KR950007510B1

KR950007510B1 - 히루딘유도체의취득방법,히루딘유도체,재조합dna및재조합벡터

Info

Publication number: KR950007510B1
Application number: KR1019910004246A
Authority: KR
Inventors: 쉬미드 게르하르드; 하버만 폴
Original assignee: 콘소티움 퍼 엘렉트로헤미쉐 인더스트리 게엠베하; 프랑크 뮬러
Priority date: 1990-03-22
Filing date: 1991-03-18
Publication date: 1995-07-11
Also published as: PT97093A; ZA912013B; DE4009268A1; EP0448093B1; PT97093B; ATE135042T1; FI100250B; CA2038888C; DK0448093T3; HU214368B; HUT59962A; JPH07106157B2; CA2038888A1; AU640212B2; CN1055010A; KR920018217A; EP0448093A2; IL97323A0; IE910738A1; US5919895A

Abstract

내용 없음.

Description

히루딘유도체의 취득방법. 히루딘유도체, 재조합 DNA 및 제조합벡터

제1도는 플라스미드(plasmid)pCM705를 나타낸다.

제2도는 pK152에서 합성히루딘유전자의 DNA 배열을 나타낸다.

제3도는 올리고뉴클레오타이드 HIR1, HIR2 및 HIR3의 배열을 나타낸다.

제4도는 플라스미드 pCM7051를 나타낸다.

제5도는 플라스미드 pCM7053을 나타낸다.

이 발명은 에.콜리(E.coli)분비형 돌연변이체(Secretor mutants)로부터 히루딘유도체를 얻는 방법과 N-말단(terminal)아미노산배열 Ala-Thr-Tyr-Tjr-Asp를 가진 히루딘유도체에 관한 것이다.

히루딘은 65개의 아미노산을 가진 폴리펩티드로서, 원래 리치히루도메디시날 (leach Hirudo Medicinals)에서 분리하였다. 이 히루딘은 트롬빈(thrombin)과 안정성있는 착체(Complexes)를 형성함으로서 트롬빈에 대한 높은 특이적 억제제(highly specific inhibitor)로서 작용하여, 가급적 여러분야의 치료용으로 사용할 수 있으며, 특히 항응혈치료(anticoagulation therapy)에 사용할 수 있다(F.Markquardt, biomed, biochim.Acta 44(1985), 1007-1013참조).

히루딘은 완전한 아미노산결합배열에 대한 발표내용(J.Dost 등, FEBS ietters 165(2), (1984), 180-184)에서는 재조합 DNA 기술에 의한 히루딘의 제조와 미생물에서의 표현이 전제가 되었다.

특허문헌 유럽특허(Ep-A-)제158564호(Transgene)명세서에서는 숙주세포 (host cell), 특히 세균(박테리아)세포내에서 히루딘 또는 히루딘유사체의 표현에 대한 클로닝벡터(Cloning Vectors)에 대해서 기재되어있다.

이경우, 히루딘에 대하여 코딩하는 유전자는 리치히루도메디시날 mRNA로 부터 출발하여 cDNA 합성에 의해 얻어진다. 특히, N-말단결합배열 Ile-Thr-Tyr-Thr-Asp를 가진 히루딘유도체와 이것을 얻는 방법에 대하여 기재되어있다.

유럽특허(Ep-A-)제168342호(Ciba Geigy) 명세서에서는 히루딘의 천연아미노산 배열에 대하여 코딩(Coding)을 하는 DNA 배열에 대하여 기재되어있으며, 여기서 그 N-말단아미노산 배열은 Val-Val-Tyr-Twr-Asp로 되어 있다. 히루딘의 표현은 미생물 에.콜리와 삭카로미세스 세레비시애(Saccharomyces Cerevisiae)의 세포내에서 발생한다.

