JP2006195076A - 走査型光学装置 - Google Patents

Abstract

【課題】 各波長毎の明るさが一様な画像を取得することができる走査型光学装置を提供する。
【解決手段】 レーザユニット１からの励起光を対物レンズ１３を介して標本１８面上に集光するとともに光学的に２次元走査する走査光学系Ａを有し、標本１８からの光を分光して受光する複数チャンネルのセルを有する光電変換素子１７の各セルの光電変換の増幅度を決定する印加電圧を調整可能としている。
【選択図】図１

Description

本発明は、標本に対してレーザ光を２次元走査し、標本からの光を検出する走査型光学装置に関するものである。

走査型光学装置である走査型レーザ顕微鏡は、レーザ光を走査光学系及び対物レンズを介して標本のＸ軸およびＹ軸方向に走査しながら照射し、標本からの蛍光または反射光を、再び対物レンズおよび走査光学系を介して検出器で検出して蛍光又は反射光の二次元の輝度情報取得するようにした顕微鏡である。又、この輝度情報をＸＹ走査位置に対応させてＣＲＴディスプレイなどに輝点の２次元分布として表示することによって、標本の蛍光像あるいは反射像を観察することも可能にしている。

一方、検出光学系の標本と共役な位置に、被測定光の回折限界程度の径を有した絞りを設けることにより、焦点の合っている面の情報のみを検出する共焦点走査型レーザ顕微鏡もある。この共焦点走査型レーザ顕微鏡は、合焦面の情報だけを検出できるため、標本を傷付けることなく、光学的な断層像、すなわち３次元情報を得ることができ、しかも、非合焦面の情報をカットすることによって、非常にシャープな画像が得られるという特徴を有している。

ところで、このような走査型光学装置は、励起レーザ光を、蛍光試薬で染色された標本上で走査し、蛍光試薬の励起により発せられる反応光（蛍光）を取得するような蛍光観察に多く用いられるようになっている。また、最近、蛍光観察の手法の多様化とともに、蛍光試薬として、励起波長の異なるものを複数使用し、これら蛍光試薬を励起するための波長の異なるレーザ光を発生する複数のレーザ光源を用いたものも実用化されている。

このような現状に対し、励起波長の異なる蛍光試薬の励起により発生される蛍光を同時に検出可能としたものとして、例えば、特許文献１に開示されるように、光学レンズ系より導かれた光を分光フィルタで分光し、これら分光された波長の光を光電子増倍管により検出するようにした光電変換素子が知られている。

このような光電変換素子は、多波長に光を分光する分光手段と、複数の蛍光波長の強度を検出する複数の受光手段（セル）を組み合わせたもので、これら複数のセルにより分光された複数の波長の光強度を同時に検出するようにしており、これらの検出データにより様々な解析を可能にしている。
特開２０００-１４６６９７号公報

しかしながら、このような複数波長の光強度を検出可能とした多波長分光型の光電変換素子は、構造上、それぞれのセルに対して各別に光電変換の増幅度を決定する印加電圧を調整することかできない。そのため、これらの複数のセルで同時に複数波長の光強度を検出すると、光電変換素子の分光感度特性の関係で、各セルで検出された画像の明るさが異なることがある。この結果、各セルで取得した画像をそのまま合成すると、明るさの異なるもの同士が合わさるため、実際のものと異なる画像になることがある。

そこで、各セルで検出された光強度について、後処理で、波長毎に画像輝度を補正する方法があるが、輝度補正によりデータの分解能が落ちるという問題点が発生する。また、光電変換により電気信号とした後に、電気的な処理により補正する方法もあるが、全ての波長を対象にして調整を行なうとなると、回路構成が複雑になるという問題も生じる。

本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、各波長毎の明るさが一様な画像を取得することができる走査型光学装置を提供することを目的とする。

請求項１記載の発明は、励起光を発生する光源と、前記光源からの励起光を対物レンズを介して標本面上に集光するとともに光学的に２次元走査する走査光学系と、前記標本からの光を分光して受光する複数チャンネルのセルを有する光電変換素子と、前記光電変換素子の各セルの光電変換の増幅度を決定する印加電圧を調整する印加電圧調整手段と、を具備したことを特徴としている。

請求項２記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記印加電圧調整手段は、各チャンネルのセルより取得される画像の明るさが同一になるように各セルの印加電圧を調整可能としたことを特徴としている。

