JPH0377048A - 分光顕微鏡 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は特定波長の光を細菌または細胞等の検体に照射
し、それによる発生光（蛍光）から検体の組織を観察す
るための分光顕微鏡に関する。

〔従来の技術〕

通常顕微鏡により細菌または細胞を観察するとき、その
生体にカルシウムイオン等の特定イオンを投与し、イオ
ンの移行を経時的に観察する方法がある。この場合、イ
オンをそのままでは観察できないので蛍光性試薬を細胞
等に取り込ませ、この細胞に試薬特有の励起波長の光を
照射するとイオンと結合または解離して照射光とは別の
特有波長の光（以下単に蛍光という）を出す。この発生
した蛍光の強さからイオン濃度、分布変化状況を観察す
るため、一般に分光顕微鏡が用いられる。その−例を第
８図に示す。

この分光顕微鏡２０は検体Ｗに対する透光ランプＬＰ３
と分光用ランプＬＰ４と目視用接眼レンズＬ１３及びＣ
ＣＤカメラ１１とを備える。

透光用ランプＬＰ３からの光は反射ミラーＭ１及びコン
デンサレンズＬＩＯを介して検体Ｗを照射し、透過光は
切換えミラーＴ　Ｍ、　　レンズ群Ｌ１２１反射ミラー
Ｍ２を介し接眼レンズＬ１３に至る。

また分光用ランプＬＰ４の光軸上にはプリズム等の分光
器ＳＰを配し、分光中の所定波長の光（ｗＪ起波長光）
はレンズ群Ｌ１４及びグイクロイックミラーＤＭを介し
て対物レンズＬｌｌから検体Ｗを照射する。この照射に
伴い発する蛍光は対物レンズＬｌｌ、反射ミラーＭ３及
びレンズ群Ｌ１５を介してＣＣＤカメラ１１に投光さ札
　撮影される。なおこのとき、切換えミラーＴＭはｓＩ
Ｉ／ａの位置に退避している。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記蛍光は通常微弱であり、ＣＣＤカメラにて撮影する
ためには分光用ラングＬＰ４は相当強力であることが必
要であると共に、それでもＳ／Ｎ比が悪く、ノイズが大
きく実用的でなかっ　た。

また光源ランプはハロゲンランプで通常管タイプであり
、ランプの取り替え時には発光位置にすべれを生じ、そ
の都度光軸の調整が必要であり、手数を要する等の問題
がある。

またレンズ、ミラー等は一般に使用される材質では使用
波長光に対し吸収の大きいガラス材質のものがあるが、
これに対する考慮がなされていないのが一般的である。

また分光器は波長のセットは手動であり、迅速かつ正確
な切り換えが困難である。特に分光分析に際し波長の異
なる照射光を照射し、これにより発生する性質の異なる
蛍光から分析することが好ましいが、従来方式ではＣＣ
ＤカメラのＶＤ傷信号応じ分光器の波長の切り換えは困
難である。

更にまた上記蛍光は微弱であり、目視あるいは各種デー
タの取り出し手段を欠くものである。

その他従来方式では照射時間のＯＮ、ＯＦＦの自動制御
を欠く等の欠点がある。

本発明はかかる点に鑑み、微量蛍光の測定を可能とする
と共に、自動制御を行う分光ＩＸＪｉ微鏡を提供するこ
とを目的とする。

〔課題を解決するための４″段〕 上記目的を達成するための本発明の分光顕微鏡は、光源
５分光器、目視用レンズ群、ＣＣＤカメラ及び対物レン
ズ等のレンズ群を備え、光源からの光を分光器により分
光し、所定の励起波長の光を取り出し、検体照射し、発
する賞光強さからイオン濃度を測定する分光顕微鏡にお
いて、光電子増倍管を付設し、ＣＣＤカメラによる撮像
と光電子増倍管による測定とを選択して行うようにした
ものである。