유럽특허(Ep-A)제171024호(Hoechst AG)명세서에서는 특히, 에, 콜리 세포내에서 히루딘활성을 가진 폴리펩티드의 유전자기술에 의한 제조방법에 대하여 기재되어있는바, 여기서 그 세포를 용해시켜 히루딘 활성을 가진 폴리펩티드는 그 세포추출물 (extrant)에서 얻어진다. 경우에 따라 적당하게 존재한 융합단백질부분은 단백질분해 또는 화학전분해(Clevage)에 의해 거의 분리 제거시킬 수 있고, 유리된 히루딘분자를 정제시킬 수 있다.

독일특허(DE-A)제3445571호(GEN-BIO-TEC)명세서에는 히루딘의 생물학적 활성을 가진 단백질에 대하여 코딩(Coding)을 하는 DNA 배열과, 세포의 분해(lysis)에 의해, 적당한 재조합벡터로 전환시키도록 하는 에.콜리 세포에서 상기 단백질을 얻는 방법에 대하여 기재되어있다.

버그먼(Bergmann)등의 논문집(Bio.Chem.Hoppe Seyleer 367(1986), 731 ~740)에서도 역시 에.콜리에서의 히루딘 합성에 대하여 기술하고 있다. 여기서 그 히루딘은 톨루엔처리에 의해 그 세포의 A₅₇₈단위 약 500mg/l의 저수율만을 얻었다.

유럽특허(Ep-A)제200655호(Transgene),유럽특허제252854호(Transgene) 및 유럽특허제0225633호(Ciba Geigy)명세서에는 진핵성숙주유기물(Eukaryotic host organism), 특히 효모로부터 히루딘 활성을 가진 단백질을 분비(Secretion)에 의해 얻어지는 기술구성에 대하여 기재되어있다.

여기서, 그 표현(expression)은 그 구조적인 유전자의 상류(upstream)에 1개의 신호 펩티드를 포함하는 DNA 배열을 가진 벡터상에 나타낸다.

효모중에서 그 N-말단배열 Val-Val-Tyr-Thr-Asp와 N-말단배열 Ile-Thr-Tyr-Thr-Asp를 가진 히루딘유도체 분비에 대하여 기술되어 있다. 이 경우 100mg/l까지의 수율에 대한 취득을 보고한 바 있다.

독일특허(DE-A)제3900626호(Hoechst AG)명세서에서는 N-말단배열 Leu-Thr-Tyr-Thr-Asp를 가진 히루딘유도체에 대하여 기재되어 있다. 그 표현은 바람직하게는 효모중에서 확인되며, 이때 효모페로몬유전자(yeast Pheromone gene) MFα의 프로모터(promoter)와 신호배열(signal sequence)을 히루딘유도체의 표현과 분비에 사용되었다. 그러나, 히루딘유도체의 제조에 대한 상기 전체의 방법은 결점이 있다. 이와같이 효모를 숙주유기물로 사용하여 히루딘을 배지(culture medium)에서 분배하였을때 비교적 고수율을 얻으나 효모세포의 배양은 그 기간이 더 길어지며, 세균, 예로서 에.콜리의 배양보다 그 배양기간을 더 필요로 한다.

그러나, 에.콜리세포중에서 그 수율이 비교적 낮거나 또는/및 그 세포의 용해시에 복잡한 분리방법이 필요하다.

따라서, 이 발명의 목적은 세균세포를 융해시킴이 없이 세균세포에서 히루딘유도체가 고수율로 얻어질 수 있는 히루딘유도체를 얻는 간단한 방법을 개발하는데 있다.

이 발명은, (1) 박테리아신호펩티드를 코딩하는 DNA 섹선(Section)다음에 히루딘유도체에 대하여 코딩하는 유전자를 위치시키는 재조합벡터(recombinant Vector )를 형성하며, (2) 위 공정(1)에서 형성된 재조합벡터를 사용하여 에.콜리 분비형돌연변이체(E.Coil Secretor mutnat)를 형질전환(transformation)시켜, (3) 배지에서 형질절환시킨 세포를 배양하여, (4) 그 배양배지에서 히루딘유도체를 취득하는 공정을 포함함을 특징으로 하는 에.콜리 분리형 돌연변이체로부터 히루딘유도체를 얻는 방법에 관한 것이다.

