JPH0228542A - 蛍光顕微鏡装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、細胞のカルシウムイオン濃度や水素イオン濃
度等を平面的に測定する蛍光顕微鏡装置に関する。

〔従来の技術と課題〕

最近、神経科学や細胞生物学分野における新しい研究手
法として、細胞内遊離カルシウムイオン濃度を定量する
方法が、急速に広がっている。しかるに、例えば細胞の
代謝機能を研究する場合、細胞内に蛍光物質を導入して
蛍光顕微鏡により観察し、同時に蛍光強度を測定するこ
とにより定量することは重要な方法で、ある。こうした
方法により生きた細胞内のカルシウムイオン濃度に限ら
ず、生きた細胞内の水素イオン濃度等のようなイオン濃
度や、巨大分子（蛋白質、核酸）が測定されている。こ
の場合、測定のための蛍光性プローブと装置の開発が重
要となる。

ところで、生きた細胞内イオン濃度の測定の場合、夫々
のイオンと特異的に結合し、結合により励起スペクトル
や蛍光スペクトルの変化する様なプローブが用いられる
。一方、蛋白質や核酸のような巨大分子の場合は、蛍光
物質をこれ←巨大分子に共有的に結合し、定量される。

従来、細胞内の例えばカルシウムイオン濃度を測定する
ときは、サンプルである細胞に例えば蛍光試薬ｆｕｒａ
−２を投与した後、この蛍光試薬とカルシウムイオンと
が特異的に結合して励起スペクトルが変化するのを分光
蛍光光度計により測定又は顕微鏡により観察することに
よりおこなっていた。なお、顕微鏡による観察は、蛍光
像上の円形の微少領域内の蛍光量変化を測光することに
より行っていた。

しかしながら、従来のこうした測定方法では、細胞中の
カルシウムイオン濃度を部分的には測定することができ
るが、平面的な濃度分布を得ることはできない。また、
仮に平面的な濃度分布を得ようとして測定を行え−ばか
なり多くの点でサンプルを採取して顕微鏡による観察を
行わなければならず、多大な観察時間を必要とする。

本発明は、上記事情に鑑みてなされたもので、蛍光顕微
鏡や画像処理装置等を組合わせて用いて高速で画像処理
を行い、細胞内のカルシウムイオン濃度や水素イオン濃
度等のイオン濃度や巨大分子濃度を、平面的な濃度分布
として把握し得る蛍光顕微鏡装置を提供することを目的
とする。

［課題を解決するための手段］ 本願第１の発明は、光源と、この光源からの光軸上に配
置され透過波長の異なる複数の干渉フィルタからなる励
起光用フィルタユニットと、この励起光用フィルタユニ
ットを駆動し光軸上に干渉フィルタを配置する駆動装置
と、励起用フィルタユニットを通過した励起光をサンプ
ルへ投射して得られるサンプルからの透過光又は反射光
の光軸上に配置された蛍光用干渉フィルタと、蛍光用干
渉フィルタを通過した蛍光像を接眼部とテレビカメラへ
分割する光路切換部と、前記蛍光像を画像処理する画像
処理装置とを具備することを特徴とする蛍光顕微鏡装置
である。

本願第２の発明は、光源と、この光源からの光軸上に配
置された励起用干渉フィルタと、この励起用干渉フィル
タを通過した励起光をサンプルへ投射して得られるサン
プルからの透過光又は反射光の光軸上に配置され、透過
波長の異なる複数の干渉フィルタからなる蛍光用フィル
タユニットと、この蛍光用フィルタユニットを駆動し光
軸上に干渉フィルタを配置する駆動装置と、蛍光用フィ
ルタユニットを通過したサンプルの蛍光像を接眼部とテ
レビカメラへ分割する光路切換部と、前記蛍光像を画像
処理する画像処理装置とを具備することを特徴とする蛍
光顕微鏡装置である。

本発明において、細胞を顕微鏡で観察するときは細胞に
予め蛍光試薬を投与するが、かかる蛍光試薬としては次
のものが挙げられる。

１）カルシウムイオン濃度の測定の場合；商品名１’ｕ
ｒａ−２，商品名Ｑ　ｕ！ｎ−２、商品名Ｉｎｄｏ−１
（下記式（Ｉ）”）　、いずれもモレキュラーブローブ
ス社（製） ここで、上記Ｉｎｄｏ−１を利用したカルシウムイオン
濃度測定の場合、その分光特性によりｆｕｒａ−２と比
べ次のような違いがある。即ち、ｆｕｒａ　−２の場合
カルシウムイオン濃度に応じて励起スペクトルの変化が
みられるが、Ｉｎｄｏ−１の場合蛍光スペクトルが第１
２図に示す如く変化する。つまり、３４０ｎ＠で励起す
ると第１２図のような蛍光スペクトルが得られ、カルシ
ウムイオン濃度に応じて４０Ｏｎｍ付近で最も大きく変
化し、４６０ｎｍでは変化しない。また、４Ｂ０ｎｍか
ら５５０ｎｍの範囲では逆向きの変化をする。そこで、
励起光の波長を固定しておき蛍光側で二つの波長を選択
することにより、三波長測定が可能となる。波長の組合
せは、４１０ｎｏ＋と４６０ｎｇ＋　、または４１０ｎ
ｉと４８Ｏｎ＋ｇが選ばれる。細胞への導入法はＩ　ｎ
ｄｏ−１／　Ａ　Ｍを用い、ｆｕｒａ−２の場合と同じ
である。また、ＮＤフィルタを利用して二波長間の比を
調整する点もｆｕｒａ−２の利用の場合と同じである。

