la mutagenesis de barrido con ala o aleatoria se lleva a cabo en el codon o región objetivo y las variantes del anticuerpo anti-cc2 ¡ntegrina humanizado expresado se tamizan para la actividad deseada Las inserciones de secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino- y/o carboxil- terminales en el intervalo de longitud de un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuencia de uno o múltiples residuos de aminoácidos. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo anti-a2 integrina humanizado con un residuo metionil N-terminal o el anticuerpo fusionado a una etiqueta del epítopo. Otras variantes de inserción de una molécula de anticuerpo anti-a2 integrina humanizado incluyen la fusión al N- o C-terminal de un anticuerpo anti-a2 integrina humanizado de una enzima o un polipéptido que aumenta la vida media en suero del anticuerpo (ver abajo).
Otro tipo de variante es un variante de sustitución de aminoácido. Estas variantes tienen al menos un aminoácido residuo en una molécula de anticuerpo anti-cc2 ¡ntegrina humanizado eliminado y un residuo diferente insertado en este lugar. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis de sustitución incluyen los lazos hipervariables, pero las alteraciones de los marcos - también se contemplan. Los residuos de marcos o residuos de región hipervariable involucrados en la unión al antígeno son generalmente sustituidos de manera relativamente conservativa. Tales sustituciones conservativas se muestran a continuación bajo el encabezamiento de "Sustituciones preferidas". Si estas sustituciones resultan en un cambio en la actividad biológica, entonces se introducen más cambios sustanciales, denominados "sustituciones ilustrativas" o como se describe abajo con referencia a las clases de aminoácidos, y se seleccionan los productos.
Las modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo se realizan al seleccionar las sustituciones que difieren significativamente en su efecto en el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una configuración de hoja o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en un sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos de origen natural se dividen en grupos basado en las propiedades de cadena lateral comunes : (1) hidrofóbico: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrofílico neutro: cys, ser, thr; (3) acídico : asp, glu; (4) básico: asn, gln, his, lys, arg; (5) residuos que influencian la orientación de la cadena : gly, pro; y (6) aromático: trp, tyr, phe.
Las sustituciones no conservativas implicarán intercambiar un miembro de una de esas clases para otra clase. Cualquier residuo de cisterna no involucrado en el matenimiento de la confirmación adecuada de un anticuerpo anti- integrina a2 humanizado se pueden sustituir también, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidante de la molécula y prevenir el entrecruzamiento aberrante. Contrariamente, los enlaces cisteína se pueden añadir al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv).
Otro tipo de variante de aminoácido del anticuerpo altera el patrón original de glicosilación del anticuerpo. Por alterar se entiende eliminar una o más porciones carbohidratos que se encuentran en el anticuerpo y/o añadir uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el anticuerpo.
La glicosilación de los anticuerpos es típicamente con enlaces N o con enlace O. con enlaces N se refiere a la unión de la porción carbohidrato a la cadena lateral de un residuo asparagina. Las secuencias tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la porción carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Así, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripéptido en un polipéptido crea un sitio potencial de glicosilación. La glicosilación con enlace O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-aceilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comunmente serina o treonina, aunque 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina también se pueden usar.
La adición o deleción de sitios de glicosilación al anticuerpo es convenientemente . realizada mediante la alteración de la secuencia de aminoácidos de modo que esta contiene o carece de una o más de las secuencias tripéptido anteriormente-descritas (para sitios de glicosilación con enlaces N). La alteración se pueden preparar también por la adición de, sustitución por, o deleción de, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilación con enlace O). Las moléculas de ácido nucleico que codifican las variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-cc2 integrina humanizado se preparan por una variedad de métodos conocidos en el arte. Los métodos incluyen, pero no se limitan a, aislamiento a partir de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia de aminoácidos de origen natural) o preparación por mutagénesis mediad por oligonucleótidos (o sitio dirigida), mutagénesis por PCR, o mutagénesis por inserción de un cásete de una variante preparada más temprano o una versión no variante del anticuerpo anti-a2 integrina humanizado.
Ordinariamente, variantes de secuencia de aminoácidos de un anticuerpo anti- integrina al humanizado tendrán una secuencia de aminoácido que tiene al menos 75% identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos del anticuerpo humanizado original de cualquiera la cadena ligera o pesada (por ejemplo, secuencias de región variable como en la sec. con núm. de ident.:21 o sec. con núm. de ident.:19, respectivamente), más preferentemente al menos 80%, más preferentemente al menos 85%, más preferentemente al menos 90%, y lo más preferentemente al menos 95%, incluyendo por ejemplo, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, y 100%. La identidad u homología con respecto a esta secuencia se define en la presente descripción como el porcentaje de residuos de aminoácidos en la secuencia candidata que son idénticos con los residuos anti-integrina a2 humanizados, después de alinear las secuencias e introducir interrupciones, si es necesario, para alcanzar el porcentaje máximo identidad de secuencia, y sin considerar cualquiera de las sustituciones conservativas como es descrito anteriormente) como parte de la identidad de secuencia. Ninguno del N-terminal, C-terminal, o extensiones internar, deleciones, o inserciones en la secuencia de anticuerpo se debe interpretar como que afecta la identidad de secuencia u homología. De esta manera la identidad de las secuencias se puede determinar por métodos estándares que se usan comúnmente para comparar la similitud en la posición de los aminoácidos de dos polipéptidos. Usando un programa de computadora tal como BLAST o FASTA, dos polipéptidos se alinean para una coincidencia óptima de sus respectivos aminoácidos (a lo largo de la longitud completa de una o ambas secuencias, o a lo largo de una porción pre-determinada de una o ambas secuencias). Los programas proporcionan una penalidad de abertura por defecto y a penalidad de interrupción por defecto, y una matriz de puntuación tal como PAM250 (una matriz de puntuación estándar; ver Dayhoff y otros, en Atlas of Protein Sequence and Structure, vol 5, supp. 3 (1978)) se pueden usar en conjunto con el programa de computadora. Por ejemplo, el porciento de identidad se puede calcular como: el número total de coincidencias idénticas multiplicado por 100 y después dividido por la suma de la longitud de la secuencia más larga con el tramo coincidente y el número de interrupciones introducidas en las secuencias más largas para alinear las dos secuencias.
Los anticuerpos que tienen las características identificadas en la presente descripción como siendo deseables en un anticuerpo anti- integrina a2 humanizado se seleccionan por métodos descritos en la presente descripción. Por ejemplo, los métodos para seleccionar los anticuerpos anti- integrina <x2 candidatos para las características y funcionalidades preferidas se proporcionan e incluyen seleccionar los anticuerpos que se unen al epítopo en el enlace de a2ß1 integrina por un anticuerpo de interés (por ejemplo, los que compiten con, inhiben o bloquean la unión del anticuerpo TMC-2206 a la integrina a2ß1 ). Los ensayos de bloqueo cruzado se pueden realizar y se describen, por ejemplo, en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lañe (1988). Además, o alternativamente, el mapeo del epítopo, por ejemplo, como se describe en Champe y otros, J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995), se puede realizar para determinar si el anticuerpo se une a un epítopo de interés.
La integrina a2ß1 inmobilizada se puede usar similarmente para determinar las potencias de unión relativas midiendo los valores K¡ en los ensayos de competencia. Por ejemplo, el Eu-TMC-2206 fluorescentemente marcado se usa en presencia de concentraciones variantes del anticuerpo candidato no marcado, por ejemplo, usando un sistema de ensayo similar al descrito anteriormente. Después de un tiempo de incubación específico, la cantidad de Eu-TMC-2206 unido se determinó. Las curvas de inhibición se ajustan con el modelo de "competencia de un sitio" usando el software Prism (GraphPad, Inc. CA) para obtener valores IC50 y calcular la K¡ usando la ecuación de Cheng y Prusoff (Biochem, Pharmacol. 22(23):3099-108(1973)).
Es deseable preparar, identificar y/o seleccionar los anticuerpos anti- integrina a2 humanizados que tienen propiedades de unión beneficiosas, por ejemplo, bajo las condiciones descritas en el Ejemplo 2 de WO2007/056858, en donde los anticuerpos candidatos se probaron para su capacidad de bloquear la adhesión celular mediada por la a2ß1 -integrina en comparación con TMC-2206 y el anticuerpo quimérico ratón-humano derivado de TMC-2206. Por ejemplo, las células CHO que expresan integrina ct2 humana y ß1 de hámster endógena (Symington y otros, J. Cell Biol. 120(2):523-35 (1993)) se preparan y etiquetan con CFSE (Molecule Probes, OR). Las células marcadas se preparan y la concentración de las células se ajusta; las células se mantienen en la oscuridad hasta que se usan. Una placa recubierta de colágeno (colágeno de la cola de rata Tipo I; BD Biosciences) se prepara y cada solución de anticuerpo serialmente diluida se añade a la placa de colágeno. Las células marcadas se añaden después al pocilio y la placa se incuba.
Después de lavar, las células se Usaron y se leyó la intensidad de la fluorescencia (excitación, 485 nm¡ emisión, 535 nm). Se calcula la actividad inhibidora de cada anticuerpo.
Adicionalmente, las constantes de unión de los anticuerpos candidatos para el ligando de integrina a2ß1 inmobilizado se puede calcular como se describe en el Ejemplo 2 de WO2007/056858. Los pocilios en una placa de microtitulación de 96 pocilios se recubren con a2ß1 -integrina de plaquetas (recubierto habitualmente con plaqueta humana a2ß1 por GTI Inc., Wl) y después bloqueada. Por ejemplo, para determinar la afinidad de TMC-2206 por su antígeno integrina a2, TMC-2206 fluorescentemente marcado o el anticuerpo de IgG de control del isotipo se usan. El anticuerpo fluorescentemente marcado, incluyendo Eu-TMC-2206 o IgG de control del isotipo Eu, se aplica a las placas de microtitulación de a2ß1 -integrina bloqueadas. Después de incubar las placas selladas para permitir que la interacción anticuerpo-antígeno alcance el equilibrio, las muestras se transfirieron de cada uno de los pocilios a un pocilio fresco que contiene una solución potenciadora para la medición de la etiqueta libre (sin unir). La solución potenciadora se añade además a los pocilios vacíos para la medición de la etiqueta unida. Los valores K<¡ del anticuerpo anti- integrina a2 se calculan por análisis Scatchard. La afinidad relativa de los derivados TMC-2206 (incluyendo anticuerpos humanizados derivados de o basados en TMC-2206) se puede determinar mediante la determinación del valor Ki en un ensayo de competencia. Por ejemplo, para el ensayo de competencia, TMC-2206 etiquetada con Eu se añade a los pocilios a2ß1 -recubiertos en presencia de anticuerpos anti- integrina <x2 no marcados, incluyendo TMC-2206 o anticuerpos quiméricos (incluyendo humanizados) derivados de o basados en TMC-2206, o anticuerpo IgG control del isotipo a varias concentraciones. Después de un periodo de incubación para alcanzar el equilibrio, los pocilios se lavan y los niveles de anticuerpo marcado enlazado se miden como etiqueta Eu retenida en cada pocilio. El valor Ki se puede derivar de los valores EC50 usando el valor Kd obtenido para el anticuerpo Eu-TMC-2206 por estudios de unión directa como se describió anteriormente.
En ciertas modalidades, el anticuerpo anti- integrina 2 humanizado es un fragmento de anticuerpo. Se han desarrollado varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, esos fragmentos se derivaron via digestión proteolítica de los anticuerpos intactos (ver, por ejemplo, Morimoto y otros, Journal of Biochemical y Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) y Brennan y otros, Science 229: 81 (1985)). Sin embargo, esos fragmentos se pueden producir directamente por células huésped recombinantes, tal como bacteria (ver, por ejemplo, Better y otros, Science 240(4855): 1041 -1043 (1988); patente de US No.6,204,023. Por ejemplo, los fragmentos Fab'-SH se pueden recuperar directamente de . coli y acoplar químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter y otros, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). De acuerdo con otro enfoque, los fragmentos F(ab')2 se pueden aislar directamente de cultivo de células huésped recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes para el profesional con experiencia.
En algunas modalidades, pudiera ser deseable generar anticuerpos anti- integrina a2 humanizados multiespecificos (por ejemplo, biespecífico) que tienen especificidades de unión por al menos dos epítopos diferentes. Los anticuerpos biespecíficos ejemplares (por ejemplo, con dos brazos de unión diferentes) pueden unirse a dos epítopos diferentes de la proteína integrina a2ß1 . Alternativamente, un brazo anti- integrina a2 se puede combinar con un brazo que se une a una molécula desencadenante en un leucocito tal como una molécula receptora de células T por ejemplo, CD2 o CD3), o receptores Fe para IgG (FcyR), tal como FcyR1 (CD64), FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16) de manera de enfocar los mecanismos de defensa celular en una célula que tiene una integrina a2ß1 unida a su superficie. Los anticuerpos biespecíficos se pueden usar para localizar agentes citotóxicos para las células con integrina a2ß1 unida a su superficie. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión de integrina a2ß1 un brazo que se une al agente citotóxico (por ejemplo, gelonina, saporina, anti-interferón alfa, vinca alcaloide, cadena de ricina A , o hapteno radioisótopo). Los anticuerpo biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo biespecíficos F(ab')2 ).
De acuerdo con otro enfoque para producir anticuerpos biespecíficos, la interfase entre un par de moléculas de anticuerpo pueden manipularse para maximizar el porcentaje de heterodímeros que son recuperado del cultivo de célula recombinante. La interfase preferida comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácido pequeñas se reemplazan con cadenas laterales más largas (por ejemplo, tirosina o triptófano). Las cavidades compensatorias de tamaño idéntico o más pequeño a las cadenas laterales largas se crearon en la interfase del segundo anticuerpo reemplazando las cadenas laterales de aminoácido largas con unas más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento de los heterodímeros sobre otros productos finales indeseados tales como los homodímeros (ver, por ejemplo, WO96/27011 ).
Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos reticulados o heteroconjugados. Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado se puede acoplar a avidina, el otro a biotina. Los anticuerpos heteroconjugados se pueden preparar usando cualquier método conveniente de entrecruzamiento. Los agentes de entrecruzamiento son bien conocidos en el arte, y se describen, por ejemplo, en la patente de US No. 4,676,980 conjuntamente con un número de técnicas de entrecruzamiento.
Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpo también se han descrito en la literatura. Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar usando enlace químico. Por ejemplo, Brennan y otros, (Science 229:81 (1985)) describen un procedimiento en donde los anticuerpos intactos se dividen proteolíticamente para generar los fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente formador de complejos ditiol arseníto sódico para estabilizar los ditioles vincal y evitar la formación de bisulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados se convierten entonces a derivados de tionitrobenzoato. Uno de los derivados Fab'-TNB se reconvierte entonces al Fab'-tiol mediante la reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden usar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.
Los fragmentos Fab'-SH recuperados de E. coli, se pueden acoplar químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Por ejemplo, Shalaby y otros, (J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)) describe la producción de una molécula del anticuerpo biespecífico F(ab')2 completamente humanizado. Donde cada fragmento Fab" se segregó separadamente a partir de E. coli y se sometió a acoplamiento químico directo in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico así formado fue capaz de unirse a células que sobreexpresan el receptor HER2 y células T humanas normales, así como desencadenar la actividad lítica de los linfocitos citotóxicos humanos contra las dianas de tumor mamario humano.
Se han descrito también varias técnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente a partir del cultivo de células recombinantes. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se han producido usando cremalleras de leucina (ver, por ejemplo, Kostgelny y otros, J. Immunol. 148(5): 1547-1553 (1992)). Los péptidos cremallera de leucina a partir de las proteínas Fos y Jun se unieron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes por fusión de genes. Los homodímeros del anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y después se re-oxidaron para formar heterodímeros de anticuerpo. Este método también se puede utilizar para la producción de heterodímeros de anticuerpo. La tecnología del diacuerpo (ver, por ejemplo, Hollinger y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden una región variable de cadena pesada (VH) conectada a una región variable de cadena ligera (VL) por un enlazador el cual es demasiado corto para permitir el pareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. En correspondencia, los dominios VH y VL de un fragmento se fuerzan para parease con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, formando de esta manera dos sitios de unión al antígeno. Otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpos biespecíficos por el uso de dímeros de cadena sencilla Fv (sFv o scFv) también ha sido reportado (ver, por ejemplo, Gruber y otros, J. Immunol. 152:5368 (1994)). Alternativamente, el anticuerpo biespecífico, puede ser un anticuerpo lineal, por ejemplo, producido como se describe en Zapata y otros, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995).
