JP2749069B2 - 蛍光顕微鏡装置 - Google Patents
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- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、細胞のカルシウムイオン濃度や水素イオン
濃度等を平面的に測定する蛍光顕微鏡装置に関する。
濃度等を平面的に測定する蛍光顕微鏡装置に関する。
［従来の技術と課題］ 最近、神経科学や細胞生物学分野における新しい研究
手法として、細胞内遊離カルシウムイオン濃度を定量す
る方法が、急速に広がっている。しかるに、例えば細胞
の代謝機能を研究する場合、細胞内に蛍光物質を導入し
て蛍光顕微鏡により観察し、同時に蛍光強度を測定する
ことにより定量することは重要な方法である。こうした
方法により生きた細胞内のカルシウムイオン濃度に限ら
ず、生きた細胞内の水素イオン濃度等のようなイオン濃
度や、巨大分子（蛋白質，核酸）が測定されている。こ
の場合、測定のための蛍光性プローブと装置の開発が重
要となる。
手法として、細胞内遊離カルシウムイオン濃度を定量す
る方法が、急速に広がっている。しかるに、例えば細胞
の代謝機能を研究する場合、細胞内に蛍光物質を導入し
て蛍光顕微鏡により観察し、同時に蛍光強度を測定する
ことにより定量することは重要な方法である。こうした
方法により生きた細胞内のカルシウムイオン濃度に限ら
ず、生きた細胞内の水素イオン濃度等のようなイオン濃
度や、巨大分子（蛋白質，核酸）が測定されている。こ
の場合、測定のための蛍光性プローブと装置の開発が重
要となる。
ところで、生きた細胞内イオン濃度の測定の場合、夫
々のイオンと特異的に結合し、結合により励起スペクト
ルや蛍光スペクトルの変化する様なプローブが用いられ
る。一方、蛋白質や核酸のような巨大分子の場合は、蛍
光物質をこれら巨大分子に共有的に結合し、定量され
る。
々のイオンと特異的に結合し、結合により励起スペクト
ルや蛍光スペクトルの変化する様なプローブが用いられ
る。一方、蛋白質や核酸のような巨大分子の場合は、蛍
光物質をこれら巨大分子に共有的に結合し、定量され
る。
従来、細胞内の例えばカルシウムイオン濃度を測定す
るときは、サンプルである細胞に例えば蛍光試薬fura−
２を投与した後、この蛍光試薬とカルシウムイオンとが
特異的に結合して励起スペクトルが変化するのを分光蛍
光光度計により測定又は顕微鏡により観察することによ
りおこなっていた。なお、顕微鏡による観察は、蛍光像
上の円形の微少領域内の蛍光量変化を測光することによ
り行っていた。
るときは、サンプルである細胞に例えば蛍光試薬fura−
２を投与した後、この蛍光試薬とカルシウムイオンとが
特異的に結合して励起スペクトルが変化するのを分光蛍
光光度計により測定又は顕微鏡により観察することによ
りおこなっていた。なお、顕微鏡による観察は、蛍光像
上の円形の微少領域内の蛍光量変化を測光することによ
り行っていた。
しかしながら、従来のこうした測定方法では、細胞中
のカルシウムイオン濃度を部分的には測定することがで
きるが、平面的な濃度分布を得ることはできない。ま
た、仮に平面的な濃度分布を得ようとして測定を行えば
かなり多くの点でサンプルを採取して顕微鏡による観察
を行わなければならず、多大な観察時間を必要とする。
のカルシウムイオン濃度を部分的には測定することがで
きるが、平面的な濃度分布を得ることはできない。ま
た、仮に平面的な濃度分布を得ようとして測定を行えば
かなり多くの点でサンプルを採取して顕微鏡による観察
を行わなければならず、多大な観察時間を必要とする。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたもので、蛍光顕
微鏡や画像処理装置等を組合わせて用いて高速で画像処
理を行い、細胞内のカルシウムイオン濃度や水素イオン
濃度等のイオン濃度や巨大分子濃度を、平面的な濃度分
布として把握し得る蛍光顕微鏡装置を提供することを目
的とする。
微鏡や画像処理装置等を組合わせて用いて高速で画像処
理を行い、細胞内のカルシウムイオン濃度や水素イオン
濃度等のイオン濃度や巨大分子濃度を、平面的な濃度分
布として把握し得る蛍光顕微鏡装置を提供することを目
的とする。
［課題を解決するための手段］ 本発明は、光源と、この光源からの光軸に配置され透
過波長の異なる複数の干渉フィルタからなる励起光用フ
ィルタユニットと、この励起光用フィルタユニットのう
ちの所望の干渉フィルタを光軸上に選択配置するための
励起フィルタ切換装置と、前記選択配置された励起光用
の干渉フィルタを通過した励起光をサンプルへ投射して
得られるサンプルからの透過光または反射光の光軸上に
配置された蛍光用干渉フィルタと、この蛍光用干渉フィ
ルタを通過した蛍光像を撮像して画像処理する画像処理
装置と、を具備し、前記励起光用フィルタユニットは、
前記複数の干渉フィルタのうちの少なくとも一つに、そ
の干渉フィルタに対応したNDフィルタが同軸に組み合わ
せられて保持されており、前記励起フィルタ切換装置に
よりこの干渉フィルタとNDフィルタの組み合わせが光軸
上に配置されるようにしたことを特徴とする蛍光顕微鏡
