BR112013016235B1

BR112013016235B1 - Anticorpo isolado, uso de um anticorpo, ácido nucleico, célula transformada e composição farmacêutica

Info

Publication number: BR112013016235B1
Application number: BR112013016235-0A
Authority: BR
Inventors: David Wilson; Tetsuya Taura
Original assignee: Cephalon Australia Pty Ltd
Priority date: 2010-12-22
Filing date: 2011-12-22
Publication date: 2020-03-31
Also published as: US9505826B2; BR112013016235A2; IL227081B; JP2014503209A; AU2011349049A1; CA2824279A1; JP2017055771A; EP2654790A1; PT2654790T; CN103429261A; JP6147670B2; ZA201305123B; JP6334669B2; EP2654790B1; KR20140003494A; KR101941514B1; MX2013007392A; EA201390923A1; EP2654790A4; AU2011349049B2

Abstract

anticorpo isolado, uso de um anticorpo, ácido nucleico, célula transformada e composição farmacêutica a presente invenção está relacionada aos anticorpos, construções de imunoglobulina ou proteínas de fusão de imunoglobulina igg4 cujas meias-vidas in vivo estão aumentadas pela combinação de: (i) uma região fc de igg4 modificada ou domínio de ligação de fcrn desta e (ii) uma sequência da região de dobradiça de igg4 modificada.

Description

ANTICORPO ISOLADO, USO DE UM ANTICORPO, ÁCIDO NUCLEICO, CÉLULA TRANSFORMADA E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA

PEDIDOS RELACIONADOS

Esse documento reivindica prioridade de USSN 61/425.858, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção está relacionada aos anticorpos, construções de imunoglobulina ou proteínas de fusão de imunoglobulina IgG4 cujas meias-vidas ín vivo estão aumentadas pela combinação de: (i) uma região Fc de IgG4 modificada ou domínio de ligação de FcRn desta e (ii) uma sequência da região de dobradiça de IgG4 modificada.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

IgG é a classe de imunoglobulina mais prevalente em humanos e em outros mamíferos e é utilizada em vários tipos de imunoterapias e procedimentos diagnósticos. Uma questão crucial nessas terapias é o período de persistência das imunoglobulinas na circulação. A taxa de depuração de uma imunoglobulina administrada diretamente afeta a quantidade e frequência de dosagem da imunoglobulina. Estudos do catabolismo de IgG na circulação identificaram as porções do domínio constante de IgG que controlam o metabolismo de IgG, incluindo a taxa de degradação de IgG no soro por meio de interações com FcRn (receptor Fc neonato). A afinidade de ligação por FcRn aumentada aumenta a meia-vida circulante (ou sérica) de uma IgG (veja, por exemplo, Kim e cols., Eur. J. Immunol., 24: 2.429 (1994)). Métodos para obtenção de moléculas fisiologicamente ativas cujas meiasvidas são modificadas por introdução de um polipeptídeo de

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2/103 ligação de FcRn nas moléculas são descritos, por exemplo, em WO 97/43316, US 5.869.046, US 5.747.035, WO 96/32478. Métodos para a fusão das moléculas aos anticorpos ou aos fragmentos do domínio de ligação de FcRn destas são descritos, por exemplo, em WO 99/43713. No entanto, os documentos acima não revelam mutantes específicos no domínio constante de IgG que afetam a meia-vida.

A modificação de moléculas de IgG por substituição, adição ou deleção de aminoácido para aumentar ou reduzir a afinidade por FcRn é revelada em WO 98/23289; no entanto, esse documento não lista quaisquer mutantes específicos que exibem meias-vidas in vivo mais longas ou mais curtas.

Foi demonstrado que um mutante da IgG1 de camundongo que aumenta a meia-vida circulante é a mutação tripla Thr252Ala, Thr254Ser e Thr256Phe descrita, por exemplo, em WO 97/34631. MedImmune (US 7.083.784) demonstrou que, no contexto de IgG1 humana, modificações de um ou mais dos resíduos de aminoácidos 251-256, 285-290 e 308-314, dentro do domínio CH2, e dos resíduos de aminoácidos 385-389 e 428-436, dentro do domínio CH3, podem aumentar a afinidade dos domínios constantes por FcRn e, dessa forma, aumentar a meia-vida circulante. Em particular, eles demonstraram que uma mutação tripla M252Y, S254T e T256E, designada YTE na Fc de um anticorpo de isótipo IgG1 humano pode aumentar a meia-vida circulante de anticorpos cerca de 2-3 vezes em primatas não humanos.

Características de anticorpos de isótipo IgG4

IgG4 difere de outros isótipos de IgG humana pelo fato de que, mediante SDS-PAGE sob condições não redutoras, duas espécies de proteína são observadas, a espécie principal

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3/103 sendo IgG tetramérica (H2L2, ou seja, duas cadeias pesadas e duas cadeias leves) e uma segunda espécie menor sendo uma meia-imunoglobulina que contém uma única cadeia pesada e uma única cadeia leve (HL). Esses achados indicam heterogeneidade na formação de ligação dissulfeto entre as duas cadeias pesadas na região de dobradiça. Além disso, quando IgG4s humanas diferentes com especificidades de ligação de antígeno diferentes são misturadas em conjunto, as moléculas de IgG4 individuais são capazes de se dissociar em meias-imunoglobulinas (HL) e que então se associam novamente para formar IgG tetramérica (H2L2) que se liga a dois antígenos diferentes (anticorpos biespecíficos). Acredita-se que a espécie HL seja um intermediário importante na montagem de IgG4. A análise das sequências de dobradiça de cadeias pesadas de IgG humana sugere que a presença de serina no resíduo 228 (também denominado em algumas publicações resíduo 241; para evitar dúvidas, isso se refere à serina no centro da sequência da região de dobradiça de IgG4 CPSCP (ID. DE SEQ. N°: 1)) de

IgG4 (de acordo com o sistema de numeração de Kabat e cols., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4^a Edição, Washington DC - United States Department of Health and Human Services) possa ser a causa da heterogeneidade. Quando esse resíduo em IgG4 é modificado de serina para prolina (o resíduo encontrado naturalmente naquela posição em IgG1 e IgG2), ele leva à produção de anticorpo homogêneo com meia-vida sérica prolongada (Angal S. e cols., Molecular Immunology volume 30, N° 1: 105-108 (1993); Labrijn e cols., Nature Biotechnology volume 27, N° 8: 767-771; Schuurman J. e cols, Molecular Immunology 38

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4/103 (2001) 1-8).

Há uma necessidade crescente para a geração de anticorpos para fins terapêuticos com propriedades aprimoradas, por exemplo, uma meia-vida circulante aumentada.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção está relacionada às moléculas, em particular anticorpos, construções de imunoglobulina e proteínas de fusão de imunoglobulina IgG4, cujas meiasvidas in vivo estão aumentadas pela combinação de: (i) uma região Fc ou região do domínio de ligação de FcRn que compreende uma sequência do isótipo IgG4 que foi modificada, e (ii) uma sequência da região de dobradiça de IgG4 modificada. Especificamente, essas moléculas possuem modificações de aminoácidos, por exemplo, mutações, que aumentam a afinidade da Fc ou regiões constantes CH2 e CH3 da cadeia pesada pela FcRn e, dessa forma, sua meia-vida circulante em um indivíduo. Além disso, as moléculas incluem uma sequência da região de dobradiça de IgG4 modificada que anula a formação de heterodímeros mistos que é típica de anticorpos de isótipo IgG4.

A invenção se baseia na descoberta surpreendente de que a combinação das modificações acima aumenta a meia-vida circulante da molécula em relação a sua contraparte do tipo selvagem não modificada substancialmente por mais tempo do que a modificação (ou modificações) da região Fc ou a modificação da região de dobradiça isoladamente. Além disso, a combinação de modificações resulta em um prolongamento supra-aditivo (sinérgico) da meia-vida. Como qualquer modificação em um fármaco à base de proteína

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5/103 humana (incluindo uma proteína que compreende uma região constante de anticorpo humano) aumenta o risco de indução de uma resposta imune antifármaco em um paciente, é geralmente aconselhável limitar o número dessas mutações para limitar o risco presumivelmente aditivamente aumentado de cada uma dessas mutações com relação à indução dessas respostas imunes contra o fármaco. No entanto, os resultados surpreendentes aqui descritos demonstram que a combinação das duas classes de substituições (modificações de Fc e modificações da dobradiça) resulta em um efeito supra-aditivo no aumento da meia-vida circulante de anticorpos IgG4. Consequentemente, essa combinação fornece uma vantagem inesperada que pode superar uma desvantagem teórica em relação ao aumento da incidência de promoção de reações imunes antifármaco. As vantagens do aumento da meia-vida de uma molécula serão imediatamente evidentes para aqueles habilitados na técnica. Esses benefícios incluem redução da dosagem e/ou da frequência de administração, o que reduz o risco de eventos adversos em um indivíduo e reduz custos. Consequentemente, essas imunoglobulinas com meia-vida aumentada são de importância farmacêutica significativa.

Além disso, como as moléculas compreendem domínios constantes do isótipo IgG4 e uma região de dobradiça de IgG4, as moléculas não exibem função efetora ou exibem uma função efetora mínima in vivo.

Consequentemente, em uma modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo isolado, uma construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 com meia-vida in vivo aumentada, que compreende:

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6/103 (i) uma região Fc de IgG4 humana ou o domínio de ligação de FcRn desta modificada em relação a uma região Fc de IgG4 não modificada correspondente ou domínio de ligação de FcRn desta para compreender substituições em um ou mais de resíduos de aminoácidos 251-256 numerados de acordo com o índice EU como em Kabat; e (ii) uma sequência da região de dobradiça central de

IgG4	humana	que compreende	uma	substituição	do resíduo	de
serina	dent	ro da sequência	de	aminoácidos	CPSCP (ID.	DE
SEQ.	N°	: 1)	para prolina;
	em	que	a meia-vida in vivo	do anticorpo,	construção	de

imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 modificada está aumentada, comparada com o anticorpo, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 não modificada correspondente.

A meia-vida in vivo aumentada do anticorpo, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 é determinada por referência à meia-vida de um anticorpo IgG4, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 humana correspondente que não possui as substituições acima.

A presente invenção também fornece um anticorpo isolado, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 com meia-vida in vivo aumentada, que compreende:

(i) uma região Fc de IgG4 humana ou o domínio de ligação de FcRn desta modificada em relação a uma região Fc de IgG4 não modificada correspondente ou domínio de ligação de FcRn desta para compreender substituições M252Y, S254T e T256E numeradas de acordo com o índice EU como em Kabat; e

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7/103 (ii) uma sequência da região de dobradiça central de IgG4 humana que compreende a substituição de aminoácido S228P de acordo com o índice EU como em Kabat;

em que a meia-vida in vivo do anticorpo, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 modificada está aumentada, comparada com o anticorpo, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 não modificada correspondente.

O anticorpo de acordo com a invenção pode ser um anticorpo quimérico, anticorpo humano, anticorpo humanizado, um anticorpo Super-Humanizado®, um anticorpo desimunizado ou um anticorpo envernizado (veneered) .

Em um exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo isolado com meia-vida in vivo aumentada, que compreende:

(i) um Fab humano ou humanizado, (ii) uma região Fc de IgG4 humana ou o domínio de ligação de FcRn desta modificada em relação a uma região Fc de IgG4 não modificada correspondente ou domínio de ligação de FcRn desta para compreender substituições em um ou mais de resíduos de aminoácidos 251-256 numerados de acordo com o índice EU como em Kabat, e (iii) uma sequência da região de dobradiça central de IgG4 humana que compreende uma substituição do resíduo de serina dentro da sequência de aminoácidos CPSCP (ID. DE SEQ. N°: 1) para prolina, também descrita como uma substituição S228P de acordo com o índice EU como em Kabat;

em que a meia-vida in vivo do anticorpo, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 modificada está aumentada, comparada com o anticorpo,

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8/103 construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 não modificada correspondente.

Ao longo de relatório descritivo, a numeração de resíduos em uma cadeia pesada de imunoglobulina é aquela do índice EU ou sistema de numeração de Kabat (Kabat e cols., “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 5^aEdição, Washington DC United States Department of Health and Human Services”, 1991, National Institutes of Health”, Bethesda. O índice EU como Kabat” se refere a uma numeração do anticorpo EU de IgG1 humana (Edelman e cols., Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85, 1969). As sequências de aminoácidos dos isótipos IgG2, IgG3 e IgG4 são alinhadas com a sequência de IgG1 por colocação dos primeiros e últimos resíduos de cisteína das respectivas regiões de dobradiça, que formam as ligações S-S intercadeia pesada, nas mesmas posições. Os resíduos de aminoácidos 251-256 de acordo com o índice EU como em Kabat estão localizados dentro do domínio CH2 da cadeia pesada de imunoglobulina da região Fc. Esses resíduos foram implicados na ligação da região Fc à FcRn e, dessa forma, estão implicados na alteração da meia-vida do anticorpo.

Em outro exemplo, a invenção fornece uma construção de imunoglobulina isolada com meia-vida in vivo aumentada, que compreende:

(i) um fragmento de anticorpo;

(ii) um domínio CH2 de IgG4 humana modificado em relação a um domínio CH2 não modificado correspondente para compreender substituições em um ou mais de resíduos de aminoácidos 251-256 numerados de acordo com o índice EU como em Kabat, e

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9/103 (iii) uma sequência da região de dobradiça central de IgG4 humana que compreende uma substituição do resíduo de serina dentro da sequência de aminoácidos CPSCP (ID. DE SEQ. N°: 1) para prolina, também descrita como uma substituição S228P de acordo com o índice EU como em Kabat;

em que a meia-vida in vivo da construção de imunoglobulina modificada está aumentada, comparada com a construção de imunoglobulina não modificada correspondente.

Em uma modalidade, a construção de imunoglobulina isolada compreende uma região Fc de IgG4 humana ou domínio de ligação de FcRn desta.

De preferência, a construção de imunoglobulina isolada compreende substituições M252Y, S254T e T256E numeradas de acordo com o índice EU como em Kabat.

Fragmentos de anticorpo específicos incluem, sem limitação, (i) um fragmento Fab (ii) um fragmento Fd, (iii) um fragmento Fv, (iv) um fragmento dAb, (v) regiões de CDR isoladas, (vi) fragmentos F(ab')2, (vii) moléculas Fv de cadeia única (scFv), (viii) Fv de cadeia única biespecífico, e (ix) diabody (x) triabody e (xi) tetrabody.

A invenção também fornece proteínas de fusão de imunoglobulina IgG4 com meia-vida in vivo aumentada que compreendem uma molécula bioativa recombinantemente fundida ou conjugada quimicamente ou modificada geneticamente para conter: (i) uma região Fc de IgG4 humana ou o domínio de ligação de FcRn desta modificada em relação a uma região Fc de IgG4 não modificada correspondente ou domínio de ligação de FcRn desta para compreender substituições M252Y, S254T e T256E numeradas de acordo com EU índice como em Kabat, e (ii) uma IgG4 humana que compreende a substituição de

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10/103 aminoácido S228P na sequência da região de dobradiça central de acordo com o índice EU como em Kabat.

A molécula bioativa pode incluir agentes protéicos ou

não protéicos	ou proteínas	não	imunoglobulina.
Em uma	modalidade,	a	molécula bioativa é um
polipeptídeo.
Em outro	exemplo, a	presente invenção fornece uma

proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 com meia-vida in vivo aumentada, que compreende:

(i) uma molécula bioativa;

(ii) um domínio CH2 de IgG4 humana modificado em relação a um domínio CH2 de IgG4 para compreender substituições em um ou mais de resíduos de aminoácidos 251256 numerados de acordo com o índice EU como em Kabat, e (iii) uma sequência da região de dobradiça central de IgG4 humana que compreende uma substituição do resíduo de serina dentro da sequência de aminoácidos CPSCP (ID. DE SEQ. N°: 1) para prolina, também descrita como uma substituição S228P de acordo com o índice EU como em Kabat;

em que a meia-vida in vivo da proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 modificada está aumentada, comparada com a proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 não modificada correspondente.

De preferência, a proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 isolada compreende uma região Fc de IgG4 humana ou domínio de ligação de FcRn desta.

De preferência, a proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 isolada compreende substituições M252Y, S254T e T256E numeradas de acordo com o índice EU como em Kabat.

A sequência da região de dobradiça central de IgG4

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11/103 humana de acordo com a invenção preferivelmente compreende uma substituição S228P de acordo com o índice EU como em

Kabat. Essa substituição também foi denominada S241P de acordo com Kabat e cols. (1987 “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, United States Department of Health and Human Services”, Washington DC). A substituição possui o efeito de produzir uma sequência do centro da região de dobradiça igual àquela de um anticorpo de isótipo

IgG1 ou IgG2 do tipo selvagem. Com relação ao anticorpo de isótipo IgG4, ele resulta na produção da forma homogênea do anticorpo IgG4 e, dessa forma, anula a dissociação e reassociação das cadeias pesadas, o que frequentemente leva à produção de anticorpos IgG4 heterodiméricos.

O anticorpo, construção de imunoglobulina ou molécula de fusão de imunoglobulina IgG4 da invenção compreende uma região Fc de IgG4 humana ou domínio de ligação de FcRn desta que compreende uma substituição em um ou mais dos resíduos de aminoácidos 252, 254 e 256 de acordo com o índice EU como em Kabat. Em certos exemplos, o anticorpo, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 de acordo com a invenção compreende uma única substituição de qualquer um dos resíduos de aminoácidos 252, 254 ou 256 da região Fc. Em outros exemplos, o anticorpo, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 compreende substituições dos resíduos 252 e 254, ou resíduos 254 e 256 ou resíduos 252 e 256 da região Fc. Em um exemplo particular, o anticorpo, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 compreende substituições de cada um dos resíduos 252, 254 e 256 da

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12/103 sequência da região Fc de IgG4 humana.

Em exemplos particulares da invenção, o resíduo 252 é substituído com tirosina, fenilalanina, serina, triptofano ou treonina, o resíduo 254 é substituído com treonina ou serina e o resíduo 256 é substituído com serina, arginina, glutamina, ácido glutâmico, ácido aspártico, alanina, asparagina ou treonina. Em um exemplo particular, o resíduo 252 é substituído com tirosina (M252Y), o resíduo 254 é substituído com treonina (S254T) e resíduo 256 é substituído com ácido glutâmico (T256E). Essas substituições são denominadas coletivamente a “modificação YTE”.

Em outra modalidade, o anticorpo ou construção de imunoglobulina de acordo com a invenção pode ainda ser fundida recombinantemente, conjugada quimicamente ou modificada geneticamente para conter uma porção. A porção de acordo com a invenção pode ser selecionada, sem limitação, de um agente terapêutico que está ligado, direta ou indiretamente, ao anticorpo, uma citotoxina, um radioisótopo, um agente imunomodulador, um agente antiangiogênico, um agente antineovascularização e/ou outro agente de vascularização, uma toxina, um agente antiproliferativo, um agente pró-apoptótico, um agente quimioterápico e um ácido nucléico terapêutico.

Em um exemplo, o anticorpo modificado de acordo com a presente invenção é um anticorpo que se liga especificamente à IL-5 humana. Em outro exemplo, o anticorpo modificado de acordo com a presente invenção é um anticorpo que se liga especificamente ao CD33 humano.

Consequentemente, em um exemplo, a presente invenção

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13/103 também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente à IL-5 que compreende:

(i) uma região Fc de IgG4 humana ou o domínio de ligação de FcRn desta modificada em relação a uma região Fc de IgG4 humana não modificada correspondente ou domínio de ligação de FcRn desta para compreender substituições de aminoácidos M252Y, S254T e T256E numeradas de acordo com o índice EU como em Kabat, e (ii) uma sequência da região de dobradiça central de IgG4 humana que compreende a substituição de aminoácido S228P de acordo com o índice EU como em Kabat, em que a meia-vida in vivo do anticorpo modificado está aumentada, comparada com a meia-vida do anticorpo não modificado correspondente.