이 발명에 의한 용어 히루딘유도체는 히루딘에서 유도되고, 트롬빈억제제( thrombin inhibitors)로서 작용하며 특이활성이 최저 10,000At-U(항트롬빈단위)/ mg을 가진 단백질을 의미한다(Dodt 등, Biol Chem. Hoppe Seyler 366(1985), 379 -385).

또, 용어 히루딘유도체는 약 50개의 아미노산길이의 N-말단융합분을 가진 융합단백질로 구성되며, 단백질분해(proteolytic) 또는 화학적분해에 의해 부분적으로 또는 완전하게 제거시킬 수 있다는 융합단백질을 포함한다. 그 결과, 분해성성물(Clevage product)로서 최저 10,000AT-U/mg의 특이활성을 가진 히루딘 유도체가 얻어진다.

이 발명의 방법에 의해 다음의 N-말단아미노산배열을 가진 히루딘유도체가 바람직하게 얻어진다 :

(X)m-Z-Thr-Tyr-Thr-Asp

여기서 m은 0~50이며, X는 같거나 다른 일반적으로 엔코딩할 수 있는 아미노산을 나타내며, Z는 Leu, Ile, Ala, Val, Gly, Ser, Asp, Gln, Asn, His, Met, Phe 및 Thr로 구성되는 그룹에서 일반적으로 엔코딩을 할 수 있는 아미노산을 나타낸다.

여기서, m이 0보다 더 클 경우 그 배열 X는 단백질분해 또는 화학적분해위치를 특히 그 말단에 포함하는 것이 바람직하다. 예로서 그 배열 X에서 최종아미노산이 Arg기(residue)일 경우, 그 융합배열 X는 트립신소화에 의해 이탈되어(Arg에 분해) 그 활성 히루딘유도체를 정제시킬 수 있다.

그러나, 다음 공지의 단백질분해소 또는 화학적분해 시약을 사용하여 융합분을 동일하게 이탈시킬 수 있다.

예로서, 아미노산배열 X가 Met기로 정지(termination)될 때, 그 융합단백질은 시아노겐 할라이드의 분해를 의해 분해시킬 수 있다(E.Gross 및 B.Wittkop, J.Am. Chem.Soc 82(1961) 1510~1517).

예로서 C-말단아미노산 배열 X가 그 아미노산배열 Ile-Glu-Gly-Arg를 포함할 경우 그 분해는 인자 Xa로 행할 수 있다(유럽특허 제0025190호 및 유럽특허 제0161973호). 이 발명의 방법에서 m=0일때 Z는 Gln, His, Phe, Tyr, Gly, Ser, Asp 또는 Asn이 바람직하고, 특히 Ala, Gly, Ser, Asp 또는 Asn이 바람직하다. m이 0이고 Z가 Ala 인 히루딘유도체가 바람직하다.

이와같이, 이 발명은 또 A가 Aln, His, Phe, Tyr, Gly, Ser, Asp 또는 Asn, 바람직하게는 Ala, Gly, Ser, Asp 또는 Asn을 표시하는 N-말단ㄴ배열 A-Thr-Tyr-Thr-Asp를 가진 히루딘유도체에 관한 것이다.

특히 그 N-말단배열 Ala-Thr-Tyr-Thr-Asp를 가진 유도체가 바람직하다. 에.콜리 분비형 돌연변이체 배양 상중액의 히루딘유도체로부터 활성히루딘을 가진 2g/l 배지를 기대이상으로 얻을 수 있다.

이 발명에 의한 방법은 그 세포배지에서 히루딘유도체를 분비하기 때문에 히루딘의 디설파이드 링크를 그 배지의 산화상태에서 정확하게 형성하는데 또 다른 잇점이 있다.

