JP2015504038A - 低減した免疫原性を有するフィブロネクチン結合ドメイン - Google Patents
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Abstract
Description
本願には配列表が含まれ、これは、EFS−Webを使ってASCIIフォーマットで提出されたものであり、引用により、その全体が本明細書に組み込まれる。2012年10月31日に作成された前記ASCIIコピーは、MXI523PC.txtという名称で、サイズは48,779バイトである。
フィブロネクチンは細胞外マトリックスの形成および細胞間相互作用に不可欠な役割を果たす大きなタンパク質であり、これは、3タイプ(I型、II型、およびIII型)の小さなドメインが数多く繰り返すことで構成されている。フィブロネクチンIII型ドメイン(Fn3)は大きなサブファミリーであり、そのメンバーは、細胞接着分子、細胞表面のホルモン受容体およびサイトカイン受容体、シャペロン、および糖質結合ドメインの一部分として、よく見いだされる。概観するには、Bork & Doolittle, Proc Natl Acad Sci USA 89(19):8990−4 (1992);Bork et al., J Mol Biol. 242(4):309−20 (1994);Campbell & Spitzfaden, Structure 2(5):333−7 (1994);Harpez & Chothia, J Mol Biol. 238(4):528−39 (1994)を参照されたい。
本願の一態様は、改良されたターゲット結合と関連する、修飾されたループ領域とスキャフォールド領域、例えばβストランドとの新規な組み合わせを含む、フィブロネクチンベーススキャフォールドポリペプチドを提供する。本願のもう一つの態様は、低減した免疫原性と関連付けられる、新規フィブロネクチンベーススキャフォールドポリペプチドを提供する。
定義
「ポリペプチド」とは、長さ、翻訳後修飾、または機能を問わず、2つ以上のアミノ酸の任意の配列を意味する。「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書においては可換的に使用される。ポリペプチドは、天然アミノ酸および非天然アミノ酸、例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6,559,126号に記載されているものを含むことができる。ポリペプチドは種々の標準的な化学的方法のいずれかで修飾することもできる(例えばアミノ酸は保護基で修飾することができ;カルボキシ末端アミノ酸は末端アミド基にすることができ;アミノ末端残基は、例えば親油性を強化するための基などで修飾することができ;あるいは、ポリペプチドを化学的にグリコシル化するか、他の方法で修飾して、安定性またはインビボ半減期を増加させることができる)。ポリペプチド修飾には、そのポリペプチドへのもう一つの構造、例えば環状化合物または他の分子などの取付けを含めることができ、立体配置(すなわちRもしくはS;またはLもしくはD)が変化している1つ以上のアミノ酸を含有するポリペプチドも含めることができる。
10Fn3ドメインは、抗体に、具体的には抗体の可変領域に、構造的にも機能的にも類似している。歴史的には、10Fn3結合ドメインのデザインは、10Fn3ドメイン構造が抗体のVHドメインの構造と類似していることに依拠していた。特に、10Fn3結合ドメインは、従来、10Fn3ドメインのCDR様ループのアミノ酸配列中の修飾に依拠してきた。10Fn3ドメインのAB、BC、CD、DE、EFおよびFGループは、フレキシブルであり、10Fn3ドメインの全体的構造を改変することなくアミノ酸配列に修飾を加えることが容易であるという点で、免疫グロブリンの相補性決定領域(CDR)と類似している。さらにまた、10Fn3ドメインの一面(すなわち「ノースポール」)に沿うCDR様ループのセットを修飾することによって、所望のターゲットに結合する10Fn3ドメインの開発が可能になることが示されている(例えばPCT公開WO02/032925、WO2008/097497、およびWO2008/066752を参照されたい)。これらの従来型10Fn3スキャフォールドデザインでは、ループ間のタンパク質配列、すなわちβストランドは、典型的には修飾されないか、最小限にしか修飾されない。なぜなら、それらは10Fn3の全体的な構造コンフォメーションの維持に、役割を果たしているからである。本発明者らは、驚いたことに、従来とは異なる方法で10Fn3ドメインを修飾することで、適切な安定性を維持しつつ、所望のターゲットに結合するタンパク質を生産することが可能であることを、ここに見いだした。
A.一般構造
Fn3とはフィブロネクチン由来のIII型ドメインを指す。Fn3ドメインは小さく、単量体型であり、可溶性であり、安定である。これはジスルフィド結合を持たないので、還元条件下で安定である。Fn3の全体的構造は免疫グロブリンフォールドに似ている。Fn3ドメインは、N末端からC末端に向かって順に、βまたはβ様ストランドA;ループAB;βまたはβ様ストランドB;ループBC;βまたはβ様ストランドC;ループCD;βまたはβ様ストランドD;ループDE;βまたはβ様ストランドE;ループEF;βまたはβ様ストランドF;ループFG;およびβまたはβ様ストランドGを含む。7本の逆平行βストランドが2つのβシートとして配置され、それが安定なコアを形成すると同時に、βまたはβ様ストランドをつなぐループから構成される2つの「面」を作り出している。ループAB、CD、およびEFが一つの面(「サウスポール」)に配置され、ループBC、DE、およびFGが反対の面(「ノースポール」)上に配置されている。ループAB、BC、CD、DE、EFおよびFGの一部または全部はリガンド結合に関与しうる。ヒトフィブロネクチンには少なくとも15の異なるFn3モジュールがあり、モジュール間の配列相動性は低いものの、三次構造の高い類似性は全てに共通している。
10Fn3の非ループ配列、すなわち「スキャフォールド領域」は、10Fn3ドメインがターゲット結合機能および/または構造安定性を保っているという条件で、改変することができる。いくつかの実施形態では、Asp7、Glu9、およびAsp23の1つ以上が、別のアミノ酸、例えば非負荷電アミノ酸残基(例えばAsn、Lysなど)で置き換えられる。これらの変異は、野生型と比較して中性pHにおける変異型10Fn3の安定性の向上を促進する効果を有すると報告されている(PCT公開WO02/04523参照)。有益であるか中立的である10Fn3スキャフォールド中のさまざまな改変は他にも開示されている。例えばBatori et al., Protein Eng. 2002 15(12):1015−20;Koide et al., Biochemistry 2001 40(34):10326−33を参照されたい。
・L18R、S21CおよびS60G;
・E9D、L18R、V50EおよびT56I;
・L18R、T49IおよびN91D;
・F48SおよびT71A;
・P5S、V10A、S60GおよびS89P;
・L18R、およびY92C;
・L18RおよびF48S;
・L18RおよびV72A;
・L18Q、R33GおよびF48S;
・Y68DおよびY92H;
・R6S、L62RおよびN91S;
・L8P、E9V、I34V、T71AおよびY92欠失;
・E9K、L18RおよびF48L;
・E9R、L18R、S60GおよびI70V;
・L18R、I88VおよびI90T;
・L18R、N91DおよびY92C;
・L18RおよびI34T;
・L18RおよびG61C;
・Y32F、T71AおよびT94A;
・L18R、T58A、Y92LおよびR93T;
・V50M、T58A、S89P、I90FおよびY92R;
・S2T、D7G、E9K、V10I、T58A、S60NおよびS89P;
・I59V、S60NおよびT94A;
・R6G、S21G、T35A、T58IおよびS60G;
・L18P、S21C、T58A、Y73HおよびY92C;
・Y31H、R33GおよびG61R;
・A74G、R93QおよびT94A
・S2PおよびT58I;
・T58IおよびI88T;
・T58IおよびI90T;
・G61RおよびA74T
・A57欠失、T58欠失およびI59欠失
・R33G、T35IおよびV50M
・V1A、R33GおよびV50M
・R33GおよびV50M
・R33G、I34VおよびV50M
・D3G、L18I、R33G、V50M、Y73HおよびN91T
・R6G、T35FおよびV72A
・A12V、S21NおよびT35A
・S21GおよびT49A
・D3SおよびD7K
・A12VおよびL19Q
・A12D、L18IおよびL19Q
・A12E、L18IおよびL19Q。
一定の実施形態では、スキャフォールド変異のこれらの特異的組み合わせが、BC、DEおよびFGループが修飾されている10Fn3ドメインにおいては除外される。
いくつかの実施形態では、ここに提供するポリペプチドのN末端および/またはC末端領域のアミノ酸配列を、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応する領域のアミノ酸配列との比較で、欠失、置換または挿入によって修飾することができる。10Fn3ドメインは一般的には配列番号1のアミノ酸番号1から始まる。しかし、アミノ酸欠失を持つドメインも、本発明に包含される。いくつかの実施形態では、配列番号1の最初の8アミノ酸(すなわち、残基1〜8)および最後の7アミノ酸(すなわち、残基95〜101)を欠失させて、配列番号60のアミノ酸配列を有する10Fn3ドメインを生成させる。一定の実施形態では、配列番号1の最後の7アミノ酸(すなわち、残基95〜101)を欠失させて、配列番号6のアミノ酸配列を有する10Fn3ドメインを生成させる。配列番号1、2、6、または60のアミノ酸配列を有する10Fn3ドメインのN末端またはC末端に、追加の配列を付加することもできる。例えば、いくつかの実施形態では、N末端伸長部が、M、MG、およびGからなる群より選択されるアミノ酸配列からなる群より選択される。
本明細書に記載する「パッチライブラリー」は、スキャフォールドタンパク質の表面上の領域を多様化したライブラリーを指す。多様化する残基は、タンパク質の表面に1つのスポットを選び、次に、何らかの距離(例えば8Å)内の全ての表面およびループ残基を同定し、形状、配列、結合性(connectivity)、保存(conservation)などを調整することによって決定することができる。例えば、スキャフォールドの「サウスウエスト(SouthWest)」部分を中心とするパッチライブラリーを作成するために、SW側面のほぼ中心にあるAsp67(EFループ中の最後のアミノ酸)を選択した。次に、Asp67から8Å以内の距離にある全ての残基を同定し、疎水性コア残基を、多様化する残基のリストから取り除くことで、G37〜G41、K63〜D67、T69、およびN91から始まるC末端配列(配列番号1または6を有する野生型ヒト10Fn3ドメインの配列に従って番号を付与した残基位置)を含む、合計14個のランダム化するアミノ酸を得る。次に、例えばCDループの長さを変えること(形状をより大きく変動させるため)またはN末端領域の配列を修飾もしくは伸長することなどといった、多様化のさらなる手段を、スキャフォールドデザインに組み込むことができる。代表的なパッチライブラリーを作成するために変異させうるアミノ酸残基の例を、図2A〜Fおよび9A〜Cに掲載する。代表的パッチライブラリーを作成するためにターゲットにすることができる異なる界面をいくつか図解した10Fn3ドメインペプチドの三次元構造を図3A〜Fに示す。いくつかの実施形態では、10Fn3ドメインポリペプチド中のアミノ酸が、ループの定義に関してではなく、10Fn3構造の表面上のそれらの物理的場所に関して、多様化される。いくつかの実施形態では、ループとストランドの両方にまたがることができる、またはもっぱらストランド残基上にあることができる、一般に連続した表面を形成するように選択された、10〜30アミノ酸またはそれ以上の「パッチ」を多様化することができる。
いくつかの実施形態では、ここに提供するポリペプチドが、(i)野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するループとの比較で、BC、DEおよびFGループから選択される少なくとも1つのノースポールループのアミノ酸配列中の修飾と、(ii)野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するループとの比較で、AB、CDおよびEFループから選択される少なくとも1つのサウスポールループのアミノ酸配列中の修飾とを有する、10Fn3ドメインを含む。修飾されたノースポールループおよびサウスポールループは同じターゲットへの結合に寄与する。修飾ノースポールループと修飾サウスポールループのさまざまな組み合わせが考えられる。例えば10Fn3は、1つの修飾ノースポールループと1つの修飾サウスポール、1つの修飾ノースポールループと2つの修飾サウスポールループ、2つの修飾ノースポールループと1つの修飾サウスポールループ、2つの修飾ノースポールループと2つの修飾サウスポールループ、3つの修飾ノースポールループと1つの修飾サウスポールループを含むことなどができ、ここでは、修飾ループのそれぞれが同じターゲットへの結合に寄与する。修飾することができるノースポールループとサウスポールループとの例示的組み合わせには、例えばCDループ(サウスポール)とFGループ(ノースポール)、CDループ(サウスポール)とDEループ(ノースポール)、EFループ(サウスポール)とFGループ(ノースポール)、ABループ(サウスポール)とFGループ(ノースポール)、またはDEループ(ノースポール)とEFループ(サウスポール)などがある。もう一つの例示的なループの組み合わせは、CDループ(サウスポール)、DEループ(ノースポール)、およびEFループ(サウスポール)である。さらにもう一つの例示的なループの組み合わせは、DEループ(ノースポール)と、AB、CDおよびEFループ(サウスポール)の1つ以上とである。修飾ループは、ループ全体にわたって配列修飾を有してもよいし、ループの一部分だけに配列修飾を有してもよい。加えて、修飾ループの1つ以上は、野生型配列の対応するループの長さとの比較で、ループの長さが変動するように、挿入または欠失を有しうる。一定の実施形態では、10Fn3ドメイン中のさらなる領域も(すなわち、ノースポールループおよびサウスポールループに加えて)、例えばβストランド、N末端および/またはC末端領域も、野生型10Fn3ドメインとの比較で配列を修飾することができ、そのような追加の修飾もターゲットへの結合に寄与しうる。
