PT93910B - Prodesso para a preparacao de uma proteina heterologa mediante secrecao a partir de uma celula - Google Patents
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Description
PROCESSO PARA A PREPARAÇAO DE UMA PROTEÍNA HETERÓLOGA MEDIANTE SE
CREÇÃO A PARTIR DE UMA CÉLULA
TRANSGENE S.A.
A presente invenção diz respeito a novos fragmentos de ADN e ã sua utilização como fragmentos de ADN que codificam para um péptido sinal útil para a secreção de proteínas heterõlogas por células eucariotas (animais ou vegetais] ou protariotas (bactérias), mais particularmente leveduras tais como estirpes de Saccharomyces.
Quando da preparação de uma proteína heterõloga pelas técnicas do ADN recombinante, um dos objectivos frequentemente perseguidos é a obtenção de um composto que é por um lado correctamente processado e por outro lado segregado no meio de cul_ tura que sintetizam a proteína heterõloga. Com efeito, no caso parti cu 1 armente da preparação de uma proteína de interesse industrial, destinada a ser produzida em grande quantidade, é desejável, para que ela conserve as propriedades pretendidas, que a proteína seja produzida sob a forma madura, quer dizer despro vida de qualquer aminoácido ou sequência peptídica suplementar estacionária fundida com a proteína. Por outro lado, pode ser interessante que a proteína seja segregada no meio de cultura a
-2fim de facilitar as operações de recuperação e purificação
As proteínas que são segregadas por uma célula, em particular por uma célula eucariota, são muito geralmente sintetizadas sob a forma de um precursor polipeptídico sem actividade biológica, comportando um fragmento correspondente a proteína madura (forma activa) e um fragmento N-terminal dito fragmento pre, também chamado pêptido sinal, que intervêm no mecanismo de secreção da proteína pela célula. Além disso, este precursor polipetídico pode compreender um ou mais fragmentos adicionais, chamados fragmentos pro, Neste ultimo caso, o precurtor polipeptídico chama-se pré-pro ou primeiro precursor, Um fragmento pro estã, na maioria dos casos, inserido entre o pêp tido sinal e o fragmento correspondente ã proteína madura, ainda que isto não seja uma regra absoluta,
Um péptido sinal inicia (i) a inserção da proteína na membrana celular (ii) a translocação da proteína através da mem brana celular, ou (iii) a entrada da proteína no retículo endoplasmãtico da célula com vista ã secreção da proteína por via do retículo endoplasmãtico. Uma vez que o pêptido sinal tenha completado a sua função, desliga-se normalmente mediante clivagem proteolítica para libertar uma proteína madura ou um segundo precursor chamado precursor pro que, tal como o primeiro precursor, não tem actividade biológica, ou que não tem a actividade completa da proteína madura.
Um fragmento pró ê útil na medida em que bloqueia ou modifica a actividade da proteína, permitindo assim proteger a
-3célula contra os efeitos tóxicos eventuais da proteína. Pode igualmente intervir, em uma certa medida, no mecanismo de secreção. Uma vez terminado o processo de secreção, o fragmento pro do segundo precursor liberta-se mediante clivagem proteolítica para libertar uma proteína madura (forma activa).
Na junção do fragmento pré e do fragmento pro, assim como na junção do fragmento pro e do fragmento correspori dente a proteína madura, deve-se encontrar um sitio de clivagem proteolítica que é reconhecido por uma das proteases da célula na qual a proteína é sintetizada. Este sítio de clivagem proteo lítica é geralmente constituído por uma sequência de 2 ou 3 aminoãcidos ou mais (chamada por consequência sequência de proteÓlise) não se encontrando nenhuma por outro lado sobre a sequêq cia pro ou sobre o fragmento correspondente ã proteína madura. Três casos são £ priori possíveis, ilustrados a seguir, com referência ã junção dos fragmentos pré e pro, ou a protease corta na cabeça da sequência e, por consequência, a sequência de proteólise deve-se ler sobre o fragmento pro;
ou então a protease corta na cauda da sequência e, por consequência, a sequência de proteólise deve-se ler sobre o fragmento prê;
ou então a protease corta no meio da sequência e, por consequência, a sequência de proteólise deve-se ler a cavalo sobre os fragmentos prê e pro.
Estas considerações aplicam-se evidentemente, de maneira semelhante, ao sítio de clivagem colocado na junção do fragmento pro e do fragmento correspondente ã proteína madura.
Para a construção de precursores sintéticos de acordo com os métodos da engenharia genética pode-se ser levado a utilizar fragmentos naturais (quer dizer tais como encontrados na natureza) e a inserir em bom lugar um novo sítio de clivagem proteolítica ou certos aminoácidos de maneira a reconstituir um novo sítio de clivagem em associação com os fragmentos, sendo este novo sítio de clivagem evidentemente reconhecido por uma das proteases da célula em que o precursor sintético é expresso .
Um exemplo do tipo de síntese e do modo de secreção des_ crito antes Õ ilustrado pelo caso da feromona sexual^ da levedura S. cerevisiae, também chamado factor 0/ (MF^Íl). MF 1 é, com efeito, sintetizado sob a forma de precursor pré-pro tal como descrito em Kurjan e Herskowitz, Cell (1982) 3Q:933. A sequência de aminoácidos do fragmento pré do precursor de
MF | Çvi é | Met | Arg | Phe | Pro | Ser | I1e Phe | Thr | Al a | Vai | Leu | Phe | Ala | |
Ala | Ser | Ser | Al a | Leu | Ala | enqu | anto a do | fra | gmen | to | pro | do | prec | ur- |
sor | do M | F 1 | é A | la P | ro V | al A | sn Thr T | hr T | hr G | lu A | s p G | lu T | hr A | 1 a |
Gin | 11 e | Pro | Ala | G1 u | Al a | Vai | Ile Gly | Tyr | Ser | Asp | Leu | Glu | Gly | Asp |
Phe | Asp | Vai | Ala | Vai | Leu | Pro | Phe Ser | As n | Ser | Thr | As n | As n | Gly | Leu |
Leu | Phe | 11 e | As n | Thr | Thr | 11 e | Ala Ser | Ile | Ala | Al a | Lys | Glu | Glu | Gly |
Vai | Ser | Leu | Asp |
De maneira surpreendente, descobriu-se agora que a ex-5/ tremidade N-terminal do precursor de uma enzima de levedura, ten do esta extremidade N-terminal a sequência de aminoácidos Arg-Phe-Ser-Thr-Thr-Leu-Ala-Thr-Ala-Ala-Thr-Ala-Leu-Phe-Phe-Thr-A1a-Ser-Gln-Val-Ser-Ala, pode ser utilizada como pêptido sinal para a secreção de proteínas heterõlogas, assim como diferentes variantes desta extremidade N-terminal. Por proteína heterõlo ga entende-se uma proteína que não e produzida naturalmente pela célula hospedeira ou então que ê codificada por uma seque£ cia que não provém da célula hospedeira.
