JP2590247B2 - スブチリシンアナログ - Google Patents

スブチリシンアナログ

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JP2590247B2 JP63503622A JP50362288A JP2590247B2 JP 2590247 B2 JP2590247 B2 JP 2590247B2 JP 63503622 A JP63503622 A JP 63503622A JP 50362288 A JP50362288 A JP 50362288A JP 2590247 B2 JP2590247 B2 JP 2590247B2
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は新規類の熱安定性及びpH安定性スブチリシン
アナログ及び該アナログの製造方法に係る。特に、本発
明は改良されたカルシウム結合能力を提供する修飾され
たカルシウム結合部位を有しており、場合によってはス
ブチリシン中に存在するAsn−Gly配列のいずれかの残基
が欠失及び／又は置換されているような類のスブチリシ
ンアナログに係る。本発明は更に、このようなスブチリ
シンを含有する洗剤組成物、並びにこのようなスブチリ
シン及び組成物の洗浄用としての使用に係る。
スブチリシンなる用語は各種のバチルス（Bacillus）
種により産生される細胞外アルカリセリンプロテアーゼ
の群を表す。これらの酵素はBacillusセリンプロテアー
ゼ、Bacillusスブチリシン又は細菌アルカリプロテアー
ゼとも呼称される。
Bacillusスブチリシン分子は274個の残基（Bacillus
licheniformisにより産生されるCarlaberg型のスブチリ
シン及びBacillus substilisDY株により産生されるスブ
チリシンの場合）、又は275個の残基（Bacillus amylol
iquefaciensにより産生されるBPN′型のスブチリシン、
Bacillus subtilisのapnA遺伝子生成物、及びBacillus
mesentericusのスブチリシンの場合）のいずれかの単一
ポリペプチド鎖から構成される。本文中で異なるBacill
us株からのスブチリシンのアミノ酸配列を比較する場
合、BPN′スブチリシンの配列が標準として使用され
る。例えば、Carlsbergスブチリシン及びBPN′スブチリ
シンの間に最高の相同度を与える配列の整列に基き、前
者の活性部位のセリンはアミノ酸配列の220位に位置す
るにも拘わらずセリン221と呼称される。同一の基準に
基づいて、Carlsbergスブチリシンのアミノ酸配列の220
位はBPN′スブチリシンの221位に「対応する」というこ
とができる（例えばNedkov他、Hoppe−Seylen's Z.Phys
iol.Chem.,364,1537−1540（1983））。
BPN′スブチリシンのＸ線構造［Wright他、Nature，2
21,235（1969）］によると、Asp32、His64及びSer221を
含むスブチリシンの触媒部位の形状は、残基Asp102、Hi
s57及びSer195を含む哺乳動物セリンプロテアーゼ（例
えばキモトリプシン）の活性部位の形状とほぼ同一であ
る。一方、Bacillusセリンプロテアーゼと哺乳動物セリ
ンプロテアーゼとは全体的に相異しているので、これら
は２つの無関係なタンパク質分解酵素の族であると言え
る。
Bacillusスブチリシンの族において、完全なアミノ酸
配列は５種のスブチリシン、即ちCarlsberg［Smith他、
J.Biol.Chem.,243,2184−2191（1968）］、BPN′［Mark
land他、J.Biol.Chem.,242,5198−5211（1967）］、apr
A遺伝子生成物［Stahl他、J.Bacteriol.,158,411−418
（1984）］、DY［Nedkov他、前出文献］及びBacillus m
esentericus［Svendsen他、FEBS Letters，196,220−23
2（1986）］で得られる。CarlsbergスブチリシンとBP
N′スブチリシン（別称Novoスブチリシン）とは、84個
のアミノ酸及びBPN′の追加の１個の残基が異なる（Car
lsbergスブチリシンはBPN′スブチリシンの残基56に対
応するアミノ酸を欠失している）。DYスブチリシンは27
4個のアミノ酸を含んでおり、Carlsbergスブチリシンと
は32個のアミノ酸位置が異なり、BPN′とは82個のアミ
ノ酸置換及び１個の欠失が異なる（DYスブチリシンはBP
N′スブチリシンの残基56に対応するアミノ酸残基を欠
失している）。arA遺伝子生成物のアミノ酸配列はBPN′
スブチリシンのアミノ酸配列と85％の相同度を有する。
このように、各種のBacillus株からのスブチリシンのア
ミノ酸配列の間には広範な相同性があると思われる。こ
の相同性は分子の所定の領域、特に触媒メカニズム及び
基質結合の役割を果たす領域で完全である。このような
配列不変性の例は一次及び二次基質結合部位夫々Ser125
−Leu126−Gly128及びTyr104、並びに反応性セリン（22
1）の周囲の配列Asn218−Gly219−Thr220−Ser221−Met
222−Ala223である。
スブチリシン分子は独特の安定性を示す。スブチリシ
ンは広いpH範囲にわたって完全に安定ではないが、尿素
及びグアニジン溶液による変質に対して比較的耐性であ
り、それらの酵素活性は8M尿素中でしばらく保持され
る。４未満のpHを有する溶液中でスブチリシンは迅速且
つ不可逆的にそのタンパク質分解活性を失う。Gounaris
他、Compt.Rend.Trav.Lab.Carlsberg，35,37（1965）
は、スブチリシンの酸失活が一般的電荷効果によらない
ことを立証し、分子の内部疎水性部分におけるヒスチジ
ン残基の陽子化のような分子中の他の変化によるもので
あると推測している。Bacillusスブチリシンは水溶液中
で温度及びpHに大幅に依存する速度で不可逆的に失活す
る。pH値が４より低いか又は11より高いと、失活速度は
非常に迅速であり、pHが4.5〜10.5では該速度は著しく
緩慢ではあるが、溶液のアルカリ度が増加するに従って
増加する。この失活のメカニズムは十分には解明されて
いないが、このpH範囲の酵素不安定性の少なくとも一部
には自己消化が関与していることを示す証拠がある。一
般に、どのようなpH値であっても温度が高いほどスブチ
リシン失活速度は速い。
タンパク質の加水分解を必要とする工業的プロセスに
おけるプロテアーゼの使用は、操作条件下の酵素の不安
定姓により制限されている。従って、例えばタンパク質
の染みを除去し易くするために洗濯用洗剤（例えばスイ
ス国Schnyder,ZBio−38）にトリプシンを導入する試み
は、非常に制限された成果しか得られず、これは確実に
洗濯条件下の酵素不安定の結果であった。更に、洗剤に
適合性の細菌アルカリプロテアーゼが洗剤配合物中で使
用されている。
多くの工業的ウロセスはほとんどの酵素の安定性の範
囲よりも高い温度で実施されるので、熱安定性の高いプ
ロテアーゼは既に安定なプロテアーゼを必要とする洗剤
及び皮革脱毛のようなある種の産業分野で有利であるの
みならず、例えば濃縮スープの製造のための植物及び動
物タンパク質の加水分解のようにタンパク質を分解する
ために化学的手段を使用する産業でも有用であり得る。
熱失活は酵素の工業的使用を制限する最も重要な因子
であり得るが、広いpH範囲にわたる効力の必要性及び変
性剤の使用といった他の因子も工業的プロセスにおける
プロテアーゼの使用に関して不利な効果を及ぼし得る。
従って、各種の産業に必要な温度、pH変性剤及び他の条
件に関して改良された安定性を有する類のプロテアーゼ
を得ることが望ましい。
過去数年間にわたって洗剤配合物には大きな変化があ
り、特にリン酸塩の代わりに別のビルダーが使用され、
環境及び消費者の需要に見合うような液体洗濯用洗剤が
開発されている。このような変化は、従来の洗剤酵素に
も変化の必要をもたらしている。より特定的には、液体
洗濯用配合物中の保存安定性が高く、より広いpH及び温
度範囲で安定性及び活性を有するタンパク質分解酵素を
使用することが望まれるようになった。
洗剤配合物中で有用な修飾されたスブチリシンを製造
する一アプローチはヨーロッパ特許出願第130756号に開
示されており、該文献は、Bacillus amyloliquefaciens
（B.amyloliquefaciens）のスブチリシンのTyr-1、Asp
32、Asn155、Tyr104、Met222、Gly166、His64、Gl
y169、Phe189、Ser33、Ser221、Tyn217、Glu156及び／
又はAla152位置に突然変異を誘発すると、安定性の変
化、配座の変更、又は酵素の「処理（processing）」の
変化が生じることを立証している。特に、Met222がAla
又はCys（該突然変異体は野生型よりも最適pH値が優れ
ている）又はSerに突然変異すると、改良された酸化安
定性が得られると主張している。Gly166をAla、Asp、Gl
u、Phe、His、Lys、Asn、Arg又はValで置換すると、酵
素の動力学的パラメーターが変化することが示唆されて
いる。しかしながら、このアプローチに開示された突然
変異では、高温での安定性が野生型酵素よりも大きいか
又は野生型酵素よりも広いpH範囲で安定性を有するアナ
ログは得られない。
別のアプローチによると、Thomas他、Nature，318,37
5−376（1985）は、BPN′スブチリシンのAsp99−Gly100
のAspをSerに置換することによりスブチリシンのpH依存
性を変更できることを開示している。この変化は活性部
位からの14〜15オングストロームの表面電荷の変化を表
す。しかしながらThomas他は、ある非帯電残基を別の残
基で置換する場合のよう表面電荷が変化しないような場
合の改良を示していない。