この場合、光源は取り替えを簡単とすべくソケットに嵌
着する球タイプとすることが好ましい。

また、　レンズ群は使用光波長に適合したレンズ材質を
使用することが好ましい。

また、検体からの光路にソレノイドにより揺動するミラ
ーを配し、ソレノイドの通電遮断によりＣＣＤカメラと
光電子増倍管とに入射光を選択することが好ましい。

また、ＣＣＤカメラ、光電子増倍管のそれぞれの入射光
路に光量増幅器（イメージインデンシファイアー）を配
備することが好ましい。

また、光源側にはモータにより回転される回折格子を備
えた自動分光器を取り付け、所定波長光に比例した格子
の回転を自動的に行うことが好ましい。

また、ＣＣＤカメラへの入射光の照射時間を画像形成の
ためのＶＤ信号のフレームに同期して制御することが好
ましい。

また、目視用レンズ群、ＣＣＤカメラ及び光電子増倍管
への入射光はそれぞれ電気回路によるシャッタのＯＮ、
ＯＦＦにより何れか一つに選択規制するようにしてもよ
い。

また、ＶＤ同期信号に同期させて検体への照射時間、Ｃ
ＣＤカメラの画像取り込みタイミング、光電子増倍管入
力タイミングを制御することが好ましい。

また、光源にレーザーを使用するようにしてもよい。

この場合、レーザー光をＣＣＤカメラの走査に同期して
検体を走査させることが好ましい。

また、光電子増倍管の入射光路にモータにより揺動され
る回折格子を備えた自動分光器を配備することが好まし
い。

また、ＣＣＤカメラ出力をビデオレコーダにインプット
することが好ましい。

また、複数の波長の異なった励起光を順次照射し、これ
を繰り返すことが効果的である。この方法によるときは
、異なった発生光の情報を逐次取り出し、イオン濃度を
決定するのにきわめて効果的である。

〔作　用〕 光電子増倍管を付設することにより励起波長光の照射に
より発光する微量蛍光の目視を可能とし、かつデータの
作成等の出力を得ることができる。この場合、波長の異
なる励起波長光の照射により、発光するそれぞれの蛍光
の波形からイオン特性の測定が容易である。

〔実施例〕

第１図乃至第７図は本発明の実施例を示す。

第１図は本発明の分光顕微鏡の概略を示すもので、この
分光顕微鏡１は資料台ＸＹ上の検体Ｗに対し上方から照
射する第１光源ＬＰ１と、下面から照射する第２光源Ｌ
Ｐ２と、目視用接眼レンズＬ８と撮影用ＣＣＤカメラ２
並びに光電子増倍管ＰＭＴを備える。

第１光ｆｉＬＰ１、第２光源ＬＰ２は例えばハロゲンラ
ンプを用いる。またこれら各光源は従来の管タイプを用
いてもよいが、ランプ取り替え時に光軸が狂う欠点があ
る。このため球タイプのものが好ましい。その−例を第
４図及び第５図に示す、即ち光源ＬＰは放電燈とし、プ
ラグａと放電管部すとからなり、プラグａには突起Ｃを
突出し、ソケット（図示省略）に挿入し、回動係止する
ようにしたものである。放電管部すには対をなす放電電
極ｄ、　　ｅを備え、中心位置に放電部ｆを形成する。

従って、光源ＬＰは交換に際しても放電部ｆの位置が狂
うことはない。

第１光源ＬＰＩからの光は全反射ミラーＡＴＭ１による
反射され、コンデンサレンズＬ６により平行光線となり
、検体Ｗを照射する。また第２光源ＬＰ２からの光は回
折格子Ｇ１により分光さ江　所定波長の光はレンズ群Ｌ
５及びソレノイドシャッタＲ３Ｉを介してダイクロイッ
クミラーＤＭにより反射し、対物レンズＬ７を通過して
検体Ｗを下方から照射する。検体Ｗがらの反射光は対物
レンズＬ７、ダイクロイックミラーＤＭを通過し、光軸
上に配備した第１のソレノイドロータリーハーフミラ−
Ｒ３２に至る。このミラーＲ８２がＯＦＦ　（鎖線位置
）のとき、上記反射光は第２のソレノイドロータリーハ
ーフミラ−Ｒ３３に至り、該ミラーＲ９３がＯＮのとき
、反射光はレンズ群Ｌ２、光量増幅器（イメージインデ
ンシファイアー）Ｉｎｔｌを介してＣＣＤカメラ２に至
る。