Em um exemplo particular, o anticorpo anti-IL-5 não modificado correspondente é hu39D10. Em outra modalidade, a sequência de Fab do anticorpo isolado pode corresponder à sequência da região variável das cadeias leve e pesada de mepolizumab.

Em outro exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo que se liga especificamente à IL-5, o anticorpo compreendendo uma sequência da cadeia pesada constante apresentada no ID. DE SEQ. N°: 6 e uma sequência da região variável da cadeia pesada apresentada no ID. DE SEQ. N°: 7. Em outro exemplo, o anticorpo que se liga especificamente à IL-5 ainda compreende uma cadeia leve que compreende as sequências da região variável e constante apresentadas no ID. DE SEQ. N°: 8.

Em outro exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente ao CD33 que

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14/103 compreende:

Em um exemplo particular, o anticorpo anti-CD33 modificado de acordo com a invenção é o anticorpo huMab195.

Em outro exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo que se liga especificamente ao CD33, o anticorpo compreendendo uma sequência da cadeia pesada apresentada no ID. DE SEQ. N°: 11 e uma sequência da cadeia leve apresentada no ID. DE SEQ. N°: 12.

A presente invenção também fornece o uso de um anticorpo isolado, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 com meia-vida in vivo aumentada, que compreende:

(i) uma região Fc de IgG4 humana ou o domínio de ligação de FcRn desta modificada em relação a uma região Fc de IgG4 não modificada correspondente ou domínio de ligação de FcRn não modificado desta para compreender substituições em um ou mais resíduos de aminoácidos 251-256 numerados de acordo com o índice EU como em Kabat, e

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15/103 (ii) uma sequência da região de dobradiça central de IgG4 humana que compreende uma substituição do resíduo de serina dentro da sequência de aminoácidos CPSCP para prolina (ID. DE SEQ. N°: 1), também descrita como uma substituição S228P de acordo com o índice EU como em Kabat;

em medicina.

De preferência, o anticorpo isolado, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 compreende substituições M252Y, S254T e T256E numeradas de acordo com o índice EU como em Kabat.

A presente invenção também fornece uso de um anticorpo isolado, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 modificada de acordo com a invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de um distúrbio.

A invenção fornece uso de um anticorpo isolado, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 com meia-vida in vivo aumentada que compreende:

(i) uma região Fc de IgG4 humana ou o domínio de ligação de FcRn desta modificada em relação a uma região Fc de IgG4 humana não modificada correspondente ou domínio de ligação de FcRn desta para compreender substituições de aminoácidos M252Y, S254T e T256E numeradas de acordo com o índice EU como em Kabat, e (ii) uma sequência da região de dobradiça central de IgG4 humana que compreende a substituição de aminoácido S228P de acordo com o índice EU como em Kabat, na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de um distúrbio em um indivíduo. A presente

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invenção	também fornece	um método	de	tratamento	ou
prevenção	de um distúrbio	em um indivíduo caracterizado	por
produção	excessiva de	eosinófilos	que	compreende	a
administração de um anticorpo anti-	IL-5	modificado	da

invenção.

A presente invenção também fornece um método de tratamento de um distúrbio em um indivíduo caracterizado por produção excessiva de eosinófilos, que compreende a administração ao indivíduo de um anticorpo isolado que se liga especificamente IL-5 que compreende:

(i) uma região Fc de IgG4 humana ou o domínio de ligação de FcRn desta modificada em relação a uma região Fc de IgG4 não modificada correspondente ou domínio de ligação de FcRn não modificado desta para compreender substituições M252Y, S254T e T256E numeradas de acordo com o índice EU como em Kabat, e (ii) uma sequência da região de dobradiça central de IgG4 humana que compreende a substituição de aminoácido S228P de acordo com o índice EU como em Kabat, em que a meia-vida in vivo do anticorpo modificado está elevada comparada com a meia-vida do anticorpo não modificado correspondente.

A presente invenção também se estende ao uso desses anticorpos modificados no tratamento ou prevenção de um distúrbio em um indivíduo caracterizado por produção excessiva de eosinófilos e ao uso dos anticorpos modificados na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de um distúrbio caracterizado por produção excessiva de eosinófilos.

Em um exemplo, a invenção fornece uso de um anticorpo

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isolado	com meia-vida	in	vivo	aumentada	que se liga
especifi	camente à IL-5,	que	compreende:
(i)	uma região Fc	de	IgG4	humana ou	o domínio de

ligação de FcRn desta modificada em relação a uma região Fc de IgG4 humana não modificada correspondente ou domínio de ligação de FcRn desta para compreender substituições de aminoácidos M252Y, S254T e T256E numeradas de acordo com o índice EU como em Kabat, e (ii) uma sequência da região de dobradiça central de IgG4 humana que compreende a substituição de aminoácido S228P de acordo com o índice EU como em Kabat, na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de um distúrbio caracterizado por produção excessiva de eosinófilos em um indivíduo.

Em um exemplo, o distúrbio é caracterizado por produção excessiva de eosinófilos (eosinofilia).

Um distúrbio caracterizado por produção excessiva de eosinófilos pode ser selecionado do grupo que consiste em asma atópica, dermatite atópica, rinite alérgica, rinite não alérgica, asma, asma grave, pneumonia eosinofílica crônica, aspergilose broncopulmonar alérgica, doença celíaca, síndrome de Churg-Strauss, síndrome de mialgia eosinofílica, síndrome hipereosinofílica, reações edematosas, incluindo angioedema episódico, infecções helmínticas, dermatite por oncocercose, esofagite eosinofílica, gastrite eosinofílica, gastrenterite eosinofílica, enterite eosinofílica, colite eosinofílica, micropolipose nasal, polipose nasal, asma por intolerância à aspirina, apnéia obstrutiva do sono, asma crônica, doença de Crohn, esclerodermia e fibrose endomiocárdica.

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18/103

Em outro exemplo, o distúrbio é doença autoimune.

Será observado que o anticorpo anti-IL-5 modificado de acordo com a invenção pode ser usado em métodos de profilaxia ou diagnóstico em relação a um distúrbio caracterizado por produção excessiva de eosinófilos.

A invenção também fornece um método de tratamento de um distúrbio canceroso em um indivíduo, que compreende a administração de um anticorpo anti-CD33 modificado de acordo com a invenção ao indivíduo.

A presente invenção também fornece um método de tratamento de um distúrbio canceroso em um indivíduo, que compreende a administração ao indivíduo de um anticorpo isolado que se liga especificamente ao CD33, que compreende:

(i) uma região Fc de IgG4 humana ou o domínio de ligação de FcRn desta modificada em relação a uma região Fc de IgG4 não modificada correspondente ou domínio de ligação de FcRn não modificado desta para compreender substituições M252Y, S254T e T256E numeradas de acordo com o índice EU como em Kabat, e (ii) uma sequência da região de dobradiça central de IgG4 humana que compreende a substituição de aminoácido S228P de acordo com o índice EU como em Kabat, em que a meia-vida in vivo do anticorpo modificado está aumentada, comparada com a meia-vida do anticorpo não modificado correspondente.

A presente invenção também se estende ao uso desses anticorpos modificados no tratamento ou prevenção de um distúrbio canceroso e ao uso dos anticorpos modificados na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção

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19/103 de um distúrbio canceroso.

Em um exemplo particular, o distúrbio canceroso é leucemia mielóide aguda.

Em outro exemplo, a invenção fornece uso de um anticorpo isolado com meia-vida in vivo aumentada que se liga especificamente ao CD33, que compreende:

(i) uma região Fc de IgG4 humana ou o domínio de ligação de FcRn desta modificada em relação a uma região Fc de IgG4 humana não modificada correspondente ou domínio de ligação de FcRn não modificado desta para compreender substituições de aminoácidos M252Y, S254T e T256E numeradas de acordo com o índice EU como em Kabat; e (ii) uma sequência da região de dobradiça central de IgG4 humana que compreende a substituição de aminoácido S228P de acordo com o índice EU como em Kabat;

na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de um distúrbio canceroso em um indivíduo.

Em um exemplo particular, o distúrbio canceroso é leucemia mielóide aguda. A presente invenção também fornece um método para aumento da meia-vida in vivo de um anticorpo humano ou humanizado de isótipo IgG4 ou construção de imunoglobulina que compreende uma região Fc de IgG4 ou domínio de ligação de FcRn desta e região de dobradiça de IgG4, o método compreendendo:

(i) introdução de substituições de aminoácidos M252Y, S254T e T256E numeradas de acordo com o índice EU como em Kabat na sequência da região Fc ou domínio de ligação de FcRn desta, e (ii) introdução da substituição de aminoácido S228P de acordo com o índice EU como em Kabat na sequência da região

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20/103 de dobradiça central.

Em um exemplo particular, o método acima pode ser usado para aumentar a meia-vida de um anticorpo anti-IL-5, em particular hu39D10.

Em um exemplo particular adicional, o método acima pode ser usado para aumentar a meia-vida de um anticorpo anti-CD33.

A presente invenção também fornece um método para aumento da meia-vida in vivo de uma proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 que compreende uma região Fc de IgG4 ou domínio de ligação de FcRn desta e região de dobradiça de

IgG4, o método compreendendo:

(i) introdução em uma região Fc de IgG4 humana ou domínio de ligação de FcRn desta de substituições de aminoácidos M252Y, S254T e T256E numeradas de acordo com o índice EU como em Kabat; e (ii) introdução da substituição de aminoácido S228P de acordo com o índice EU como em Kabat em uma sequência da região de dobradiça central de IgG4 humana.

A invenção também fornece um método para aumento da meia-vida in vivo de uma proteína por sua modificação genética como uma proteína de fusão que compreende o ID. DE SEQ. N°: 14.

A invenção também fornece uma proteína de fusão que compreende o ID. DE SEQ. N°: 14.

Em um exemplo, a proteína de fusão ainda compreende uma única lisina anexada imediatamente no terminal C em relação ao ID. DE SEQ. N°: 14.

A invenção também fornece um método para redução da função efetora de um anticorpo não IgG4, o método

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21/103 compreendendo:

(i) substituição da região constante da cadeia pesada do anticorpo não IgG4 com uma região constante de IgG4 humana ou domínio de ligação de FcRn desta, modificada para compreender substituições de aminoácidos M252Y, S254T e T256E numeradas de acordo com o índice EU como em Kabat; e (ii) substituição da região de dobradiça do anticorpo não IgG4 com uma região de dobradiça de IgG4 que possui a substituição de aminoácido S228P de acordo com o índice EU como em Kabat.

A invenção também fornece um método para aumento da meia-vida ín vivo de um anticorpo IgG4 não humano, o método compreendendo:

(i) substituição da região constante da cadeia pesada do anticorpo IgG4 não humano com uma região constante de IgG4 humana ou domínio de ligação de FcRn desta, modificada para compreender substituições de aminoácidos M252Y, S254T e T256E numeradas de acordo com o índice EU como em Kabat;

(ii) substituição da região de dobradiça do anticorpo IgG4 não humano com uma região de dobradiça de IgG4 que possui a substituição de aminoácido S228P de acordo com o índice EU como em Kabat.

A presente invenção também fornece um ácido nucléico que codifica um anticorpo, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4, como aqui descritos de acordo com qualquer modalidade.

A presente invenção também fornece uma célula transformada que expressa um anticorpo, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4,

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22/103 como aqui descritos de acordo com qualquer modalidade.

A presente invenção também fornece uma célula transformada que compreende um ácido nucléico que codifica um anticorpo, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 como aqui descritos.

Em outra modalidade, a invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo isolado, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 de acordo com a invenção, em conjunto com um excipiente farmaceuticamente aceitável. De preferência, a composição compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 mostra a sequência da cadeia pesada de relizumab, incluindo o domínio variável e o domínio constante de IgG4, sequências do domínio constante (isótipo IgG4 nativo) ou do domínio constante de IgG4 com a mutação S228P, as mutações YTE ou uma combinação das mutações S228P e YTE; também é mostrada a sequência do domínio variável da cadeia pesada de hu39D10 e da cadeia leve de hu39D10.

A Figura 2 mostra a sequência do domínio extracelular de FcRn humano.

A Figura 3 mostra a sequência da porção madura da microglobulina humana beta-2.

A Figura 4 mostra um ensaio à base de ELISA para medir a afinidade de FcRn humano por hu39D10 contendo um domínio Fc de IgG4 nativo, ou um que carrega a mutação S228P, as mutações YTE, ou tanto as mutações S228P quanto YTE.

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A Figura 5 mostra um estudo PK em camundongos com FcRn humanizado, ou seja, camundongos que tiveram deletado o gene de FcRn endógeno, mas possuem expressão ectópica da contraparte humana. No dia 0, os camundongos receberam hu39D10 ou variantes que contêm as substituições YTE isoladamente, a substituição da dobradiça (S228P) isoladamente ou ambos os tipos de substituições. Cada camundongo foi sangrado do seio retro-orbital em 2, 12, 24 horas e 2, 4, 7, 10, 14, 18, 21 e 28 dias. Amostras de plasma foram analisadas quanto à concentração de anticorpo humanizado. Os níveis de anticorpo são expressos como um percentual do nível no ponto do tempo de 24 horas no mesmo camundongo.

A Figura 6 mostra a sequência do anticorpo de CD33 huMab195 no qual o domínio Fc é um isótipo IgG4 que contém as modificações S228P e TYE; também é mostrada a cadeia leve de huMab195.

A Figura 7 mostra a sequência da proteína de fusão de domínio extracelular de CD33 humano-Fc.

A Figura 8 mostra um estudo PK em camundongos com FcRn humanizado, ou seja, camundongos que tiveram deletado o gene de FcRn endógeno, mas possuem expressão ectópica da contraparte humana. No dia 0, os camundongos receberam huMab195 com um domínio Fc de IgG4 nativo ou variantes que contêm as substituições YTE isoladamente, a substituição da dobradiça (S228P) isoladamente ou ambos os tipos de substituições. Cada camundongo foi sangrado do seio retroorbital em 2, 12, 24 horas e 2, 4, 7, 10 e 14 dias.

Amostras de plasma foram analisadas quanto à concentração de anticorpo humanizado. Os níveis de anticorpo são

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24/103 expressos como um percentual do nível no ponto do tempo de 24 horas no mesmo camundongo.

A Figura 9 mostra a sequência da porção de dobradiçaFc da cadeia pesada de IgG4 humana nativa e a sequência da porção de dobradiça-Fc da cadeia pesada de IgG4 humana com mutações S228P e YTE e desprovida da lisina do terminal C.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Geral

O termo e/ou, por exemplo, X e/ou Y deve ser subentendido como significando X e Y ou X ou Y e deve ser considerado para fornecer suporte explícito para ambos os significados ou para um deles.

Ao longo desse relatório descritivo, a menos que especificamente estabelecido de forma diferente ou o contexto exija de forma diferente, referência a uma única etapa, composição de matéria, grupo de etapas ou grupo de composições de matéria deve ser considerada como englobando uma e diversas (ou seja, uma ou mais) daquelas etapas, composições de matéria, grupos de etapas ou grupos de composições de matéria. Dessa forma, como aqui usadas, as formas no singular um, uma, o e a incluem aspectos no plural, a menos que o contexto determine claramente de forma diferente. Por exemplo, referência a um ou uma inclui um único, bem como dois ou mais; referência a o ou a inclui um único, bem como dois ou mais, e assim por diante. Cada exemplo da revelação deve ser aplicado, feitas as devidas modificações, a cada uma e a todas as outras modalidades, a menos que especificamente estabelecido de forma diferente.

Aqueles habilitados na técnica observarão que a

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25/103 revelação aqui apresentada é suscetível a variações e modificações além daquelas especificamente descritas. Deve ser subentendido que a revelação engloba todas essas variações e modificações. A revelação também inclui todas as etapas, características, composições e compostos citados ou indicados nesse relatório descritivo, individual ou coletivamente, e qualquer e todas as combinações ou quaisquer duas ou mais das referidas etapas ou características.

A presente revelação não está limitada em escopo pelas modalidades específicas aqui descritas, que têm a finalidade única de exemplificação. Produtos, composições e métodos funcionalmente equivalentes estão claramente dentro do escopo da revelação.

As composições de matéria e métodos aqui descritos são produzidos ou realizados sem experimentação desnecessária usando, a menos que indicado de forma diferente, técnicas convencionais de biologia molecular, microbiologia, virologia, tecnologia de DNA recombinante, síntese peptídica em solução, síntese peptídica de fase sólida e imunologia. Esses procedimentos são descritos, por exemplo, em Sambrook, Fritsch & Maniatis, “Molecular Cloning: A

Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratories, Nova York, Segunda Edição (1989), todos os Volumes I, II e III; Benny K.C. Lo, “Antibody Engineering: Methods and

Protocols”, (2004) Humana Press, Vol. 248; “DNA Cloning: A Practical Approach”, Volumes I e II (D.N. Glover, ed., 1985), IRL Press, Oxford, todo o texto; “Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach” (M.J. Gait, ed, 1984) IRL

Press, Oxford, todo o texto e, particularmente, os artigos

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26/103 nele existente por Gait, ppl-22; Atkinson e cols., páginas 35-81; Sproat e cols., páginas 83-115; e Wu e cols., páginas 135-151; “4. Nucleic Acid Hybridization: A

Practical Approach” (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds., 1985) IRL Press, Oxford, todo o texto; Immobilized Cells and Enzymes: A Practical Approach” (1986) IRL Press, Oxford, todo o texto; Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning” (1984); Methods In Enzymology” (S. Colowick e N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.), toda a série; J.F. Ramalho Ortigao, The Chemistry of Peptide Synthesis” Em:

Knowledge Database of Access to Virtual Laboratory Website” (Interactiva, Alemanha); Sakakibara, D., Teichman,

J., Lien, E. Land Fenichel, R.L. (1976). Biochem. Biophys. Res. Commun. 73 336-342; Merrifield, R.B. (1963). J. Am.

Chem. Soc. 85, 2.149-2.154; Barany, G. e Merrifield, R.B.

(1979) em The Peptides” (Gross, E. e Meienhofer, J. eds.), vol. 2, páginas 1-284, Academic Press, Nova York. 12. Wunsch, E., ed. (1974) Synthese von Peptiden in HoubenWeyls Metoden der Organischen Chemie” (Muller, E., ed.), vol. 15, 4^a Edição, Partes 1 e 2, Thieme, Stuttgart;

Bodanszky, M. (1984) Principles of Peptide Synthesis”, Springer- Verlag, Heidelberg; Bodanszky, M. & Bodanszky, A. (1984) The Practice of Peptide Synthesis”, SpringerVerlag, Heidelberg; Bodanszky, M. (1985) Int. J. Peptide Protein Res. 25, 449-474; Handbook of Experimental

Immunology”, Volumes I-IV (D.M. Weir e C.C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); e Animal Cell Culture: Practical Approach”, Terceira Edição (John R. W. Masters, ed., 2000), ISBN 0199637970, todo o texto.

Ao longo desse relatório descritivo a palavra

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27/103 compreendem, ou variações como, por exemplo, compreende ou que compreende, incluirá implicitamente a inclusão de um elemento, número inteiro ou etapa estabelecida, ou grupo de elementos, números inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro elemento, número inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, números inteiros ou etapas.

