JPH0324442A - ｐＨ測定装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 く産業上の利用分野〉 本発明は、ｐＨ測定装置、特に、微生物や組織細胞など
、微細部分のｐＨを測定するのに適したｐＨ測定装置に
関するものである。

く従来の技術〉 細胞の形態と細胞内ｐＨの関係や、ある系に細胞が存在
している場合、その位置的情報と細胞内ｐＨとの関係を
知ることが、細胞工学、組織化学、生理学等の各分野で
必要になってきている。

従来の細胞内ｐＨの測定法としては、ｐＨ電極、ラベル
した５．　　５−ｄｌｓｅＬｙｌ　　−　２，　４ｏｘ
ａｚｏｌｔｄＩ−ｎｅｄ１ｏｎｓ　ＮＭＲ，螢光光度計
等等を用いた方法が知られている。しかし、これら従来
の方法では、ｐＨｍ極を用いた方法を除いてすべて細胞
集団の平均的な細胞内ｐＨという形で求めることが出来
るが細胞１個１個の細胞内ｐＨを求めることはできない
。また、ｐＨ電極を用いるのは、巨大組織等に対しては
可能であるが、微生物に応用することはきわめて困難で
あり、また多数の細胞を一度に測定することも不可能で
ある。

そこで螢光顕Ｗ１鏡下で観察した生体画像からその細胞
内ｐＨを測定する方法、装置が期待される。

このようなものとしては、光源系として高圧水銀ランプ
と２種類の波長の励起光用のフィルター（λ−４６６ｎ
ｍ，λ−４２５ｎｍ）を使用し、蛍光染色した酵母細胞
試料から発生する螢光強度を求め、両者の螢光強度の差
、すなわち■４６６−１　　４２５とｐＨとの相関関係
により酵母細胞のｐＨを測定した例がある（ＰＩＥＢＳ
：　Ｌｅｔｔ．１５６，Ｐ．　　２２７〜Ｐ．　　２３
０　（１９８３）　１）。

しかしこのような方法は、上記の相関関係が十分でなく
、また、螢光強度の低下の問題等もあり、正確な測定値
を得ることは難しいと考えられる。

また、光源系として２台のモノクロメーター（λ−４９
０ｎｍの励起光用およびλ−４３９ｎｍの励起光用）を
使用し、螢光物質含有試料から発生する螢光の写真撮影
により螢光強度Ｉ４９０およびＩ　４３９を求め、Ｉｎ
　（１４　９　０／　Ｉ　　４　３　９）とｐＨとの相
関関係を利用して、胃の細胞のｐＨを測定した例もある
（Ｎａｔｕｒｅ　　ｖｏｌ．３２５　　４４７　〜４５
０　（１９８７）　）。

しかし、この方法では２台の高価なモノクロメーターを
用いなければいけないために、装置が大型化し、価格も
上昇することになる。

〔発明の概要〕

本発明は、上述の問題点を解決することを１４的とし、
２８類の励起光のための光源系として励起光選択用フィ
ルターで選択した励起光を用いる系、すなわち高圧水銀
ランプ等の光源とフィルターを用いる系、を使用すると
共に、蛍光物質を含む試料への光源の照射時間を短くし
、更にこの短時間照射によって試料から螢光が発生する
時の顕微鏡画像の画像処理をすることにより、この目的
を達成しようとするものである。

すなわち、本発明によるｐＨ測定装置は、螢光物質を含
む試料に励起光選択用フィルターで選択された第１およ
び第２の波長の励起光を夫々短特開照射する光源照射手
段と、上記２種類の各励起光によって発生した螢光を特
定波長において顕微鏡的に撮像する手段と、該各顕微鏡
画像より２種類の螢光の強度を求めると共に第１の波長
の励起光による螢光の強さと第２の波長の励起光による
螢光の強さとの除算値の対数値を求め、該対数値とｐＨ
との相関関係から試料のｐＨを求める画像処理手段と、
を有すこと、を特徴とするものである。

く作　用〉 蛍光物質を含む試料、たとえば螢光染色した細胞など螢
光物質を含む細胞試料、をｐＨａｌ１定装置の所定位置
にセットし、まず高圧水鉗ランプなどの光源からの光を
励起光選択用フィルターによって選択した第１の波長の
励起光を細胞試料に短６４ｒ間照射すると、これによっ
て細胞試料から螢光が発生する。この短時間照射による
螢光を特定波長において顕微鏡的に撮像して顕微鏡画像
を得る。