同時係属中の米国特許出願第819241号に記載されてい
る第３のアプローチは、プロテアーゼ中に存在するAsn
−Gly配列の欠失及び／又は修飾を特徴とするBacillus
セリンプロテアーゼアナログの類に係る。
発明の要約 本発明は、洗剤配合物及び安定なプロテアーゼを必要
とする他のプロセスで特に有用にするために、改良され
たpH及び熱安定性を有することを特徴とするスブチリシ
ンアナログの類を提供する。本発明のスブチリシンアナ
ログは、（１）天然に産生するBacillusスブチリシンの
アミノ酸配列中に存在するカルシウム結合部位の１個以
上のアミノ酸残基を負の電荷を有するアミノ酸で置換
し、（２）天然に産生するBacillusスブチリシンのアミ
ノ酸配列中に存在するAsn−Gly配列のいずれかの残基を
欠失又は置換させることにより修飾された天然に産生す
るBacillusスブチリシンのアミノ酸配列を有することを
特徴とする。本発明は更に、本発明のスブチリシンアナ
ログを含む洗剤組成物、並びにこのようなスブチリシン
アナログ及び組成物の洗浄用としての使用に係る。
本発明のスブチリシンアナログは改良された熱及びpH
安定性、高い比活性及び広い基質特異性を示し、従って
このようなアナログを含有する洗剤配合物の洗浄性を増
加させる。特に、本発明のスブチリシンアナログは「野
生型」のスブチリシンに見いだされるよりも改良された
熱安定性、高いpH安定性及び高い比活性を有する。
更に、本発明は上記スブチリシンアナログをコードす
るコドンを有するDNA配列にも係る。
本発明は更に、上記スブチリシンアナログをコードす
る核酸を有する宿主細胞を含むスブチリシンアナログの
製造方法も提供する。このような細胞において、スブチ
リシンアナログをコードする核酸は染色体又は染色体外
であり得る。宿主細胞は好ましくは本発明のアナログを
容易に単離できるように、分泌されるプロテアーゼを欠
失する株から選択される。
更に、本発明はカルシウム結合部位を修飾し及び／又
はAsn−Gly配列中のアスパラギン、特に第１表に示した
アミノ酸配列の218位に対応するスブチリシンのアミノ
酸配列中の位置のアスパラギン残基をアスパラギン以外
のアミノ酸に置換することにより、スブチリシンの熱及
びpH安定性を改良するための方法を提供する。
図面の簡単な説明 第１図はアンヒドロアスパルチルグリシンを形成する
ために、第１表に示すようなスブチリシンの218及び219
位に見いだされるようなAsn−Gly残基の環化、及びその
塩基触媒による加水分解を示す概略図、第２図はBacill
us subtilis（B.subtilis）株QB127のEcoR I〜Kpn I遺
伝子フラグメントを含むaprA遺伝子の部分制限地図、及
びaprA遺伝子とフランキング配列の部分制限地図、第３
図はプラスミドpAMB11の部分制限地図、第４図はB.Subt
ilis宿主細胞からの［Ser］218−スブチリシンの合成を
導くプラスミドであるpAMB113の構築段階を示すフロー
チャート、第５図はpAMB30プラスミドの部分制限地図、
第６図はpAMB106の構築を示す説明図、第７図はM13 mp1
8 apr4の構築を示す説明図である。
詳細な説明 本文中において、「スブチリシン」なる用語は分泌以
前又は分泌時に成熟酵素から切断されたリーダー配列を
欠失する酵素の成熟分泌型を意味することに留意すべき
である。本発明に従って修飾され得るスブチリシンの非
限定的な例は、Carlsbergスブチリシン、BPN′スブチリ
シン、Bacillus subtilisのaprA遺伝子生成物、DYスブ
チリシン並びにBacillus mesentericusのスブチリシン
のアミノ酸配列により代表される天然に産生するスブチ
リシンである。Carlsbergスブチリシンのアミノ酸配列
はSmith他、J.Biol.Chem.，243,2184−2191（1968）に
より記載されている。BPN′スブチリシンのアミノ酸配
列はMarkland他、J.Biol.Chem.，242,5198−5211（196
7）により記載されている。DYスブチリシンのアミノ酸
配列はNdelov他、Hoppe−Seyler's Z.Physiol.Chem.，3
64,1537−1540（1983）により記載されている。Bacillu
s mesentericusのスブチリシンのアミノ酸配列はSvedse
n他、FEBS Letters，196,220−232（1986）により記載
されている。Bacillus subtilisのaprA遺伝子生成物の
アミノ酸配列はStahl他、J.Bacteriol.，158,411−418
（1984）により記載されている。このようなスブチリシ
ンのアミノ酸配列は参考として本発明の一部とする。こ
のようなスブチリシンは分子を安定化させるために必要
なカルシウム結合部位を有することを特徴とする。
本発明によると、カルシウムに結合する改良された能
力を有する類のスブチリシンアナログが提供される。カ
ルシウムは粉末及び液体洗剤中で、特に高温を必要とす
る用途でスブチリシンを安定化させるために使用されて
いる。本発明はカルシウム結合を増加させるためのスブ
チリシン分子のカルシウム結合部位の修飾にも係る。本
文中において「カルシウム結合部位の修飾」なる用語
は、形成されるスブチリシンアナログに別の負の電荷を
与えるように、スブチリシンのアミノ酸配列中に存在す
るカルシウム結合部位の領域の１個以上のアミノ酸を負
の電荷を有するアミノ酸で置換することを意味する。ス
ブチリシン中のある１つのカルシウム結合部位は、第１
表に示すアミノ酸配列に関連して次のアミノ酸配列:Asp
41、Leu75、Asn76、Asn77、Ser78、Ile79、Gly80、Val
81、Thr208及びTyr214を含むことが認められている。本
発明は好ましくは、カルシウム結合部位に存在するアミ
ノ酸の１個以上を、Asp及びGlu、より好ましくはAspの
ような「負の電荷を有する」アミノ酸で置換するもので
ある。カルシウム結合部位のAsp41は負の電荷を有する
アミノ酸であるが、本発明の一態様はAsp41をGlu41に置
換するものであることに留意すべきである。その他の態
様はAsp41以外ものへの置換に係る。
本発明の一好適態様はAsn76がAsp76に変換されたスブ
チリシンアナログを含む。別の態様はIle79からAsp79へ
の変換を含む。一好適態様はAsn77がAsp77に変換された
スブチリシンアナログを含む。本発明のより好適な態様
は、カルシウム結合部位に上記好適な修飾を施し、且つ
Asn109及びAsn218をSer109及びSer218に置換し、２つの
不安定なAsn−Gly配列を除去する。
上記カルシウム結合部位に加えて、スブチリシンは１
個以上の別のカルシウム結合部位を含み得る。本発明の
請求の範囲はスブチリシン中に存在し得る全カルシウム
結合部位の１個以上の修飾を包含する。修飾され得る特
定のスブチリシン中のカルシウム結合部位の数は多くの
因子、即ち特定のスブチリシン、スブチリシンアナログ
の特定用途に依存する。スブチリシン中に存在し得る他
の重要なカルシウム結合部位としては、（１）Asp140及
びPro172、（２）Pro14及びGln271、並びに（３）Pro
172及びGlu195又はAsp197が挙げられる。各分子中に存
在する特定のカルシウム結合部位は修飾すべき特定のス
ブチリシンに依存する。上述したように、上記可能なカ
ルシウム結合部位におけるアミノ酸の１種以上を置換す
ることにより、改良された熱及びpH安定性を有するスブ
チリシンが得られる。置換の例としては、Asp140をGlu
140、Pro172をAsp172、Pro14をAsp14、Gln271をGl
u271、Glu197をAsp197で置換する例が挙げられる。
スブチリシン分子のカルシウム結合部位の修飾に加え
て、スブチリシン中に存在するAsn−Gly配列を欠失又は
置換させることが好ましい。米国特許出願第819241号に
既に記載されているように、Bacillusスブチリシンの10
9〜110位、特に218〜219位に維持された配列Asn−Gly
は、これらの物質のpH不安定性に関与する主要な因子で
あることが認められている。不安定な成分であるAsn218
−Gly219をスブチリシン分子から除去するために、Asn
218をアスパラギン以外のアミノ酸で置換するか及び／
又はGly219をグリシン以外のアミノ酸に変えることが開
示されている。同様に、109〜110位の不安定なAsn−Gly
成分を修飾することによってもアナログに安定性を与え
ることができることが記載されている。
更に、上述したように、本発明のBacillusスブチリシ
ンのアナログの好適類は、カルシウム結合部位の修飾に
加えて、Bacillusスブチリシン中のAsn−Gly配列を含む
位置でアナログがAsn−Gly配列を含まず、特にBacillus
スブチリシンもりもAsn−Gly配列の数が少ないようなア
ミノ酸配列を有する。最適には、第１表に示すアミノ酸
配列中の218位に対応する位置はアスパラギニル残基を
含まず、別のアミノ酸、好ましくはセリン、バリン、ス
レオニン、システイン、グルタミン及びイソロイシンか
ら選択されたアミノ酸を含んでいる。（例えば芳香族ア
ミノ酸の存在により導入され得る立体障害又はプロリン
の存在により導入され得るような三次構造の変化によ
り）アスパラギンを所定のアミノ酸に置換することによ
り活性部位配座に障害を生じ得る程度まで、このような
アミノ酸で置換することは通常好適でない。同様に、ア
スパラギンを他のアミノ酸で置換することにより帯電基
（例えばアスパラギン酸）が活性部位の近傍に導入され
得る程度まで、このような置換は好ましくない。本発明
の好適な態様の例は修飾されたカルシウム結合部位を有
しており且つスブチリシンのAsn−Gly配列が［Ser218］
で修飾されたアナログである。本発明の企図の範囲内の
アナログの別の態様は、修飾されたカルシウム結合部位
を有しており且つBPN′スブチリシン又はaprA遺伝子生