上記ロータリーハーフミラ−Ｒ８３の下方には全反射ミ
ラーＡＴＭ３を配し、上記ミラーＲ５３のソレノイドが
ＯＦＦのとき反射光は全反射ミラーＡＴＭ３に至り、反
射されてレンズ群Ｌ３、　ロータリソレノイドスイッチ
Ｒ８４を経て全反射ミラーＡＴＭ４に至り、反射されて
フィルタＦ１、光量増幅器Ｉｎｔ２を経て光電子増倍管
ＰＭＴに投光される。

第２図及び第３図は第２光源ＬＰ２側の回折格子Ｇ１を
取り付ける鏡胴の一例を示す。この鏡Ｎ３は第２光源Ｌ
Ｐ２に連結される連結筒４とコンデンサレンズ５と全反
射ミラー６とを同一光軸上に配し、全反射ミラー６によ
る反射光は回折格子Ｇ１を照射する。この回折格子Ｇ１
は反射形とし、グレーティング７とこれの回転用ステッ
ピングモータＭ１及びフォトセンサＳ１とを備える。区
側はフォトセンサＳ１は１個のみを示したが、後述する
如く２種類の励起波長光を選択して発するためには２個
のフォトセンサを設ける。

この回Ｆｒ格子Ｇｌの反射光軸には前述のソレノイドシ
ャッタＲ８Ｉ及びレンズＬ５を備える（但し本ＭＦＲは
第１図とはソレノイドシャッタとレンズとの配置が逆に
なっている）。ソレノイドシャッタＲ５Ｉはドラム８と
駆動用ロータリソレノイド９と両者を連結する連結ロッ
ド】０とからなり、　ドラム８には十字形に透孔１１を
穿孔する。１２は一方の透孔に必要により取り付けたＵ
Ｖフィルタである。これによりドラム８を４５６回転す
る毎に回折格子Ｇ１からの光をＯＮ、ＯＦＦする。図中
Ｖ１は光量絞り、Ｖｌｌは視野絞りである。なお、第１
図におけるｖｌ２も同様に視野絞りである。

また、上記各レンズ、ハーフミラ−の材質は好ましくは
使用波長光の吸収の小さいガラスを使用する。例えば紫
外光に対しては合成フユーズドシリカが好ましい。

次に上記分光顕微鏡による測定要領を説明する。先ず、
第１光源ＬＰＩを点灯し、コンデンサレンズＬ６で収束
されて資料台ＸＹ上の検体Ｗを照射する。対物レンズＬ
７により得られる検体像はダイクロイックミラー〇Ｍを
通過し、ハーフミラ−Ｒ５２をＯＮすることにより反射
さ札　レンズ群Ｌ１で拡大され、全反射ミラーＡＴＭ２
で反射後接眼レンズＬ８に至る。これにより検体Ｗ中の
測定物（例えば細胞）を所定位置にセットする。

次いで、予め投与した試薬特有の励起波長光の照射によ
る測定に移る。先ずＣＣＤカメラ２による撮影に際して
は第２光［ＬＰ２からの光を回折格子Ｇｌで一定波長の
光に分光し、光量絞りｖｌ、視野絞りＶＩＬを通り、　
レンズＬ５で収束され、シヤツクＲ３Ｉを経てダイクロ
イックミラーＤＭで反射し、対物レンズＬ７で更に収束
されて検体Ｗを照射する。これにより検体Ｗから発する
特有波長の光（以下単に蛍光という）は対物レンズＬ７
で拡大され、ハーフミラ−Ｒ８２をＯＦＦすることによ
りミラーＲ３３に至り、該ミラーをＯＮすることにより
反射してレンズ群Ｌ２で更に拡大される。この像は光量
増幅器Ｉｎｔｌで増幅されてＣＣＤカメラ２に入る。

次に光電子増倍管ＰＭＴに対する投光について説明する
。この場合には、ソレノイドロータリーハーフミラ−Ｒ
３３までは上記ＣＣＤカメラの場合と同一である。ただ
し、このこのミラーＲ３３をＯＦＦ位置とすることによ
り蛍光は全反射ミラーＡＴＭ３に至り、反射された光は
レンズ群Ｌ３で収束され、シャッタＲ５４を通り、全反
射ミラーＡＴＭ４で反射され、フィルターＦで波長選択
後、光量増幅器１ｎｔ２で増幅されて光電子増倍管ＰＭ
Ｔに入る。なお鎖線で示す如く、フィルターＦを削除し
て前述の自動回折格子Ｇｌと同一の自動河ｔｔｒｔｔｉ
子Ｇ２を配してもよい。