Definições

Como aqui usado, o termo anticorpo não modificado correspondente significa um anticorpo da mesma sequência

que o	anticorpo modificado,	mas sem	as	alterações	à
sequência de aminoácidos aqui	descritas,	em	particular	à
região	Fc e de dobradiça.
O	termo epitopo visa	se referir	à	parte de uma

molécula antigênica para a qual um anticorpo é produzido e à qual o anticorpo se ligará. O termo epitopo, como aqui usado, se refere a uma porção (ou porções) de um peptídeo que possui atividade antigênica ou imunogênica em um animal, preferivelmente um vertebrado, mais preferivelmente um mamífero e, mais preferivelmente ainda, em um ser humano ou um animal transgênico que expressa componentes relevantes do sistema imune humano. Epitopos podem compreender proteínas, fragmentos de proteína, peptídeos, carboidratos, lipídeos e outras moléculas, mas, para as finalidades da presente invenção, são mais comumente oligopeptídeos curtos. O termo epitopo visa englobar um epitopo imunogênico, um epitopo antigênico, ou epitopo de antígeno.

O termo anticorpo, como aqui usado, se refere a uma molécula que é capaz de se ligar a um alvo por meio de pelo menos um sítio de reconhecimento de epitopo, localizado na

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28/103 região variável da molécula de imunoglobulina. Os termos imunoglobulina e anticorpo podem ser usados de forma intercambiável ao longo de relatório descritivo. A molécula de imunoglobulina ou anticorpo inclui anticorpos de quatro cadeias (por exemplo, duas cadeias leves e duas cadeias pesadas), anticorpos recombinantes ou modificados (por exemplo, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos, anticorpos com CDR enxertada, anticorpos primatizados, anticorpos desimunizados, anticorpos Super-Humanizados®, meio-anticorpos, anticorpos biespecíficos). Um anticorpo geralmente compreende domínios constantes, que podem ser dispostos em uma região constante ou fragmento constante ou fragmento cristalizável (Fc). Formas exemplares de anticorpos compreendem uma estrutura de quatro cadeias como sua unidade básica. Anticorpos de comprimento total compreendem duas cadeias pesadas (aproximadamente 50-70 kD) ligadas covalentemente e duas cadeias leves (aproximadamente 23 kD cada). Cada cadeia pesada e leve compreende regiões variáveis e domínios constantes. Uma cadeia leve geralmente compreende uma região variável (se presente) e um domínio constante e, em mamíferos, é uma cadeia leve κ ou uma cadeia leve λ. Uma cadeia pesada geralmente compreende uma região variável e um ou dois domínios constantes ligados por uma região de dobradiça a domínios constantes adicionais. As cadeias pesadas de mamíferos são de um dos seguintes tipos: α, δ, ε, γ ou μ. Cada cadeia leve também está ligada covalentemente a uma das cadeias pesadas. Por exemplo, as duas cadeias pesadas e as cadeias pesadas e leves são mantidas juntas por ligações dissulfeto intercadeias e por

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29/103 interações não covalentes. O número de ligações dissulfeto intercadeias pode variar entre diferentes tipos de anticorpos. Cada cadeia possui uma região variável do terminal N (VH ou VL, em que cada uma possui aproximadamente 110 aminoácidos de comprimento) e um ou mais domínios constantes no terminal C. O domínio constante da cadeia leve (CL, que possui aproximadamente 110 aminoácidos de comprimento) está alinhado e com ligação dissulfeto ao primeiro domínio constante da cadeia pesada (Ch1, que possui 330-440 aminoácidos de comprimento). A região variável da cadeia leve está alinhada com a região variável da cadeia pesada. A cadeia pesada do anticorpo pode compreender 2 ou mais domínios Ch adicionais (por exemplo, Ch2, Ch3 e semelhantes) e pode compreender uma região de dobradiça entre os domínios constantes Ch1 e Ch2 . Anticorpos não modificados pode ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA₂) ou subclasse.

O termo construção de imunoglobulina”, como aqui usado, se refere a uma construção que compreende pelo menos uma domínio constante e região de dobradiça da cadeia pesada CH2 de um anticorpo IgG4 de primata ou humano. De preferência, o termo visa se referir a uma construção que compreende pelo menos domínios constantes e região de dobradiça da cadeia leve e pesada de um anticorpo IgG4 de primata ou humano.

O termo região constante” ou fragmento constante” se refere à porção de uma molécula de imunoglobulina ou anticorpo que possui uma a sequência de aminoácidos conservada central em relação a outra porção da

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30/103 imunoglobulina ou anticorpo, a chamada região variável, que contém o sítio de ligação de antígeno. Na cadeia pesada, a região constante contém os domínios CH1, CH2 e CH3.

O termo “região Fc, como aqui usado, se refere à porção de um anticorpo ou molécula de imunoglobulina que está correlacionada com um fragmento cristalizável obtido por digestão com papaína de uma molécula de IgG. A região Fc consiste na região do terminal C de uma cadeia pesada de IgG constituída pelo terminal C e aproximadamente metade das duas cadeias pesadas de uma molécula de IgG que estão ligadas por ligações dissulfeto. Embora os limites possam variar ligeiramente (em alguns casos ela inclui parte da dobradiça), como numerado de acordo com o índice EU de Kabat, a região Fc se estende do aminoácido 231 ao aminoácido 447. A região Fc de uma IgG compreende dois domínios constantes, CH2 e CH3. O domínio CH2 de uma região Fc de IgG humana normalmente se estende do aminoácido 231 ao aminoácido 341 de acordo com o índice EU de Kabat. O domínio CH3 de uma região Fc de IgG humana normalmente se estende dos aminoácidos 342 ao 447 de acordo com o índice

EU de Kabat. A região Fc não possui atividade de ligação de antígeno, mas contém a porção de carboidrato e o sítio de ligação para o receptor Fc, incluindo o receptor Fc neonatal (FcRn).

O termo “domínio de ligação de FcRn deste”, como aqui usado, se refere a uma porção da região Fc que é capaz de ligação ao FcRn. No presente contexto, ele também visa se referir a um fragmento da sequência da região Fc que inclui pelo menos o domínio CH2. O termo “receptor FcRn, como aqui usado, se refere a um receptor Fc (“n indicando

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31/103 neonatal) que está envolvido na transferência de IgGs maternas a um feto por meio da placenta humana ou de primata e a um neonato pelo colostro através do intestino delgado. O FcRn também está envolvido na manutenção de níveis séricos constantes de IgG por ligação das moléculas de IgG e sua reciclagem no soro. A ligação de FcRn às moléculas de IgG é estritamente pH-dependente com ligação ótima em pH 6,0. O FcRn está tipicamente em complexo com microglobulina beta-2.

O termo “região de dobradiça”, como aqui usado, se refere a uma porção rica em prolina de uma cadeia pesada de imunoglobulina entre as regiões Fc e Fab que confere mobilidade nos dois braços do Fab da molécula de anticorpo. Ela está localizada entre o primeiro e segundo domínios constantes da cadeia pesada. A região de dobradiça inclui resíduos de cisteína que estão envolvidos em ligações dissulfeto intercadeias pesadas. Ela é geralmente definida como alongamento de Glu216 até Pro230 de IgG1 humana de acordo com o sistema de numeração EU de Kabat (ou Glu226 até Pro243 de acordo com o sistema de numeração de Kabat). Regiões de dobradiça de outros isótipos de IgG podem ser alinhadas com a sequência de IgG1 por colocação dos primeiros e últimos resíduos de cisteína que formam ligações dissulfeto (S-S) intercadeias pesadas nas mesmas posições (veja, por exemplo, WO 2010/080538). A região de dobradiça inclui resíduos de cisteína que estão envolvidos em ligações dissulfeto intercadeias pesadas.

O termo “sequência da região de dobradiça central”, como aqui usado, visa se referir à sequência de aminoácidos

CPSCP (ID. DE SEQ. N°: 1) presente em IgG4 e que se estende

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32/103 do aminoácido 226 ao 230 de acordo com o índice EU de Kabat (frequentemente denominada a dobradiça inferior). A região de dobradiça central é distinguida da região de dobradiça superior que, em uma IgG4 humana, é a sequência ESKYGPP.

O termo “região variável”, como aqui usado, se refere às porções das cadeias leves e/ou pesadas de um anticorpo, como aqui definidas, que são capazes de se ligar especificamente a um antígeno, e inclui sequências de aminoácidos de regiões determinantes de complementaridade (CDRs); ou seja, CDR1, CDR2 e CDR3, e regiões framework (FRs). Por exemplo, a região variável compreende três ou quatro FRs (por exemplo, FR1, FR2, FR3 e, opcionalmente, FR4) junto com três CDRs. No caso de uma proteína derivada de uma IgNAR, a proteína pode não possuir uma CDR2. VH se refere à região variável da cadeia pesada. VL se refere à região variável da cadeia leve.

O termo “Fab”, como aqui usado, visa se referir a uma região de um anticorpo composta por um domínio constante e um domínio variável de cada uma das cadeias pesadas e leves (fragmento de ligação de antígeno monovalente), mas em que a cadeia pesada está truncada de tal forma que não possua o domínio CH2 e CH3 (ou seja, VH, CH1, VL e CL), e também pode não possuir uma parte ou toda a região de dobradiça. Ela pode ser produzida por digestão de um anticorpo inteiro com a enzima papaína. Fab pode se referir a essa região isoladamente ou a essa região no contexto de um anticorpo de comprimento total, uma construção de imunoglobulina ou uma proteína de fusão de Fab. O termo Fab', como aqui usado, pode ser obtido por tratamento de um anticorpo inteiro com pepsina, seguido por redução, para gerar uma

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33/103 molécula que consiste em uma cadeia leve intacta e uma porção de uma cadeia pesada que compreende uma Vh e um domínio constante único. Dois fragmentos Fab' são obtidos por anticorpos tratados dessa forma.

Por scFv significa um fragmento de anticorpo que compreende os domínios VH e VL de um anticorpo, em que esses domínios estão presentes em uma única cadeia polipeptídica. Veja, por exemplo, Patentes U.S. N^os4.946.778, 5.260.203, 5.455.030 e 5.856.456. Geralmente, o polipeptídeo Fv ainda compreende um vinculador polipeptídico entre os domínios VH e VL que permite que o scFv forme a estrutura desejada para a ligação de antígeno. Para uma revisão sobre scFv, veja Pluckthun (1994) The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, volume 113 ed. Rosenburg e Moore (Springer-Verlag, Nova York) páginas 269315. O complexo de fragmentos Fv do domínio VH e VL também pode ser estabilizado por uma ligação dissulfeto (Patente U.S. N° 5.747.654).

Por função efetora ausente ou mínima significa que certas atividades normalmente atribuíveis aos anticorpos do tipo IgG1 como, por exemplo, fixação de complemento ou estimulação de citotoxicidade mediada por células anticorpo-dependente (ADCC), estão reduzidas ou eliminadas.

O termo isolado, como aqui usado, se refere a um anticorpo, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 removido de seu ambiente nativo. Dessa forma, um anticorpo, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão produzido por um hospedeiro recombinante é considerado isolado para as finalidades da presente invenção. De preferência, o

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34/103 anticorpo, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 isolado é substancialmente purificado.

Por substancialmente purificado” significa que o anticorpo, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 é substancialmente livre de material celular ou outras proteínas contaminantes da célula ou fonte de tecido da qual é derivado, ou é substancialmente livre de precursores químicos ou outras substâncias químicas quando sintetizado quimicamente. O termo inclui preparações de um anticorpo, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão que é separado de componentes celulares das células das quais é isolado ou recombinantemente produzido. Dessa forma, um anticorpo, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 que é substancialmente livre de material celular inclui preparações que possuem menos do que cerca de 30%, 20%, 10% ou 5% (por peso seco) de proteínas e meio de cultura contaminantes.

O termo proteína de fusão de imunoglobulina IgG4” se refere a uma molécula bioativa que está ligada ou anexada a uma região de dobradiça de IgG4 humana modificada e região Fc de IgG4 humana modificada e/ou domínio de ligação de FcRn desta. Proteínas de fusão serão discutidas com mais detalhe posteriormente.

O termo meia-vida in vivo”, como aqui usado, se refere a uma meia-vida circulante de uma anticorpo, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 particular que contém uma região Fc e/ou domínio de ligação de FcRn desta na circulação de

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35/103 certo animal e é representada pelo tempo necessário para que metade da quantidade administrada no animal seja depurada da circulação. Quando uma curva de depuração de certo anticorpo, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 de acordo com a invenção é construída em função do tempo, a curva é normalmente bifásica, com uma fase alfa rápida que representa um equilíbrio das moléculas de IgG injetadas entre os espaços intra e extravascular e que é, em parte, determinada pelo tamanho das moléculas, e uma fase beta mais longa que representa o catabolismo das moléculas de IgG no espaço intravascular. O termo “meia-vida in vivo” praticamente corresponde à meia-vida das imunoglobulinas ou proteínas de fusão de IgG4 modificadas ou não modificadas na fase beta.

O termo “meia-vida in vivo aumentada”, como aqui usado, significa que o anticorpo, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 modificada de acordo com a invenção possui uma persistência no soro ou plasma maior e/ou leva um período de tempo maior até reduzir à metade a concentração sérica ou plasmática máxima medida em relação ao mesmo anticorpo, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 que não contém as mesmas substituições.

O termo “recombinante” deve ser subentendido como significando o produto de recombinação genética artificial. Consequentemente, no contexto de uma proteína recombinante que compreende um domínio de ligação de antígeno de anticorpo, esse termo não engloba um anticorpo que ocorre naturalmente dentro do corpo de um indivíduo que é o produto de recombinação natural que ocorre durante

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36/103 maturação de células B. No entanto, se um anticorpo desse tipo é isolado, ele deve ser considerado uma proteína isolada que compreende uma região variável de anticorpo. Similarmente, se um ácido nucléico que codifica a proteína é isolado e expresso usando meios recombinantes, a proteína resultante é uma proteína recombinante que compreende um domínio de ligação de antígeno do anticorpo. O termo recombinante também engloba um anticorpo, imunoglobulina ou proteína de fusão expresso por meios recombinantes artificiais quando está dentro de uma célula, tecido ou indivíduo, por exemplo, no qual é expresso.

O termo se liga especificamente se refere a uma molécula (por exemplo, anticorpo, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4) que se liga específica ou preferencialmente a um antígeno (por exemplo, epitopo ou complexo imune) e não se liga especificamente (ou seja, reage de forma cruzada com) a antígenos como, por exemplo, outras proteínas estrutural ou funcionalmente relacionadas, ou proteínas com homologia de sequência. Uma molécula que se liga especificamente a um antígeno pode se ligar a outros peptídeos ou polipeptídeos com afinidade menor, como determinada, por exemplo, por imunoensaios, BIAcore, ou outros ensaios conhecidos na técnica. De preferência, moléculas que se ligam especificamente a um antígeno não reagem de forma cruzada com outras proteínas. Moléculas que se ligam especificamente a um antígeno podem ser identificadas, por exemplo, por imunoensaios, BIAcore, ou outras metodologias conhecidas por aqueles habilitados na técnica. Apenas como exemplo não limitante, um anticorpo pode ser considerado

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37/103 como se ligando a um antígeno preferencialmente caso ele se ligue ao referido antígeno com uma constante de dissociação (KD) que é menor do que a KD do anticorpo para outro antígeno. Em outro exemplo não limitante, um anticorpo pode ser considerado como se ligando preferencialmente a um primeiro antígeno caso se ligue ao referido primeiro antígeno com uma afinidade que é pelo menos um ordem de magnitude menor do que a KD do anticorpo para o segundo antígeno. Em outra modalidade não limitante, um anticorpo pode ser considerado como se ligando preferencialmente a um primeiro antígeno caso se ligue ao referido primeiro antígeno com uma afinidade que é pelo menos duas ordens de magnitude menor do que a KD do anticorpo para o segundo antígeno.

O termo “que trata” ou “tratar”, como aqui usado, se refere à administração de uma “quantidade terapeuticamente eficaz” do anticorpo, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de acordo com a invenção suficiente para reduzir ou eliminar pelo menos um sintoma de uma doença ou condição especificada.

O termo “evitar” ou “que evita”, como aqui usado, se refere à administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 suficiente para parar ou interromper o desenvolvimento de uma distúrbio ou condição especificada.

Como aqui usado, o termo “quantidade terapeuticamente eficaz” significa uma quantidade suficiente de um anticorpo, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 para reduzir ou inibir um ou

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38/103 mais sintomas de uma doença clínica até um nível que seja abaixo daquele observado e aceito como clinicamente diagnóstico ou clinicamente característico daquela doença. Aqueles habilitados na técnica estarão cientes de que essa quantidade irá variar dependendo, por exemplo, do anticorpo específico (ou anticorpos), construção de imunoglobulina (ou construções) e/ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 (ou proteínas) administrados e/ou do indivíduo particular e/ou do tipo ou gravidade ou nível de doença. Consequentemente, esse termo não deve ser considerado como limitante da invenção a uma quantidade específica, por exemplo, peso ou quantidade e, em vez disso, a presente invenção engloba qualquer quantidade do anticorpo (anticorpos), construção de imunoglobulina (ou construções) e/ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 (proteínas) suficiente para obter o resultado estabelecido em um indivíduo.

O termo farmaceuticamente aceitável”, como aqui usado, significa aprovado por um órgão regulador do governo federal ou estadual ou listado na US Pharmacopeia” ou em outra farmacopéia geralmente reconhecida para uso em humanos.

Como aqui usado, o termo indivíduo” significa um ser humano ou um primata não humano ou mamífero não primata com um FcRn humano.

Substituições de aminoácido

Métodos de substituição de aminoácidos são conhecidos na técnica. Por exemplo, substituições de aminoácidos podem ser feitas por mutagênese sítio-dirigida (por exemplo, Zoller e Smith Nucl. Acids Res. 10: 6.487 (1982)). A

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39/103 mutagênese pode ser realizada por síntese de um oligonucleotídeo que possui uma ou mais modificações dentro da sequência do domínio constante de um anticorpo a ser modificada. A mutagênese sítio-dirigida permite a produção de mutantes por meio do uso de sequências de oligonucleotídeos específicas que codificam a sequência de DNA da mutação desejada, bem como um número suficiente de oligonucleotídeos adjacentes para fornecer uma sequência iniciadora de tamanho e complexidade de sequência suficientes para formar um duplex estável em ambos os lados da junção de deleção que está sendo atravessada. Tipicamente, um iniciador de cerca de 17 até cerca de 75 nucleotídeos ou mais de comprimento é preferido, com cerca de 10 até cerca de 25 ou mais resíduos em ambos os lados da junção da sequência que está sendo alterada. Vários desses iniciadores que introduzem diversas mutações diferentes em uma ou mais posições podem ser usados para gerar uma biblioteca de mutantes.

A metodologia de mutagênese sítio-dirigida é bem conhecida na técnica, (veja, por exemplo, Kunkel e cols., Methods Enzymol. , 154: 367-82, 1987). Em geral, a mutagênese sítio-dirigida é realizada obtendo-se primeiro um vetor de fita simples ou separando por derretimento duas fitas de um vetor de fita dupla que inclui em seu interior sua sequência uma sequência de DNA que codifica o peptídeo desejado. Um iniciador de oligonucleotídeo que abriga a sequência mutada desejada é preparado, geralmente sinteticamente. Esse iniciador é então anelado com o vetor de fita simples e submetido às enzimas de polimerização de

DNA como, por exemplo, T7 DNA polimerase, a fim de

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40/103 completar a síntese da fita que abriga a mutação. Dessa forma, é formado um heteroduplex no qual uma fita codifica a sequência não mutada original e a segunda fita abriga a mutação desejada. Esse vetor de heteroduplex é então usado para transformar ou transfectar células apropriadas, por exemplo, células de E. call, e são selecionados clones que incluem vetores recombinantes que abrigam o arranjo da sequência mutada. Como será observado, a técnica tipicamente emprega um vetor de fago que existe tanto em uma forma de fita simples quanto de fita dupla. Vetores típicos úteis na mutagênese sítio-dirigida incluem vetores como, por exemplo, o M13 fago. Esses fagos são facilmente disponíveis comercialmente e seu uso é geralmente bem conhecido por aqueles habilitados na técnica. Plasmídeos de fita dupla também são rotineiramente empregados na mutagênese sítio-dirigida, o que elimina a etapa de transferência do gene de interesse de um plasmídeo para um fago. A mutagênese sítio-dirigida também tem sido usada para identificar resíduos de aminoácidos que influenciam a depuração plasmática de fragmentos de dobradiça-Fc de IgG1 murídea, como descrito em Kim Jin-Kyoo e cols., (1994) Eur. J. Immunol. 24: 542-548).