成物のAsn109が好ましくはセリンにより置換されてお
り、110及び／又は219位のグリシン残基が各種のアミノ
酸残基で置換されているようなアナログである。他のス
ビチリシンでは、カルシウム結合部位の修飾及びCarlsb
erg又はDYスブチリシンの残基62のAsn又は残基63のGly
の置換も本発明に包含される。
Bacillus微生物は実質的量のタンパク質を分泌する能
力があり、洗剤プロテアーゼを製造するために一般に使
用されているので、本発明のスビチリシンアナログを組
換により製造するための好適宿主である。ほとんどのBa
cillusはアルカリ性及び中性プロテアーゼを分泌するの
で、他のプロテアーゼを含まない媒体中にB.subtilisに
より突然変異スブチリシンを産生及び分泌できるように
B.subtilisの内因性アルカリ性及びプロテアーゼ遺伝子
に突然変異を導入することが好ましい。従って、本発明
は内因性プロテアーゼの合成が妨げられ且つ本発明のス
ブチリシンアナログを合成及び分泌する能力を維持する
ようなB.subtilisの突然変異株も提供する。
以下により詳細に記載するように、本発明のスブチリ
シンアルカリのpH及び熱安定性並びに洗剤配合物におけ
る安定性は、野生型のaprA遺伝子生成物スブチリシン及
びCarlsbergスブチリシンよりも著しくすぐれているこ
とが発見された。
本発明のスブチリシンアナログは次の手順に従って作
成され得る。
１）B.subtilisから代表的なスブチリシン遺伝子aprAの
単離。
２）所望の修飾を形成するようにオリゴヌクレオチド部
位特異的突然変異誘発を利用できるようなベクター上で
aprA遺伝子をクローニング。
３）部位特異的突然変異及び形成されたDNAを配列決定
し、所望の突然変異の存在を確認。
４）B.subtilisにおける突然変異酵素の合成を誘導する
べく発現ベクターを構築。
５）スブチリシン及び中性プロテアーゼを合成しない突
然変異B.subtilis株の構築。
６）細胞外増殖培地における酵素の単離及びその精製。
７）予め内因性プロテアーゼの合成を妨げるように突然
変異させたB.subtilis株の染色体内に改良された酵素を
コードする遺伝子を挿入するための手順の実施。
本文中において、特定のスブチリシンアナログは置換
又は欠失しているアミノ酸を括弧内に表記することによ
り示される。例えば、［Ser109］スブチリシンはアミノ
酸の109位にセリンを有するスブチリシン分子を表し、
［Ser109,Ser218］スブチリシンはアミノ酸の109及び21
8位にセリンを有するスブチリシン分子を表す。
実施例１では、スブチリシンをコードするaprA遺伝子
をB.subtilisゲノムから単離する。実施例２では、aprA
遺伝子に特定部位突然変異を誘発する。実施例３では突
然変異aprA遺伝子を含む発現ベクターを構築する。実施
例４では［Ser109］スブチリシンアナログを作成する。
実施例５は［Ser109,Ser218］スブチリシンアナログの
作成について記載する。実施例６は［Asp76,Ser109,Ser
218］スブチリシンアナログの作成について記載する。
実施例７では［Asp76,Asp77,Ser109,Ser218］スブチリ
シンアナログを作成する。実施例８は［Asp76,Glu79,Se
r109,Ser218］スブチリシンアナログの作成について記
載する。実施例９では、検出可能な細胞外プロテアーゼ
を産生しないB.subtilisの２種の突然変異株を構築す
る。実施例10は突然変異aprA遺伝子のB.subtilisの染色
体への組み込み手順を記載する。実施例11では、野生型
及び突然変異aprAスブチリシンを単離及び精製する。実
施例12〜14は［Ser218］スブチリシンの熱安定性を野生
型aprA遺伝子生成物と比較する。
本発明のスブチリシンアナログ以外に、本発明の洗剤
組成物は次の成分を含有し得る。
（ａ）アニオン性、非イオン性、もしくは両性であり得
る少なくとも１種の界面活性剤、又は水溶性石鹸。典型
的には、夫々洗剤組成物の５〜30重量％のアニオン性界
面活性剤（例えば線状アルキルアリールスルホネート）
及び１〜５重量％の非イオン性界面活性剤（例えばアル
キルフェニルポリグリコールエーテル）の混合物が使用
される。
（ｂ）好ましくは付随する金属イオン封鎖機能を有する
１種以上のビルダー。このような化合物の例としてはト
リポリリン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ケイ酸
ナトリウム及びゼオライトが挙げられ、通常洗剤組成物
の10〜70重量％を構成する。
（ｃ）漂白剤、好ましくは過ホウ酸ナトリウムのような
ペルオキシ化合物であり、典型的には組成物の30重量％
まで配合される。
（ｄ）カルボキシメチルセルロース、蛍光増白剤及び香
料のような助剤。必要に応じて、洗濯用媒体のpHを8.0
〜10.5にするためにpH調整剤を添加する。
洗剤組成物は本発明のスブチリシンアナログの１種以
上を有効量含有している。本文中において、「スブチリ
シンアナログの有効量」とは特定の洗剤組成物中で必要
な酵素活性を得るために必要なスブチリシンアナログの
量を表す。このような有効量は当業者には容易に想到さ
れ、使用される特定のスブチリシンアナログ、洗浄用
途、洗剤組成物の特定の組成、液体組成物と乾燥組成物
のどちらが必要であるかなどの多くの因子に依存する。
本発明の粒状スブチリシンアナログ調製物は洗剤組成
物100g当たり少なくとも0.1Anson単位（AU,下記参
照）、好ましくは0.5〜2.5AUの酵素活性を与えるように
計算された量を添加される。必要に応じて無機充填剤、
好ましくは硫酸ナトリウムを加えることにより100％に
することができる。
液体洗剤組成物は好ましくは非水性媒体中の酵素スラ
リーから調製され得る。典型的には、このようなスラリ
ーは液体非イオン性界面活性剤、例えばTergitol 15 S
9又はこのような界面活性剤の混合物中の微粉状スブチ
リシンアナログ濃縮物の懸濁液から構成され得る。通
常、スラリーは更に、微粉状塩化ナトリウムのような１
種以上の無機充填剤を含有しており、該充填剤は場合に
よっては例えばヒュームドシリカ（Aerosil200）のよう
な懸濁安定剤との混合物として添加される。Tergitol及
びAerosilは商標である。
本発明のスブチリシンアナログは、液体洗剤組成物10
0g当たり少なくとも0.AU、好ましくは0.5〜2.5AUのプロ
テアーゼ活性を与えるように計算された量を添加され
る。
洗剤組成物は通常通りの方法で調製され得、例えば成
分を相互に混合することにより調製され得る。あるいは
予備混合物を形成してから、残りの成分と混合する。
本文中に記載するような良好な安定性及び活性によ
り、本発明のスブチリシンアナログはタンパク質分解酵
素が一般に使用される全分野で使用することができる。
特に、洗剤及びクレンザー又は染み抜き剤として、なめ
し革の脱毛剤として、更にはタンパク質加水分解物を製
造する食品産業、並びに不完全抗体を検出する血清学の
分野で使用することができる。本発明のスブチリシンア
ナログは食品産業及び血清学の分野で使用すると特に有
利であり、他の酵素調製物とは対照的に、水溶液中のス
ブチリシンアナログを安定化させるために生理学的に許
容可能な量のカルシウムイオンを必要としない固体又は
溶解形態ですぐれた安定性を有する。
以下の実施例は本発明を更に説明する目的であるが、
本発明はこれらの具体的な実施例に限定されないことが
理解されよう。
実施例１ Ohio State University,Columbus,OhioのBacillus Ge
netic Stock CenterからB.subtilis株QB127（trpC2 leu
A8 sacUh200）［Lepesant他、Molec.Gen.Genet.，118,1
35−160（1982）］を入手した。この株は、sacUh200突
然変異の多面的効果により相同遺伝子のsacU+株に比較
して細胞外セレン及び金属プロテアーゼ、α−アミラー
ゼ及びレバンスクラーゼを過剰に産生する［Lepesant
他、Schlessinger,D.編Microbiology,1976,American So
ciety for Microbiology,Washington,D.C.,p.65（197
6）］。即ち、株QB127はスブチリシンをコードするaprA
遺伝子を単離するために適当なDNAソースである。
Saito他、Biochim.Biophys.Acta. 72,619−629（196
3）の手順に従ってB.subtilis株QB127の細胞からゲノム
DNAを単離した。精製した染色体DNAをEcoR I制限エンド
ヌクレアーゼで完全に消化した。
得られたDNAフラグメントを電気泳動により低融点ア
ガロースゲル上で分解させ、4.4〜8.0キロベース（kb）
範囲のフラグメントを単離した。高温でより多くのコピ
ー数を示し且つカナマイシン耐性を与える大腸菌（Esch
erichia coli,E.Coli）プラスミドであるpCFM936（Amer
ican type Culture Collection,12301 Parklawn Drive,
Rockville,MarylandからのA.T.C.C No.53,413）にこれ
らのフラグメントを連結した。ベクターをEcoR Iで消化
させ、連結前にウシ腸アルカリホスファターゼで脱ホス
ホリル化した。
連結物をE.coli C600（American type Culture Colle
ction,12301 Parklawn Drive,Rockville,Marylandから
のA.T.C.C.No.23724）に導入し、10μg/mlのカナマイシ
ンを補充したＬ−寒天上で一晩インキュベーション後、
カナマイシン耐性宿主細胞を選択した。選択した宿種細
胞を42℃で４時間インキユベートすることによりプラス
ミドDNAを増幅した。次にコロニーをニトロセルロース
フィルターに移し、Grunstein他、Proc.Natl.Acad.Sci.