ループ修飾とスキャフォールド修飾との新規組み合わせを有する10Fn3ドメインも、ここに提供する。特に本願は、(i)ループAB、BC、CD、DE、EF、またはFGの少なくとも1つのアミノ酸配列中の修飾と、(ii)少なくとも1つのスキャフォールド領域のアミノ酸配列中の修飾(すなわち、少なくとも1つのβストランド、N末端領域、および/またはC末端領域中の修飾)とを含み、修飾ループと修飾スキャフォールド領域とがどちらも同じターゲットへの結合に寄与する、10Fn3ドメインを含むポリペプチドを提供する。例示的実施形態では、スキャフォールド領域修飾がループ領域中の修飾に隣接して配置される。例えば、ABループが修飾されている場合、スキャフォールド変異は、10Fn3ドメインの直線的配列においてABループに隣接するβストランドAおよび/またはβストランドB中に配置される傾向を持ちうる。別の実施形態では、修飾のクラスターを、10Fn3ドメインの直線的配列において互いに隣接するループ領域およびスキャフォールド領域中に、一緒に見出すことができる。例えば、ループ修飾とスキャフォールド修飾とをどちらも有する10Fn3結合物質は、10Fn3ドメインの直線的配列において互いに隣接する以下の組み合わせのループ領域とスキャフォールド領域とに、アミノ酸修飾のクラスターを有しうる:βストランド/ループ/βストランド、ループ/βストランド/ループ、ループ/βストランド/ループ/βストランド、末端領域/βストランド/ループ、またはループ/βストランド/末端領域など。例えば、ループ修飾とスキャフォールド修飾との新規な組み合わせを有する10Fn3ドメインは、20連続アミノ酸のストレッチにおいてそのアミノ酸のうちの少なくとも15個が野生型との比較で修飾されているように、修飾のクラスターを有しうる。別の実施形態では、連続ストレッチにおいて、20残基のうちの少なくとも17残基、20残基のうちの少なくとも18残基、25残基のうちの少なくとも17残基、25残基のうちの少なくとも20残基、または30残基のうちの少なくとも25残基が、対応するアミノ酸のストレッチにおける野生型10Fn3ドメイン配列との比較で修飾されている。一定の実施形態では、所与の10Fn3ドメインが、無修飾(すなわち野生型)配列のストレッチによって分離された、2つまたは3つの修飾クラスターを有しうる。修飾されるどの所与の領域(すなわちループ、βストランドまたは末端領域)についても、その領域の全部または一部分だけを、野生型配列との比較で、修飾することができる。βストランド領域を修飾する場合、好ましくは、疎水性コア残基は無修飾(すなわち、野生型)のままにしておき、βストランド中の非コア残基の1つ以上を修飾する。ループ、βストランドまたは末端領域の好適な修飾には、アミノ酸の置換、欠失および/または挿入、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。
いくつかの実施形態において、本願は、分子の「ウエストサイド」(図3C参照)に沿った結合面を有する10Fn3ドメインを提供し、これを「ウエストサイド結合物質」または「WS結合物質」という。本明細書に記載するWS結合物質は、配列番号1または6に示す対応するCDおよびFGループ配列と比較して、修飾されたCDループおよび修飾されたFGループを有する10Fn3ドメインを含む。CDループとFGループはどちらも同じターゲットへの結合に寄与する。一定の実施形態において、WS結合物質は、10Fn3ドメイン内の1つ以上の領域に追加の修飾を含みうる。例えば、WS結合物質は、CDおよび/またはFGループに隣接するβストランド領域の1つ以上に、スキャフォールド修飾を含みうる。特に、WS結合物質は、βストランドC、βストランドD、βストランドF、および/またはβストランドGの1つ以上に配列修飾を含みうる。例示的スキャフォールド修飾には、配列番号1または6のアミノ酸位置:33、35、49、69、71、73、89および/または91に対応する1つ以上のスキャフォールド領域位置における修飾が含まれる。WS結合物質は、BCループ、特にBCループのC末端側部分にも、修飾を含みうる。ある実施形態では、BCループの最後の2残基(すなわち、野生型10Fn3ドメイン中のアミノ酸30および31に対応する残基)が、野生型配列との比較で、修飾されている。追加のループ修飾およびスキャフォールド修飾の全部または一部が、修飾CDループおよび修飾FGループと共に、ターゲットへの結合に寄与する。好ましくは、疎水性コア残基は、野生型配列との比較で、無修飾である。
いくつかの実施形態において、ここに提供するポリペプチドは、CDループ、DEループ、そして場合によってはEFループに修飾を有する10Fn3ドメインを含み、ループ修飾は全てターゲット結合に寄与する。これらのポリペプチドを本明細書では「フロント結合物質」と呼ぶ。フロント結合物質はさらに、1つ以上のスキャフォールド領域、特に修飾ループ領域の側面に位置するまたは修飾ループ領域に隣接するスキャフォールド領域にも、修飾を含みうる。例えば、フロント結合物質は、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するβストランドの配列との比較で、βストランドC、βストランドD,および/またはβストランドEの1つ以上にスキャフォールド修飾を含みうる。好ましくは、疎水性コア残基は、野生型配列との比較で、無修飾である。フロント結合物質中に存在しうる例示的スキャフォールド修飾には、配列番号1または6のアミノ酸位置36、49、58および/または60に対応する1つ以上の位置における修飾が含まれる。そのようなスキャフォールド修飾は、修飾ループと共に、ターゲットへの結合に寄与しうる。一定の実施形態では、フロント結合物質が、10Fn3ドメインの数個のループ領域とストランド領域とにまたがる修飾のクラスターを含みうる。特に、フロント結合物質は、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の残基36〜66に対応するアミノ酸間の31残基のうちの、少なくとも15、20、24、25、または27残基に、修飾を含みうる。ループ修飾および/またはストランド修飾は、アミノ酸の置換、欠失および/もしくは挿入、またはそれらの組み合わせを含みうる。例示的実施形態では、CDループが、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のCDループとの比較で、長さが延長されているか、または長さが短縮されている。例示的10Fn3フロント結合物質デザインには、例えば図9Aに示すフロント1デザインおよびフロント2デザインが含まれる。
いくつかの実施形態において、ここに提供するポリペプチドは、EFおよびFGループに修飾を有する10Fn3ドメインを含み、それらのループ修飾は同じターゲットへの結合に寄与する。これらのポリペプチドを本明細書では「バック結合物質」と呼ぶ。バック結合物質は、他のループ領域および/またはスキャフォールド領域に追加の修飾を含みうる。例えば、バック結合物質は、ABループの少なくとも一部分、好ましくはABループのN末端側部分に、修飾を含有しうる。例示的実施形態では、ABループの最初の2アミノ酸(すなわち、野生型10Fn3ドメインのアミノ酸残基14および15に対応するもの)が、野生型配列との比較で、修飾されている。一定の実施形態では、バック結合物質が、1つ以上のスキャフォールド修飾、特に修飾ループ領域に隣接する1つ以上のスキャフォールド領域中の修飾も含有しうる。例えば、バック結合物質は、βストランドA、βストランドG、N末端領域、および/またはC末端領域の1つに、1つ以上の修飾を含有しうる。好ましくは、疎水性コア残基は、野生型配列との比較で、無修飾である。例示的スキャフォールド修飾には、配列番号1または6のアミノ酸位置1〜7、9〜13、89、91、93および/または94に対応する1つ以上の位置における修飾が含まれる。追加のループ修飾および/またはスキャフォールド修飾の1つ以上は、修飾EFおよびFGループと共に、ターゲットへの結合に寄与しうる。好適なループ領域および/またはスキャフォールド領域の修飾には、アミノ酸の置換、欠失および/もしくは挿入、またはそれらの組み合わせが含まれる。一定の実施形態では、FGループのアミノ酸配列が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のFGループとの比較で、長さが延長されているか、または長さが短縮されている。
一定の実施形態において、本願は、10Fn3ドメインを含むポリペプチドであって、10Fn3ドメインが、野生型配列の対応する領域の配列との比較で、βストランドA、ループAB、βストランドB、ループCD、βストランドE、ループEF、およびβストランドFのアミノ酸配列に修飾を含むポリペプチドを提供する。これらのポリペプチドを本明細書では「サウスポール結合物質」または「SP結合物質」と呼ぶ。修飾ループと修飾ストランドは同じターゲットへの結合に寄与する。CDループのアミノ酸配列は、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のCDループとの比較で、長さが延長されていてもよいし、または長さが短縮されていてもよい。サウスポール結合物質は、野生型配列の対応する領域の配列との比較で、βストランドGおよび/またはC末端領域に追加の修飾を含みうる。例示的実施形態において、サウスポール結合物質は、野生型配列の位置11、12、19、60、61、69、91、93および95〜97に対応するアミノ酸に、1つ以上の修飾を含みうる。例示的10Fn3サウスポール結合物質デザインには、例えば、図9Aに示すSP1、SP2およびSP3デザインが含まれる。
いくつかの実施形態において、本願は、配列番号1または6に示す対応するBC、DEおよびFGループ配列と比較して修飾されたBC、DEおよびFGループと、βストランドC、βストランドD、βストランドFおよびβストランドGストランド残基の1つ以上の追加の修飾とを有する、10Fn3ドメインを含むポリペプチドを提供する。βストランド領域修飾とループ領域の修飾は共にターゲットへの結合に寄与する。これらのタンパク質を本明細書では「ノースウエスト結合物質」または「NW結合物質」と呼ぶ。例示的実施形態では、NW結合物質が、配列番号1または6のスキャフォールド領域位置R33、T49、Y73およびS89に対応するアミノ酸位置のいずれか1つまたはその組み合わせに、1つ以上のスキャフォールド修飾を含む。ループ領域およびスキャフォールド領域中の好適な修飾には、アミノ酸の置換、欠失および/もしくは挿入、またはそれらの組み合わせが含まれる。一定の実施形態において、BC、DEおよびFGループの1つ以上は、野生型配列との比較で、長さが延長されているか、または長さが短縮されているか、またはその組み合わせである。ある実施形態において、BC、DEおよびFGループのそれぞれは、野生型配列(例えば配列番号1または6)との比較で、長さが延長されているか、長さが短縮されているか、またはその組み合わせである。一定の実施形態では、BCループの一部分だけ、特にC末端側部分だけが、野生型配列との比較で、修飾されている。例えば、BCループは、野生型BCループのアミノ酸27〜31に対応するアミノ酸残基だけが修飾されていて、BCループの残りの部分(すなわち、野生型ループの残基23〜26に対応する部分)が無修飾のままであってもよい。
いくつかの実施形態において、本願は、修飾BC、DEおよびFGループと、N末端領域、βストランドA、βストランドBおよび/またはβストランドEのいずれか1つまたはその組み合わせに1つ以上の追加の修飾とを有する、10Fn3ドメインを含むポリペプチドを提供する。これらのタンパク質を本明細書では「ノースイースト結合物質」または「NE結合物質」と呼ぶ。例示的実施形態において、NE結合物質は、野生型配列(配列番号1または6)のスキャフォールド領域位置1〜7、E9、L19、S21および/またはT58に対応するアミノ酸のいずれか1つまたはその組み合わせが修飾されている。修飾ループ領域および修飾スキャフォールド領域の組み合わせがターゲットへの結合に寄与する。例示的10Fn3 NE結合物質デザインには、例えば図9Cに示すNE1デザインおよび図2Bに示すデザインなどがある。NE結合物質のモデルを図3Bに図示する。
いくつかの実施形態において、本願は、AB、CD、DEおよびEFループの1つ以上の中の修飾と、βストランドB、βストランドDおよび/またはβストランドEの1つ以上における追加の修飾とを有する、10Fn3ドメインを含むポリペプチドを提供する。これらのタンパク質を本明細書では「サウスフロント結合物質」と呼ぶ。修飾ループ残基と修飾ストランド残基の組み合わせが、ターゲットへの結合に寄与する。例示的実施形態において、サウスフロント結合物質は、配列番号1または6のスキャフォールド領域位置L19、T49、T58、S60、および/またはG61に対応する1つ以上のアミノ酸位置および/または配列番号1または6のループ領域位置T14〜S17、P51、T56、G40〜E47、および/またはK63〜G65に対応する1つ以上のアミノ酸位置が、修飾されうる。例示的実施形態において、サウスフロント結合物質は、野生型配列の残基18および20に対応するアミノ酸間のABループおよび/またはCDループにおいて、長さが延長されているか、または長さが短縮されていてもよい。例示的10Fn3サウスフロント結合物質デザインには、例えば図9Aに示すサウスフロントデザインおよび図2Dに示すデザインなどがある。サウスフロント結合物質のモデルを図3Dに図示する。
いくつかの実施形態において、本願は、配列番号1または6の対応するストランドと比較して修飾されたβストランドAおよびβストランドGを有する10Fn3ドメインを含むポリペプチドを提供する。これらのタンパク質を本明細書では「AG結合物質」または「AGストランド」結合物質という。一定の実施形態では、AGストランド結合物質が、10Fn3ドメインのN末端およびC末端部分に修飾のクラスターを含み、一方、10Fn3の中央部分は無修飾のままである。例えば、AGストランド結合物質は、10Fn3ドメインの最初の19アミノ酸(すなわち、配列番号1または6のアミノ酸位置1〜19に対応するもの)のうちの19アミノ酸中16アミノ酸における修飾、および10Fn3ドメインの最後の18アミノ酸(すなわち、配列番号1のアミノ酸位置84〜101に対応するもの)のうちの18アミノ酸中13〜17アミノ酸または10Fn3ドメインの最後の22アミノ酸(すなわち、配列番号1のアミノ酸位置80〜101に対応するもの)のうちの22アミノ酸中14〜18アミノ酸における修飾を含みうる。例示的実施形態において、AG結合物質は、配列番号1の位置1〜7、9、11〜17、19、84〜89および91〜97に対応する1つ以上の位置に修飾を含みうる。好ましくは、AG結合物質中の修飾領域は、同じターゲットへの結合に寄与する。例示的10Fn3 AG結合物質デザインには、例えば図9Aに示すAGストランドデザインおよび図2Eに示すデザインなどがある。AG結合物質のモデルを図3Eに図示する。
いくつかの実施形態において、本願は、修飾されたCDおよびEFループと、配列番号1の位置69または91〜97に対応する残基のいずれか1つまたはその組み合わせにおける追加の修飾とを有する、10Fn3ドメインを含むポリペプチドを提供する。これらのタンパク質を本明細書では「サウスウエスト結合物質」または「SW結合物質」と呼ぶ。修飾ループ領域と修飾スキャフォールド領域は、ターゲットへの結合に寄与する。例示的10Fn3 SW結合物質デザインには、例えば図9Aに示すサウスウエストデザインおよび図2Fに示すデザインなどがある。SW結合物質のモデルを図3Fに図示する。
いくつかの実施形態において、ここに提供するポリペプチドは、低減した免疫原性と関連付けられる。実施例で述べるように、10Fn3ドメインのBCループ付近の領域は、免疫原性ホットスポットであると思われる。そこで本願は、低減した免疫原性を有する2タイプの10Fn3デザインを提供する。最初のタイプのデザインでは、宿主(例えばヒト)免疫応答が10Fn3ドメインのBC領域を自己と認識し、それによって免疫応答を回避する可能性が高くなるように、BCループが全面的または少なくとも部分的に無修飾である。第2のタイプのデザインでは、BC領域が宿主HLA受容体にそれほど強固に結合せず、それによって10Fn3結合物質のBC領域の潜在的免疫原性が減少するように、10Fn3ドメインのBC領域中の強いHLA結合アンカーが除去または破壊される。これらの10Fn3デザインを以下にさらに説明する。