装置である。
過波長の異なる複数の干渉フィルタからなる励起光用フ
ィルタユニットと、この励起光用フィルタユニットのう
ちの所望の干渉フィルタを光軸上に選択配置するための
励起フィルタ切換装置と、前記選択配置された励起光用
の干渉フィルタを通過した励起光をサンプルへ投射して
得られるサンプルからの透過光または反射光の光軸上に
配置された蛍光用干渉フィルタと、この蛍光用干渉フィ
ルタを通過した蛍光像を撮像して画像処理する画像処理
装置と、を具備し、前記励起光用フィルタユニットは、
前記複数の干渉フィルタのうちの少なくとも一つに、そ
の干渉フィルタに対応したNDフィルタが同軸に組み合わ
せられて保持されており、前記励起フィルタ切換装置に
よりこの干渉フィルタとNDフィルタの組み合わせが光軸
上に配置されるようにしたことを特徴とする蛍光顕微鏡
装置である。
また、前記蛍光用干渉フィルタを、透過波長の異なる
複数の干渉フィルタからなる蛍光用フィルタユニットで
構成し、この蛍光用フィルタユニットのうちの所望の干
渉フィルタを光軸上に選択配置するための蛍光フィルタ
切換装置を備えているようにしてもよい。
複数の干渉フィルタからなる蛍光用フィルタユニットで
構成し、この蛍光用フィルタユニットのうちの所望の干
渉フィルタを光軸上に選択配置するための蛍光フィルタ
切換装置を備えているようにしてもよい。
本発明において、細胞を顕微鏡で観察するときは細胞
に予め蛍光試薬を投与するが、かかる蛍光試薬としては
次のものが挙げられる。
に予め蛍光試薬を投与するが、かかる蛍光試薬としては
次のものが挙げられる。
１）カルシウムイオン濃度の測定の場合；商品名fura−
2,商品名Quin−2,商品名Indo−１（下記式（Ｉ））、い
ずれもモレキュラープローブス社（製） ここで、上記Indo−１を利用したカルシウムイオン濃
度測定の場合、その分光特性により後に詳述するfura−
２の場合と比べ次のような違いがある。即ち、fura−２
の場合カルシウムイオン濃度に応じて励起スペクトルの
変化がみられず、Indo−１の場合蛍光スペクトルが第12
図に示す如く変化する。つまり、340nmで励起すると第1
2図のような蛍光スペクトルが得られ、カルシウムイオ
ン濃度に応じて400nm付近で最も大きく変化し、460nmで
は変化しない。また、460nmから550nmの範囲では逆向き
の変化をする。そこで、励起光の波長を固定しておき蛍
光側で二つの波長を選択することにより、二波長測定が
可能となる。波長の組合せは、410nmと460nm,または410
nmと480nmが選ばれる。細胞への導入法はIndo−1/AMを
用い、fura−２の場合と同じである。また、NDフィルタ
を利用して二波長間の比を調整する点もfura−２の利用
の場合と同じである。更に、画像を得たあとの処理も全
く同じである。なお、ステッピングモータのコントロー
ルはfura−２の場合と同様にパーソナルコンピューター
により行われる。
2,商品名Quin−2,商品名Indo−１（下記式（Ｉ））、い
ずれもモレキュラープローブス社（製） ここで、上記Indo−１を利用したカルシウムイオン濃
度測定の場合、その分光特性により後に詳述するfura−
２の場合と比べ次のような違いがある。即ち、fura−２
の場合カルシウムイオン濃度に応じて励起スペクトルの
変化がみられず、Indo−１の場合蛍光スペクトルが第12
図に示す如く変化する。つまり、340nmで励起すると第1
2図のような蛍光スペクトルが得られ、カルシウムイオ
ン濃度に応じて400nm付近で最も大きく変化し、460nmで
は変化しない。また、460nmから550nmの範囲では逆向き
の変化をする。そこで、励起光の波長を固定しておき蛍
光側で二つの波長を選択することにより、二波長測定が
可能となる。波長の組合せは、410nmと460nm,または410
nmと480nmが選ばれる。細胞への導入法はIndo−1/AMを
用い、fura−２の場合と同じである。また、NDフィルタ
を利用して二波長間の比を調整する点もfura−２の利用
の場合と同じである。更に、画像を得たあとの処理も全
く同じである。なお、ステッピングモータのコントロー
ルはfura−２の場合と同様にパーソナルコンピューター
により行われる。
２）pH測定の場合；商品名BCECF（２′,7′−Bis carbo
xyethyl carboxy fluorescein、モレキュラープローブ
ス社（製）） ３）膜電位の測定の場合;Styryl系色素、例えばRH421,R
H460（A.Grinvald,et al,Biophys.J.,1982,pp301−30
8） ［作用］ 本発明の作用は、以下に述べる通りである。ここで
は、カルシウムイオン濃度測定の場合について述べる。
xyethyl carboxy fluorescein、モレキュラープローブ
ス社（製）） ３）膜電位の測定の場合;Styryl系色素、例えばRH421,R
H460（A.Grinvald,et al,Biophys.J.,1982,pp301−30
8） ［作用］ 本発明の作用は、以下に述べる通りである。ここで
は、カルシウムイオン濃度測定の場合について述べる。