（USA），72,3961（1975）に記載されているコロニーハ
イブリダイゼーション手順に従って処理した。
オリゴヌクレオチプローブを使用してpCFM936上にス
ブチリシン遺伝子を生息させるコロニーをスクリーニン
グした。Beaucage他、Tetrahedron Letters，22,1859−
1862（1981）により記載されている亜リン酸塩法により
合成したプローブは、aprA遺伝子生成物のアミノ末端に
対応するヌクレオチド配列： ５′ GCGCAATCTGTTCCTTATGGC 3′ を有していた（Wong他、Proc.Natl.Acad.Sci.（USA），
81,1184−1188（1984）;Stahl他、J.Bacteriol.，158,4
11−418（1984））。55℃のハイブリダイゼーション温
度を使用し、合計400個のコロニーから５個の陽性のコ
ロニーを確認した。陽性のコロニーのうちの１個のコロ
ニーのプラスミドDNAをpCFM936 apr2と命名した。
プラスミドpCFM936 apr2をEcoR I単独、Hind III単
独、及びEcoR IとHind IIIの組み合わせで消化した。ス
ブチリシン遺伝子のEcoR Iフラグメントの寸法はStahl
他の前出の文献に記載されている寸法に合致していた
が、その他にも記載されていない数個のHind III部位が
見出された。実施例３に記載するように、Hind III部位
の２個をスブチリシン遺伝子の遺伝子操作に使用した。
制限酵素消化物がStahl他の前出の文献に報告されて
いるような結果に合致することを確認することにより、
B.subtilis QB127ゲノムDNAの6.5kbの大きいEcoR Iフラ
グメントはaprA遺伝子、その調節配列及び無関係なフラ
ンキング配列を有することが判明した。このことは、Sa
nger他、L.Mol.Biol.，143,161−178（1980）により記
載されているチェインターミネーター法（dideoxy chai
n termination method）を使用するDNA配列決定により
確認された。6.5kb EcoR Iフラグメントの3.0kb EcoR I
〜Kpn Iサブフラグメントも同様に、第２図に示すaprA
遺伝子、その調節配列及び無関係なフランキング配列を
含むことが確認された。Stahl他の文献及び第１図の説
明によると、Kpn I〜EcoR Iフラグメントは2.5kbの長さ
を有することが報告されているが、第１図のスケールと
同図中のフラグメントの段階的説明とを比較すると、St
ahl他に文献においてさえKpn I−EcoR Iフラグメントは
実質的に2.5kbよりも大きいことが明らかである。
Bacillus宿主系のクローニングベクターであるプラス
ミドpAMBllを次のように構築した。プラスミドpTG402
（Northern Regional Research Laboratories,United S
tates Department of Agriculture,Peoria,looinois,株
番号NRRL B−15264）をRsa I制限エンドヌクレアーゼデ
部分的に消化した。予めHinc IIで消化しておいたM13 m
p18（Bethesda Research Laboratories,Gaithersburg,M
arylandからカタログ番号8227SAとして入手可能）にフ
ラグメントを連結させた。Mandel他、L.Mol.Biol.，53,
154,（1970）の手順に従って形質転換することにより連
結物をE.coli JM103（Pharmacia,Inc.,Piscataway,New
Jerseyからカタログ番号27−1545−01として入手可能）
に導入した。バクテリオファージプラークに0.5Mカテコ
ール（蒸留水中で調製）を噴霧し、pTG402から誘導され
るxylE遺伝子の機能的発現を検出した。xylE遺伝子はカ
テコール2,3−ジオキシゲナーゼをコードし、各種の生
物中でプロモーターを検出するために有用である［Zuko
wski他、Proc.Natl.Acad.Sci.（USA），80,1101−1105
（1983）］。
次にxylE遺伝子を、R.Dedonder（Institut Pasteur,P
aris,France）から入手したE.coli/B.subtilisプラスミ
ドpHV33（American Type Culture CollectionからA.T.
C.C.39217として入手可能）［Primrose他、Plasmid，
６,193−201（1981）］に1.0kb EcoR I〜Pst Iフラグメ
ントとして移した。pHV33プラスミドは予めEcoR I及びP
st Iで消化させておき、xylEを含有するフラグメントが
この領域に連結した場合に遺伝子のアンピリシン耐性を
失活させるようにした。得られたプラスミドpAMB21はE.
coli宿主細胞中に機能的xylE遺伝子を含んでいるが、xy
lEをB.subtilis宿主細胞中に発現させるためにプロモー
ターを加える必要がある。pAMB21を生息させるE.coli細
胞はテトラサイクリン（15μg/ml）及びクロラムフェニ
コール（20μg/ml）に対して耐性であり、pAMB21を生息
させるB.subtilis細胞はクロラムフェニコール（５μg/
ml）のみに耐性である。
バクテリオファージλのtoop転写終結配列を（400塩
基対Pst I〜Bg1 IIフラグメント上の）プラスミドpCFM9
36からpAMB21の非反復Pst I部位に移した。配列５′GAT
CTGCA 3′を有する合成ヌクレオチドを構築し、toopフ
ラグメントのBgl II末端をベクターpAMB21のPst I部位
に結合させた。形成されたプラスミドをpAMB22と命名し
たが、このプラスミドは転写ターミネーターを含んでい
ること除いてpAMB21と同一の特性を有していた。pAMB22
プラスミドはB.subtilis中で機能的な強力なプロモータ
ーを検出するために有用である。
制限されたフラグメントの電気泳動後、xylE及びtoop
を含むpAMB22からのDNAの1.4gb EcoR I〜Bgl IIフラグ
メントを低融点アガロースゲルから単離した。予めEcoR
I及びBamH Iで消化させておいたプラスミドpBD64（Bac
illus Genetic Stock Centerから番号1E22として入手可
能）にDNAの1.4kb片を連結させた。形成された5.3kbプ
ラスミドpAMB11は、第３図に示すようにxylE遺伝子の上
流にM13mp18のポリリンカー配列（EcoR I、Sst I、Xma
I、Sma、BamH I及びXba I）を含んでおり、下流にtoopt
を含んでいる。pAMB11プラスミドはB.subtilis中で複製
することが可能であり、宿主細胞にクロラムフェニコー
ル（５μg/ml）及び／又はカナマイシン（５μg/ml）耐
性を与える。
第４図に示すように、aprAを含む精製したEcoR I〜Kp
n IフラグメントをpAMBllにクローニングし、pAMBlllを
形成した。Chang他、Mol.Gen.Genet.，168,111−115（1
979）により記載されているプロトプラスト形質転換法
により、連結物をB.subtilisMI112（arg−15 leuB thr5
recE4）（Bacillus Genetic Stock CenterからNo.lA42
3として入手可能）に導入した。プラスミドDNAを含まな
いB.subtilis MI112はプロテアーゼ−プロフィシエント
（protease−proficient（Prt+表現型）であるが、スブ
チリシンの分泌レベルはかなり低い。1.5％（w/v）の脱
脂粉乳及び５μg/mlのクロラムフェニコールを補充した
Ｌ−寒天培地にクロラムフェニコール耐性（Cmr）トラ
ンスフォーマーを移した後、37℃でインキュベートし
た。
37℃で約16時間インキュベーション後、プラスミドpA
MB111を生息させるMI112のコロニーは各コロニーの周囲
に明白なハローを形成した。ハローは脱脂粉乳培地補充
物のカゼイン成分上のスブチリシンのタンパク質分解作
用により形成された。pAMB11ベクター単独を生息させる
MI112では16時間インキュベーション後にハローは見ら
れなかったが、37℃で40時間インキュベーション後には
場合によっては薄いハロー形成された。pAMB111を担持
する細胞はハローの寸法の差によりpAMB11を担持する細
胞から明白に区別された。このような完全に機能的な形
態でaprA遺伝子をクローニングすると、B.subtilisによ
る高レベルのスブチリシン産生及び分泌を実現すること
ができた。
実施例２ 第４図に示すように、実施例１に記載したように単離
した3.0kb EcoR I〜Kpn IゲノムフラグメントをHind II
Iで消化し、３個のフラグメント、即ち（１）aprA遺伝
子発現の遺伝子調節配列、スブチリシンの細胞外輪出に
必要な遺伝子の「プレプロ」領域、及び成熟スブチリシ
ンの最初の49個のアミノ酸をコードするDNA配列を担持
する1.1kb EcoR I〜Hind IIIフラグメント、（２）転写
終結配列及び３′ノンコーディング配列と共にスブチリ
シンの50〜275（カルボキシ末端）のアミノ酸をコード
するDNA配列を担持する1.1kb Hind III〜Hind IIIフラ
グメント、並びに（３）３′ノンコーディング配列を含
む0.8kb Hind III〜Kpn Iフラグメントを作成した。
両側をHind III部位により切断した1.1kbフラグメン
トをバクテリオファージM13 mp18の単一Hind III部位に
クローニングし、DNA配列決定及び部位特異的突然変異
を誘発させた。組換体の１つであるM13 mp18 apr2は、a
prA遺伝子の部位特異的突然変異誘発に必要な一重鎖鋳
型DNAを提供した。
aprA遺伝子のコーディング領域を配列決定し、配列の
結果を以下の第１表に示す。リーダー領域の最初の５個
のコドンはaprA遺伝子の配列情報に関するStahl他の前
出の文献及びWong他の前出の文献に報告されており、ア
ミノ酸84位及び85位ではStahl他の前出の文献とはコド
ン配列に相異があることに留意すべきである。特に、St
ahl他の前出の文献は、アミノ酸84位の（バリンをコー
ドする）コドンGTTを報告しているが、第１表には（同
様にバリンをコードする）コドンGTAが見られる。同様
にStahl他の前出の文献はアミノ酸85位に（セリンをコ
ードする）コドンAGCを報告しているが、第１表には
（アラニンをコードする）コドンGCGが見られる。
転写終結配列及び３′ノンコーディング配列と共にap
rA−スブチリシンのアミノ酸50〜275（カルボキシ末
端）をコードするヌクレオチド配列を担持するB.subtil
is QB127ゲノムDNAの1.1kb Hind III〜Hind IIIフラグ
メントをバクテリオファージM13 mp18の非反復Hind III
部位に挿入することにより、バクテリオファージM13 mp
18 apr2を構築した。３′ノンコーディング配列を除去
するために、Kpn I制限エンドヌクレアーゼ部位を部位
特異的突然変異誘発により転写終結配列の直後の位置に
導入した。
部位特異的突然変異誘発はNorrander他、Gene，26,10
1−106（1983）に記載されている手順に従って実施し
た。M13 mp18 apr2からの一重鎖DNAを、Beaucague他、T
etrahedron Letters 22,1859−1862（1981）により記
載されている亜リン酸塩法により合成したプライマー： にアニールした。プライマーは２個（アステリスクで示
す）を除いてこの領域でヌクレオチドと相同であり、チ
ミン（Ｔ）がグアニン（Ｇ）に置換され、別のチミン
（Ｔ）がアデニン（Ａ）に置換され、こうしてこの領域
にKpn I部位（下線部）を形成している。
プライマーを65℃でM13 mp18 apr2 DNAにアニール
し、アニールしたDNAを約22℃まで徐冷した後、アニー
ルしたDNA溶液12.5μ、夫々10mMのdATP、dCTP及びdGT
P2.5μ、12mM ATP20μ、Klenox DNAポリメラーゼ0.