一定の実施形態では、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質が、2つ以上の10Fn3ドメインを含む多価タンパク質である。例えば、多価フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質は、共有結合によって結合した2個、3個またはそれ以上の10Fn3ドメインを含みうる。例示的実施形態では、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質が、2つの10Fn3ドメインを含む二重特異性または二量体型タンパク質である。一定の実施形態では、多価フィブロネクチンベースタンパク質スキャフォールドが、第1ターゲット分子に結合する第1の10Fn3ドメインと、第2ターゲット分子に結合する第2の10Fn3ドメインとを含む。第1ターゲット分子と第2ターゲット分子は同じターゲット分子または異なるターゲット分子でありうる。第1ターゲット分子と第2ターゲット分子とが同じである場合、第1および第2の10Fn3ドメインは、同じターゲットの異なるエピトープに結合しうる。また、第1ターゲット分子と第2ターゲット分子とが同じである場合、ターゲット結合に関連する10Fn3ドメイン中の修飾の領域は、同じであっても異なってもよい。さらにまた、第1および第2の10Fn3ドメインは、同じまたは異なるスキャフォールドデザインに基づきうる。例えば、多価フィブロネクチンベースタンパク質スキャフォールドは、2つの10Fn3ドメインを含み、どちらの10Fn3も本明細書に記載の同じ非従来型スキャフォールドデザインに基づくか、または10Fn3ドメインの一方が第1タイプの非従来型スキャフォールドデザインに基づき、かつもう一つの10Fn3ドメインが第2タイプの非従来型スキャフォールドデザインに基づくか、または10Fn3ドメインの一方が非従来型スキャフォールドデザインに基づき、かつもう一つが従来型のスキャフォールドデザイン(すなわち、BC、DEおよびFGループが修飾される)に基づくことができる。
一態様において、本願は、薬物動態(PK)成分をさらに含むフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質を提供する。薬物動態には、例えば対象による吸収、分布、代謝、および排除などといった化合物の性質が包含される。改良された薬物動態は、認知された治療ニーズに応じて評価することができる。多くの場合、バイオアベイラビリティーを増加させること、および/または、例えば投与後の血清中でタンパク質が利用可能な状態を保つ時間を増加させることなどによって投与間隔を増加させることが望ましい。場合によっては、タンパク質の血清中濃度の経時的な持続性を改良すること(例えば投与直後と次の投与の直前におけるタンパク質の血清中濃度の差を減少させること)が望ましい。フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質は、哺乳動物(例えばマウス、ラット、またはヒト)におけるそのポリペプチドのクリアランス率を無修飾ポリペプチドと比較して3分の1未満に低減する成分に取付けることができる。改良された薬物動態の他の尺度として、血清中半減期を挙げることもでき、これはα相とβ相に分割されることが多い。適当な成分を付加することにより、一方または両方の相を有意に改良することができる。PK成分とは、生物学的活性分子に融合した時に、その生物学的活性分子の薬物動態特性に影響を及ぼす、任意のタンパク質、ペプチド、または成分を指す。
一態様において、本願は、ヒトターゲット、例えばTNF−α、DLL4、IL−17、PXRまたは他のタンパク質に結合するフィブロネクチンIII型ドメインを含むフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質を提供する。特異的結合特性を持つFn3ドメインを素早く作製して試験するための一方法は、Bristol−Myers Squibb Companyの一社、Adnexusの核酸−タンパク質融合技術である。核酸−タンパク質融合物(RNA−およびDNA−タンパク質融合物)を活用するPROfusion(商標)と名付けられたそのようなインビトロ発現およびタグ付け技術を使って、新規ポリペプチドと、タンパク質への結合にとって最も重要なアミノ酸モチーフとを同定することができる。核酸−タンパク質融合技術は、タンパク質と、それをコードする遺伝情報とを、共有結合的にカップリングする技術である。RNA−タンパク質融合技術およびフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質ライブラリースクリーニング法の詳細な説明については、引用により本明細書に組み込まれるSzostakらの米国特許第6,258,558号;同第6,261,804号;同第6,214,553号;同第6,281,344号;同第6,207,446号;同第6,518,018号;PCT公開WO00/34784;WO01/64942;WO02/032925;ならびにRoberts and Szostak, Proc Natl. Acad. Sci. 94:12297−12302, 1997を参照されたい。
本明細書に開示するさまざまなフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質のいずれかをコードする核酸は、化学的、酵素的または組換え的に合成することができる。細胞における発現が改良されるようにコドン使用頻度を選択することができる。そのようなコドン使用頻度は選択した細胞タイプに依存するであろう。大腸菌および他の細菌、ならびに哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞および昆虫細胞に特化したコドン使用頻度パターンが開発されている。例えば次の文献を参照されたい:Mayfield et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2003 Jan 21;100(2):438−42;Sinclair et al., Protein Expr Purif. 2002 Oct;26(1):96−105;Connell ND. Curr Opin Biotechnol. 2001 Oct;12(5):446−9;Makrides et al., Microbiol Rev. 1996 Sep;60(3):512−38;およびSharp et al., Yeast. 1991 Oct;7(7):657−78。
タンパク質生産のために、本明細書に記載の発現またはクローニングベクターで宿主細胞を形質転換し、プロモーターを誘導するため、または形質転換体を選択するため、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するための変更を適宜加えた従来の栄養培地で培養する。
一態様において、本願は、検出可能成分で標識されたフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質を提供する。フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質は、さまざまな診断的応用に使用することができる。検出可能成分は、検出可能なシグナルを直接的または間接的に生成する能力を有するものならなんでもよい。例えば検出可能成分は、放射性同位体、例えばH3、C14、C13、P32、S35、またはI131;蛍光もしくは化学発光化合物、例えばフルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、もしくはルシフェリン;または酵素、例えばアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼもしくはセイヨウワサビペルオキシダーゼであることができる。
本願はさらに、本明細書に記載のフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質を含む医薬上許容される組成物であって、本質的にエンドトキシンフリーおよび/またはパイロジェンフリーである組成物を提供する。
野生型10Fn3配列:
WT10Fn3ドメイン
WT10Fn3ドメインコア配列バージョン1
D80E置換を持つWT10Fn3ドメイン
WT10Fn3ドメインコア配列バージョン2
WT10Fn3ドメインコア配列バージョン3
WT10Fn3ドメインコア配列バージョン4
MGVSDVPRDL(配列番号9)
VSDVPRDL(配列番号10)
GVSDVPRDL(配列番号11)
XnSDVPRDL[配列中、n=0、1または2アミノ酸であり、n=1である場合、XはMetまたはGlyであり、n=2である場合、XはMet−Glyである](配列番号16)
XnDVPRDL[配列中、n=0、1または2アミノ酸であり、n=1である場合、XはMetまたはGlyであり、n=2である場合、XはMet−Glyである](配列番号17)
XnVPRDL[配列中、n=0、1または2アミノ酸であり、n=1である場合、XはMetまたはGlyであり、n=2である場合、XはMet−Glyである](配列番号18)
XnPRDL[配列中、n=0、1または2アミノ酸であり、n=1である場合、XはMetまたはGlyであり、n=2である場合、XはMet−Glyである](配列番号19)
XnRDL[配列中、n=0、1または2アミノ酸であり、n=1である場合、XはMetまたはGlyであり、n=2である場合、XはMet−Glyである](配列番号20)
XnDL[配列中、n=0、1または2アミノ酸であり、n=1である場合、XはMetまたはGlyであり、n=2である場合、XはMet−Glyである](配列番号21)
MASTSG(配列番号50)
EIEK(配列番号7)
EIEKPC(配列番号8)
EGSGC(配列番号23)
EIEKPCQ(配列番号24)
EIEKPSQ(配列番号25)
EIEKP(配列番号26)
EIEKPS(配列番号27)
EGSGS(配列番号28)
EIDK(配列番号29)
EIDKPSQ(配列番号30)
EIDKPCQ(配列番号31)
PSTSTST(配列番号32)
GPG(配列番号33)
GPGPGPG(配列番号34)
GPGPGPGPGPG(配列番号35)
PAPAPA(配列番号36)
PAPAPAPAPAPA(配列番号37)
PAPAPAPAPAPAPAPAPA(配列番号38)
GSGSGSGSGS(配列番号39)
GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS(配列番号40)
GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号41)
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号42)
GGGGSGGGGSGGGSG(配列番号43)
HHHHHH(配列番号44)
PTSLLISWDAPAVTVRYYRITYG(配列番号58)
PVQEFTVPGSKSTATISGLK(配列番号51)
TITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(配列番号52)
MGEVVAATPTSLLIS(配列番号53)
PHFPTRYYRITYGETGGNS(配列番号54)
PTSLLISWDAPAVTVRYYRITYG(配列番号55)
PTSLLISWSARLKVARYYRITYG(配列番号56)
PTSLLISWRHPHFPTRYYRITYG(配列番号57)
図10のアドネクチン1〜8のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号70、71、62、63、72、13、14および15に対応する。6×Hisテール(配列番号44)を持たない図10のアドネクチン1〜8のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号64、65、48、49、66、67、68および69に相当する。
選択した結合物質をPET9dベクターにクローニングし、大腸菌BL21 DE3 plysS細胞に形質転換した。形質転換細胞を、50μg/mLカナマイシンおよび34μg/mlクロラムフェニコール(chloromphenicol)を含有する5mlのLB培地に、24ウェルフォーマットで摂取し、37℃で終夜成長させた(接種物培養)。200μlの接種物培養を吸引して、50μg/mlカナマイシンおよび34μg/mlクロラムフェニコールを含有する5ml(24ウェルフォーマット)のTB終夜発現培地(TB−Overnight Expression Media)(自己誘導)に移すことにより、生産培養を樹立した。培養物を37℃で4時間成長させた時点で、温度を18℃に下げて、20時間成長させた。4℃における2750gで10分間の遠心分離によって、培養物を収穫した。
適応免疫応答は、樹状細胞などの抗原提示細胞(APC)によって内部に取り込まれたタンパク質のプロセシングおよび消化で開始される。APCは、内部に取り込まれたタンパク質を短いペプチドに切り取り、そのペプチドをその表面MHCクラスII分子上にディスプレイする。MHCクラスII分子のペプチド結合部位はコッペパンのように長くて細く、そのペプチドを長く伸びた形式で保持し、一次結合部位には9アミノ酸分の余地がある(そして一般的にはペプチドのどちらの側の短いテールにも対応できる)。ペプチド結合の決定においては、MHC結合部位内の一定のポケットが支配的である。これらのポケットは、アンカリングされる9マーペプチドの部分におけるアミノ酸位置1、4、6、および9に対応する。これら4つの位置のそれぞれに好ましい側鎖を有するペプチドは一般にHLA(MHCクラスII分子)によく結合するであろう。
この実験では、野生型または改変型10Fn3ドメイン配列の異なる領域に対応する合成ペプチドをHLA結合アッセイで評価した。類似するHLA結合アッセイがReijonen H, Kwok WW「Use of HLA class II tetramers in tracking antigen−specific T cells and mapping T−cell epitopes」Methods 29(3):282−8 (2003)に記載されている。HLA結合アッセイで試験した各実験ペプチドは、各ループのN末端側およびC末端側に隣接する追加のアミノ酸を有する野生型10Fn3ドメインノースポールループ(BC、DEまたはFGループ)ペプチドセグメント(配列番号58、51および52)、BCループのN末端側に位置する野生型10Fn3ドメイン由来のスキャフォールド領域(配列番号53)またはBCループ(配列番号54)のC末端側に位置する改変型10Fn3ドメイン由来のスキャフォールド領域ペプチドセグメントのいずれかであった。実験ペプチドを、アッセイにおいて所望する濃度の50倍の濃度で、100%DMSOに溶媒和させた。次に、ペプチド反応緩衝液に希釈し、128μMから2μMまで連続的にタイトレートした。