（１）蛍光指示薬の投与 まず、神経系の株化細胞（NG108,N115）、グリア由来
の株化細胞（C6Bu−１）に蛍光試薬fura−２（細胞の外
から投与し、細胞内に導入できるようにアセトキシメチ
ルエステル化された誘導体fura−2/AM）を導入した。fu
ra−２の構造は、下記（II）式に示す通りである。
の株化細胞（C6Bu−１）に蛍光試薬fura−２（細胞の外
から投与し、細胞内に導入できるようにアセトキシメチ
ルエステル化された誘導体fura−2/AM）を導入した。fu
ra−２の構造は、下記（II）式に示す通りである。
上記式（II）に示すfura−２は、カルシウムイオンと
特異的に結合し、第８図に示す様な励起スペクトルの変
化が見られる。なお、蛍光スペクトルは510nmにシング
ルピークをもち、バンドパスは10nmである。第８図から
明らかのように、カルシウムの変化に対し異なる波長で
異なった強度変化が起こる場合、二波長測定が有効であ
り、異なる二つの波長で励起し、夫々の蛍光強度の比を
求めることにより定量する。ここで、二波長測定は蛍光
指示薬の濃度，照明強度のばらつき，蛍光指示薬の減衰
を標準化できる。また、二波長のうち、一点は大きく変
化する波長（第８図の場合、波長340nm励起）で、他の
一点は変化しない波長（360nm;カルシウム依存性のない
点）又は逆向きの変化をする波長（380nm）が選ばれ
る。
特異的に結合し、第８図に示す様な励起スペクトルの変
化が見られる。なお、蛍光スペクトルは510nmにシング
ルピークをもち、バンドパスは10nmである。第８図から
明らかのように、カルシウムの変化に対し異なる波長で
異なった強度変化が起こる場合、二波長測定が有効であ
り、異なる二つの波長で励起し、夫々の蛍光強度の比を
求めることにより定量する。ここで、二波長測定は蛍光
指示薬の濃度，照明強度のばらつき，蛍光指示薬の減衰
を標準化できる。また、二波長のうち、一点は大きく変
化する波長（第８図の場合、波長340nm励起）で、他の
一点は変化しない波長（360nm;カルシウム依存性のない
点）又は逆向きの変化をする波長（380nm）が選ばれ
る。
ところで、励起光として340nmと360nmを選択した場
合、第８図に従えば蛍光強度の比（I340/I360）はカル
シウム濃度により0.64〜1.89の間で変化する。但し、第
９図は蛍光分光光度計での測定値であり、測定装置，方
法により変化する。特に、本発明の場合の様に顕微鏡を
用いると、光源，レンズ，反射鏡の波長特性により、I
340/I360比が第８図とは異なる値となる。そこで、励起
光強度を濃淡フィルター（Neutral Density Filter）
を用いて調節し、蛍光強度の比がカルシウム濃度の変化
する範囲の中心で約1.0となるようにする。こうするこ
とにより、使用するカメラのダイナミックレンジを、第
９図に示す如く有効に利用できる。なお、蛍光物質を用
いて測定をする場合、励起による蛍光の減衰が問題とな
る。つまり、第10図の最少検出値以下になれば出力の変
化が小さく、測定不能となる。従って、励起光量を出来
るだけ少なくし、また光の当たっている時間を最少にす
る必要がある。
合、第８図に従えば蛍光強度の比（I340/I360）はカル
シウム濃度により0.64〜1.89の間で変化する。但し、第
９図は蛍光分光光度計での測定値であり、測定装置，方
法により変化する。特に、本発明の場合の様に顕微鏡を
用いると、光源，レンズ，反射鏡の波長特性により、I
340/I360比が第８図とは異なる値となる。そこで、励起
光強度を濃淡フィルター（Neutral Density Filter）
を用いて調節し、蛍光強度の比がカルシウム濃度の変化
する範囲の中心で約1.0となるようにする。こうするこ
とにより、使用するカメラのダイナミックレンジを、第
９図に示す如く有効に利用できる。なお、蛍光物質を用
いて測定をする場合、励起による蛍光の減衰が問題とな
る。つまり、第10図の最少検出値以下になれば出力の変
化が小さく、測定不能となる。従って、励起光量を出来
るだけ少なくし、また光の当たっている時間を最少にす
る必要がある。
（II）細胞内のカルシウムイオン濃度及び分布の時間的
変化の測定； 即ち、測定光340nmとリファレンス光360nmを目的とす
る時間内に移動させ、二波長測定をする。このとき前述
したTVカメラ（SIT）の積算時間内は各干渉フィルタ,ND
フィルタを停止させる機能が必要である。つまり、連続
的に340nm又は360nm等の波長の光を細胞に照射する様な
ことを長時間すると、細胞内の蛍光色素fura−２の蛍光
が減衰してしまい、測定に不利になる。従って、TVカメ
ラの積算時間外では、細胞標本に励起光が照射されない
様に前述したシャッターなどを必要とする。また、各波
長でのTVカメラの積算時間，測定間隔時間は、細胞内カ
ルシウム濃度の変化具合やfura−２濃度等の実験条件に
より、様々に変化する。そのため、これらの時間はプロ
グラム的及びメカニカル的にも対応がとれる様にする事
が重要である。しかるに、本発明の場合、上記の内容を
パソコンへユーザーが入力指示する事により自動的に実
施させる様に構成されている。
変化の測定； 即ち、測定光340nmとリファレンス光360nmを目的とす
