KR20020018192A - 신규한 융합단백질로부터 재조합 인슐린을 제조하는 방법 - Google Patents

신규한 융합단백질로부터 재조합 인슐린을 제조하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단백질의 발현분비를 위한 1개 이상의 아미노산 잔기로 구성되는 리더 펩티드 서열(Y), 효소적 또는 화학적 절단에 사용되는 아미노산 서열(X1), 인슐린의 B쇄의 아미노산 서열(B-chain), 효소적 절단에 사용되는 아미노산 서열(X2), 1개 이상의 아미노산 잔기로 구성되는 링커 서열(linker), 효소적 절단에 사용되는 아미노산 서열(X3), 인슐린의 A쇄의 아미노산 서열(A-chain)이 순서대로 연결된 하기식 I의 융합단백질을 암호화하는 DNA 및 전기 DNA를 포함하는 발현계를 사용하여 인슐린을 제조하는 방법에 관한 것이다.
[Y]-[X1]-[B-chain]-[X2]-[linker]-[X3]-[A-chain] (식 I)
본 발명에 의하면, 효율적이며 고생산성의 유전자 재조합 인슐린의 생산방법이 제공된다.

Description

신규한 융합단백질로부터 재조합 인슐린을 제조하는 방법{Process for Producing Recombinant Insulin from Novel Fused Protein}
인슐린은 음식을 섭취할 때에 췌장의 랑게르한스섬의 B세포로부터 분비되어, 당, 아미노산, 지방산의 축적 또는 이용, 그리고, 혈당치의 항상성을 유지하는 가장 중요한 호르몬이다. 혈당, 즉, 혈액 중의 글루코스는 생체에서 불가결한 에너지원이지만, 혈당치가 항상성을 유지하지 않으면 생체에 위독한 병이 생기기도 한다. 혈당치가 높아지면, 당뇨가 나타나 글루코스의 상실을 초래하고, 당뇨병이 된다. 이 상태가 장기간 경과하면서 계속되면 생체 각 조직에 합병증을 유발한다. 한편 혈당치가 저하되면, 에너지원이 없어지는 것이기 때문에 생명의 위험을 가져온다. 혈당치는 혈당치를 높이는 방향으로 작용하는 원인(글루카곤, 성장호르몬, 코르티졸, 카테콜아민)과 혈당치를 저하시키는 원인에 의해 항상성이 유지되고 있다. 인슐린은 혈당치를 저하시키는 유일한 호르몬이다. 따라서, 몇가지의 원인으로 인슐린의 분비기능이 저하되어 인슐린이 충분하게 공급될 수 없게 되면 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM)이 된다. 이러한 환자의 치료에는 인슐린은 필수적인 의약품이다.
사람의 인슐린은 21개의 아미노산으로 구성되는 A쇄와 30개의 아미노산으로 구성되는 B쇄로 구성되는 폴리펩티드로 A쇄 내에서 1개, A쇄와 B쇄간에서 2개의 디설피드 결합을 가진다. 인슐린은 췌장 랑게르한스섬의 B세포에서 24개의 아미노산으로 구성되는 시그널 펩티드(SP), B쇄(B), 31개의 아미노산으로 구성되는 C펩티드(C), A쇄(A)가 이 순서로 직쇄상으로 서열된 프리프로인슐린(SP-B-C-A)로 최초에 세포 내의 리보좀에서 생합성된다. 프리프로인슐린은 소포체에 들어갈 때에 시그널펩티드가 잘려 나가서 프로인슐린(B-C-A)로 된다. 프로인슐린은 소포체 내에서 디설피드 결합을 형성하여 입체구조를 가지게 된다. 다음으로, 프로호르몬 변환효소 PC1/3에 의해 B-C결합이 절단되고, PC2에 의해 C-A결합이 절단된다. 마지막으로 PC1/3의 절단시에 B쇄의 C말단에 남은 C펩티드의 N말단의 2개의 염기성 아미노산이 카르복시펩티다제 H에 의해 절단되어 인슐린이 생성된다.
치료용 인슐린 생산법의 개발의 역사는 소나 돼지 등의 동물의 췌장의 추출물에서부터 시작되었다. 그러나, 사람 인슐린과 비교하면 소(A쇄에 2개소, B쇄에 1개소)나, 돼지(B쇄에 1개소)의 인슐린은 아미노산 조성이 달라 치료에 이용할 때, 알레르기 등의 부작용을 피할 수 없었다. 이 후, 돼지의 인슐린에서 트립신을 이용한 펩티드 전위반응법을 이용하여 사람 인슐린을 반합성하는 방법이 개발되었지만, 유전자 재조합 기술에 의해 만들어진 유전자 재조합 인슐린이 저가의 생산비용과 효율성이 높아 주류가 되었다.
유전자 재조합 인슐린의 제조 방법은 몇몇의 방법이 개발되었다. 우선, Eli Lilly사는 대장균을 이용하여 A쇄와 B쇄를 각각 발현시키고, 실험실적 조건(in vitro)에서 혼합시켜 디설피드 결합을 만들고 A쇄와 B쇄를 연결시키는 방법(참조: 특공소 63-18960호 공보)을 사용하였으나, 생산효율이 좋지 않았다. 이 후, Eli Lilly사는 프로인슐린을 발현시키고 실험실적 조건으로 디설피드 결합을 만들고 나서, 트립신과 카르복시펩티다제 B로 C펩티드를 잘라내어 인슐린을 만드는 방법(참조: 특공평 1-48278호 공보, 특허제 2634176호 공보)으로 전환하였다.
Novo Nordisk사는 B쇄와 A쇄를 염기성의 아미노산 2개로 연결한 미니프로인슐린을 효모에서 발현시키고, 실험실적 조건으로 트립신 처리를 하여 인슐린을 수득하는 방법을 개발하였다(참조: 특공평 7-121226호 공보, 특공평 8-8871호 공보, 특허 제 2553326호 공보). 이 방법은 미니프로인슐린이 발현, 분비되는 과정에서 디설피드 결합을 형성시키는 장점을 가지고 있다. 또한, 배지 중에 분비되기 때문에 분리정제가 용이하다.
유전자 재조합 인슐린의 신규한 제조방법의 개발은 이 후에도 적극적으로 진행되었다. 헥스트사는 신규 인슐린 유도체 또는 프리프로인슐린을 대장균에서 발현시키고, 실험실적 조건에서 디설피드 결합을 형성시키고, 리실엔도펩티다제 (lysylendopeptidase) 또는 클로스트리파인(clostripain)과 카르복시펩티다제 (carboxypeptidase) B로 처리하여 인슐린을 수득하는 방법을 개발하였다(참조: 특개평 2-195896호 공보, 특개평 2-225498호 공보, 특개평 2-233698호 공보, 특개평 3-169895호 공보, 특개평 4-258296호 공보, 특개평 6-228191호 공보, 특개평 7-265092호 공보). 최근에는 BIO-TECHNOLOGY GENERAL CORP.가 대장균에서 슈퍼옥시드 디스뮤타제(SOD)에 프로인슐린을 연결한 융합단백질을 발현시켜 발현효과와 실험실적 조건에서의 디설피드 결합형성 효율을 높였다. 인슐린에의 변환은 트립신과 카르복시펩티다제 B로 행하였다(참조: WO 96/20724). 이와 같이, 유전자 재조합 인슐린의 제조방법은 많은 시도가 있고, 발현효율, 디설피드 결합의 형성효율, 인슐린에의 변환방법의 관점에서 개량되고 있다.
유전자 재조합 단백질을 생산하는 숙주로는, 미생물, 동물, 식물 등 광범위한 종류가 이용되고 있다. 이 중에서도 특히 미생물이 취급하기 쉽고 공업적 생산이 되고 있기 때문에 가장 많이 이용되고 있고, 대장균, 효모가 잘 알려진 숙주이다. 최근 고초균속의 바실러스 브레비스(Bacillus brevis)를 이용한 유전자 재조합 단백질의 발현계도 알려져 있다(참조: 특허 제 2082727호, 특개소 62-201583호 공보, Yamagata, H. 등 J. Bacteriol., 169:1239-1245, 1987; 주조 우다카, 니혼노게이 카가쿠시 61:669-676, 1987; Takao, M 등 Appl. Microbiol. Biotechnol., 30:75-80, 1989, Yamagata, H. 등, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86:3589-3593, 1989).