Alternativamente, PCR com enzimas termoestáveis comercialmente disponíveis como, por exemplo, Taq DNA polimerase, pode ser usada para incorporar um iniciador de oligonucleotídeo mutagênico em um fragmento de DNA amplificado que pode então ser clonado em um vetor de clonagem ou de expressão apropriado. Veja, por exemplo, Tomic e cols., Nucleic Acids Res., 18(6): 1.656, 1987, e Upender e cols., Biotechniques, 18(1): 29-30, 32, 1995,

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41/103 para procedimentos de mutagênese mediada por PCR. PCR com o emprego de uma ligase termoestável além de uma polimerase termoestável também pode ser usada para incorporar um oligonucleotídeo mutagênico fosforilado em um fragmento de DNA amplificado que pode então ser clonado em um vetor de clonagem ou de expressão apropriado (veja, por exemplo, Michael, Biotechniques, 16(3): 410-2, 1994).

Outros métodos conhecidos por aqueles habilitados na técnica de produção de variantes de sequência da região Fc de um anticorpo ou um domínio de ligação de FcRn desta podem ser usados. Por exemplo, vetores recombinantes que codificam a sequência de aminoácidos do domínio constante de um anticorpo ou um fragmento deste podem ser tratados com agentes mutagênicos, por exemplo, hidroxilamina, para obter variantes de sequência.

Mutantes que resultam em afinidade aumentada por FcRn e meia-vida in vivo aumentada podem ser selecionados usando ensaios de rotina como, por exemplo, aqueles descritos posteriormente.

Substituições de aminoácidos exemplares incluem T250Q e/ou M428L ou T252A, T254S e T266F ou M252Y, S254T e T256E ou H433K e N434F de acordo com o sistema de numeração EU de Kabat. Substituições de aminoácidos adicionais ou alternativas são descritas, por exemplo, em US20070135620 ou US7083784.

Anticorpos da invenção

O anticorpo ou imunoglobulina de acordo com a invenção inclui qualquer molécula de imunoglobulina ou anticorpo que se liga (como determinado por imunoensaios conhecidos na técnica para a avaliação de ligação específica de antígeno

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42/103 anticorpo) a um antígeno e contém uma região Fc ou domínio de ligação de FcRn. Os anticorpos podem ser policlonais, monoclonais ou monoespecíficos, biespecíficos (no contexto de formas multiméricas do anticorpo), humanos, humanizados, quiméricos, Super-Humanizados®, primatizados ou desimunizados. Em outro exemplo, os anticorpos da presente invenção podem ser monoespecíficos (ou biespecíficos, triespecíficos ou de multiespecificidade maior, se presente em forma multimérica).

Em particular, o anticorpo é um tetrâmero monoespecífico.

O anticorpo (e outra construção de imunoglobulina ou proteína de fusão aqui descrita) pode ser de qualquer origem animal. De preferência, o anticorpo é humano ou humanizado. Como aqui usado, o termo anticorpo humano inclui anticorpos que possuem a sequência de aminoácidos de uma imunoglobulina humana e incluem anticorpos isolados de bibliotecas de imunoglobulina humana ou de animais transgênicos para uma ou mais imunoglobulinas humanas e que não expressam imunoglobulinas endógenas, como descrito, por exemplo, em US 5.939.598.

Os anticorpos da invenção compreendem uma região de dobradiça de IgG4 estabilizada. O termo região de dobradiça de IgG4 estabilizada será subentendido como significando uma região de dobradiça de IgG4 que foi modificada para reduzir a troca de braço de Fab ou a propensão para passar por troca de braço de Fab ou formação de um meio-anticorpo ou uma propensão para formar um meioanticorpo. O termo troca de braço de Fab se refere a um tipo de modificação de proteína para IgG4 humana, no qual

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43/103 uma cadeia pesada de IgG4 e cadeia leve anexada (meiamolécula) é trocada por um par de cadeia pesada-leve de outra molécula de IgG4. Dessa forma, moléculas de IgG4 podem adquirir dois braços de Fab distintos que reconhecem dois antígenos distintos (que resultam em moléculas biespecíficas). A troca de braço de Fab ocorre naturalmente in vivo e pode ser induzida in vitro por células sanguíneas purificadas ou agentes redutores como, por exemplo, glutationa reduzida. Um meio-anticorpo se forma quando um anticorpo IgG4 se dissocia para formar duas moléculas, cada uma contendo uma única cadeia pesada e uma única cadeia leve.

A região de dobradiça de IgG4 estabilizada compreende uma substituição de serina para prolina na posição 228 de acordo com o sistema de numeração EU de Kabat (Kabat e cols., Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services, 2001 e Edelman e cols., Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85, 1969), que corresponde a uma substituição de serina para prolina na posição 241 de acordo com o sistema de numeração de Kabat (Kabat e cols., Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services, 1987 e/ou 1991). Para evitar dúvidas, isso se refere à serina no centro da sequência da região de dobradiça de IgG4 CPSCP (ID. DE SEQ. N°: 1). Após substituição da serina para prolina, a região de dobradiça de IgG4 compreende uma sequência CPPCP. A esse respeito, aqueles habilitados na técnica estarão cientes de que a região de dobradiça é uma porção rica em prolina de uma região constante da

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44/103 cadeia pesada de anticorpo que liga as regiões Fc e Fab que confere mobilidade nos dois braços de Fab de um anticorpo.

Em um exemplo, o anticorpo da invenção pode estar em uma forma multimérica. Por exemplo, o anticorpo pode assumir a forma de um dímero, trímero de anticorpo, ou multímero de ordem superior de moléculas monoméricas de imunoglobulina. Dímeros de moléculas de imunoglobulina inteiras ou de fragmentos F(ab')2 são tetravalentes, enquanto dímeros de fragmentos Fab ou moléculas de scFv são bivalentes. Os monômeros individuais dentro de um multímero de anticorpo podem ser idênticos ou diferentes, ou seja, podem ser multímeros de anticorpo heteroméricos ou homoméricos. Por exemplo, os anticorpos individuais dentro de um multímero podem ter especificidades de ligação iguais ou diferentes.

A multimerização de anticorpos pode ser obtida por meio de agregação natural de anticorpos ou por meio de metodologias de ligação químicas ou recombinantes conhecidas por aqueles habilitados na técnica. Por exemplo, uma percentagem de preparações de anticorpos purificadas forma espontaneamente agregados de proteína que contêm homodímeros de anticorpos e outros multímeros de anticorpos de ordem superior. Alternativamente, homodímeros de anticorpos podem ser formados por meio de metodologias químicas de ligação conhecidas por aqueles habilitados na técnica. Como exemplo não limitante, agentes de reticulação heterobifuncionais que incluem, sem limitação, SMCC [succinimidil 4-(maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato] e SATA [N-succinimidil S-acetiltio-acetato] (disponível, por exemplo, de Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, 111))

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45/103 podem ser usados para formar multímeros de anticorpos. Um protocolo exemplar para a formação de homodímeros de anticorpos é dado em Ghetie M.A. e cols. Homodímeros de anticorpos podem ser convertidos em homodímeros de F(ab')2 por meio da digestão com pepsina. Outra forma para formar homodímeros de anticorpos é por meio do uso do peptídeo autofílico TI 5 descrito em Zhao Y & Kohler H., J. Immunother. (1997) 25(5): 396-404.

Alternativamente, podem ser feitos anticorpos para sofrer multimerização naturalmente ou por meio de técnicas de DNA recombinante. Dímeros de ScFv também podem ser formados por meio de metodologias recombinantes conhecidas na técnica; um exemplo da construção de dímeros de scFv é dado em Goel A. e cols. Cancer Research 60(24): 6.9646.971. Multímeros de anticorpos podem ser purificados por qualquer método adequado conhecido na técnica, por exemplo, cromatografia por exclusão de tamanho.

Derivados de anticorpo

A presente invenção também fornece anticorpos que compreendem ou, alternativamente, consistem em variantes (incluindo derivados) das moléculas de anticorpo (por exemplo, os domínios VH e/ou domínios VL) aqui descritos, e esses anticorpos se ligam especificamente a peptídeos antigênicos (por exemplo, o antígeno de IL-5 ou o antígeno de CD33). Metodologias padronizadas conhecidas por aqueles habilitados na técnica podem ser usadas para introduzir mutações na sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula da invenção, incluindo, por exemplo, mutagênese sítio-dirigida e mutagênese mediada por PCR, que resultam em substituições de aminoácidos.

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Derivados de anticorpo de acordo com a invenção também englobam substituições de aminoácidos conservadoras na região Vl e/ou Vh de imunoglobulina. Uma “substituição de aminoácido conservadora” é aquela na qual o resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido que possui uma cadeia lateral com uma carga similar. Famílias de resíduos de aminoácidos que possuem cadeias laterais com cargas similares foram definidas na técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares sem carga (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais com ramificação beta (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Alternativamente, mutações podem ser introduzidas aleatoriamente ao longo de toda ou parte da sequência codificadora, por exemplo, por mutagênese por saturação, e os mutantes resultantes podem ser avaliados quanto à atividade biológica para identificar mutantes que retêm atividade (por exemplo, a habilidade para se ligar aos peptídeos antigênicos da invenção (por exemplo, a habilidade para se ligar aos peptídeos antigênicos da invenção).

O termo substituição conservadora” significa substituições de aminoácidos apresentadas na Tabela 1.

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Tabela 1 - Substituições exemplares.

Resíduo original	Substituições exemplares
Ala (A)	val; leu; ile; gly
Arg (R)	lys
Asn (N)	gln; his
Asp (D)	glu
Cys (C)	ser
Gln (Q)	asn; his
Glu (E)	asp
Gly (G)	pro; ala
His (H)	asn; gln
Ile (I)	leu; val; ala
Leu (L)	ile; val; met; ala; phe
Lys (K)	arg
Met (M)	leu; phe
Phe (F)	leu; val; ala
Pro (P)	gly
Ser (S)	thr
Thr (T)	ser
Trp (W)	tyr
Tyr (Y)	trp; phe
Val (V)	ile; leu; met; phe; ala

Por exemplo, é possível introduzir mutações somente em regiões framework ou somente em regiões de CDR de uma molécula de anticorpo. As mutações introduzidas podem ser 5 mutações com troca de sentido silenciosas ou neutras, ou seja, possuem pouco ou nenhum efeito sobre a habilidade do anticorpo para se ligar ao antígeno. Esses tipos de mutações podem ser úteis para otimizar o uso de códons, ou

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48/103 para aumentar a produção de anticorpos por uma linhagem de células.

Alternativamente, mutações com troca de sentido não neutras podem alterar habilidade de um anticorpo para se ligar AO antígeno. Aqueles habilitados na técnica seriam capazes de projetar e testar moléculas mutantes com propriedades desejadas, por exemplo, nenhuma alteração na atividade de ligação de antígeno ou nenhuma alteração na atividade de ligação (por exemplo, aprimoramentos na atividade de ligação de antígeno ou alteração na especificidade de anticorpo). Após a mutagênese, a proteína codificada pode ser expressa rotineiramente e a atividade funcional e/ou biológica da proteína codificada (por exemplo, habilidade para se ligar especificamente aos peptídeos antigênicos da invenção) pode ser determinada usando técnicas aqui descritas ou por metodologias de modificação rotineiras conhecidas na técnica.

Os anticorpos da invenção incluem derivados que são, de outra forma, modificados por adesão covalente de qualquer tipo de molécula ao anticorpo, de tal forma que a adesão covalente não evite que o anticorpo se ligue ao antígeno. Por exemplo, os derivados de anticorpo incluem anticorpos que foram modificados, por exemplo, por glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a uma ligante celular ou a outra proteína etc. Qualquer uma de diversas modificações químicas pode ser realizada por metodologias conhecidas na técnica, incluindo clivagem química específica, acetilação, formilação, síntese metabólica de

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49/103 tunicamicina etc. Adicionalmente, o derivado pode conter um ou mais aminoácidos não clássicos.

Além disso, os anticorpos da invenção podem ser sintetizados quimicamente. Por exemplo, um peptídeo que corresponde a uma porção de uma proteína pode ser sintetizado por uso de um sintetizador peptídico. Além disso, se desejado, aminoácidos não clássicos ou análogos químicos de aminoácidos podem ser introduzidos como substituições e/ou adicionais na sequência de um, qualquer um, ambos, vários ou todos os polipeptídeos do complexo.

Aminoácidos não clássicos incluem, sem limitação, os D-isômeros dos aminoácidos comuns, flúor-aminoácidos, aminoácidos planejados como, por exemplo, beta-metil aminoácidos, C gama-metil aminoácidos, N gama-metil aminoácidos e análogos de aminoácidos em geral.

A presente invenção também fornece imunoconjugados que compreendem um anticorpo ou construção de imunoglobulina da presente invenção conjugado a uma porção distinta, por exemplo, um agente terapêutico, que está ligado direta ou indiretamente ao anticorpo. Exemplos de outras porções incluem, sem limitação, uma citotoxina, um radioisótopo (por exemplo, iodo-131, ítrio-90 ou índio-111), um agente imunomodulador, um agente antiangiogênico, um agente antineovascularização e/ou outro agente de vascularização, uma toxina, um agente antiproliferativo, um agente próapoptótico, um agente quimioterápico e um ácido nucléico terapêutico.

Uma citotoxina inclui qualquer agente que seja prejudicial (por exemplo, mate) às células. Para uma descrição dessas classes de fármacos que são conhecidas na

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50/103 técnica, e seus mecanismos de ação, veja Goodman e cols., “Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics”, 8^a Edição, Macmillan Publishing Co., 1990. Técnicas adicionais relevantes para a preparação de imunotoxinas de anticorpo são fornecidas, por exemplo, em Vitetta (1993) e US 5.194.594. Toxinas exemplares incluem cadeia A de difteria, fragmentos ativos não ligantes de toxina diftérica, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A de ricina, cadeia A de abrina, cadeia A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogilina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Veja, por exemplo, WO 93/21232.

Agentes terapêuticos adequados à formação de imunoconjugados da presente invenção incluem taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, diidróxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glicocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol e puromicina, antimetabólitos (por exemplo, metotrexato, 6mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5fluoruracil, decarbazina, hidroxiuréia, asparaginase, gemcitabina, cladribina), agentes alquilantes (por exemplo, mecloretamina, tioepa, clorambucil, melfalan, carmustina (BSNU), lomustina (CCNU), ciclofosfamida, bussulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, dacarbazina (DTIC),

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51/103 procarbazina, mitomicina C, cisplatina e outros derivados de platina, por exemplo, carboplatina), antibióticos (por exemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, daunorrubicina (anteriormente daunomicina), doxorrubicina, idarrubicina, mitramicina, mitomicina, mitoxantrona, plicamicina, antramicina (AMC)).

Diversos radionuclídeos estão disponíveis para a produção de anticorpos radioconjugados. Exemplos incluem,

sem limitação,	²¹²Bi,	¹³¹I, ⁹⁰Y e ¹⁸⁶Re.
Conjugados	do	anticorpo e	agentes	terapêuticos	são
feitos com o	uso	de diversos	agentes	bifuncionais	de

acoplamento de proteína como, por exemplo, sem limitação, ácido 4-(4^,acetilfenoxi)butanóico (AcBut), ácido 3acetilfenil acídico (AcPac), ácido 4-mercapto-4-metilpentanóico (Amida), N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (por exemplo, dimetil adipimidato HCl), ésteres ativos (por exemplo, dissuccinimidil suberato), aldeídos (por exemplo, glutaraldeído), compostos bis-azido (por exemplo, bis(pazidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (por exemplo, bis-(p-diazôniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (por exemplo, tolueno 2,6-diisocianato) e compostos bis-ativos de flúor (por exemplo, 1,5-diflúor2,4-dinitrobenzeno), e derivados destes. Por exemplo, uma imunotoxina de ricina pode ser preparada como descrito por Vitetta e cols. (1987). Ácido 1-isotiocianatobenzil-3metildietileno triaminapenta-acético (MX-DTPA) marcado com carbono-14 é um agente quelante exemplar para conjugação de um radionucleotídeo ao anticorpo (WO 94/1 1026).

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Construções de imunoglobulina da invenção

Como aqui usado, o termo “construção de imunoglobulina” visa se referir às construções nas quais um fragmento de ligação de antígeno de anticorpo é ligado a uma região de dobradiça de IgG4 humana modificada e a uma região Fc de IgG4 humana modificada ou domínio de ligação de FcRn desta de acordo com a presente invenção. De interesse particular são construções de imunoglobulina que compreendem regiões Fc, fusões de Fc e a região constante da cadeia pesada (CH1-dobradiça-CH2-CH3).

Fragmentos de anticorpo específicos incluem, sem

limitação	,	i)	o fragmento	Fab que consiste	nos domínios
VL, VH,	CL	e	CH1; (ii)	o	fragmento Fd	que	consiste nos
domínios	VH	e	CH1, (iii	o	fragmento Fv	que	consiste nos
domínios	VL	e	VH de um	úni	co anticorpo;	(iv)	o fragmento

dAb (Ward e cols., (1989) Nature 341:544-546) que consiste em uma única região variável; (v) regiões de CDR isoladas;

(vi) fragmentos F(ab')2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados; (vii) moléculas Fv de cadeia única (scFv), em que um domínio VH e um domínio VL estão ligados por um peptídeo vinculador, o que permite que os dois domínios se associem para formar um sítio de ligação de antígeno (Bird e cols., (1988) Science 242: 423426, Huston e cols., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:

5.879-5.883); (viii) Fv de cadeia única biespecífico (WO 03/11 161); e (ix) diabodies e triabodies ou tetrabodies (Tomlinson e cols., (2000) Methods Enzymol. 326: 461-479;

WO 94/13804; Hollinger e cols., (1993) Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 90: 6.444-6.448). As moléculas podem ser estabilizadas pela incorporação de pontes de dissulfeto que

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53/103 ligam os domínios VH e VL (Reiter e cols., (1996) Nature

Biotech. 14: 1.239-1.245).

Será observado que os fragmentos descritos acima (que não contêm uma região de dobradiça) podem ser unidos a uma região de dobradiça-Fc, em que a dobradiça serve como um vinculador.

Em outro exemplo, o fragmento de anticorpo pode ser um minibody flex que consiste em scFV-CH3 e sequência da região de dobradiça (como descrito em Hu, Shi-zhen e cols., (1996) Cancer Research 56: 3.055-3.061).

Preparação de anticorpos

Anticorpos podem ser preparados com o uso de uma ampla variedade de metodologias conhecidas na técnica, incluindo o uso de tecnologias de hibridoma, recombinantes e de exibição em fago, ou uma combinação destas. Por exemplo, anticorpos monoclonais podem ser produzidos com o uso de metodologias de hibridoma, incluindo aquelas conhecidas na técnica e ensinadas, por exemplo, por Harlow e cols., “Antibodies: A laboratory Manual” (Cold Spring Harbor

Laboratory Press, 2^a Edição 1988).