De acordo com isto, a presente invenção tem por objecto um fragmento de ADN isolado que codifica para um péptido sinal cuja sequência de aminoácidos apresenta um grau de homologia de pelo menos 60%, de maneira preferencial de pelo menos 80%, com a sequência de aminoácidos I ou II, de preferência com a sequência II. As sequências I e II são como se segue:
(I) Arg-Phe-Ser-Thr-Thr-Leu-Ala-Thr-Ala-Ala-Thr-Ala-Leu-Phe-Phe-Thr-Ala-Ser-Gln.
(II) Arg-Phe-Ser-Thr-Thr-Leu-Ala-Thr-Ala-Ala-Thr-Ala-Leu-Phe-Phe-Thr-Alj-Ser-Gln-Val-Ser-Ala,
Por fragmento de ADN isolado entende-se um fragmento de ADN cuja extremidade 3' não estã ligada mediante ligação co valente a um fragmento de ADN que codifica para uma enzima ten do uma actividade p-1,3-glucanase tal como descrito, em particular, em Klebl & Tanner, J. Bact., Nov. 1989, 171 (11): :6259.
Mais particularmente, um fragmento de ADN de acordo com
-6a presente invenção codifica para um peptido comportando a seguinte sequência de aminoácidos III:
(III) R]-Rg-Rg-Thr-Thr-R^A!a-Thr-A!a-ΑΊa-Thr-Al a-Leu-Phe-Phe1 5 10
-Thr-Ala-Rg-Rg
19 na qual
R-| representa um aminoãcido seleccionado entre Arg e Lys,
Rg e Rg representam, cada um, um aminoãcido seleccionji do de maneira independente entre Ala, Asn, Cys, Gin, Gly, His, I1e, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp , Tyr e Vai,
Rg e Rg representam, cada um, um aminoãcido selecionado de maneira independente entre Asp, Gly, Asn, Pro e Ser, e
R4 representa um aminoãcido seleccionado entre Vai , Leu, Ala, Cys, Phe, Ile e Met,
De maneira preferida, um fragmento de ADN de acordo com a presente invenção codifica para um pêptido comportando a seguinte sequência de aminoácidos de formula geral IV:
(IV) R1-Rg-R3-Thr-Thr-R4-Ala-Thr-Ala-Ala-Thr-Ala-Leu-Phe-Phe-7- Th r - A1 a - R5 - Rg - Ry na qual
Rj representa um aminoácido seleccionado entre Arg e Lys ,
Rg e Rg representam, cada um, um aminoácido seleccion<a do de maneira independente de Ala, Asn, Cys, Gin, Gly, His, lie, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp,
Tyr e Va1 ,
Rg e Rg representam, cada um, um aminoácido selecciona. do de maneira independente entre Asp, Gly, Asn, Pro e Ser;
R^ representa um aminoácido seleccionado entre Vai, Leu, Ala, Cys, Phe, Ile e Met,
Ry representa uma sequência de proteolise, símbolo Ry representa preferencia 1 mente uma sequência de proteolise de formula geral R8~R9_R10 na 9ua^ ·
Rg representa um aminoácido seleccionado entre Ala , Vai, Ser, Cys, Gly, Ile, Leu, Thr,
Rg representa um aminoácido seleccionado entre Ala ,
-8Arg, Cys, Gin, Gly, His, Ser, Thr, Trp, Tyr e Vai
R1O representa um aminoácido Cys, Gly, Leu, Pro, Gin, seleccionado entre Ala ,
Ser e Thr,
De acordo com a presente invenção, um fragmento de ADN preferido codifica para um péptido comportando uma sequência de aminoácido seleccionada entre as seguintes sequências de aminoácidos de formulas V, VI, VII e VIII:
(V) Arg-Phe-Ser-Thr-Thr-Leu-Ala-Thr-Ala-Ala-Thr-Ala-Leu-Phe-Phe-Thr-Ala-Ser-Gln (VI) Arg-Phe-Ser-Thr-Thr-Val-Ala-Thr-Ala-Ala-Thr-Ala-Leu-PhePhe-Thr-Ala-Ser-Gln (VII) Arg-Phe-Ser-Thr-Thr-Leu-Ala-Thi—Ala-Ala-Thr-Ala-Leu -Phe-PheThr-Ala-Ser-Gln-Ry na qual R? tem os significados definidos antes, (VIII) Arg-Phe-Ser-Thr-Thr-Val-Ala-Thr-Ala-Ala-Thr-A1a-Leu-Phe-PheThr-Ala-Ser-Gln-R?
na qual R? tem os significados definidos antes,
De maneira completamente preferida, o símbolo R? representa uma sequência em que o símbolo Rg representa Vai, o sTmbo lo Rg representa Ser e o símbolo R-| θ representa Ala.
-94»
E muito particularmente preferido que um fragmento de ADN de acordo com a presente invenção tenha por sequência nu-
cleotídi ca e XII : | uma | das | seguintes sequências | de | fõrmu1 as | IX, | X, | XI |
(IX) CGT | TTC | TCT | ACT ACA GTC GCT ACT | GCA | GCT ACT | GCG | CTA | TTT |
TTC | ACA | GCC | TCC CAA, | |||||
(X) CGT | TTC | TCT | ACT ACA CTC GCT ACT | GCA | GCT ACT | GCG | CTA | TTT |
TTC | ACA | GCC | TCC CAA, | |||||
(XI) CGT | TTC | TCT | ACT ACA GTC GCT ACT | GCA | GCT ACT | GCG | CTA | TTT |
TTC | ACA | GCC | TCC CAA GTT TCA GCT, | |||||
(XII) CGT | TTC | TCT | ACT ACA CTC GCT ACT | GCA | GCT ACT | GCG | CTA | TTT |
TTC | ACA | GCC | TCC CAA GTT TCA GCT. |
Os peptidos codificados pelos fragmentos de acordo com a presente invenção compreendem uma região hidrofoba possuindo uma estrutura em hélice QC compreendida entre o aminoácido na posição 3 e o aminoácido na posição 18. Esta estrutura contri_ bui para os tornar aptos a uma utilização como péptido sinal . Sabe-se que a parte hidrofoba das sequências sinal é constituí da, na sua maioria, pelos aminoãcidos Ala, Cys, Phe, Ile, Leu, Met, Vai. Pode-se por conseguinte igualmente prever que certas modificações de aminoãcidos não dão origem a modificações na aptidão do péptido sinal para desempenhar o seu papel,
Sob um outro aspecto, a presente invenção propõe por consequência a aplicação de um fragmento de ADN de acordo com a presente invenção como fragmento de ADN que codifica para um
peptido sinal útil para a secreção de uma proteína heterõloga por uma célula hospedeira.