る時間内に移動させ、二波長測定をする。このとき前述
したTVカメラ（SIT）の積算時間内は各干渉フィルタ,ND
フィルタを停止させる機能が必要である。つまり、連続
的に340nm又は360nm等の波長の光を細胞に照射する様な
ことを長時間すると、細胞内の蛍光色素fura−２の蛍光
が減衰してしまい、測定に不利になる。従って、TVカメ
ラの積算時間外では、細胞標本に励起光が照射されない
様に前述したシャッターなどを必要とする。また、各波
長でのTVカメラの積算時間，測定間隔時間は、細胞内カ
ルシウム濃度の変化具合やfura−２濃度等の実験条件に
より、様々に変化する。そのため、これらの時間はプロ
グラム的及びメカニカル的にも対応がとれる様にする事
が重要である。しかるに、本発明の場合、上記の内容を
パソコンへユーザーが入力指示する事により自動的に実
施させる様に構成されている。
すなわち、本願第１の発明によれば、光源からの光の
うち励起光用フィルタユニットにより選択された波長の
光だけがサンプルに投射される。励起光用フィルタユニ
ットは透過波長の異なる複数の干渉フィルタを切換装置
により任意に切り換えられるから波長の切換えが高速か
つ容易にでき、例えば前述のfura−２を用いたカルシウ
ムイオン濃度測定のような、複数の異なる波長を励起光
として用いる二波長測定が簡単に行える。また、サンプ
ルから得られる透過光または反射光は、蛍光用干渉フィ
ルタを介して画像処理装置により撮像、画像処理され
る。得られる試料像は画像処理装置で処理されるため、
画像の二次元的な強度分布などの分析も迅速かつ容易に
行える。
うち励起光用フィルタユニットにより選択された波長の
光だけがサンプルに投射される。励起光用フィルタユニ
ットは透過波長の異なる複数の干渉フィルタを切換装置
により任意に切り換えられるから波長の切換えが高速か
つ容易にでき、例えば前述のfura−２を用いたカルシウ
ムイオン濃度測定のような、複数の異なる波長を励起光
として用いる二波長測定が簡単に行える。また、サンプ
ルから得られる透過光または反射光は、蛍光用干渉フィ
ルタを介して画像処理装置により撮像、画像処理され
る。得られる試料像は画像処理装置で処理されるため、
画像の二次元的な強度分布などの分析も迅速かつ容易に
行える。
また、この蛍光顕微鏡装置において蛍光用干渉フィル
タを複数の干渉フィルタを切換可能な蛍光用フィルタユ
ニットとすることで、試料からの光を複数の異なる波長
で評価する二波長測定も簡単にできるようになる。
タを複数の干渉フィルタを切換可能な蛍光用フィルタユ
ニットとすることで、試料からの光を複数の異なる波長
で評価する二波長測定も簡単にできるようになる。
さらに、励起光用フィルタユニットにおいて干渉フィ
ルタに応じたNDフィルタを干渉フィルタに一体的に取り
付けておくことにより、干渉フィルタの切換に伴ってND
フィルタが同時に切り替わるから、選択した透過波長の
それぞれの光量は常に適正に保たれる。
ルタに応じたNDフィルタを干渉フィルタに一体的に取り
付けておくことにより、干渉フィルタの切換に伴ってND
フィルタが同時に切り替わるから、選択した透過波長の
それぞれの光量は常に適正に保たれる。
また、本願第２の発明によれば、第１の発明と逆に、
所定のひとつの波長の光を励起光として用い、試料から
の蛍光の波長を蛍光用フィルタユニットにより任意に選
択することができるので、例えば前述のIndo−１を用い
たカルシウムイオン濃度測定のように、試料からの蛍光
を複数の異なる波長で評価する二波長測定が簡単に行え
る。得られる試料像は、第１の発明と同様に画像処理装
置で処理されるため、画像の二次元的な強度分布などの
分析も迅速かつ容易に行える。
所定のひとつの波長の光を励起光として用い、試料から
の蛍光の波長を蛍光用フィルタユニットにより任意に選
択することができるので、例えば前述のIndo−１を用い
たカルシウムイオン濃度測定のように、試料からの蛍光
を複数の異なる波長で評価する二波長測定が簡単に行え
る。得られる試料像は、第１の発明と同様に画像処理装
置で処理されるため、画像の二次元的な強度分布などの
分析も迅速かつ容易に行える。
［実施例］ 以下、本発明の一実施例を第１図〜第６図を参照して
説明する。ここで、第１図は本発明に係る蛍光顕微鏡装
置のブロック図、第２図は同装置の概略図、第３図は同
装置の光学系を示す平面図、第４図は第３図のＡ矢視
図、第５図は前記装置のフィルタユニット周辺の斜視
図、第６図は上記装置の下部の説明図である。
説明する。ここで、第１図は本発明に係る蛍光顕微鏡装
置のブロック図、第２図は同装置の概略図、第３図は同
装置の光学系を示す平面図、第４図は第３図のＡ矢視
図、第５図は前記装置のフィルタユニット周辺の斜視
図、第６図は上記装置の下部の説明図である。
図中の１は、内部に光源としてのHgランプ２を内蔵し
た落射蛍光照明装置である。ここで、光源はHgランプ以
外に必要な波長を放射するものであれば良く、例えばXe
ランプなども使用できる。この照明装置１には投光管３
が連結され、該投光管３内でかつ前記Hgランプ２の光軸
上にはNDフィルタ4aと干渉フィルタ５からなるフィルタ