본 발명의 목적은 기존의 유전자 재조합 인슐린의 생산계와 동등 이상의 효율적이며 생산량이 높은 발현계 및 생산방법을 알아 내는 것이다. 즉, 인슐린에의 신규한 변환법, 인슐린의 활성에 필요한 디설피드 결합이 생기는 환경, 생산량이높은 발현계를 찾아내는 것이다.
본 발명은 첫번째 태양에 따르면, 단백질의 발현분비를 위한 1개이상의 아미노산 잔기로 구성되는 리더 펩티드 서열(Y), 효소적 또는 화학적 절단에 사용되는 아미노산 서열(X1), 인슐린의 B쇄의 아미노산 서열(B-chain), 효소적 절단에 사용되는 아미노산 서열(X2), 1개 이상의 아미노산 잔기로 구성되는 링커 서열(linker), 효소적 절단에 사용되는 아미노산 서열(X3), 인슐린의 A쇄의 아미노산 서열(A-chain)이 순서대로 연결된 하기식 I:
[Y]-[X1]-[B-chain]-[X2]-[linker]-[X3]-[A-chain] (식 I)
의 융합단백질을 암호화하는 DNA를 제공한다.
본 발명은 다른 태양에 따르면, 인슐린의 B쇄의 아미노산 서열(B-chain), 효소적 절단에 사용되는 아미노산 서열(X2), 1개 이상의 아미노산 잔기로 구성되는 링커 서열(linker), 효소적 절단에 사용되는 아미노산 서열(X3), 인슐린의 A쇄의 아미노산 서열(A-chain)이 순서대로 결합된 하기식 II:
[B-chain]-[X2]-[linker]-[X3]-[A-chain] (식 II)
의 융합단백질을 암호화하는 DNA를 제공한다.
본 발명의 실시태양에 따르면, 융합단백질의 효소적 절단에 사용되는 아미노산 서열 X1, X2 또는 X3는 트롬빈에 의해 절단가능한 서열이다. 예를 들면, 트롬빈에 의해 절단가능한 아미노산 서열은
X1 = GlySerLeuGlnProArg (서열번호 1)
X2 = ArgGlyHisArgPro (서열번호 2), 또는
X3 = ProArg
이다.
본 발명의 다른 실시태양에 따르면, 링커의 아미노산 서열은
GluAlaGluAspLeuGlnValGlyGlnValGluLeuGlyGlyGlyProGlyAlaGlySerLeuGlnProLeuAlaLeuGluGlySerLeuGln (서열번호 3) 이다.
본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면, 리더 펩티드 서열은, 바실러스 속 세균의 세포벽단백질(CWP)의 하나인 MWP(middle wall protein) 단백질의 N말단에서 9개의 아미노산 잔기(즉, 아미노산 위치 1 내지 9를 의미한다)로 구성되는 것이다. 이 경우, DNA의 5'말단에 CWP의 시그널펩티드가 연결되어 있어도 무방하다.
본 발명의 DNA의 구체적인 예는 후술의 실시예에 기재된 것처럼, 서열표의 서열번호 21에 표시된 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 가지는 DNA이다. 보다 구체적으로는, 전기 DNA는 서열표의 서열번호 20에 표시된 염기서열을 가진다.
본 발명은 다른 태양에 따르면, 상기의 정의한 DNA의 5' 말단에 원핵생물 또는 진핵생물에의 유전자 재조합 단백질 발현에 필요한 프로모터 영역을 함유하는 DNA서열이 연결되어 있는 DNA를 제공한다.
본 발명의 실시태양에 따르면, 프로모터 영역을 함유하는 DNA 서열은 바실러스속 세균유래, 바람직하게는 바실러스속 세균의 CWP유래이다.
본 발명의 다른 태양에 따르면, 본 발명의 상기 DNA를 포함하는 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기의 벡터로 형질전환시킨 숙주세포를 제공한다. 숙주세포의 바람직한 예는 바실러스속 세균, 예를 들면 바실러스 브레비스(Bacillus brevis)이다.
본 발명은 또 다른 태양에 따르면, 상기의 숙주세포 또는 세균을 배지 중에서 배양하고, 목적 DNA를 발현시켜 그 DNA에 의해 암호화되는 융합단백질을 회수한 후, 전기 융합단백질을 효소적 절단처리하여 인슐린을 분리하는 단계를 포함하는 인슐린의 제조방법을 제공한다. 여기서, 전기 DNA의 구체적인 예는 서열표의 서열번호 21에 표시된 염기서열을 가지는 DNA이고, 전기 융합단백질의 구체적인 예는 서열번호 22에 표시된 아미노산 서열을 가지는 단백질이다.
상기 방법에 있어서, 발현된 융합단백질은 숙주세포 또는 세균에서, 또는 배양하여 수득된 배지에서 분리정제한다. 본 발명의 실시태양에서 효소적 절단처리는 프로인슐린과 카르복시펩티다제 B로 행할 수 있다.
본 발명은 유전자 재조합 인슐린을 제조하기 위하여 신규한 융합단백질을 암호화하는 DNA, 보다 구체적으로는 이 발명을 통하여 수득된 융합단백질로부터 트롬빈과 카르복시펩티다제 B에 의해 인슐린을 제조시, 전기 DNA의 사용에 관한 것이다.
도 1은 융합단백질, MWPmp9-GSLQPR-B-chain-RGHRP-linker-PR-A-chain에서 인슐린에의 변환의 모식도이다.
도 2는 융합체 MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B-chain-RGHRP-linker-PR-A-chain의 아미노산 서열 및 그것을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 3은 융합단백질을 바실러스 브레비스의 발현벡터(pNU211R2L5)에 삽입하는 개략도이다.
도 4은 형질전환체의 배양 후의 배지의 전기영동사진이다. 여기서, 시료는 마커펩티드(레인 1), 음성대조(외래단백질을 포함하지 않는 플라스미드 pNU211R2L5만의 형질전환체: 레인 2), 형질전환체 NWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B-chain-RGHRP-linker-PR-A-chain(레인 3)이다.
도 5는 융합단백질 MWPmp9-GSLQPR-B-chain-RGHRP-linker-PR-A-chain의 XL 크로마토그래피에 의한 분리정제를 나타내는 크로마토그램이다.
도 6은 융합단백질 MWPmp9-GSLQPR-B-chain-RGHRP-linker-PR-A-chain의 XL크로마토그래피에 의한 분리정제를 나타내는 크로마토그램이다.
도 7은 ITOHAM 인슐린(본 발명), Novolin(시판 인슐린인 노보놀티스크파머사의 노보린 40)의 펩티드 지도이다.
도 8은 ITOHAM 인슐린(본 발명), Novolin의 HPLC에 의한 용출 패턴을 나타내는 크로마토그램이다.
도 9은 ITOHAM 인슐린(본 발명), Novolin 투여 후의 혈장 중 글루코스 농도의 경시적 변화를 나타낸 그래프이다.
도 10은 ITOHAM 인슐린(본 발명), Novolin 투여 후의 혈장 중 인슐린의 농도의 경시적 변화를 나타낸 그래프이다.
본 발명의 DNA은 상기 식 I 또는 식 II로 표시되는 구조를 가진다. 즉, 식 I의 DNA는 단백질의 발현분비를 위한 1개 이상의 아미노산 잔기로 구성되는 리더펩티드 서열(Y), 효소적 또는 화학적 절단에 사용되는 아미노산 서열(X1), 인슐린의B쇄의 아미노산 서열(B-chain), 효소적 절단에 사용되는 아미노산 서열(X2), 1개 이상의 아미노산 잔기로 구성되는 링커 서열(linker), 효소적 절단에 사용되는 아미노산 서열(X3), 인슐린의 A쇄의 아미노산 서열(A-chain)이 순서대로 연결되어 있다. 또한, 식 II의 DNA은 인슐린의 B쇄의 아미노산 서열(B-chain), 효소적 절단에 사용되는 아미노산 서열(X2), 1개 이상의 아미노산 잔기로 구성되는 링커 서열(linker), 효소적 절단에 사용되는 아미노산 서열(X3), 인슐린의 A쇄의 아미노산 서열(A-chain)이 순서대로 연결되어 있다. 리더 펩티드 서열의 존재에 따라 발현산물은 숙주세포 외부로 분비되고, 한편 이러한 서열이 없는 경우에는 발현산물은 숙주세포 내에 체류한다.