O termo “anticorpo monoclonal”, como aqui usado, não está limitado aos anticorpos produzidos por meio da tecnologia de hibridoma. O termo se refere a qualquer anticorpo que seja derivado de um único clone, incluindo qualquer clone procariótico, eucariótico ou de fago, e não ao método pelo qual é produzido.

Métodos para produção e avaliação de anticorpos específicos usando a tecnologia de hibridoma são rotineiros na técnica. Por exemplo, camundongos podem ser imunizados com um antígeno de interesse ou uma célula que expressa

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54/103 esse antígeno. Após a detecção de uma resposta imune, o baço do camundongo é coletado e os esplenócitos isolados. Os esplenócitos são então fundidos a células de mieloma. Os hibridomas são selecionados e clonados por diluição limitante. Os clones são então testados por métodos conhecidos na técnica quanto às células que secretam anticorpos capazes de se ligar ao antígeno. Fluido ascítico, que geralmente contém níveis elevados de anticorpos, podem ser gerados por inoculação de camundongos por via intraperitoneal com clones de hibridoma positivos.

Fragmentos de anticorpo que reconhecem epitopos específicos podem ser gerados por técnicas de rotina. Por exemplo, fragmentos Fab e F(ab')2 podem ser produzidos por clivagem proteolítica de moléculas de imunoglobulina, usando enzimas como, por exemplo, papaína (para produzir fragmentos Fab) ou pepsina (para produzir fragmentos F(ab')2). Fragmentos F(ab')2 contêm a cadeia leve completa, e a região variável, a região CH1 e a região de dobradiça da cadeia pesada.

Anticorpos também podem ser gerados com o uso de vários métodos de exibição em fago. Nos métodos de exibição em fago, domínios funcionais do anticorpo são exibidos na superfície de partículas de fago que carregam as sequências de polinucleotídeos que os codificam. Em uma modalidade particular, esse fago pode ser utilizado para exibir domínios de ligação de antígeno, por exemplo, Fab e Fv ou Fv estabilizado por ligação dissulfeto, expressos por um repertório ou biblioteca combinatória de anticorpos (por exemplo, humanos ou murídeos). Fagos que expressam um domínio de ligação de antígeno que se liga ao antígeno de

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55/103 interesse podem ser selecionados ou identificados com antígeno, por exemplo, usando antígeno marcado ou antígeno ligado ou capturado em uma superfície sólida ou glóbulo. Os fagos usados nesses métodos são tipicamente fagos filamentosos, incluindo fd e M13. Os domínios de ligação de antígeno são expressos como uma proteína fundida recombinantemente à proteína do gene de fago III ou do gene VIII. Alternativamente, uma porção de ligação de FcRn modificada de imunoglobulinas da presente invenção também pode ser expressa em um sistema de exibição em fago. Exemplos de métodos de exibição em fago que podem ser usados para produzir as imunoglobulinas, ou fragmentos destas, da presente invenção incluem aqueles revelados em Brinkman e cols., J. Immunol. Methods, 182: 41-50, 1995; Ames e cols., J. Immunol. Methods, 184: 177-186, 1995; Kettleborough e cols., Eur. J. Immunol., 24: 952-958, 1994; Persic e cols., Gene, 187: 9-18, 1997; Burton e cols., Advances in Immunology, 57: 191-280, 1994; Pedido PCT N° PCT/GB91/01134; Publicações PCT WO 90/02809; WO 91 /10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/1 1236; WO 95/15982; WO 95/20401; e Patentes U.S. N^os 5.698.426, 5.223.409, 5.403.484, 5.580.717, 5.427.908, 5.750.753, 5.821.047,

5.571.698,	5.427.	908,	5.516	.637, 5.780.225, 5.658.727,
5.733.743	e 5.969.	108.
Após	seleção	do	fago,	as regiões codificadoras	de
anticorpo	do fago	podem ser	isoladas e usadas para gerar
anticorpos	inteiros,	incluindo anticorpos humanos,	ou
quaisquer	outros	fragmentos	desejados, e expressas	em

qualquer hospedeiro desejado, incluindo células mamíferas, células de inseto, células de planta, levedura e bactérias.

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Por exemplo, também podem ser empregadas técnicas para produzir recombinantemente fragmentos Fab, Fab' e F(ab')2 com o uso de métodos conhecidos na técnica como, por exemplo, aqueles revelados na Publicação PCT WO 92/22324; Mullinax e cols., BioTechniques, 12(6): 864-869, 1992; e

Sawai e cols., AJRI, 34: 26-34, 1995; e Better e cols.,

Science, 240: 1.041-1.043, 1988; exemplos de técnicas que podem ser usadas para produzir Fvs e anticorpos de cadeia única incluem aquelas descritas nas Patentes U.S. N^os4.946.778 e 5.258.498; Huston e cols., Methods in Enzymology, 203: 46-88, 1991; Shu e cols., PNAS, 90: 7.9957.999, 1993; e Skerra e cols., Science, 240: 1.038-1.040,

1988.

Produção recombinante de anticorpos, construções de imunoglobulina e proteínas de fusão de imunoglobulina IgG4

Os anticorpos, construções de imunoglobulina e proteínas de fusão de imunoglobulina IgG4 da presente invenção podem ser produzidos recombinantemente. Por exemplo, DNA que codifica um anticorpo, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 da invenção é facilmente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, por utilização de sondas de oligonucleotídeo que são capazes de se ligar especificamente aos genes que codificam as cadeias pesadas e leves de anticorpos). Uma célula de hibridoma serve como uma fonte preferida desse DNA para anticorpos. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são então transfectados em células hospedeiras como, por exemplo, células de E. coli, células de símios COS, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de

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57/103 mieloma que, de outro modo, não produzem proteína de anticorpo, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Artigos de revisão sobre a expressão recombinante em bactérias de DNA que codifica o anticorpo incluem Skerra e cols., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993) e Pluckthun, Immunol. Revs.,

730: 151-188 (1992). Metodologias de clonagem molecular para atingir esses objetivos são conhecidas na técnica. Uma ampla variedade de métodos de clonagem e amplificação in vitro é adequada para a construção de ácidos nucléicos recombinantes. Exemplos dessas técnicas e instruções suficientes para dirigir aqueles habilitados na técnica por meio de muitos exercícios de clonagem são encontrados em Berger e Kimmel, “Guide to Molecular Cloning Techniques”, “Methods in Enzymology”, volume 152, Academic Press, Inc., San Diego, Califórnia (Berger); Sambrook e cols. (1989) “Molecular Cloning A Laboratory Manual” (2^a Edição), Volume 13, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, N.Y., (Sambrook); e “Current Protocols in Molecular Biology”, F.M. Ausubel e cols., eds., “Current Protocols”, um empreendimento comum entre Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc. (Suplemento de 1994) (Ausubel). Métodos de produção de imunoglobulinas recombinantes também são conhecidos na técnica. Veja, Cabilly, Patente U.S. N° 4.816.567; e Queen e cols. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10.029-10.033.

Para produção recombinante, o ácido nucléico que codifica o anticorpo, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 é preferivelmente isolado e inserido em um vetor replicável para clonagem

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58/103 posterior (amplificação do DNA) ou para expressão. DNA que codifica o anticorpo ou proteína de fusão é facilmente isolado ou sintetizado com o uso de procedimentos convencionais (por exemplo, por utilização de sondas de oligonucleotídeo que são capazes de se ligar especificamente aos DNAs que codificam as cadeias pesadas e leves do anticorpo). Muitos vetores estão disponíveis. Os componentes do vetor geralmente incluem, sem limitação, um ou mais dos seguintes: uma sequência sinalizadora, uma sequência que codifica um anticorpo da presente invenção ou fragmento desta (por exemplo, derivada da informação aqui fornecida), um elemento intensificador, um promotor e a sequência de terminação da transcrição.

(i) Componente de sequência sinalizadora. O anticorpo dessa invenção pode ser produzido recombinantemente não apenas diretamente, mas também como um polipeptídeo de fusão com um polipeptídeo heterólogo, que é preferivelmente uma sequência sinalizadora ou outro polipeptídeo que possui um sítio de clivagem específico no terminal N da proteína ou polipeptídeo maduro. A sequência sinalizadora heteróloga selecionada preferivelmente é uma que é reconhecida e processada (ou seja, clivada por uma peptidase sinalizadora) pela célula hospedeira. Para células hospedeiras procarióticas que não reconhecem e processam a sequência sinalizadora de anticorpo nativa, a sequência sinalizadora é substituída por uma sequência sinalizadora procariótica selecionada, por exemplo, do grupo dos líderes de fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp ou enterotoxina II termoestável. Para secreção em leveduras, a sequência sinalizadora nativa pode ser substituída, por exemplo, pelo

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59/103 líder de invertase de levedura, líder de fator α ou líder de fosfatase ácida, o líder de glicoamilase de C. albicans ou o sinal descrito em WO 90/13646. Na expressão em células mamíferas, estão disponíveis sequências sinalizadoras mamíferas, bem como líderes secretores virais, por exemplo, o sinal de gD do herpes simplex. O DNA para essa região precursora é ligado em quadro de leitura ao DNA que codifica o anticorpo.

(ii) Componente de promotor. Vetores de expressão e de clonagem normalmente contêm um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e é ligado operacionalmente ao ácido nucléico do anticorpo. Promotores adequados para uso com hospedeiros procarióticos incluem o promotor de phoA, sistemas promotores de β-lactamase e lactose, fosfatase alcalina, um sistema promotor de triptofano (trp) e promotores híbridos como, por exemplo, o promotor de tac. No entanto, outros promotores bacterianos conhecidos são adequados. Promotores para uso em sistemas bacterianos também conterão uma sequência de Shine-Dalgarno (S.D.) ligada operacionalmente ao DNA que codifica o anticorpo.

São conhecidos promotores para eucariotas. Praticamente todos os genes eucarióticos possuem uma região rica em AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases acima do sítio onde a transcrição é iniciada. Outra sequência encontrada 70 a 80 bases acima do início da transcrição de muitos genes é uma região CNCAAT, em que N pode ser qualquer nucleotídeo. Na extremidade 3' da maioria dos genes eucarióticos está uma sequência AATAAA que pode ser o sinal para adição da cauda poli A à extremidade 3' da sequência codificadora. Todas essas sequências são

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60/103 adequadamente inseridas em vetores de expressão eucarióticos. Exemplos de sequências promotoras adequadas para uso com hospedeiros de levedura incluem os promotores para 3-fosfoglicerato quinase ou outras enzimas glicolíticas, por exemplo, enolase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, hexoquinase, piruvato descarboxilase, fosfofrutoquinase, glicose-6-fosfato isomerase, 3fosfoglicerato mutase, piruvato quinase, triosefosfato isomerase, fosfoglicose isomerase e glicoquinase. Outros promotores de levedura, que são promotores indutíveis que possuem a vantagem adicional de transcrição controlada por condições de crescimento, são as regiões promotoras para álcool desidrogenase 2, iso-citocromo C, fosfatase ácida, enzimas de degradação associadas ao metabolismo do nitrogênio, metalotioneína, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose. Vetores e promotores adequados para uso em expressão em levedura são ainda descritos em EP 73.657. Intensificadores de levedura também são usados vantajosamente com promotores de levedura.

A transcrição de anticorpo por vetores em células hospedeiras mamíferas é controlada, por exemplo, por promotores obtidos dos genomas de vírus como, por exemplo, o vírus do polioma, vírus da bouba aviária, adenovírus (por exemplo, Adenovírus 2), CMV, vírus do papiloma bovino, vírus do sarcoma aviário, citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite-B e, mais preferivelmente, vírus símio 40 (SV40), por promotores mamíferos heterólogos, por exemplo, o promotor de actina ou um promotor de imunoglobulina, por promotores de choque térmico, desde que esses promotores

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61/103 sejam compatíveis com os sistemas da célula hospedeira.

(iii) Componente de elemento intensificador. A transcrição de um DNA que codifica o anticorpo dessa invenção por eucariotas superiores é frequentemente aumentada por inserção de uma sequência intensificadora no vetor. Muitas sequências intensificadoras são agora conhecidas para genes de mamíferos (globina, elastase, albumina, α-fetoproteína e insulina). Tipicamente, no entanto, será utilizado um intensificador de um vírus de célula eucariótica. Exemplos incluem o intensificador de SV40 no lado tardio da origem de replicação (bp 100-270), o intensificador do promotor precoce de citomegalovírus, o intensificador de polioma no lado tardio da origem de replicação e intensificadores de adenovírus. Veja também Yaniv (1982) Nature 297: 17-18 sobre elementos de intensificação para ativação de promotores eucarióticos. O intensificador pode ser unido ao vetor em uma posição 5' ou 3' em relação à sequência codificadora de anticorpo, mas está localizado preferivelmente em um sítio 5' em relação ao promotor.

(iv) Componente de terminação da transcrição. Os vetores de expressão usados em células eucarióticas hospedeiras (leveduras, fungos, insetos, plantas, animais, humanas ou células nucleadas de outros organismos multicelulares) também conterão sequências necessárias à terminação da transcrição e à estabilização do mRNA. Essa sequências estão comumente disponíveis pelas regiões não traduzidas 5' e, ocasionalmente, 3', de DNAs ou cDNAs eucarióticos ou virais. Essas regiões contêm segmentos de nucleotídeos transcritos como fragmentos poliadenilados na

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62/103 porção não traduzida do mRNA que codifica o anticorpo. Um componente de terminação da transcrição útil é a região de poliadenilação do hormônio do crescimento bovino. Veja WO 94/1 1026 e o vetor de expressão nela revelado.

(v) Seleção e transformação de células hospedeiras. Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão do DNA nos vetores aqui apresentados são as células procariotas, de leveduras ou de eucariotas superiores descritas acima. Procariotas adequados para essa finalidade incluem eubactérias, por exemplo, organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae como, por exemplo, Escherichia, por exemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por exemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo, Serratia marcescans, e Shigella, além de bacilos como, por exemplo, B. subtilis e B. licheniformis, Pseudomonas, por exemplo, P. aeruginosa, e Streptomyces. Um hospedeiro de clonagem de E. coli preferido é E. coli 294 (ATCC 31.446), embora outras cepas como, por exemplo, E. coli B, E. coli X 1776 (ATCC 31.537) e E. coli W3110 (ATCC 27.325) sejam adequadas. Esses exemplos são ilustrativos, e não limitantes.

Além de procariotas, micróbios eucarióticos como, por exemplo, fungos filamentosos ou leveduras, são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vetores que codificam anticorpos. Saccharomyces cerevisiae, ou levedura de padaria comum, é a mais comumente usada entre microorganismos hospedeiros eucarióticos inferiores. No entanto, vários outros gêneros, espécies e cepas são comumente disponíveis e úteis nesse pedido, por exemplo,

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Schizosaccharomyces pombe; hospedeiros de Kluyveromyces hosts como, por exemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans e K. marxianus; Yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070); Candida;

Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces como, por exemplo, Schwanniomyces occidentalis; e fungos filamentosos como, por exemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, e hospedeiros de Aspergillus como, por exemplo, A. nidulans e A. niger.

Células hospedeiras adequadas à expressão de anticorpo glicosilado são derivadas de organismos multicelulares. Exemplos de células de invertebrados incluem células de planta e de inseto. Várias cepas e variantes baculovirais e células hospedeiras de inseto permissivas correspondentes de hospedeiros como, por exemplo, Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de frutas) e Bombyx mori foram identificadas. Diversas cepas virais para transfecção estão disponíveis publicamente, por exemplo, a variante L-I de Autographa californica NPV e a cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, e esses vírus podem ser aqui usados como o vírus de acordo com a presente invenção, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda.

Exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis são a linhagem de rim de macaco CVI transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293 subclonadas para crescimento em cultura de suspensão, Graham e cols (1977)

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Gen. Virol. 36:59); células de rim de filhote de hamster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês (CHO, Urlaub e cols (1980) Proc. Natl. Acad. Sci USA 77: 4.216); células de Sertoli de camundongo (TM4, Mather (1980) Biol. Repro^d. 23: 243-251); células de rim de macaco (CVI ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather e cols (1982) Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68);

células MRC 5; células FS4; e PER.C6™ (Crucell NV).

As células do hospedeiro são transformadas com os vetores de expressão ou clonagem descritos acima para a produção de anticorpo ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 e cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados da forma adequada para indução de promotores, seleção de transformantes ou amplificação dos genes que codificam as sequências desejadas.

(vii) Cultivo das células hospedeiras. As células hospedeiras usadas para produzir o anticorpo dessa invenção podem ser cultivadas em diversos meios. Meios disponíveis comercialmente como, por exemplo, meio de Ham FI0 (Sigma), meio essencial mínimo ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) e meio de Eagle modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) são adequados para o cultivo das células hospedeiras. Além disso, qualquer um dos meios descritos em Ham e cols (1979) Meth. Enz. 58: 44, Barnes e cols. (1980) Anal. Biochem.

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102: 255, Patentes U.S. N^os 4.767.704; 4.657.866;

4.927.762; 4.560.655; ou 5.122.469; WO 90/03430; WO

87/00195; ou Patente U.S. Re. 30.985 pode ser usado como meios de cultura para as células hospedeiras. Qualquer um desses meios pode ser suplementado da forma necessária com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (por exemplo, insulina, transferrina ou fator de crescimento epidérmico), sais (por exemplo, cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (por exemplo, HEPES), nucleotídeos (por exemplo, adenosina e timidina), antibióticos (por exemplo, o fármaco GENTAMICINA™), microelementos (definidos como compostos inorgânicos normalmente presentes em concentrações finais na faixa micromolar) e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suplementos necessários também podem ser incluídos em concentrações apropriadas que seriam conhecidas por aqueles habilitados na técnica. As condições de cultura, por exemplo, temperatura, pH e semelhantes, são aquelas previamente usadas com a célula hospedeira selecionada para expressão, e serão evidentes para aqueles habilitados na técnica.

Anticorpos quiméricos

O anticorpo de acordo com a invenção pode ser um anticorpo quimérico. Anticorpos quiméricos são feitos por meios recombinantes por combinação da regiões variáveis da cadeia leve e pesada (VL e VH) obtidas de células produtoras de anticorpos de uma espécie com as regiões constantes da cadeia leve e pesada de outra. Tipicamente, anticorpos quiméricos utilizam regiões variáveis de roedor ou coelho e regiões constantes humanas a fim de produzir um anticorpo com predominantemente domínios humanos. Por

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66/103 exemplo, um anticorpo quimérico compreende uma região variável de um anticorpo de camundongo fundida a uma região constante humana. A produção desses anticorpos quiméricos é conhecida na técnica, e pode ser obtida por meios-padrão (como descrito, por exemplo, em Morrison, Science 229: 1.202 (1985); Oi e cols., BioTechniques 4: 214 (1986);

Gillies e cols., (1989) J. Immunol. Methods 725: 191-202;

Patentes U.S. N^os 5.807.715, 4.816.567 e 4.816.397).

Anticorpo primatizado

O termo “anticorpo primatizado” se refere a um anticorpo que compreende regiões variáveis de macaco e regiões constantes humanas. Métodos para produção de anticorpos primatizados são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, as Patentes U.S. N^os 5.658.570, 5.681.722 e

5.693.780.

Anticorpos humanizados e humanos

Estão incluídos dentro do escopo da invenção anticorpos desimunizados que possuem variações de sequência produzidas com o uso de métodos descritos, por exemplo, nas Publicações de Patente N^os EP 0983303, WO 00/34317 e WO

98/52976.