용어 에.콜리 분비형 돌연변이체는 이 발명에 의해 배지에서 다량의 단백질분비를 나타내는 에.콜리균주(E.Coil strains)를 말한다. 이들의 분비형 돌연변이체를 제조하는 방법은 유럽특허제338410호에 기재되어 있다. 적당한 에.콜리 분비형 돌연변이체는 특히 에.콜리 DS 410(DSM 4513) 또는 에.콜리 BW7261(DSM 5231)에서 출발하여 취득할 수 있다. 그 에.콜리균주는 분비할 수 있는 단백질에 대하여 코딩하는 DNA 배열을 포함하는 플라스미드(Plasmic)를 사용하여 우선 형질전환을 시킨다. 그 다음 그 형질전환 시킨 에.콜리균주는 예로서 N-말단-N'-니트로-N-니트로소구아니딘으로 처리함으로써 돌연변이생성(mutagenesis)을 시킨다.

그 다음으로 적당한 분비형 돌연변이체로 선택을 한다. 분비할 수 있는 사용단백질을 예로서 α-시클로덱스트린 글리코실트란페라제로 할 경우 분비형 돌연변이체는 세포벽 활성물질 D-시클로세린에 대한 내성에 의해 알 수 있다.

또, α-시클로덱스트린 글리코실트란스페라제(CGTase)의 분비(Secretion)는 주위 배지중 전분을 가수분해시킨다. 이 배지는 아밀로펙틴아주레(azure)배지를 사용할 때 분비형 돌연변이체 선택에 있어서 추가 선택을 제공한다.

이 발명의 제조합벡터로서, 에.콜리 게놈(genome)중에 직접할 수 있는 벡터[예로서 박테리오파지(bacterio phage)λ] 또는 형질전환시킨 에.콜리 세포에서 염색체외에 존재하는 벡터(예로서 플라스미드)가 적당하다. 플라스미드의 사용이 바람직하다. 신호펩티드와 히루딘유도체로 구성되는 단백질에 대하여 코딩을 하는 제조합벡터상에서의 유전자구성은 유도할 수 있는 프로모터, 특히 바람직하게는 락토오스 또는 IPTG(이소프로필 β-D-티오갈락토사이드)의 첨가에 의해 유도할 수 있는 trp-lac 융합프로모터(promotor)의 제어하에 존재하는 것이 바람직하다. 또, 선택표시유전자 (Selection matker gene)와, 적합할 경우 락억제유전체(lac repressor gene)가 그 벡터상에는 존재한다.

기본적으로 에.콜리 세포의 세포막을 침입하도록 하는 일체의 공지신호펩티드는 히루딘유도체의 분비를 가능하게 하는 박테리아 신호배열로서 적합하다. 따라서, 그람 음성균으로부터의 신호단백질, 예로서 다음의 에.콜리 단백질의 신호단백질을 사용하는 것이 바람직하다.

세포막의 단백질 OmpA(DiRienzo 등, 1978 Ann.Rev Biochem, 47 :481-532), 알칼리포스파타제PhoA(Inouye 등 1982J.Bacteriol.149 : 434-439), LamB 단백질(Hedgpeth 등, 1980 proc, Nat.Acad.Sci,USA 77 : 2621-2625), 말토스결합단백질 MalE(Bedouelle H 등, 1980 Nature 285 : 78~81).

특히, α-CGTase 신호단백질의 사용이 바람직하다. 이 발명의 방법에 적합한 벡터의 예는 플라스미드 pCM705(제1도)로, 이것은 길이가 약 1Kb인 NruI 프라그멘트(fragment)를 제거시킴으로써 유럽특허제383410호에 기재된 플라스미드 pCM703에서 얻을 수 있다.