この励起光を短時間照射すること、すなわちシャッター
スピードを短くすること、によって誤差の原因と考えら
れる螢光強度の低下が防止できる。

上記顕微鏡画像は画像処理手段によって処理され、第１
の波長の励起光による細胞試料からの螢光の強さが求め
られる。

続いて、第１の波長の励起光の場ａと同様にして励起光
選択用フィルターによって第２の波長の励起光を同じ細
胞試料に短時間照月１し顕微鏡的に撮像することにより
、該試料から上記短時間照η・Ｉによって発生した螢光
の特定波長における顕微鏡画像が螢光強度の低下が防止
された状態で得られる。この顕微鏡画像は同様にして画
像処理手段によって処理され、第２の波長の励起光によ
る細胞試料からの螢光の強さが求められる。

第１の波長の励起光による上記螢光の強さと第２の波長
の励起光による上記螢光の強さは、両像処理手段によっ
て両者の除算値の対数値が求められると共に、あらかじ
め作成されている該対数値とｐＨとの相関関係から細胞
のｐＨが求められる。

く効　果〉 本発明によるｐｎ測定装置は、試料として例えば細胞試
料を用いた場合、以下のような効果を有している。

（１）　細胞試料への光源の照射時間を短肋間で行なう
手段を有しているので、励起光選択用フィルターを用い
る光源系、すなわちブロードなスペクトルを持った励起
光を用いる光源系を使用しながら、顕微鏡像による高倍
率下でも、従来のように螢光強度が低下して誤差の原因
となるようなことがなく、再現性の高いデータが得られ
る。

（２）　螢光強度だけでなく、この螢光の顕微鏡画像デ
ータが得られるので、微細部位も測定でき、細胞試料に
おける種々の部位のｐＨ分布を知ることができる。

（３）　光源系として、安価な高圧水銀ランプ等の光源
と励起光選択用のフィルターを用いることができるので
、高価なモノクロメーターを２台も使用する必要がなく
、コンパクトで安価な装置にすることができる。

〔発明の具体的説明〕

本発明によるｐＨ測定装置は、前記のような｛１５Ｓ成
をＨする装置であり、（ａ）たとえば螢光染色した細胞
など螢光物質を含む試料に、水銀ランプなどの光源から
出射された光を励起光選択用フィルターによって選択し
た第１の波長の励起光を短時間照剃すること、（ｂ）（
ａ）の短時間照射によって試料から発生する螢光を特定
波長のものについて顕微鏡的に撮像して顕微鏡画像を得
ること、（ｃ）（ｂ）で得られる顕微鏡画像を画像処狸
手段によって処理して第１の波長の励起光による試料か
らの螢光の強さを求めること、（ｄ）励起先選択用フィ
ルターをとりかえ（ａ）と同様にして第２の波長の励起
光を同じ試料に短時間照射すること、（ｅ）　（ｂ）　
、（ｃ）と同様にして第２の波長の励起光の短時間照射
によって試料から発生する螢光についての顕微鏡画像を
得ると共に螢光の強さを求めること、（ｆ）画像処理手
段によって（Ｃ）の第１の波長の励起光による螢光の強
さと（ｅ）の第２の波長の励起光による螢光の強さとの
除算値の対数値を求め、あらかじめ作成しておいた該対
数値とｐＨとの相関関係から試料のｐＨを求めること、
により試料のｐＨを測定することを基本構成とするもの
である。

螢光染色などによって細胞試料等の試料に含まれる螢光
物質としては、６−カルボキシフルオレセイン、フルオ
レセイン、ジメチルーカルボキシフルオレセイン、４−
メチルーウンベリフエロンなどがあげられる。螢光物質
とｐＨとの相関関係については、たとえば６−カルボキ
シフルオレセイン、フルオレセインの２Ｆｆ１の励起光
（たとえば４８８ｎｍ，４４１　ｎｍに対する各々の螢
光（たとえば波長−５１８ｎｍ）強度の比が螢光物質の
濃度に依存しないでｐＨと相関関係があることが認めら
れた（第２図参照）。第２図では６−カルボキシフルオ
レセインの蛍光強度を励起光の波長幅を変えて調べた（
螢光光度：トで測定）結果が示されているが、この結果
から波長幅が２０ｎｍであっても相関関係があることが
わかる。