Los anticuerpos con más de dos valencias se contemplan. Por ejemplo, los anticuerpos triespecíficos se pueden preparar {ver, por ejemplo, Tutt y otros, J. Immunol. 147:60 (1991)).
Otras modificaciones del anticuerpo anti- integrina a2 humanizados se contemplan. Por ejemplo, pudiera ser deseable modificar el anticuerpo con respecto a la función efectora, de manera que se aumente o se disminuya la efectividad del anticuerpo, por ejemplo, en tratar el cáncer. El (los) residuo(s) de cisteína se pueden introducir en la región Fe, permitiendo de esta manera la formación de enlaces bisulfuro intercadena en la región. El anticuerpo homodimerico así generado puede tener capacidad de internalización mejorada y/o muerte celular mediada por el complemento aumentada (CMC) y/o citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) (ver por ejemplo, Carón y otros, J. Exp. Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B.J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)). Los anticuerpos homodiméricos con actividad anti tumoral mejorada se pueden preparar también usando reticuladores heterobifuncionales (ver, por ejemplo, aquellos descritos en Wolff y otros, Cáncer Research 53:2560-2565 (1993)). Alternativamente, un anticuerpo se puede manipular el cual tiene regiones Fe duales y puede de ese modo tener capacidades CMC y/o ADCC mejoradas (ver, por ejemplo, Stevenson y otros, Anti-Cancer fármaco Design 3:219-230 (1989)).
Los inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo anti- integrina a2 humanizado conjugado a una porción, por ejemplo, una molécula, composición, complejo, o agente, por ejemplo un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, hongos, planta o animal, o fragmentos de éstas), o un isótopo radiactivo (por ejemplo, una radioconjugado), para dirigir el agente a una célula, tejido u órgano que exprese la anti- integrina a2. Tal inmunoconjugado se puede usar en un método dirigir la porción o agente a un sitio particular de acción caracterizado por la presencia de integrina a2 o a2ß1.
Los agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de tales inmunoconjugados han sido descritos anteriormente. Las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de éstas que se pueden usar incluyen la cadena de difteria A, fragmentos activos sin unir de la toxina de la difteria, cadena de exotoxina A (a partir de Pseudomonas aeruginosa), cadena de ricina A, cadena de abrina A, cadena de modeccina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina o los tricotecenos. Una variedad de radionuclidos están disponibles para la producción de anticuerpos de anti-alfa 2 integrina radioconjugados. Los ejemplos incluyen 212 Bi, 131 ln, 90Y o 186Re.
Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se preparan usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncional tal como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tal como dimetil adipimidato HCL), ésteres activos (tal como disuccinimidil suberato), aldehidos (tal como gluteraldehído), compuestos bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina),derivados de bis-diazonio (tal como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tal como tolieno 2,6-diisocianato), o compuestos de flúor bis-activos (tal como 1 ,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, una inmunotoxina ricina se puede preparar como se describe en Vitetta y otros, Science 238:1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietileno triaminapenta acético marcado con carbono-14(MX-DTPA) es un agente quelante ilustrativo para la conjugación del radionúclido al anticuerpo (ver, por ejemplo, W094/1 1026).
En otra modalidad, el anticuerpo se puede conjugar a un receptor (tal como estreptavidina) para su utilización en predirigir la célula, tejido u órgano que expresa la integrina a.2, en donde el conjugado anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido por la eliminación del conjugado sin enlazar de la circulación usando un agente aclarante y después la administración de un ligando (por ejemplo, avidina) la cual se conjuga con un agente, por ejemplo un agente citotóxico (por ejemplo, un radionúclido).
Los anticuerpos anti- integrina oc2 descritos en la presente descripción se puede también formular como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan por métodos conocidos en el arte, tal como se describe en Epstein y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 82. 3688 (1985); Hwang y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 77: 4030 (1980); y las patentes de US Nos. 4,485,045 y 4,544,545, liposomas con tiempo de circulación mejorados se describen en la patente de US No. 5,013,556.
Particularmente, los liposomas útiles se pueden generar por el método de evaporación de fase inversa con una composición de lípidos que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas son extrudidos a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' de un anticuerpo anti- integrina a2 se pueden conjugar con los liposomas como se describe en Martin y otros, J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) via una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéutico (por ejemplo, doxorubicina) está opcionalmente contenido dentro del liposoma (ver, por ejemplo, Gabizon y otros, J. National Cáncer Inst. 81 (19): 1484 (1989)).
Los anticuerpos anti- integrina a2 humanizados también se pueden usar en la terapia con profármacos de enzimas dirigidas al anticuerpo (ADEPT) conjugando el anticuerpo a una enzima que activa el profármaco que convierte un profármaco (por ejemplo, un agente quimioterapéutico de peptidilo, ver, por ejemplo, WO81/01145) en un fármaco activo, (ver, por ejemplo, WO88/07378 y patente de US No.4,975,278). El componente enzimático del inmunoconjugado útil para ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar en un profármaco en cualquier manera que lo convierta en su forma más activa. Las enzimas que son útiles incluyen, pero no se limitan a, fosfatasa alcalina útil para convertir los profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; arilsulfatasa útil para convertir los profármacos que contienen sulfato en fármacos libres; citosina deaminasa útil para convertir la 5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco anti-cáncer, 5-fluorouracil; proteasas, tal como serratia proteasa, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasa y catepsinas (tal como catepsinas B y L), que son útiles para convertir profármacos que contienen péptidos en fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir los profármacos que contienen sustituyentes D-aminoácido; enzimas de escisión de carbohidratos tal como ß-galactosidasa y neuraminidasa útiles para convertir profármacos glicosilados en fármacos libres; ß-lactamasa útil para convertir los fármacos derivados con ß-lactamas en fármacos libres; y penicilina amidasas, tal como penicilina V amidasa o penicilina G amidasa, útiles para convertir los fármacos derivados en sus nitrógenos de amina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. Alternativamente, los anticuerpos con actividad enzimática, conocidos también como aczimas, se pueden usar para convertir los profármacos de la invención en fármacos libres activos (ver, por ejemplo, Massey, Nature 328: 457-458 (1987)). Los conjugados anticuerpp-aczima se pueden preparar como se describe en la presente descripción, incluyendo por entrega de la aczima a una célula, tejido u órgano que expresa la integrina a2.
Las enzimas se pueden enlazar covalentemente a los anticuerpos anti- integrina a2 por técnicas bien conocidas en el arte, incluyendo el uso de los reactivos de entrecruzamiento heterobifuncionales discutidos anteriormente. Alternativamente, las proteínas de fusión que comprenden al menos la unión a la región del antígeno de un anticuerpo anti- integrina <x2 unido al menos a una porción funcionalmente activa de una enzima se pueden construir usando técnicas de ADN recombinado bien conocidas en el arte (ver, por ejemplo, Neuberger y otros, Nature 312: 604-608 (1984)).
En ciertas modalidades de la invención, pudiera ser deseable usar un fragmento de anticuerpo, en lugar de un anticuerpo intacto, por ejemplo, para aumentar la penetración en el tejido o tumor. También puede ser deseable modificar el fragmento de anticuerpo para aumentar su media vida en suero. Esto se puede alcanzar incorporando un epítopo de unión al receptor de salvamento en el fragmento de anticuerpo, por ejemplo, por mutación de la región adecuada en el fragmento de anticuerpo incorporando el epítopo en una etiqueta péptido que es después fusionada al fragmento de anticuerpo en el extremo o en el medio, por ejemplo, por síntesis de ADN o péptido (ver, por ejemplo, W096/32478).
Las modificaciones covalentes de los anticuerpos anti- integrina a2 humanizados se pueden preparar, por ejemplo, por síntesis química o por escisión enzimática o química del anticuerpo. Otros tipos de modificaciones covalentes del anticuerpo se introducen en la molécula reaccionando los residuos objetivo de aminoácidos del anticuerpo con un agente orgánico derivatizante que es capaz de reaccionar con las cadenas laterales seleccionadas o los residuos N- o C-terminales. Los residuos cisteinil, por ejemplo, más comúnmente reaccionan con a-haloacetatos (y las aminas correspondientes), tal como ácido cloroacético o cloroacetamida, para dar derivados de carboximetil o carboxiamidometil . Los residuos cisteinil además se derivatizan por reacción con bromotrifluoroacetona, ácidoa-bromo-3-(5-imidozoil)propiónico, cloroacetil fosfato, N-alquilmaleimidas, 3-nitro-2-piridil disulfuro, metil 2-piridil disulfuro, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol, o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1 ,3-diazol. Los residuos histidil, por ejemplo, se derivatizan por reacción con dietilpirocarbonato a pH 5.5-7.0 porque este agente es relativamente específico para la cadena lateral de histidil. El para-bromofenacil bromuro también es útil; la reacción se realiza preferentemente en 0.1 M cacodilato sódico a pH 6.0. Los residuos lisinil y amino-terminal, por ejemplo, reaccionan con los anhídridos del ácido succínico u otros carboxílicos. La derivatización con esos agentes tiene el efecto de revertir la carga de los residuos de lisinil. Otros reactivos adecuados para derivatizar residuos que contienen a-amino incluyen imidoésteres tal como metil picolinimidato, piridoxal fosfato, piridoxal, cloroborohidruro, ácido trinitrobencenosulfónico, O-metilisourea, 2,4-pentanodiona, y la reacción catalizada con transaminasa con glioxilato. Los residuos de arginil, por ejemplo, son modificados por la reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1 ,2-ciclohexanodiona, y ninhidrina. La derivatización de los residuos de arginina requiere que la reacción se realice en condiciones alcalinas debido al pKa alto del grupo funcional de guanidina. Además, esos reactivos pueden reaccionan con los grupos de lisina así como el grupo epsilon-amino arginina. Los residuos de tirosil, por ejemplo, se modifican específicamente con interés particular en introducir las etiquetas espectrales en los residuos de tirosil por reacción con compuestos de diazonio aromáticos o tetranitrometano. Más comúnmente, N-acetilimidizol y tetranitrometano se usan para formar especies O-acetil tirosil y derivado 3-nitro, respectivamente. Los residuos de tirosil son yodados usando 125l o 1311 para preparar proteínas etiquetadas para uso en radioinmunoensayo. Los grupos laterales carboxilo, por ejemplo, aspartil o glutamilo, se modifican selectivamente por la reacción con carbodiimidas (R-N=C=N-R'), donde R y R' son grupos alquilo diferentes, tal como 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil) carbodiimida o 1-etil-3-(4- azon¡a-4,4-dimetilpentil) carbodiimida. Además, los residuos aspartil y glutamilo se convierten a residuos asparaginil y glutaminil por la reacción con iones amonio. Los residuos glutaminilo y asparaginilo se desamidan a menudo a los residuos correspondientes glutamil y aspartil, respectivamente. Estos residuos se desamidan bajo condiciones neutras o básicas. La forma desamidada de estos residuos se acepta dentro del alcance de esta invención. Otras modificaciones incluyen la hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de seril o treonil, metilación de gruposa-amino de cadenas laterales lisina, arginina, e histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), acetilación del N-terminal amina, y amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal .
Otro tipo de modificación covalente involucra el acoplamiento químico o enzimático de glicósidos al anticuerpo. Estos procedimientos son ventajosos porque no requieren la producción del anticuerpo en una célula húesped que tiene capacidades de glicosilación para la glicosilación con enlace O o N. Dependiendo del modo de acoplamiento usado, el(los) azúcar(es) pueden unirse a(a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilos libres, (c) grupos sulfhidrilos libres tales como aquellos de cisteína, (d) grupos hidroxilo libres tales como aquellos de serina, treonina, o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos tales como los de fenilalanina, tirosina, o triptófano, o (f) el grupo amida de glutamina (ver, por ejemplo, WO87/05330; Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981 )).
La eliminación de cualquiera de las porciones de carbohidrato presentes en el anticuerpo puede realizarse, por ejemplo, química o enzimáticamente. La deglicosilación química requiere exposición del anticuerpo al compuesto ácido trifluorometanosulfónico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento resulta en la escisión de la mayoría de los azúcares excepto el azúcar de enlace (N-acetilglucosamina o N-acetilgaláctosamina), mientras dejan el anticuerpo intacto {ver, por ejemplo, Hakimuddin, y otros, Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 (1987); Edge y otros, Anal. Biochem., 18: 131 (1981)). La escisión enzimática de porciones de carbohidrato en los anticuerpos se puede lograr por el uso de una variedad de endo- y exo-glicosidasas, (ver, por ejemplo, Thotakura y otros, Meth. Enzymol. 138: 350 (1987)).
Otro tipo de modificación covalente del anticuerpo comprende enlazar el anticuerpo a uno de una variedad de polímeros no proteinaceos, tal como polietilenglicol, polipropilenglicol, o polioxialquilenos (ver, por ejemplo, las patentes de US Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301 ,144; 4,670,417; 4,791 ,192 o 4,179,337).
Para la producción recombinante del anticuerpo, el(los) ácido(s) nucleico(s) que codifican para el anticuerpo se aislan e insertan en un vector replicable para la clonación posterior (amplificación del ADN) o para la expresión. El ADN que codifica el anticuerpo se aisla fácilmente y es secuenciado usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas ligera y pesada del anticuerpo). Muchos vectores están disponibles. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción.
Un anticuerpo anti- integrina a2 se puede producir recombinantemente, incluyendo como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo que es preferentemente una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión especifico en el N-terminal de la proteína o polipéptido maduro. La secuencia señal heteróloga seleccionada preferentemente es una que es reconocida y procesada (por ejemplo, escindida por una peptidasa señal) por la célula húesped. Para las células huésped procariotas que no reconocen y procesan una secuencia señal eucariota (por ejemplo, una secuencia señal de inmunoglobulina), la secuencia señal se sustituye por una secuencia señal procariota incluyendo, por ejemplo, líderes de pectato lisasa (tal como pelB), fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp, o enterotoxina II estable al calor. Para la secreción de levadura, una secuencia señal de levadura se puede utilizar, incluyendo, por ejemplo, la secuencia líder de levadura invertasa, un factor líder (incluyendo factores líderes de Saccharomyces y Kluyveromyces a), o secuencia líder de fosfatasa ácida, la secuencia líder de glucoamilasa de C. albicans, o la secuencia señal descritas en WO90/13646. En expresión de células en mamíferos, las secuencia señales de mamíferos así como las líderes secretoras virales, por ejemplo, la señal gD de herpes simplex, están disponibles y pueden ser utilizadas. El ADN para esa región precursora (por ejemplo, la secuencia señal) está ligada en el marco de lectura al ADN que codifica un anticuerpo anti- integrina a2.
Ambos vectores de expresión y clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas . Generalmente en los vectores de clonación, esta secuencia es una que permite al vector replicarse independientemente del ADN cromosomal del hospedero e incluye orígenes de replicación o secuencias de replicación autónomas. Tales secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. Por ejemplo, el origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias gram-negativo, el origen del plásmido de 2 µ es adecuado para levadura, y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para los vectores de clonación en células de mamíferos Generalmente, el origen del componente de replicación no es necesario para vectores de expresión de mamíferos (por ejemplo, el origen SV40 se puede usar típicamente solamente debido a que contiene el promotor temprano).
Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, también llamado un marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican las proteínas que (a) confieren resistencia a los antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina, (b) complementan las deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles del medio complejo, (por ejemplo, el gen que codifica para la D-alanina racemasa para Bacilli).
Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula húesped. Aquellas células que se transforman exitosamente con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia a los fármacos y así sobrevive al régimen de selección. Los ejemplos de esa selección dominante usa los fármacos metotrexato, neomicina, histidinol, puromicina, ácido micofenolico e higromicina.
Otro ejemplo de marcadores seleccionabas adecuados para las células de mamífero son aquellos que permiten la identificación decélulas competentes para captar el ácido nucleico del anticuerpo anti- integrina 2, tal como DHFR, timidina quinasa, metalotioneina-l y -II, preferentemente genes de metalotioneina de primate, adenosina deaminasa, ornitina decarboxilasa, etc.
Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección DHFR son primero identificadas por cultivo de todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), una antagonista competitivo de DHFR. Una célula húesped adecuada cuando se emplea un DHFR silvestre es la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad DHFR.