이 벡터에는 엠피실린-내성유전자, lac-리프레서(repressor)에 대한 유전자 및 신호단백질에 대하여 코딩하는 단편을 그 5'-말단에 가진 CGTase유전자를 가진다. 그 히루딘유도체에 대하여 코딩하는 유전자는 벡터 pCM705내에 집합하면, 세포내에서 그 N-말단에 α-CGTase의 신호단백질을 가진 선구분자(Precursor molecule)를 생산한다. 그 유전자구조는 tac프로모터의 제어하에 있다. 이 방법에서 얻어지는 플라스미드를 사용하여 에.콜리 분비형 돌연변이체를 형질변환시킬 수 있다.

포지티브로 형질변환시킨 클론을 진탕플라스크 또는 배양기중에 배양한다. 약 1의 광학밀도(OD₆₀₀)에 도달될때 IPTG(이소프로필 β-D-티오가락토시드)또는 락토오스에 의해 유도시킨다.

그다음, 트롬빈불활성테스트(Griesback 등, Thrombosis Research 37, (1985), 347-350)에 의해 그 히루딘유도체 생산과정을 측정한다. 융합단백질의 축적을 HPLC 크로마토그라피(액상 : reversed phase)에 의해 분석한다. 그 다음으로 융합단백질의 전부분(pre position)은 분배시킬 수 있고, 그 결과 얻어진 활성히루딘유도체를 정제시킬 수 있다.

다음 실시예를 첨부도면 제1도 내지 제5도에 구체적으로 설명한다.

[실시예 1]

분비벡터의 형성

플라스미드 pK152에는 합성히루딘유전자를 갖고 있으며, 그 유전자의 배열은 특허문헌 유럽특허제17024호에 기재되어있다. 이 플라스미드로부터 시작하여, 크기가 약 200bp이고 히루딘에 대하여 코딩을 한 대부분의 DNA 배열을 구성하는 Hinf I-Hind Ⅲ DNA 프라그멘트를 아가로오스겔전기영동(agarosegel electrophoresis) (제2도)에 의해 분리하였다. 그 결실 5'-말단배열을 새로 합성한 올리고뉴클레오타이드(Oligonucleotide)(HIR 1)에 의해 재생하였다(regeneration). 그 올리고뉴클레오타이드의 코딩하는 배열을 제3도에 나타낸다. 그 Hinf I 말단의 융합(fusion)에 의해 N-말단배열 Ala-Thr-Tyr-Thr-Asp를 가진 히루딘유도체를 얻었다.

그 플라스미드 pCM705(제1도)를 Pst I과 Hind Ⅲ으로 절단한다. 그 쌍방절단 위치는 CGTase의 유전자에 코딩하는 영역에 위치되며 크기가 약 1Kb인 절단된 DNA 프라그멘트를 얻었다.

Pst I은 신호펩티다제 절단위치에 대하여 코딩하는 영역내에서 정확하게 절단하였다. 그 프라그멘트 pCM705 Pst I-Hind Ⅲ 6.3Kb, pK 152 Hinf I-Hind Ⅲ 0.2Kb 및 그 올리고뉴클레오타이드 HIR 1은 같이 결합되어 이것에 의해 플라스미드 pCM7051을 얻었다(제4도).

이 결합혼합물을 사용하여 에.콜리균주 HB(DSM 1607)을 형질전환시켰다. 아밀로펙틴아주레(amylopectin azure)(착색된 아밀로펙틴)을 포함하는 선택배지상에서 전분분해량을 나타내지 않았다. 따라서, α-CGTase 표현을 나타내지 아니한 클로니 (colony)를 분리시켜 균일하게 될때까지 정제하였다.

플라스미드 DNA를 수개의 정제된 클론(clones)에서 분리시켜 제한분석에 의해 그 특징을 나타내었다. 히루딘인서트(hirudin insert)를 가진 2개의 플라스미드로 그 융합영역의 배열분석을 실시하였다.