1μ、T4 DNAリガーゼ0.1μ及び無菌蒸留水13μｌか
ら構成される反応混合物中で15℃で２時間重合した。形
成された二重鎖の共有的閉環状DNAをトランスフェクシ
ョンによりE.coli JM103に導入した。
次にバクテリオファージプラークをGene Screen（New
England Nuclear,Beverly,Massachusettsの登録商標）
ハイブリダイゼーション膜に移した。上記突然変異誘発
反応に使用した放射性物質で標識した（γ−32P）合成
オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることにより、
所望の塩基置換を有するDNAを含むプラークを認識し
た。ハイブリダイゼーションは、Kpn I突然変異を有す
るDNAのみが合成オリゴヌクレオチドにハイブリダイズ
するように、制御温度（65℃）で実施した。単一の精製
プラークからのDNA上のaprA遺伝子の下流のKpn I突然変
異（M13 mp18 apr2 Kpn Iと命名）の存在は、Singer他
の前出の文献に記載されている手順によるDNA配列決定
及び制限酵素分析により確認した。
M13 mp18 apr2 Kpn IをKpn Iで消化し、消化物を500n
gDNA/mlの濃度で再連結させ、次にトランスフェクショ
ンにより連結物をE.coli JM103に導入することにより、
３′ノンコーディング領域の大部分を担持する1.1kbセ
グメントを欠失させた。所望の0.35kb欠失を有するDNA
を含むバクテリオファージプラークを制限エンドヌクレ
アーゼに分析より認識した。このようなプラークからの
バクテリオファージをM13 mp18 apr4（第７図）と命名
した。M13 mp18 apr4は実施例３に記載するaprA遺伝子
の部位特異的突然変異誘発の一重鎖鋳型DNAを提供し
た。
実施例３ B.subtilis中で突然変異スブチリシン遺伝子を発現さ
せるために、突然変異遺伝子のベクターとしてプラスミ
ドpAMB106を次のように構築した。
１）pAMB111をHind IIIで消化した。pAMB111のHind III
消化物を約１μg/mlの濃度で再連結させることによりap
rA遺伝子の大部分を担持する1.1kbセグメントを欠失さ
せた。こうして第４図に示すようにpAMB110を形成し
た。pAMB110プラスミドはスブチリシン遺伝子の発現の
ための遺伝子調節配列、スブチリシンの分泌に必要な
「プレプロ」領域、並びに成熟スブチリシンの３′ノン
コーディング領域及び成熟スブチリシンの最初の49個の
アミノ酸をコードするDNA配列を担持している。
２）プラスミドpAMB110をBamH I及びPst Iの組み合わせ
で消化した。こうして6.2kb及び1.0kbの２種類の寸法の
DNAフラグメントを作成した。1.0kbのフラグメントはPs
eudomonas putida mt−２（Zukowski他の前出の文献）
のTOLプラスミドからのカテコール2,3−ジオキシゲナー
ゼをコードするxylE遺伝子を担持している。
３）より大きい6.2kb−BamH I−Pst Iフラグメントを、
Beaucage他の前出の文献に記載されている亜リン酸塩法
により合成した一重鎖合成オリゴヌクレオチド５′GATC
TGCA 3′、及びT4 DNAリガーゼにより自己連結させた。
Change他、Mol.Gen.Genet.168,111−115（1979）により
記載されているプロトプラスト形質転換法により、連結
物をB.subtilis MI112（arg−15 leuB thr5 recE4）（B
acillus Genetic Stock CenterからNo.1A423として入手
可能）に導入した。
クロラムフェニコール耐性（CmR）コロニーのプラス
ミド含有量をスクリーニングした。6.2kbのプラスミドp
AMB106は制限エンドヌクレアーゼ分析により認識した。
該プラスミドはxylEを欠失している以外はプラスミドpA
MB110と同一であった（第６図）。
pAMB106はaprAスブチリシンの50〜275のアミノ酸をコ
ードするDNAを欠失しているので、B.subtilis宿主細胞
に導入してもスブチリシンを合成しない。スブチリシン
はスブチリシン遺伝子の残部、即ち天然のDNA配列又は
アナログをコードする配列のいずれかの挿入後のみに合
成される。
実施例４ ［セリン109］スブチリシンアナログの作成 Beaucage他の前出の文献に記載されている亜リン酸塩
法により合成したプライマー： にバクテリオファーシM13mp18 apr4からの一重鎖DNAを
アニールした。プライマーは１個の塩基（アステリスク
で示す）を除いてaprA−スブチリシンの106〜113のアミ
ノ酸のコドンを含むヌクレオチドと相同であり、Asn109
（コドンAAC）をSer109（コドンAGC）に置換させるトラ
ンジションを可能にするようにＡがＧに置換されてい
た。
プライマーを65℃でM13mp18 apr4 DNAにアニールし、
アニールしたDNAを約22℃まで徐冷した後、実施例２に
記載したように重合、連結及びトランスフェクトした。
バクテリオファージプラークをハイブリダイゼーショ
ン膜に移し、上記突然変異誘発反応に使用した放射性物
質で標識した（α−32P）オリゴヌクレオチドにハイブ
リダイズすることにより、所望の塩基置換を有するDNA
を含むプラークを認識した。ハイブリダイゼーションは
65℃で実施した。１個の陽性のプラークはM13mp18 apr4
［Ser109］と呼称されるバクテリオファージを含んでい
た。このバクテリオファージからの二重鎖DNAをHind II
I及びKpn Iの組み合わせで消化した後、Hind III及びKp
n Iで予め消化しておいたpAMB106に、aprA−スブチリシ
ン遺伝子の突然変異部分を担持する750bpフラグメント
を連結した。得られたプラスミドpAMB129を適当なB.sub
tilis宿主細胞に導入し、［Ser109］−スブチリシンを
合成及び分泌することができる。
実施例５ ［セリン109,セリン218］スブチリシンアナログの作成 Beuacage他の前出の文献により記載されている亜リン
酸塩法により合成したプライマー： にM13mp18 apr4［Ser109］からの一重鎖DNAをアニール
した。プライマーは１個の塩基（アステリスクで示す）
を除いてaprA−スブチリシンの215〜220のアミノ酸のコ
ドンを含むヌクレオチドと相同であり、Asn218（コドン
AAC）をSer218（コドンAGC）に置換させるトランジショ
ンを可能にするようにＡがＧに置換されていた。アニー
リング、重合、連結、トランスフェクション及び陽性プ
ラークの認識の条件は実施例２に記載した通りである。
１個の精製プラークは、M13mp18 apr4［Ser109,Se
r218］と命名されるバクテリオファージを含んでいた。
このバクテリオファージから二重鎖DNAをHind III及びK
pn Iの組み合わせで消化した後、２つの突然変異部を有
する750bpフラグメントを予めHind III及びKpn Iで消化
しておいたpAMB106に連結した。得られたプラスミドpAM
B130をB.subtilis宿主細胞に導入し、［Ser109,Se
r218］−スブチリシンを合成及び分泌することができ
る。
実施例６ ［Asp76,Ser109,Ser218］スブチリシンアナログの作成 Beaucage他の前出の文献に記載されている亜リン酸塩
法により合成したプライマー： にM13mp18 apr4［Ser109,Ser218］からの一重鎖DNAをア
ニールした。プライマーは１個の塩基（アステリクスで
示す）を除いてaprA−スブチリシンの74〜79のアミノ酸
のコドンを含むヌクレオチドと相同であり、Asn76（コ
ドンAAT）をAsp76（コドンGAT）に置換させるトランジ
ションを可能にするようにＡがＧに置換されていた。
プライマーを65℃でM13mp18［Ser109,Ser218］DNAに
アニールし、アニールしたDNAを約22℃まで徐冷した
後、実施例２に記載したように重合、連結及びトランス
フェクトした。
バクテリオファージプラークをハイブリダイゼーショ
ン膜に移し、ハイブリダイゼーションを46℃で実施した
以外は実施例２に記載したようにハイブリダイズするこ
とにより、所望の塩基置換されを有するDNAを含むプラ
ーク認識した。１個の陽性のプラークはM13mp18 apr4
［Asp76,Ser109,Ser218］と呼称されるバクテリオファ
ージを含んでいた。このバクテリオファージからの二重
鎖DNAをHind III及びKpn Iの組み合わせにより消化した
後、Hind III及びKpn Iで予め消化しておいたpAMB106