Alternativamente, las células huésped (particularmente hospederos silvestre que contienen DHFR endógeno) transformadas o co-transformadascon secuencias de ADN que codifican el anticuerpo anti- integrina a2, proteina DHFR silvestre, y otro marcador seleccionable tal como aminoglicosído 3'-fosfotransferasa (APH) se pueden seleccionar por crecimiento celular en medio que contiene una agente de selección para el marcador seleccionable, incluyendo un antibiótico aminoglicosidico, tal como canamícina, neomicina, o G418 (ver por ejemplo, patente de US No.4,965,199).
Un gen se selección adecuado para usar en levadura es el gen trp1 presente en un plásmido levadura YRp7 (Stinchcomb y otros, Nature, 282: 39 (1979)). El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1 (ver, por ejemplo, Jones, Genetics, 85: 12 (1977)). La presencia de la lesión trp1 en el genoma de la célula húesped de levadura proporciona un ambiente eficaz para detectar la transformación por crecimiento en ausencia de triptófano.
Similarmente, cepas de levadura deficientes en Leu2 (ATCC 20,622 o 38,626) se complementan por plásmidos conocidos que portan el gen Leu2.
Además, los vectores derivados del plásmido circular pKD1 1.6 µ se pueden usar para la transformación de levaduras Kluyveromyces. Alternativamente, un sistema de expresión para la producción a gran escala de quimosina de ternero recombinante se reportó para K. lactis por Van den Berg, Bio/Technology, 8: 35 (1990). Los vectores de expresión multi-copia estables para la secreción de albúmina sérica humana recombinante madura por cepas industriales de Kluyveromyces han sido además descritas (ver, por ejemplo, Fleer y otros, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)).
Los vectores de expresión y clonación usualmente contienen un promotor que es reconocido por el organismo huésped y es operablemente unido al ácido nucleico del anticuerpo anti- integrina a2. Los promotores adecuados para usar con hospederos procariotas incluyen el promotor de arabinosa (por ejemplo, araB), promotor phoA, sistemas promotores ß-lactamasa y lactosa, fosfatasa alcalina, un sistemas promotor de triptófano (trp), y promotores híbridos tal como el promotor tac. Sin embargo, otros promotores bacterianos conocidos son adecuados. Los promotores para usar en sistemas bacterianos contendrán además una secuencia Shine-Dalgamo (S.D.) operablemente unida al ADN que codifica el anticuerpo anti- integrina a2.
Las secuencias promotoras se conocen para los organismos eucariotas. La mayoría de los genes eucariotas tienen una región rica en AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases corriente arriba del sitio donde se inicia la transcripción. Otra secuencia que se encuentra 70 a 80 bases corriente arriba del inicio de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT (sec. con núm. de ident.:115) donde N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucariota es una secuencia AATAAA (sec. con núm. de ident.:116) que puede ser la señal para la adición de la cola poli A al extremo 3' de la secuencia codificante. Tales secuencias se insertan adecuadamente en los vectores de expresión eucariotas.
Los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para usar con hospederos de levadura incluyen pero sin limitarse a los promotores para la 3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glicolíticas, tal como enolasa, gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenasa, hexoquinasa, piruvato decarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucoquinasa. Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que tienes la ventaja adicional de la transcripción controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para la alcohol dehidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradantes asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneina, gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de la maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para usar en la expresión de levadura son descritos además en EP 73,657. Los potencíadores de levadura se usan también ventajosamente con promotores de levadura.
La transcripción del anticuerpo anti- integrina al de los vectores en células huésped de mamíferos es controlada, por ejemplo, por los promotores obtenidos de los genomas de virus tal como virus del polioma, virus fowlpox, adenovirus (tal como Adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis-B o virus del simio 40 (SV40), de promotores mamíferos heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, a partir de promotores de choque térmico, con la condición de que esos promotores sean compatibles con los sistemas de célula húesped . Lso promotores temprano y tardío del virus SV40 son convenientemente obtenidos como un fragmento de restricción SV40 que contiene también el origen de replicación viral de SV40 El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano es convenientemente obtenido como un fragmento de restricción Hind\\\ E . Un sistema para expresar el ADN en hospederos mamíferos usando el virus del papiloma bovino como un vector se describe en la patente de US No.4,419,446, y una modificación de este sistema se describe en la patente de US No.4,601 ,978 (ver, además Reyes y otros, Nature 297: 598-601 (1982) en la expresión del ADNc de ß-interferón humano en células de ratón bajo el control de un promotor de timídina quinasa del virus de herpes simplex). Alternativamente, la repetición del terminal largo del virus del sarcoma de rous se puede usar como el promotor.
La transcripción de ADN que codifica un anticuerpo anti- integrina al por organismos eucanotas superiores es frecuentemente aumentada insertando una secuencia potenciadora en el vector. Muchas secuencias potenciadoras se conocen a partir de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteina, e insulina). Frecuentemente, sin embargo, se usa un potenciador de un virus de célula eucariota. Los ejemplos incluyen el potenciador SV4Q en el lado posterior del origen de replicación (bp 100-270), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en lado posterior del origen de replicación, y potencíadores adenovirus {ver, además, por ejemplo, Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982) en elementos potencíadores para la activación de promotores eucariotas). El potenciador se puede empalmar en el vector en una posición 5' o 3' para la secuencia codificante del anticuerpo anti-integrina al, pero se localiza preferentemente en un sitio 5' del promotor. Otros sistemas de regulación de genes bien conocidos en el arte (por ejemplo sistemas inducibles, tal como sistemas inducibles por tetraciclina y GeneSwitch™) se pueden usar para controlar la transcripción de ADN que codifica una anti- integrina a2.
Los vectores de expresión usados en células huésped eucariotas (células de levadura, hongos, insectos, plantas, animal, humana, o nucleada de otros organismos multicelulares) contendrán además secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Tales secuencias are comúnmente disponibles de las regiones 5' y, ocasionalmente 3', sin traducir de ADNc o ADN eucariota o viral. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilatados en la porción no traducida del ARNm que codifica un anticuerpo anti- integrina a2. Un componente útil de terminación de la transcripción es la región de poliadenilación hormona de crecimiento bovino (ver, por ejemplo, WO94/11026 y el vector de expresión descrito en la presente descripción).
Las células huésped adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores en la presente descripción son las células procariotas, levadura, o eucariotas superiores como se describió anteriormente. Los organismos procariotas adecuados para este propósito incluyen eubacteria, incluyendo organismos gram-negativos o gram-positivos por ejemplo, Enterobacteriaceae tal como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como Bacilli tal como B. subtilis y B. licheniformis, Pseudomonas tal como P. aeruginosa, y Streptomyces. Los hospederos de clonación adecuados de E. coli incluyen E. coli 294 (ATCC 31 ,446), E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31 ,537), y E. coli W31 10 (ATCC 27,325).
Además de los organismos procariotas, los microbios eucariotas tal como hongo filamentoso o levadura son hospederos de clonación o expresión adecuados para los vectores que codifican para el anticuerpo de anti-alfa 2 integrina. Saccharomyces cerevisiae, o levadura común de panadería, es la más comúnmente usada entre los microorganismos huésped eucariota inferiores. Sin embargo, un número de otros género, especies, y cepas están comúnmente disponibles y útiles, tal como Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces hosts incluyendo K, lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophílarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans, o K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 83,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); • Neurospora crassa; Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis; y hongo filamentoso incluyendo Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, o Aspergillus hosts tal como A. nidulans o A. niger.
Las células huésped adecuadas para la expresión del anticuerpo anti- integrina <x2 glicosilatado se derivan de organismos multicelulares. Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células de plantas e insectos. Numerosas cepas y variantes de baculovirus y las células huésped de insectos permisivas correspondientes de hospederos tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), y Bombyx morí han sido identificadas. Una variedad de cepas virales para la transfección se encuentran públicamente disponibles, por ejemplo, la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx morí NPV, y tales virus se pueden usar, particularmente para la transfección de células deSpodoptera frugiperda .
Los cultivos de células vegetales de algodón, maíz, papa, frijol de soya, petunia, tomate, y tabaco también se pueden utilizar como hospederos.
Sin embargo, ha sido mayor el interés en células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados, incluyendo una variedad de células de mamífero, se convierte en procedimiento de rutina. Los ejemplos de células huésped útil de mamífero incluyen: un línea CV1 de riñon de mono transformada por SV40 {por ejemplo, COS-7, ATCC CRL 1651); una línea riñon embriónica humana 293 o 293 células subclonadas para crecimiento en cultivo de suspensión (ver por ejemplo, Graham y otros, J. Gen Virol. 36: 59 (1977)); células de riñon de hámster bebé (por ejemplo, BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células CHO que carecen de DHFR (ver, por ejemplo, DHFR Urlaub y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 77: 4216 (1980)); células de Sertoli de ratón ((por ejemplo, TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de riñon de mono (por ejemplo, CV1 ATCC CCL 70); células de riñon de mono verde africano (por ejemplo, VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (por ejemplo, HELA, ATCC CCL 2); células de riñon canino (por ejemplo, MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (por ejemplo, BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (por ejemplo, W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (por ejemplo, Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (por ejemplo, MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (ver, por ejemplo, Mather y otros, Annals N.Y Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; o una línea de hepatoma humana (por ejemplo, Hep G2).
Las células huésped se transforman con un vector expresión o clonación anteriormente-descrítos para la producción y cultivo de anticuerpo anti- integrina a2 en medio nutriente convencional modificado como sea adecuado para inducir los promotores, seleccioan los transformantes y/o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.
Las células huésped usadas para producir un anticuerpo anti- integrina cc2 se pueden cultivar en una variedad de medios. Los medios comercialmente disponibles como Ham's F10 (Sigma), Medio Mínimo Esencial ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), y Medio Eagle modificado de Dulbecco ((DMEM), Sigma) son adecuados para el cultivo de células huésped. Además, cualquier medio descrito en Ham y otros, Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes y otros, Anal. Biochem. 102: 255 (1980), las patentes de US Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; o 5,122,469; WO90103430; WO 87/00195; o Patente U.S. Re. No. 30,985 se pueden usar como medio de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios se puede suplementar como sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tal como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), sales (tal como sodio cloruro, calcio, magnesio, y fosfato), tampones (tal como HEPES), nucleótidos (tal como adenosina y timidina), antibióticos (tal como el fármaco GENTAMYCIN™), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes a concentraciones finales en el intervalo micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquier otro suplemento necesario se puede incluir también a concentraciones adecuadas que pudieran ser conocidas aquellos con experiencia en la materia. Las condiciones de cultivo, tal como temperatura, pH, y similares, se seleccionan por aquellos con experiencia en la materia, incluyendo las condiciones de cultivo previamente usadas con la célula huésped seleccionada para la expresión.
Los anticuerpos anti- integrina a2 se pueden purificar a partir de células, incluyendo células microbianas o de mamífero usando, por ejemplo, cromatografía de proteína A, cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de interacción hidrofóbica, electroforesis en gel, diálisis, y/o cromatografía de afinidad. La idoneidad de la proteína A como un ligando de afinidad depende de las especies y del isotipo de cualquier dominio Fe de inmunoglobulina que está presente en el anticuerpo. La proteína A se puede usar para purificar los anticuerpos que están basados en cadena pesadas humanasyl , y2, o y4 (ver, por ejemplo, Lindmark y otros, J. Immunol Meth. 62:1-13 (1983)). La proteína G es útil para los isotipos de ratón y para ?3 humana (ver, por ejemplo, Guss y otros, E BO J. 5:1516- 517 (1986)). La matriz al cual el ligando de afinidad se une es frecuentemente agarosa, pero otras matrices están disponibles. Las matrices mecánicamente estables tal como vidrio de poro controlado o poli(estirenodivinil)benceno permiten tasas de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que se pueden alcanzar con la agarosa. Donde el anticuerpo comprende un dominio CH3, el Bakerbond ABX™ (J.T. Baker, Phillipsburg, N.J.) es útil para la purificación. La purificación de la proteína puede incluir una o más de las siguientes técnicas tal como fraccionamiento en una columna de intercambio de iones, precipitación de etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina SEPHAROSE™, cromatografía en una resina de intercambio de cationes o aniones (por ejemplo, una columna de ácido poliaspártico), cromatoenfoque, SDS-PAGE, precipitación de sulfato amónico y/o cromatografía de interacción hidrofóbica . Por ejemplo, puede ser útil seguir cualquier etapa de purificación, para someter una mezcla que comprende el anticuerpo de interés y contaminantes a cromatografía de interacción hidrofóbica a bajo pH usando un tampón de elución a un pH entre aproximadamente 2.5-4.5, preferentemente realizado concentraciones bajas de sal (por ejemplo, de aproximadamente 0-0.25M sal).
Las formulaciones de un anticuerpo anti- integrina a2, incluyendo aquellos para administración terapéutica, se preparan para almacenamiento mezclando el anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con portadores, diluyentes, excipientes o estabilizantes fisiológicamente aceptable opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16ta edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o solución acuosa. Los portadores, diluyentes, excipientes, o estabilizantes aceptables son no tóxicos para los receptores a dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tal como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; preservativos (tal como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio; fenol, butil o bencil alcohol; alquil parabenos tal como metil o propil parabeno; catecol; resprcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos) ; proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos tal como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos, u otros carbohidratos incluyendo glucosa, mannosa, o dextrinas; agentes quelantes como EDTA; azúcares tal como sucrosa, mannitol, trehalosa o sorbitol; contra-iones formadores de sal tal como sodio; complejos de metal {por ejemplo, complejos Zn-proteína); y/o surfactantes no iónicos tal como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG). Para usos terapéuticos el anticuerpo anti- integrina a2 de la presente invención se puede formular por ejemplo en tampón fosfato salino (PBS) que contiene 0,03% Tween-80™. La formulación del anticuerpo puede contener además más de un compuesto activo para la indicación particular a ser tratada, preferentemente aquellas con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. Pudiera ser deseable usar un anticuerpo anti- integrina a2 además de uno o más agentes corrientemente usados para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. Además, pudiera ser deseable proporcionar adicionalmente un agente inmunosupresivo. Tales moléculas están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito pretendido.
Los ingredientes activos se pueden atrapar además en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsula de, hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsula de oli-(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas de entrega fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas o nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences 16ta edición, Osol, A. Ed. (1980).
Las formulaciones a ser usadas para la administración in vivo son preferentemente estériles. Esto es fácilmente alcanzado, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles.
Las preparaciones de liberación sostenida pueden prepararse. Los ejemplos de preparaciones de liberación sostenida adecuadas incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, esas matrices están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas, o microcápsula. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, fiidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), o poli(vinilalcohol)), polilactidos ( Patente US No. 3,773,919), copolimeros de ácido L-glutámico y ? etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinilo no degradable, copolimeros de ácido glicólico- ácido láctico degradables tal como el Lupron Depot™ (microesferas inyectables compuestas de copolimero de ácido glicólico- ácido láctico y leuprolida acetato), y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutirico. Aunque los polímeros tales como acetato de etileno-vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de las moléculas durante más de 100 días, determinados hidrogeles liberan las proteínas durante períodos de tiempo más corto. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante mucho tiempo, ellas se podrían desnaturalizar o agregar como un resultado de la exposición a la humedad a 37°C, lo que resulta en una pérdida de la actividad biológica y cambios posibles en la inmunogenicidad. Las estrategias racionales se pueden concebir para la estabilización en función de los mecanismos involucrados. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación se descubre estando en la formación del enlace intermolecular S-S mediante el intercambio dé tio-disulfuro,la estabilización se podría lograr mediante la modificación de los residuos sulfhidrilo, la liofilización de soluciones ácidas, el control del contenido de humedad, mediante aditivos apropiados, y el desarrollo de las composiciones específicas de la matriz del polímero.