ユニット６が配置されている。第１図に示すフィルタユ
ニット６は、NDフィルタ4aと干渉フィルタ５を離間して
光路中に配置した一例を示してある。ここで、前記NDフ
ィルタ4aは、各波長での透過率を調整するために使用す
る。また、前記投光管３の先端には、第５図に示すよう
に後記対物レンズを変えたときの補正を目的に使用され
る（例えば透過率０％,25％,40％,100％の）NDフィルタ
4bが複数個設けられていて、そのうちの一つが光路中に
挿入可能にスライダ等によって切換えられるようになっ
ている。前記Hgランプ２の光軸上には、ダイクロイック
ミラー７が設けられている。ここで、このダイクロイッ
クミラー７は、前記ランプ２からの光束を対物レンズ８
を通してステージ９上のサンプル10に照射するととも
に、サンプル10からの蛍光を通過させる機能を有する。
た落射蛍光照明装置である。ここで、光源はHgランプ以
外に必要な波長を放射するものであれば良く、例えばXe
ランプなども使用できる。この照明装置１には投光管３
が連結され、該投光管３内でかつ前記Hgランプ２の光軸
上にはNDフィルタ4aと干渉フィルタ５からなるフィルタ
ユニット６が配置されている。第１図に示すフィルタユ
ニット６は、NDフィルタ4aと干渉フィルタ５を離間して
光路中に配置した一例を示してある。ここで、前記NDフ
ィルタ4aは、各波長での透過率を調整するために使用す
る。また、前記投光管３の先端には、第５図に示すよう
に後記対物レンズを変えたときの補正を目的に使用され
る（例えば透過率０％,25％,40％,100％の）NDフィルタ
4bが複数個設けられていて、そのうちの一つが光路中に
挿入可能にスライダ等によって切換えられるようになっ
ている。前記Hgランプ２の光軸上には、ダイクロイック
ミラー７が設けられている。ここで、このダイクロイッ
クミラー７は、前記ランプ２からの光束を対物レンズ８
を通してステージ９上のサンプル10に照射するととも
に、サンプル10からの蛍光を通過させる機能を有する。
前記ダイクロイックミラー７の下方には第３図、第４
図に示すようにエミッションフィルタ19及び前記サンプ
ル10からの蛍光を切換える光路切換部が設けられ、この
光路切換部にはビームスプリッター11が内蔵されてい
る。ここで、このビームスプリッター11により、前記サ
ンプル10からの蛍光のうち20％がミラー60を介して第３
図に示す接眼レンズ12へ、残りの80％が第４図に示すTV
カメラ（SIT）13へ送られる。
図に示すようにエミッションフィルタ19及び前記サンプ
ル10からの蛍光を切換える光路切換部が設けられ、この
光路切換部にはビームスプリッター11が内蔵されてい
る。ここで、このビームスプリッター11により、前記サ
ンプル10からの蛍光のうち20％がミラー60を介して第３
図に示す接眼レンズ12へ、残りの80％が第４図に示すTV
カメラ（SIT）13へ送られる。
このTVカメラ13には、TVカメラコントロール機能とデ
ータ処理機能をもつイメージプロセッサ14が連結されて
いる。このイメージプロセッサ14には、RAMディスクを
内蔵したコンピュータ15,モニタ16,プリンタ17が順次接
続されている。ここで、前記コンピュータ15は、ステッ
ピングモータ18のON,OFFを行わせるとともに、データの
記憶を行う。なお、第１図中の19は510nm付近の波長の
蛍光のみを通過させるエミッションフィルタであり、第
２図中の20は透過照明装置である。なお、本実施例のフ
ィルタユニット６は、第１図に示すようにNDフィルタ4a
と干渉フィルタ５を離間して配置し、それぞれをステッ
ピングモータ18、18で駆動するようにしたが、第７図に
示す如く、フィルタ枠41内に押さえ42により干渉フィル
タ44、NDフィルタ45を一体的に組み合わせて取り付けた
構造のものでもよい。
ータ処理機能をもつイメージプロセッサ14が連結されて
いる。このイメージプロセッサ14には、RAMディスクを
内蔵したコンピュータ15,モニタ16,プリンタ17が順次接
続されている。ここで、前記コンピュータ15は、ステッ
ピングモータ18のON,OFFを行わせるとともに、データの
記憶を行う。なお、第１図中の19は510nm付近の波長の
蛍光のみを通過させるエミッションフィルタであり、第
２図中の20は透過照明装置である。なお、本実施例のフ
ィルタユニット６は、第１図に示すようにNDフィルタ4a
と干渉フィルタ５を離間して配置し、それぞれをステッ
ピングモータ18、18で駆動するようにしたが、第７図に
示す如く、フィルタ枠41内に押さえ42により干渉フィル
タ44、NDフィルタ45を一体的に組み合わせて取り付けた
構造のものでもよい。
また、本装置の下部は第６図に示すようになってい
る。同図において、21はベース22に固定された顕微鏡本
体である。前記ベース22上には脚23が固定され、この脚
23には計４ケ（片側の脚23に２ケ）の防振ゴム24を介し
て装置ベース25が固定されている。この装置ベース25上
には、リニアベアリングでレールと移動ブロックを組合
わせたリニアガイドの１本のガイドレール26が固定され
ている。このガイドレール26には２ケの移動ブロックが
組込まれていて移動台27を直線案内するようになってい