De uma maneira geral, a presente invenção pode ser uti lizada em uma célula procariota ou eucariota, de preferência nesta ultima. A célula eucariota pode ser, por exemplo, uma célula de mamífero ou de levedura. De maneira completamente pre ferida, a segregação de uma proteína heterõloga com a ajuda de um pêptido sinal codificado por um fragmento de acordo com a pre sente invenção é realizada por uma célula de levedura, por exem pio do género Saccharomyces, mais particularmente da espécie S. cerevisiae.
Evidentemente, como fragmentos de ADN que codificam para um péptido sinal, os fragmentos de ADN de acordo com a presen te invenção serão precedidos de um cõdão de iniciação da tradução, geralmente de um cõdão que codifica para uma metionina, em particular um ATG.
Os fragmentos de ADN de acordo com a presente invenção podem ser utilizados para a construção de uma cassete de expres. são de uma pnoteína, precedida do cõdão de iniciação, sõs ou em associação com outros componentes, por exemplo um fragmento pro, Estes fragmentos de ADN podem preparar-se mediante síntese quími ca, por meio de um sintetizador de oligonucleõtidos mediante uma técnica conhecida dos entendidos na matéria,
A presente invenção diz igualmente respeito a uma casse te de expressão de uma proteína heterõloga comportando um frag-11-
mento de ADN de acordo com a presente invenção a título de frag mento de ADN que codifica para o péptido sinal da referida proteína heterõloga. De maneira detalhada, uma cassete de expressão de acordo com a presente invenção que comporta por conseguin_ te a informação necessária para a secreção de uma proteína heterõloga madura, compreende, de um modo sequencial, pelo menos:
a) um fragmento de ADN comportando sinais de ini ci a_ ção da transcrição e da tradução,
b) um fragmento de ADN de acordo com a presente invenção ,
c) um fragmento de ADN que codifica para uma proteína heterõloga madura (com cõdão de fim de tradução) .
Em uma primeira variante, pode-se ligar directamente o fragmento b) em fase com o fragmento c), na medida em que, na junção do fragmento b) e do fragmento c), existe uma sequência de ADN que codifica para um sítio de clivagem proteolítica de maneira a permitir a libertação de uma proteína madura no fim do processo de expressão e de secreção. De maneira preferida, a sequência de ADN que codifica para um sítio de clivagem proteolítica lê-se sobre o fragmento b).
Em uma segunda variante, uma cassete de expressão de acordo com a presente invenção compreende além disso um fragmen. to de ADN b‘) que codifica para um fragmento peptídico pro. Es_ te fragmento b') liga-se em fase com o fragmento b) e o fragmeji
to c), na medida em que, na junção dos fragmentos b) e b1) por um lado e dos fragmentos b1) e c) por outro lado, existe uma sequência de ADN que codifica para um sitio de clivagem proteolítica.
Numerosos fragmentos b') podem ser utilizados nas casse tes de acordo com a presente invenção, Em particular, diversos fragmentos b1) podem ser construídos de maneira sintética, Como exemplo, indica-se adiante a construção de um fragmento b') s i ni tético a partir da sequência de ADN que codifica para o fragmeji to pro do precursor MF^l. Esta sequência pode ser utilizada na totalidade ou em parte, Em um modo de realização particular, utiliza-se esta sequência de que se eliminou parte que codifica para os aminoãcidos em posição 3 a 42 sobre o fragmento pro, quer dizer a sequência que codifica para: Ala Pro Gly Leu Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Vai Ser Leu Asp. Para formar o fragmento b'), esta ultima sequência de ADN ê seguida de uma sequência que codifica para (i) um péptido compreendendo um sitio de clivagem proteolítica ou (ii) um sítio de clivagem proteolítica, sendo este ultimo modo de realização preferido. Muito particularmente, este ultimo sítio de clivagem ê Lys-Arg, sendo este reconhecido pela endopeptidase de levedura yscF que é codificada pelo Gene KEX2 e que corta ao nível da extremidade C-terminal do dipéptido Lys-Arg, Em re sumo, um fragmento b') particular codifica para Ala Pro Gly Leu Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Vai Ser Leu Asp Lys Arg.
A sequência a) compreende em particular um promotor fun
cional na célula em que se pretende sintetizar a proteína heterologa codificada pelo fragmento c), de preferência um promotor funcional na levedura. Pode-se citar exemplos dos promotores constitutivos de levedura cuja funcionalidade foi confirmada pela transcrição, de genes que codificam para proteínas heterõlogas tais como os promotores PGK, ENO1 , MF^.1, ou ainda promotores capazes de serem induzidos tais como PHO5 e GAL1.. Por exemplo, quando se utiliza na cassete de expressão elementos do gêne MFóil de leve dura, poder-se-ã utilizar o promotor do gene MF^dl.
Finalmente, as cassetes de expressão podem igualmente comportar um fragmento de ADN d) comportando sinais de termina_ ção da transcrição, de preferência funcionais na levedura, por exemplo o do gene PGK.
De um modo geral , uma cassete de expressão de acordo com a presente invenção pode ser introduzida em uma célula procariota ou eucariota, de preferencia eucariota tal como uma célula de mamífero ou de levedura, sendo uma célula de levedura muito particularmente preferida, Esta introdução pode ser realizada colocando a cassete em um plasmídeo de replicação autónoma ou em uma construção destinada ã integração para ser introduzida directamente no genoma de levedura, de maneira a obter nos dois casos uma célula transformada.
Quando o plasmídeo Ó autónomo, comporta elementos que asseguram a sua repl icação,'quer dizer uma sequência de replica_ ção autónoma, ou uma origem de replicação tal como a do plasmídeo 2 u de levedura. Além disso, o plasmídeo poderá comportar
-14L /
elementos de selecção tais como o gene URA3 ou LEU 2 que asse gurarão a complementação da levedura ura3 ou leu2. Em particu. lar, poder-se-ã , com vantagem, utilizar o gene URA3 de que se eliminou o seu promotor (URÀ3-d).
Estes plasmídeos podem igualmente comportar elementos que assegurem a sua replicação nas bactérias, quando o plasmídeo deve ser um plasmídeo transportador, por exemplo uma origem de replicação tal como a do pBR322, um gene marcador de selecção tal como Amp e/ou outros elementos conhecidos dos entendidos na matéria.