El anticuerpo anti- integrina a2 se administra por cualquier medio adecuado, incluyendo parenteral, subcutáneo, intraperitoneal, intrapulmonar, o intranasal. Si se desea para tratamiento inmunosupresivo local, se hace la administración intralesional del anticuerpo (incluyendo la perfusión o de cualquier otra forma contactando el injerto con el anticuerpo antes del transplantate). La administración parenteral incluye la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, o subcutánea. Además, el anticuerpo anti- integrina cc2 se administra adecuadamente por infusión de pulso, por ejemplo, con doses del anticuerpo decrecientes. Preferentemente la dosificación de da por inyecciones, más preferentemente intravenosas o inyecciones subcutáneas. Esto puede depender en parte de si la administración es breve o crónica. Más preferentemente los anticuerpo anti- integrina a2 o las composiciones descritas en la presente descripción se administran en los métodos de la presente invención por infusión intravenosa, bolo intravenoso, administración subcutánea, infusión subcutánea o bolo subcutáneo, mientras que la infusión intravenosa o el bolo intravenoso es más preferido. El término "infusión intravenosa" se refiere a la introducción de un fármaco en la vena de un animal o paciente humano durante un período de tiempo mayor que aproximadamente 5 minutos, preferentemente entre aproximadamente 30 a 90 minutos, aunque, de conformidad con la invención, la infusión intravenosa es alternativamente administrada por 10 horas o menos. El término "bolo intravenoso" o "push intravenoso" se refiere a la administración del fármaco en una vena de un animal o humano de manera que el cuerpo recibe el fármaco en aproximadamente 15 minutos o menos, preferentemente 5 minutos o menos. El término "administración subcutánea" se refiere a la introducción de un fármaco debajo de la piel de un paciente humano o animal, preferiblemente dentro de un bolsillo entre la piel y el tejido subyacente, por liberación sostenida, relativamente lenta desde un receptáculo del fármaco. El bolsillo puede crearse al pellizcar o estirar la piel hacia arriba y lejos del tejido subyacente. El término "infusión subcutánea" se refiere a la introducción de un fármaco debajo de la piel de un paciente humano o animal, preferentemente dentro de un bolsillo entre la piel y el tejido subyacente, por liberación sostenida, relativamente lenta desde un receptáculo del fármaco por un período de tiempo que incluye, pero sin limitarse a, 30 minutos o menos, o 90 minutos o menos. El término "bolo subcutáneo" se refiere a la administración del fármaco debajo de la piel de un paciente animal o humano, donde la entrega del fármaco en bolo es preferentemente menor de aproximadamente 15 minutos, más preferentemente menor de 5 minutos, y lo más preferido menor de 60 segundos. La administración es preferentemente dentro de un bolsillo entre la piel y el tejido subyacente, donde el bolsillo se crea, por ejemplo, al pellizcar o estirar la piel hacia arriba y lejos del tejido subyacente. Opcionalmente, la infusión se puede preparar por implantación subcutánea de un bomba de liberación del fármaco implantada debajo de la piel del paciente animal o humano, en donde la bomba liberara una cantidad predeterminada de fármaco por un período de tiempo predeterminado, tal como 30 minutos, 90 minutos, o un período de tiempo que abarca la duración del régimen de tratamiento. La dosificación intermitente o periódica es una dosificación que es continua por un cierto período de tiempo y es a intervalos regulares que son preferentemente separados más que por un día.
"Cantidad terapéuticamente efectiva" o "cantidad efectiva" las cuales se usan como sinónimos en la presente descripción, se refieren a una cantidad de los anticuerpos anti- integrina a2 descrito en la presente descripción efectivo para mejorar o prevenir los síntomas, o prolongar la supervivencia del sujeto que se está tratando. La determinación de una cantidad terapéuticamente efectiva está dentro de las capacidades de aquellos con experiencia en la materia, especialmente a la luz de la descripción detallada proporcionada en la presente descripción. El término "cantidad terapéuticamente efectiva" del anticuerpo anti- integrina a2s descrito en la presente descripción específicamente se refiere a la cantidad necesaria para retrasar o inhibir el crecimiento tumoral.
Para la prevención o tratamiento del cáncer, la dosis apropiada de anticuerpo dependerá del tipo de enfermedad a ser tratada, como se definió anteriormente, la gravedad y el curso de la enfermedad, ya sea que el anticuerpo anti- integrina a2 se administre con propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta al anticuerpo, y la discreción del médico que lo atiende. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente de una vez o en una serie de tratamiento.
El anticuerpo anti- integrina a2s se puede así administrar a un sujeto, preferentemente a un humano, en el método de la presente invención, en una cantidad terapéuticamente efectiva en el intervalo de aproximadamente 0.1. a aproximadamente 100 mg/kg. Preferentemente, una cantidad terapéuticamente efectiva en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mg/kg, más preferentemente una cantidad terapéuticamente efectiva en el intervalo de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 mg/kg se administra a un sujeto, preferentemente a un humano. Una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo humanizado o fragmento de unión de este se puede administrar al sujeto en una o más dosis terapéuticamente efectivas.
Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, una dosificación inicial candidata para administración al sujeto es de aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg del anticuerpo, ya sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas, o por infusión continua. Una dosis diaria típica por ejemplo para un humano pudiera encontrarse en el intervalo de 0.1 mg/k a 20 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para la administración repetida durante varios días o más larga, dependiendo de la afección, el tratamiento es sostenido hasta que ocurra una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad . Sin embargo, otros regímenes de dosificación puedens ser útiles. El progreso de esta terapia se monitorea fácilmente por aquellos con experiencia en la materia. De conformidad con estudios toxicocinéticos como se describe en ejemplo 6 los anticuerpos anti- integrina a2 de la presente invención tienen una vida media estimada de T1/2 de entre 199 y 316 horas. De esta manera un régimen de dosificación de una vez cada dos semanas parece ser el preferido.
Inesperadamente los anticuerpos anti-alfa 2 (a2) integrina usados en la presente invención inhiben el crecimiento tumoral a un grado , comparable con los anticuerpos anti-VEGF. Específicamente a una dosis de 50 mg/kg de anticuerpo anti-afa 2 (<x2) integrina administrado bisemanalmente por 22 días en un estudio de xenoinjerto de ratón, el tamaño del tumor fue de alrededor de 60 % del control del isotipo el día 27. Así, la invención proporciona un método de tratar el cáncer seleccionado del grupo que consiste de cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón, y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer de estómago o gástrico incluyendo cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer colorectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de las glándulas salivares, cáncer renal o del riñon, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de la vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello, así como linfoma de células B incluyendo linfoma no de Hodgkin folicular/ grado bajo (NHL); NHL linfocítico pequeño (SL); NHL folicular/grado intermedio ; NHL difuso de grado intermedio ; NHL inmunoblástico de grado alto; NHL linfoblástico de grado alto; NHL de células no hendidas pequeñas de grado alto; NHL con enfermedad de gran carga tumoral; linfoma de células del manto; linfoma relacionados con el SIDA, y macroglobulinemia de Waldenstrom; leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crónica; y trastorno linfoproliferativo post-trasplante (PTLD), asi como proliferación vascular anormal asociadas con facomatosis, edema tal como that asociadas con tumores cerebrales, síndrome de Meigs, melanoma, mesotelioma, mieloma múltiple, fibrosarcoma, osteosarcoma, y carcinoma epidermoide, al administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti- integrina a2 humanizado, mientras el tamaño del tumor tratado con el anticuerpo anti- integrina cc2 humanizado es igual o menor que el 90 %, preferentemente igual o menor que el 80 %, más preferentemente igual o menor que el 70 %, lo más preferido igual o menor que el 60 %, en particular igual o menor que el 50 %, más particular igual o menor que el 40 %, lo más particular igual o menor que el 30 % del tamaño del tumor tratado con el anticuerpo control, mientras que el tamaño del tumor es usualmente medido como volumen del tumor o peso del tumor.
Un anticuerpo anti- integrina a2 composición será formulado, dosificado, y administrado de una manera consistente con las buenas prácticas médicas. Los factores a considerar en este contexto incluyen el trastorno particular que se trata, el mamífero particular que se trata, la afección clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de entrega del agente, el método de administración, el programa de administración, los resultados de los estudios de toxicidad farmacológica y otros factores conocidos por los médicos. Una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo a administrar se determina por consideración de éstos, y es I a cantidad mínima necesaria para prevenir, mejorar, o tratar un trastorno asociado a la integrina a2ß1. Tal cantidad preferentemente se encuentra por debajo de la cantidad que es tóxica para el huésped o hace el huésped significativamente más susceptible a las infecciones.
El anticuerpo anti- integrina a2 no necesita ser, pero puede ser opcionalmente formulado, coadministrado o usado como una terapia adicional con uno o más agentes corrientemente usado para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. Por ejemplo, el anticuerpo se puede dar de conjunto con radioterapia y/o una o varios medicamentos para el cáncer. Estos medicamentos para el cáncer pueden comprender otro anticuerpo, agente quimio-terapéutico, agente citotóxico, agente anti-angiogénico, agente inmunosupresivo, profármaco, citocina, antagonista de citocina, citotóxico radioterapia, corticosteroide, antieméticos, vacuna contra el cáncer, analgésico, agente anti-vascular, o agente inhibidor de crecimiento. Los agentes más específicos incluyen, por ejemplo, ¡rinotecan (CA PTOSAR®), cetuximab (ERBITUX®), fulvestrant (FASLODEX®), vinorelbina (NAVELBINE®), antagonistas del receptor EFG tal como erlotinib (TARCEVA®), antagonistas de VEGF tal como bevacizumab (AVASTIN®), vincristina (ONCOVIN®), inhibidores de mTo (una serina/treonina proteína quinasa) tal como rapamicina y CCI-779, y anti- HER1 , HER2, ErbB, y/o antagonistas de EGFR tal como trastuzumab (HERCEPTIN®), pertuzumab (OMNI- TARG™), o lapatinib, y otros agentes citotóxicos incluyendo agentes quimioterapéuticos. Alternativamente, o además, los antagonistas de la integrina a2ß1 se pueden administrar al mamífero que padece de un trastorno asociado con la integrina a2ß1. La cantidad efectiva de tales otros agentes depende de la cantidad del anticuerpo anti- integrina a2 presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento, y otros factores discutidos anteriormente. Estos son generalmente usados en las mismas dosificaciones y con rutas de administración como las usadas en la presente descripción antes o aproximadamente de 1 a 99% de las dosificaciones anteriormente empleadas.
Se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales, incluyendo un anticuerpo anti- integrina a2, útil para el tratamiento del cáncer como se describió anteriormente. El artículo de fabricación comprende un contenedor y una etiqueta. Los contenedores adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, frascos, jeringas, y tubos de prueba. Los contenedores se pueden conformar a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El contenedor mantiene una composición que es efectiva para el tratamiento de la afección y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo el contenedor puede estar en una bolsa o un frasco de solución intravenosa que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). El agente activo en la composición es un anticuerpo anti-alfa 2 integrina. La etiqueta en, o asociada con, el contenedor indica que la composición se usa para tratar el cáncer como se describió anteriormente. El artículo de fabricación puede comprender, además, un segundo contenedor que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como tampón fosfato salino, solución de Ringer o solución de dextrosa. Este puede incluir además otros materiales deseables de el punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas, y insertos de empaque con instrucciones de uso.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación. Las descripciones de todas las citas en la descripción se incorporan expresamente en la presente descripción como referencia.
EJEMPLOS Ejemplo 1 Evaluación ln vitro de las potencias del anticuerpo anti-a2 integrina en inhibir la interacción entre la a2 integrina humana expresada en líneas celulares de carcinoma humano y colágeno humano Un ensayo de unión in vitro entre la línea celular humana y colágeno humano ha sido establecida para evaluar la potencia de diferentes anticuerpos anti-a2 integrina para inhibir la interacción entre integrina (a2 ß?) VLA-2 humana expresada en líneas celulares de carcinoma humano y colágeno humano tipo I. En este ensayo, las líneas celulares de cáncer pancreático humano fluorescentemente marcadas que expresan de manera natural VLA-2 se distribuyeron en placas de 96 pocilios que habían sido previamente recubiertos con colágeno humano tipo I. Una línea celular de cáncer pancreático humano fluorescentemente marcada que no expresa VLA-2 se usó como un control negativo. Las células fluorescentemente marcadas se incubaron después en las placas de 96 pocilios recubiertos con colágeno en presencia de diferentes concentraciones de anti-a2 integrina (GBR500 o TMC2206) o anticuerpo control coincidente con el isotipo (GBR600) por una hora. Las placas se lavaron cuidadosamente y la fluorescencia restante se midió en cada pocilio de la placa. La fuerza de la señal de fluorescencia medida en cada pocilio individual es proporcional al número de células que se habían adherido al colágeno.
Materiales y métodos Tabla 1 : Anticuerpos La integrinaa2anti-humana humanizada GBR500 como se refiere en la presente descripción comprende una cadena pesada que comprende sec. con núm. de ident.:187 y una cadena ligera que comprende sec. con núm.. de ident.:188.
Tabla 2: Líneas celulares Nombre Fuente Suministrador Cat# expresión VLA-2 SK-BR-3 Carcinoma de ATCC HTB-30 Bajo mamas AsPC-1 Carcinoma ATCC CRL-1682 Alto Pancreático HPAF-II Carcinoma ATCC CRL-1997 Alto Pancreático MIA PaCa-2 Carcinoma ATCC CRL-1420 Negativo Pancreático Citometría de Flujo Después de la incubación con Versene (Gibco, cat# 15040), las células AsPC-1 , células HPAF-II y células MIA PaCa-2 se recogieron y resuspendieron en PBS-2.5% FBS a una concentración de 1x106 células/mL Cien µ? de la suspensión celular se incubó con 10 pg/mL de GBR500-FITC o hlgG4-FITC como control por 20 minutos en hielo. Las células se lavaron dos veces con PBS-2.5% FBS y se analizaron por citometría de flujo. La línea celular SK-BR-3 tripsinisada se trató de la misma forma que se describió para la línea celular pancreática. El nivel de expresión de la molécula VLA-2 se expresó como la Intensidad de fluorescencia promedio (MFI).
Ensayo de unión al colágeno Noventa y seis placas ELISA de pocilios (cliniplaca negra, Thermo Firsher scientific, cat n° 9502867) se recubrieron con 100 µ? de colágeno humano tipo I (SIGMA, cat n° C7774) a 50 pg/mL en ácido acético 0.02N o en PBS. El colágeno se diluyó en ácido acético y se incubó por 1 hora a 37°C o diluyó en PBS y se incubó toda la noche a 4°C. Las placas se bloquearon con 150 µ? de PBS suplementado con 0.1% BSA o 1% BSA (Sigma, cat n° A3059). Las células se etiquetaron primero con CFSE (Invitrogen cat n° C34554) en medio DMEM libre de suero (PAA, cat n° E15-005). Tres µ? de una solución 15 mM CFSE se añadieron a 5 mi células a una concentración entre 1x106 células/ml a 0.6x106 células/ml. Las células se incubaron con CFSE por 10 minutos a 37°C y el exceso de CFSE se eliminó por centrifugación de las células a 900 rpm por 3 min. Las células marcadas con CFSE se resuspendieron a una concentración entre 0.6x106 a 1x106 células/ml en DMEM suplementado con 0.1 % BSA. Cincuenta µ? de las diluciones del anticuerpo en DMEM-0.1 % BSA se distribuyeron a la placa recubierta de colágeno y cincuenta µ? de células marcadas con CFSE se distribuyeron inmediatamente a la placa. El anticuerpo GBR600 se usó como un anticuerpo control del isotipo para GBR500. Las placas se incubaron a temperatura ambiente por 1 hora y las células que no se unieron al colágeno se eliminaron por vertido del sobrenadante, las placas se lavaron cuatro veces con tampón PBS manualmente o usando una lavadora BioTek. Los pocilios en las placas se rellenaron con PBS y se midió la fluorescencia con excitación a 498 nm y emisión a 525 nm usando el fluorómetro Synerg HT2. Los datos se analizaron usando el software PRISM. La actividad del anticuerpo anti-VLA-2 se expresó como EC50 que se define como la concentración del anticuerpo que provoca una respuesta intermedia entre los valores iniciales y la máxima respuesta.
Resultados Tabla 3: Tinción FACS Ensayo de unión al colágeno El ensayo de unión al colágeno usando las tres líneas celulares de cáncer pancreático y la linea celular de cáncer de mamas se realizaron dos veces. Tabla 4 Resume los valores EC-50 obtenidos en los 2 experimentos realizados representados abajo Tabla 4: Valores de EC-50 Los anticuerpos GBR500 y TMC-2206 inhibieron la unión de las células de cáncer de mamas y pancreático positivas VLA-2 al colágeno humano. La línea celular MIA PaCa-2 que no expresa VLA-2 no se unió al colágeno. Este resultado demuestra que la expresión de VLA-2 es un prerrequisito para la adherencia celular al colágeno tipo I.