る。この移動台27にはラック28が取付けられ、前記装置
ベース25上に防振ゴム29を介して設けられたモータ30の
ピニオン31の回転により移動台27を駆動するようになっ
ている。こうした防振対策により、顕微鏡ステージ上に
ガラス毛細針をセットし、測定対象の細胞内に前記ガラ
ス毛細針を進入させた状態でフィルタユニットを駆動さ
せても、モータ及びメカの振動の伝達（毛細針への）を
防ぐことができ、細胞内のpH,電位等を同時に測定する
ことを可能になる。なお、上記の様な防振対策なしでガ
ラス毛細針を細胞内にさしてフィルタユニットを動かす
と、振動により細胞膜がやぶれること がある。
る。同図において、21はベース22に固定された顕微鏡本
体である。前記ベース22上には脚23が固定され、この脚
23には計４ケ（片側の脚23に２ケ）の防振ゴム24を介し
て装置ベース25が固定されている。この装置ベース25上
には、リニアベアリングでレールと移動ブロックを組合
わせたリニアガイドの１本のガイドレール26が固定され
ている。このガイドレール26には２ケの移動ブロックが
組込まれていて移動台27を直線案内するようになってい
る。この移動台27にはラック28が取付けられ、前記装置
ベース25上に防振ゴム29を介して設けられたモータ30の
ピニオン31の回転により移動台27を駆動するようになっ
ている。こうした防振対策により、顕微鏡ステージ上に
ガラス毛細針をセットし、測定対象の細胞内に前記ガラ
ス毛細針を進入させた状態でフィルタユニットを駆動さ
せても、モータ及びメカの振動の伝達（毛細針への）を
防ぐことができ、細胞内のpH,電位等を同時に測定する
ことを可能になる。なお、上記の様な防振対策なしでガ
ラス毛細針を細胞内にさしてフィルタユニットを動かす
と、振動により細胞膜がやぶれること がある。
次に、上述した蛍光顕微鏡装置の画像データ入力シス
テムについて説明する。
テムについて説明する。
（１）測定前処理 測定条件の入力，及び測定条件ファイルの作成・修正
・保存・削除を、コンピュータ15で行う。
・保存・削除を、コンピュータ15で行う。
（イ）測定条件ファイルの作成；メモリ上の測定条件テ
ーブルを作成し、必要ならばフアィル名を入力し、測定
条件ファイルとしてフロッピーへ保存する。この際、測
定条件としては次の〜が挙げられる。
ーブルを作成し、必要ならばフアィル名を入力し、測定
条件ファイルとしてフロッピーへ保存する。この際、測
定条件としては次の〜が挙げられる。
TVカメラの積算回数;1〜32000回で、これにより測定
時間が決まる。なお、積算回数は、細胞の明るさによっ
て決めるもので、明るければ回数を少なく、暗けれけれ
ば回数を多くする。
時間が決まる。なお、積算回数は、細胞の明るさによっ
て決めるもので、明るければ回数を少なく、暗けれけれ
ば回数を多くする。
測定時間;1/30秒×積算回数以上 測定回数;59以下 測定波長;340nm360nm又は380nm NDフィルタの選択 測定波長の選択 画素配列；縦，横ともに最大512 （ロ）測定条件ファイルの修正；フロッピーより測定条
件ファイルを選択し、メモリ上に測定条件テーブルを展
開し、その修正を行い、必要ならばフロッピーへの保存
を行う。なお、測定条件は前記〜である。
件ファイルを選択し、メモリ上に測定条件テーブルを展
開し、その修正を行い、必要ならばフロッピーへの保存
を行う。なお、測定条件は前記〜である。
（ハ）測定条件ファイルの削除；フロッピーより測定条
件ファイルを指定し、削除する。
件ファイルを指定し、削除する。
（ニ）測定条件のプリンタ出力；フロッピーより測定条
件ファイルを指定し、その内容をプリンタ出力する。
件ファイルを指定し、その内容をプリンタ出力する。
（２）測定処理；測定を行い、その画像データをTVカメ
ラより入力し、コンピュータにとり込む。
ラより入力し、コンピュータにとり込む。
（３）画像データ保存；画像データをフロッピーへセー
ブする。
ブする。
（４）画像データ出力；画像データをモニタ画面に出力
し、またモニタ画面のカラーハードコピーも行なえる。
し、またモニタ画面のカラーハードコピーも行なえる。
次に、上記システムのソフトウェアについて説明す
る。ここで、このソフトウェアは、下記の５ケのメニュ
ーに別れる。
る。ここで、このソフトウェアは、下記の５ケのメニュ
ーに別れる。
（１）自由観察；画面からの指示によって、顕微鏡のフ
ィルタを操作し、ピントチェックを行い、予めCaイオン
濃度測定用の蛍光試薬（fura−２）が投与された細胞を
観察する。
ィルタを操作し、ピントチェックを行い、予めCaイオン
濃度測定用の蛍光試薬（fura−２）が投与された細胞を
観察する。
（２）測定条件登録；自動測定を行うための条件を、画
面より登録する。
面より登録する。
（３）自動測定；測定条件に従い、細胞のカルシウムイ
オン濃度を測定し、フレームメモリに書込まれた画像デ
ータを、コンピュータ15に内蔵したRAMディスクに保存
する。
オン濃度を測定し、フレームメモリに書込まれた画像デ
ータを、コンピュータ15に内蔵したRAMディスクに保存
する。
（４）データFD保存；自動測定により作成されたRAMデ
ィスク内の画像データを、フロッピーディスクに保存す