후술하는 실시예에 있어서, 트롬빈과 카르복시펩티다제 B에 의한 인슐린에의 변환법을 완성시키기 위하여, 트로빈에 의한 절단 부위를 인슐린 B쇄와 링커 펩티드 및 링커와 A쇄의 사이에 배치된 신규한 변이형 프로인슐린을 고안하였다. 다음으로, 이 변이형 프로인슐린을 디설피드 결합이 가능한 환경을 제공하며 바실러스 브레비스에서 발현이 가능하게 하기 위하여, 변이형 프로인슐린의 N말단에 바실러스 브레비스의 세포벽 단백질의 N말단의 9개의 아미노산을 리더 펩티드로 연결하고, 그 직후에 리더 펩티드로부터 변이형 프로인슐린에의 절단을 가능하게 하는 제 3의 트롬빈 절단 부위를 연결시켜 수득되는 인공융합 단백질, 즉, 리더펩티드, 트롬빈 절단부위, 인슐린 B쇄, 트롬빈 절단부위, 링커펩티드, 트로빈 절단부위, 인슐린A쇄가 이 순서로 직쇄상으로 연결된 인공융합 단백질을 고안하였다. 우선 대응하는 융합단백질을 암호화하는 DNA를 제작하고, 적절한 발현 벡터에 삽입한 후, 적절한 숙주세포 중에 도입하고, DNA의 발현을 위하여 숙주를 배양하여 융합단백질을 수득하고, 이 융합단백질을 트롬빈과 카르복시펩티다제 B로 효소적 절단처리하여 천연형의 소망하는 일차구조와 생물활성을 가지는 인슐린을 수득할 수 있다.
이하에서, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
단백질의 발현에 필요한 1개 이상의 아미노산 잔기로 구성되는 리더 펩티드(Y)로는 대장균의 MBP(참조: Maina, C.V. et al., Gene, 74:365-373, 1988), GST(Smith, D.B. et al., Gene, 67:31-40, 1988), TRX(LaVallie, E.R. et al., Bio/Technology 11:187-193, 1993), DsbA(Collins-Racie, L. A. et. al., Biotechnology, 13:982-987, 1995), LamB(Benson, S.A. et al., Cell, 32:1325-1335, 1983)이나, 효모의 α factor(Brake, A.J. Yeast Genetic Engineering, 269-280, 1989)가 알려져 있다. 특히, 대장균에서 주변 원형질 내부에 또는 효모에서 배지 중에 목적 단백질을 분비시키는 경우에 요구되는 경우가 많다. 본 발명의 실시태양에 따르면, 바람직한 리더 펩티드는 바실러스속 세균의 CWP단백질의 N말단의 아미노산 잔기 9개이다. CWP단백질로는 이하의 것에 한정되어 있지 않으나, 예를 들면 바실러스 브레비스주 47(참조: FERM P-7224: 특개소 60-58074호 공보, 특개소 62-201589로 공보), HPD31(참조: FERM BP-1087: 특개평 4-278091호 공보) 등에서 유래된 것을 이용할 수 있다. 구체적으로는, 이하에 예시하는 서열을 이용할 수 있다(괄호 안은 인용문헌을 기재하였다).
MWPmp9: AlaGluGluAlaAlaThrThrThrAla
(서열번호 4, 참조: J. Bacteriol., 169:1239-1245, 1989)
OWPmp9: AlaProLysAspGlyIleTyrIleGly
(서열번호 5, 참조: J. Bacteriol., 170:176-186, 1998)
HWPmp9: AlaGluAspThrThrThrAlaProLys
(서열번호 6, 참조: J. Bacteriol., 172:1312-1320, 1990)
N말단으로부터의 아미노산 잔기 수는 전기 융합단백질을 발현시키면 반드시 9개 이어야 할 필요는 없다. 예를 들면, 바실러스속 세균의 CWP단백질의 N말단에서 1개 내지 50개의 아미노산 잔기로 구성되는 서열을 가지는 것이 사용된다. 리더 펩티드는 전기 융합단백질의 인슐린 B쇄 이하의 융합단백질, 즉 B-chain-X2-linker-X3-A-chain이 각각 발현계의 프로모터 영역을 포함하는 DNA의 3'말단에 연결되어 발현이 가능하게 되면 반드시 필요한 것은 아니다. 그러나, CWP유래의 리더 펩티드 서열을 포함하는 경우, 그 서열의 5' 말단에 CWP(특히, MWP)시그널펩티드 서열을 포함하는 것이 바람직하다. MWP의 서열에 관한 정보는 [Yamagata, H. 등, J. Bacteriol., 169:1239-1245, 1987 또는 Tsuboi, A. 등, J. Bacteriol., 170:935-945, 1988]에 기재된 내용을 참조 가능하다. 시그널 펩티드는 일반적으로 발현, 번역된 단백질을 막으로 유도하고, 단백질을 세포외로 분비시키는 역할을 한다. 분비된 단백질은 비분비형의 단백질과 비교하여, 분리, 정제가 용이하기때문에 유리하다.
상기 융합단백질 중, X1의 효소적 절단의 예로는 인슐린의 B쇄 및 A쇄에 그 효소의 절단 부위를 포함하지 않는 것으로, factor Xa, 트롬빈, 엔테로키나제 등을 들 수 있다. 또는, 인슐린의 B쇄의 N 말단에 Gly나 Ser이 1개 들어 있어도 인슐린의 활성에 영향을 미치지 않는 것이면, TEV프로테아제도 예로 들 수 있다. 또한 화학적 절단의 예로는 메티오닌의 C말단측을 선택적으로 절단하는 예(참조: J. Biol. Chem., 237:1856-1860, 1962)나 트립토판의 C말단측에서 선택적으로 절단하는 예(참조: Methods in Enzymol., 91:318-324, 1983)을 들 수 있다.
바람직한 실시태양에 따르면, X1 내지 X3까지 한꺼번에 절단할 수 있는 것이어야 하기 때문에, 그러한 효소가 트롬빈이며, 트롬빈으로 절단가능한 이들의 아미노산 서열은 X1 = GlySerLeuGlnProArg (서열번호 1), X2 = ArgGlyHisArgPro (서열번호 2), X3 = ProArg이나, 트롬빈으로 목적으로 하는 부위가 절단되기만 하면, 이들의 서열에 한정되지 않는다. 예를 들면 X1, X3의 경우, Ser = Val, Glu, Phe, Asp, Pro, Ileu, Gly, Lys, Arg, Ala, Gln, Asn, Leu, Leu = Arg, Val, Phe, Asp, Gly, Leu, His, Ileu, Met, Thr, Lys, Gln = Gln, Phe, Tyr, Gly, Ileu, Asn, Ala, Arg, Thr, Ser, Leu, Val, Cys, Pro = Ala, Val, Arg = Lys(참조: Chang, J-Y, Eru. J. Biochem., 151:217-224, 1985; Kawabata, S. et al., Eur. J. Biochem., 172:17-25, 1988), X2의 경우, Arg = Lys, Gly = Thr, Ileu, His, Ser, Ala, Phe, Val, Asn, Asp, Leu, Pro, His = Pro, Trp, Cys, Gln, Thr, Ser, Val, Leu, Ala, Phe, Gly, Arg = Val, Pro, Glu, Asn, Asp, Ser, Met, Lys, Ala, Gln, Gly, Trp, Thr, Pro = Val, Thr, Leu, ser, Asp, Gly, Tyr, Ileu, Asn, Arg, His, Glu(참조: Chang J-Y, Eur. J. Biochem, 151:217-224, 1985)이어도 절단될 수 있는 것으로 예상된다.
1개 이상의 아미노산 잔기로 구성되는 링커서열은 일반적으로 단백질 중에서기능 도메인 사이에 존재하고 있고, 각각의 도메인의 기능에 영향을 미치지 않고, 도메인을 연결하는 기능이 있다. 본 발명에서는 인슐린의 B쇄와 A쇄와의 사이에서 각각 효소적 절단을 통하여 배치되어 있으나, B쇄와 A쇄 간의 디설피드 결합이나 전기 융합단백질의 발현을 용이하게 하는데에 적합하다. 이러한 기능을 만족시키면 1개이상의 아미노산으로 무방하고, 아미노산의 종류는 관계없다. 바람직한 실시태양에 따르면, 이러한 링커서열은 프로인슐린의 C펩티드를 구성하는 것이 바람직하고, 본 발명의 실시태양에 따르면 하기의 서열:
GluAlaGluAspLeuGlnValGlyGlnValGluLeuGlyGlyGlyProGlyAlaGlySerLeuGlnProLeuAlaLeuGluGlySerLeuGln(서열번호 3)으로 구성된다.