Conclusión 1) La expresión de la ¡ntegrinacc2 en las líneas celulares de carcinoma AsPC-1, HPAF-II y células SKBR3 pueden detectarse usando el anticuerpo GBR500 fluorescentemente marcado. La línea celular de cáncer pancreático expresa un nivel alto de integrinaa2 comparado con la línea celular de cáncer de mamas. 2) Las líneas celulares AsPC-1 , HPAF-II y líneas celulares SK-BR-3 positivas a VLA-2 se adhirieron al colágeno mientras que la línea celular MiaPaCA negativa a VLA-2 no lo hizo. 3) Los valores EC-50 del anticuerpo para la inhibición de unión al colágeno para las diferentes líneas celulares probadas se muestran en Tabla 5: Tabla 5: Valores de EC-50 El valor EC50 obtenido con la línea celular HPAF-II fue aproximadamente 4 veces (3.9 veces para GBR500 y 3.6 para TMC-2206) mayor comparado con el valor EC50 medido para la línea celular AsPC-1. Esta diferencia no se puede atribuir al nivel de expresión de VLA-2, ya que ambas líneas celulares pancreáticas expresaron niveles similares de VLA-2 (ver datos de tinción FACS). Además, la línea celular SK-BR-3 que expresa un nivel bajo de VLA-2, mostró un valor EC50 comparable con AsPC-1 (expresión VLA-2 alta ). Sin embargo, las condiciones de recubrimiento con colágeno fueron diferentes entre las líneas celulares pancreáticas y la línea celular del cáncer de mamas (colágeno diluido en ácido acético a 37°C por una hora versus colágeno diluido en PBS a 4°C toda la noche), por lo tanto las comparaciones del valor EC50 entre estas líneas celulares se deben interpretar con cuidado. 4) Este estudio identifica la adhesión al colágeno tipo I mediada por la integrina a2ß? como una diana terapéutica potencial, además, el anticuerpo GBR500 y TMC2206 anti-VLA-2 mostró una buena capacidad para inhibir la unión de las líneas celulares que expresan VLA-2 al colágeno. El anticuerpo GBR500 es por lo tanto un candidato terapéutico potencial en el tratamiento del cáncer de mamas y pancreático.
Ejemplo 2 Efecto de GBR500 contra el xenoinjerto de tumor de carcinoma pancreático humano AsPC- 1 en ratones atímicos BALB/c desnudos (nu/nu) Ratones atímicos BALB/c desnudos (nu/nu) hembra, de al menos 6-8 semanas se usaron en el estudio de xenoinjerto. Los animales obtenidos de Australian Research Council (ARC) se asignaron en grupos de tratamiento el día -2 del estudio y el tratamiento se inició según el régimen descrito en la Tabla 6. El día 1 , las células tumorales de carcinoma pancreático AsPC-1 humano (ATCC® número: CRL-1682) se cosecharon a partir de cultivos sub-confluentes que crecen in vitro y el número de células viables se determinó. Las células se resuspendieron en 1x PBS a una concentración de 5 x 107 células/ml y se inyectó a los animales subcutáneamente en el flanco de la oreja derecha con aproximadamente 5 x 106 células en un volumen de 0.1 mi.
Los animales se examinaron regularmente para la aparición de tumores y se dosificaron bisemanalmente por 22 días comenzando a partir del día -2 (Total 7 inyecciones los días -2, 2, 6, 9, 13, 16, 20). Los anticuerpos se administraron en un volumen de 10 ml/kg. El día 20, los tratamientos se detuvieron y los animales se monitorearon hasta el día 27.
Tabla 6: Grupos de tratamiento y diseño del estudio * bisemanalmente por 22 días comenzando a partir del día -2 (Total 7 inyecciones los días -2, 2, 6, 9, 13, 16, 20) Las mediciones del tumor se obtuvieron dos veces semanalmente usando un calibrador digital por la duración del estudio. Las dimensiones del tumor se registraron (longitud y ancho), y los volúmenes del tumor se calcularon usando la fórmula W2 x L x 0.536, donde W es la dimensión más ancha del tumor y L es la más larga. Los resultados del estudio se muestran en la Figura 1. Los volúmenes del tumor se refieren a la media por grupo de 14 animales. A una dosis de 50 mg/kg GBR500, el tamaño del tumor fue de alrededor de 60 % del control del isotipo el día 27.
Ejemplo 3 Efecto de GBR500 contra el xenoinjerto de carcinoma de colon humano HT29 en ratones atímicos nu/nu Se usaron ratones Nu/Nu macho, de Harían, Italia. Los animales se mantuvieron en cajas usando lecho de vapor de agua en autoclave (estéril), dieta y agua se ofrecieron ad libitum. Los animales se identificaron con un número único en una etiqueta en la oreja que aparecía en las hojas de datos. El peso corporal el día de la implantación del tumor fue: 24-31g.
Número de grupos- calendario de tratamiento: El número de grupos fue 5. El número de animales/grupo fue 10. El tratamiento se inició según el régimen descrito en la Tabla 7.
Tabla 7: Grupos de tratamiento y diseño del estudio * IP: intraperitoneal ** El tratamiento empieza el día 6 después de los implantes del tumor Sustancias: Los compuestos de prueba se almacenaron a 4°C temperatura y se protegieron de la luz hasta el uso. Los compuestos de prueba se disolvieron en 0,03% Tween-80™ en tampón fosfato salino y se diluyeron inmediatamente antes del uso para alcanzar la concentración correcta (isotipo lgG4, Ha1/29 y GBR500 en PBS; Avastin® en solución salina). Los tratamientos se administraron intraperitonealmente (IP) en un volumen de 10 ml/kg Tumor: El fragmento de tumor HT29 de los ratones previamente inoculados con células HT29 (ATCC HTB-38™) se implantaron subcutáneamente en el flanco izquierdo de los ratones atímicos desnudos. Los animales se examinaron regularmente para la aparición de tumores. Cuando los tumores medibles se establecieron en la mayoría de los ratones, los animales se asignaron en grupos de tratamiento, con un objetivo de 10 ratones por grupo (5 ratones por caja). Cuando el tratamiento empieza el volumen medio del tumor fue 120 mm3.
Evaluación de la actividad antitumoral en los modelos de xenoinjerto y toxicidad: Al menos dos veces a la semana, el crecimiento tumoral y el peso corporal neto se evaluaron. El crecimiento tumoral se evaluó con un calibre. Las dimensiones de los tumores se midieron regularmente con un calibre durante los experimentos, y la masa del tumor se calculó como sigue: Longitud (mm) ) . ancho i 2 (mm) , . . 3 Peso del tumor (mg) =— -— · d (mg/mm ) asumiendo densidad d = 1 mg/mm3 para el tejido tumoral La toxicidad se evaluó en base a la reducción del peso corporal. Los ratones se sacrificaron cuando los tumores alcanzaron un volumen que los dificultaba.
Resultados y Conclusiones: Ha 1/29 (5 mg/kg) y GBR500 (50 mg/kg) administrado como agentes únicos dos veces a la semana, dio una inhibición del peso del tumor el día 28 de 12 % y 16%, respectivamente. Ha1/29 en combinación con GBR500 mostró una reducción del peso del tumor de 19% (Tabla 8).
Tabla 8: Esquema de dosificación e inhibición del peso del tumor Dosis % inhibición del peso del tumor Grupo Compuesto mg/kg 6 9 13 16 20 23 28 31 35 1 lgG4 isotipo 50 - 2 Ha 1/29 5 1 14 28 33 23 17 12 3 -4 3 GBR500 50 2 4 11 18 12 15 16 13 0 Ha1/29 4 + GBR500 50 + 5 2 17 24 33 23 25 19 7 -1 5 Avastin® 40 1 20 28 43 44 50 50 40 24 La máxima actividad antitumoral de los grupos tratados con los anticuerpos se observó el día 16 con una inhibición del peso del tumor de 33, 18, 33 % (Ha1/29, GBR500 y el grupo de combinación respectivamente). Avastina ®, administrada a 40 mg/kg, mostró una inhibición del crecimiento tumoral de 50% el día 28. En la Figura 2 se muestra la comparación del crecimiento tumoral promedio observada en los diferentes grupos de tratamiento. Los tratamientos fueron bien tolerados y no hubo ratones muertos en los grupos tratados durante el experimento. No hubo signos de diestres durante y después de los tratamientos y no se observó pérdida significativa de peso corporal.
Ejemplo 4 Detección de los niveles de expresión de CD49b (subunidad de integrina ct2) en líneas celulares humanas Líneas celulares y condiciones de cultivo Un panel de lisados celulares se seleccionó para la expresión de CD49b. Este panel consistió de lisados de cuatro líneas celulares humanas no transformadas (BJ, I407, fibroblastos primarios, WRL-68) y 96 líneas celulares de cáncer humano e diferentes tejidos/órganos (incluyendo colorectal, piel, mama, próstata, páncreas, pulmón, cervix, riñon y, ovario, CNS, huesos, hígado, tiroides, y sangre). Las líneas celulares usadas se muestran en la Tabla 9 A y 9B.
Tabla 9 A: Líneas celulares Tabla 9 B: Líneas celulares Preparación del lisado por inmunotransferencia.
Los lisados se preparan a partir de cultivos of líneas celulares sub-confluentes mantenidas en medio de crecimiento adecuado en presencia de 10% suero fetal de ternero (ver tabla 8 para detalles). Las líneas celulares adherentes se sembraron en placas de 150 mm (células cosechadas a approx. 60-70% confluencia); líneas celulares en suspensión se cultivaron en frascos T-175 (células cosechadas a approx. 200,000 células/ml).
Protocolo para las líneas celulares adherentes: 1) Lavar la placa con PBS frío (sin Ca2+ y Mg2+). Eliminar PBS. 2) Dejar que el exceso de PBS drene a un lado y eliminar. 3) Añadir T mi tampón de lisis frío y poner la placa en hielo. Raspar las células. 4) Recolectar el lisado y lavar la placa con otros 200 µ? de tampón de lisis y adicionar al lisado, agitar en ambiente frío por 15 min. 6J Agitar por 15 min en microfuga (15000 rpm a 4°C). 7) Recuperar el sobrenadante y congelar en alícuotas en nitrógeno líquido. 8) Determinar la concentración de la proteína en una alícuota de cada lisado usando una curva de referencia BSA. 9) Llevar las muestra a 1 mg/ml con tampón de lisis completo, 4x tampón de muestra LDS , 20x agente reductor (1 M DTT) y calentar 10 min.
Protocolo para las líneas celulares en suspensión: 1 ) Agitar la suspensión celular por 15 min (2000 rpm a 4°C) y eliminar el medio. 2) Lavar con PBS frío (sin Ca2+ y Mg2+), agitar por 15 min (2000 rpm a 4°C) y eliminar el PBS. 3) Adicionar 1 mi tampón de lisis frío y pipetear el lisado de células en hielo. 4 Mantener célula/lisado agitaando en ambiente frío por 15 min. 6) Agitar por 15 min (15000 rpm a 4°C). 7) Recuperar el sobrenadante y congelar en alícuotas en nitrógeno líquido. 8) Determinar concentración de la proteína en todos los lisados en paralelo usando la misma curva de referencia BSA. 9) Llevar las muestra a 1 mg/ml con tampón de lisis completo, 4x tampón de muestra LDS, 20x agente reductor (1 M DTT) y calentar 10 min.
Composición del tampón de lisis completo: 50 mM Hepes pH 7.5 150 mM NaCI 1% Tritonx-100 1% Deoxicolato 0.1% SDS 10 mM EDTA Adicionar DTT (final 1 mM) y cocteles de inhibidor proteasa/fosfatasa (Sigma P-2850, P-5726, P-8340) como se requirió justo antes del uso. Agente reductor DTT (Biorad, cat. # 161-0610): 50 mM concentración final.
Composición del tampón de muestra LDS (Invitrogen, cat. # 02 98 22 201): 106mM Tris HCI pH 8.5 150mM Tris base 1% TritonX-100 2% LDS 10% glicerol 0.51 mM EDTA 0.22mM Serva Blue G250 0.175mM Fenol Rojo Inmunotransferencia.
Los extractos de proteína (10 µg proteínas/muestra) se resolvieron por SDS-PAGE usando 4-12% de geles Bis-Tris Midi (Invitrogen) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Las membranas se tiñeron con Ponceau Rojo después de transferirlas Los anticuerpos anti-CD49b y anti-GAPDH se usaron para diluir 1 :1000 y 1 :2000, respectivamente, en tampón de bloqueo que contiene 5% de leche seca no-grasa. Los anticuerpos secundarios conjugados. HRP se usaron 1:5000 en tampón de bloqueo que contiene 5% leche seca no-grasa.
Anticuerpos usados en el estudio • Anticuerpo monoclonal lgG2a anti-CD49b (cadena de integrina a2) de ratón (Becton Dickinson, cat. #611016); · Anticuerpo policlonal IgG anti-GAPDH (gliceraldehído 3-fosfato dehidrogenasa) de conejo (Santa Cruz Biotechnology, cat. # sc-25778); • Anticuerpos HRP-conjugado anti-ratón y anti-conejo (Pierce); • Biotina-anticuerpo monoclonal GBR500 (lote AT-220208A) recombinante humanizado; • Biotina-anticuerpo monoclonal lgG4 (lote AT-090108A) recombinante humanizado (Glenmark Pharmaceuticals S.A.); • Fluorolink™Cy™2 IgG de cabra anti-ratón (GE Healthcare, cat. # PA42002); · Streptavidina-FITC (BD Pharmingen, ca. # 554060).
Preparación de la muestra para inmunofluorescencia Las células se cultivaron en portaobjetos para cámara Lab-Tek (Nunc) por 48 horas (70,000 células/cámara), y después se fijaron con formaldehído 3.7% (v/v) por 20 minutos. Las células se lavaron dos veces con PBS, después saturadas por 30 minutos con una solución bloqueadora que contiene 1% (p/v) albúmina de suero bovino (BSA) y 0.3% (v/v) Tritón X-100 (Sigma-Aldrich) en PBS. Los anticuerpos primarios se añadieron a una dilución recomendada en solución bloqueadora. Después de 1 hora de incubación a 37°C, la solución se eliminó y células se lavaron dos veces con PBS.
Los anticuerpos secundarios, o alternativamente Streptavidina-FITC, se añadieron en la solución bloqueadora a una dilución recomendada junto con 1 mg/ml DRAQ5™ (Alexis, cat. # BOS-889-001-R200). Los portaobjetos se incubaron por 1 hora a 37°C, y después la solución se eliminó y las células se lavaron dos veces con PBS. El PBS se eliminó y los portaobjetos se montaron con cubreobjetos usando una solución Mowiol (Mowiol 4.88, Calbiochem cat. # 475904).
Microscopía confocal de barrido con láser Se obtuvieron los gráficos de inmunofluorescencia usando un microscopio Axioplan (Zeiss) acoplado con un sistema de barrido con láser Radiance 2000 (Bio-Rad, 40X objetivo, inmersión en aceite). La captación se realizó usando filtro Kalman (10 iteraciones); la alimentación láser fue igual para el mismo canal de fluorescencia en muestras diferentes.
Resultados y Conclusiones Análisis por inmunotransferencia de la expresión de CD49b en líneas celulares humanas La tinción con Ponceau rojo de las membranas confirmó la transferencia homogéneo de las proteínas celulares a la membrana.
Los análisis de inmunotransferencia para la expresión de CD49b y GAPDH se muestran en la Figura 3. En general, el CD49b se expresa de manera ubicua en líneas celulares adherentes, pero no en suspensión (leucemias - bloque 15 y SCLCs - bloque 20). Hay algunas excepciones de unas pocas líneas celulares adherentes con niveles de CD49b indetectables (por ejemplo, MIA PaCa-2 y U031), y contrariamente, de líneas celulares que crecen en suspensión expresando altos niveles de CD49b (CEM/VM1 y RS4-11). Todas las líneas celulares muestran una expresión consistente de GAPDH, usada como una carga/WB control.
Los altos niveles de CD49b se encuentran en las siguientes líneas celulares: - HT-1080 (fibrosarcoma); - BxPC-3 (adenocarcinoma páncreas); - CAL-12T (cáncer de pulmón de células no pequeñas); - NCI-H1299 (cáncer de pulmón de células no pequeñas); - TK10 (adenocarcinoma riñon); - SNB19 y U251 (glioblastomas); - A431 (carcinoma epidermoide).
Con respecto a los carcinomas colorectales, la mayoría de las 22 líneas probadas mostraron expresión relativa de CD49b homogénea, moderadamente alta. En solo 3/22 líneas probadas, los niveles de expresión fueron relativamente bajos, pero todavía fácilmente detectables por inmunotransferencia.