る。
ィスク内の画像データを、フロッピーディスクに保存す
る。
（５）データ表示;RAMディスクあるいはフロッピーディ
スクにある画像データを、グラフィック画面に疑似カラ
ーで出力する。なお、表示中の画像データのカラーハー
ドコピーが可能である。フロッピーディスクに保存され
た各波長（340nmと360nm）の画像は、画像処理プログラ
ムに従って対応する画素間で比が求められ、検量線によ
りカルシウムイオン濃度に変換される。そして、濃度に
応じた疑似カラーが与えられ、カルシウムイオン濃度分
布図が得られる。
スクにある画像データを、グラフィック画面に疑似カラ
ーで出力する。なお、表示中の画像データのカラーハー
ドコピーが可能である。フロッピーディスクに保存され
た各波長（340nmと360nm）の画像は、画像処理プログラ
ムに従って対応する画素間で比が求められ、検量線によ
りカルシウムイオン濃度に変換される。そして、濃度に
応じた疑似カラーが与えられ、カルシウムイオン濃度分
布図が得られる。
しかして、上記実施例に係る蛍光顕微鏡装置によれ
ば、Hgランプ２を有した落射蛍光照明装置１、干渉フィ
ルタ5,NDフィルタ4aから構成されるフィルタユニット
６、ダイクロイックミラー７、ビームスプリッタ11、及
びTVカメラ13,イメージプロセッサー14,コンピュータ1
5,モニタ16,プリンタ17などからなる画像処理装置から
構成されているため、画像データをグラフィック画面に
疑似カラーで出力し、これにより高速で画像処理しなが
ら細胞内のカルシウムイオン濃度を平面的な濃度分布と
して観察することができる。事実、本発明装置により撮
影したカルシウムイオン濃度分布の模式図は、例えば第
11図のように表示される。なお、同図には３つの細胞
，，が存在しており、例えば各点（Ａ〜Ｅ）のCa
濃度（/nM）はA;94.1、B;82.7、C;110.6、D;90.3、E;3
0.9であり、色分けにより各点の濃度が同時に判別でき
るようになっている（但し、第11図は模式図の為色分け
は省略している）。
ば、Hgランプ２を有した落射蛍光照明装置１、干渉フィ
ルタ5,NDフィルタ4aから構成されるフィルタユニット
６、ダイクロイックミラー７、ビームスプリッタ11、及
びTVカメラ13,イメージプロセッサー14,コンピュータ1
5,モニタ16,プリンタ17などからなる画像処理装置から
構成されているため、画像データをグラフィック画面に
疑似カラーで出力し、これにより高速で画像処理しなが
ら細胞内のカルシウムイオン濃度を平面的な濃度分布と
して観察することができる。事実、本発明装置により撮
影したカルシウムイオン濃度分布の模式図は、例えば第
11図のように表示される。なお、同図には３つの細胞
，，が存在しており、例えば各点（Ａ〜Ｅ）のCa
濃度（/nM）はA;94.1、B;82.7、C;110.6、D;90.3、E;3
0.9であり、色分けにより各点の濃度が同時に判別でき
るようになっている（但し、第11図は模式図の為色分け
は省略している）。
上記実施例では、510nm付近の波長の蛍光のみを通過
させるエミッションフィルタを用いる場合について述べ
たが、これに限らず、例えば第13図及び第14図に示すよ
うに上記エミッションフィルタの代わりにステッピング
モータ51に直結した円板状のフィルターホルダー52を遮
光用ボックス内53内にとりつけてもよい。このホルダー
52には例えば３ケのフィルター挿着用穴54a,54b,54cが
あり、この穴のうち一箇所には例えば410nm（波長幅10
〜20nm）、他の一箇所には460nm（波長幅10〜20nm）の
干渉フィルタ44を夫々NDフィルタ45に重ねて挿着し、残
りの挿着用穴はfura−２測定のとき利用するようにフィ
ルターを挿着しない（100％透過）。このようにすれ
ば、410nmと460nmでの蛍光像の間で比を求め、第15図に
示すカルシウムイオン濃度と蛍光強度比との関係を示す
特性図によりカルシウムイオン濃度を求めることができ
る。ところで、励起光はfura−２で用いた340nmの干渉
フィルタを利用することにより得られる。なお、第14図
において、図中の55はフィルタ位置決め用センサ、56は
結像用レンズ、57はモータ支えである。
させるエミッションフィルタを用いる場合について述べ
たが、これに限らず、例えば第13図及び第14図に示すよ
うに上記エミッションフィルタの代わりにステッピング
モータ51に直結した円板状のフィルターホルダー52を遮
光用ボックス内53内にとりつけてもよい。このホルダー
52には例えば３ケのフィルター挿着用穴54a,54b,54cが
あり、この穴のうち一箇所には例えば410nm（波長幅10
〜20nm）、他の一箇所には460nm（波長幅10〜20nm）の
干渉フィルタ44を夫々NDフィルタ45に重ねて挿着し、残
りの挿着用穴はfura−２測定のとき利用するようにフィ
ルターを挿着しない（100％透過）。このようにすれ
ば、410nmと460nmでの蛍光像の間で比を求め、第15図に
示すカルシウムイオン濃度と蛍光強度比との関係を示す
特性図によりカルシウムイオン濃度を求めることができ
る。ところで、励起光はfura−２で用いた340nmの干渉