HLA結合は、例えばEpiMatrixを使って、インシリコで予測することができる。EpiMatrixは、EpiVaxによって開発されたプロプライエタリーコンピュータアルゴリズムであり、推定HLA結合モチーフの存在についてタンパク質配列をスクリーニングするために使用される。インプット配列は、オーバーラップする9マーフレームに解剖され、ここでは、各フレームが最後のフレームと8アミノ酸分オーバーラップする。次に、その結果生じたフレームのそれぞれを、8つの共通するクラスII HLAアレル(DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*0801、DRB1*1101、DRB1*1301,、およびDRB1*1501)のパネルに対して、予測される結合アフィニティについてスコア化する。生スコアは、大量のランダム生成ペプチド試料のスコアに対して標準化される。その結果生じる「Z」スコアが報告される。1.64を超えるEpiMatrix Z−スコアを持つ9マーペプチドはいずれも、推定HLA結合モチーフとみなす。
修飾10Fn3ドメインを含むウエストサイド(「WS」)結合物質ポリペプチドのライブラリーを、mRNAディスプレイ法(Xu et al. Chem Biol. 2002 Aug;9(8):933−42)を使って、ターゲットとしてのマウスIL−17、マウスDLL4またはヒトPXRへの結合についてスクリーニングした。BCループ配列が野生型のまま残されるように、WS結合物質をデザインした。WS1ライブラリーデザイン(図9A参照)を使って、ターゲットヒトPXRへの結合物質を同定し、WS−LI1ライブラリーデザイン(図9A参照)を使って、ターゲットマウスIL17またはマウスDLL4への結合物質を同定した。ターゲット結合をqPCRによってモニタリングし、特異的結合シグナルが観察された場合は、集団をクローニングし、大腸菌で発現させた。
DLL4はNotch1タンパク質のリガンドである。WS−LI1デザインを有する10Fn3ポリペプチドの、Notch1とマウスDLL4との間の相互作用を妨害する能力を、競合Biacore実験を使って評価した。およそ4500RUのNotch1−FcをCM5 Biacoreチップ上に固定化した。2μMのWS−LI1結合物質を、ポリペプチドを加えていない対照と共に、HBSP緩衝液および5mM CaCl2中で、20nMマウスDLL4と平衡化した。各試料をチップ上に流し、マウスDLL4の結合を、WS−LI1ポリペプチドを添加していない対照と比較した。したがって、シグナルの減少は、Notch1:マウスDLL4相互作用の阻害に対応した。各試料ラン間に、HBSP(pH7.4)および50mM EDTAでの30秒間の洗浄を2回行うことで、チップを再生した。この実験の結果を図5に示す。配列番号3および4の配列を有するポリペプチドは、それぞれNotch1とマウスDLL4との間の相互作用の100%競合をもたらすことがわかった。配列番号5の配列を有するポリペプチドは、Notch1とマウスDLL4との間の相互作用の75%競合を誘発することができた。
サイズ排除クロマトグラフィーを利用して、実施例4で観察された競合結果が試験したWS−LI1結合物質の単量体型によるものであることを証明した。配列番号3または4のいずれかのアミノ酸配列を有するWS−LI1結合物質が主として単量体型であったのに対し、配列番号5のアミノ酸配列を有するWS−LI1結合物質は、単量体型タンパク質と凝集タンパク質との混合物を含有していた。この実験の結果を図6に示すが、これは実施例4で試験したWS−LI1結合物質が単量体型分子種として作用していたことを表し、これらの結合物質が、安定で、よく折り畳まれたポリペプチドとして存在することを示唆している。
実施例4で述べたポリペプチドの安定性を、熱シフト蛍光ベースアッセイ(TSF)によって評価した。配列番号3のアミノ酸配列を有するポリペプチドは59℃で転移を起こした。配列番号4のアミノ酸配列を有するポリペプチドは49℃で転移を起こした。配列番号5のアミノ酸配列を有するポリペプチドでは転移は観察されなかった。
IL−17はIL−17受容体Aタンパク質IL−17RAのリガンドである。WS−LI1デザインを有する10Fn3ドメインの、マウスIL−17とマウスIL−17RAとの間の相互作用を妨害する能力を、競合Alphascreen実験を使って評価した。ストレプトアビジンドナービーズ、抗ヒトIgGアクセプタービーズ、1.5nMマウスIL−17RA−Fcおよび2.5nMビオチン化マウスIL−17を、製造者の指示に従って合わせることで、ロバストなAlphascreenシグナルを得た。配列番号45、46または47のいずれかの配列を有するポリペプチドを、1μMの濃度で混合物に加えた時にこのシグナルを阻害するそれぞれの能力について評価した。配列番号45の配列を有するポリペプチドはAlphascreenシグナルの83%阻害を引き起こし、配列番号46の配列を有するポリペプチドはAlphascreenシグナルの94%阻害を引き起こし、配列番号47の配列を有するポリペプチドはAlphascreenシグナルの81%阻害を引き起こした。これらの結果は、IL−17に結合してマウスIL−17とその受容体との間の相互作用を効果的に阻害する能力を有する10Fn3ドメインを、WS−LI1ライブラリーデザインがもたらすことを実証している。
サイズ排除クロマトグラフィーを利用して、実施例7で観察された競合結果が試験したWS−LI1結合物質の単量体型によるものであることを証明した。配列番号45、46または47のいずれかを有するWS−LI1結合物質は主として単量体型であった。この実験の結果を図7に示すが、これは実施例7で試験したWS−LI1結合物質が単量体型分子種として作用していたことを表し、結合物質が、安定で、よく折り畳まれたポリペプチドとして存在することを示唆している。
実施例7で述べたポリペプチドの安定性を、TSFによって評価した。配列番号45のアミノ酸配列を有するポリペプチドは51℃で転移を起こした。配列番号46のアミノ酸配列を有するポリペプチドは60℃で転移を起こした。配列番号47のアミノ酸配列を有するポリペプチドでは転移は観察されなかった。
PXRに結合する能力を有するWS1結合物質を、Biacore結合アッセイとGSTタグ付きPXRとを使って特徴づけた。14000RUの抗GST抗体をBiacoreチップ上に固定化し、チップ上に50nM溶液を5μL/分の速度で3分間流すことによって、GST−PXRを捕捉した。WS1結合物質を0.5〜2μMの濃度でチップ上に流し、PXRを欠く対照との比較で、結合を観察した。各ランの間に、10mMグリシン(pH2.0)による各30秒間で2回の洗浄を使って、チップをストリッピングし、新鮮なGST−PXRを捕捉した。これらの条件下で、配列番号48のアミノ酸配列を有するWS1結合物質は146RUがGST−PXRに結合し、配列番号49のアミノ酸配列を有するWS1結合物質は81RUがGST−PXRに結合した。これらの結果は、配列番号48または49のどちらかのアミノ酸配列を有するWS1結合物質が、GST−PXRに結合する能力を有することを実証している。
サイズ排除クロマトグラフィーを利用して、実施例10で観察された結合結果が試験したWS1結合物質の単量体型によるものであることを証明した。配列番号48または49のどちらかのアミノ酸配列を有するWS1結合物質は主として単量体型であった。この実験の結果を図8に示すが、これは実施例10で試験したWS1結合物質が単量体型分子種として作用していたことを表し、結合物質が、安定で、よく折り畳まれたポリペプチドとして存在することを示唆している。
この実施例では、ヒトPXRリガンド結合ドメイン(LBD)に結合するさらに6つの10Fn3ポリペプチドを記載する。これらの6つのポリペプチドおよび実施例10に記載した2つのポリペプチド(配列番号48および49を有するもの)の結合特性も提供する。
[表1]ヒトPXRに対するアドネクチン1〜8の結合特性
組換えヒトインテグリンαVβ3(R&D Systems、ミネソタ州ミネアポリス)を40μg/mLになるように酢酸緩衝液pH5.0(GE Healthcare、ニュージャージー州ピスカタウェイ)に希釈してから、標準的なアミンカップリング技法を使ってCM7チップ(GE Healthcare)上に固定化した。500nMフィブロネクチン(Roche Diagnostics、インディアナ州インディアナポリス)およびビトロネクチン(R&D Systems)ならびに5μMの非結合性対照10Fn3分子(配列番号6からなり、N末端にMGが追加されていて、RGDをRGEに変化させる単一アミノ酸置換を持つ)または標的10Fn3分子(RGDモチーフを含有しない変異FGループを有するもの)のどちらかを、固定化インテグリンの上に流した。結合RUを試料注入の最後に収集した。結果は、FGループ中のRGDの欠如が、フィブロネクチンおよびビトロネクチンへの10Fn3分子の結合の消失をもたらすことを示している。
この実施例では、11個の異なるライブラリーから得られる分子のさまざまな特徴を示す。以下のライブラリーを作成した。
・LI−1ライブラリー:これは、ライブラリーLI−1(a)、LI−1(b)およびLI−1(c)の混合物であって、図9Bに掲載するアミノ酸配列を有する10Fn3分子を含む。下線を付したアミノ酸残基は、置換によって任意のアミノ酸に変異させたアミノ酸残基である。下線を付した残基は野生型残基であってもよい;
・LI−3ライブラリー:これは、図9B(「LI−3(b)」)に掲載するアミノ酸配列を有する10Fn3分子を含む。ここでは、囲み枠付きのアミノ酸残基を、任意のアミノ酸への置換または欠失または付加によって変異させた。囲み枠付きの残基は野生型残基であってもよい;
・WS−LI1ライブラリー:これは、図9Aに示すアミノ酸配列を有する10Fn3分子を含む。ここでは、囲み枠付きのアミノ酸残基を、任意のアミノ酸への置換または欠失または付加によって変異させた。囲み枠付きの残基は野生型残基であってもよい;
・LI−S9ライブラリー:これは、図9Aに示すアミノ酸配列を有する10Fn3分子を含む。ここでは、囲み枠付きの残基はアミノ酸の置換、付加または欠失によって変異させ、下線付きの残基は置換によって変異させた。反転表示した残基はEに変化させる。囲み枠付きまたは下線付きの残基は野生型残基であってもよい;
・LI−S8ライブラリー:これは、図9Aに示すアミノ酸配列を有する10Fn3n3分子を含む。ここでは、囲み枠付きの残基を置換、付加または欠失によって変異させた。反転表示した残基をEに変化させる。囲み枠付きの残基は野生型残基であってもよい;
・NP4_FGライブラリー:これは、図9Cに示すアミノ酸配列を有する10Fn3分子を含む。ここでは、囲み枠付きの残基をアミノ酸の置換、付加または欠失によって変異させ、下線付きの残基を置換によって変異させた。囲み枠付きまたは下線付きの残基は野生型残基であってもよい。このライブラリーは、FG、FおよびG中の残基だけを変異させたNP4ライブラリーに相当する;
・WS2’_CDライブラリー:これは、図9Aに示すアミノ酸配列を有する10Fn3分子を含む。ここでは、囲み枠付きの残基を、アミノ酸の置換、付加または欠失によって変異させ、下線付きの残基を置換によって変異させた。囲み枠付きまたは下線付きの残基は野生型残基であってもよい。このライブラリーは、CD、CおよびD中の残基だけを変異させたWS2’ライブラリーに相当する;
・NP1’ライブラリー:これは、図9Cに示すアミノ酸配列を有する10Fn3分子を含む。ここでは、囲み枠付きの残基を、アミノ酸の置換、付加または欠失によって変異させ、下線付きの残基を置換によって変異させた。囲み枠付きまたは下線付きの残基は野生型残基であってもよい;
・NP4ライブラリー:これは、図9Cに示すアミノ酸配列を有する10Fn3分子を含む。ここでは、囲み枠付きの残基をアミノ酸の置換、付加または欠失によって変異させ、下線付きの残基を置換によって変異させた。囲み枠付きまたは下線付きの残基は野生型残基であってもよい;および
・WS2’ライブラリー:これは、図9Aに示すアミノ酸配列を有する10Fn3分子を含む。囲み枠付きの残基をアミノ酸の置換、付加または欠失によって変異させ、下線付きの残基を置換によって変異させた。囲み枠付きまたは下線付きの残基は野生型残基であってもよい。
本明細書に記載する文書および参考文献は、特許文書およびウェブサイトを含めて全て、この文書に全部または一部が記載されているのと同じ程度に、引用により、個別に、この文書に組み込まれる。
Claims (226)
- ヒトフィブロネクチン3型第10(10Fn3)ドメインを含むポリペプチドであって、10Fn3ドメインが、(i)野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1)の対応するループとの比較で、BC、DEおよびFGループから選択される少なくとも1つのノースポールループのアミノ酸配列中の修飾と、(ii)野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するループとの比較で、AB、CDおよびEFループから選択される少なくとも1つのサウスポールループのアミノ酸配列中の修飾とを含み、前記少なくとも1つの修飾ノースポールループおよび前記少なくとも1つの修飾サウスポールループが同じターゲットへの結合に寄与する、ポリペプチド。
- ノースポールループの少なくとも1つまたはサウスポールループの少なくとも1つが、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するループのアミノ酸配列を有する、請求項1に記載のポリペプチド。
- BCループの少なくとも一部分が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するループのアミノ酸配列を有する、請求項1に記載のポリペプチド。
- BCループの最初の3残基が野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のBCループ中の対応する残基と同じである、請求項3に記載のポリペプチド。
- BCループの最初の4残基が野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のBCループ中の対応する残基と同じである、請求項3に記載のポリペプチド。
- BCループの最初の5残基が野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のBCループ中の対応する残基と同じである、請求項3に記載のポリペプチド。
- BCループが、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するループのアミノ酸配列を有する、請求項3に記載のポリペプチド。
- BCループ中に追加の修飾を有する等価なポリペプチドと比較して、低減した免疫原性を有する、請求項3〜7のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- FGループがRGDインテグリン結合部位を含有しない、請求項1〜8のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 少なくとも1つのβストランドのアミノ酸配列が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するβストランドのアミノ酸配列との比較で、修飾されている、請求項1〜9のいずれかに記載のポリペプチド。