본 발명에 있어서, 융합단백질을 암호화하는 DNA는 각각의 발현계의 프로모터 영역을 포함하는 DNA의 3'말단에 연결되어 발현되지만, 이러한 프로모터로는 박테리오파지의 λpL프로모터, T7 프로모터, 대장균의 trp-lac프로모터(참조: Maniatis, T. 등, Molecular Cloning 2nd ed., A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989), 효모의 PRBI 프로모터(참조: BIO/TECHNOLOGY, 9:183-187, 1991), GAPDH프로모터(참조: BIO/TECHNOLOGY, 12:381-384, 1994), 바이러스의 LTR프로모터, SV40프로모터(Maniatis, T. 등, Molecular Cloning 2nd ed., A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) 등을 예로 들 수 있다. 본 발명의 실시태양에 따르면, 전기 융합단백질은 바실러스속 유래의 프로모터 영역을 함유하는 DNA 서열의 3'말단에 결합된다. 사용가능한 프로모터로는 바실러스 브레비스 47유래의 MWP 프로모터(특공평 1-58950호 공보, 특공평 7-108224호공보), 바실러스 브레비스 HPD31유래의 HWP 프로모터(특개평 4-278091호 공보, 특개평 6-133782호 공보) 등을 들 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 DNA는 당업계에 공지의 기술을 조합해서 제작할 수 있다. 예를 들면, 구성요소의 각 DNA 서열을 화학적 합성법 또는 클로닝법에 의해 각각 제조하고, 이들 구성요소를 리가제를 이용하여 순차연결하고, 폴리머라제 연쇄반응(PCR)증폭법을 조합하여 목적의 DNA를 제조할 수 있다. 구체적으로는 실시예를 참조하여 상세하게 설명하지만, 각각의 기술는 [Maniatis, T. 등, Molecular Cloning 2nd, ed., A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Innis, M. A. 등, PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, 1990] 등에 기재된 일반적인 기술을 사용할 수 있다.
인슐린의 B쇄, C펩티드, A쇄를 포함하는 사람 프로인슐린을 암호화하는 DNA는 시판되는 사람 췌장의 mRNA에서 시판되는 cDNA 1st-strand 합성 키트(파마시아사제) 등을 이용하여 수득할 수 있다. 또한, 이미 알려진 DNA 서열을 토대로 시판되는 DNA 합성기를 이용하여 프라미어가 되는 단쇄 DNA를 합성할 수 있으면 일반적인 PCR로 B쇄, C펩티드, A쇄 등을 암호화하는 소망하는 DNA단편을 증폭할 수 있다. 이 경우, DNA의 변성(예를 들면, 94℃, 30초 내지 1분), 프라미어와 어닐링(예를 들면, 45 내지 60℃, 30초 내지 1분) 및 신장반응(예를 들면 72℃, 30초 이상)을 한 사이클로 하여 20사이클 이상 반복한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 상기 DNA를 포함하는 벡터를 제공한다. 사용가능한 벡터는 본 발명의 DNA를 재조합할 수 있는 적당한 삽입부위 즉 제한 효소부위를 가지고 있고, 전기 DNA를 숙주세포 내에서 발현 가능하며, 또한 전기 숙주세포 내에서 자가복제 가능한 등의 성질을 최소한으로 가지고 있어야 한다. 벡터는 일반적으로 프로모터를 포함하고 프로모터는 목적의 DNA를 상류(upsteam)에 작동할 수 있도록 연결된다. 벡터는 복제개시점, 종료 서열을 포함할 수 있고, 약제 내성 유전자, 영양 요구성을 상보하는 유전자 등의 선택 마커를 포함하고 있어도 무방하다. 바람직하게는 본 발명 벡터는 바실러스속 세균에서 복제 가능한 플라스미드이다. 이하의 것에 한정되지는 않지만, 예를 들면, pNU200, pHY500(참조: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86:3589-3593, 1989), pHY4831(참조: J. Bacteriol., 169:1239-1245, 1987), pNU100(참조: Appl. Microbiol. Biotechnol., 30:75-80, 1989), pNU211(참조: J. Biochem., 112:488-491, 1992), pHT210(참조: 특개평 6-133782호 공보), pHT110R2L5(참조: Appl. Microbiol. Biotechnol., 42:358-363, 1994)를 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적인 예로서는, 도 3에 표시된 것과 같은 구축법으로 발현 벡터 pNU-mPINS를 제작할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 정의된 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 숙주세포는 원핵(예를 들면, 세균류) 또는 진핵세포(예를 들면, 균류, 효모, 동물세포, 식물세포)의 어느 것이라도 무방하나, 바람직하게는 바실러스속 세균이다. 숙주로서의 바실러스속 세균으로는 이하의 것에 한정되는 것은 아니나, 바실러스 브레비스주 47(FERM P-7224, 참조: 특개소 60-58074호 공보, 특개소 62-201589호 공보), 47K(참조: 특개평 2-257876호 공보), 31OK(특개평 6-296485호 공보) 및 HPD31(FERM BP-1087, 참조: 특개평 4-278091호 공보) 등을 예로 들 수 있다. 발현벡터 pNU-mPINS를 바실러스 브레비스 47-5Q주에 이입하여 수득된 재조합 세균은 평성 11년(1999년) 4월 20일에 공업기술원 생명공학 공업기술연구소(일본국 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1-3)에 부다페스트 조약하에 기탁되어 수탁번호 FERM BP-6706이 부여되었다.
상술한 바와 같이 하여 수득된 발현 벡터는 컨피턴트(competent) 숙주세포, 바람직하게는 바실러스속 세균에 이입하고 발현가능한 조건하에서 적절한 배지에서 전기 세균을 배양하여 목적하는 재조합 융합 폴리펩티드를 균체외 또는 균체내, 바람직하게는 균체 외에서 생산하고, 통상적인 방법으로 폴리펩티드를 회수하고, 정제한다. 이입방법으로는 일렉트로포레이션(참조: Methods in Enzymol., 217:23-33, 1993) 등의 관용방법을 사용할 수 있다. 또한, 융합폴리펩티드의 정제는 예를 들면, 용매추출, 한외여과, 황산암모늄분획, HPLC, 겔여과크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 전기영동, 등전점 전기영동 등의 방법을 적절히 조합하여 실시할 수 있다.
상기에서 수득된 융합폴리펩티드는 효소적 절단을 가능하게 하는 프로테아제 및/또는 펩티다제, 후술의 구체예의 트롬빈과 카르복시펩티다제 B로 처리하여 인슐린을 수득할 수 있다. 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 적당한 조건하에서 우선 트롬빈으로 리더 펩티드(Y)와 B-chain과의 사이, B-chain과 linker의 사이, 링커서열과 A-chain과의 사이가 절단된다. 트롬빈에 의한 바람직한 특이적 절단조건은 pH 7.5 내지 8.5(트리스 완충액이 바람직하다), 온도 3 내지 6℃, 보다 바람직하게는 4℃, 기질:효소=5:1 내지 125:1(몰비), 보다 바람직하게는 25:1, 시간은 1 내지24시간이다. 이 후, 카르복시펩티다제 B로 B-chain의 C 말단에 남은 Arg이 잘려나가서 인슐린이 된다(도 1참조). 효소의 양은 융합단백질의 절단을 일으킬 수 있는 임의의 양이면 무방하다.
본 발명에 의해 상기와 같이 형질전환된 바실러스속 세균을 배지에 배양하고, 균체 외에 인슐린 서열을 포함하는 융합단백질을 축적시키고, 수득된 융합단백질을 절단하여, 인슐린을 수득할 수 있다.
이렇게 수득된 재조합 인슐린은 천연형의 인슐린과 완전히 동일한 아미노산 조성, 디설피드결합, 생물활성을 가지고 있고, 인술린 의존형 당뇨병의 치료용 의약품으로 유용하다.