Detección de CD49b en líneas celulares seleccionadas por microscopía confocal usando Anticuerpo GBR500 La microscopía confocal se usó para probar si los datos de la inmunotransferencia obtenidos usando anti-CD49b de Becton-Dickinson correlacionó con la expresión de superficie celular usando GBR500. En las muestras estudiadas, las líneas celulares con alta expresión del antígeno evaluado por inmunotransferencia se encontraron además que exhibían inmunoreactividad específica en la membrana plasmática usando GBR500. Las líneas celulares de tumor humano que expresan CD49b en la membrana plasmática y que por lo tanto pudieran ser adecuadas para estudios in vivo incluyen las líneas HT-29 de carcinoma colorectal y BX-PC3 de carcinoma pancreático, aunque muchos otros candidatos se han identificado en este estudio.
Cinco líneas celulares seleccionadas (HT-1080, BxPC-3, MIAPaCa2, HT-29 y SW480) se inmunotiñeron con Biotina-GBR500 y biotina-hlgG4 ( isotipo no relacionado) y se analizaron por Microscopía confocal de barrido con láser. Estas líneas celulares tumorales se seleccionaron sobre la base de los resultados obtenidos por Transferencia de Western, usando el anticuerpo BD anti-CD49b: BxPC-3: carcinoma pancreático con alto nivel de CD49b MIAPaCa2: carcinoma pancreático con CD49b indetectable HT-29: carcinoma colorectal con nivel moderadamente alto de CD49b SW480: carcinoma colorectal con nivel relativamente bajo, pero detectable de CD49b La línea celular de fibrosarcoma HT1080, conocida por expresar altos niveles de CD49b, se usó como control positivo: la microscopía confocal confirma fuerte teñido de la membrana concentrado en las áreas similares a lamellipodia de la membrana plasmática (Figura 4).
Como se muestra en las imágenes reportadas en la Figura 5 (BxPC-3) y Figura 6 (MIA PaCa2) si parece haber correlación entre los datos de la inmunotransferencia obtenidos con el anticuerpo BD y los resultados de inmunocitoquímica obtenidos con GBR500: BxPC-3 son muy positivos, mientras que MIAPaCa2 son negativos para la tinción con GBR500. En particular, la microscopía confocal reveló inmunotinción fuerte con biotina-GRB500, pero no con biotina-hlgG4, de la membrana celular dentro de áreas de contacto célula-a-célula para BxPC-3. Este es un patrón de tinción distinto comparado con las células HT-1080, donde la tinción con GBR500 se confina a posiblemente a regiones tipo lamellipodia de la membrana plasmática.
La línea celular de adenocarcinoma de colon HT-29 mostró intensa inmunotinción con biotina-GRB500 (Figura 7), con una distribución similar a la observada en células BX-PC-3.
En células SW480, otra línea con baja expresión de CD49b según la inmunotransferencia, la tinción con biotina-GBR500 fue casi indistinguishibie a partir de la tinción con biotina-lgG4 (Figura 8), confirmando un bajo nivel de expresión de CD49b detectado por inmunotransferencia.
En conclusión la expresión de CD49b se detectó en la mayoría de las líneas celulares de carcinoma de colon, así como muchos otros tipos de tumor sólidos, donde se detecta comúnmente. La expresión de CD49b es relativamente rara en Carcinoma de pulmón de células pequeñas, y leucemias/linfomas. Las líneas celulares de mayor expresión según el análisis de inmunotransferencia son HT-1080 (fibrosarcoma), BxPC-3 (adenocarcinoma pancreático), CAL-12T (cáncer de pulmón de células no pequeñas), NCI-H1299 (cáncer de pulmón de células no pequeñas), TK10 ( adenocarcinoma renal), SNB19 y U251 (glioblastomas).
Ejemplo 5 Efecto de GBR500contra el xenoinjerto de cáncer de pulmón de células no pequeñas A549 en ratones atímicos nu/nu Se usaron ratones Nu/Nu macho, de Harían, Italia. Los animales se mantuvieron en cajas usando lecho de vapor de agua en autoclave (estéril), dieta y agua se ofrecieron ad libitum. Los animales se identificaron con un número único en una etiqueta en la oreja que aparecía en las hojas de datos. El peso corporal el día de la implantación del tumor fue: 24-31g.
Número de grupos- calendario de tratamiento: El número de grupo fue 4. número de animales/grupo fue 10. El tratamiento se inició el día después de la implantación del tumor hasta el día 27 según el régimen descrito en la Tabla 10.
Tabla 10: Grupos de tratamiento y diseño del estudio * IP: intraperitoneal ** El tratamiento empieza el día 6 después de los implantes del tumor Sustancias: Los compuestos de prueba se almacenaron a 4°C temperatura y se protegieron de la luz hasta el uso. Los compuestos de prueba se disolvieron en 0,03% Tween-80™ en tampón fosfato salino y se diluyeron inmediatamente antes del uso para alcanzar la concentración correcta (isotipo lgG4, Ha1/29 y GBR500 en PBS; Avastin ® en solución salina). Los tratamientos se administraron intraperitonealmente (IP) en un volumen de 10 ml/kg Tumor: La línea celular de carcinoma de pulmón epitelial A549 (ATCC® número: CCL-185) se usó como representativa para cáncer de pulmón de células no pequeñas. Los fragmentos de tumor a partir de un xenoinjerto A549 se implantaron subcutáneamente en el flanco izquierdo de los ratones atímicos desnudos. Los animales se examinaron regularmente para la aparición de tumores. Cuando los tumores medibles se establecieron en la mayoría de los ratones, los animales se asignaron en grupos de tratamiento, con un objetivo de 10 ratones por grupo (5 ratones por caja). Cuando el tratamiento empieza el volumen medio del tumor fue 120 mm3.
Evaluación de la actividad antitumoral en los modelos de xenoinjerto y toxicidad: Al menos dos veces a la semana, el crecimiento tumoral y el peso corporal neto se evaluaron. El crecimiento tumoral se evaluó con un calibre. Las dimensiones de los tumores se midieron regularmente con un calibre durante los experimentos, y la masa del tumor se calculó como sigue: Peso tumor (mg) ^Longitud (mm) - ancho 2 (mm) ¿ (mg/mm3 ) asumiendo densidad d = 1 mg/mm3 para el tejido tumoral La toxicidad se evaluó en base a la reducción del peso corporal. Los ratones se sacrificaron cuando los tumores alcanzaron un volumen que los dificultaba.
Resultados y Conclusiones: Como se puede observar a partir de la Tabla 11 la máxima actividad antitumoral de los grupos tratados con los anticuerpos se observó el día 17 con una inhibición del peso del tumor de 18% y 11% (Ha1/29 + GBR500 grupos de combinación respectivamente). La Avastin ®, administrada a 40 mg/kg, mostró una inhibición del crecimiento tumoral de 20% el día 28. En la Figura 9 se muestra la comparación del crecimiento tumoral promedio observada en los diferentes grupos de tratamiento. Los tratamientos fueron bienl tolerados y no hubo ratones muertos en los grupos tratados durante el experimento. No hubo signos de diestres durante y después de los tratamientos y no se observó pérdida significativa de peso corporal..
Tabla 11: Grupos de tratamiento y diseño del estudio Ejemplo 6 Tóxico-cinéticas de GBR500 en monos Cynomolgus Como parte de un estudio de toxicidad de 6-semanas con puntos extremos de toxicocinética, los monos Cynomolgus se dosificaron via infusión intravenosa lenta de GBR 500 durante aproximadamente 60 minutos. Los animales se dosificaron una vez por semana por seis semanas, (días 1 , 8, 15, 22, 29, y 36). La asignación del grupo de dosis y niveles de dosis se resumen en la Tabla 12 abajo: Tabla 12: Asignación del grupo de dosis y niveles de dosis Las muestras de sangre de 1 mi se tomaron de los animales el día 1 (predosis, 15 minutos, 4, 8, 24, 48 y 120 horas post infusión, Día 8 (predosis, 15 minutos post infusión), Día 15 (predosis, 15 minutos post infusión), Día 22 (predosis, 15 minutos post infusión), Día 29 (predosis, 15 minutos post infusión), Día 36 (predosis, 15 minutos, 4, 8, 24, 48 y 120 horas post infusión), y días 50, 57, 64, 71 , 78, 84, 91 , y 98. La concentración de GBR 500 se determinó con un ensayo ELISA validado.
El perfil tóxico-cinético (TK) de cada animal se caracterizó por análisis no compartamental de la V de GBR 500 en suero usando software de computadora validado (WinNonlin, versión 3.2, Pharsight Corp., Mountain View, California, USA). Un modelo se seleccionó basado en la ruta de administración vascular y la matriz del suero. La concentración al tiempo cero el día 1 se asumió que era 0 con propósitos de estimación del parámetro. Los valores de concentración en suero obtenidos en el punto de tiempo de la predosis se usaron para estimar la concentración en el momento cero el día 36.
Para los animales en recuperación del grupo 4, la vida media T1/2 se estimó entre 199 y 316 horas, el volumen de distribución Vz se estimó entre 10.1-23.6 mLAg, y la liquidación CL entre 0.03-0.60 mL/hr/kg. Los estimados de Vz y CL indicaron que GBR500 no se distribuyó más allá del plasma y fue muy lentamente eliminado de éste. Las Figuras 10A y 10 B muestran las curvas de concentración del grupo de dosis de 100 mg para monos macho y hembra.
Ejemplo 7 Evaluación In vitro de las potencias del anticuerpo anti-a2 integrina en inhibir la interacción entre la 2 integrina humana expresada en la línea celular de fibrosarcoma humano y colágeno humano Materiales y métodos Los ensayos de citometría de flujo e inhibición de unión al colágeno se realizaron como se describe en Ejemplo 1. Una línea celular de fibrosarcoma HT-1080 se usó en los experimentos (Tabla 13).
HT-1080 se tripsinizó para preparar células por citometría de flujo como es descrito para SK-BR-3 Table 13: Líneas celulares Resultados Tabla 14: Tinción FACS La expresión de VLA-2 por HT-1080 fue alta.
Ensayo de unión al colágeno Table 15: Valores de EC-50 Líneas celulares GBR500 ECS0 TMC-2206 EC50 HT-1080 0.076 ± 0.045 (n=3) 0.097 ± 0.038 (n=3) GBR 500 y TMC-2206 inhibieron la unión de células HT-1080 al colágeno humano I.
Conclusión La expresión de Iaa2 integrina en la línea celular de fibrosarcoma HT-1080 se detectó usando el anticuerpo GBR500 fluorescentemente marcado. El nivel de expresión VLA-2 es alto.
La línea celular HT-1080 positiva para VLA-2 se adhirió al colágeno humano tipo I. Esta unión se inhibió por los anticuerpos GBR 500 y TMC-2206 VLA-2.
Ejemplo 8 Efecto de GBR500 contra el xenoinjerto de fibrosarcoma HT-1080 en ratones atímicos nu/nu Se usaron ratones Nu/Nu macho, de Harían, Italia. Los animales se mantuvieron en cajas usando lecho de vapor de agua en autoclave (estéril), dieta y agua se ofrecieron ad libitum. Los animales se identificaron con un número único en una etiqueta en la oreja que aparecía en las hojas de datos. El peso corporal el día de la implantación del tumor fue: 24-31g.
Número de grupos- calendario de tratamiento: El número de grupos fue 5. El número de animales/grupo fue 4. El tratamiento se inició según el régimen descrito en la Tabla 16.
Tabla 16: Grupos de tratamiento y diseño del estudio * IP: intraperitoneal El tratamiento empieza el día 6 después de los implantes del tumor Sustancias: Los compuestos de prueba se almacenaron a 4°C temperatura y se protegieron de la luz hasta el uso. Los compuestos de prueba se disolvieron en 0,03% Tween-80™ en tampón fosfato salino y se diluyeron inmediatamente antes del uso para alcanzar la concentración correcta (isotipo lgG4 , Ha1/29 y GBR500 en PBS; Avastin ® en solución salina). Los tratamientos se administraron intraperitonealmente (IP) en un volumen de 10 ml/kg Tumor: La línea celular de fibrosarcoma HT-1080 (ATCC® número: CCL-121) se usó. Los fragmentos de tumor de un xenoinjerto HT-1080 se implantaron subcutáneamente en el flanco izquierdo de los ratones atímicos desnudos. Los animales se examinaron regularmente para la aparición de tumores. Cuando los tumores medibles se establecieron en la mayoría de los ratones, los animales se asignaron en grupos de tratamiento, con un objetivo de 10 ratones por grupo (5 ratones por caja). Cuando el tratamiento empieza el volumen medio del tumor fue aproximadamente 300 mm3.
Evaluación de la actividad antitumoral en los modelos de xenoinjerto y toxicidad: Al menos dos veces a la semana, el crecimiento tumoral y el peso corporal neto se evaluaron. El crecimiento tumoral se evaluó con un calibre. Las dimensiones de los tumores se midieron regularmente con un calibre durante los experimentos, y la masa del tumor se calculó como sigue: Peso tumor (mg) ^Longitud (mm) ' ancho (mm) ¿ (mg/mm3) asumiendo densidad d = 1 mg/mm3 para el tejido tumoral La toxicidad se evaluó en base a la reducción del peso corporal. Los ratones se sacrificaron cuando los tumores alcanzaron un volumen que los dificultaba.
Resultados y Conclusiones: El día 11 , después de dos dosis del anticuerpo, la Avastina indujo una reducción del peso del tumor de 31.6% en relación al control. La combinación Ha 1/29 5mg/GBR500 5 mg indujo a una reducción del peso del tumor de 3.5% y la combinación Ha 1/29 5mg/GBR500 50 mg indujo a una reducción del peso del tumor de 27.7% (Tabla 17).
Tabla 17: Grupos de tratamiento y diseño del estudio Los tratamientos fueron bienl tolerados y no hubo ratones muertos en los grupos tratados durante el experimento. No hubo signos de diestres durante y después de los tratamientos y no se observó pérdida significativa de peso corporal.

Claims (80)

Reivindicaciones
1. Un método para el tratamiento del cáncer seleccionado del grupo consistentede cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón que incluyen cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón, y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer de estómago o gástrico que incluye cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer colorectal carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de las glándulas salivares, cáncer renal o del riñón, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de la vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello, así como linfoma de células B que incluyen linfoma no de Hodgkin (NHL) folicular/ grado bajo; NHL linfocítico pequeño (SL); NHL folicular/grado intermedio; NHL difuso de grado intermedio; NHL inmunoblástico de grado alto; NHL linfoblástico de grado alto; NHL de células no hendidas pequeñas de grado alto; NHL con enfermedad de gran carga tumoral; linfoma de células del manto; linfoma relacionado con el SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom; leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crónica; y trastorno linfoproliferativo post-trasplante (PTLD), así como proliferación vascular anormal asociadas con facomatosis, edema tal como el asociado con tumores cerebrales, síndrome de Meigs, melanoma, mesotelioma, mieloma múltiple, fibrosarcoma, osteosarcoma, y carcinoma epidermoide, caracterizado porque comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti- integrina a2 humanizado que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, sec. con núm. de ident.:2), (b) HCDR1 (GFSLTNYGIH, sec. con núm. de ident.:1), HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, sec. con núm. de ident.:2) y HCDR3 (ANDGVYYAMDY, sec. con núm. de ident.:3), o (c) sec. con núm. de ident.:40 y/o una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) una LCDR1 seleccionada de SANSSVNYIH (sec. con núm. de ident.:4) o SAQSSVNYIH (sec. con núm. de ident.:112), (b) LCDR2 (DTSKLAS; sec. con núm. de ident.:5) y (c) LCDR3 (QQWTTNPLT, sec. con núm. de ident.:6).
2. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.:185.
3. El método de la reivindicación 2, caracterizado porque la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.:185 en la cual la posición 30 es Thr y/o la posición 31 es Asn.
4. El método de la reivindicación 2, caracterizado porque la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ¡dent.:185 en la cual (a) la posición 71 es Lys, (b) la posición 73 es Asn, (c) la posición 78 es Val, o (d) cualquier combinación de (a)-(c).
5. El método de la reivindicación 1 , caracterizado porque la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácido seleccionada de las sec. con núm. de ident.:70-79 y sec. con núm. de ident: 109-111.
6. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la región variable de cadena pesada comprende una secuencia.de aminoácido seleccionada de las sec. con núm. de ident.:70-75, sec. con núm. de ident.:77-79 y sec. con núm. de ident.: 109-111.
7. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la región variable de cadena pesada comprende además una región FW4 que comprende la secuencia de aminoácidos WGQGTLVTVSS (sec. con núm. de ident. :13
8. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de HCDR1 (sec. con núm. de ident.:1), HCDR2 (sec. con núm. de ident.:2) y HCDR3 (sec. con núm. de ident.:3).
9. El método de la reivindicación 1 , caracterizado porque el anticuerpo anti- integrina ct2 humanizado comprende una cadena pesada que comprende sec. con núm. de ident.: 187.
10. El método de la reivindicación 1 , caracterizado porque la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.: 186.
1 . El método de la reivindicación 10, caracterizado porque la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.: 186 en la cual la asparagina (N) en la posición 26 del aminoácido se reemplaza por glutamina (Q).
12. El método de la reivindicación 10, caracterizado porque la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.: 186 en la cual (a) la posición 2 es Phe, (b) la posición 45 es Lys, (c) la posición 48 es Tyr, o (d) cualquier combinación de (a)-(c).
13. El método de la reivindicación 1 , caracterizado porque la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácido seleccionada de sec. con núm. de ¡dent.:41 , sec. con núm. de ident.:80-92 y sec. con núm. de ident.:108.
14. El método de la reivindicación 1 , caracterizado porque la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácido seleccionada de las sec. con núm. de ident.:90-92.
15. El método de la reivindicación 1 , caracterizado porque la región variable de cadena ligera comprende además una región FW4 que comprende la secuencia de aminoácidos FGQGTKVEIK (sec. con núm. de ident.:38).
16. El método de la reivindicación 1 , caracterizado porque la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de LCDR1 (sec. con núm. de ident.:4), LCDR2 (sec. con núm. de ident.:5) y LCDR3 (sec. con núm. de ident.:6).
17. El método de la reivindicación 1 , caracterizado porque la región variable de cadena' ligera comprende la secuencia de aminoácidos de LCDR1 (sec. con núm. de ident.:112), LCDR2 (sec. con núm. de ident.:5) y LCDR3 (sec. con núm. de ident.:6).
18. El método de la reivindicación 1 , caracterizado porque el anticuerpo anti- integrina a2 humanizado comprende una cadena ligera que comprende sec. con núm. de ident.:188,
19. El método de la reivindicación 1 , caracterizado porque el anticuerpo anti- integrina a.2 humanizado comprende: (i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, sec. con núm. de ident.:2), (b) HCDR1 (GFSLTNYGIH, sec. con núm. de ident.:1), HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, sec. con núm. de ident.:2) y HCDR3 (ANDGVYYAMDY, sec. con núm. de ident.:3), o (c) sec. con núm. de ident.:40; y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) una LCDR1 seleccionada de SANSSVNYIH (sec. con núm. de ident.:4) o SAQSSVNYIH (sec. con núm. de ident.:1 12), (b) LCDR2 (DTSKLAS; sec. con núm. de ident.:5) y (c) LCDR3. (QQWTTNPLT, sec. con núm. de ident.:6).
20. El método de la reivindicación 1 , caracterizado porque el anticuerpo anti- integrina ct2 humanizado comprende: (i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) HCDR1 (GFSLTNYGIH, sec. con núm. de ident.:1), HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, sec. con núm. de ident.:2) y HCDR3 (ANDGVYYAMDY, sec. con núm. de ident.:3), o (b) sec. con núm. de ident.:40; y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) una LCDR1 seleccionada de SANSSVNYIH (sec. con núm. de ident.:4) o SAQSSVNYIH (sec. con núm. de ¡dent.:112), (b) LCDR2 (DTSKLAS; sec. con núm. de ident.:5) y (c) LCDR3 (QQWTTNPLT, sec. con núm. de ident.:6).
21. El método de la reivindicación 1 , caracterizado porque el anticuerpo anti- integrina a2 humanizado comprende: (i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de HCDR1 (GFSLTNYGIH, sec. con núm. de ident.:1), HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, sec. con núm. de ident.:2) y HCDR3 (ANDGVYYAMDY, sec. con núm. de ident.:3); y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de LCDR1 (SAQSSVNYIH, sec. con núm. de ident.:112), LCDR2 (DTSKLAS; sec. con núm. de ident.:5) y LCDR3 (QQWTTNPLT, sec. con núm. de ident.:6).
22. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque (a) la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.:185, (b) la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.:186, o (c) ambas (a) y (b).
23. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque (a) la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.:185 en la cual la posición 30 es Thr y/o la posición 31 es Asn; (b) la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.:186 en la cual la asparagina (N) en la posición 26 del aminoácido se reemplaza por glutamina (Q); o (c) ambas (a) y (b).
24. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque (i) la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.:185 en la cual (a) la posición 71 es Lys, (b) la posición 73 es Asn, (c) la posición 78 es Val, o (d) cualquier combinación de (a)-(c); (ii) la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.:186 en la cual (a) la posición 2 es Phe, (b) la posición 45 es Lys, (c) la posición 48 es Tyr, o (d) cualquier combinación de (a)-(c); o (iii) ambos (i) y (ii).
25. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque (a) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácido seleccionada de las sec. con núm. de ident.:70- 79 y sec. con núm. de ident.: 109-111 ; (b) la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácido seleccionada de sec. con núm. de ident. :41 , sec. con núm. de ident.:80-92 y sec. con núm. de ident.: 108; o (c) ambas (a) y (b).
26. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque (a) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácido seleccionada de las sec. con núm. de ident.:70- 75, sec. con núm. de ident.:77-79 y sec. con núm. de ident.: 109-111 ; (b) la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácido seleccionada de las sec. con núm. de ident. :90-92; o (c) ambas (a) y (b).
27. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque el anticuerpo anti- integrina a2 humanizado comprende una cadena pesada que comprende sec. con núm. de ident.:187 y una cadena ligera que comprende sec. con núm. de ident.:188.
28. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque el anticuerpo anti- integrina a2 humanizado comprende una cadena pesada que comprende sec. con núm. de ident.:174 o sec. con núm. de ident.:176 y una cadena ligera que comprende sec. con núm. de ident.:178.
29. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-28, caracterizado porque el anticuerpo anti- integrina a2 humanizado reconoce el dominio I de la integrina a2 humana.
30. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-28, caracterizado porque el anticuerpo anti- integrina a2 humanizado se une a la integrina a2ß1.
31. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-28, caracterizado porque el anticuerpo anti- integrina <x2 humanizado inhibe la unión deot2 o integrina a2ß1 a un ligando de integrina a2ß1.
32. El método de la reivindicación 31 , caracterizado porque el ligando de integrina a2ß1 se selecciona de colágeno, laminina, Echovirus-1 , decorina, cadherina E, metaloproteinasa de la matriz I (MMP-I), endorepelina, colectina y proteina del complemento C1q.
33. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-28, caracterizado porque el anticuerpo anti- integrina cc2 humanizado se une a un epítopo de integrina al, el epítopo comprende: (a) un residuo de Lys que corresponde a la posición 19 de la secuencia de aminoácido de la integrina al expuesta en la sec. con núm. de ident.:8 o la posición 40 de la secuencia de aminoácido del dominio I de la integrina al expuesta en la sec. con núm. de ident.: 1 ; (b) un residuo Asn que corresponde a la posición 225 de la secuencia de aminoácido de la integrina al expuesta en la sec. con núm. de ident. :8 o la posición 73 de la secuencia de aminoácido del dominio I de la integrina al expuesta en la sec. con núm. de ident.:11 ; (c) un residuo Gln que corresponde a la posición 241 de la secuencia de aminoácido de la integrina oc2 expuesta en la sec. con núm. de ident. :8 o la posición 89 de la secuencia de aminoácido del dominio I de la integrina al expuesta en la sec. con núm. de ident.:11 ; (d) un residuo Tyr que corresponde a la posición 245 de la secuencia de aminoácido de la integrina al expuesta en la sec. con núm. de ident. :8 o la posición 93 de la secuencia de aminoácido del dominio I de la integrina al expuesta en la sec. con núm. de ident.:11 ; (e) un residuo Arg que corresponde a la posición 317 de la secuencia de aminoácido de la integrina a2 expuesta en la sec. con núm. de ident.:8 o la posición 165 de la secuencia de aminoácido del dominio I de la integrina <x2 expuesta en la sec. con núm. de ident.:11 ¡ (f) un residuo Asn que corresponde a la posición 318 de la secuencia de aminoácido de la integrina ct2 expuesta én la sec. con núm. de ident.:8 o la posición 166 de la secuencia de aminoácido del dominio I de la integrina <x2 expuesta en la sec. con núm. de ident.:11 ; or (g) cualquier combinación de (a) a (f).
34. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-33, caracterizado porque el anticuerpo anti- integrina a2 humanizado es un anticuerpo de longitud completa.
35. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-33, caracterizado porque el anticuerpo anti- integrina a2 humanizado es un fragmento de unión al antígeno.
36. Un método de tratamiento de cáncer seleccionado del grupo consistentede cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón que incluyen cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón, y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer de estómago o gástrico que incluye cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer colorectal carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de las glándulas salivares, cáncer renal o del riñon, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de la vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello, así como linfoma de células B que incluyen linfoma no de Hodgkin (NHL) folicular/ grado bajo; NHL linfocítico pequeño (SL); NHL folicular/grado intermedio; NHL difuso de grado intermedio; NHL inmunoblástico de grado alto; NHL linfoblástico de grado alto; NHL de células no hendidas pequeñas de grado alto; NHL con enfermedad de gran carga tumoral; linfoma de células del manto; linfoma relacionados con el SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom; leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crónica; y trastorno linfoproliferativo post-trasplante (PTLD), así como proliferación vascular anormal asociadas con facomatosis, edema tal como el asociado con tumores cerebrales, síndrome de Meigs, melanoma, mesotelioma, mieloma múltiple, fibrosarcoma, osteosarcoma, yy carcinoma epidermoide, que comprende administrar a un sujeto una composición que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti- integrina cc2 humanizado que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, sec. con núm. de ident.:2), (b) HCDR1 (GFSLTNYGIH, sec. con núm. de ident.:1), HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, sec. con núm. de ¡dent.:2) y HCDR3 (ANDGVYYAMDY, sec. con núm. de ident.:3), o (c) sec. con núm. de ident.:40 y/o una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) una LCDR1 seleccionada de SANSSVNYIH (sec. con núm. de ident.:4) o SAQSSVNYIH (sec. con núm. de ident.:112), (b) LCDR2 (DTSKLAS; sec. con núm. de ident.:5) y (c) LCDR3 (QQWTTNPLT, sec. con núm. de ident.:6) y un portador farmacéuticamente aceptable.
37. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-36, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón, y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer de estómago o gástrico incluyendo cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer colorectal, carcinoma endometrial o uterino , carcinoma de las glándulas salivares, cáncer renal o del riñon, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de la vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello, así como linfoma de células B incluyendo linfoma no de Hodgkin folicular/ grado bajo (NHL); NHL linfocítico pequeño (SL); NHL folicular/grado intermedio ; NHL difuso de grado intermedio ; NHL inmunoblástico de grado alto; NHL linfoblástico de grado alto; NHL de células no hendidas pequeñas de grado alto; NHL con enfermedad de gran carga tumoral; linfoma de células del manto; linfoma relacionados con el SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom; leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crónica; y trastorno linfoproliferativo post-trasplante (PTLD), así como proliferación vascular anormal asociadas con facomatosis, edema tal como that asociadas con tumores cerebrales, síndrome de Meigs, melanoma, mesotelioma, y mieloma múltiple.
38. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-36, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de mamas, cáncer colorectal, rectal cáncer cáncer de pulmón de células no pequeñas, linfoma de no- Hodgkins (NHL), cáncer de células renales, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer pancreático, sarcoma de tejido blando, sarcoma de kaposi, carcinoma carcinoide, cáncer de cabeza y cuello, melanoma, cáncer de ovario, mesotelioma, mieloma múltiple, colorectal metastásico y cáncer de mamas metastásico.
39. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-36, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer colorectal, cáncer de riñon, cáncer de próstata, mesotelioma, fibrosarcoma, osteosarcoma, carcinoma epidermoide, cáncer colorectal metastásico, de próstata metastásico y de mamas metastásico.
40. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-36, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer pancreático, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer colorectal, cáncer de pulmón de células no pequeñas, fibrosarcoma, cáncer colorectal metastásico y de mamas metastásico.
41. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-36, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer pancreático, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer colorectal, cáncer de pulmón de células no pequeñas, y fibrosarcoma.
42. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-36, caracterizado porque el cáncer es cáncer pancreático, cáncer de mamas o cáncer de mamas metastásico.
43. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-42, caracterizado porque el anticuerpo o la composición se administra por infusiónintravenosa o bolo intravenoso.
44. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-42, caracterizado porque la cantidad terapéuticamente efectiva se encuentra en el intervalo de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 mg/kg.
45. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-42, caracterizado porque el anticuerpo o la composición se administra una vez cada dos semanas.
46. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-42, caracterizado porque el método no se asocia con (a) activación plaquetaria, (b) agregación plaquetaria, (c) una disminución del conteo de plaquetas circulantes, (d) complicaciones de sangramiento, o (e) cualquier combinación de (a) a (d).
47. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-46, caracterizado porque el anticuerpo o la composición es co-administrada con uno o más medicamentos para el cáncer.
48. El método de la reivindicación 47, caracterizado porque el uno o más medicamentos coadministrado para el cáncer comprende otro anticuerpo, agente quimio-terapéutico, agente citotóxico, agente anti-angiogénico, agente inmunosupresivo, profármaco, citocina, antagonista de citocina, radioterapia citotóxica, corticosteroide, antiemético, vacuna contra el cáncer, analgésico, agente anti-vascular, o agente inhibidor del crecimiento.
49. Un anticuerpo anti- integrina a2 humanizado que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, sea con núm. de ident.:2), (b) HCDR1 (GFSLTNYGIH, sec. con nüm. de ¡dent.:1), HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, sec. con núm. de ident.:2) y HCDR3 (ANDGVYYAMDY, sec. con núm. de ident.:3), o (c) sec. con núm. de ident.:40 y/o una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) una LCDR1 seleccionada de SANSSVNYIH (sec. con núm. de ident.:4) o SAQSSVNYIH (sec. con núm. de ident.:112), (b) LCDR2 (DTSKLAS; sec. con núm. de ident.:5) y (c) LCDR3 (QQWTTNPLT, sec. con núm. de ident.:6) o una composición que comprende dicho anticuerpo anti- integrina <x2 humanizado y un portador farmacéuticamente aceptable para su uso en un método para el tratamiento de cáncer seleccionado del grupo que consiste de cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón que incluyen cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón, y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer de estómago o gástrico que incluyen cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer colorectal, carcinoma endometrial o uterino , carcinoma de las glándulas salivares, cáncer renal o del riñon, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de la vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello, así como linfoma de células B incluyendo linfoma no de Hodgkin folicular/ grado bajo (NHL); NHL linfocítico pequeño (SL); NHL folicular/grado intermedio ; NHL difuso de grado intermedio; NHL inmunoblástico de grado alto; NHL linfoblástico de grado alto; NHL de células no hendidas pequeñas de grado alto; , NHL con enfermedad de gran carga tumoral; linfoma de células del manto; linfoma relacionados con el SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom; leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crónica; y trastorno linfoproliferativo post-trasplante (PTLD), así como proliferación vascular anormal asociadas con facomatosis, edema tal como that asociadas con tumores cerebrales, síndrome de Meigs, melanoma, mesotelioma, mieloma múltiple, fibrosarcoma, osteosarcoma, y carcinoma epidermoide.
50. El anticuerpo anti- integrina a2 humanizado o la composición de la reivindicación 49, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón, y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer de estómago o gástrico incluyendo cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer colorectal, carcinoma endometrial o uterino , carcinoma de las glándulas salivares, cáncer renal o del riñón, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de la vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello, así como linfoma de células B incluyendo linfoma no de Hodgkin folicular/ grado bajo (NHL); NHL linfocítico pequeño (SL); NHL folicular/grado intermedio ; NHL difuso de grado intermedio ; NHL inmunoblástico de grado alto; NHL linfoblástico de grado alto; NHL de células no hendidas pequeñas de grado alto; NHL con enfermedad de gran carga tumoral; linfoma de células del manto; linfoma relacionados con el SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom; leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crónica; y trastorno linfoproliferativo post-trasplante (PTLD), así como proliferación vascular anormal asociadas con facomatosis, edema tal como that asociadas con tumores cerebrales, síndrome de Meigs, melanoma, mesotelioma, y mieloma múltiple.