- 修飾βストランドが、10Fn3ドメインの直線的配列において、修飾ループの一つに隣接して位置する、請求項10に記載のポリペプチド。
- 修飾βストランドが、10Fn3ドメインの直線的配列において、修飾ノースポールループと修飾サウスポールループとの間に位置する、請求項10に記載のポリペプチド。
- 修飾ノースポールループ、修飾βストランド、および修飾サウスポールループが、10Fn3ドメインの直線的配列において、互いに隣接して位置する、請求項10〜12のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 修飾βストランドがターゲットへの結合に寄与する、請求項10〜13のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 疎水性コア残基が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)との比較で、修飾されていない、請求項1〜13のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 修飾ループの少なくとも1つのアミノ酸配列が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するループのアミノ酸配列との比較で、長さが延長されたものである、請求項1〜15のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 修飾ループの少なくとも1つのアミノ酸配列が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するループのアミノ酸配列との比較で、長さが短縮されたものである、
請求項1〜16のいずれか一項に記載のポリペプチド。 - C末端テールのアミノ酸配列が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のC末端テールのアミノ酸配列との比較で、修飾されている、請求項1〜17のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 最初の7アミノ酸残基のアミノ酸配列が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の最初の7アミノ酸残基のアミノ酸配列との比較で、修飾されている、請求項1〜18のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1)との比較で、N末端から1〜7アミノ酸が切断されているか、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)との比較で、C末端から1〜9アミノ酸が切断されているか、またはその両方である、請求項1〜17のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のアミノ酸配列に対して、少なくとも50%の同一性を有する、請求項1〜20のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のアミノ酸配列に対して、少なくとも65%の同一性を有する、請求項1〜21のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- ヒトフィブロネクチン3型第10(10Fn3)ドメインを含む複数のポリペプチドを含むライブラリーであって、10Fn3ドメインが、(i)野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1)の対応するループとの比較で、BC、DEおよびFGループから選択される少なくとも1つのノースポールループのアミノ酸配列中の修飾と、(ii)野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するループとの比較で、AB、CDおよびEFループから選択される少なくとも1つのサウスポールループのアミノ酸配列中の修飾とを含む、ライブラリー。
- それぞれが異なる10Fn3ドメイン配列を含む少なくとも105個のポリペプチドを含む、請求項23に記載のライブラリー。
- ターゲットに結合するポリペプチドを同定するための方法であって、ターゲットに結合するポリペプチドを同定するために請求項23または24に記載のライブラリーをスクリーニングすることを含む方法。
- 請求項25に記載の方法によって同定される単離されたポリペプチド。
- 500nM未満のKdでターゲットに結合する、請求項26に記載の単離されたポリペプチド。
- ヒトフィブロネクチン3型第10(10Fn3)ドメインを含むポリペプチドであって、10Fn3ドメインが、(i)野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するループとの比較で、ループAB、BC、CD、DE、EF、またはFGの少なくとも1つのアミノ酸配列中の修飾と、(ii)野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するβストランドとの比較で、少なくとも1つのβストランドのアミノ酸配列中の修飾とを含み、前記少なくとも1つの修飾ループおよび前記少なくとも1つの修飾βストランドが同じターゲットへの結合に寄与する、ポリペプチド。
- 修飾βストランドが、10Fn3ドメインの直線的配列において、修飾ループに隣接している、請求項28に記載のポリペプチド。
- 少なくとも2つのβストランドが、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するβストランドとの比較で、修飾されたアミノ酸配列を有する、請求項28または29に記載のポリペプチド。
- 修飾βストランドが、10Fn3ドメインの直線的配列において、修飾ループの両側に隣接する、請求項30に記載のポリペプチド。
- 両方の修飾βストランドがターゲットへの結合に寄与する、請求項30または31に記載のポリペプチド。
- 少なくとも2つのループが、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するループとの比較で、修飾されたアミノ酸配列を有する、請求項28〜32のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 少なくとも1つの修飾ループが、BC、DEおよびFGループから選択されるノースポールループであり、少なくとも1つの修飾ループが、AB、CDおよびEFループから選択されるサウスポールループである、請求項33に記載のポリペプチド。
- 両方の修飾ループがターゲットへの結合に寄与する、請求項33または34に記載のポリペプチド。
- ノースポールループの少なくとも1つまたはサウスポールループの少なくとも1つが、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するループのアミノ酸配列を有する請求項28〜35のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- BCループの少なくとも一部分が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するループのアミノ酸配列を有する、請求項28〜35のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- BCループの最初の3残基が野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のBCループ中の対応する残基と同じである、請求項37に記載のポリペプチド。
- BCループの最初の4残基が野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のBCループ中の対応する残基と同じである、請求項37に記載のポリペプチド。
- BCループの最初の5残基が野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のBCループ中の対応する残基と同じである、請求項37に記載のポリペプチド。
- BCループが、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するループのアミノ酸配列を有する、請求項37に記載のポリペプチド。
- BCループ中に追加の修飾を有する等価なポリペプチドと比較して、低減した免疫原性を有する、請求項37〜41のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- FGループがRGDインテグリン結合部位を含有しない、請求項28〜42のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 疎水性コア残基が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)との比較で、修飾されていない、請求項28〜43のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 少なくとも1つの修飾ループのアミノ酸配列が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するループのアミノ酸配列との比較で、長さが延長されたものである、請求項28〜44のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 少なくとも1つの修飾ループのアミノ酸配列が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するループのアミノ酸配列との比較で、長さが短縮されたものである、請求項28〜45のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- C末端テールのアミノ酸配列が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のC末端テールのアミノ酸配列との比較で、修飾されている、請求項28〜46のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 最初の7アミノ酸残基のアミノ酸配列が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の最初の7アミノ酸残基のアミノ酸配列との比較で、修飾されている、請求項28〜47のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)との比較で、N末端から1〜7アミノ酸が切断されているか、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1)との比較で、C末端から1〜9アミノ酸が切断されているか、またはその両方である、請求項28〜46のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のアミノ酸配列に対して、少なくとも50%の同一性を有する、請求項28〜49のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のアミノ酸配列に対して、少なくとも65%の同一性を有する、請求項28〜50のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- ヒトフィブロネクチン3型第10(10Fn3)ドメインを含む複数のポリペプチドを含むライブラリーであって、10Fn3ドメインが、(i)野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1)の対応するループとの比較で、ループAB、BC、CD、DE、EF、またはFGの少なくとも1つのアミノ酸配列中の修飾と、(ii)野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するβストランドとの比較で、少なくとも1つのβストランドのアミノ酸配列中の修飾とを含む、ライブラリー。
- それぞれが異なる10Fn3ドメイン配列を含む少なくとも105個のポリペプチドを含む、請求項52に記載のライブラリー。
- ターゲットに結合するポリペプチドを同定するための方法であって、ターゲットに結合するポリペプチドを同定するために請求項52または53に記載のライブラリーをスクリーニングすることを含む方法。
- 請求項54に記載の方法によって同定される単離されたポリペプチド。
- 500nM未満のKdでターゲットに結合する、請求項55に記載の単離されたポリペプチド。
- ヒトフィブロネクチン3型第10(10Fn3)ドメインを含むポリペプチドであって、10Fn3ドメインが、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するループの配列との比較で、CDおよびFGループのアミノ酸配列に修飾を含み、CDループおよびFGループが同じターゲットへの結合に寄与する、ポリペプチド。
- CDループの11アミノ酸のうちの少なくとも4アミノ酸が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のCDループの配列との比較で、修飾されている、請求項57に記載のポリペプチド。
- 野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のアミノ酸残基46または47に対応するCDループの1つ以上のアミノ酸残基が、その位置における野生型アミノ酸と同じである、請求項57または58に記載のポリペプチド。
- FGループの13アミノ酸のうちの少なくとも11アミノ酸が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のFGループの配列との比較で、修飾されている、請求項57〜59のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のアミノ酸残基75または87に対応するFGループの1つ以上のアミノ酸残基が、その位置における野生型アミノ酸と同じである、請求項60に記載のポリペプチド。