De acordo com este processo, a presente invenção diz igualmente respeito a uma célula transformada por (i) um fragmento de ADN de acordo com a presenta invenção ou (ii) uma cassete de expressão de acordo com a presente invenção, quer inserida num plasmídeo, quer integrada no genoma da célula.
Quando o promotor é o do gene MF^l, a célula de levedura transformada ê de preferência do tipo sexual MAT , Utili^ zar-se-ã, por exemplo, uma estirpe de genotipo ura3 ou leu2 ou outra, complementada pelo plasmídeo para assegurar a manuteji ção do plasmídeo na levedura por uma pressão de selecção aorop r i a d a .
Finalmente, a presente invenção tem por objecto um processo para a preparação de uma proteína heterologa, caracteriza. do pelo facto de se cultivar uma célula de acordo com a presente invenção e de de se recuperar a dita proteína no meio de cultu
ra. Este processo aplica-se à preparação de qualquer proteína de natureza heterõloga. Entre estas proteínas, pode-se particularmente citar a hirudina ou defensinas, por exemplo a defeji sina A.
Mais particularmente, a presente invenção diz respeito a um processo para a secreção de hirudina sob a forma madura a partir de estirpes de leveduras transformadas de acordo com a presente invenção.
A presente invenção aplica-se muito particularmente bem a produção de hirudina e é por este motivo que um dos exemplos ilustrativos da presente invenção diz respeito a esta proteína,
Com efeito, a hirudina, cuja fonte principal se encontra nas glândulas salivares de sanguessugas medicinais e um inibidor muito específico e muito eficaz da trombina. Trata-se, por con. sequência de um agente terapêutico muito interessante cuja utilização em clínica exige uma enorme pureza do composto, sendo, por conseguinte, um candidato interessante para a produção por engenharia genética.
Um certo numero de variantes naturais da hirudina foram identificadas e designadas por HV1 , HV2 e HV3, Por consequên cia, estas variantes naturais assim como outras anãlogas foram pre paradas por engenhar ia genética em diversas células hospedeiras, como a que estã descrita por exemplo nas publicações europeias de pa tente de invenção EP-A-0200655, EP-A-027380Q em nome da Requerente. A comparação da hirudina sintetizada pela Escherichia coli (E. coli) e por uma levedura do gênero S, cerevisiae
demonstrou que a hirudina sintetizada por E. coli permanece intracelular e deve, por conseguinte, ser purificada a partir de um grande numero de polipeptidos de E, coli, Γ, por conseguinte, particularmente interessante poder fazer-se exprimir um gene de hirudina na levedura de modo a obter-se uma hirudina se gregada sob a forma madura e sem que a levedura produza substan cias pirogénicas ou tóxicas para o homem.
A presente invenção aplica-se portanto a todas as moléculas de hirudina, quer dizer, variantes naturais da hirudina tal e qual ou tendo sofrido uma ou várias mutações conservando sempre a sua actividade antitrombõtica sendo este ultimo tipo de variante chamado análoga. Os exemplos seguintes dizem mais particularmente respeito ao análogo designado por rHV2Lys47 (por recombinante variante HV2 tendo sofrido uma mutação do aminoãci_ do Asp na posição 47 em aminoácido Lysí, descrito na publicação da patente de invenção europeia EP-A-0273800 já referida.
A presente invenção diz igualmente respeito ã produção de defensinas. As defensinas, também chamadas formicinas, são péptidos originalmente extraídos da hemolinfa de certos insectos, os Dípteros, que têm uma actividade bactericida sobre os germes Gram-positi vos. Estas defensinas são mais amplamente des critas no pedido de patente de invenção europeia EP—A-349451, A defensina A ê um pêptido básico tendo por sequência Ala Thr Cys
Asp Leu Leu Ser Gly Thr Gly IIe Asn His Ser Ala Cys Ala Ala His
Cys Leu Leu Arg Gly Asn Arg Gly Gly Tyr Cys Asn Gly Lys Gly Vai
Cys Vai Cys Arg Asn, A defensina B apenas difere da defensina A pelo aminoácido na posição 32 onde uma arginina substitui uma
glicina.
Os exmplos seguintes permitirão demonstrar outras cara£ terísticas e vantagens da presente invenção. Estes exmeplos se rão ilustrados pelas seguintes figuras:
- a figura 1 representa a estrutura esquemática do pla_s mTdeo pTG2958.
- a figura 2 representa a estrutura esquemática dos vec tores M13TG3839 e M13TG3841. Para M13TG3839 os quadros tracejados nas extremidades correspondem a M13TG103 e para M13TG3841 a M13TG3149
- a figura 3 representa a estrutura esquemática do vector M13TG3845, 0 quadro tracejado: corresponde a
M13TG3149.
- a figura 4 representa a estrutura esquemática do pias mTdeo pTG3828.
- a figura 5 representa a estrutura esquemática do pias mTdeo pTG3864.
EXEMPLO 1: Construção dos vectores de exoressão da Fiirudina:
PTG3864, pTG3867, pTG3894 e pTG3884.
A. Construção do vector M13TG3845
plasmídeo pTG2958 (figura 1} é pouco diferente do plasmídeo pTG1 833 descrito na publicação europeia da patente de invenção EP-A-252854 portador da sequência que codifica para rHV2Asp47. 0 plasmídeo pTG2958 não contêm o sítio de restrição HindIII artificialmente introduzido. 0 plasmídeo pTG2958 contém:
- um fragmento de 1217 pares de bases correspondendo a região 5' do gene MF<xl (contendo o promotor, a sequência que codifica para o péptido sinal, a região pro e uma sequência que codifica para o péptido Lys-Arg) e 4 pares de bases (sítio BglΓΙ° , tratamento por Klenow) ,
- um fragmento de 234 pares de bases contendo o ADN corp plementar de rHV2Lys47,
- um fragmento de 243 pares de bases comportando o ter minador PGK de levedura,
- o fragmento Pvu II-EcoRI de pBR322 compreendendo entre outras a origem de replicação deste plasmídeo e o gene da resistência a ampicilina (2292 pares de b^a ses),
- o fragmento EcoRI-Hind III do plasmídeo 2da levedura (forma B}, contendo o gene LEU2 de levedura, sob a forma eliminada e inserido no sítio PstI ,
- um fragmento Hind III-Sma I do gene URA3 de levedura, fragmento Ncol-Ncol do vector pTG2958 que comporta as sequências LEU2-d, 2jj e URA 3 é substituído pelo fragmento Ncol-Ncol de pTG2800 descrito na publicação europeia da patente de inven. ção EP-A-0268501 que comporta as sequências do plasmídeo 2^u e do gene URA3 de que se eliminou o seu promotor (URA3-d) para se obter o pTG2877.