に、aprA−スブチリシン遺伝子の３つの突然変異部を担
持する750bpフラグメントを連結した。得られたプラス
ミドpAMB131をB.subtilis宿主細胞に導入し、［Asp76,S
er109,Ser218］−スブチリシンを合成及び分泌すること
ができる。
実施例７ ［Asp76,Asp77,Ser109,Ser218］スブチリシンアナログ
の作成 Beaucage他の前出の文献に記載されている亜リン酸塩
法により合成したプライマー： にM13mp18 apr4［Asp76,Ser109,Ser218］からの一重鎖D
NAをアニールした。プライマーは２個の塩基（アステリ
クスで示す）を除いて［Asp76,Ser109,Ser218］−スブ
チリシンの74〜80のアミノ酸のコドンを含むヌクレオチ
ドと相同であり、Asn77（コドンAAC）をAsp77（コドンG
AT）に置換させるトランジションを可能にするようにＡ
がＧ、ＣがＴに置換されていた。
プライマーを65℃でM13mp18 apr4［Asp76,Ser109,Ser
218］DNAにアニールし、アニールしたDNAを約22℃まで
徐冷した後、実施例２に記載したように重合、連結及び
トランスフェクトした。
バクテリオファージプラークをハイブリダイゼーショ
ン膜に移し、ハイブリダイゼーションを46℃で実施した
以外は実施例２に記載したようにハイブリダイズするこ
とにより、所望の塩基置換を有するDNAを含むプラーク
を認識した。１個の陽性のプラークはM13mp18 apr4［As
p76,Asp77,Ser109,Ser218］と呼称されるバクテリオフ
ァージを含んでいた。このバクテリオファージからの二
重鎖DNAをHind III及びKpn Iの組み合わせにより消化し
た後、Hind III及びKpn Iで予め消化しておいたpAMB106
に、aprA−スビチリシン遺伝子の４つの突然変異部を担
持する750bpフラグメントを連結した。得られたプラス
ミドpAMB132をB.subtilis宿主細胞に導入し、［Asp76,A
sp77,Ser109,Ser218］−スブチリシンを合成及び分泌す
ることができる。
実施例８ ［Asp76,Asp79,Ser109,Ser218］スブチリシンアナログ
の作成 Beaucage他の前出の文献に記載されている亜リン酸塩
法により合成したプライマー： にM13mp18 apr4［Asp76,Ser109'Ser218］からの一重鎖D
NAをアニールした。プライマーは３個の塩基（アステリ
クスで示す）を除いて［Asp76,Ser109,Ser218］−スブ
チリシンの75〜83のアミノ酸の一部のコドン及び76〜82
のアミノ酸の全コドンを含むヌクレオチドと相同であ
り、Ile79（コドンATC）をGlu79（コドンGAAに置換させ
るトランジションを可能にするようにＡがＧ、ＴがＡ、
ＣがＡに置換されていた。
プライマーを65℃でM13mp18 apr4［Asp76,Ser109,Ser
218］DNAにアニールし、アニールしたDNAを約22℃まで
徐冷した後、実施例２に記載したように重合、連結及び
トランスフェクトした。
バクテリオファージプラークをハイブリダイゼーショ
ン膜に移し、ハイブリダイゼーションを45℃で実施した
以外は実施例２に記載したようにハイブリダイズするこ
とにより、所望の塩基置換されを有するDNAを含むプラ
ークを認識した。１個の陽性のプラークはM13mp18 apr4
［Asp76,Glu79,Ser109,Ser218］と呼称されるバクテリ
オファージを含んでいた。このバクテリオファージから
の二重鎖DNAをHnd III及びKpn Iの組み合わせにより消
化した後、Hind III及びKpn Iで予め消化しておいたpAM
B106に、aprA−スブチリシン遺伝子の４つの突然変異部
を担持する750bpフラグメントを連結した。得られたプ
ラスミドpAMB133をB.subtilis宿主細胞に導入し、［Asp
76,Glu79,Ser109,Ser218］−スブチリシンを合成及び分
泌することができる。
実施例９ ほとんどのBacilliは周囲の増殖培地中にアルカリ性
及び／又は中性プロテアーゼを分泌するので、突然変異
スブチリシン遺伝子が突然変異細胞に導入されると突然
変異スブチリシンを産生し、完全なスブチリシンアナロ
グの単離を妨害し得る他のプロテアーゼを含まない培地
中に該突然変異スブチリシンを分泌するように、B.subt
ilisの内因性アルカリ性及び中性プロテアーゼ遺伝子に
突然変異を導入してその合成を阻止することが好まし
い。検出可能な細胞外プロテアーゼを産生しない２種類
の突然変異B.subtilis株BZ24及びBZ25を次の手順に従っ
て構築した。
まず、E.coli中では複製することが可能であるが、B.
subtilis中では相同組換によりB.subtilis染色体に組み
込まない限り複製することができないプラスミドベクタ
ーを次のように構築した。プラスミドpBD64（Bacillus
Genetic Stock Center,Number1E22）をHpa IIで完全に
消化させ、夫々2.95kb、1.0kb及び0.75kbの寸法の３つ
のフラグメントを作成した。これらのフラグメントを次
に、Cla Iで予め消化しておいたプラスミドpBR322（A.
T.C.C.37017）に混合物として連結した。連結物を形質
転換によりE.coli C600（American Type Culture Colle
ctionからA.T.C.C.23724として入手可能）に導入した
［Mandel他、J.Mol.Biol.，53,154（1970）］。クロラ
ムフェニコール（20μg/ml）及びアンピシリン（50μg/
ml）に対して耐性の細胞を選択した。Birnboim他、Nucl
eic Acids Res.，７,1513−1523（1979）に記載のアル
カリ抽出手順により12個の形質転換細胞からプラスミド
DNAを作成し、次にHind III及びEcoR Iの組み合わせで
消化し、挿入したフラグメントの存在を確認した。この
ような１個のプラスミドpAMB30はpBR322のCla I部位にp
BD64の1.0及び0.75kbのHpa IIフラグメントを担持する
ことが確認された。これらのフラグメントはE.coli及び
B.subtilis中で機能的なクロラムフェニコールアセチル
トランスフェラーゼ（cat）遺伝子を含んでいる。Bgl I
I及びSau3Aで別々に消化した処、第５図に示すようにpA
MB30上にcat遺伝子の存在及び配向が確認された。
pMAB30はB.subtilis中に機能的な複製配列の起源を欠
いているので、B.subtilis宿主細胞中で自律的レプリコ
ンとして複製することができない。他方、pAMB30はE.co
li中にpBR322から誘導される機能的な複製起源を含んで
いるので、プラスミドはE.coli宿主細胞中で増殖され得
る。プラスミドpAMB30は少なくとも２つの点で有用であ
る。まず第１に、B.subtilis中に機能的複製起源を含む
DNAのフラグメントはpAMB30にクローニングすると検出
され得、プラスミドは染色体外状態で自律的に複製す
る。第２に、プラスミドpAMB30は染色体とpAMB30にクロ
ーニングしたB.subtilisDNAとの間の相同部位でB.subti
lisのゲノムに組み込まれ得る。このことは、pAMB30と
同一ではないがこれに類似するプラスミドベクターを使
用してHaldenwang他、J.Bacteriold.，142,90−98（198
0）及びYoung,J.Gen.Microbiol.，129,1497−1512（198
3）により立証されている。
プラスミドpAMB21（実施例１に記載）をEcoR I及びPs
t Iで消化し、1.0kbフラグメント上のxylE遺伝子を単離
した。予めEcoR I及びPst Iで消化しておいたpAMB30に
フラグメントを連結した。連結物を形質転換によりE.co
li C600に導入した。pAMB21のxylEフラグメントをpAMB3
0のアンピシリン耐性構造遺伝子に挿入したためにアン
ピシリン（50μg/ml）に感受性であるクロラムフェニコ
ール耐性（20μg/ml）宿主細胞を選択した。形成された
プラスミドpAMB30/21はpAMB30と同一の特性を有してお
り、更に、機能的xylE遺伝子を有している。
成熟スブチリシンの最後の226個のアミノ酸をコード
する領域を欠失するaprA遺伝子を担持するプラスミドpM
B110をEcoR I及びKpn Iで消化させた。aprA遺伝子発現
の遺伝子調節配列、「プレプロ」領域、成熟スブチリシ
ンの最初の49個のアミノ酸をコードするDNA配列、並び
に３′ノンコーディング配列を含むB.subtilis DNAの1.