フィルタを利用することにより得られる。なお、第14図
において、図中の55はフィルタ位置決め用センサ、56は
結像用レンズ、57はモータ支えである。
［発明の効果］ 以上詳述した如く本発明によれば、蛍光顕微鏡や画像
処理装置等を組合わせて用いて高速で画像処理を行い、
細胞内のカルシウムイオン濃度や水素イオン濃度等のイ
オン濃度や巨大分子濃度を、平面的な濃度分布として把
握し得る蛍光顕微鏡装置を提供できる。
処理装置等を組合わせて用いて高速で画像処理を行い、
細胞内のカルシウムイオン濃度や水素イオン濃度等のイ
オン濃度や巨大分子濃度を、平面的な濃度分布として把
握し得る蛍光顕微鏡装置を提供できる。
第１図は本発明の一実施例に係る蛍光顕微鏡装置のブロ
ック図、第２図は同装置の概略図、第３図は同装置の光
学系を示す平面図、第４図は第３図のＡ矢視図、第５図
は前記装置のフィルタユニット周辺の斜視図、第６図は
前記装置の下部の説明図、第７図は本発明に係るフィル
タユニットの他の例を示す断面図、第８図は蛍光指示薬
fura−２による励起スペクトル特性図、第９図はTVカメ
ラの入力−出力特性図、第10図はカルシウムイオン濃度
と蛍光強度比との関係を示す特性図、第11図は本発明装
置により撮影したカルシウムイオン濃度分布の模式図、
第12図は蛍光強度と波長との関係を示す特性図、第13図
及び第14図は夫々本発明の他の実施例に係る蛍光顕微鏡
装置のフィルタ周辺部の説明図、第15図はカルシウムイ
オン濃度と蛍光強度比との関係を示す特性図である。 １……落射蛍光照明措置、２……Hgランプ、３……投光
管、4a,4b,45……NDフィルタ、5,44……干渉フィルタ、
６……フィルタユニト、７……ダイクロイックフィル
タ、８……対物レンズ、10……サンプル、11……ビーム
スプリッター、12……接眼レンズ、13……TVカメラ、14
……イメージプロセッサ、15……コンピュータ、16……
モニタ、17……プリンタ、18,51……ステッピングモー
タ、24,26……防振ゴム、28……ラック、30……モー
タ。
ック図、第２図は同装置の概略図、第３図は同装置の光
学系を示す平面図、第４図は第３図のＡ矢視図、第５図
は前記装置のフィルタユニット周辺の斜視図、第６図は
前記装置の下部の説明図、第７図は本発明に係るフィル
タユニットの他の例を示す断面図、第８図は蛍光指示薬
fura−２による励起スペクトル特性図、第９図はTVカメ
ラの入力−出力特性図、第10図はカルシウムイオン濃度
と蛍光強度比との関係を示す特性図、第11図は本発明装
置により撮影したカルシウムイオン濃度分布の模式図、
第12図は蛍光強度と波長との関係を示す特性図、第13図
及び第14図は夫々本発明の他の実施例に係る蛍光顕微鏡
装置のフィルタ周辺部の説明図、第15図はカルシウムイ
オン濃度と蛍光強度比との関係を示す特性図である。 １……落射蛍光照明措置、２……Hgランプ、３……投光
管、4a,4b,45……NDフィルタ、5,44……干渉フィルタ、
６……フィルタユニト、７……ダイクロイックフィル
タ、８……対物レンズ、10……サンプル、11……ビーム
スプリッター、12……接眼レンズ、13……TVカメラ、14
……イメージプロセッサ、15……コンピュータ、16……
モニタ、17……プリンタ、18,51……ステッピングモー
タ、24,26……防振ゴム、28……ラック、30……モー
タ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 宮川 厚夫 東京都渋谷区幡ケ谷２丁目43番２号 オ リンパス光学工業株式会社内 (56)参考文献 特開 昭62−263447（ＪＰ，Ａ) 実開 昭56−130150（ＪＰ，Ｕ) 実開 昭62−14357（ＪＰ，Ｕ) 実開 昭62−25847（ＪＰ，Ｕ) 欧州公開263037（ＥＰ，Ａ２)
Claims (2)
- 【請求項１】光源と、 この光源からの光軸に配置され透過波長の異なる複数の
干渉フィルタからなる励起光用フィルタユニットと、 この励起光用フィルタユニットのうちの所望の干渉フィ
ルタを光軸上に選択配置するための励起フィルタ切換装
置と、 前記選択配置された励起光用の干渉フィルタを通過した
励起光をサンプルへ投射して得られるサンプルからの透
過光または反射光の光軸上に配置された蛍光用干渉フィ
ルタと、 この蛍光用干渉フィルタを通過した蛍光像を撮像して画
像処理する画像処理装置と、 を具備し、 前記励起光用フィルタユニットは、前記複数の干渉フィ
ルタのうちの少なくとも一つに、その干渉フィルタに対
応したNDフィルタが同軸に組み合わせられて保持されて
おり、前記励起フィルタ切換装置によりこの干渉フィル
タとNDフィルタの組み合わせが光軸上に配置されるよう
にしたことを特徴とする蛍光顕微鏡装置。 - 【請求項２】前記蛍光用干渉フィルタは、透過波長の異
なる複数の干渉フィルタからなる蛍光用フィルタユニッ
トで構成され、この蛍光用フィルタユニットのうちの所
望の干渉フィルタを光軸上に選択配置するための蛍光フ
ィルタ切換装置を備えていることを特徴とする請求項
（１）記載の蛍光顕微鏡装置。
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