- CDループ、FGループ、またはその両方のアミノ酸配列が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するループのアミノ酸配列との比較で、長さが延長されている、請求項57〜61のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- CDループ、FGループ、またはその両方のアミノ酸配列が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するループのアミノ酸配列との比較で、長さが短縮されている、請求項57〜61のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- CDループおよびFGループの少なくとも1つのアミノ酸配列が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するループとの比較で、長さが延長されており、かつCDループおよびFGループの少なくとも1つのアミノ酸配列が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するループとの比較で、長さが短縮されている、請求項57〜61のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- βストランドCおよびβストランドDのアミノ酸配列が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するβストランドの配列との比較で、修飾されている、請求項57〜64のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- BCループの少なくとも一部分が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のBCループの配列との比較で、修飾されている、請求項57〜65のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のアミノ酸残基30および31に対応するBCループの1つ以上のアミノ酸残基が、その位置における野生型アミノ酸との比較で、修飾されている、請求項66に記載のポリペプチド。
- βストランドFおよびβストランドGのアミノ酸配列が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するβストランドの配列との比較で、修飾されている、請求項57〜67のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 修飾βストランドの1つ以上がターゲットへの結合に寄与する、請求項57〜68のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 修飾βストランドの全てがターゲットへの結合に寄与する、請求項69に記載のポリペプチド。
- AB、DEおよびEFループの1つ以上が野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するループのアミノ酸配列を有する、請求項57〜70のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 疎水性コア残基が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)との比較で、修飾されていない、請求項57〜71のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- BCループの少なくとも一部分が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するループのアミノ酸配列を有する、請求項57〜72のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- BCループの最初の3残基が野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のBCループ中の対応する残基と同じである、請求項73に記載のポリペプチド。
- BCループの最初の4残基が野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のBCループ中の対応する残基と同じである、請求項73に記載のポリペプチド。
- BCループの最初の5残基が野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のBCループ中の対応する残基と同じである、請求項73に記載のポリペプチド。
- BCループの最初の6残基が野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のBCループ中の対応する残基と同じである、請求項73に記載のポリペプチド。
- BCループが、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するループのアミノ酸配列を有する、請求項73に記載のポリペプチド。
- BCループ中に追加の修飾を有する等価なポリペプチドと比較して、低減した免疫原性を有する、請求項73〜78のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- ヒトフィブロネクチン3型第10(10Fn3)ドメインを含む複数のポリペプチドを含むライブラリーであって、10Fn3ドメインが、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するループの配列との比較で、CDおよびFGループのアミノ酸配列に修飾を含む、ライブラリー。
- それぞれが異なる10Fn3ドメイン配列を含む少なくとも105個のポリペプチドを含む、請求項80に記載のライブラリー。
- ターゲットに結合するポリペプチドを同定するための方法であって、ターゲットに結合するポリペプチドを同定するために請求項80または81に記載のライブラリーをスクリーニングすることを含む方法。
- 請求項80に記載の方法によって同定される単離されたポリペプチド。
- 500nM未満のKdでターゲットに結合する、請求項83に記載の単離されたポリペプチド。
- ヒトフィブロネクチン3型第10(10Fn3)ドメインを含むポリペプチドであって、10Fn3ドメインが、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するループの配列との比較で、CDおよびDEループのアミノ酸配列に修飾を含み、CDループおよびDEループが同じターゲットへの結合に寄与する、ポリペプチド。
- EFループのアミノ酸配列が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のEFループの配列との比較で、修飾されていて、EFループがターゲットへの結合に寄与する、請求項85に記載のポリペプチド。
- βストランドC、βストランドD、およびβストランドFの1つ以上のアミノ酸配列が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するβストランドの配列との比較で、修飾されている、請求項85または86に記載のポリペプチド。
- 修飾βストランドの1つ以上がターゲットへの結合に寄与する、請求項87に記載のポリペプチド。
- 野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の残基36〜66に対応するアミノ酸間の31残基のうちの少なくとも24残基が、野生型配列中の対応する残基との比較で、修飾されたものである、請求項85〜88のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- CDループが、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のCDループとの比較で、長さが延長されているか、または長さが短縮されている、請求項85〜89のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 疎水性コア残基が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)との比較で、修飾されていない、請求項85〜90のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- FGループがRGDインテグリン結合部位を含有しない、請求項85〜91のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- ヒトフィブロネクチン3型第10(10Fn3)ドメインを含む複数のポリペプチドを含むライブラリーであって、10Fn3ドメインが、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するループの配列との比較で、CDおよびDEループのアミノ酸配列に修飾を含む、ライブラリー。
- それぞれが異なる10Fn3ドメイン配列を含む少なくとも105個のポリペプチドを含む、請求項93に記載のライブラリー。
- ターゲットに結合するポリペプチドを同定するための方法であって、ターゲットに結合するポリペプチドを同定するために請求項93または94に記載のライブラリーをスクリーニングすることを含む方法。
- 請求項95に記載の方法によって同定される単離されたポリペプチド。
- 500nM未満のKdでターゲットに結合する、請求項96に記載の単離されたポリペプチド。
- ヒトフィブロネクチン3型第10(10Fn3)ドメインを含むポリペプチドであって、10Fn3ドメインが、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1)の対応するループの配列との比較で、EFおよびFGループのアミノ酸配列に修飾を含み、EFループおよびFGループが同じターゲットへの結合に寄与する、ポリペプチド。
- ABループのアミノ酸配列が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のABループの配列との比較で、修飾されていて、ABループがターゲットへの結合に寄与する、
請求項98に記載のポリペプチド。 - βストランドAおよびβストランドGの1つ以上のアミノ酸配列が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するβストランドの配列との比較で、修飾されている、請求項98または99に記載のポリペプチド。
- 修飾βストランドの1つ以上がターゲットへの結合に寄与する、請求項100に記載のポリペプチド。
- 野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1)の最初の7アミノ酸のアミノ酸配列または残基93〜97に対応するアミノ酸のアミノ酸配列が、野生型配列中の対応する残基との比較で、修飾されたものである、請求項98〜101のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 追加の修飾アミノ酸がターゲットへの結合に寄与する、請求項102に記載のポリペプチド。
- 10Fn3ドメインの最初の15アミノ酸残基のうちの少なくとも14アミノ酸残基が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)中の対応する残基との比較で、修飾されたものである、請求項98〜103のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- EFループのアミノ酸残基の5つのうちの少なくとも4つが、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)中の対応する残基との比較で、修飾されたものである、請求項98〜104のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1)の残基80〜97に対応するアミノ酸間の18残基のうちの少なくとも15残基が、野生型配列中の対応する残基との比較で、修飾されたものである、請求項98〜105のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- FGループのアミノ酸配列が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のFGループとの比較で、長さが延長されているか、または長さが短縮されている、請求項98〜106のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 疎水性コア残基が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)との比較で、修飾されていない、請求項98〜107のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- FGループがRGDインテグリン結合部位を含有しない、請求項98〜108のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- ヒトフィブロネクチン3型第10(10Fn3)ドメインを含む複数のポリペプチドを含むライブラリーであって、10Fn3ドメインが、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するループの配列との比較で、EFおよびFGループのアミノ酸配列に修飾を含む、ライブラリー。
- それぞれが異なる10Fn3ドメイン配列を含む少なくとも105個のポリペプチドを含む、請求項110に記載のライブラリー。
- ターゲットに結合するポリペプチドを同定するための方法であって、ターゲットに結合するポリペプチドを同定するために請求項110または111に記載のライブラリーをスクリーニングすることを含む方法。
- 請求項112に記載の方法によって同定される単離されたポリペプチド。
- 500nM未満のKdでターゲットに結合する、請求項113に記載の単離されたポリペプチド。
- ヒトフィブロネクチン3型第10(10Fn3)ドメインを含むポリペプチドであって、10Fn3ドメインが、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するループの配列との比較で、ABおよびFGループのアミノ酸配列に修飾を含み、ABループおよびFGループが同じターゲットへの結合に寄与する、ポリペプチド。
- 10Fn3ドメインが、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するβストランドおよびループの配列との比較で、βストランドA、ループAB、βストランドB、ループFG、およびβストランドGのアミノ酸配列に修飾を含み、修飾ループおよび修飾ストランドが同じターゲットへの結合に寄与する、請求項115に記載のポリペプチド。
- 野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1)の最初の7アミノ酸のアミノ酸配列または残基93〜97に対応するアミノ酸のアミノ酸配列が、野生型配列中の対応する残基との比較で、修飾されたものである、請求項115または116に記載のポリペプチド。
- 追加の修飾アミノ酸がターゲットへの結合に寄与する、請求項117に記載のポリペプチド。