請求項３記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記光電変換素子の有する分光感度特性の各セルに対応する波長域における感度の平均値に基づいて求められた各セル相互の印加電圧の情報を予め用意し、前記印加電圧調整手段は、任意のセルの印加電圧の調整により、前記予め用意された情報に基づいて他のセルの印加電圧を調整可能としたことを特徴としている。

請求項４記載の発明は、請求項１記載の発明において、基準となる多波長光源の各波長に基づいて前記光電変換素子の各セルに対応する各波長ごとの印加電圧の情報を予め用意し、前記印加電圧調整手段は、各波長の指定に基づいて、前記予め用意された情報に基づいて各セルの印加電圧を調整可能としたことを特徴としている。

請求項５記載の発明は、請求項３又は４記載の発明において、前記予め用意される印加電圧の情報は、記憶手段に保存可能としたことを特徴としている。

請求項６記載の発明は、請求項３乃至５のいずれかに記載の発明において、前記印加電圧調整手段は、各セルの印加電圧の調整を自動で行なうことを特徴としている。

本発明によれば、例えば、多波長分光型の光電変換素子において、波長毎の明るさが一様な画像を取得することができる走査型光学装置を提供できる。

以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。

（第１の実施の形態）
図１は、本発明の第１の実施の形態に適用される共焦点走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示している。

図１において、１は光源としてのレーザユニットで、このレーザユニット１には、波長の異なるレーザ光（励起光）を発振するレーザ光源２、３、４が設けられている。

レーザ光源２からのレーザ光の光路上には、反射ミラー５が配置されている。また、レーザ光源３からのレーザ光の光路上には、反射ミラー５で反射されるレーザ光との交点上にダイクロイックミラー６が配置されている。ダイクロイックミラー６は、これら２つのレーザ光路を合成するもので、レーザ光源３からのレーザ光を反射し、反射ミラー５で反射されるレーザ光を透過するようになっている。また、レーザ光源４からのレーザ光の光路上には、ダイクロイックミラー６で合成されたレーザ光との交点上にダイクロイックミラー７が配置されている。ダイクロイックミラー７は、これら２つのレーザ光路を合成するもので、レーザ光源４からのレーザ光を透過し、ダイクロイックミラー６からのレーザ光を反射するようになっている。

ダイクロイックミラー７により合成されたレーザ光の光路上には、走査光学系Ａとして、ダイクロイックミラー８、走査光学ユニット９、瞳投影レンズ１０、反射ミラー１１、結像レンズ１２、対物レンズ１３が配置されている。

ダイクロイックミラー８は、標本１８を染色する蛍光色素の励起波長（レーザ波長）と蛍光色素の蛍光波長によって特性が決定されている。例えば、蛍光指示薬にカルシュウムイオン指示薬のｆｌｕｏ−３、レーザ光として４８８ｎｍ（例えばアルゴンレーザ）を使用しているものとすると、ｆｌｕｏ−３は、蛍光波長５３０ｎｍの光を発生するので、この場合のダイクロイックミラー８は、４８８ｎｍのレーザ光（励起光）を透過し、５３０ｎｍの蛍光波長の光を反射するような特性を有するものが用いられる。

走査光学ユニット９は、直交する２方向に光を偏向するための２枚のミラー９ａ、９ｂを有し、これらのミラー９ａ、９ｂにより標本１８上に集光されるレーザ光を２次元方向に走査するようになっている。瞳投影レンズ１０は、レーザ光によるビーム径を対物レンズ１３の瞳径に変更するものである。結像レンズ１２は、瞳投影レンズ１０を透過したレーザ光を対物レンズ１３を介して標本１８の焦点位置に集光させるものである。

これにより、走査光学ユニット９で２次元走査されたレーザ光は、瞳投影レンズ１０、反射ミラー１１、結像レンズ１２、対物レンズ１３を介してステージ１９に載置された標本１８の焦点位置に結像され、標本１８から発せられた蛍光は、上述したと逆の光路をたどって対物レンズ１３、結像レンズ１２、反射ミラー１１、瞳投影レンズ１０、走査光学ユニット９を介してダイクロイックミラー８まで戻るようになっている。