更に、画像を得たあとの処理も全く同じである。なお、
ステッピングモータのコントロールはｆｕｒａ−２の場
合と同様にパーソナルコンピューターにより行われる。

■ｒ ２）ｐＨ測定の場合；商品名ＢＣＥＣＦ　（２’７　’
　−Ｂ　１ｓ　ｃａｒｂｏｘｙｅＬｈｙｌ　ｃａｒｂｏ
ｘｙ　ｒｌｕｏｒｅｓｃｅｌｎ　ｓモレキュラーブロー
ブス社（製）） ３）Ｈ！電位の測定の場合；　Ｓ　Ｌｙｒｙｌ系色素、
例えばＲＨ４２１，ＲＨ４ＢＧ　　（Ｇｒｉｎｖａｌｄ
、　　ｅｔ　ａｌ。

Ｂ　１ｏｐｈｙｓ、　Ｊ　、　１９８２　、ｐｐ３０１
−３０８．Ａ）［作用］ 本発明の作用は、以下に述べる通りである。ここでは、
カルシウムイオン濃度測定の場合について述べる。

（１）蛍光指示薬の投与 まず、神経系の株化細胞（ＮＧ１０ｇ　、　Ｎ１１５　
）、グリア由来の株化綿ｋ　（Ｃ６Ｂ　ｕ　−１）に蛍
光試薬ｒｕｒａ−２（細胞の外から投与し、細胞内に導
入できるようにアセトキシメチルエステル化された誘導
体ｒｕｒａ２　／　Ａ　Ｍを導入した。このｒｕｒａ−
２の構造は、下記（ｎ）式に示す通りである。

上記式（ｎ）に示すｆ’ｕｒａ−２は、カルシウムイオ
ンと特異的に結合し、第８図に示す様な励起スペクトル
の変化が見られる。なお、蛍光スペクトルは５１０　ｎ
ｍｊこシングルピークをもち、バンドパスはｌＯｎｍで
ある。第８図から明らかのように、カルシウムの変化に
対し異なる波長で異なった強度変化が起こる場合、三波
長測定が有効であり、異なる二つの波長で励起し、夫々
の蛍光強度の比を求めることにより定量する。ここで、
三波長測定は蛍光指示薬の濃度、照明強度のばらつき、
蛍光指示薬の減衰を標準化できる。また、三波長のうち
、−点は大きく変化する波長（第８図の場合、波長３４
０　ｎｍ励起）で、他の一点は変化しない波長（３６０
ｎｓ；カルシウム依存性のない点）又は逆向きの変化を
する波長（３８０ｎｍ）が選ばれる。

ところで、励起光として３４０ｎ−と３６０ｎ＊を選択
した場合、第８図に従えば蛍光強度の比（Ｉ　３４０　
／　Ｉ　３６０　）はカルシウム濃度により０．６４〜
１，８９の間で変化する。但し、第９図は蛍光分光光度
計での測定値であり、測定装置。

方法により変化する。特に、本発明の場合の様に顕微鏡
を用いると、光源、レンズ、反射鏡の波長特性により、
Ｉ　３４０　／　１３　ｂ　ｏ比が第８図とは異なる値
となる。そこで、励起光強度を濃淡フィルター（Ｎ　ｏ
ｕｔｒａｌ　　Ｄ　ｅｎｓｌｔｙ　　Ｆ　１ｉｔｅｒ　
）を用いて調節し、蛍光強度の°比がカルシウム濃度の
変化する範囲の中心で約１．０となるようにする。こう
することにより、使用するカメラのダイナミックレンジ
を、第９図に示す如く有効に利用できる。

なお、蛍光物質を用いて測定をする場合、励起による蛍
光の減衰が問題となる。つまり、第１０図の最少検出値
以下になれば出力の変化が小さく、測定不能となる。従
って、励起光量を出来るだけ少なくし、また光の当たっ
ている時間を最少にする必要、がある。