이하에서 본 발명을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
융합단백질을 암호화하는 DNA를 제작하기 위해서는, PCR반응으로 증폭시킨 DNA 단편을 DNA 리가제를 이용한 라이게이션 반응으로 연결하는 방법을 채용하였다. 본 명세서에서, MWPsp는 MWP단백질의 시그널펩티드를 의미하고, MWPmp9는 MWP 성숙단백질의 N말단으로부터 아미노산의 수가 9개(즉, 아미노산 위치 1 내지 9)인 것을 의미한다.
실시예 1: MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B-chain-RGHRP-linker-PR-A-chain 융합 DNA 를 재조합한 벡터(pmPINS)의 구축
(1) DNA단편 MWPsp-MWPmp9의 수득
a. 주형 DNA
바실러스 브레비스(47-5Q주)에서 공지된 방법(참조: Molecular Cloning 2nd ed., A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)에 의해 추출한 게놈 DNA 840ng
b. 프라이머
센스프라미머: 5'-GTCGTTAACAGTGTATTGCT-3' (서열번호 7)
안티센스프라이머: 5'-AGCTGTAGTAGTTGCTGC-3' (서열번호 8)
야마가타(Yamagata, H.) 등(참조: J. Bacteriol., 169:1239-1245, 1987)과 츠보이(Tsuboi, A.) 등(참조: J. Bacteriol., 170:935-945, 1988)에 의해 결정된 MWP단백질의 염기서열을 토대로 화학합성하고, 최종농도 0.1μM이 되도록 가하였다.
c. Taq DNA 중합효소
시판되는 제품(GIBCO BRL사제) 5U을 가하였다.
d. 기타
Tris-HCl(최종농도 20mM, pH 8), MgCl2(최종농도 2.5mM), dNTPs(dATP, dGTP, dCTP, dTTP가 각각 최종농도 50μM)를 가하였다.
a 내지 d를 반응액량 100㎕로 하여 0.5ml튜브에 넣고 공지된 방법(참조: Innis. M. A. 등, PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, 1990)으로 PCR 반응(변성온도: 94℃-1분, 어닐(anneal)온도: 50℃-1분, DNA쇄 신장온도: 72℃-1분을 1사이클로하여 30회 반복)을 행하였다. PCR 반응 종료후, 반응액을 페놀로 농축하여 0.8% 아가로스겔에서 통상적인 조건하에서 전기영동을 하고, 밀리포아사의 울트라프리-C3H로 아가로스겔으부터 PCR산물, 즉, DNA단편 MWPsp-MWPmp9를 회수하였다. 회수한 PCR 산물은 페놀 추출후, 에탈올 침전하여 진공건조하고, 적량의 증류수에 용해시키고 평활말단(blunt end) 반응을 타카라슈조사(도쿄, 일본)의 DNA blunting kit을 사용하여 행하였다.
(2) DNA단편 프로인슐린의 수득
이하를 제외하고는 (1)과 같은 방법으로 순서에 따라 평활말단화하여 DNA단편 프로인슐린을 수득하였다.
주형 DNA로는 사람 프리프로인슐린 DNA를 재조합한 플라스미드벡터 10ng을 이용하였다. 사람 프리프로인슐린 DNA를 재조합한 플라스미드 벡터는 다음과 같이 하여 수득하였다. 시판되는 사람 췌장 mRNA(CLONTEHC사제)에서 파마시아사의 1st strand cDNA synthesis kit를 이용하여, 사람췌장의 cDNA를 합성하였다. 이 cDNA를 주형으로 하여 벨(Bell, G. I.) 등(참조: Nature, 282:525-527, 1979)에 의해 결정된 사람 프리프로인슐린 유전자의 염기서열을 토대로 합성된 센스프라이머, 5'-ATGGCCCTGTGGATGCGCC-3'(서열번호 9), 안티센스프라이머, 5'-CTAGTTGCAGTAGTTCTCC-3'(서열번호 10)을 이용하여 PCR 반응(조건: 94℃-1분, 60℃-1분, 72℃-1분을 1사이클로 하여 35사이클 반복)을 행하고, 수득된 PCR 산물, 즉 사람 프리프로인슐린 DNA를 pGEM-T벡터(Promega사제)로 클로닝하였다.
프라이머로는 센스프라이머, 5'-TTTGTGAACCAACACCTG -3'(서열번호 11), 안티센스 프라이머, 5'-CTAGTTGCAGTAGTTCTCC-3'(서열번호 10)를 이용하였다.
PCR 반응조건을 「변성온도: 94℃-1분, 어닐 온도: 47℃-1분, DNA쇄 신장온도: 72℃-30초를 한 사이클로 하여 25회 반복」으로 하였다.
(3) DNA 단편 GSLQPR-B-chain-R의 수득
이하를 제회하고는 (1)과 같은 방법에 따라 평활말단화된 DNA단편 GSLQPR-B-chain-R을 수득하고, 또한 인산화반응(니폰진사의 T4 polynucleotide kinase를 사용)을 행하고, 인산화한 DNA 단편 GSLQPR-B-chain-R을 수득하였다.
주형 DNA로는 (2)에서 수득된 프로인슐린 PCR산물 10ng을 이용하였다.
프라이머로는 센스프라이머, 5'-GGTTCCTTGCAACCTCGTTTTGTGAACCAACACCTG-3'(서열번호 12), 안티센스프라이머, 5'-GCGGGTCTTGGGTGTGTA-3'(서열번호 13)을 이용하였다.
PCR 반응조건을 「변성온도 94℃-1분, 어닐온도 47℃-1분, DNA쇄 신장온도 72℃-30초를 한 사이클로 하여 25회 반복」으로 하였다.
(4) DNA 단편 링커서열의 수득
이하를 제외하고는 (1)과 같은 방법으로 평활말단화된 DNA단편 링커서열을 수득하였다.
주형 DNA로는 (2)에서 수득된 프로인슐린 PCR산물 10ng을 이용하였다.
프라이머로는 센스프라이머, 5'-GAGGCAGAGGACCTGCAG-3', 안티센스프라이머, 5'-CTGCAGGGACCCCTCCAG -3'(서열번호 15)를 이용하였다.
PCR 반응조건을 「변성온도: 94℃-1분, 어닐온도: 55℃-1분, DNA쇄 신장온도: 72℃-30초를 한 사이클로 하여 25회 반복」으로 하였다.
(5) DNA 단편 GHRP-linker의 수득
이하를 제외하고는 (4)와 같은 방법으로 평활말단화된 DNA단편 GHRP-linker를 수득하고, 인산화 반응(니폰진사의 T4 polynucleotide kinase를 사용)을 행하여, 인산화한 DNA 단편 GHRP-linker를 수득하였다.
주형 DNA로는 (4)에서 수득된 DNA단편 linker PCR산물 10ng을 이용하였다.
센스프라이머로는 5'-GGTCACCGTCCAGAGGCAGAGGACCTGCAGGTGGGG-3' (서열번호 16)을 이용하였다.
PCR 반응조건을 「변성온도: 94℃-1분, 어닐온도: 55℃-1분, DNA쇄 신장온도: 72℃-30초를 한 사이클로 하여 25회 반복」으로 하였다.
(6) DNA 단편 A-chain의 수득
`
이하를 제외하고는 (1)과 같은 방법으로 평활말단화된 DNA단편 A-chain을 수득하였다.
주형 DNA로는 (2)에서 수득된 프로 인슐린 PCR산물 10ng을 이용하였다.
프라이머로는 센스프라이머, 5'-GGCATTGTGGAACAATGCTGT-3'(서열번호 17), 안티센스 프라이머, 5'-CTAGTTGCAGTAGTTCTCCAGCTGGTA-3'(서열번호 18)을 이용하였다.
PCR의 반응조건을 「변성온도: 94℃-1분, 어닐온도: 55℃-1분, DNA쇄 신장 반응 온도: 72℃-30초를 한 사이클로 하여 25회 반복」으로 하였다.
(7) DNA단편 PR-A-chain의 수득
이하를 제외하고는 (6)과 같은 방법으로 평활말단화된 DNA단편 PR-A-chain을 수득하고, 인산화 반응(니폰진사의 T4 polynucleotide kinase를 사용)을 행하여, 인산화한 DNA 단편 PR-A-chain을 수득하였다.
주형 DNA로는 (6)에서 수득된 DNA단편 A-chain PCR산물 10ng을 이용하였다.