O termo anticorpos “humanos” inclui anticorpos que possuem a sequência de aminoácidos de uma imunoglobulina humana, e incluem anticorpos isolados de bibliotecas de imunoglobulina humana ou de animais transgênicos para uma ou mais imunoglobulinas humanas como descrito, por exemplo, em Patente U.S. N° 5.939.598. Anticorpos humanos podem ser feitos por diversos métodos conhecidos na técnica, incluindo exibição em fago usando bibliotecas de anticorpos derivadas de sequências de imunoglobulina humana. Veja

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67/103 também WO 98/46645, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 e WO 91 /10741.

Os anticorpos da presente invenção podem ser anticorpos humanizados. Formas humanizadas de anticorpos não humanos (por exemplo, murídeos) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou fragmentos destas (por exemplo, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de ligação de antígeno de anticorpos) que contêm sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Anticorpos humanizados incluem imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) nas quais resíduos de uma região determinante de complementaridade (CDR) do receptor são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador) como, por exemplo, de camundongo, rato ou coelho, que possuem a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, um ou mais resíduos

Fv framework da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Anticorpos humanizados também podem compreender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo receptor nem na CDR ou sequências framework importadas. Em geral, o anticorpo humanizado pode compreender substancialmente tudo de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as regiões de CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma sequência de consenso de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado otimamente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana

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68/103 (Jones e cols. (1986) Nature, 321: 522-525; Riechmann e cols. (1988) Nature, 332: 323-329; e Presta (1992) Curr.

Op. Struct. Biol., 2: 593-59).

Métodos para humanização de anticorpos não humanos podem ser realizados basicamente de acordo com o método de Winter e colaboradores (Jones P.T. e cols. (1986) Nature 321 (6069): 522; Riechmann L e cols. (1988) Nature

332(6162): 323-327; Verhoeyen M. e cols. (1988) Science 239 (4847): 1.534-1.536. Geralmente, um anticorpo humanizado possui um ou mais resíduos de aminoácidos nele introduzidos de uma fonte não humana. Esses resíduos não humanos de aminoácidos são frequentemente denominados resíduos importados, que são tipicamente recolhidos de um domínio variável importado. Consequentemente, esses anticorpos humanizados são anticorpos quiméricos (Patente U.S. N° 4.816.567), em que substancialmente menos de um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos da CDR e possivelmente alguns resíduos da FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores.

Anticorpos podem ser humanizados com o uso de diversas metodologias conhecidas na técnica, incluindo, por exemplo, enxerto de CDR (EP 239400; Publicação PCT WO 91/09967; Patentes U.S. N^os 5.225.539, 5.530.101 e 5.585.089), envernizamento (veneering) ou recondicionamento (EP 592106; EP519596; Padlan E.A. e cols. (1991) Mol. Immunol. 28(4-5): 489; Studnicka G.M. e cols. (1994) Protein Eng. 7(6): 80514) e embaralhamento de cadeias (Patente U.S. 5.565.332).

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Em alguns casos, resíduos dentro das regiões framework de uma ou mais regiões variáveis da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes (veja, por exemplo, Patente U.S. de Queen 5.585.089; Patentes U.S. 5.693.761, 5.693.762 e 6.180.370.

A invenção também se estende aos anticorpos humanizados de acordo com os métodos denominados SuperHumanização® descritos em US 6.881.557 e 7.732.578. Resumidamente, esses métodos para anticorpos humanizados se baseiam na seleção de sequências framework da região variável de genes de anticorpo humano por comparação de tipos de estrutura canônica de CDR para sequências de CDR da região variável de um anticorpo não humano com tipos de estrutura canônica de CDR para CDRs correspondentes de uma biblioteca de sequências de anticorpo humano. Regiões variáveis de anticorpo humano que possuem tipos similares de estrutura canônica de CDR para as CDRs não humanas formam um subconjunto de sequências de anticorpo humanomembro do qual são selecionadas sequências framework humanas.

Também estão incluídos dentro do escopo da invenção os “anticorpos envernizados”. O termo anticorpo envernizado se refere a uma substituição seletiva de resíduos da região framework com resíduos da região framework humana a fim de fornecer uma molécula xenogênica que compreende um sítio de ligação de antígeno que retém substancialmente toda a estrutura de enovelamento nativa da região framework. Técnicas de envernizamento se baseiam na compreensão de que as características de ligação de ligante de um sítio de ligação de antígeno são determinadas primariamente pela

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70/103 estrutura e disposição relativa de conjuntos de CDR da cadeia pesada e leve dentro da superfície de ligação de antígeno. Utilizando-se as técnicas de envernizamento, os resíduos exteriores (por exemplo, acessível a solventes) da região framework, que são facilmente encontrados pelo sistema imune, são seletivamente substituídos com resíduos humanos para fornecer uma molécula híbrida que compreende uma superfície envernizada fracamente imunogênica, ou substancialmente não imunogênica.

Anticorpos humanos também podem ser produzidos com o uso de diversas metodologias conhecidas na técnica, incluindo bibliotecas de exibição em fago (Hoogenboom e Winter (1991) J. Mol. Biol., 227: 381; Marks e cols (1991)

J. Mol. Biol., 222: 581). As técnicas de Cole e cols e

Boerner e cols. Também são adequadas para a preparação de anticorpos monoclonais humanos (Cole e cols., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, página 77 (1985) e Boerner e cols. (1991) J. Immunol., 147: 86-95) .

Similarmente, anticorpos humanos podem ser feitos por introdução de loci de imunoglobulina humana em animais transgênicos, por exemplo, camundongos nos quais os genes endógenos de imunoglobulina foram parcial ou completamente inativados. Após ataque, a produção de anticorpo humano é observada, que se parece muito com aquela observada em humanos em todos os aspectos, incluindo rearranjo de genes, montagem e repertório de anticorpos. Essa abordagem é descrita, por exemplo, nas Patentes U.S. N^os 5.545.807, 5.545.806, 5.569.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016.

Em outra modalidade, anticorpos totalmente humanos são obtidos por imunização de camundongos transgênicos. Um

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71/103 camundongo desse tipo é obtido usando a tecnologia XenoMouse™ (Abgenix; Fremont, Califórnia) e é revelado nas Patentes U.S. N^os 6.075.181, 6.091.001 e 6.114.598. Esperase que anticorpos totalmente humanos minimizem as respostas imunogênicas e alérgicas intrínsecas aos anticorpos monoclonais de camundongo ou derivatizados de camundongo e, dessa forma, aumentem a eficácia e segurança dos anticorpos administrados.

Anticorpos completamente humanos que reconhecem um epitopo selecionado também podem ser gerados usando um a técnica denominada “seleção guiada”. Nessa abordagem, um anticorpo monoclonal não humano selecionado, por exemplo, um anticorpo de camundongo, é usado para guiar a seleção de um anticorpo completamente humano que reconhece o mesmo epitopo (Jespers e cols., Bio/technology 72: 899-903 (1988)).

Os anticorpos também podem ser amadurecidos em termos de afinidade usando métodos conhecidos de seleção e/ou mutagênese que são conhecidos na técnica. Anticorpos amadurecidos em termos de afinidade preferidos possuem uma afinidade que é cinco vezes, mais preferivelmente 10 vezes,

ainda mais	preferivelmente 20 ou	30 vezes	maior do que	o
anticorpo	de partida (geralmente	murídeo	humanizado	ou
humano) a	partir do qual o anticorpo	amadurecido	é
preparado.
Um anticorpo amadurecido em	termos	de afinidade”	é

aquele com uma ou mais alterações em uma ou mais CDRs deste que resultam em um aumento na afinidade do anticorpo por IL-5, comparado com um anticorpo parente que não possui aquelas alterações. Marks e cols. (1991) J. Mol. Biol. 222:

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581-597 descrevem amadurecimento da afinidade por embaralhamento dos domínios VH e VL.

Ligação de anticorpos

Os anticorpos da invenção podem ser avaliados quanto à ligação específica por qualquer método conhecido na técnica. Os imunoensaios que podem ser usados incluem, sem limitação, sistemas de ensaios competitivos e não competitivos que utilizam técnicas como, por exemplo, análise BIAcore, análise FACS (classificador de células ativadas por fluorescência), imunofluorescência, imunocitoquímica, western blots, radioimunoensaios, ELISA, imunoensaios em sanduíche, ensaios de imunoprecipitação, reações de precipitina, reações de precipitina por difusão em gel, ensaios de imunodifusão, ensaios de aglutinação, ensaios de fixação de complemento, ensaios imunorradiométricos, imunoensaios fluorescentes, imunoensaios de proteína A etc.

Proteínas de fusão de imunoglobulina IgG4

A presente invenção também fornece proteínas de fusão que compreendem uma molécula bioativa recombinantemente fundida ou conjugada quimicamente (incluindo conjugações covalentes ou não covalentes) a uma região Fc de IgG4 humana modificada ou domínio de ligação de FcRn desta e sequência da região de dobradiça central de IgG4 humana modificada da invenção. O termo “proteína de fusão” é frequentemente sinônimo com o termo “imunoadesina”. Sem se prender a uma teoria, acredita-se que mutações da proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 estabilizem a região de dobradiça, e mutações na região Fc aumentam a afinidade por FcRn humano. Em uma modalidade particular, a proteína de

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73/103 fusão compreende a sequência de aminoácidos no ID. DE SEQ. N°: 14, ou uma variante desta desprovida do aminoácido do terminal C (lisina).

A molécula bioativa que é fundida pode ser qualquer polipeptídeo ou fármaco sintético conhecido por aqueles habilitados na técnica. Exemplos de polipeptídeos adequados incluem citocinas, moléculas de adesão celular (por exemplo, CTLA4, CD2 e CD28), ligantes (por exemplo, TNFalfa, TNF-beta e fator antiangiogênico), receptores e fatores de crescimento (por exemplo, PDGF, EGF, NGF e KGF), uma enzima, uma quimiocina.

A molécula bioativa que pode ser fundida também pode ser um polímero não proteináceo, por exemplo, polietileno glicol ou polipropileno glicol.

Métodos para produção da molécula bioativa ou proteínas de fusão de imunoglobulina IgG4 da invenção incluem técnicas recombinantes padronizadas ou técnicas sintéticas de proteína, por exemplo, por uso de um sintetizador automatizado de proteína. Por exemplo, uma molécula de ácido nucléico que codifica a molécula bioativa da invenção pode ser sintetizada por técnicas convencionais, incluindo sintetizadores automatizados de DNA. Alternativamente, a amplificação por PCR de fragmentos gênicos pode ser realizada usando iniciadores de ancoragem que dão origem a protuberâncias complementares entre dois fragmentos gênicos consecutivos que podem subsequentemente ser anelados e reamplificados para gerar uma sequência gênica quimérica. Além disso, uma sequência de ácidos nucléicos que codifica uma molécula pode ser clonada em um vetor de expressão que contém a região Fc ou domínio de

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74/103 ligação de FcRn desta, de tal forma que a molécula esteja ligada in frame à região Fc ou domínio de ligação de FcRn desta.

Métodos para fusão ou conjugação de polipeptídeos às regiões constantes de anticorpos são conhecidos na técnica

(veja, por	exemplo, US	5.	336.603,	US	5.622.929,	US
5.359.046,	US 5.349.053,	US	5.447.851,	US	5.723.125,	US
5.783.181,	US 5.908.626,	US	5.844.096,	US	5.112.946,	US

7.955.590).

A sequência de nucleotídeos que codifica a molécula bioativa pode ser obtida, por exemplo, de Genbank, e a sequência de nucleotídeos que codifica um domínio constante pode ser determinada por análise de sequência de mutantes produzidos com o uso das técnicas aqui descritas. A sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de fusão pode ser inserida em um vetor de expressão apropriado.

Polinucleotídeos

A presente invenção também fornece polinucleotídeos que compreendem uma sequência de nucleotídeos que codifica o anticorpo, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 modificada da invenção e sequências de polinucleotídeos que hibridizam sob rigor elevado para ela.

Ensaios para avaliação da meia-vida de anticorpos, construções de imunoglobulina e proteínas de fusão de imunoglobulina IgG4 da invenção

A meia-vida do anticorpo, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 da invenção pode ser medida por estudos farmacocinéticos (PK) de acordo com o método descrito por Kim e cols., Eur. J. of Immunol.

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24: 542 (1994). De acordo com esse método, imunoglobulina modificada radiomarcada é injetada por via intravenosa em camundongos e sua concentração plasmática é periodicamente medida em função do tempo, por exemplo, em 3 minutos até 72 horas após a injeção. A curva de depuração assim obtida deve ser bifásica, ou seja, uma fase alfa e uma beta fase. Para determinação da meia-vida in vivo da imunoglobulina modificada ou proteína de fusão da invenção, a taxa de depuração em fase beta é calculada e comparada com aquela do anticorpo, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de IgG4 do tipo selvagem ou não modificado.

Estudos PK tais como aqueles descritos acima podem ser realizados em um modelo em camundongo de FcRn humanizado em que o FcRn murídeo endógeno é knocked out e o FcRn humano knocked in como descrito em Petkova S.B. e cols., (2006)

International Immunology 18(12): 1.759-1.769.

Foi relatado recentemente que a meia-vida aumentada do anticorpo pode estar correlacionada com atividade in vivo aumentada (Zalevsky J. e cols., (2010) Nature Biotechnology

28(2): 157-159).

A fim de comparar a habilidade do anticorpo, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 modificada para se ligar a FcRn com aquela de IgG4 do tipo selvagem, o anticorpo IgG4 modificado, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 que compreende modificação da região de dobradiça de IgG4 e modificações da região constante da cadeia pesada e a IgG4 do tipo selvagem podem ser radiomarcados e reagidos com células que expressam FcRn in vitro. A radioatividade das frações ligadas à célula

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76/103 pode então ser contada e comparada. As células que expressam FcRn usadas nesse ensaio são preferivelmente linhagens de células endoteliais, incluindo células endoteliais capilares pulmonares de camundongo (B10,

D2.PCE)	derivadas de	pulmões de	camundongos B10.DBA/2	e
células	endoteliais	transformadas	de SV40 (SVEC) (Kim	e
cols.,	J. Immunol.,	40: 457-465	, (1994)) derivadas	de

camundongos C3H/HeJ. No entanto, outros tipos de células como, por exemplo, bordas em escova intestinais isoladas de camundongos lactentes com 10 a 14 dias de idade, que expressam um número suficiente de FcRn, também podem ser usadas. Alternativamente, células mamíferas que expressam FcRn recombinante de uma espécies de escolha também podem ser utilizadas. Após contagem da radioatividade da fração ligada de imunoglobulina modificada ou proteína de fusão ou aquela de IgG4 do tipo selvagem, as moléculas ligadas podem então ser extraídas com detergente e o percentual de liberação por número unitário de células pode ser calculado e comparado.

A afinidade do anticorpo modificado, construção de imunoglobulina ou fusão de imunoglobulina IgG4 por FcRn pode ser medida por medição por ressonância de plasmônio de superfície (SPR) usando, por exemplo, um BIAcore 2000 (BIAcore, Inc.) como descrito (Popov e cols., Mol. Immunol., 33: 493-502 (1996); Karlsson e cols., J. Immunol.

Methods, 145: 229-240 (1991), que são incorporados por referência). Nesses método, moléculas de FcRn são acopladas a um chip sensor BIAcore (por exemplo, chip Cm5 por Pharmacia) e a ligação da imunoglobulina modificada ou proteína de fusão ao FcRn imobilizado é medida em certa

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77/103 taxa de fluxo para obter sensorgramas usando o software de avaliação BIA 2.1, com base no qual as taxas on e off do anticorpo, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 modificada para FcRn podem ser calculadas.

As afinidades relativas do anticorpo, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 modificada e da IgG4 do tipo selvagem por FcRn também podem ser medidas por um ensaio de ligação por competição simples. Anticorpo modificado/construção de imunoglobulina/proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 ou IgG4 do tipo selvagem não marcado é adicionado em quantidades diferentes aos poços de uma placa de 96 poços na qual FcRn é imobilizado. Uma quantidade constante de IgG do tipo selvagem radiomarcada é então adicionada a cada poço. O percentual de radioatividade da fração ligada é tabulado contra a quantidade de imunoglobulina/proteína de fusão modificadas ou IgG4 do tipo selvagem não marcada e a afinidade relativa do anticorpo/construção de imunoglobulina/proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 modificados pode ser calculada a partir da inclinação da curva.

Além disso, as afinidades do anticorpo/construção de imunoglobulina/proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 modificados e da IgG4 do tipo selvagem por FcRn também podem ser medidas por um estudo de saturação e análise de Scatchard.

A transferência de anticorpo/construção de imunoglobulina/proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 modificados e da IgG4 do tipo selvagem para FcRn pode ser

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78/103 medida por um ensaio de transferência in vitro usando IgG4 radiomarcada e células que expressam FcRn e comparando-se a radioatividade de um lado da monocamada de células com aquela do outro lado. Alternativamente, essa transferência pode ser medida in vivo alimentando-se camundongos lactentes com 10 a 14 dias de idade com anticorpo/construção de imunoglobulina/proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 modificados radiomarcados e contando-se periodicamente a radioatividade em amostras de sangue, o que indica a transferência da IgG4 através do intestino para a circulação (ou qualquer outro tecido-alvo). Para testar a inibição dose-dependente da transferência de IgG através do intestino, uma mistura de IgG4 marcada e não marcada em certa proporção é dada aos camundongos, e a radioatividade do plasma pode ser medida periodicamente (Kim e cols., Eur. J. of Immunol. 24: 542 (1994)).

Composições farmacêuticas e modos de administração

Os anticorpos, construções de imunoglobulina ou proteínas de fusão de imunoglobulina IgG4 da presente invenção são úteis para administração parenteral, tópica, oral ou local, administração em aerossol ou administração transdérmica, para tratamento profilático ou terapêutico. As composições farmacêuticas podem ser administradas em diversas formas de dosagem unitária, dependendo do método de administração. Por exemplo, formas de dosagem unitária adequadas à administração oral incluem pó, comprimidos, pílulas, cápsulas e losangos. Reconhece-se que as composições farmacêuticas dessa invenção, quando administradas oralmente, devem ser protegidas da digestão. Isso é tipicamente obtido formando-se um complexo da

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79/103 proteína com uma composição para torna-la resistente à hidrólise ácida e enzimática ou embalando-se da proteína em um veículo adequadamente resistente como, por exemplo, um lipossomo. Meios para a proteção de proteínas da digestão são conhecidos na técnica.

As composições farmacêuticas dessa invenção são particularmente úteis para administração parenteral, por exemplo, administração intravenosa ou administração em uma cavidade do corpo ou lúmen de um órgão ou articulação. As composições for administração comumente compreenderão uma solução do anticorpo, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 da presente invenção dissolvido em um veículo farmaceuticamente aceitável, preferivelmente um veículo aquoso. Diversos veículos aquosos podem ser usados, por exemplo, solução salina tamponada e semelhantes. Essas soluções são estéreis e geralmente livres de matéria indesejada. Essas composições podem ser esterilizadas por técnicas de esterilização convencionais bem conhecidas. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis, como necessário para se aproximar das condições fisiológicas como, por exemplo, agentes de ajuste do pH e de tamponamento, agentes de ajuste da toxicidade e semelhantes, por exemplo, acetato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, lactato de sódio e semelhantes. A concentração de anticorpo, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 da presente invenção nessas formulações pode variar amplamente, e será selecionada primariamente com base nos volumes de fluido, viscosidades, peso corporal

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80/103 e semelhantes, de acordo com o modo de administração particular selecionado e com as necessidades do indivíduo.

Por exemplo, para administração parenteral, os anticorpos em questão podem ser formulados em uma forma injetável de dosagem unitária (solução, suspensão, emulsão) em associação com um veículo parenteral farmaceuticamente aceitável. Exemplos desses veículos são água, solução salina, solução de Ringer, solução de dextrose e albumina sérica humana 5%. Veículos não aquosos como, por exemplo, óleos mistos e oleato de etila, também podem ser usados. Lipossomos também podem ser usados como veículos. Os veículos podem conter quantidades menores de aditivos que aumentam a isotonicidade e a estabilidade química, por exemplo, tampões e conservantes.