vector M13TG3839 (figura 2) deriva do M13TG103 /Kieny, Μ. P. e colab. (1983) Gene 26, 91-997 no qual o fragmento HindlII-HindlII do ptG2877 e introduzido no mesmo sítio. Um sí tio de restrição Sall e introduzido neste vector a jusante do codão de terminação da tradução da região que codifica para rHV2 Lys47 mediante mutagenese orientada com a ajuda do seguin te oligonucleotido:
5' CAATGAAAAATGGTCGACTATCAATCATAG para se obter o M13TG3839 Sall. Introduz-se então um sítio Sphl a montante da cassete de expressão eliminando a sequência URA3-d mediante mutagenese orientada com a ajuda do oligonucleotido seguinte:
5' GACGGCCAGTGAATTGGCATGCTATTGATAAGATTTAAG para se obter o M13TG384Q.
vector M13TG131 /kieny Μ, P, e colab, (1983) Gene 26, 91-997 θ clivado pela PstI, as extremidades tornadas livres mediante tratamento com o fragmento Klenow da ADN polimerase I para ser, em seguida, .religado a si mesmo para se obter o
Ml3TG3160. Este vector ê, em seguida, clivado por Smal e EcoRI e depois religado para se obter o M13TG3149, fragmento Sphl-Sall do M13TG384Q (descrito antes) com portando a cassete de expressão de rHV2Lys47 (sem sequência ter minadora da transcrição) ê introduzido no sítio Sphl-Sall de M13TG3149 para se obter o M13TG3841 (figura 2).
A sequência que codifica os aminoácidos na posição 3 a 42 sobre o fragmento pro do precursor de MF<xl ê eliminada do Ml3TG3149 mediante mutagênese dirigida e um sítio de restrição Smal introduzido utilizando o seguinte oligonucleotido:
5' CTCCGCATTAGCTGCTCCCGGGTTATTGTTTATAAAT, para se obter o que se chama na descrição seguinte uma sequência pro.cortada.
Obtêm-se deste modo o M13TG3842, Um sítio de restrição BamHI destruindo o ATG do precursor do factor ê introduzido neste vector mediante mutagênese orientada com o seguijn te oligonucleotido:
' AATATAAACGATTAAAAGGATCC.GATTTCCTTCAATTTTTA
Obtêm-se então o M13TG3843. ApÕs fosfori1 ação, os se guintes oligonucleotidos:
5' GATCCGTTTCTCTACTACAGTCGCTACTGCAGCTACTGCGCTATT
GCAAAGTGATGATGTCAGCGATG 5' e
5' TTTCACAGCCTCCCAAGTTTCAGCTGCTCCC
ACGTCGATGACGCGATAAAAAGTGTCGGAGGGTTCAAAGTCGACGAGGG 5
-21/ são inseridos no vector M13TG3843 cortado por BamHI e Smal introduzindo assim a sequência de formula XI, portanto sem ATG,
De modo a restaurar o ATG, o sítio BamHI Õ eliminado mediante mutagenese orientada utilizando o seguinte oligonucleotido:
51 AATATAAACGATTAAAAGAATGCGTTTCTCTACTACAGTC para se obter o vector M13TG3845 (figura 3) que comporta:
- o promotor do gene MF<X1, seguido de um cõdão ATG, como fragmento a) ,
- a sequência XI como fragmento b),
- a sequência pro de que se elimina o gene MFo<l, se guida dos codãos que codificam para Lys-Arg como frag mento b1) ,
- a sequência que codifica para rHV2 Lys47 como fragmento c) ,
- uma parte do vector M13TG3149.,
B. Construção do plasmídeo pTG3864 plasmídeo pTG848 descrito na publicação europeia da patente de invenção EP-A-0252854 ê digerido por Bgl II e depois religado para se obter o pTG2886. 0 grande fragmento HindlII-EcoRI do pTG2886 liga-se na presença da ligase T4 ao fragmento HindIII-EcoRI de 2,1 Kb do plasmídeo pFLl £Parent, S.A, e colab. (1985) Yeast 1, 83-138/ que transporta a sequência do plasmídeo 2 u de S. cerevisiae para se obter o plasmídeo
pTG2886 LEU2-d ,URA3-d. 0 fragmento HindIII de 0,9 Kb do plasmídeo pTG2800 descrito na publicação europeia da patente de i£ venção EP—A—0258501 comportando o gene URA3-d ê então inserido no sítio HindIII deste plasmídeo para se obter o pTG2886URA3-d, delta L E U 2 - d . 0 fragmento Smal-BglII do M13TG131 Zki eny e co lab. (1983) Gene 26, 91-997 que possui vãrios sítios de restrição é, em seguida, introduzido neste plasmídeo para se obter o pTG3828 (figura 4) que comporta:
- a sequência do gene URA3 de que se eliminou o seu pro motor (U RA3-d) ,
- sítios de restrição provenientes do M13TG131 permitir^ do a inserção dos elementos da expressão de um gêne heterologo, rHV2Lys47 no caso presente,
- o terminador da transcrição do gêne PGK de levedura,
- um fragmento do pBR322 que permite a replicação e a selecção na E. coli,
- um fragmento do plasmídeo 2μ que possui os elementos estruturais necessários para a replicação e a equipartição mitõtica na levedura, fragmento Sphl-SalI do vector M13TG3845 (figura 3) é introduzido no plasmídeo pTG3828 digerido por Sphl e Sall pa. ra se obter o vector de expressão pTG3864 Qf.igura 5),
C. Construção do vector de expressão pTG3867
Para suprimir completamente a sequência que codifica pg z
ra o precursor do gene MFodl efectua-se uma mutagenese orientada sobre o M13TG3845 (figura 3) com o seguinte oligonucleotido:
5' GCCTCCCAAGTTTCAGCTATTACGTATACAGACTGC para se obter o vector M13G3846. 0 fragmento Sphl-SalI deste vector ê introduzido no plasmídeo pTG3828 (figura 4) digerido por Sphl e Sall para se obter o vector de expressão pTG3867 , Neste vector, a sequência XI e a que codifica para rHV2Lvs47 são adjacentes.
Para se obter a estrutura esquemática deste plasmTdeo, ê suficiente, na figura 5, retirar a sequência pro de que se eliminou M F<xl .