센스프라이머로는 5'-CCACGTGGCATTGTGGAACAATGCTGT-3'(서열번호 19)를 이용하였다.
PCR의 반응조건을 「변성온도: 94℃-1분, 어닐 온도: 55℃-1분, DNA쇄 신장 온도: 72℃-30초를 한 사이클로 하여 25회 반복」으로 하였다.
(8) MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B-chain-R융합DNA의 수득
이하를 제외하고는 (1)과 같은 방법으로 평활말단화된 융합 DNA, MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B-chain을 수득하였다.
주형 DNA로는 (1)에서 수득된 DNA단편 MWPsp-MWPmp9와 (3)에서 수득된 DNA단편 GSLQPR-B-chain을 적량씩 혼합하여 타카라슈조사의 DNA ligation kit로 16℃에서 30분 반응시킨 것을 이용하였다.
안티센스 프라이머는 5'-GCGGGTCTTGGGTGTGTA-3'(서열번호 13)을 이용하였다.
PCR 반응조건을 「변성온도: 94℃-1분, 어닐온도: 47℃-1분, DNA쇄 신장 온도: 72℃-30초를 한 사이클로 하여 25회 반복」으로 하였다.
이 후, 니폰진사의 T4 polynucleotide kinase를 이용하여 PCR 산물의 인산화를 행하였다. 인산화된 PCR 산물은 타카라슈조의 DNA ligation kit를 이용하여 제한 효소 HincII로 절단하고 벡터(STRATAGENE사제, BlueScript SK-)에 재조합하고, 공지된 방법(참조: Molecular Cloning 2nd ed., A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)에 따라 대장균 DH5α를 형질전환시키고, 형질전환체로부터 벡터인 플라스미드 DNA를 제작하였다. 벡터의 염기서열결정용 센스프라이머(M13 forward primer) 또는 안티센스프라이머(M13 reverse primer)를 이용하여 염기서열을 결정하여 MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B-chain-R 융합 DNA가 만들어지는 것을 확인하였다. 다음으로. MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B-chain-R을 조합한 벡터를 주형 DNA로 하여 센스프라이머, 5'-GTCGTTAACAGTGTATTGCT-3'(서열번호 7)과 안티센스프라이머, 5'-GCGGGTCTTGGGTGTGTA-3'(서열번호 13)을 이용하여 상기와 같은 방법으로 2차 PCR을 행하고, 평활말단화된 융합 DNA, MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B-chain-R을 수득하였다.
(9) MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B-chain-RGHRP-linker융합 DNA의 수득
이하를 제외하고는 (8)과 같은 방법으로 평활말단화된 융합 DNA, MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B-chain-RGHRP-linker를 수득하였다.
1차 PCR 반응의 주형 DNA (8)에서 수득된 융합DNA, MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B-chain-R과 (5)에서 수득된 DNA단편 GHRP-linker를 적량씩 혼합시켜 타카라슈조의 DNA ligation kit로 16℃에서 30분 반응시켜 사용하였다.
안티센스 프라이머로는 5'-CTGCAGGGACCCCTCCAG-3'(서열번호 15)를 사용하였다.
(10) MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B-chain-RGHRP-linker-PR-A-chain융합 DNA를 재조합한 벡터의 수득
이하를 제외하고는 (8)과 같은 방법으로 융합체 MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B-chain-RGHRP-linker-PR-A-chain이 재조합된 벡터(pmPINS)를 수득하였다.
1차 PCR반응의 주형 DNA로는 (9)에서 수득된 융합 DNA, MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B-chain-RGHRP-linker와 (7)에서 수득된 DNA단편 PR-A-chain을 적량씩 혼합시켜 타카라슈죠의 DNA ligation kit로 16℃에서 30분 반응시켜 사용하였다.
1차 PCR 반응의 안티센스프라이머로는 5'-CTAGTTGCAGTAGTTCTCCAGCTGGTA-3'(서열번호 18)을 사용하였다.
PCR의 반응조건을 「변성온도: 94℃-1분, 어닐온도: 50℃-1분, DNA쇄 신장온도: 72℃-1분을 한 사이클로 하여 25회 반복」으로 하였다.
실시예 2: 융합 DNA의 발현분비
(1) 융합체의 아미노산 및 염기서열
실시예 1에서 수득된 융합체의 아미노산 및 염기서열을 도 2에 나타내었다.
(2) 융합체의 발현분비
실시예 1에서 수득된 융합 DNA에 의해 암호화되는 융합단백질을 발현시켰다. 융합 DNA를 발현벡터에 재조합하는 양식을 도 3에 나타내었다.
구체적으로는 상기의 융합 DNA를 재조합한 벡터 pmPINS를 제한효소 ApaL I과 HindIII로 처리하여 0.8% 아가로스 전기영동을 행하고, 융합 DNA를 포함하는 DNA 단편을 잘라내었다. 잘라낸 융합 DNA와 ApaLI과 HindIII로 절단한 바실러스 브레비스용 발현벡터 pNU211R2L5(참조: 특개평 7-170984호 공보)를 적량씩 혼합, 타카라슈조의 DNA ligation kit로 16℃에서 30분 반응시켜 융합 DNA를 발현벡터에 재조합하였다. 이상과 같이 하여 융합 DNA를 재조합한 발현벡터, pNU-mPINS를 수득하였다. 이들의 발현벡터로 바실러스 브레비스의 47-5주(FERM BP-1664)를 공지된 방법(참조: Methods in Enzymol., 217:23-33, 1993)으로 형질전환하여 T2한천배지(폴리펩톤 1%, 고기엑기스 0.5%, 효모엑기스 0.2%, 우라실 0.1mg/ml, 글루코스 1%, 에리스로마이신 10㎍/ml, 한천 1.5%, pH 7)에 접종하고, 형질전환체를 수득하였다.
형질전환체는 T2 배지(T2 한천배지에서 한천을 제거한 것)에서 37℃, 1일간배양하고, 공지된 방법(참조: Molecular Cloning 2nd ed., A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)로 플라스미드 DNA를 정제하고, ApaLI과 HindIII로 처리하여 융합 DNA가 재조합된 것을 확인하였다. 융합 DNA가 재조합된것이 확인된 형질전환체에서 재조합된 융합 DNA에서 암호화하는 융합단백질의 발현분비를 시험하였다. 즉, T2 배지에서 37℃, 1일간 배양한 균 현탁액을 1/1000의 비율로 배지(폴리펩톤 3%, 효모엑기스 0.4%, 글루코스 3%, MgSO4·7H2O 0.01%, MnSO4·4H2O 0.001%, 에리스로마이신 10㎍/ml, pH 8)에 첨가하고 30℃에서 4일간 진탕배양하였다.
배양 후, 배지를 15,000rpm, 2분 원심하여 배양상층을 수득하여 공지된 방법(참조: Laemmli, U. K., Nature, 227:680-685, 1970)으로 전기영동하여 단백질을 분석하였다. 즉, 배양상층의 18㎕의 완충액 1(125mM Tris-HCl, pH 6.8, 20% 글리세롤, 4% SDS, 10% 2-머캅토에탄올)을 2㎕ 가하여 5분간 끓이고, 완충액 2(250mM Tris-HCl, pH 6.5, 50% 글리세롤, 0.5% BPB)를 4㎕을 가하여 시판되는 15/25% SDS 폴리아크릴 아미드겔(다이이찌카가쿠, 도쿄, 일본)에서 전기영동(전기영동 완충액: 100mM Tris, 100mM Tricine, 0.1% SDS)을 행하였다. 전기영동 후 쿠마시에로 염색하여 발현분비의 유무를 조사하였다. 도 4에 나타낸 것과 같이 융합체를 포함하는 pNU-mPINS로 형질전환시킨 균의 배지에는 융합단백질에 상당하는 밴드(화살표)가 검출되었으나(레인 3), 융합체를 포함하지 않은 벡터만의 배지에는 확인되지 않았다(레인 2).