ダイクロイックミラー８の蛍光の反射光路上には、検出光学系Ｂとして、測光フィルタ１４、レンズ１５、共焦点ピンホール１６および光検出手段としての光電変換素子１７が配置されている。測光フィルタ１４は、標本１８からの蛍光波長を選択するものである。共焦点ピンホール１６は、対物レンズ１３の焦点と光学的に共役な位置に配置され、標本１８からの蛍光のうち合焦の成分を通過し、非合焦の成分を遮断して高い空間分解能を与えるためのものである。光電変換素子１７は、共焦点ピンホール１６を通過した蛍光の強度を検出するものである。この場合、光電変換素子１７は、多波長に光を分光する分光器と、各波長毎の光強度を検出する複数チャンネルのセルを組み合わせた多波長分光型のもので、これら複数のセルにより対応波長の蛍光を検出するとともに、それぞれ電気信号に変換して出力するようにしている。

光電変換素子１７には、制御手段としてのコントロールユニット２０が接続されている。コントロールユニット２０には、走査光学ユニット９および表示装置２１が接続されている。コントロールユニット２０は、走査光学ユニット９での２次元走査に対応させて光電変換素子１７からの電気信号を取り込むとともに、この電気信号をデジタル値に変換し、さらに２次元走査にしたがった標本１８上の焦点面からの蛍光の強度分布に応じた濃淡画面を生成し、表示装置２１に表示させるようにしている。

また、コントロールユニット２０は、光電変換素子１７の各チャンネルのセルに対して光電変換の増幅度を決定する印加電圧を各別に調整する印加電圧調整手段を有している。

図２は、コントロールユニット２０の印加電圧調整手段として光電変換素子１７の各セルの印加電圧を調整するための操作部２０ａを示すもので、この操作部２０ａには、分光される各波長に対応する複数チャンネルのセル、ここでは、チャンネル１〜３２のセルに対応させた操作摘み２０ｂが設けられている。これら操作摘み２０ｂは、それぞれの操作により、対応チャンネルのセルの印加電圧を調整して、それぞれの受光感度を制御できるようになっている。

なお、図面中２２は、光強度変換装置で、この光強度変換装置２２は、コントロールユニット２０からの指示によりレーザユニット１からのレーザ光の強度を調整可能としたものである。

次に、このように構成した第１の実施の形態の作用を説明する。

まず、共焦点走査型レーザ顕微鏡について、簡単に説明する。レーザユニット１からレーザ光が発せられると、レーザ光は、励起光としてダイクロイックミラー８を透過し、走査光学ユニット９に入射し、ミラー９ａ、９ｂで２次元方向に走査され、瞳投影レンズ１０、反射ミラー１１、結像レンズ１２を介して対物レンズ１３に入射し、標本１８上に集光される。

標本１８にレーザ光が照射されると、蛍光試薬が励起され蛍光が発せられる。標本１８からの蛍光は、先の光とは逆に、対物レンズ１３を透過し、結像レンズ１２、反射ミラー１１、瞳投影レンズ１０、走査光学ユニット９を介してダイクロイックミラー８に入射する。そして、ダイクロイックミラー８で反射し、測光フィルタ１４、レンズ１５、共焦点ピンホール１６に結像される。

共焦点ピンホール１６は、標本１８からの蛍光のうち合焦の成分のみを通過させる。共焦点ピンホール１６を通過した蛍光は、光電変換素子１７で分光されるとともに、複数チャンネルのセルで検出され電気信号に変換される。光電変換素子１７からの電気信号は、コントロールユニット２０に送られ、走査光学ユニット９の２次元走査に対応させてデジタル値に変換され、標本１８上の焦点面からの蛍光の強度分布に応じた濃淡画面が蛍光観察画像として表示装置２１に表示される。

次に、光電変換素子１７の各セルにより取得される各波長毎の画像の明るさを一様に調整する方法を説明する。

この場合、図３に示すフローチャートが実行される。まず、ステップ３０１で、標本１８の蛍光観察画像をリアルタイムで取得する。この蛍光観察画像の取得方法は上述した通りである。

次に、ステップ３０２で、取得した蛍光観察画像を各セル別に表示装置２１に表示させる。この場合、図４（ａ）、（ｂ）、…に示すようにチャンネル１、２、…の各セルに対応した画像を更新しながら表示する。