9kbフラグメントを、予めEcoR I及びKpn Iで消化したpA
MB30/21に連結した。連結物を形質転換によりE.coli C6
00に導入した。数個の形質転換細胞からのプラスミドDN
AをBirnbojm他の前出の文献に記載のアルカリ抽出手順
により単離し、挿入した1.9kbフラグメントの存在を多
重制御エンドヌクレアーゼ消化により確認した。このよ
うな１つのプラスミドpAMB301を後の使用のために残し
ておいた。
B.subtilis株BGSC1A274（Bacillus Genetic Stock Ce
nter）はnpr遺伝子座に突然変異部を担持しており、細
胞外中性プロテアーゼを産生することができない。コン
ピテント細胞の形質転換によりプラスミドpAMB301をB.s
ubtilis BGSC1A274のゲノムに組み込んだ［Spizizen,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.（USA），44,1072−1078（195
8）］。クロラムフェニコール耐性（５μg/ml）宿主細
胞を選択し、無菌楊枝により1.5％（w/v）の脱脂粉乳及
び（５μg/ml）のクロラムフェニコールを補充したＬ−
寒天に移した。これらの細胞はコロニーの周囲に明白な
ハローを形成し得ず、npr突然変異と新たに導入したapr
A突然変異との組み合わせにより細胞外中性及びセリン
プロテアーゼを産生する能力を欠いていた。aprA突然変
異部は野生型aprA遺伝子がpAMB301に担持された欠失型
で置換されているので成熟スブチリシンの最後の226個
のアミノ酸を欠失していた。このような１つの株BZ24は
Npr-Apr-Cmr表現型を有しており、従って、検出可能な
細胞外中性プロテアーゼ及び細胞外アルカリ性プロテア
ーゼのいずれも産生せず、５μg/mlのクロラムフェニコ
ールに耐性である。サザンブロッティング［Southern,
J.Mol.Biol.，98,503−517（1975）］を使用してB.subt
ilis BZ24の染色体上のaprA遺伝子の欠失を確認した。
約32世代の抗生物質選択の不在下でB.subtilis BZ24を
抗生物質培地No.3（Penassay Broth,Difco,Detroit,Mic
higan）で培養した処、BZ24染色体の不安定性により宿
主細胞にクロラムフェニコール耐性を与えるcat遺伝子
が欠失するようなBZ24の誘導株が単離された。このよう
な現象はStahl他、J.Bacteriol.，158,411−418（198
4）により既に認められている。BZ24のクロラムフェニ
コール感受性誘導株をBZ25と命名した。B.subtilis BZD
TはNpr-Apr-表現型を有するので、検出可能な細胞外中
性プロテアーゼも細胞外アルカリ性プロテアーゼを産生
しない。サザンブロッティングを使用してB.subtilis B
Z25の染色体上のaprA遺伝子の欠失を確認した。
B.subtilis BZ25は検出可能な細胞外中性プロテアー
ゼ及びスブチリシンのいずれも産生しないので、他のプ
ロテアーゼを含まない周囲増殖培地中に分泌され得る突
然変異スブチリシンを産生するためにpAMB113のような
プラスミドDNAを導入するための有用な宿主細胞であ
る。
B.subtilis BZ25は培養上清を以下に記載するように
試験すると、検出可能な細胞外プラスミドを産生しな
い。（Chang他の前出の文献に記載のプロトプラスト形
質転換法により導入した）プラスミドpAMB113を生息さ
せるBZ25であるB.subtilis BZ25/pAMB113は、培養上清
を以下に記載するように試験すると多少の量の［Se
r218］−スブチリシンを産生する。
実施例10 ［Ser218］−スブチリシン遺伝子のB.subtilisの染色
体への組み込みは、この突然変異遺伝子の遺伝子安定性
を増加する有効な方法であると考えられている。このよ
うなアプローチは、それ以外の方法ではプラスミドDNA
を染色体外状態で維持するために選択的圧力を加えるこ
とが必要な発酵培地にクロラムフェニコールを使用する
必要がない。従って、［Sur218］−スブチリシン遺伝子
は、B.subtilis染色体と相同のその遺伝子調節配列及び
フランキングDNAと共に、予めEcoR I及びPst Iの組み合
わせで消化しておいたpAMB113の電気泳動後に低融点ア
ガロースゲルから単離した。次に、4.0kb EcoR I〜Pst
Iフラグメント（第４図）を予めEcoR I及びPst Iの組み
合わせで消化しておいたpAMB30（第５図）に連結した。
連結物を形質転換によりE.coli HB101（A.T.C.C.3369
4）に導入した。クロラムフェニコール（20μg/ml）に
耐性の細胞を選択した。上記基準を満たす４つの形質転
換細胞からのプラスミドDNAをBirnboim他の前出の文献
に記載されたアルカリ抽出手順により単離した後、EcoR
I及びPst Iの組み合わせで消化した。４個のプラスミ
ドはいずれもpAMB30の4.0kbのインサート及び5.6kbの残
部を含んでいた。このような１個のプラスミドpAMB302
を精製し、その後の使用に備えて保持した。
コンピテンス法［Spizizen、前出文献］によりB.subt
ilis BZ25の染色体にプラスミドpAMB302を組み込むよう
に繰り返し試みたが、成功しなかった。これは使用した
方法によりBZ25細胞をコンピテントにすることができな
かったためであると考えられる。従って、Chang他の前
出の文献のプロトプラスト形質転換方法によりB.subtil
is BZ25にpAMB302を導入した。この結果は、組み込みが
得られた試験株をコンピテンス法による形質転換に基づ
いて選択したという点で特に意味がある。コンピテント
によることができない株、特にコンピテンス法による形
質転換に基づいて選択されなかった一般市販株はコンピ
テントとなり得ない可能性が大きい。
クロラムフェニコール耐性（５μg/ml）細胞を選択
し、次に1.5％（w/v）の脱脂粉乳及び５μg/mlのクロラ
ムフェニコールを補充したＬ−寒天に無菌楊枝で移し
た。細胞を37℃で一晩インキュベートした。異なる直径
の鮮明なハローがCmrコロニーの周囲に観察された。こ
れは、これらの細胞によりスブチリシンが産生及び分泌
されたことを意味する。アルカリ抽出法によりこれらの
コロニーの８個からプラスミドDNAを単離するように試
みた。電気泳動後にDNAを可視化するように臭化エチジ
ウム（１μg/ml）で染色したアガロースゲル上にプラス
ミドDNAは検出されなかった。スブチリシンを産生するC
mr細胞中に染色体外プラスミドDNAが不在であること
は、pAMB302がB.subtilisの染色体に組み込まれたこと
を表す有力な証拠である。
この実験からの数個のコロニーを単離し、BZ28、BZ2
9、BZ30、BZ31、BZ32及びBZ33と命名した。５μg/mlの
クロラムフェニコールを補充した脳−心インフュージョ
ン培地（BHI,Difco）中で激しく振蕩させながら各株を3
7℃で一晩増殖させた。培養上清のスブチリシン活性を
試験した。B.subtilis株BZ28、BZ29、BZ30、BZ31、BZ32
及びBZ33はいずれもスブチリシンを産生し、周囲の増殖
培地中に分泌し、他の株よりも産生量の多い株もあっ
た。液体培地ブロス中に観察されたスブチリシンの量
は、脱脂粉乳Ｌ−寒天培地上に観察されたハローの寸法
に正比例していた。これらの細胞により分泌されるスブ
チリシンの量の差により、pAMB302の多重コピーを染色
体に組み込み、又は遺伝子増幅［Young,J.Gen.Microbio
l.，129,1497−1512（1983）;Albertini他、J.Bacterio
ld.，162,1203−1211（1985）］を実施した。
実施例11 BZ25/pAMB111からの野生型スブチリシン、及びBZ25/p
AMB131からの［Asp76,Ser109,Ser218］−スブチリシン
アナログを次のように単離及び精製した。各培養ブロス
を15,000gで30分間遠心分離し、透明な上清中のタンパ
ク質を（NH4）2SO4（350g/）で沈澱させた。沈澱を遠
心分離により収集し、75％アセトンと混和し、過及び
真空乾燥した。
酵素を更に精製するために、乾燥した沈澱を水に溶解
させ、溶液を過してからpH6.3の0.02Mリン酸ナトリウ
ム緩衝液で透析した。透析した溶液を2ml/minの速度で
カルボメキシメチルセルロースのカラム（2.5×15cm）
に通した。カラムを0.02Mリン酸ナトリウム（pH6.3）で
洗浄後、0.15MのNaClを含有する同一の緩衝液で酵素を
溶出させた。ピークフラクションをプールし、2.5容量
のアセトンを添加することにより酵素を含有するフラク
ションからのタンパク質が沈澱し、これはスクシニル−
Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−フェ
ニルアラニル−ｐ−ニトロアニリド（Vega Biochemical
s）と混合したフラクションのサンプル中の色変化によ
り確認された。沈澱を遠心分離により収集し、0.005M酢
酸カルシウムに溶解させた（約1ml/10mg）。得られた溶
液を４℃で水で透析した後、凍結乾燥した。
実施例12 純粋なスブチリシン又はスブチリシンアナログをEPLC
Superose12カラムに加え、完全な（切断していない）
タンパク質として溶出する物質を20mM MES,0.1M NaCl,1
0mM CaCl2,pH6.3中にプールした。野生型スブチリシ
ン、又は本発明のスブチリシンアナログのサンプルを、
同一緩衝液、緩衝液＋３％ SDS、又は20mM MES,0.1M Na
Cl,5mM CaCl2及び15mM EDTA中で指定した温度で10分間
インキュベートした。サンプルを５分間で室温まで冷却
した後、0.6％のアゾカゼインを加えたTris−HCl,pH8.0
中で室温（20℃）で20分間試験し、タンパク質分解活性
を決定した。各サンプルのタンパク質分解性活性は10mM
CaCl2中20℃における野生型又はアナログのいずれかの
元の活性の百分率として表し、第２表に示す。 第２表 野生型スブチリシンのタンパク質分解活性温度 ０％ SDS ３％ SDS ０％ SDS＋15mM EDTA 20 100 ８ 100 35 100 ０ 62 50 95 ０ 37 70 14 ０ 14 100 0 ０ 0 実施例５の［Asp76,Ser109,Ser218］スブチリシンアナ