정확한 히루딘유전자구조를 가진 플라스미드 DNA를 Nru I과 Nde I로 절단하여 크기가 5.08Kb인 프라그멘트를 아가로오스겔전기용동에 의해 분리하였다. Nde I절단에 의해 돌출되어 있는 그 배열의 클레노우(Klenow)효소로 충전(filling)을 한 다음, 그 프라그멘트를 연결(ligation)에 의해 환상화시켰다. 그결과 얻어진 플라스미드 pCM7053이라 칭한다(제5도). 이 플라스미드 pCM7053을 사용하여 특허문헌 유럽특허 제338410호에 기재된 방법에 의해 얻어진 분비형 돌연변이체 에.콜리 WCM 100을 형질전환시켰다.

[실시예 2]

진탕플라스크 실험에서의 히루딘 분비테스트

암피실린 100μg/ml를 포함하는 LB배지 100ml에 WCM 100 pCM7053의 새로 하루밤 배양 배양물을 광학밀도 OD₄₂₀=0.1까지 접종하였다.

그 배양물을 30℃에서 교반하였다. 그 광학밀도 OD₄₂₀=0.1에 도달될때 즉시 인듀서락토오스(inducerlactose)를 1%의 최종농도까지 첨가하였다. 48시간후, 그 배양물에서 샘플을 위하여 그 세포를 원심분리한 다음 그 상층액내의 히루딘 농도를 측정하였다. 그 측정은 트롬빈실활성테스트에 의해 실시하였다. 4000AT-U/ml(항트롬빈 단위)의 수율로 측정되었다(=250mg/l).

[실시예 3]

101 발효조 내에서의 히루딘 생산

암피실린 100μg/ml를 포함하는 7

의 미니말(minmal)배지에 WMC 100 pCM7053의 새로 하루밤 배양한 배양물을 광학밀도 OD₆₀₀=0.1로 될때까지 접종하였다. 발효조건은 아래와 같다.

온도 30℃

교반속도 450~950rpm

통기(Aeration) 0.5~1.5Vvm

PH 7.0±0.1

광학밀도 OD₆₀₀=1.0에 도달될때 IPTG(이소프로필 β-D-티오갈락토사이드) 0.5mM을 첨가하였다.

IPTG첨가 40시간후 그 상승액에서 36,000AT-U/ml가 측정되었다(

2.25g/l ).

[실시예 4]

N-말단배열 Ala-Thr-Leu-Thr-Tyr-Thr-Asp를 가진 히루딘의 분비

실시예 1과 동일한 공정을 밟아 실시하나 올리고뉴클레오타이드 HIR 2(제3도)를 올리고 뉴클레오타이드 HIR 대신 사용할때 그 결과, 신호펩티드를 이탈시킨 후 N-말단배열 Ala-Thr-Arg-Leu-Thr-Tyr-Thr-Asp를 가진 히루딘융합단백질을 얻었다.

상중액에서 이 융합단백질의 축적을 역상조건(reversed phase conditions) (C₁₆크로마토그라피컬럼)을 사용하여 HPLC분석에 의해 측정하였다. 이 유전자구조를 가진 균주 WCM 100의 발효는 융합단백질 25mg/l의 수율을 얻었다. N-말단배열 Leu-Thr-Tyr-Thr-Asp를 가진 활성히루딘은 트립신분해에 의해 얻어질 수 있다.

[실시예 5]

분비형 돌연변이체 WCM88를 가진 히루딘의 분비.

특허문헌 유럽특허제338410호에서 기술한 방법과 동일하게하여 얻어진 분비형 돌연변이체 WCM 88을 플라스미드 pCM7053(실시예 1)으로 형질전환시켰다. 배지중에서 분비에 의한 히루딘의 생산을 진탕플라스크실험 및 발효에 의해 테스트를 하였다.

(a) 진탕플라스크 실험

WCM 88 pCM7053균주를 실시예 2와 동일하게 배양하였다. 그 배양액의 상증액에서 히루딘 농도를 48시간 후 측정하였다.

1800AT-U/ml의 수율을 얻었다(

110mg/l).

(b) 10ℓ발효조내에서의 생산

그 균주를 실시예 3에서아 같이 배양 하였다.