실시예 3: 인슐린의 변환
(1) 융합단백질, MWPmp9-GSLQPR-B-chain-RGHRP-linker-PR-A-chain분리정제
pNU-mPINS로 형질전환시킨 균을 37℃에서 1일간 배양하고, 그 균현탁액 50㎕를 50ml의 배지(폴리펩톤 3%, 효모엑기스 0.4%, 글루코스 3%, MgSO4·7H2O 0.01%, MnSO4·4H2O 0.001%, 에리스로마이신 10㎍/ml, pH 8)에 첨가하여 500ml의 삼각플라스크(총 6개)에 넣고 30℃에서 4일간 진탕배양하였다. 배지를 9,000rpm, 20분간 원심하여 수득된 상층을 4℃에서 20mM Na-PO4, 150mM, pH 8의 완충액에서 투석하였다. 다음으로, 10,000rpm, 20분 원심하여 수득된 상층을 파마시아사의 Ni-킬레이트컬럼 (5 x 10cm)으로 상기의 완충액에 60mM의 이미다졸을 가하여 목적하는 융합단백질을 용출하였다. 이 용출분획에 EDTA, 벤즈아미딘을 각각 1mM이 되도록 가하고, 4℃에 온도를 유지하였다. 또한, 요소(최종농도 1M), 시스테인(최종농도 1mg/ml)을 가하고 1N의 NaOH로 pH를 10.8로 조정하여 같은 온도에서 1시간 교반하였다. 다음으로 20mM Tris, 1mM EDTA, pH 8.0에 대하여 투석하고, 요소(최종농도 1M), 2-프로판올(최종농도 20%)를 가하고 파마시아사의 Q-Sepharose XL컬럼(1.6 x 10cm)으로 분석하였다. 완충액(20mM Tris, 1mM EDTA, 1M Urea, 20% 2-propanol, pH 8)로 충분하게 평형화(equilibration)하고 동일한 완충액으로 1M NaCl을 포함하는 용액으로구배(gradient)를 걸어서 용출하고, 도 5에 용출 패턴을 나타내었다. 160mM-200mM NaCl로 용출된 분획(화살표)을 모아서 1N HCl로 pH 3에 조정하고, 분획 분자량 3,000의 한외여과기에서 농축하여 사이프러스사의 Vydac214TP54(C4컬럼, 4.6 x 250mm)에서 HPLC로 정제하였다. 25% 아세토니트릴, 0.1% TFA용액으로 평형화시키고 33% 아세토니트릴, 0.1% TFA용액으로 구배를 걸어 용출하고, 도 6에 그 용출 패턴을 나타내었다. 30 내지 31% 아세토니트릴로 용출시킨 분획(화살표)를 원심농축하여 건고한 것으로 이하의 절단 실험을 행하였다.
(2) 인슐린에의 변환과 정제
상기(1)에서 건고하여 수득된 융합단백질 MWPmp9-GSLQPR-B-chain-RGHRP-linker-PR-A-chain을 적량의 0.1% TFA에 용해시킨 후, 0.1M 트리스완충액(pH 8)을 가하여 20nmol/ml로 하였다. 4℃로 냉각시키고, 기질:효소=25:1(몰비)의 트롬빈 용액(250μmol/ml)을 가하여 9시간 후에 10% TFA를 pH 2가 되도록 적량 가하여 반응을 정지시켰다. 트롬빈은 JP그레이드의 트롬빈(이토햄사제, 효고, 일본)을 Macro Prep CM(BIO Rad사제)와 Lysine Sepharose 4B(파마시아사제)로 재정제하여 사용하였다.
트롬빈으로 절단된 B쇄의 C말단에 Arg을 가지는 인슐린Arg을 HPLC로 역상 크로마토그래피로 정제하기 위하여 상기의 트롬빈 처리후의 반응정지액을 Cica-MERCK사의 Mightysil RP4(20 x 250mm)로, 25% 아세토니트릴, 0.1% TFA 용액으로 평형화시키고, 35% 아세토니트릴, 0.1% TFA용액으로 구배를 걸어 용출하였다. 30 내지 31% 아세토니트릴로 용출된 분획을 원심농축하여 건고한 것을 이하의 실험에 사용하였다.
건고하여 수득된 인슐린 Arg을 적량의 0.1% TFA에 용해시키고, 0.1M 트리스완충액(pH 8)을 가하여 1mg/ml로 하였다. 기질:효소=500:1(몰비)의 카르복시펩티다제 B용액(시그마사, 4.7mg/ml)을 가하여 25℃에서 12시간 처리하고, 10% TFA를 pH 2가 되도록 적량 가하여 반응을 정지시켰다. 반응정지액으로 인슐린을 정제하기 위하여 상기의 인슐린-Arg을 정제하는 것과 같은 방법으로, HPLC에 의해 역상 크로마토그래피를 행하였다.
(3) 인슐린의 아미노산 분석
우선 총 아미노산을 분석하였다. 상기 (2)에서 수득된 인슐린 약 2nmole에 200㎕의 6N HCl과 20㎕의 5% 페놀을 가하여 반응액에서 기체를 제거하고, 튜브를 봉하여 110℃에서 24시간 가수분해하였다. 다음으로, 건고한 0.01N HCl 100㎕에 용해시키고 0.2㎛ 필터로 여과하여, 그 50㎕를 히타치 아미노산 분석장치 L-8500형(히타치세이사쿠쇼, 도쿄, 일본)으로 분석하였다.
다음으로, 시스테인산의 분석을 행하였다. 상기 (2)에서 수득된 인슐린 약 2nmole을 포름산:메탄올(5:1) 용액 40㎕에 용해하고 -20℃로 냉각시켰다. 여기에 -20℃로 냉각시킨 99% 포름산:30% 과산화수소수(19:1) 용액을 400㎕ 가하고, -20℃에서 4시간 반응시켰다. 반응후, 증류수를 3ml 가하여 동결건조시켰다. 이것을 상기와 같은 방법으로 가수분해하여 분석하였다.
총 아미노산 분석과 시스테인산 분석의 Val의 분석치를 비교하여, 시스테인산의 분석치를 총아미노산의 시스테인 분석으로 환산하였다. 표 1에서 볼 수 있듯이, 인슐린(INS)의 아미노산 조성의 이론치와 거의 일치하였다.
아미노산 INS분석 INS이론치
분석치 nmole mol% 잔기수 잔기mmole 잔기 mol%
Cys-SO3HAspThrSerGluProGlyAlaCys1/2Val*MetIleLeuTyrPheLysHisTrpArg 5.6972.7622.6962.4376.2710.9853.3921.0003.2051.4095.4623.5072.6400.9131.8220.924 12.63%6.12%5.97%5.40%13.90%2.18%7.52%2.22%7.10%3.12%12.10%7.77%5.85%2.02%4.04%2.05% 6.413.113.032.747.051.113.811.123.601.586.1430942.971.032.051.04 0.9500.9210.8990.8120.8960.9850.8481.0000.8010.7050.9100.8770.8800.9130.9110.924 3337141642643121 5.88%5.88%5.88%13.73%1.96%7.84%1.96%11.76%7.84%3.92%11.76%7.84%5.88%1.96%3.92%1.96%
45.122 100.00% 50.73 0.889 51 100.00%
(4) 인슐린의 펩티드 지도작성
상기 (2)에서 수득된 인슐린(이하에서는 "ITOHAM insulin"이라고 함)과, 시판되는 인슐린인 노보놀디스크파머사의 노보린 40(이하에서는 "Novolin"이라 함)을5nmole씩 0.1M 탄산수소암모늄, 2mM EDTA용액(pH 7.8) 50㎕에 용해시키고, V8 프로테아제(와코쥰야쿠, 도쿄, 일본; 2㎍/ml) 수용액 1.35㎕를 가하여 25℃에서 24시간 반응시킨 후, 1% TFA를 가하여 pH 2로 만들고 반응을 정지시켰다. 다음으로, 반응 정지액을 Vydac218TP54(4.6 x 250mm, C18컬럼)에서, 5% 아세토니트릴, 0.1% TFA용액에서 평형화시키고 나서, 35% 아세토니트릴, 0.1% TFA용액으로 구배를 걸어서 용출하였다. 도 7에서 그 용출 패턴을 나타낸 ITOHAM insulin과 Novolin은 같은 양상의 패턴을 나타내었으므로 두 인슐린의 디설피드 결합양식은 같다는 결론을 얻었다.
실시예 4: 인슐린의 생물활성
Novolin 1.2ml을 Wakocil-II 5C18 AR Prep(와코쥰야쿠사제, 50 x 250mm)를 이용하여 실시예 3의 (2)와 같은 방법으로 인슐린 분획을 수득하였다. 실시예 3의 (2)에서 수득된 ITOHAM insulin과 Novolin의 인슐린 분획을 Vydac218TP54(4.6 x 250mm, C18컬럼)으로 분석하고, 인슐린의 주 피크 면적으로 계산하여 동량이 되도록 분취하여 건고하였다. 도 8에서 보듯이, Novolin에는 다량체라고 여겨지는 부피크가 있고, Novolin의 부피크의 레벨(총 피크 면적)은 ITOHAM insulin의 1.23배 이었다.