Os anticorpos, construções de imunoglobulina ou proteínas de fusão de imunoglobulina IgG4 da presente invenção podem ser formulados para administração parenteral, por exemplo, formulados para injeção por meio da via intravenosa, intramuscular, subcutânea, transdérmica ou outras vias desse tipo, incluindo administração peristáltica e instilação direta em um tumor ou local de doença (administração intracavidade). Tipicamente, essas composições podem ser preparadas como injetáveis, como soluções ou suspensões líquidas; formas sólidas adequadas à utilização para preparar soluções ou suspensões após a adição de um líquido antes da injeção também podem ser preparadas; e as preparações também podem ser emulsificadas.

As formas farmacêuticas adequadas ao uso injetável incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis;

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81/103 formulações que incluem óleo de gergelim, óleo de amendoim ou propileno glicol aquoso; e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Em todos os casos, a forma deve ser estéril e fluida a um grau tal que exista possibilidade de introdução em seringas. Ela deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento e deve ser preservada contra a ação contaminante de microorganismos, por exemplo, bactérias e fungos.

As composições podem ser formuladas em uma composição aquosa estéril em uma forma neutra ou de sal. Soluções dos anticorpos, construções de imunoglobulina ou proteínas de fusão de imunoglobulina IgG4 da presente invenção como base livre ou sais farmacologicamente aceitáveis podem ser preparadas em água adequadamente misturadas com um tensoativo, por exemplo, hidroxipropilcelulose. Sais farmaceuticamente aceitáveis, incluem os sais de adição ácida (formados com os grupos amino livres da proteína), e aqueles que são formados com ácidos inorgânicos como, por exemplo, ácido clorídrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos como, por exemplo, ácido acético, trifluoracético, oxálico, tartárico, mandélico, e semelhantes. Sais formados com os grupo carboxil livres também podem ser derivados de bases inorgânicas como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amônio, cálcio ou férricos, e bases orgânicas como, por exemplo, isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína e semelhantes.

Veículos adequados incluem solventes e meios de dispersão que contêm, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietileno

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82/103 glicol líquido, e semelhantes), misturas adequadas destes, e óleos vegetais. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, por exemplo, lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário, no caso de dispersão, e/ou pelo uso de tensoativos.

Sob condições comuns de armazenamento e uso, todas essas preparações podem conter um conservante para evitar o crescimento de microorganismos. A prevenção da ação de microorganismos pode ser efetuada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, e semelhantes. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser criada pelo uso nas composições de agentes de retardo da absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

Antes ou mediante formulação, os anticorpos, construções de imunoglobulina ou proteínas de fusão de imunoglobulina IgG4 da presente invenção podem ser intensamente dialisados para remover moléculas de pequeno peso molecular indesejadas, e/ou liofilizados para uma formulação mais fácil em um veículo desejado, quando adequado. Soluções injetáveis estéreis são preparadas por incorporação dos ingredientes ativos na quantidade desejada no solvente apropriado com vários dos outros ingredientes enumerados acima, como desejado, seguido por esterilização filtrada. Geralmente, dispersões são preparadas por incorporação dos vários ingredientes ativos esterilizados em um veículo estéril que contém o meio de dispersão básico

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83/103 e os outros ingredientes necessários entre aqueles enumerados acima.

No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são técnicas secagem a vácuo e de congelamento-secagem que geram um pó dos ingredientes ativos, mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma solução previamente estéril-filtrada destes.

Composições farmacêuticas adequadas de acordo com a invenção geralmente incluirão uma quantidade do anticorpo, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 da presente invenção misturada com um diluente ou excipiente farmacêutico aceitável, por exemplo, uma solução aquosa estéril, para gerar uma gama de concentrações finais, dependendo do uso desejado. As metodologias de preparação são geralmente conhecidas na técnica, como exemplificado por “Remington's Pharmaceutical Sciences”, 16^a Edição Mack Publishing Company, 1980, aqui

incorporado	por referência.	Deve ser	observado que	a
contaminação	por endotoxina deve ser mant	ida minimamente	em
um nível seguro, por exemplo,	menos do	que 0,5 ng/mg	de
proteína.
Após	formulação, o	anticorpo,	construção	de

imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 da presente invenção será administrado de uma forma compatível com a formulação de dosagem e em uma quantidade tal que seja terapeuticamente/profilaticamente eficaz. As formulações são facilmente administradas em diversas formas de dosagem como, por exemplo, o tipo de soluções injetáveis descrito acima, mas outras formas farmaceuticamente

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84/103 aceitáveis também são contempladas, por exemplo, comprimidos, pílulas, cápsulas ou outros sólidos para administração oral, supositórios, pessários, soluções ou sprays nasais, aerossóis, inalantes, formas lipossômicas e semelhantes. Cápsulas ou composições farmacêuticas de “liberação lenta” também podem ser usadas. Formulações de liberação lenta são geralmente projetadas para gerar um nível de fármaco constante ao longo de um período prolongado e podem ser usadas para liberar anticorpos, construções de imunoglobulina ou proteínas de fusão de imunoglobulina IgG4 da presente invenção.

Em algumas modalidades, lipossomos e/ou nanopartículas também podem ser empregados com os ingredientes ativos. A formação e uso de lipossomos são geralmente conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Lipossomos podem ser formados por fosfolipídeos que são dispersos em um meio aquoso e formam espontaneamente vesículas de bicamadas concêntricas multilamelares (também denominadas vesículas multilamelares (MLVs). MLVs podem geralmente ter diâmetros a partir de 25 nm até 4 pm. A sonificação de MLVs resulta na formação de vesículas unilamelares pequenas (SUVs) com diâmetros na faixa de 200 a 500 angstrom, que contêm uma solução aquosa no núcleo. Fosfolipídeos podem formar diversas estruturas além de lipossomos quando dispersos em água, dependendo da proporção molar de lipídeo para água. Em proporções baixas o lipossomo é a estrutura preferida. As características físicas dos lipossomos dependem do pH, força iônica e da presença de cátions divalentes. Lipossomos podem exibir baixa permeabilidade às substâncias iônicas e polares, mas, em temperaturas elevadas, passam

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85/103 por uma transição de fase que altera acentuadamente sua permeabilidade. A transição de fase envolve uma mudança de uma estrutura ordenada, intensamente compactada, conhecida como o estado de gel, para uma estrutura menos ordenada, pouco compactada, conhecida como o estado de fluido. Isso ocorre em uma temperatura de transição de fase característica e resulta em um aumento na permeabilidade aos íons, açúcares e fármacos.

Nanocápsulas podem geralmente capturar compostos de uma forma estável e reprodutível. Para evitar efeitos colaterais em função da sobrecarga polimérica intracelular, essas partículas ultrafinas (com dimensão em torno de 0,1 pm) devem ser projetadas com o uso de polímeros capazes de serem degradados in vivo. Nanopartículas biodegradáveis de polialquil-cianoacrilato que obedecem a essas exigências são contempladas para uso na presente invenção, e essas partículas podem ser feitas facilmente.

A Publicação Internacional N° WO/2002/080967 descreve composições e métodos para administração de composições aerossolizadas que compreendem anticorpos para o tratamento, por exemplo, de asma, que também são adequadas para administração de um anticorpo da presente invenção.

A dosagem do anticorpo, construção de imunoglobulina ou proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 da invenção pode ser determinada por aqueles habilitados na técnica. A dosagem, no entanto, dependerá da extensão à qual a meiavida in vivo da imunoglobulina modificada ou proteína de fusão foi aumentada. Além disso, a dosagem e frequência de administração de anticorpos ou proteínas de fusão de acordo com a invenção também podem ser reduzidas por aumento da

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86/103 captação e penetração no tecido (por exemplo, nos pulmões) por modificações como, por exemplo, lipidação. O tratamento com os anticorpos, construções de imunoglobulina ou proteínas de fusão de imunoglobulina IgG4 da invenção incluem tratamento único ou uma série de tratamentos. A composição farmacêutica da invenção pode ser administrada uma vez por semana, duas vezes por semana, uma vez a cada duas semana, uma vez por mês ou uma vez a cada seis semanas.

Uso de anticorpos modificados, construções de imunoglobulina ou proteínas de fusão de imunoglobulina IgG4 da invenção

Os anticorpos modificados, construções de imunoglobulina e proteínas de fusão de imunoglobulina IgG4 na presente invenção podem ser usados para várias finalidades não terapêuticas. Eles podem ser usados como um agente de purificação por afinidade. Eles também podem ser úteis em ensaios diagnósticos, por exemplo, na detecção da expressão de um antígeno de interesse em células específicas, tecidos ou soro. Para aplicações diagnósticas, os anticorpos tipicamente serão marcados com uma porção detectável, incluindo radioisótopos, marcadores fluorescentes e vários marcadores de substrato de enzima. Os anticorpos também podem ser empregados em qualquer método de ensaio conhecido como, por exemplo, ensaios de ligação competitiva, ensaios em sanduíche diretos e indiretos e ensaios de imunoprecipitação. Os anticorpos, construções de imunoglobulina e proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 também podem ser usados para ensaios diagnósticos in vivo. Geralmente, os anticorpos,

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87/103 construções de imunoglobulina e proteína de fusão de imunoglobulina IgG4 são marcados com um radionucleotídeo, de modo que o antígeno ou célula que o expressa possa ser localizado com o uso de imunocintigrafia.

Uso de anticorpos anti-IL-5 em terapia

Uma característica geral na patogênese da asma e de outras doenças alérgicas crônicas mostrou ser números elevados de eosinófilos, especialmente na mucosa brônquica dos pulmões. Após ativação, os eosinófilos secretam diversos mediadores que estão ativamente envolvidos na resposta inflamatória da via aérea. Na ativação de eosinófilos, a interleucina 5 (IL-5) tem um papel importante.

IL-5 é uma citocina encontrada em muitas espécies mamíferas e, entre outros, tanto o gene humano quanto o murídeo para IL-5 foram clonados. O gene humano consiste em quatro éxons com três íntrons posicionados no cromossomo 5 e codifica uma sequência-líder do terminal N de 134 aminoácido. A IL-5 ativa é um homodímero e a estrutura tridimensional da hIL-5 recombinante foi determinada por cristalografia de raios X. O receptor para IL-5 está presente primariamente em eosinófilos e é composto por uma cadeia alfa e uma cadeia beta. A cadeia alfa do receptor é específico para IL-5 e a cadeia beta, que assegura ligação com afinidade elevada e transdução de sinal, é compartilhada com os receptores de heterodímeros para IL-3 e GM-CSF.

IL-5 é secretada principalmente por células Th2 completamente diferenciadas, mastócitos e eosinófilos. Foi demonstrado que atua em eosinófilos, basófilos, linfócitos

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T citotóxicos e em células B murídeas.

As ações de IL-5 sobre eosinófilos incluem quimiotaxia, adesão aumentada às células endoteliais, ativação da diferenciação terminal das células. Além disso, foi demonstrado que IL-5 evita que eosinófilos maduros sofram apoptose. Esses achados contribuíram para o conceito de que IL-5 é a citocina mais importante para diferenciação de eosinófilos.

Embora o tratamento atual da asma envolva corticosteróides, prevê-se que o tratamento futuro da asma, bem como de outras condições mediadas por eosinófilos, incluirão anticorpos anti-IL-5. A secreção inadequada de citocinas e de outras moléculas efetoras por eosinófilos causa danos e disfunção ao tecido circundante. O dano ao órgão final que resulta da infiltração e ativação de eosinófilos representa um componente patogênico comum de vários estados de doença, incluindo doenças atópicas e síndromes hipereosinofílicas (HES). Há nitidamente uma necessidade de terapias que reduzam os números de eosinófilo em humanos.

Anticorpos, construções de imunoglobulina e proteínas de fusão de imunoglobulina IgG4 da invenção no tratamento ou prevenção de distúrbios

Os anticorpos modificados, construções de imunoglobulina e proteínas de fusão de imunoglobulina IgG4 possuem várias aplicações terapêuticas. Os anticorpos modificados, construções de imunoglobulina e proteínas de fusão de imunoglobulina IgG4 podem ser usados para tratar um indivíduo que sofre de, ou predisposto a, uma doença ou distúrbio, que poderia se beneficiar da administração dos

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89/103 anticorpos modificados. As condições que podem ser tratadas com os anticorpos incluem câncer; condições inflamatórias como, por exemplo, asma; doenças autoimunes; e infecções virais etc.

Os cânceres que podem ser tratados pelos anticorpos, construções de imunoglobulina e proteínas de fusão de imunoglobulina IgG4 aqui descritos incluem, sem limitação, câncer de mama, câncer de célula escamosa, câncer de pulmão de pequena célula, câncer de pulmão de célula não pequena, câncer gastrintestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer de bexiga, hepatoma, câncer do cólon, câncer cólon-retal, carcinoma endometrial, carcinoma da glândula salivar, câncer renal, câncer do fígado, câncer de próstata, câncer da vulva, câncer da tireóide, carcinoma hepático, e vários tipos de câncer da cabeça e pescoço.

As doenças autoimunes incluem, sem limitação, doença de Addison, doenças autoimunes do ouvido, doenças autoimunes do olho como, por exemplo, uveíte, hepatite autoimune, doença de Crohn, diabetes (Tipo I), epididimite, glomerulonefrite, doença de Graves, síndrome de GuillainBarre, doença de Hashimoto, anemia hemolítica, lúpus eritematoso sistêmico, esclerose múltipla, miastenia grave, pênfigo vulgar, psoríase, artrite reumatóide, sarcoidose, esclerodermia, síndrome de Sjogren, espondiloartropatias, tireoidite, colite ulcerativa e vasculite.

A presente invenção também inclui métodos para o tratamento de doenças caracterizadas por eosinofilia. A asma é um alvo-chave para o método da invenção, mas também outras condições crônicas como, por exemplo, alergia,

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90/103 rinite alérgica e esofagite eosinofílica, são alvos adequados para tratamento. Dessa forma, uma modalidade do método da invenção compreende o tratamento e/ou prevenção e/ou melhora de asma ou de outras condições alérgicas crônicas caracterizadas por eosinofilia, que compreende a administração de um anticorpo anti-IL-5 que infra-regula a atividade de IL-5 a tal ponto que o número de células de eosinófilos seja significativamente reduzido.

No presente contexto, uma redução significante nos números de células de eosinófilos é de pelo menos 20%, comparado com o número de eosinófilos do tratamento da técnica estabelecida, mas percentagens maiores são contempladas, por exemplo, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% e até mesmo pelo menos 90%. A redução pode ser sistêmica ou, mais frequentemente, localmente, por exemplo, nos pulmões.

Os números de eosinófilos são determinados por métodos conhecidos na técnica, tipicamente com o uso de microscopia de uma amostra de fluido de lavagem broncoalveolar (BAL) adequada e contagem do número de células de eosinófilos manualmente sob microscópio. Alternativamente, os números de eosinófilo podem ser contados com o uso de citometria de fluxo capaz de distinguir eosinófilos.

Os anticorpos anti-CD33 modificados da invenção são particularmente úteis no tratamento de câncer, mais particularmente leucemia mielóide. A presente invenção também engloba um anti-CD33 que foi modificado de acordo com a invenção para aumentar sua meia-vida, conjugado a calicheamicina (Hamann PR e cols., (2002) Bioconj. Chem.

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13(1): 40-6). O conjugado de anti-CD33-calicheamicina pode ser usado para tratar leucemia mielóide aguda.

Utilidade de anticorpos não imunoestimulantes

Os anticorpos, construções de imunoglobulina e proteínas de fusão de imunoglobulina IgG4 da invenção compreendem uma região Fc de IgG4 humana modificada ou domínio de ligação de FcRn desta e uma sequência da região de dobradiça central de IgG4 humana modificada. Sabe-se na técnica que o isótipo do domínio constante do anticorpo influencia as funções efetoras do anticorpo. Das várias classes de imunoglobulinas humanas, somente a IgG1, IgG2, IgG3 e IgM humanas sabidamente ativam complemento; e IgG1 e IgG3 humanas medeiam a citotoxicidade celular anticorpodependente (ADCC) mais eficazmente do que IgG2 e IgG4. Como as imunoglobulinas e proteínas de fusão da presente invenção compreendem sequências da região constante de IgG4, elas são incapazes de ativar a cascata do complemento ou a atividade de ADCC e, dessa forma, qualquer ativação de células NK ou células T indesejada. Consequentemente, elas são particularmente adequadas às condições alérgicas como, por exemplo, asma, nas quais não é desejável provocar a ativação de células que só podem exacerbar a condição. Anticorpos IgG4 diferem funcionalmente de outras subclasses de IgG em sua atividade antiinflamatória, o que inclui uma baixa habilidade para induzir complemento e ativação celular por causa da baixa afinidade por C1q (o fragmento q do primeiro componente do complemento) e receptores Fc gama. Consequentemente, IgG4 se tornou a subclasse preferida para imunoterapia, em que o recrutamento da função efetora do hospedeiro é indesejável.

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Anticorpos anti-IL-5

A presente invenção se estende aos anticorpos, construções de imunoglobulina ou proteínas de fusão de imunoglobulina IgG4 que compreendem sequências da região variável de cadeias leves e pesadas de anticorpos contra IL-5 conhecidos, unidas a uma região Fc de IgG4 humana modificada e região de dobradiça de IgG4 humana modificada de acordo com a presente invenção. Vários exemplos de anticorpos anti-IL-5 são descritos em US 5.683.892, US 5.693.323, US 5.783.184, US 5.851.525, US 6.129.913, US 5.096.071, US 6.056.957 e US 6.451.982. Além disso, anticorpos anti-IL-5 humanizados CTIL-5-10gH/-gL6 (como descritos em US RE39,548E), aqui denominados 39D10 ou hu39D10 humanizado) e mepolizumab são particularmente adequados para modificação de acordo com a presente invenção.

Será observado por aqueles habilitados na técnica que diversas variações e/ou modificações podem ser feitas à invenção, como mostrado nas modalidades específicas, sem se afastar do escopo da invenção amplamente descrita. As presentes modalidades, portanto, devem ser consideradas em todos os aspectos como ilustrativas, e não restritivas.

Efeito sinérgico de substituições

Os presentes inventores verificaram que as substituições YTE (ou seja, mutações M252Y, S254T e T256E) em uma imunoglobulina ou região Fc de anticorpo IgG4, quando combinadas com a mutação S228P da região de dobradiça em um anticorpo IgG4, aumentavam sinergicamente a meia-vida do anticorpo IgG4 modificado in vivo. Isso foi demonstrado para dois anticorpos diferentes que se ligam a

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93/103 dois antígenos diferentes, não relacionados, como descrito nos exemplos.