本発明によるｐＨ測定装置はこの原理を応用したもので
ある。

本発明測定値に用いられる試料としては、蛍光物質を含
有させることのできるものであればよいが、とくに細胞
試料、すなわち微坐物や組織細胞など種々の細胞もしく
はこの細胞を含むもの、あるいは毛細血管中の血液のｐ
Ｈ，固定化ｉＬｌ体中のｐＨ分布などの微細部分の測定
を必要とするもの、が好ましい。

以下、試料として上記細胞試料を用いた場合を例にとっ
て本発明を更に説明するものとする。

この装置を用いてｐＨｆｌｌｌｌ定を行なうため．の螢
光物質を含む細胞試料を用意するためには、まず酊母や
細菌などの細胞に螢光物質、たとえば代表的なものとし
て６−カルボキシフルオレセインあるいはフルオレセイ
ンを取り込ませることになる。

この物質は疎水性物質であり、このままでは取り込まな
いので、取り込まれやすい形態、たとえばエステル化し
た無螢光な６−カルボキシフルオレセインジアセテート
またはフルオレセインジアセテートを用いる。この物質
は細胞に速やかに取り込まれ、生きている細胞において
は細胞内部のエステラーゼによってエステル部が取れて
螢光を−ａする６−カルボキシフルオレセインまたはフ
ルオレセインとなり、細胞内部に留まることになる。

細胞内の６−カルボキシフルオレセインあるいはフルオ
レセインは、ｐＨに応じた２励起波長に対する螢光強度
比を也するので、その値から細胞内ｐＨｆＪ＜測定され
る。

以下は、本発明によるｐａ測定装置を第１図に基づいて
具体的に説明するものである。

この測定装置は、励起用光源１と、該光源１からの光を
短時間通過させることが可能な開閉口（Ｅのシャッタ一
部２と、シャッタ一部２を通過した光について第１また
は第２の特定波長の励起光を形戊する励起用フィルター
３と、励起光が細胞試料ａに照射される光路中に設けら
れたダイクロイックミラ−４および対物レンズ５と、細
胞試料ａを載置するステージ６と、細胞試料ａからの螢
光について特定波長の光を通す螢光側フィルター７と、
該フィルター７からの螢光を撮像する高感度のカメラ８
と、デジタル化された画像データの記憶場所であるフレ
ームメモリーを有し、この画像データを処理して第１お
よび第２の波長の２抽類の励起光による螢光強度の大き
さからｐＨに変換する画像処理装置部９と、画像処理結
果を出力するディスプレー１２を有するものである。

このｐＨ測定装置では細胞試料ａから発ノ１二する螢光
をカメラ８で撮像したデータは、画像処理装置部９のフ
レームメモリーに取り込まれてから該装置部９でｐＨ変
換のための処理が行なわれるが、必要に応じて磁気テー
プなどの画像記憶装置部１０を設け、カメラ８の撮像に
よる画像を一度該記憶装置部１０に記憶させた後に画像
処理装置部９によって処理されるように措成してもよい
。

光源１は、細胞試料ａの螢光物質が６〜カルボキシフル
オレセイン、フルオレセインなどの場合には、波長４０
０ｎｍ〜５００ｎｍ程度にスペクトラムをもつものであ
ればよく、たとえば高圧水銀ランプ、キセノンランプ、
ハロゲンランプ、白熱タングステンランプ等があげられ
る。

シャッタ一部２は、カメラのシャッター状の構造を有す
る装置あるいは瞬時に開閉できる板状の装置であり、（
ａ）開放特開が約１．５０秒以下、好ましくは０．４５
秒以下さらに好ましくは０．２５秒以下に設定できる機
能、を備えている必要がある。更に、前記フレームメモ
リーへの両像取り込みを行なわせるための信号が発生す
る機能を有し、かつ（ｂ）この画像取り込みの信号が、
シャッターの開放後約０．５５秒以内、好ましくは０．
３５秒以下さらに好ましくは０．１５秒以下に発生し、
その一定性が±０，１秒以下好ましくは±０．０２秒以
下である装置、を備えているシャッターが好ましい。上
記の一定性とは、前記螢光強度比とｐＨとの相関を求め
るための検量線作成時及び実際のサンプル測定時のシャ
ッターのスピード及びフレームメモリーへの取り込ませ
時間がほぼ同一でなければならないということであり、
一定性が±０．　　１秒以下であるということは、例え
ば、フレームメモリーへの画像取り込ませ時間をシャッ
ター開放後０．３００秒に設定した場合、シャッター開
放後０，２０〜０，４０秒の間に毎回、画像の取り込ま
せが行なわれると（゜）うことである。