이렇게 하여 수득된 ITOHAM insulin, Novolin을 각각 0.1% BSA, 0.9% NaCl, 0.1% 페놀용액으로 1 unit/ml이 되도록 조정(26 units/mg로 하여 계산)하고, 일본백색종 토끼(Kbs:JW, 2.0 내지 2.5kg)의 등족피부하에서 0.5ml투여하였다. 투여시에서 경시적으로 귀 정맥에서 채혈하고, 혈액 0.45ml에 0.05ml의 해당저지제 혼합액(NaF: 12.5mg/ml, heparin-Na: 125units/ml, EDTA-2Na: 48mg/ml)을 가하여 충분히 혼합시키고, 5℃에서 3,000rpm, 15분 원심하여 수득된 상층액 시료혈장으로 하였다. 혈장 중의 글루코스 농도는 생화학 자동분석 장치(CIBA-CORNING사제, Express PLUS)를 이용하고, 인슐린농도는 EIA키트(와코쥰약쿠사제, GLAZY ME Insulin-EIA TEST)를 이용하여 측정하였다. 도 9에서, 혈장 중 글루코스 농도의 경시변화를 도 10에 혈장 중 인슐린 농도의 경시변화를 나타내었다. ITOHAM insulin, Novolin 모두 투여 후의 혈장 중의 글루코스 농도는 저하되고, 인슐린의 혈당저하 작용이 확인되었다. 또한, 혈장 중의 인슐린 농도는 비슷한 추이를 나타내었다. Novolin의 글루코스 농도가 ITOHAM insulin에 비교하여 약간 낮고, 인슐린 농도가 약간 높게 나온 것은 HPLC에 의한 분석으로 지적되어 있는 부피크분의 가산된 것이 있기 때문이라고 사료되었다.
본 발명에 의해 인슐린에의 변환이 가능한 신규한 융합단백질을 바실러스속의 발현계에 있어서, 고발현 분비를 가능하게 하고 수득된 융합단백질을 트로빈과 카르복시펩티다제 B를 처리하여 천연형과 같은 아미노산 조성과 생물활성을 가지는 인슐린의 수득을 가능하게 하였다. 즉, 본 발명에 의해 효율적이며, 고생산성의유전자재조합 인슐린의 생산방법이 제공된다.
서열표 프리텍스트
서열번호 1: 트롬빈에 의해 절단가능한 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 2: 트롬빈에 의해 절단가능한 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 12: GSLQPR-B-chain-R을 암호화하는 DNA 단편을 증폭하기 위하여 PCR용 센스프라이머를 나타낸다.
서열번호 16: GHRP-linker를 암호화하는 DNA 단편을 증폭하기 위한 PCR용 센스프라이머를 나타낸다.
서열번호 19: PR-A-chain을 암호화하는 DNA단편을 증폭하기 위한 PCR용 센스프라이머를 나타낸다.
서열번호 20: MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B-chain-RGHRP-linker-PR-A-chain을 암호화하는 DNA의 염기서열을 나타낸다.
서열번호 21: MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B-chain-RGHRP-linker-PR-A-chain의 아미노산 서열을 나타낸다.

Claims (21)

  1. 단백질의 발현분비를 위한 1개 이상의 아미노산 잔기로 구성되는 리더 펩티드 서열(Y), 효소적 또는 화학적 절단에 사용되는 아미노산 서열(X1), 인슐린의 B쇄의 아미노산 서열(B-chain), 효소적 절단에 사용되는 아미노산 서열(X2), 1개 이상의 아미노산 잔기로 구성되는 링커 서열(linker), 효소적 절단에 사용되는 아미노산 서열(X3), 인슐린의 A쇄의 아미노산 서열(A-chain)이 순서대로 연결된 하기식 I의 융합단백질을 암호화하는 DNA:
    [Y]-[X1]-[B-chain]-[X2]-[linker]-[X3]-[A-chain] (식 I)
  2. 인슐린의 B쇄의 아미노산 서열(B-chain), 효소적 절단에 사용되는 아미노산 서열(X2), 1개 이상의 아미노산 잔기로 구성되는 링커 서열(linker), 효소적 절단에 사용되는 아미노산 서열(X3), 인슐린의 A쇄의 아미노산 서열(A-chain)이 순서대로 결합된 하기식 II의 융합단백질을 암호화하는 DNA:
    [B-chain]-[X2]-[linker]-[X3]-[A-chain] (식 II)
  3. 제 1항 또는 2항에 있어서,
    융합단백질의 효소적 절단에 사용되는 아미노산 서열 X1, X2 또는 X3 는 트롬빈에 의해 절단가능한 아미노산 서열인 것을 특징으로하는 DNA.
  4. 제 1항 또는 2항에 있어서,
    융합단백질의 효소적 절단에 사용가능한 아미노산 서열 X1, X2, 또는 X3는
    X1 = GlySerLeuGlnProArg(서열번호 1)
    X2 = ArgGlyHisArgPro(서열번호 2), 또는
    X3 = ProArg
    인 것을 특징으로 하는
    DNA.
  5. 제 1항 또는 2항에 있어서,
    링커의 아미노산 서열은
    GluAlaGluAspLeuGlnValGlyGlnValGluLeuGlyGlyGlyProGlyAlaGlySerLeu
    GlnProLeuAlaLeuGluGlySerLeuGln(서열번호 3)
    인 것을 특징으로 하는
    DNA.
  6. 제 1항에 있어서,
    리더 펩티드 서열은, 바실러스 속 세균의 세포융합단백질(CWP, cell wall protein)의 하나인 MWP(middle wall protein) 단백질의 N말단으 로부터 9개의 아미노산 잔기로 구성되는 것을 특징으로 하는
    DNA.
  7. 제 1항에 있어서,
    DNA의 5'말단에 CWP의 시그널펩티드가 연결되어 있는 것을 특징으로 하는
    DNA.
  8. 서열표의 서열번호 21에 표시된 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 가지는 DNA.
  9. 제 8항에 있어서,
    서열표의 서열번호 20에 표시된 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하 는
    DNA.
  10. 제 1, 2항 및 8항의 어느 한 항에 기재된 DNA의 5' 말단에 원핵생물 또는 진핵생물에의 유전자 재조합 융합단백질 발현에 필요한 프로모터 영역을 함유하는 DNA 서열이 연결되어 있는 DNA.
  11. 제 10항에 있어서,
    프로모터 영역을 함유하는 DNA 서열은 바실러스속 세균유래인 것을 특 징으로 하는
    DNA.
  12. 제 11항에 있어서,
    프로모터 영역을 함유하는 DNA 서열은 바실러스속 세균의 CWP유래인것을 특징으로 하는
    DNA.
  13. 제 10항에 기재된 DNA를 포함하는 벡터.
  14. 제 13항에 기재된 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  15. 제 13항에 기재된 벡터로 형질전환된 바실러스속 세균.
  16. 제 15항에 있어서,
    바실러스속 세균은 바실러스 브레비스(Bacillus brevis)인 것을 특징 으로 하는
    세균.
  17. 제 14항 또는 15항에 기재된 숙주세포 또는 세균을 배지 중에서 배양하고,목적 DNA를 발현시켜 전기 DNA에 의해 암호화되는 융합단백질을 회수한 다음, 전기 융합단백질을 효소적 절단 처리하여 인슐린을 분리하는 단계를 포함하는 인슐린의 제조방법.
  18. 제 17항에 있어서,
    융합단백질은 서열표의 서열번호 21로 표시된 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는
    방법.
  19. 제 17항에 있어서,
    발현된 융합단백질을 숙주세포 또는 세균에서, 또는 배양하여 수득된 배지에서 분리정제하는 것을 특징으로 하는
    방법.
  20. 제 17항에 있어서,
    효소적 절단 처리는 트롬빈과 카르복시펩티다제 B로 행하는 것을 특징 으로 하는
    방법.
  21. 서열표의 서열번호 21에 표시된 아미노산 서열을 가지는 융합단백질.
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