なお分光分析に際し、検体から発する蛍光は微弱であり
、その光の強弱から直接イオン濃度の強弱を判断するこ
とは困難な場合がある。このため試薬特有の特質の異な
る（例えば一方はイオンと結合、他方は解１１）２種の
励起波長光を照射し、両波長兄による異なる蛍光を測定
し、両者の比較によりイオン濃度変Ｌ　　分布状態を測
定することが好ましい。

本発明によるとは、ＣＣＤカメラにより同一画面に両賞
光による像を重合して表示することが可能である。かつ
またＣＣＤカメラによる撮影と共に光電子増倍管ＰＭＴ
へも同時に蛍光信号の送達を可能とするものである。

その要領を第６図及び第７図を参照して説明する。ただ
し、接眼レンズＬ８による巨視は終了しているものとし
、第２光源ＬＰ２を点灯し、第１のソレノイドロータリ
ーハーフミラ−Ｒ８２はＯＦＦの位置にあるものとする
。

第６図において（ａ）はＶＤ信号を示し、１　ａ。

２　ａ、　　３　ａ・・・はそれぞれａｄｄフィールド
開始点、ｌｂ、２ｂ、３ｂ・・・はそれぞれｅｖｅｎフ
ィールド開始点とする。即ち、１ａ−１ｂ間及び１ｂ−
２ａ間はそれぞれ１フィールド１ｌａ−２ａ間の長さは
１フレームである。

また（ｂ）は回折格子Ｇｌの波長切り換えタイミングを
示すもので、上記第１ｅｖｅｎフイールド開始点１ｂと
同期して作動し、第１の波長光ｋｌを発光する位置に停
止する。この切り換えは１フイ一ルド時間以内とする。

これにより検体Ｗには第１波長光が照射さへ　所定時間
例えば第３ｅｖｅｎフイールド開始点３ｂと同期して第
２の波長光ＮＩＩＬ２を発光する位置に切り換える。こ
れによる＆１．に２の波長光の照射時間を同図（ｄ）に
示す。

上記ＶＤ信号と同期してロータリーハーフミラ−Ｒ３３
を切り換える。即ち、常時は該ミラーＲ３３はＯＦＦの
位置にあり、第２ｅｖｅｎフイールド開始点２ｂと同期
してＯＮ、　　第４ａｄｄフイールド開始点でＯＦ　Ｆ
、　　第４ｅｖｅｎフイールド開始点でＯＮとする。こ
れにより光電子増倍管ＰＭＴには（ｅ）図に示す如く２
ａ−２ｂ、　　４　ａ　−４ｂフィールド間は投光され
る。

なお、ＣＣＤカメラに対しては（ｆ）図に示す如くブラ
ンクの時間があり、ＣＣＤカメラに対する画像取り込み
時間は同図（ｃ）に示す如く、第１波長光に対する蛍光
は２ｂ−３ｂフレーム、第２波長光に対する蛍光は５ｂ
−８ｂフイ一ルド間となる。ＣＣＤカメラは一般に１秒
間に３０フレームの一面が表示されるものであり、従っ
て第１．第２の両波長兄照射による２種の蛍光が重合し
て表示される。

第７図は上記走査を行うためのブロックダイアグラムで
ある。回折捨子Ｇ１のステッピングモータＭ１の回動ス
テップ数並びに照射時間を予め設定し、上記モータＭ１
をＶＤ信号のフィールド（フレーム）と同期させて回動
し、同時にシャッタＲ３Ｉを開閉し、検体に対する投光
時間を設定するようにしたものである。その他の作動は
前述と重複する故説明を省略する。但し、図はＣＣＤカ
メラの出力をビデオレコーダにストックするようにした
ものであり、モニターにより監視すると共に、コンピュ
ータＣＰＵにインプットするものである。

なお、光電子増倍管ＰＭＴの出力もコンピュータＣＰＵ
にインプットする。コンピュータはそれぞれの蛍光の情
報を逐次取り出し、整理し処理する。

なお、上記実施例は光源としてハロゲンランプを用いた
が、第２光源として所定波長のレーザーを用いてもよい
。この場合、レーザーの光束を検体全面を照射する大き
さとしてもよく、あるいはこれを絞って微小点とし、Ｃ
ＣＤカメラのスキャニングに同期して検体面を走査させ
るようにしても良い。この場合のレーザー光の走査のた
めの偏光要領は適宜の周知装置を用いるものであり、説
明を省略する。