51. El anticuerpo anti- integrina <x2 humanizado o la composición de la reivindicación 49, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de mamas, cáncer colorectal, rectal cáncer cáncer de pulmón de células no pequeñas, linfoma de no- Hodgkins (NHL), cáncer de células renales, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer pancreático, sarcoma de tejido blando, sarcoma de kaposi, carcinoma carcinoide, cáncer de cabeza y cuello, melanoma, cáncer de ovario, mesotelioma, mieloma múltiple, colorectal metastásico y cáncer de mamas metastásico.
52. El anticuerpo anti- integrina a2 humanizado o la composición de la reivindicación 49, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer colorectal, cáncer de riñon, cáncer de próstata, mesotelioma, fibrosarcoma, osteosarcoma, y carcinoma epidermoide, cáncer colorectal metastásico, de próstata metastásico y de mamas metastásico.
53. El anticuerpo anti- integrina oc2 humanizado o la composición de la reivindicación 49, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer pancreático, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer colorectal, cáncer de pulmón de células no pequeñas, fibrosarcoma, cáncer colorectal metastásico, y cáncer de mamas metastásico.
54. El anticuerpo anti- integrina al humanizado o la composición de la reivindicación 49, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer pancreático, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer colorectal, cáncer de pulmón de células no pequeñas, y fibrosarcoma.
55. El anticuerpo anti- integrina a2 humanizado o la composición de la reivindicación 49, caracterizado porque el cáncer es cáncer pancreático, cáncer de mamas o cáncer de mamas metastásico.
56. Uso de un anticuerpo anti- integrina a2 humanizado que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, sea con núm. de ident.:2), (b) HCDR1 (GFSLTNYGIH, sec. con núm. de ident.:1), HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, sec. con núm. de ident.:2) y HCDR3 (ANDGVYYAMDY, sec. con núm. de ident.:3), o (c) sec. con núm. de ident.:40 y/o una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) una LCDR1 seleccionada de SANSSVNYIH (sec. con núm. de ident.:4) o SAQSSVNYIH (sec. con núm. de ident.:112), (b) LCDR2 (DTSKLAS; sec. con núm. de ident.:5) y (c) LCDR3 (QQWTTNPLT, sec. con núm. de ident.:6) o una composición que comprende dicho anticuerpo anti- integrina a2 humanizado y un portador farmacéuticamente aceptable para la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer seleccionado del grupo que consiste de cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón, y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer de estómago o gástrico incluyendo cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer colorectal, carcinoma endonietrial o uterino , carcinoma de las glándulas salivares, cáncer renal o del riñon, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de la vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello, así como linfoma de células B incluyendo linfoma no de Hodgkin folicular/ grado bajo (NHL); NHL linfocítico pequeño (SL); NHL folicular/grado intermedio ; NHL difuso de grado intermedio ; NHL inmunoblástico de grado alto; NHL linfoblástico de grado alto; NHL de células no hendidas pequeñas de grado alto; NHL con enfermedad de gran carga tumoral; linfoma de células del manto; linfoma relacionados con el SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom; leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crónica; y trastorno linfoproliferativo post-trasplante (PTLD), así como proliferación vascular anormal asociadas con facomatosis, edema tal como that asociadas con tumores cerebrales, síndrome de Meigs, melanoma, mesotelioma, mieloma múltiple, fibrosarcoma, osteosarcoma, y carcinoma epidermoide.
57. El uso del anticuerpo anti- integrina a2 humanizado o la composición de acuerdo con la reivindicación 56, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón, y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer de estómago o gástrico incluyendo cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer colorectal, carcinoma endometrial o uterino , carcinoma de las glándulas salivares, cáncer renal o del riñon, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de la vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello, así como linfoma de células B incluyendo linfoma no de Hodgkin folicular/ grado bajo (NHL); NHL linfocítico pequeño (SL); NHL folicular/grado intermedio ; NHL difuso de grado intermedio ; NHL inmunoblástico de grado alto; NHL linfoblástico de grado alto; NHL de células no hendidas pequeñas de grado alto; NHL con enfermedad de gran carga tumoral; linfoma de células del manto; linfoma relacionados con el SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom; leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crónica; y trastorno linfoproliferativo post-trasplante (PTLD), así como proliferación vascular anormal asociadas con facomatosis, edema tal como that asociadas con tumores cerebrales, síndrome de Meigs, melanoma, mesotelioma, y mieloma múltiple.
58. El uso del anticuerpo anti- integrina a2 humanizado o la composición de acuerdo con la reivindicación 56, caracterizado porque el cáncer se selecciona del. grupo que consiste de cáncer de mamas, cáncer colorectal, rectal cáncer cáncer de pulmón de células no pequeñas, linfoma de no- Hodgkins (NHL), cáncer de células renales, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer pancreático, sarcoma de tejido blando, sarcoma de kaposi, carcinoma carcinoide, cáncer de cabeza y cuello, melanoma, cáncer de ovario, mesotelioma, mieloma múltiple, colorectal metastásico y cáncer de mamas metastásico.
59. El uso del anticuerpo anti- integrina a2 humanizado o la composición de acuerdo con la reivindicación 56, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer colorectal, cáncer de riñon, cáncer de próstata, mesotelioma, fibrosarcoma, osteosarcoma, carcinoma epidermoide, cáncer colorectal metastásico, de próstata metastásico y de mamas metastásico.
60. El uso del anticuerpo anti- integrina a2 humanizado o la composición de acuerdo con la reivindicación 56, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer pancreático, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer colorectal, cáncer de pulmón de células no pequeñas, fibrosarcoma, metastatic colorectal, y cáncer de mamas metastásico.
61. El uso del anticuerpo anti- integrina o2 humanizado o la composición de acuerdo con la reivindicación 56, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer pancreático, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer colorectal, cáncer de pulmón de células no pequeñas, y fibrosarcoma.
62. El uso del anticuerpo anti- integrina a2 humanizado o la composición de acuerdo con la reivindicación 56, caracterizado porque el cáncer es cáncer pancreático, cáncer de mamas o cáncer de mamas metastásico.
63. Un kit para el tratamiento de cáncer seleccionado del grupo que consiste de cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón, y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer de estómago o gástrico incluyendo cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer colorectal, carcinoma endometrial o uterino , carcinoma de las glándulas salivares, cáncer renal o del riñon, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de la vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello, así como linfoma de células B incluyendo linfoma no de Hodgkin folicular/ grado bajo (NHL); NHL linfocítico pequeño (SL); NHL folicular/grado intermedio ; NHL difuso de grado intermedio ; NHL inmunoblástico de grado alto; NHL linfoblástico de grado alto; NHL de células no hendidas pequeñas de grado alto; NHL con enfermedad de gran carga tumoral; linfoma de células del manto; linfoma relacionados con el SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom; leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crónica; y trastorno linfoproliferativo post-trasplante (PTLD), así como proliferación vascular anormal asociadas con facomatosis, edema tal como that asociadas con tumores cerebrales, síndrome de Meigs, melanoma, mesotelioma, mieloma múltiple, fibrosarcoma, osteosarcoma, y carcinoma epidermoide, en un paciente humano que comprende un empaque que comprende un anticuerpo anti- integrina a2 humanizado composición que comprende un anticuerpo anti- integrina al humanizado que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) HCDR2 (VI WARG FTN YNSALMS , sec. con núm. de ident.:2), (b) HCDR1 (GFSLTNYGIH, sec. con núm. de ident.:1), HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, sec. con núm. de ident.:2) y HCDR3 (ANDGVYYAMDY, sec. con núm. de ident.:3), o (c) sec. con núm. de ident.:40 y/o una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) una LCDR1 seleccionada de SANSSVNYIH (sec. con núm. de ident.:4) o SAQSSVNYIH (sec. con núm. de ident.:112), (b) LCDR2 (DTSKLAS; sec. con núm. de ident.:5) y (c) LCDR3 (QQWTTNPLT, sec. con núm. de ident.:6) e instrucciones para usar dicho anticuerpo anti- integrina a2 humanizado para dicho tratamiento.
64. El kit de la reivindicación 63, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón, y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer de estómago o gástrico incluyendo cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer colorectal, carcinoma endometrial o uterino , carcinoma de las glándulas salivares, cáncer renal o del riñon, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de la vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello, así como linfoma de células B incluyendo linfoma no de Hodgkin folicular/ grado bajo (NHL); NHL linfocítico pequeño (SL); NHL folicular/grado intermedio ; NHL difuso de grado intermedio ; NHL inmunoblástico de grado alto; NHL linfoblástico de grado alto; NHL de células no hendidas pequeñas de grado alto; NHL con enfermedad de gran carga tumoral; linfoma de células del manto; linfoma relacionados con el SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom; leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crónica; y trastorno linfoproliferativo post-trasplante (PTLD), así como proliferación vascular anormal asociadas con facomatosis, edema tal como that asociadas con tumores cerebrales, síndrome de Meigs, melanoma, mesotelioma, y mieloma múltiple
65. El kit de la reivindicación 63, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de mamas, cáncer colorectal, cáncer rectal, cáncer de pulmón de células no pequeñas, linfoma de no- Hodgkins (NHL), cáncer de células renales, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer pancreático, sarcoma de tejido blando, sarcoma de kaposi, carcinoma carcinoide, cáncer de cabeza y cuello, melanoma, cáncer de ovario, mesotelioma, mieloma múltiple, cáncer colorectal metastásico y cáncer de mamas metastásico.
66. El kit de la reivindicación 63, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer colorectal, cáncer de riñon, cáncer de próstata, mesotelioma, fibrosarcoma, osteosarcoma, y carcinoma epidermoide, cáncer colorectal metastásico, de próstata metastásico y de mamas metastásico.
67. El kit de la reivindicación 63, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer pancreático, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer de pulmón de células no pequeñas, fibrosarcoma, cáncer colorectal, metastatic colorectal, y cáncer de mamas metastásico.
68. El kit de la reivindicación 63, caracterizado porque caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer pancreático, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer colorectal, cáncer de pulmón de células no pequeñas, y fibrosarcoma.
69. El kit de la reivindicación 63, caracterizado porque el cáncer es cáncer pancreático, cáncer de mamas o cáncer de mamas metastásico.
70. The kit de la reivindicación 63, caracterizado porque el anticuerpo anti- integrina <x2 humanizado comprende: (i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) HCDR1 (GFSLTNYGIH, sea con núm. de ident.:1), HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, sec. con núm. de ident.:2) y HCDR3 (ANDGVYYA DY, sec. con núm. de ident.:3), o (b) sec. con núm. de ident.:40; y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) una LCDR1 seleccionada de SANSSVNYIH (sec. con núm. de ident.:4) o SAQSSVNYIH (sec. con núm. de ident.:112), (b) LCDR2 (DTSKLAS; sec. con núm. de ident.:5) y (c) LCDR3 (QQWTTNPLT, sec. con núm. de ident.:6).
71. El kit dé la reivindicación 63, caracterizado porque el anticuerpo anti- integrina a2 humanizado comprende: (i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de HCDR1 (GFSLTNYGIH, sec. con núm. de ident.:1), HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, sec. con núm. de ident.:2) y HCDR3 (ANDGVYYAMDY, sec. con núm. de ident.:3); y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de LCDR1 (SAQSSVNYIH, sec. con núm. de ident.:112), LCDR2 (DTSKLAS; sec. con núm. de ident.:5) y LCDR3 (QQWTTNPLT, sec. con núm. de ident.:6).
72. Un artículo de fabricación que comprende un anticuerpo anti- integrina a2 humanizado que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) HCDR2 (VIWARGFTNYNSAL S, sec. con núm. de ident.:2), (b) HCDR1 (GFSLTNYGIH, sec. con núm. de ¡dent.:1), HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, sec. con núm. de ident.:2) y HCDR3 (ANDGVYYAMDY, sec. con núm. de ident.:3), o (c) sec. con núm. de ident.:40 y/o una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) una LCDR1 seleccionada de SANSSVNYIH (sec. con núm. de ident.:4) o SAQSSVNYIH (sec. con núm. de ident.:112), (b) LCDR2 (DTSKLAS; sec. con núm. de ident.:5) y (c) LCDR3 (QQWTTNPLT, sec. con núm. de ident.:6) un contenedor y una etiqueta que indica el uso de dicho anticuerpo anti-integrina cc2 humanizado para el tratamiento de cáncer seleccionado del grupo que consiste de cáncer de células escamosas; cáncer de pulmón incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón, y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer de estómago o gástrico incluyendo cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer colorectal, carcinoma endometrial o uterino , carcinoma de las glándulas salivares, cáncer renal o del riñon, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de la vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello, así como linfoma de células B incluyendo linfoma no de Hodgkin folicular/ grado bajo (NHL); NHL linfocítico pequeño (SL); NHL folicular/grado intermedio; NHL difuso de grado intermedio; NHL inmunoblástico de grado alto; NHL linfoblástico de grado alto; NHL de células no hendidas pequeñas de grado alto; NHL con enfermedad de gran carga tumoral; linfoma de células del manto; linfoma relacionados con el SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom; leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crónica; y trastorno linfoproliferativo post-tras plante (PTLD), así como proliferación vascular anormal asociadas con facomatosis, edema tal como that asociadas con tumores cerebrales, síndrome de Meigs, melanoma, mesotelioma, mieloma múltiple fibrosarcoma, osteosarcoma y carcinoma epidermoide.
73. El artículo de fabricación de la reivindicación 72, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón, y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer de estómago o gástrico incluyendo cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer colorectal, carcinoma endometrial o uterino , carcinoma de las glándulas salivares, cáncer renal o del riñon, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de la vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello, así como linfoma de células B incluyendo linfoma no de Hodgkin folicular/ grado bajo (NHL); NHL linfocítico pequeño (SL); NHL folicular/grado intermedio ; NHL difuso de grado intermedio ; NHL inmunoblástico de grado alto; NHL linfoblástico de grado alto; NHL de células no hendidas pequeñas de grado alto; NHL con enfermedad de gran carga tumoral; linfoma de células del manto; linfoma relacionados con el SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom; leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crónica; y trastorno linfoproliferativo post-trasplante (PTLD), así como proliferación vascular anormal asociadas con facomatosis, edema tal como that asociadas con tumores cerebrales, síndrome de Meigs, melanoma, mesotelioma, y mieloma múltiple.
74. El artículo de fabricación de la reivindicación 72 caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de mamas, cáncer colorectal, rectal cáncer, cáncer de pulmón de células no pequeñas, linfoma de no- Hodgkins (NHL), cáncer de células renales, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer pancreático, sarcoma de tejido blando, sarcoma de kaposi, carcinoma carcinoide, cáncer de cabeza y cuello, melanoma, cáncer de ovario, mesotelioma, mieloma múltiple, colorectal metastásico y cáncer de mamas metastásico.
75. El artículo de fabricación de la reivindicación 72, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer colorectal, cáncer de riñon, cáncer de próstata, mesotelioma, fibrosarcoma, osteosarcoma, y carcinoma epidermoide, cáncer colorectal metastásico, de próstata metastásico y de mamas metastásico.
76. El artículo de fabricación de la reivindicación 72, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer pancreático, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer colorectal, cáncer de pulmón de células no pequeñas, fibrosarcoma, metastatic colorectal, y cáncer de mamas metastásico.
77. El artículo de fabricación de la reivindicación 72, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer pancreático, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer colorectal, cáncer de pulmón de células no pequeñas, y fibrosarcoma.
78. El artículo de fabricación de la reivindicación 72, caracterizado porque el cáncer es cáncer pancreático, cáncer de mamas o cáncer de mamas metastásico.
79. El artículo de fabricación de la reivindicación 72, caracterizado porque el anticuerpo anti-integrína a2 humanizado comprende: (i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) HCDR1 (GFSLTNYGIH, sec. con núm. de ident.:1), HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, sec. con núm. de ident.:2) y HCDR3 (ANDGVYYAMDY, sec. con núm. de ident.:3), o (b) sec. con núm. de ident.:40; y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) una LCDR1 seleccionada de SANSSVNYIH (sec. con núm. de ident.:4) o SAQSSVNYIH (sec. con núm. de ident.:112), (b) LCDR2 (DTSKLAS; sec. con núm. de ident.:5) y (c) LCDR3 (QQWTTNPLT, sec. con núm. de ident.:6).
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