次に、ステップ３０３で、表示装置２１に表示される各セル毎の画像について、最適な輝度になるような調整を行なう。この場合、例えば、図４（ａ）に示すチャンネル１のセルに対応した画像が表示装置２１に表示されているものとすると、図２に示す操作部２０ａのチャンネル１のセルに対応する操作摘み２０ｂを手動操作して印加電圧を調整し、最適な輝度の画像が得られるようにする。以下、図４（ｂ）に示すチャンネル２のセルに対応した画像、さらにチャンネル３以降のセルに対応した画像についても同様にして操作部２０ａの各チャンネルのセルに対応する操作摘み２０ｂを操作して印加電圧を調整し、それぞれ最適な輝度の画像が得られるようにする。

このような輝度調整は、ステップ３０４で、各チャンネルのセルに対応した画像の明るさが均一と判断できるまで行われる。その後、ステップ３０５に進み、改めて標本１８の蛍光観察画像をリアルタイムで取得し、表示装置２１に表示させる。

したがって、このようにすれば、多波長分光型の光電変換素子１７の各波長毎の光強度を検出する複数チャンネルのセルについて、それぞれの光電変換の増幅度を決定する印加電圧を手動により調整できるようにしたので、全てのセルについてコントラストが高く、輝度の最大値が一定以上の良好な画像を取得することができる。これにより、各波長毎の光強度を検出する複数チャンネルのセルを有する光電変換素子１７を適用した場合、各セル間に存在する分光感度特性の関係で各セルで検出された画像の明るさが異なることがあっても、これら画像の明るさを各別に調整できるので、各セルについて明るさが同一で最適な画像を取得することができる。また、光電変換素子１７の各セル毎の印加電圧が調整可能であることから、励起波長の異なる蛍光試薬に対する適用範囲が広まり、様々な標本の観察が可能となる。

なお、上述した第１の実施の形態では、各セルに対する画像の取得、各セルの印加電圧の調整を手動操作により行なうようにしたが、これら各セルに対する画像の取得から、最適輝度を得られるような各セルの印加電圧の値を探す作業の一部又は全てをパソコンなどの制御手段で自動的に行なうようにしても良い。

（第２の実施の形態）
次に、本発明の第２の実施の形態を説明する。

この場合、第２の実施に適用される共焦点走査型レーザ顕微鏡については、図１と同様なので、同図を援用するものとする。

この場合、光電変換素子１７が図５（ａ）に示すような分光感度特性を有するものとする。まず、この分光感度特性を参考にして、同図（ｂ）に示すように各チャンネルのセルに対応する波長域＃１、＃２、…における感度の平均値２３ａ、２３ｂ、２３ｃ、２３ｄ…を求め、これら平均値２３ａ、２３ｂ、２３ｃ、２３ｄ…に対し、それぞれ相対的な比を求める。そして、これらの比に対し、明るさが均一になるように感度平均値の逆数から各セル相互の印加電圧の比を算出し、この算出した値を印加電圧の情報として、記憶手段であるルックアップテーブルに格納する。そして、その後は、任意のセルの印加電圧を調整した際に、ルックアップテーブルの印加電圧の情報を参照して、その他のセルについても同じ明るさになるように印加電圧を自動的に調整するようにする。

この場合、図６に示すフローチャートが実行される。まず、ステップ６０１で、任意のチャンネルのセルの印加電圧の調整が行なわれると、ステップ６０２で、ルックアップテーブルを参照し、ステップ６０３で、その他のチャンネルのセルついても印加電圧を自動的に調整する。このような自動調整は、ステップ６０４で、全てのチャンネルのセルの明るさが均一と判断できるまで行われる。その後、ステップ６０５に進み、改めて標本１８の蛍光観察画像をリアルタイムで取得し、表示装置２１に表示させる。

したがって、このようにすれば、多波長分光型の光電変換素子１７の各波長毎の光強度を検出する複数チャンネルのセルについて、それぞれの光電変換の増幅度を決定する印加電圧を自動的に調整できるので、観察者の作業工数を削減することができ、効率の良い蛍光観察を行なうことができる。勿論、この場合も、第１の実施の形態と同様な効果を得ることができる。

（第２の実施の形態の変形例）
上述したルックアップテーブルは、光電変換素子１７やコントロールユニット２０の電気回路内に設定してもよいし、または、コントロールユニット２０としてパソコンなどの制御機器を用いる場合、これらパソコンなどの制御機器内に設定してもよい。