〔発明の効果〕

本発明によるときは、下記の効果を有する。

（１）本発明は光電子増倍管を付設したから、ＣＣＤカ
メラによる撮影と共に、微弱蛍光による像の目視を可能
とすると共に、各種データの測定が可能となる。

（２）光源はソケットに嵌着する球タイプとじたことに
より取り替え簡単であると共に、取り替えに際し光軸が
狂うことはない。

（３）レンズ群は使用光波長に適合した材質とするとき
は、使用光（蛍光を含む）を吸収することがなく、従っ
て微弱光での測定を可能とする。

（４）検体からの光路にソレノイドにより揺動するミラ
ーを配し、ソレノイドの作動によりＣＣＤカメラと光電
子増倍管とに入射光を選択するときは、切り換えが外部
より迅速かつ正確に行うことができる。

（５）ＣＣＤカメラ、光電子増倍管のそれぞれの光路に
光量増幅器を配備するときは、Ｓ／Ｎ比を向上し、ノイ
ズを減少できる。

（６）分光手段としてモニターにより回転される回折格
子を備えた自動分光器を使用するときは、投射波長光の
切り換えを迅速且つ自動的に行うことができる。

（７）ＣＣＤカメラへの入射光の照射時間をＶＤ信号の
フレームに同期させるときは画像の乱れを生ずることは
ない。

（８〉目視顕微鏡、ＣＣＤカメラ及び光電子増倍管への
入射光を電気的シャッタによるＯ　Ｎ。

ＯＦＦとするときは、切り換えを自動的にかつ瞬時に行
うことができる。

（９）ＶＤ信号に同期させて検体への照射時間、ＣＣＤ
カメラの百像取り込みタイミング、光電子増倍管入力タ
イミングを制御するときは、ＣＣＤカメラの！ｆ　（Ｌ
　　光電子増倍管出力に乱れを生ずることはない。

（１０）光源にレーザーを使用するときは、光の波長は
単波長で強力とすることができる。

（＋ｉ）また上記レーザー光をＣＣＤカメラの走査に同
期し検体を走査させるときは照射光は強力となり、従っ
てＣＣＤカメラの画像質の向上を図ることができる。

（１２）光電子増倍管の入射光路に波長選択用として回
折格子を備えた自動分光器を配備するときは、使用光の
波長偏光に対し迅速に切り換えることができる。

（１３）ＣＯＤカメラの出力をビデオレコーダにインプ
ットするときは、繰り返し観察するのに便利である。

（１４）複数の波長の異なった励起光を順次照射すると
きは、得られるそれぞれの蛍光は特徴を異にしており分
析に便利である。

（１５）更にそれぞれの蛍光の情報を取り出すことによ
り分析を正確に行うことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図乃至第７図は本発明の実施例に関し、第１図は本
発明の分光顕微鏡の概略説明図、第２図は回折格子を取
り付ける鏡胴の縦断面図、第３図は第２図における右側
面図、第４図は光源の正面図、第５図はその右側面図、
第６図はＶＤ信号と回折格子の波長切換時期、ＣＣＤカ
メラ画像取り込み時期、光電子増倍管への光入射時期と
の関係グラ入　第７図は第６図に示す操作を行うための
ブロックダイヤグラムであり、また第８図は従来の分光
顕微鏡のｓｑ説明図であ　る。 １は分光顕微鏡、２はＣＯＤカメラ、ＬＰＩ。 Ｌ　Ｐ　２は光源、Ｇｌ、Ｇ２は回折格子、Ｌ１〜Ｌ３
及びＬ５はレンズ群、Ｌ６はコンデンサレンズ、　Ｌ７
は対物レンズ、　Ｌ８は接眼レンズ、Ｒ５Ｉはソレノイ
ドシャッタ、　Ｒ３２，ＲＳ３はソレノイドロータリー
ハーフミラ−Ｉｎｔｌ、Ｉｎｔ２は光量増幅器、ＰＭＴ
は光電子増倍管である。