シャッタ一部２には必ずしもこの様な装置を備えている
必要はない。すなわち上記（　ａ　）の条件を満たす時
間内に撮像された画像を画（象記憶装置部１０、たとえ
ばビデオテーブに記憶させておき、後でそのテープから
上記（ｂ）の条件をみたす画像を取り出しｐＨ計算のた
めの処理をすることが可能であるということである。

励起用フィルター３による励起波長は４００ｎｍ〜５０
０ｎｍの間に高波長側、短波長側、２波長選べばよく、
例えば、第１の励起波長および第２の励起波長は４７０
ｎｍ〜４９８ｎｍ程度及び４２５ｎｍ〜４　５　１　ｎ
　ｍ程度の範囲にある波艮であり（順序は問わない）、
好ましくはこの波長幅が２０ｎｍ以下の波長である。

螢光用フィルター７による螢光波長は、５００〜６００
ｎｍ好ましくは５００〜５６０ｎｍ楳度の範囲にある波
長であり、好ましくは波長範囲が４０ｎｍ以下の波長で
ある。

カメラ８は高感度の性能を脊するものであり、たとえば
３Ｘ１０’ルックス以下の光を連続的に感知可能なもの
（具体的にはたとえばＳＩＴ（Ｓｌ目ｃｏｎ　−　１ｎ
ｔｅｎｓｌｌ’ｌｅｒ　Ｔａｒｇｅｔ　ｔｕｂｅ）ビデ
オカメラ（ＲＣＡ社））である。

２種類の励起光に対する蛍光強度（１）の除算値の対数
値からｐＨを求める場合の対数値とは、たとえば２種の
励起光の波長を４８８ｎｍおよび４４　１ｎｍとした場
合、ｌｎ（＋　　４８８／１４４１）またはＩｎ　（１
　　４４１／＋　　４８８）の式で表わされるものであ
る。

なお、第１図において１１は観察用光諒である。

この測定装置の動作の流れは次のようである。

高圧水銀ランプ等の光源１からの光束はシャッタ一部２
の短時間の開閉によって励起用フィルター３を通過し、
第１の波長の励起光を形威する。

励起光はダイクロイックミラ−４（たとえばＤＭ５１０
（（株）ニコン）で反射され、対物レンズ５を通過して
ステージ６上の試料ａに照射される。

励起光によって発生した螢光の光束は対物レンズ５、ダ
イクロイックミラ−４を通過し、史に螢光用フィルター
７を通過した螢光のみがカメラ８によって撮像される。

シャッタ一部２のシャッターが開放されて一定時間後に
このシャッタ一部から信号が発生し、その信号により画
像処理装置部９のフレームメモリーにカメラ８の画像が
取り込まれる。その後一定時間後にシャッターが閉じら
れる。

ひき続いて，光源１からの光束はシャッタ一部２の短時
間の開閉によって１回目とは穴なる励起波長の励起用フ
ィルター３を通過し、第２の波長の励起光を形或する。

この励起光は１回目と同様にして撮像され、画像処理部
９のフレームメモリーに画像が取り込まれる。その後一
定峙間後にシャッターが閉じられる。このようにして得
られる２波長による螢光画像は、画像処理装置部９によ
り画面間演算、すなわち２画面間の除算値およびその対
数値を求め、あらかじめ作成しておいた検量線からｐＨ
に変換するための演算等の処理が行なわれ、この結果が
ディスプレー１２に画像出力される。

螢光の撮像後の画像の取り込みは、磁気テープ等画像記
憶装置部１０によりシャッター開族四間中の画像を経時
的に記憶させておき、後で特定ｎ！ｊ間後の画像につい
て画像処理装置部９により計算することもできる。

画像処理のフローおよび原理は次のようてある。

■　螢光物質を取り込ませた細胞をスライドグラスに載
せ、本発明測定装置に装着後、励起用フィルターによっ
て形或された第１の波長の励起光を一定、短時間照射す
る。高感度カメラによって撮像された螢光画像をフレー
ムメモリーに記憶させる（画像Ａ−１とする）。