- ABループのアミノ酸配列が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のABループとの比較で、長さが延長されているか、または長さが短縮されている、請求項115〜118のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- ABループが、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のアミノ酸残基15および18に対応するアミノ酸残基間に挿入または欠失を含有する、請求項115〜119のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- FGループのアミノ酸配列が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のFGループとの比較で、長さが延長されているか、または長さが短縮されている、請求項115〜120のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- FGループのうちの、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のFGループのアミノ酸残基84〜87に対応する部分が、野生型CDループの同じ部分との比較で、修飾されたアミノ酸配列を有する、請求項115〜121のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- FGループが、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のアミノ酸残基83および88に対応するアミノ酸残基間に、挿入または欠失を含有する、請求項115〜122のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- βストランドBが、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のアミノ酸残基18および20に対応するアミノ酸残基間に、挿入または欠失を含有する、請求項115〜123のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の残基1〜19に対応するアミノ酸間の19残基のうち少なくとも16残基が、野生型配列中の対応する残基との比較で、修飾されたものである、請求項115〜124のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1)の残基84〜97に対応するアミノ酸間の14残基のうちの少なくとも13残基が、野生型配列中の対応する残基との比較で、修飾されたものである、請求項115〜125のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- BC、CD、DEまたはEFループの1つ以上が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するループの配列を有する、請求項115〜126のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 疎水性コア残基が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)との比較で、修飾されていない、請求項115〜127のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- FGループがRGDインテグリン結合部位を含有しない、請求項115〜128のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- ヒトフィブロネクチン3型第10(10Fn3)ドメインを含む複数のポリペプチドを含むライブラリーであって、10Fn3ドメインが、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するループの配列との比較で、ABおよびFGループのアミノ酸配列に修飾を含む、ライブラリー。
- それぞれが異なる10Fn3ドメイン配列を含む少なくとも105個のポリペプチドを含む、請求項130に記載のライブラリー。
- ターゲットに結合するポリペプチドを同定するための方法であって、ターゲットに結合するポリペプチドを同定するために請求項130または131に記載のライブラリーをスクリーニングすることを含む方法。
- 請求項132に記載の方法によって同定される単離されたポリペプチド。
- 500nM未満のKdでターゲットに結合する、請求項133に記載の単離されたポリペプチド。
- ヒトフィブロネクチン3型第10(10Fn3)ドメインを含むポリペプチドであって、10Fn3ドメインが、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するβストランドおよびループの配列との比較で、ループCD、ループEF、βストランドF、およびβストランドGのアミノ酸配列に修飾を含み、修飾ループおよび修飾ストランドが同じターゲットへの結合に寄与する、ポリペプチド。
- 野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1)の残基93〜97に対応するアミノ酸のアミノ酸配列が、野生型配列中の対応する残基との比較で、修飾されたものである、請求項135に記載のポリペプチド。
- 追加の修飾アミノ酸が、ターゲットへの結合に寄与する、請求項136に記載のポリペプチド。
- CDループのうちの、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のCDループのアミノ酸残基37〜45に対応する部分が、野生型CDループの同じ部分との比較で、修飾アミノ酸配列を有する、請求項135〜137のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- CDループのうちの、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のCDループのアミノ酸残基37〜45に対応する部分が、野生型CDループの同じ部分との比較で、挿入または欠失を含有する、請求項135〜138のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- EFループのアミノ酸配列が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のEFループとの比較で、長さが延長されているか、または長さが短縮されている、請求項135〜139のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- βストランドFが、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のアミノ酸残基68および70に対応するアミノ酸残基間に挿入または欠失を含有する、請求項135〜140のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1)のアミノ酸残基91〜97の配列に対応するアミノ酸配列が、野生型配列の同じ部分との比較で、修飾アミノ酸配列を有する、請求項135〜141のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1)のアミノ酸残基90および98に対応するアミノ酸残基間に挿入または欠失を含む、請求項135〜142のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- AB、BCまたはDEループの1つ以上が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するループの配列を有する、請求項135〜143のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 疎水性コア残基が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)との比較で、修飾されていない、請求項135〜144のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- FGループがRGDインテグリン結合部位を含有しない、請求項135〜145のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- ヒトフィブロネクチン3型第10(10Fn3)ドメインを含む複数のポリペプチドを含むライブラリーであって、10Fn3ドメインが、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するβストランドおよびループの配列との比較で、ループCD、ループEF、βストランドF、およびβストランドGのアミノ酸配列に修飾を含む、ライブラリー。
- それぞれが異なる10Fn3ドメイン配列を含む少なくとも105個のポリペプチドを含む、請求項147に記載のライブラリー。
- ターゲットに結合するポリペプチドを同定するための方法であって、ターゲットに結合するポリペプチドを同定するために請求項147または148に記載のライブラリーをスクリーニングすることを含む方法。
- 請求項149に記載の方法によって同定される単離されたポリペプチド。
- 500nM未満のKdでターゲットに結合する、請求項150に記載の単離されたポリペプチド。
- ヒトフィブロネクチン3型第10(10Fn3)ドメインを含むポリペプチドであって、10Fn3ドメインが、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するβストランドおよびループの配列との比較で、βストランドA、ループAB、βストランドB、ループCD、βストランドE、ループEF、およびβストランドFのアミノ酸配列に修飾を含み、修飾ループおよび修飾ストランドが同じターゲットへの結合に寄与する、ポリペプチド。
- CDループのアミノ酸配列が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のCDループとの比較で、長さが延長されているか、または長さが短縮されている、請求項152に記載のポリペプチド。
- βストランドGのアミノ酸配列が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のβストランドGの配列との比較で、修飾されている、請求項152または153に記載のポリペプチド。
- C末端テールのアミノ酸配列が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1)のC末端テールのアミノ酸配列との比較で、修飾されている、請求項152〜154のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 疎水性コア残基が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)との比較で、修飾されていない、請求項152〜155のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- FGループがRGDインテグリン結合部位を含有しない、請求項152〜156のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- ヒトフィブロネクチン3型第10(10Fn3)ドメインを含む複数のポリペプチドを含むライブラリーであって、10Fn3ドメインが、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するβストランドおよびループの配列との比較で、βストランドA、ループAB、βストランドB、ループCD、βストランドE、ループEF、およびβストランドFのアミノ酸配列に修飾を含む、ライブラリー。
- それぞれが異なる10Fn3ドメイン配列を含む少なくとも105個のポリペプチドを含む、請求項158に記載のライブラリー。
- ターゲットに結合するポリペプチドを同定するための方法であって、ターゲットに結合するポリペプチドを同定するために請求項158または159に記載のライブラリーをスクリーニングすることを含む方法。
- 請求項160に記載の方法によって同定される単離されたポリペプチド。
- 500nM未満のKdでターゲットに結合する、請求項161に記載の単離されたポリペプチド。
- ヒトフィブロネクチン3型第10(10Fn3)ドメインを含むポリペプチドであって、10Fn3ドメインが、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するβストランドおよびループの配列との比較で、ループAB、βストランドB、ループCD、βストランドD、ループDE、βストランドE、およびループEFのアミノ酸配列に修飾を含み、修飾ループおよび修飾ストランドが同じターゲットへの結合に寄与する、ポリペプチド。
- ABループのアミノ酸配列が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のABループとの比較で、長さが延長されているか、または長さが短縮されている、請求項163に記載のポリペプチド。
- CDループのうちの、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のCDループのアミノ酸残基40〜47に対応する部分が、野生型CDループの同じ部分との比較で、修飾アミノ酸配列を有する、請求項163または164に記載のポリペプチド。
- CDループのうちの、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のCDループのアミノ酸残基40〜47に対応する部分が、野生型CDループの同じ部分との比較で、挿入または欠失を含有する、請求項163〜165のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- βストランドBが、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のアミノ酸残基18および20に対応するアミノ酸残基間に、挿入または欠失を含有する、請求項163〜166のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の残基14〜19に対応するアミノ酸の6残基のうちの少なくとも5残基が、野生型配列中の対応する残基との比較で、修飾されたものである、請求項163〜167のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の残基40〜66に対応するアミノ酸間の27残基のうちの少なくとも18残基が、野生型配列中の対応する残基との比較で、修飾されたものである、請求項163〜168のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- BCループが、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するループの配列を有する、請求項163〜169のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 疎水性コア残基が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)との比較で、修飾されていない、請求項163〜170のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- FGループがRGDインテグリン結合部位を含有しない、請求項163〜171のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- ヒトフィブロネクチン3型第10(10Fn3)ドメインを含む複数のポリペプチドを含むライブラリーであって、10Fn3ドメインが、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するβストランドおよびループの配列との比較で、ループAB、βストランドB、ループCD、βストランドD、ループDE、βストランドE、およびループEFのアミノ酸配列に修飾を含む、ライブラリー。