IPTG의 첨가 45시간후에 그 상증액에서 21,000AT-U/ml를 측정하였다 (

1.3g/l)

[실시예 6]

테트라사이클린 내성유전자를 가진 분비벡터의 형성

플라스미드 pBR 322(F.Bolivar 등, Gene 2, 95-113, 1977)의 1.1Kb Nru I-프라그멘트를 분리시켜 Nru I분해에 의해 선상화시킨 pCM7051과 연결시켰다. 그 연결 혼합물을 사용하여 에.콜리 HB 101를 형질전환시켰다. 형질전환물( transformants)을 그 테트라사이클린 내성에 대하여 선택하였다. 플라스미드 DNA를 선택한 클론(clone)에서 재분리시켜 Nde I 및 Ava I에 의해 절단시켰다.

DNA 프라그멘트를 아가로오스겔 전기영동에 의해 분리하였다. 크기가 더 큰 프라그멘트를 분리시켜 돌출 1개사슬에 클레노우 효소를 충전(filling)한 다음 연결하였다. 그 결과 얻어진 플라스미드는 pCMT203이었다.

[실시예 7]

분리벡터 pCMT203을 사용하는 히루딘의 분비

분비형 돌연변이체 WCM 100(실시예 1참조)을 플라스미드 pCMT203으로 형질전환 시켰다. 이 균주를 실시예 3에서와 같이 10ℓ발효조내에서 배양하여 IPTG첨가 45시간후 히루딘 42,000AT-U/ml이 측정되었다(

2.63g/l).

Claims

배지에서 다량의 단백질 분리를 나타내는 에.콜리균주(E.Coil-strains)에서 N-말단배열 Ala-Thr-Tyr-Thr-Asp를 가진 히루딘유도체(hirudin derivatives)를 취득하는 방법에 있어서, (가) 박테리아신호펩티드(bacterial signal peptide)에 대하여 코딩(Coding)을 하는 DNA 단편(Section)의 직후(downstream)에 위 히루딘유도체에 대하여 코딩하는 유전자를 가진 재조합벡터(recombinant vector)를 형성시키고, (나) 위 (가)공정에서 형성된 재조합벡터를 사용하여 배지에서 다량의 단백질 분리를 나타내는 에.콜리 균주를 형질전화시키며, (다) 그 형질전환시킨 세포를 배지중에서 배양시켜, (라) 그 배지에서 위 히루딘유도체를 얻음을 특징으로 하는 위 방법.
제1항에 있어서, 위 재조합벡터로서 플라스미드(plasmid)를 사용함을 특징으로 하는 위 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 위 히루딘유도체와 위 신호펩티드에 대하여 코딩하는 DNA 배열은 유도할 수 있는 프로모터(inmducible promotor)의 조절에 의해 위치디는 재조합벡터를 형성함을 특징으로 하는 위 방법.
제3항에 있어서, 위 유도할 수 있는 프로모터로서, trp-lac 융합프로모터를 사용함을 특징으로 하는 위 방법.
제1항에 있어서, 그램-음성박테리아의 신호펩티드를 사용함을 특징으로 하는 위 방법.
제5항에 있어서, α-시클로덱스트린 글리코실트란스페라제 신호펩티드를 사용함을 특징으로 하는 위 방법.
A가 Ala를 나타내는 N-말단배열 A-Thr-Thr-Asp를 가짐을 특징으로 하는 히루딘유도체.
N-말단배열 Ala-Thr-Tyr-Thr-Asp를 가진 히루딘유도체에 대하여 코딩을 함을 특징으로 하는 재조합 DNA.
박테리아신호펩티드와 N-말단배열 Ala-Thr-Tyr-Thr-Asp를 가진 히루딘유도체로 구성된 단백질에 대하여 코딩을 하는 유전자구조의 하나 또는 그 이상의 복제(copies)를 포함함을 특징으로 하는 재조합벡터(recombinant vector).