■　■の状態のまま第１の波長の励起光を１１（（射せ
ずに得られる画像をフレームメモリに記憶させる（画像
Ａ−２とする）。

■　励起用フィルターを交換後、同一のサンプルに、第
２の波長の励起光を照射する。それによって得られる螢
光画像をフレームメモリに記憶させる（画像Ｂ−１とす
る）。

■　■の状態のまま第２の波長の励起光をｊ（ａη１せ
ずに得られる画像をフレームメモリーに記憶させる（画
像Ｂ−２とする）。

■　フレームメモリー上で画像Ａ−１から肉｛象Ａ−２
の各画素毎の減算をし、減算粘果のＬｌ４ｉ像（画像Ａ
とする）を得る。

■　同様に画像Ｂ−１から画像Ｂ−２の各画素毎の減算
をし、減算結果の画像（両像Ｂとする）を拐る。

■　画像Ａと画像Ｂの画素毎の除算をしその対数値を求
める。

■　前もって、同一の条件下で作成しておいた検量線か
らこの対数値をｐＨに変換し、各画素毎にその結果を出
力する。見やすくするためにｐＨを疑似カラーで出力す
ることができる。その画素によって構成される画像がｐ
Ｈ分布を示す画１象になる。

検量線を作成するには、ｐＨ既知のバッファーに螢光物
質、たとえば６−カルボキシフルオレセイン、を溶解し
、本発明測定装置を用いて上述したような測定方法に従
って、あるいは螢光光度＝１を用いて螢光を測定し、ｐ
｝Ｉと（画１象Ａ／画像Ｂ）の計算結果より検量線を作
成する。

より正確に求める場合には６−カルボキシフルオレセイ
ンを取り込ませた細胞をｐＨ既知のバツファーに懸濁し
、そこにＫ＋及びナイジエリジン（イオノフォア：細胞
内外のｐＨ勾配を消失させる抗生物質）を添加後、細胞
内外のｐＨが・１く衡に達したとき（Ｉ！！ｉ像Ａ／画
像Ｂ）の計算を行い検量線を作成する。

なお、試料細胞の粗抽出液を添加したバッファーを用い
て検量線を作成してもよい。

く実験例〉 実験例１：　　ｐＨ測定装置の作威 第１図に示した前述の本発明ｐＨｌｌ定装置を作成した
。

実験例２：　　ｐＨ標準液の測定 実験例１の装置（励起用フィルター４２５〜４４５ｎｍ
，４７０〜４９０ｎｍ，螢光用フィル−　５　２　０　
〜５　６　０　ｎ　ｍ　）を用いてａｌｌ＋定を行なっ
た。

５０μＭの６−カルボキシフルオレセインを含む５０ｍ
Ｍ　　ＭＥＳ　（ｐＨ６．２０）バッファ−をスライド
グラスに滴下しカバーグラスをしたのちｐＨの測定を６
回行った。本法ではシャッタースピードを０，３０秒に
設定し、シャッター開放後０．１０秒後の画像を画像処
理部により処理し、同条件で作威した検量線よりｐＨの
計算を行った。

また対照として、３秒以内の任意の時間にシャッターの
開閉を行い、その開放時間山の１Ｉ：意の１１！ｊ間の
画像を同様に画像処理しｐＨの計算を行った。

結果は第１表に示されている。

実験例３：　検量線の作或 第３図、第４図は実験例１の装置（フィルターシャッタ
ースピード、画像取り込ませ時間専の設定は実験例２の
通り）により検量線を作成したものである（横軸がｐＨ
，縦軸がＩｎ（高波長側励起画像輝度／低波長側励起画
像輝度ＸＩＯＯ）の平均値）。終濃度５０μＭのフルオ
レセインまたは６−カルボキシフルオレセインを各々含
む５０ｍＭのＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７．１３）　、ＭＯＰ
Ｓ（ｐＨ６．６６）　、ＭＥＳ　　（ｐＨ６．２０、５
．３０）、クエン酸／リン酸２ナトリウム（ｐＨ５．６
０、４。６０、４．００，３．４０、３．００）を用い
た。測定は実験例２と同様に行った。第３図がフルオレ
セインを用いたもの、第４図が６−カルボキシフルオレ
セインを用いたものである。

実験例４：　検量線の作成　その２ 第５図、第６図は実験例３と同様のバツファーを用い、
螢光光度計（島津製作所製、ＲＦ５００ＬＣ）を用いて
フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセインを螢光
試薬としてｌＱｆｆｉ線を作威したものである。この時
、励起波長幅は４３１〜４５１ｎｍ及び４７８〜４９８
ｎｍ，また螢光検出側波長幅は５００〜５４０ｎｍで測
定を行った。