Em particular, os inventores verificaram que, embora as substituições YTE aumentassem a afinidade dos anticorpos modificados por FcRn humano, a inclusão adicional da modificação S228P à região de dobradiça não produzia efeitos adicionais sobre a afinidade do anticorpo pelo FcRn. Isso não é inteiramente inesperado, considerando que essa região não interage com o FcRn. Portanto, seria previsto que não haveria sinergia com relação à substituição S228P e substituições YTE. Como qualquer modificação em um fármaco à base de proteína humana (incluindo uma proteína que compreende uma região constante de anticorpo humano) aumenta o risco de indução de uma resposta imune antifármaco em um paciente, a prática geral consiste em limitar o número dessas mutações para limitar o risco presumivelmente aditivamente aumentado de cada uma dessas mutações com relação à indução dessas respostas imunes contra o fármaco. No entanto, em função dos resultados surpreendentes aqui descritos de que a combinação das duas classes de modificações (modificações de Fc e modificações da dobradiça) resulta em um efeito supra-aditivo sobre o aumento da meia-vida circulante de anticorpos IgG4, os benefícios da combinação dessas duas classes de mutações pode se sobrepor às desvantagens teoréticas em relação ao aumento da incidência de promoção de reações imunes antifármaco. As vantagens do aumento da meia-vida de uma molécula serão imediatamente evidentes para aqueles habilitados na técnica. Esses benefícios incluem redução da dosagem e/ou da frequência de

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94/103 administração, o que reduz o risco de eventos adversos em um indivíduo e reduz custos. Consequentemente, essas imunoglobulinas com meia-vida aumentada são de importância farmacêutica significativa.

Todas as referências ou documentos aqui citados são considerados como incorporados por referência em sua totalidade.

Ao longo desse relatório descritivo, a palavra compreendem, ou variações como, por exemplo, compreende ou que compreende, incluirá implicitamente a inclusão de um elemento, número inteiro ou etapa estabelecida, ou grupo de elementos, números inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro elemento, número inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, números inteiros ou etapas.

Qualquer discussão de documentos, atos, materiais, dispositivos, artigos ou semelhantes que foi incluída no presente relatório descritivo não deve ser considerada como uma admissão de que qualquer uma ou todas essas matérias forme parte da base da técnica estabelecida ou seja conhecimento geral comum no campo relevante à presente invenção como se existisse antes da data de prioridade de cada reivindicação nesse pedido.

EXEMPLO 1

Materiais e métodos

Geração de hu39D10 e suas variantes

Os genes que codificam a região constante da cadeia pesada de IgG4 humana foram isolados da biblioteca de cDNA Quickclone (Clontech, Mountain View, CA) e clonados no vetor de expressão pTT5 (Durocher e cols., Nucleic Acids Research volume 30, N° 2, página e9). Para introduzir as

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95/103 mutações descritas acima no domínio Fc, um conjunto de dois iniciadores de sequência complementar com uma ou mais mutações foi sintetizado e usado para mutagênese sítiodirigida à base de PCR. O vetor de expressão de kappa de Ig foi construído por meio similar. Os fragmentos de DNA que codificam as regiões variáveis de hu39D10 (Figura 1) foram designados de forma reversa a partir das sequências de proteína publicadas (US RE39,548E), usando 18 (cadeia pesada) ou 16 (cadeia leve) oligonucleotídeos por montagem de gene à base de PCR. Os fragmentos foram clonados nos vetores de expressão com o uso de sítios de restrição integrados nos vetores para clonagem. A sequência de aminoácidos final para as cadeias pesadas e leves de hu39D10 é mostrada na Figura 1. A figura também mostra a sequência de hu39D10 com as 4 substituições de aminoácidos (YTE + S228P, ID. DE SEQ. N°: 6).

Expressão e purificação de hu39D10 e variantes

Vetores de expressão pTT5 para hu39D10 e suas variantes foram transfectados em células HEK293 6E de acordo com Durocher e cols., Nucleic Acids Research volume 30, N° 2, página e9. Após 6 dias de transfecção, o meio de cultura foi isolado e depois submetido à purificação por afinidade usando glóbulos de Proteína G-agarose (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ).

Geração de construções de expressão de complexo de ΕοΕη/β2 microglobulina

Os fragmentos de DNA que codificam FcRn humano e microglobulina β2 foram isolados de cDNA sintetizado com RNA humano Universal (BioChain, Hayward, CA), um pool de RNA humano total, usando um kit de Síntese de Primeira-Fita

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Superscript III (Invitrogen, Carlsbad, CA). O domínio extracelular de FcRn (aminoácidos 24-290) e a parte madura de microglobulina β2 (aminoácidos 21-1 19) foram clonados no vetor de expressão pTT5 individualmente. As sequências do domínio extracelular de FcRn humano e de microglobulina

β2 são mostradas	na Figura 2 e	na Figura	3,
respectivamente.
Expressão e	purificação de	complexo	de
FcRn/microglobulina	β2
Os vetores de	expressão pTT5 para	produção de	FcRn

humano e microglobulina β2 foram co-transfectados em células HEK293 6E. Seis dias após a transfecção, o meio de cultura foi isolado e depois submetido à purificação por afinidade usando glóbulos de IgG-Sefarose (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ).

ELISA para medir a afinidade de hu39D10 e variantes ao complexo de FcRn/microglobulina β2

Placas de 96 poços Maxisorp (Thermo Fisher Scientific,

Rochester, NY) foram revestidas com 5 pg/ml de anticorpo monoclonal anti-microglobulina β2. Os poços foram então lavados com PBS e tratados com solução de bloqueio Superblock (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). A seguir, o complexo de FcRn/microglobulina β2 foi diluído até 5 pg/ml em SPBS6T (50 mM de tampão de fosfato de sódio pH 6,0, 150 mM de NaCl, Tween-20 0,05%) e adicionado para permitir a captura pelo anticorpo anti-microglobulina β2 revestido por 60 min em temperatura ambiente. Os poços foram então lavados por SPBS6T e depois expostos ao hu39D10 ou suas variantes em SPBS6T e incubados por 60 min em temperatura ambiente. O complexo de hu39D10/FcRn formado

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97/103 pela incubação foi sondado com um fragmento F(ab')2 de um anti-kappa humano conjugado à HRP (Sourthern Biotechnology, Birmingham, AL; diluição de 1/5.000 em SPBS6T) por 30 min em temperatura ambiente. Após lavagem com SPBS6T, 100 μΐ de TMB (Sigma) foi carregado em cada poço para detecção de sinal. A seguir, 50 μl de ácido sulfúrico 2 N foram adicionados para interromper o desenvolvimento de cor, e então A450 foi medida em uma leitora de placas de Vmax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). A afinidade das variantes de IgG ao FcRn foi calculada e tabulada usando o software Prism por GraphPad Software (La Jolla, CA).

Resultados e conclusões

Como mostrado na Figura 4, a afinidade de hu39D10 por FcRn humano (EC50 = 3,8 nM) foi aumentada por 4,7 vezes fazendo-se as mutações YTE (para EC50 = 0,81 nM). A adição posterior da mutação S228P não teve efeito sobre a afinidade por FcRn (EC50 = 0,81 nM, a mesma que por hu39D10 com as mutações YTE). Esse resultado não foi inesperado, na medida em que a mutação S228P está bem distante da região do Fc que interage com FcRn. Com base nesse resultado, não seria esperada nenhuma sinergia entre as mutações YTE e S228P sobre a meia-vida circulante.

EXEMPLO 2

Estudo PK

O estudo PK em camundongo foi realizado pelo Jackson Laboratory - West (Sacramento, CA) com camundongos que possuem seu FcRn endógeno knocked out, mas que possuem o FcRn humano knocked in (o modelo em camundongo hemizigoto 4919 Tg276 descrito em Petkova e cols., (2006)

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1.769). No dia 0, sete camundongos em cada grupo receberam hu39D10 ou suas variantes por via intraperitoneal (IP) (200 pg). Cada camundongo foi sangrado do seio retro-orbital em 2, 12, 24 horas e 2, 4, 7, 10, 14, 18, 21 e 28 dias para preparar amostras de plasma.

ELISA para medir hu39D10 e variantes em amostras de plasma

Placas de 96 poços Maxisorp (Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY) foram revestidas com IL-5 recombinante (O antígeno de hu39D10; R&D Systems, Minneapolis, MN) a 2 pg/ml em PBS de um dia para o outro em um refrigerador. Os poços foram então lavados com PBS e bloqueados com 200 pl de solução de bloqueio Superblock (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) por 30 min para minimizar a ligação não específica. As amostras de plasma foram então diluídas até 1/50 em PBS-Tween 20 (PBST) e carregadas nos poços revestidos com IL-5. Além disso, um padrão de hu39D10 recombinante foi diluído em PBST com soro de camundongo 2% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) e carregado em poços revestidos para fazer uma curva-padrão para a quantificação. Após uma incubação de 60 min em temperatura ambiente, os poços foram lavados com PBST, e depois um anti-Fc humano conjugado à HRP (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, 1 /1000 diluição em PBST) foi adicionado e incubado por min em temperatura ambiente. Os poços foram então lavados com PBST. Para detecção de sinal, 100 pl de TMB (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) foram carregados em cada poço. A seguir, 50 pl de ácido sulfúrico 2 N foram adicionados para interromper o desenvolvimento de cor, e então A450 foi medida em uma leitora de placas de Vmax

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99/103 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). A concentração de hu39D10 e das variantes no plasma foi calculada usando o software Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA) e usando a curva-padrão de hu39D10. Para cada camundongo, a concentração relativa de hu39D10 comparada com a concentração medida no 1° Dia (definida como 100%) foi tabulada em função do tempo. A meia-vida de hu39D10 ou de suas variantes em animais individuais também foi calculada usando o software, presumindo uma queda exponencial e uma assíntota de zero. Para o cálculo da meia-vida da variante com mutações combinadas (S228P + YTE), dois resultados fora da curva (ou seja, os resultados de dois dos camundongos), que aumentam a meia-vida calculada, foram excluídos para o cálculo da meia-vida média.

Resultados e conclusões

Como mostrado na Figura 5, a meia-vida sérica de hu39D10 com a mutação S228P (t1/2 = 6,5 dias) foi aumentada por 42%, comparada com hu39D10 com Fc não modificado (t1/2 = 4,6 dias). As mutações YTE também mostram aumento significante da meia-vida sérica por 75% (t1/2 = 8,0 dias). Surpreendentemente, quando combinadas, as mutações S228P e YTE alongaram ainda mais a meia-vida circulante sinergicamente (até t1/2 = 13,3 dias). A adição da mutação S228P às mutações YTE aumentou a meia-vida circulante por 66% (ou por 5,3 dias) em relação à YTE isoladamente, enquanto o aumento da meia-vida de S228P, no contexto de IgG4 não mutada com YTE, resultou em um aumento de somente 42% (1,9 dia). Sem a sinergia entre as mutações S228P e YTE, a mutação S228P causaria o mesmo aumento ou um aumento proporcionalmente reduzido na meia-vida no contexto da

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100/103 hu39D10 mutada com YTE, como ocorre no contexto do hu39D10 não mutado com YTE, gerando uma meia-vida de no máximo 11 dias para hu39D10 com ambas as mutações, YTE e S228P.

Em função dessa sinergia, foi concluído que é benéfico combinar as mutações YTE e S228P na mesma molécula a fim de obter uma meia-vida muito longa para um fármaco à base de anticorpo (ou de proteína de fusão Fc), apesar da probabilidade aumentada de promoção de respostas imunes antifármaco em consequência de um número aumentado de mutações na região constante de Fc.

EXEMPLO 3

Materiais e métodos

Geração de huMab195 e suas variantes de Fc

Os fragmentos de DNA que codificam as regiões variáveis do anticorpo huMab195 de ligação de CD33 (Figura 6), foram criadas de forma reversa a partir das sequências de proteína publicadas (US 5.693.761), usando 18 (cadeia pesada) e 18 (cadeia leve) oligonucleotídeos por montagem de gene à base de PCR. Os fragmentos da região variável da cadeia pesada e leve foram então clonados nos vetores de expressão de IgG4 humana (nativa e variante) descritos na seção anterior para criar uma versão IgG4/kappa de huMab195, com sequência do domínio constante de IgG4 nativa, ou versões contendo a mutação S228P, as mutações YTE, ou tanto as mutações S228P quanto YTE. A sequência da cadeia pesada de IgG4 huMab195 com ambas as mutações S228P e YTE é mostrada na Figura 6, bem como a sequência da cadeia leve.

Expressão e purificação de huMab195 e variantes

Os vetores de expressão pTT5 para huMab195 e suas

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101/103 variantes foram transfectados em células HEK293 6E a fim de produzir as várias proteínas de IgG4, como descrito no Exemplo 2. Essas proteínas foram então purificadas usando glóbulos de Proteína G-agarose como no Exemplo 2.

Geração de domínio extracelular de CD33 humano

Um fragmento de DNA que codifica o domínio extracelular de CD33 humano (hCD33 ECD, aminoácidos 1-258, incluindo sequência-líder) foi amplificado a partir da biblioteca de cDNA humano Quickclone (Clontech, Mountain View, CA). DNA que codifica um tag (His)e, seguido por um sítio de clivagem de trombina (Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser), foi adicionado à extremidade 3' do fragmento hCD33 ECD por PCR usando um iniciador que carrega essas sequências. O fragmento de DNA que codifica hCD33 ECD com tag his6 foi então ligado a um fragmento de DNA que codifica Fc de IgG1 humana por PCR (hCD33 ECD-Fc) e clonado no vetor de expressão pTT5. A sequência de proteína do hCD33 ECD-Fc é mostrada na Figura 7.

Expressão e purificação do domínio extracelular de CD33 humano

O vetor de expressão pTT5 que codifica a proteína de fusão de hCD33 ECD-Fc foi transfectado em células HEK293 6E, e depois o meio de cultura foi isolado e submetido à purificação por afinidade usando glóbulos de Proteína Gagarose (GE Healthcare Sciences, Piscataway, NY). Para isolar hCD33 ECD, a proteína de fusão purificada foi tratada com trombina (EMD Chemicals, San Diego, CA) para remover a porção de Fc. A seguir, a hCD33 ECD foi isolada por cromatografia por afinidade em NiNTA-agarose (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha).

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Estudo PK

O estudo PK em camundongo foi realizado pelo Jackson Laboratory - West (Sacramento, CA) com camundongos que possuem seu FcRn endógeno knocked out, mas que possuem o FcRn humano knocked in (o modelo em camundongo hemizigoto 4919 Tg276 descrito em Petkova e cols., International

Immunology vol. 18, N° 12, páginas 1.759-1.769). No dia 0, sete camundongos em cada grupo receberam huMab195 ou suas variantes por via intraperitoneal (IP) (200 pg). Em 2, 12 e horas e 2, 4, 7, 10, 14 dias após a administração, cada camundongo foi sangrado para preparar amostras de plasma.

ELISA para medir huMAb195 e variantes em amostras de plasma

Placas de 96 poços Maxisorp (Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY) foram revestidas com hCD33 ECD recombinante a 2 pg/ml em solução de PBS. Os poços foram então lavados com PBS e bloqueados com solução de bloqueio Superblock (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). As amostras de plasma foram diluídas até 1/50 em PBS-Tween 20 (PBST), e depois carregadas em poços revestidos com hCD33 ECD. Em paralelo, concentrações conhecidas de padrões de huMab195 recombinante foram diluídos em PBST com soro de camundongo 2% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) e carregadas em poços revestidos par fazer uma curva-padrão para a quantificação. Após uma incubação de 60 min em temperatura ambiente, os poços foram lavados com PBST, e depois um fragmento antikappa humano conjugado à HRP (Invitrogen, Carlsbad, CA; 1/2000 diluição em PBST) foi adicionado e incubado por 30 min. Após lavagem dos poços, os sinais foram desenvolvidos, medidos e analisados como descrito no Exemplo 2.

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Resultados e conclusões

Como mostrado na Figura 8, a meia-vida sérica do huMab195 com a mutação S228P (t1/2 = 2,0 dias) foi aumentada por 26%, comparada com a de huMAb195 com Fc não modificado (t1/2 = 1,6 dia). As mutações YTE também mostram aumento significante da meia-vida sérica POR 110% (t1/2 = 3,4 dias).

Quando as mutações S228P e YTE foram combinadas, a meiavida foi aumentada ainda mais para 14 dias, um aumento de 312% comparado com a da variante de YTE. Sem a sinergia, o aumento máximo pela adição da mutação S228P ao huMab195 contendo YTE seria de 26%, resultando em uma meia-vida de 4,3 dias, que é significativamente mais curta do que os 14 dias observados. Esse segundo exemplo confirma a observação de que as modificações S228P e YTE aos anticorpos IgG4 humanos são sinérgicas com relação ao seu efeito sobre o aumento das meias-vidas circulantes de anticorpos IgG4 em indivíduos com um humano FcRn. Essa sinergia pode justificar o uso dessas duas modificações na mesma proteína, apesar do potencial para imunogenicidade aumentada.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo isolado, caracterizado por se ligar especificamente à interleucina (IL)-5 e compreender:

(i) uma região Fc de IgG4 humana ou o domínio de ligação de FcRn desta modificada em relação a uma região Fc de IgG4 não modificada correspondente ou domínio de ligação de FcRn desta para compreender substituições de aminoácidos M252Y, S254T e T256E numerados de acordo com o índice EU como em Kabat; e (ii) uma sequência da região de dobradiça central de IgG4 humana modificada para compreender a substituição de aminoácido S228P de acordo com o índice EU como em Kabat;

em que a combinação de modificações resulta em um aumento da meia-vida in vivo do anticorpo para (IL)-5 modificado comparada com o anticorpo correspondente tendo somente (i) ou (ii).
2. Uso de um anticorpo isolado que se liga especificamente à interleucina (IL)-5, compreendendo:

(i) uma região Fc de IgG4 humana ou o domínio de ligação de FcRn desta modificada em relação a uma região Fc de IgG4 não modificada ou domínio de ligação de FcRn não modificado correspondentes das mesmas para compreender substituições de aminoácidos M252Y, S254T e T256E numeradas de acordo com o índice EU como em Kabat; e (ii) uma sequência da região de dobradiça central de IgG4 humana modificada para compreender a substituição de aminoácido S228P de acordo com o índice EU como em Kabat;

caracterizado por ser na preparação de um medicamento para tratar ou prevenir um distúrbio definido pela produção excessiva de eosinófilos

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2/3 em que a combinação de modificações resulta em um aumento da meia-vida in vivo do anticorpo para (IL)-5 modificado comparada com o anticorpo correspondente tendo somente (i) ou (ii).
3. Anticorpo de acordo a reivindicação 1 ou uso de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato do anticorpo ser quimérico, humano, humanizado, CDR enxertada, primatizado, desimunizado, envernizado ou biespecífico.
4. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1 ou uso de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por compreender uma sequência de região constante da cadeia pesada apresentada no ID. DE SEQ. N°: 6 e uma sequência da região variável da cadeia pesada apresentada no ID. DE SEQ. N°: 7.
5. Anticorpo ou uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por compreender ainda uma cadeia leve compreendendo sequências de região variável e constante apresentada no ID. DE SEQ. N°: 8.
6. Uso de um anticorpo, de acordo com a reivindicação

2, caracterizado pelo fato do distúrbio ser selecionado do grupo que consiste em asma atópica, dermatite atópica, rinite alérgica, rinite não alérgica, asma, asma grave, pneumonia eosinofílica crônica, aspergilose broncopulmonar alérgica, doença celíaca, síndrome de Churg-Strauss, síndrome de mialgia eosinofílica, síndrome hipereosinofílica, reações edematosas incluindo angioedema episódico, infecções helmínticas, dermatite por oncocercose, esofagite eosinofílica, gastrite eosinofílica, gastrenterite eosinofílica, enterite eosinofílica, colite eosinofílica, micropolipose nasal, polipose nasal, asma por

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3/3 intolerância à aspirina, apnéia obstrutiva do sono, asma crônica, doença de Crohn, esclerodermia, fibrose endomiocárdica e doença autoimune.
7. Ácido Nucleico caracterizado pelo fato de codificar

5 um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 e 3-5.
8. Célula Transformada caracterizada pelo fato de compreender o ácido nucleico codificando um anticorpo, como definido na reivindicação 7 e por ser limitada a um

10 microrganismo transgênico.
9. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 3-5, caracterizado por ser fornecido em uma composição farmacêutica em conjunto com um excipiente farmaceuticamente aceitável.