D. Construção do vector de expressão pTG3894
Um sitio Smal ê criado na sequência que codifica para o fragmento pro do precursor do factor mediante mutagénese orientada sobre o M13TG3841 (figura 2] graças ao seguinte oligo nucleotido:
5' TCCGCATTAGCTGCTCCCGGGAACACTACAACAGAA para se obter o M13TG3869Este vector é em seguida digerido por Sphl e Smal e o pequeno fragmento e isolado e ligado ao grag de fragmento Sphl e Smal de M13TG3845 (figura 3) para se obter o vector M13TG3891. 0 fragmento Sphl-SalI deste vector ê intro duzido no plasmídeo pTG3828 (figura 4) aberto nos sítios Sphl
-24e Sal I para se obter o vector de expressão pTG3894 que comporta, portanto, a sequência pro do precursor do factor muta^ do. Para se obter a estrutura esquemática deste plasmTdeo, bas ta substituir na figura 5 a sequência pro de que se eliminou MF^l pela sequência pro mutada.
E. Construção do vector de expressão pTG3884
A sequência XI ê modificada mediante mutagénese orientada sobre o M13TG3845 uti1izandooseguinte oligonucleõtido:
5' GTTTCTCTACTACACTCGCTACTGC
A modificação de uma so base dã a sequência XII e induz a substituição de uma valina por uma leucina como aminoaci_ do representado pelo símbolo R^ do peptido sinal. Obtém-se de£ te modo o bacteriofago M13TG3846, 0 fragmento Spbl-Sal I do
M13TG3846 é introduzido no plasmídeo pTG3828 (figura 4) aberto nos sítios Sphl e Sall para se obter o vector de expressão pTG3884 que comporta:
- a sequência do gene URA3 do que se eliminou o seu promotor (URA3-d),
- o promotor do gene MFc^l , seguido de um codão ATG, co mo fragmento a) ,
- a sequência XII, como fragmento bj,
-25- a sequência pro de que se eliminou o gene MF;<1 , seguida dos codãos que codificam para Lys-Arg, como fragmento b 1 ) ,
- a sequência que codifica para rHV2Lys47 como fragmeri to c) ,
- o terminador do gene que codifica para PGK da leved£ ra,
- um fragmento do pBr322,
- um fragmento do plasmídeo 2μ,
EXEMPLO 2: Produção de rHV2Lys47 no sobrenadante da cultura em função do plasmídeo utilizado
Uma estirpe de levedura da espécie Saccharomyces cere visiae de genotipo MAT°4, ura3-251, -373, -328, meu2-3, -112, his3, pep4-3 é transformada pelos plasmídeos pTG3864, pTG3867, pTG3894 e pTG3884 pelo método do acetato de lítio £lto, H, e colab. ( 1 983 ) J. Bacteriol, 1 537 e sei ecci onam-^se os prototr£ pos Ura+. Cultivam-se, em seguida, em erlenmeyer a 30°C em meio selectivo (0,7% de bases azotadas para leveduras (Yeast Nitr£ gen Base), 0,5% de ãcidos casamínicos e 1% de glucose). Depois de 48 horas de cultura, separam-se as células e o sobrenadante mediante centrifugação e determina-se a actividade inibidora da trombina no sobrenadante utilizando o teste colorimêtrico (actividade proteolítica sobre um substrato sintético), a cro-26mozima TH-Boehringer Mannheim). 0 quadro I apresenta os tados dos doseamentos; cada valor corresponde a media de experiências independentes. A actividade de rHV2Lys47 ê sa em ATU/ml de sobrenadante.
duas expres
Quadro I
PIasmídeo | ATU/ml |
pTG3894 | 4Q |
pTG3864 | 50 |
PTG3867 | 130 |
pTG3884 | 125 |
Em todos os casos determina-se uma actividade anti-trom bina. A proteína rHV2Lys47 produzida pela levedura ê, portanto, excretada no sobrenadante. Alêm disso, e segregada na forma activa. Os melhores resultados são obtidos com as estirpes transformadas pelo pTG3884 e pTG3867.
conteúdo em proteína dos sobrenadantes analisa-se me diante HPLC. 0 pico maior obtido corresponde então ao da rHV2Lys47 (na sua forma de 65 aminoãcidos) e a determinação da sequência N-terminal confirma a obtenção de uma molécula correctamente sintetizada.
EXEMPLO 3: Construção de um vector de expressão da defensina A de insectos: pTG4826
A. Síntese de uma sequência de ADN que codifica para a defensina A de insecto.
A síntese faz-se em dois blocos reunidos graças ãs suas extremidades coesivas Kpnl. 0 primeiro bloco comporta 3 oligonucleotidos numerados de 1 a 3 e o segundo bloco, 6 oligonucleo. tidos numerados de 4 a 9. A sua sequência e a posição dos oligonucleotidos (última linha do quadro; os círculos representam' a parte 5' do oligonucleotido) são dados no quadro II.
QUADRO II
no | Sequência |
1 | 5 1 AGCTTGGACAAGAGAGCTACCTGTGACTTGTTGTCCGGTAC |
2 | 5' GGTAGCTCTCTTGTCCA |
3 | 5' CGGACAACAAGTCACA |
4 | 51 CGGTATTAACCACTCCGCTTGTGCTGCTCACTGTTTGTTG |
5 | 5' AGCACAAGCGGAGTGGTTAATACCGGTAC |
6 | 5' AGAGGTAACAGAGGTGGCTACTGTAACGGTAAGGGTGT |
7 | 5' AGTAGCCACCTCTGTTACCTCTCAACAAACAGTGAGC |
8 | 5* TTGTGTTTGTAGAAACTAAGGATCCG |
9 | 51 AATTCGGATCCTTAGTTTCTACAAACACAAACACCCTTACCGTTAC |
1 4 6 8 3 0- 0_ 0_ | |
0 0 0 o 2 3 5 7 9 |
-28A sequência obtida é a seguinte:
HindlII | + 1 | Kpnl | 10 | |||||||||||
AGC | TTG | GAC | AAG | AGA | GCT | ACC | TGT | GAC | TTG | TTG | TCC | GGT ACC | GGT ATT | AAC |
Ala | Thr | Cys | Asp | Leu | Leu | Ser | Gly Thr | Gly Ile | Asn | |||||
CAC | TCC | GCT | TGT | GCT | GCT | CAC | 20 TGT | TTG | TTG | AGA | GGT | AAC AGA | GGT GGC | TAC |
Hi s | Ser | Ala | Cys | Ala | Ala | Hi s | Cys | Leu | Leu | Arg | Gly | Asn Arg | Gly Gly | Tyr |
30 | 40 | BamHI- | EcoRI | |||||||||||
TGT | AAC | GGT | AAG | GGT | GTT | TGT | GTT | TGT | AGA | AAC | TAA | GGATCCG | ||
Cys | As n | Gly | Lys | Gly | Vai | Cys | Vai | Cys | Arg | Asn |
A síntese do primeiro bloco utiliza os oligonucleotidos
4,5,6,7,8 e 9 e efectua-se do seguinte modo:
- fosforilam-se inicialmente os oligonucleotidos 5,6,7 e 8 na sua extremidade 5' para evitar a formação de po límeros durante a reunião. Para cada um destes oligonucleotidos, tratam-se 100 picomolescom a pol i nucl eoti_ do-quinase, 2 unidades em um volume final de 20 jjl de Trys HC1 60 de pH 7,5; 10 de MgCl 2; 8jjM de ditiotreitol (tampão de quinação) contendo 3,3 picomoles 32 de ATP^ç· marcado com P (5000 Ci/nimole). Apos 15 minutos de incubação a 37°C, adicionam-se 5 jumoles de ATP não marcado.