実験例５：　　シャッタースピードと測定粘果のばらつ
き 実験例１の装置（フィルターは実験例２通り）を用いた
。

終濃度５０μＭのフルオレセインを含む５０ｍＭＭＥＳ
バッファ−（ｐＨ６．２０）を用い、幽而開演算（高波
長側励起画像／低波長励起画像×１００）後画像の平均
輝度のばらつきを示した（第２表）。なお、シャッター
閉時０．１０秒前に取り込ませた画像を用いた。ｐＨの
計算は、シャッター開放特開を０．２０秒にして作成し
た検量線より計算した。

実験例６：　酵母細胞内ｐＨのＭ１定 実験例１の装置（フィルター、シャッタースピード、画
像取り込ませｎｂ間等の設定は実験例２の通り）を用い
た。

ＳａｃｅｈａｒｏＩｌｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｌｓｌａｅ
を酵母エキス１．５％、ペプトン３％、グルコース３％
の培地に［ｊ後２５℃で振盪培養した。対数増殖後期に
集薗し５０ｍＭ　　ＭＥＳ　　バッフｙ−　（ｐＨ６．
２０＜１℃）で３回洗浄後フルオレセインジアセテート
、または６−カルボキシフルオレセインジアセテートを
終濃度１ｍＭになるように添加した。０℃３０分静置後
５０ｍＭ　　ＭＥＳ　　バッファ−（ｐＨ６．２０、１
℃）で３回洗浄後、フルオレセインジアセテート添加区
は５０ｍＭ　　ＭＥＳバッファ一（ｐＨ５．３０、１℃
）で、また６カルポキシフルオレセインジアセテート添
加区は５０ｍＭ　　クエン酸／リン酸２ナトリウム　バ
ッファ一（ｐＨ３．４０、１℃）で２同洗浄後、各々の
バッファーで再懸濁し１℃９０分静置後各々の酵母内ｐ
Ｈを実験例２と同様の条件で測定した。

第７図は測定結果（画像処理結果）がディスプレーに画
像出力された様子を模式的に表わしたものである。ｌは
、酵母の顕微鏡画像の各画素らの蛍光強度の除算値の対
数値を擬似カラー表示したものである（ただし、図面上
では酵母の顕微鏡画像の輪郭のみを示している）。２は
、検量線から求めた、前記擬似カラーとｐＨとの相関関
係を示す指標である。１の画像のカラーと２の指標のカ
ラーを対応させることにより、酵母細胞内各部のｐＨを
知ることができる。

第 １ 表

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明によるｐＨｆｌｌｌｌ定装置の一丈施例
を示すものである。 第２図は、螢光光度計を用いた螢光のａｌｌｌ定によっ
て得られた、２種の励起光に対する螢光の強度比とｐＨ
との相関関係および励起光波長幅の及ぼす影響を示す図
である。 第３〜４図は、本発明による測定装置を用いて作成した
検量線を示すものであり、第３図は螢光物質としてフル
オレセインを用いた場合、第４図は螢光物質として６−
カルポキシフルオレセインを用いた場合、である。 第５〜６図は螢光光度計を用いて作成した険瓜線を示す
ものである。 第７図は、本発明による７１ｐｊ定装置を用いてｐＨ緩
衝液内における酵母の細胞内ｐＨをδｐ１定した時のデ
ィスプレー上への画像出力の一例を現す模式図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、螢光物質を含む試料に励起光選択用フィルターで選
   択された第１および第２の波長の励起光を夫々短時間照
   射する光源照射手段と、上記２種類の各励起光によって
   発生した螢光を特定波長において顕微鏡的に撮像する手
   段と、該各顕微鏡画像より２種類の螢光の強度を求める
   と共に第１の波長の励起光による螢光の強さと第２の波
   長の励起光による螢光の強さとの除算値の対数値を求め
   、該対数値とｐＨとの相関関係から試料のｐＨを求める
   画像処理手段と、を有するｐＨ測定装置。 ２、試料が細胞試料であり、第１および第２の波長の励
   起光、ならびに撮像のための特定波長の螢光が、該細胞
   中に螢光物質として６−カルボキシフルオレセインまた
   はフルオレセインを含む細胞試料に対するものである、
   請求項１記載のｐＨ測定装置