ログの活性温度 ０％ SDS ３％ SDS ０％ SDS＋15mM EDTA 20 100 55 91 50 100 12 94 100 5 0 5 実施例13 Superose12カラム上でFPLCにより完全なスブチリシン
を得た。完全なスブチリシンを、15mM MES、4mM CaCl2
又は4mM EDTAを含有するpH6.3の0.5M NaCl、及び各種の
量のSDS中で室温（20℃）で30分間インキュベートし
た。次にTris−HCl,pH8.0中の0.6％アゾカゼイン中で20
分間インキュベートすることにより酵素のタンパク質分
解活性を決定した。試験した各サンプルのタンパク質分
解活性を、０％ SDS及び10mM Ca2+中のサンプルの元の
活性の百分率として第３表に示す。 第３表 野生型スブチリシンのタンパク質分解活性 ％ SDS 4mM Ca2+ 4mM EDTA 0 100 94 0.1 100 78 0.25 100 45 0.50 76 13 0.75 63 3 1.0 60 0 2.0 29 0 3.0 17 0 ［Asp76,Ser109,Ser218］スブチリシンアナログのタン
パク質分解活性 ％ SDS 4mM Ca2+ 4mM EDTA 0 100 95 0.1 100 95 0.25 100 86 0.50 100 81 0.75 96 79 1.0 96 78 2.0 86 69 3.0 71 65 実施例14 ［Asp76,Ser109,Ser218］スブチリシンアナログ、［Asp
76,Glu79,Ser109,Ser218］スブチリシンアナログ及びCa
rlsbergスブチリシンの安定性を３種類の温度（25℃、3
7℃及び50℃）で２種類の緩衝液（0.06Mリン酸ナトリウ
ムpH9.0、又は0.12Mグリシン酸ナトリウムpH11.0）中で
試験した。結果を第４表に各条件下の酵素の半減期とし
て示す。
以上、本発明の好適態様について記載したが、変形及
び改良が当業者に想到されることは理解されよう。従っ
て、本文中に記載した特定のカルシウム以外のカルシウ
ム結合部位で残基を置換しても同様に安定性を改良でき
ることが予想される。Asn−Gly配列を有する他の酵素及
びこの配列を含む他のタンパク質で同様に置換すると安
定性を更に改良できるものと予想される。更に、本発明
のスブチリシンアナログはいずれも参考資料として本発
明の一部とする例えば米国特許第3732170号、3749671号
及び3790482号に記載されているような洗剤配合物中の
野生型スブチリシンよりもすぐれた特性を有することが
予想される。
更に、実用的な理由により多くの工業プロセスはほと
んどの酵素の安定性温度範囲よりも高い温度で実施され
る。従って、本文中では洗剤用を強調したが、本発明の
熱安定スブチリシンアナログは従来安定なスブチリシン
が必要とされている洗剤産業のような所定の産業に有利
であるのみならず、例えば固形スープの製造のための植
物及び動物タンパク質の加水分解のようにタンパク質を
加水分解するための化学的手段を使用する産業でも有用
であり得る。
従って、本発明は請求の範囲に該当する限りこのよう
なあらゆる変形及び改良を包含する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:125） (72)発明者 レビツト，マイケル アメリカ合衆国、カリフオルニア・ 94305、スタンフオード、ラスロープ・ ドライブ・880 (56)参考文献 特開 昭62−596（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−160884（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−70075（ＪＰ，Ａ) Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｎｏ ｌ．，47（1977）Ｐ．132−145

Claims (24)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（１）天然に産生するBacillusスブチリシ
    ンのAsp41、Leu75、Asn76、Asn77、Ser78、Ile79、Gly
    80、Val81、Thr208及びTyr214により表されるカルシウ
    ム結合部位に存在するアミノ酸の１個以上を、負の電荷
    を有するアミノ酸により置換させ、 （２）天然に産生するBacillusスブチリシンの任意のAs
    n−Gly配列のアミノ酸の１個以上を欠失又は別のアミノ
    酸により置換させることにより修飾された天然に産生す
    るBacillusのアミノ酸配列を有することを特徴とする、
    天然のBacillusスブチリシンに対し改良されたpH及び熱
    安定性を有するスブチリシンアナログ。
  2. 【請求項２】アナログがCarlsbergスブチリシン、DYス
    ブチリシン、BPN′スブチリシン、Bacillus subtilisの
    aprAスブチリシン及びBacillus mesentericusからのス
    ブチリシンから選択される天然に産生するBacillusスブ
    チリシンのアナログであることを特徴とする請求項１に
    記載のスブチリシンアナログ。
  3. 【請求項３】負の電荷を有するアミノ酸がAsp又はGluで
    あることを特徴とする請求項１に記載のスブチリシンア
    ナログ。
  4. 【請求項４】Asn76がAsp76で置換されていることを特徴
    とする請求項３に記載のスブチリシンアナログ。
  5. 【請求項５】Asn77がAsp77で置換されていることを特徴
    とする請求項３に記載のスブチリシンアナログ。
  6. 【請求項６】Ile79がGlu79で置換されていることを特徴
    とする請求項３に記載のスブチリシンアナログ。
  7. 【請求項７】Asn76がAsp76で置換され且つAsn77がAsp77
    で置換されていることを特徴とする請求項３に記載のス
    ブチリシンアナログ。
  8. 【請求項８】Asn76がAsp76で置換され且つIle79がGlu79
    で置換されていることを特徴とする請求項３に記載のス
    ブチリシンアナログ。
  9. 【請求項９】Asn−Gly配列中のAsn残基が異なるアミノ
    酸の残基により置換されていることを特徴とする請求項
    １に記載のスブチリシンアナログ。
  10. 【請求項１０】該Asn−Gly配列中のAsn残基が、Ser、Va
    l、Thr、Cys、Glu及びIleから構成される群から選択さ
    れたアミノ酸の残基により置換されていることを特徴と
    する請求項９に記載のスブチリシンアナログ。
  11. 【請求項１１】Asn−Gly配列中のAsn残基がSerにより置
    換されていることを特徴とする請求項10に記載のスブチ
    リシンアナログ。
  12. 【請求項１２】109位のAsn残基がSerにより置換されて
    いることを特徴とする請求項11に記載のスブチリシンア
    ナログ。
  13. 【請求項１３】218位のAsn残基がSerにより置換されて
    いることを特徴とする請求項11に記載のスブチリシンア
    ナログ。
  14. 【請求項１４】109及び218位のAsn残基がSerにより置換
    されていることを特徴とする請求項11に記載のスブチリ
    シンアナログ。
  15. 【請求項１５】［Asp76,Ser109,Ser218］スブチリシ
    ン、［Asp77,Ser109,Ser218］スブチリシン、［Glu79,S
    er109,Ser218］スブチリシン、［Asp76,Asp77,Ser109,S
    er218］スブチリシン及び［Asp76,Glu79,Ser109,Se
    r218］スブチリシンから構成される群から選択されるこ
    とを特徴とする請求項14に記載のスブチリシンアナロ
    グ。
  16. 【請求項１６】Bacillusスブチリシンが第１表に示した
    天然に産生するアミノ酸配列を有していることを特徴と
    する請求項１に記載のスブチリシンアナログ。
  17. 【請求項１７】［Asp76,Ser109,Ser218］スブチリシン
    であることを特徴とする請求項16に記載のスブチリシン
    アナログ。
  18. 【請求項１８】［Asp77,Ser109,Ser218］スブチリシン
    であることを特徴とする請求項16に記載のスブチリシン
    アナログ。
  19. 【請求項１９】［Glu79,Ser109,Ser218］スブチリシン
    であることを特徴とする請求項16に記載のスブチリシン
    アナログ。
  20. 【請求項２０】［Asp76,Asp77,Ser109,Ser218］スブチ
    リシンであることを特徴とする請求項16に記載のスブチ
    リシンアナログ。
  21. 【請求項２１】［Asp76,Glu79,Ser109,Ser218］スブチ
    リシンであることを特徴とする請求項16に記載のスブチ
    リシンアナログ。
  22. 【請求項２２】カルシウム結合部位及びAsn−Gly配列を
    含むアミノ酸配列を有するBacillusスブチリシンのアナ
    ログをコードするDNA配列であって、（１）カルシウム
    結合部位におけるアミノ酸の１個以上をコードするコド
    ンが負の電荷を有するアミノ酸をコードするコドンによ
    り置換されており、（２）Asn−Gly配列中のアミノ酸の
    １個以上をコードするコドンが欠失しているか又は別の
    アミノ酸残基をコードするコドンにより置換されている
    ことを特徴とする前記DNA配列。
  23. 【請求項２３】改良された熱及びpH安定性を有するBaci
    llusスブチリシンのアナログの製造方法であって、適当
    な栄養条件下で、請求項22に記載のDNA配列で安定的に
    形質転換又はトランスフェクションした原核宿主細胞
    を、該スブチリシンのアナログの発現がなされるように
    培養し、所望のスブチリシンアナログを単離することか
    ら成る前記方法。
  24. 【請求項２４】洗剤配合物中に有効量の請求項１に記載
    のスブチリシンアナログを含有することを特徴とする組
    成物。
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