- apõs incubação a 37°C durante 30 minutos, misturam-se 75 picomoles dos oligonucleotidos 5,6,7 e 8 e aquece-se a 95°C durante 3 minutos; adicionam-se, depois ,
os oligonucleotidos 4 e 9 em um volume final de 90 yjmo les de tampão de quinação descrito antes, Aquece-se o conjunto a 95°C durante 3 minutos e arrefece-se, depois, lentamente no decurso de duas horas a 37°C,
- submetem-se 25 picomoles destes oligonucleotidos hibridados ao tratamento com a ligase durante uma hora a 15°C. Adiciona-se , em seguida, esta mistura reaccional (1 picomole) a 50 ng do bacteriõfago M13TG131 Zkieny M, P. e colab. (1983) Gene 26, 91-99/ tratado com EcoRI e Kpnl (durante 1 hora a 15°C), A mistura de ligação uti_ liza-se para transformar as células competentes da estir pe E. coli JM103 /Messing J, e colab, (1981), Nucleic Acid Res. 9 , 309/. Isola-se um clone apresentando a sequência pretendida e chama-se-lhe M13TG3821.
A síntese do segundo bloco utiliza os oligonucleotidos 1, 2 e 3 e efectua-se de acordo com o processo descrito para a síntese do primeiro bloco. Neste caso, sõ o oligonucleotido 2 ê fosforilado na sua extremidade 5'.
Este segundo bloco e clonado entre os sítios HindIII e Kpnl do bacteriõfago M13TG3821 e isola-se um clone comportando a sequência de ADN que codifica para a defensina A (figura 5) , chama-se-lhe M13TG3849.
B. Construção do plasmídeo para a expressão da defensina A: pTG4839
fragmento Sphl-Smal de 1045 pares de bases do bacteriofago M13TG3846 descrito anteriormente (Exemplo 1, E.) é tran£ ferido para o vector M13TG3869 descrito anteriormente (Exemplo 1, D.) previamente digerido por Sphl e Smal, Obtêm-se, deste modo, o vector M13TG4803 que comporta:
- o promotor do gene MF^l, seguido de um codão ATG ,
- a sequência XII,
- a sequência pro mutada do gene MFfcd seguida dos cõ dãos que codificam para Lys-Arg,
- a sequência que codifica para rHV2Lys47,
Com o objectivo de substituir a sequência que codifica para rHV2Lys47 pela que codifica pára'a defensina A de insecto intro duz-se um sitio HindIII na sequência que codifica para pro mu tada de MF^í1 com o oligonucleotido de sequência;
5' GAAGGGGTAAGCTTGGATAAA
Introduz-se, depois, o fragmento· Hi nd 111-BamHI de M13TG3849 descrito antes (Exemplo 3,A.) que comporta a sequência ϊ sintética que codifica para a defensina A neste vector previamen te tratado com HindIII e BamHI para eliminar a sequência que co difica pata rHV2Lys 47.
Introduz-se o fragmento Sphl-SalI do M13TG4813 no plasmídeo pTG3828 (figura 4) aberto nos sítios Sphl e Sall para se obter o vector de expressão pTG4839 que comporta:
-31- a sequêucia do gene URA3 de que se eliminou o seu promotor (URA3-d),
/
- o promotor do gene MF^dl , seguido e um ATG,
- a sequência XII
- a sequência pro mutada do gene MF^l seguida dos co does que codificam para Lys-Arg,
- a sequência sintética que codifica para a defensina A de insectos,
- o terminador do gene que codifica para PGK da levedu ra,
- um fragmento de pBR322,
- um fragmento do plasmídeo 2 p,
EXEMPLO 4: Produção de defesina A no sobrenadante de cultura
Transforma-se uma estirpe de levedura da espécie Saccharomyces cerevisae de genotipo MAT<^, ura3-251, -378, -328 , -leu2-3, -112, his3, pep4-3 com o plasmídeo pTG4839 pelo méto do do acetato de lítio fito, H. e colab, J, Bacteriol, (1983) 1 537 e seieccionam-se os prototrofos Ura+.Cul tivam-se, em seguida, em erlenmeyer a 30°C sobre um meio selectivo (0,7% de bases azotadas para leveduras (Yeast Nitrogen Base), 0,5 de ácidos casamínicos e 1% de glucose), Depois de 48 horas de cultura , separam-se as células e 0 sobrenadante mediante centrifugação e
-32/
filtra-se o sobrenadante sobre um filtro de 22 Ji e passa-se , depois, sobre um cartucho Sep-Pak C18, Elui-se o material fixado com 60% de acetonitrilo, 0,1% de acido trif1uoroacetico em agua e seca-se sobre vazio. Demonstra-se, em seguida, a acti_ vidade antibacteriana da defensina A pelo teste de exposição sobre agarou sobregelose semeada com germes bacterianos (Micrococcus luteus) de acordo com o processo descrito por Lambert e colab,
989 ZPNAS'86, 262-2667.
No sobrenadante das leveduras transformadas pelo plasmídeo pTG4839 detecta-se efectivamente uma actividade antibacte riana. A proteína defensina A produzida pela levedura ê, por conseguinte, excretada no sobrenadante. Alem disso, ê segregada sob forma activa.
Analisa-se o conteúdo em proteína dos sobrenadantesmediante HPLC. 0 pico maior obtido corresponde então ao da defeji sina A de insecto e a determinação da sequência da proteína confirma a obtenção de uma molécula correctamente sintetizada,
Claims (19)
1.- Processo de secreção de uma proteína heteróloga por uma célula hospedeira, caracterizado pelo facto de, na qualidade de sequência sinal para a secreção da referida proteína heterõloga, se utilizar um fragmento de ADN isolado que codifica para um peptido cuja sequência de aminoácidos apresenta um grau de homologia de pelo menos 60% com a sequência de aminoácidos de fórmula
I ou II:
(I) Arg-Phe--Ser-Thr-Thr-Leu-Ala-Thr-Ala-Ala-Th.r-Ala-Leu-?he-?he-Thr-Ala-Ser-Gln e
II) Arg-Phe-Ser-Thr-Thr-Leu-Ala-Thr-Ala-Ala-Thr-Ala-Leu-Phe-Pne-Thr-Ala-Ser-Gln-Val-Ser-Ala.