また、上述では、任意のセルの印加電圧を決定すると、自動的に他のチャンネルのセルの印加電圧が決定されるようにしているが、印加電圧を決定する任意のセルが複数の場合、これらセルにそれぞれ隣接するセルの印加電圧を決定するようにしても良い。

さらに、モノクロメータ等の測定器により予め波長特性の判明している白色光源等の多波長光源を使用し、この光源を基準光源として、各波長の光を各セルで測定し、これら各セルでの測定値が基準光源の波長特性と一致するような印加電圧の値を求め、これらの値を各セルに対応する各波長ごとの印加電圧の情報として用意しておき、その後の波長の指定に基づいて、予め用意された情報に基づいて各セルの印加電圧を調整を行なうようにすることもできる。このようにしても、複数チャンネルのセルについて、それぞれの光電変換の増幅度を決定する印加電圧を自動的に調整できるので、観察者の作業工数を削減することができ、効率の良い蛍光観察を行なうことができる。

その他、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。

上述した実施の形態において、各セル印加電圧を決定するための各種の値は、全てハードウエアまたはソフトウエアの状態で記憶手段に記憶し、自由に読み出し加工できるようにすることが望ましい。こうすれば、装置の電源を切って電源を再投入したときも、光電変換素子１７の各セルの印加電圧の情報を直ちに再現して使用することができる。

また、上述した実施の形態では、共焦点走査型レーザ顕微鏡について述べたが、これに限らず各種の走査型光学装置に適用することができる。さらに、走査光学ユニット９の２次元光走査機構に変えて、１次元光スキャナによって対物レンズ１３の集束光を標本１８の１ライン上で走査し、標本１８を観察するような構成であっても良い。

さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。

本発明の第１の実施の形態に適用される共焦点走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示す図。 第１の実施の形態に用いられるセルの印加電圧を可変するための操作部の概略構成を示す図。 第１の実施の形態の動作を説明するためのフローチャート。 第１の実施の形態の各セルに対応した画像例を示す図。 本発明の第２の実施の形態を説明するための図。 第２の実施の形態の動作を説明するためのフローチャート。

符号の説明

１…レーザユニット、２〜４…レーザ光源
５…反射ミラー、６〜８…ダイクロイックミラー
９…走査光学ユニット、９ａ．９ｂ…ミラー
１０…瞳投影レンズ、１１…反射ミラー
１２…結像レンズ、１３…対物レンズ
１４…測光フィルタ、１５…レンズ
１６…共焦点ピンホール、１７…光電変換素子
１８…標本、１９…ステージ
２０…コントロールユニット、２０ａ…操作部
２０ｂ…操作摘み、２１…表示装置
２２…光強度変換装置、２３ａ、２３ｂ、…平均値

Claims (6)

1. 励起光を発生する光源と、
   前記光源からの励起光を対物レンズを介して標本面上に集光するとともに光学的に２次元走査する走査光学系と、
   前記標本からの光を分光して受光する複数チャンネルのセルを有する光電変換素子と、
   前記光電変換素子の各セルの光電変換の増幅度を決定する印加電圧を調整する印加電圧調整手段と、
   を具備したことを特徴とする走査型光学装置。
2. 前記印加電圧調整手段は、各チャンネルのセルより取得される画像の明るさが同一になるように各セルの印加電圧を調整可能としたことを特徴とする請求項１記載の走査型光学装置。
3. 前記光電変換素子の有する分光感度特性の各セルに対応する波長域における感度の平均値に基づいて求められた各セル相互の印加電圧の情報を予め用意し、
   前記印加電圧調整手段は、任意のセルの印加電圧の調整により、前記予め用意された情報に基づいて他のセルの印加電圧を調整可能としたことを特徴とする請求項１記載の走査型光学装置。
4. 基準となる多波長光源の各波長に基づいて前記光電変換素子の各セルに対応する各波長ごとの印加電圧の情報を予め用意し、
   前記印加電圧調整手段は、各波長の指定に基づいて、前記予め用意された情報に基づいて各セルの印加電圧を調整可能としたことを特徴とする請求項１記載の走査型光学装置。
5. 前記予め用意される印加電圧の情報は、記憶手段に保存可能としたことを特徴とする請求項３又は４記載の走査型光学装置。
6. 前記印加電圧調整手段は、各セルの印加電圧の調整を自動で行なうことを特徴とする請求項３乃至５のいずれかに記載の走査型光学装置。

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