- それぞれが異なる10Fn3ドメイン配列を含む少なくとも105個のポリペプチドを含む、請求項173に記載のライブラリー。
- ターゲットに結合するポリペプチドを同定するための方法であって、ターゲットに結合するポリペプチドを同定するために請求項173または174に記載のライブラリーをスクリーニングすることを含む方法。
- 請求項175に記載の方法によって同定される単離されたポリペプチド。
- 500nM未満のKdでターゲットに結合する、請求項176に記載の単離されたポリペプチド。
- ヒトフィブロネクチン3型第10(10Fn3)ドメインを含むポリペプチドであって、10Fn3ドメインが、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のループFGのアミノ酸残基77〜83の配列との比較で、FGループに配列修飾を含み、10Fn3が500nM未満のKdでターゲットに結合する、ポリペプチド。
- FGループのうちの、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のアミノ酸残基77〜83に対応する部分が、野生型FGループのアミノ酸残基77〜83の配列との比較で、長さが延長されているか、または長さが短縮されている、請求項178に記載のポリペプチド。
- FGループが単独で、ターゲットへの結合を媒介する、請求項178または179に記載のポリペプチド。
- AB、BC、CD、DEまたはEFループの1つ以上が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するループの配列を有する、請求項178〜180のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- ヒトフィブロネクチン3型第10(10Fn3)ドメインを含む複数のポリペプチドを含むライブラリーであって、10Fn3ドメインが、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のループFGのアミノ酸残基77〜83の配列との比較で、FGループに配列修飾を含む、ライブラリー。
- それぞれが異なる10Fn3ドメイン配列を含む少なくとも105個のポリペプチドを含む、請求項182に記載のライブラリー。
- ターゲットに結合するポリペプチドを同定するための方法であって、ターゲットに結合するポリペプチドを同定するために請求項182または183に記載のライブラリーをスクリーニングすることを含む方法。
- 請求項184に記載の方法によって同定される単離されたポリペプチド。
- 500nM未満のKdでターゲットに結合する、請求項200に記載の単離されたポリペプチド。
- ヒトフィブロネクチン3型第10(10Fn3)ドメインを含むポリペプチドであって、10Fn3ドメインが、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するループの配列との比較で、BCループの一部分およびFGループの一部分に配列修飾を含み、10Fn3ドメインが、野生型BCループとの比較で修飾されているBCループの割合が大きい等価な10Fn3ドメインと比較して、低減した免疫原性を有する、ポリペプチド。
- BCループのうちの修飾されている部分が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のBCループの残基28および29に対応する、請求項187に記載のポリペプチド。
- BCループのうちの修飾されている部分が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のBCループの残基27〜29に対応する、請求項187に記載のポリペプチド。
- BCループのうちの修飾されている部分が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のBCループの残基24〜29に対応する、請求項187に記載のポリペプチド。
- FGループのうちの修飾されている部分が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のFGループの残基77〜83に対応する、請求項187〜190のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- FGループのうちの修飾されている部分が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のFGループの残基77〜82に対応する、請求項187〜190のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- FGループのうちの修飾されている部分が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のFGループの残基77〜86に対応する、請求項187〜190のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- FGループのうちの修飾されている部分が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のFGループの残基77〜79に対応する、請求項187〜190のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- FGループのうちの修飾されている部分が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のFGループの対応する部分との比較で、挿入または欠失を有する、請求項191〜194のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- BCループおよびFGループがターゲットへの結合に寄与する、請求項187〜195のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 10Fn3ドメインがさらに、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のDEループの配列との比較で、DEループの一部分に配列修飾を含む、請求項187〜196のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- DEループのうちの修飾されている部分が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のDEループの残基52および53に対応する、請求項197に記載のポリペプチド。
- 10Fn3ドメインが、野生型BCループ中の対応する部分との比較でアミノ酸残基23〜27の1つ以上に修飾をさらに含む等価な10Fn3ドメインと比較して、低減した免疫原性を有する、請求項187〜198のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 10Fn3ドメインが500nM未満のKdでターゲットに結合する、請求項187〜199のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- ヒトフィブロネクチン3型第10(10Fn3)ドメインを含む複数のポリペプチドを含むライブラリーであって、10Fn3ドメインが、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するループの配列との比較で、BCループの一部分およびFGループの一部分に配列修飾を含む、ライブラリー。
- それぞれが異なる10Fn3ドメイン配列を含む少なくとも105個のポリペプチドを含む、請求項201に記載のライブラリー。
- ターゲットに結合するポリペプチドを同定するための方法であって、ターゲットに結合するポリペプチドを同定するために請求項201または202に記載のライブラリーをスクリーニングすることを含む方法。
- ターゲットに結合しかつ低減した免疫原性を有するポリペプチドを同定する可能性を増加させるための方法であって、ターゲットに結合するポリペプチドを同定するために請求項201または202に記載のライブラリーをスクリーニングすることを含む方法。
- 請求項203または204に記載の方法によって同定される単離されたポリペプチド。
- 500nM未満のKdでターゲットに結合する、請求項205に記載の単離されたポリペプチド。
- ヒトフィブロネクチン3型第10(10Fn3)ドメインを含むポリペプチドであって、10Fn3ドメインが、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するループおよびβストランドの配列との比較で、BCループとβストランドBまたはβストランドCの少なくとも1つとに配列修飾を含み、10Fn3ドメインが、野生型との比較でβストランドBまたはβストランドCの少なくとも1つに配列修飾を有さない等価な10Fn3ドメインと比較して、低減した免疫原性を有する、ポリペプチド。
- BCループのアミノ酸配列が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のBCループのアミノ酸配列との比較で、長さが延長されているか、または長さが短縮されている、請求項207に記載のポリペプチド。
- 10Fn3ドメインがさらに、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の最初の7アミノ酸残基のアミノ酸配列と比較して、最初の7アミノ酸残基のアミノ酸配列に修飾を含む、請求項207または208に記載のポリペプチド。
- 10Fn3ドメインがさらに、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するループの配列との比較で、DEループ、FGループ、またはその両方に修飾を含む、請求項207〜209のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- DEループのアミノ酸配列が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のDEループのアミノ酸配列との比較で、長さが延長されているか、または長さが短縮されている、請求項210に記載のポリペプチド。
- FGループのアミノ酸配列が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のFGループのアミノ酸配列との比較で、長さが延長されているか、または長さが短縮されている、請求項210または211に記載のポリペプチド。
- 10Fn3ドメインがDEループに配列修飾を含み、さらに、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するβストランドの配列との比較で、βストランドD、βストランドE、またはその両方に配列修飾を含む、請求項210〜212のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 10Fn3ドメインがFGループに配列修飾を含み、さらに、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するβストランドの配列との比較で、βストランドF、βストランドG、またはその両方に配列修飾を含む、請求項210〜212のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- BCループのうちの、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のBCループのアミノ酸残基27〜31に対応する部分が、野生型BCループの同じ部分との比較で、修飾アミノ酸配列を有する、請求項207〜214のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- BCループが、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のアミノ酸残基26および32に対応するアミノ酸残基間に、挿入または欠失を含有する、請求項207〜215のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- βストランドDが、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のアミノ酸残基48および50に対応するアミノ酸残基間に、挿入または欠失を含有する、請求項207〜216のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- βストランドFが、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のアミノ酸残基72および74に対応するアミノ酸残基間に、挿入または欠失を含有する、請求項207〜217のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- βストランドGが、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)のアミノ酸残基88および90に対応するアミノ酸残基間に、挿入または欠失を含有する、請求項207〜218のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 疎水性コア残基が、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)との比較で、修飾されていない、請求項207〜219のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- ヒトフィブロネクチン3型第10(10Fn3)ドメインを含む複数のポリペプチドを含むライブラリーであって、10Fn3ドメインが、野生型ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1または6)の対応するループおよびβストランドの配列との比較で、BCループとβストランドBまたはβストランドCの少なくとも1つとに配列修飾を含む、ライブラリー。
- それぞれが異なる10Fn3ドメイン配列を含む少なくとも105個のポリペプチドを含む、請求項221に記載のライブラリー。
- ターゲットに結合するポリペプチドを同定するための方法であって、ターゲットに結合するポリペプチドを同定するために請求項221または222に記載のライブラリーをスクリーニングすることを含む方法。
- ターゲットに結合しかつ低減した免疫原性を有するポリペプチドを同定する可能性を増加させるための方法であって、ターゲットに結合するポリペプチドを同定するために請求項221または222に記載のライブラリーをスクリーニングすることを含む方法。
- 請求項223または224に記載の方法によって同定される単離されたポリペプチド。
- 500nM未満のKdでターゲットに結合する、請求項223に記載の単離されたポリペプチド。
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