2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o fragmento de ADN codificar para um péptido cuja sequência de aminoácidos apresenta um grau de homologia de pelo menos 30% com a sequência de aminoácidos de fórmula I cu
II:
(I) Arg-Pne-Ser-Thr-Thr-Leu-Ala-Thr-Ala-Ala-Thr-Ala-Leu-Php-Phe-Thr-Ala-Ser-Gln e (II) Arg-Phe-Ser-Thr-Thr-Leu-Ala-Thr-Ala-Ala-Thr-Ala-Leu-Phe-Phe-Thr-Ala-Ser-Gln-Val-Ser-Ala.
3. - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 7, caracterizado pelo facto de o fragmento de ADN codificar para um péptido comportando a sequência de aminoácidos de fórmula geral (III) R^-Rg-Rg-Thr-Thr-R^-Ala-Thr-Ala-Ala-Thr-Ala-Leu-Phe15 10
-Phe-Thr-Ala-R_-R□ 0
15 19 na qual
R^ representa um aminoácido seleccionado entre Arg e Lys,
Rg e Rg representam, cada um, um aminoácido seleccionado de maneira independente entre Ala, Asn, Cys, Gin,
Gly, Kis, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Tyr e Vai, Rg e R^ representam, cada um, um aminoácido seleccionado de maneira independentemente entre Asp, Gly, Asn,
-35Pro e Ser e
R^ representa um aminoácido seleccionado entre Vai,
Leu., Ala, Cys, Phe, Ile e Met.
4. - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo facto de o fragmento de ADN codificar para um pêpti. do que compreende a sequência de aminoãcidos de fórmula geral (IV) R1-R2-R3-Thr-Thr-R4-Ala-Thr-Ala-Ala-Thr-Ala-Leu-Phe-Phe-Thr-Ala-Rc-Rr-R_ □ D / na qual
R1 representa um aminoácido seleccionado entre Arg e Lys,
R2 e Rg representam, cada um, um aminoácido seleccionado de maneira independente entre Ala, Asn, Cys, Gin,
Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr e Vai,
Rg e Rg representam, cada um, um aminoácido seleccionado de maneira independente entre Asp, Gly, Asn, Pro e
Ser,
R^ representa um aminoácido seleccionado entre Vai,
Leu, Ala, Cys, Phe, Ile e Met e
Ry representa uma sequência de proteólise.
5. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracteriza do pelo facto de o símbolo R^ representar uma sequência de pro-36- teõlise de fórmula geral Rg-Rg-R^g na qual
Rg representa um aminoácido seleccionado entre Ala, Vai, Ser, Cys, Ile, Leu, Thr,
Rg representa um aminoácido seleccionado entre Ala, Arg, Cys, Gin, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tvr e Vai e
R^g representa um aminoácido seleccionado entre Ala, Cys, Gly, Leu, Pro, Gin, Ser e Thr.
6.- Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, carac » * _ terizado pelo facto de o fragmento de ADN codificar para um péptido que compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada entre as sequências de aminoácidos de fórmula V e VI (V) Arg-Phe-Ser-Thr-Thr-Leu-Ala-Thr-Ala-Ala-Thr-Ala-Leu-Phe-Phe-Thr-Ala-Ser-Gln (VI) Arg-Phe-Ser-Thr-Thr-Val-Ala-Thr-Ala-Ala-Thr-Ala-Leu-Phe-Phe-Thr-Ala-Ser-Gln.
7.- Processo de acordo com uma das reivindicações 1, 2,
4 e 5, caracterizado pelo facto de o fragmento de ADN codificar para um péptido que compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada entre as sequências de aminoácidos de fórmula VII e
VIII (VII) Arg-Phe-Ser-Thr-Thr-Leu-Ala-Thr-Ala-Ala-Thr-Ala-Leu
-Phe-Phe-Thr-Ala-Ser-Gln-R^ na cual Ry representa una sequência de proteólise;
(VIII) Arg-Phe-Ser-Thr-Thr-Val-Ala-Thr-Ala-Ala-Thr-Ala-Leu-Phe-Phe-Thr-Ala-Ser-Gln-R.?
na qual R^ representa una sequência de proteólise.
8. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de o fragmento de ADN codificar para um péptido que compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada entre as sequências de aminoácidos de fórmula geral VI e VIII em que o símbolo R^ representa Val-Ser-Ala.
9. - Processo para a secreção de uma proteína heterõloga por uma célula hospedeira, caracterizado pelo facto de se transformar uma célula hospedeira com uma cassete de expressão que compreende pelo menos:
a) um fragmento de ADN que comporta sinais de iniciação de transição e de tradução;
b) um fragmento de ADN tal como definido nas reivindi cações 1 a 8; e
c) um fragmento de ADN que codifica para a proteína heterõloga madura, ou por um vector plasmídico que comporta a referida cassete de expressão, de se cultivar a célula assim, transformada e de se re cuperar a referida proteína no meio de cultura.
10. - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de se incluir além disso um fragmento de ADN b1) que codifica para um fragmento peptídico pro.
11. - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de se incluir um fragmento de ADN b') que codifica para um fragmento peptídico pro tendo por sequência Ala,
Pro, Gly, Leu, Leu, Phe, Ile, Asn, Thr, Thr, Ile, Ala, Ser, Ile, Ala, Ala, Lys, Glu, Glu, Gly, Vai, Ser, Leu, Asp, Lys, Arg.
12. - Processo de acordo com uma das reivindicações 10 ou 11, caracterizado pelo facto de o fragmento a) comportar um promotor funcional na célula de levedura e um codão de iniciação de tradução ATG.
»
13.- Processo de acordo com uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo facto de o fragmento de ADN c) codificar para uma hirudina.
14.- Processo de acordo com uma das reivindicações 10 a
13, caracterizado pelo facto de o fragmento de ADN c) codificar para a variante hirudina rHV2Lys47.
15.- Processo de acordo com uma das reivindicações 10 a
14, caracterizado pelo facto de o fragmento de ADN c) codificar para uma defensina de insectos.
16. - Processo de acordo com uma das reivindicações 10 a 15, caracterizado pelo facto e o fragmento de ADN c) codificar para a defensina A.
17. - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de o referido vector plasmídico comportar um fra£ mento de plasmídeo 2 u de levedura.
/
18. - Processo de acordo com a reivindicação 9 ou 17, carac terizado pelo facto de o referido vector plasmídico comportar como gene de selecção, o gene URA3 deletaco do seu promotor.
19. - Processo de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de a célula ser uma célula de levedura.
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