（■）細胞内のカルシウムイオン濃度及び分布の時間的
変化の測定； 即ち、測定光３４０ｎｍとリファレンス光３６０１ｍを
目的とする時間内に移動させ、二波長測定をする。この
とき前述したＴＶカメラ（ＳＩＴ）の積算時間内は各干
渉フィルタ、ＮＤフィルタを停止させる機能が必要であ
る。つまり、連続的に３４０ｎａ＋又は３６０ｎｍ等の
波長の光を細胞に照射する様なことを長時間すると、細
胞内の蛍光色素ｆｕｒａ−２の蛍光が減衰してしまい、
測定に不利になる。従って、ＴＶカメラの積算時間外で
は、細胞標本に励起光が照射されない様に前述したシャ
ッターなどを必要とする。また、各波長でのＴＶカメラ
の積算時間、測定間隔時間は、細胞内カルシウム濃度の
変化具合やＩ’ｕｒａ　−２濃度等の実験条件により、
様々に変化する。そのため、これらの時間はプログラム
的及びメカニカル的にも対応がとれる様にする事が重要
である。更に、使用する対物レンズにより波長透過特性
が異なっているため、対物レンズを変更するとともにＮ
Ｄフィルタも変える必要がある。しかるに、本発明の場
合、上記の内容をパソコンへユーザーが入力指示する事
により自動的に実施させる様に構成されている。

［実施例］ 以下、本発明の一実施例を第１図〜第６図を参照して説
明する。ここで、第１図は本発明に係る蛍光顕微鏡装置
のブロック図、第２図は同装置の概略図、第３図は同装
置の光学系を示す平面図、！、ト訃っｔ丸−ｑ →→→Ｈ艶鈴である。

図中の１は、内部に光源としてのＨｇランプ２を内蔵し
た落射蛍光照明装置である。ここで、光源はＨｇランプ
以外に必要な波長を放射するものであれば良く、例えば
Ｘｅランプなども使用できる。この照明装置１には投光
管３が連結され、該投光管３内でかつ前記Ｈｇランプ２
の光軸上にはＮＤフィルタ４ａ、干渉フィルタ５からな
るフィルタユニット６が複数配置されている。ここで、
前記ＮＤフィルタ４ａは、各波長での透過率を調整する
ために使用する。また、前記投光管３の先端には、後記
対物レンズを変えたときの補正を目的に使用される（例
えば透過率０％、２５％、４０％。

１００％の）ＮＤフィルタ４ｂが複数個設けられている
。前記Ｈｇランプ２の光軸上には、ダイクロイックミラ
ー７が設けられている。ここで、このダイクロイックミ
ラー７は、前記ランプ２からの光束を対物レンズ８を通
してステージ９上のサンプルｌＯに照射するとともに、
サンプルｌＯからの蛍光を通過させる機能を有する。

前記ダイクロイックミラー７の下方には前記サンプル１
０からの蛍光を切換える光路切換部が設けられ、この光
路切換部にはビームスプリッタ−１１ｐ（内蔵されてい
る。ここで、このビームスプリッタ−１１により、前記
サンプルｌＯからの蛍光のうち２０％が接眼レンズ１２
へ、残りの８０％がＴＶカメラ（ＳＩＴ）１３へ送られ
る。

このＴＶカメラ１３には、ＴＶ左カメラントロール機能
とデータ処理機能をもつイメージプロセッサ１４が連結
されている。このイメージプロセッサ１４には、ＲＡＭ
ディスクを内蔵したコンピュータ１５゜モニタ１Ｂ、プ
リンタ１７が順次接続されている。ここで、前記コンピ
ュータ１５は、ステッピングモータ１８のＯＮ、ＯＦＦ
を行わせるとともに、データの記憶を行う。なお、ｍ１
図中の１９は５１０ｎｍ付近の波長の蛍光のみを通過さ
せるエミッションフィルタであり、第２図中の２０は透
過照明装置である。

また、本装置の下部は第６図に示すようになっている。

同図において、２１はベース２２に固定された顕微鏡本
体である。前記ベース２２上には脚２３が固定され、こ
の脚２３には計４ヶ（片側の脚２３に２ケ）の防振ゴム
２４を介して装置ベース２５が固定されている。この装
置ベース２５上には、リニアベアリングでレールと移動
ブロックを組合わせたリニアガイドの１本のガイドレー
ル２６が固定されている。このガイドレール２Ｂには２
ケの移動ブロックが組込まれていて移動台２７を直線案
内す４ようになっている。この移動台２７にはラック２
８が取付けられ、前記装置ベース２Ｂ上に防振ゴム２９
を介して設けられたモータ３０のピニオン３１の回転に
より移動台２７を駆動するようになっている。こうした
防振対策により、顕微鏡ステージ上にガラス毛細針をセ
ットし、ｎ１定対象の細胞内に前記ガラス毛細針を進入
させた状態でフィルタユニットを駆動させても、モータ
及びメカの振動の伝達（毛細針への）を防ぐことができ
、細胞内のｐＨ，電位等を同時に測定することを可能に
なる。なお、上記の様な防振対策なしでガラス毛細針を
細胞内にさしてフィルタユニットを動かすと、振動によ
り細胞膜がやぶれること がある。

次に、上述した蛍光顕微鏡装置の画像データ入力システ
ムについて説明する。

（１）測定前処理 測定条件の入力、及び測定条件ファイルの作成・修正・
保存・削除を、コンピュータ１６で行う。

（イ）測定条件ファイルの作成；メモリ上の測定条件テ
ーブルを作成し、必要ならばファイル名を入力し、測定
条件ファイルとしてフロッピーへ保存する。この際、測
定条件としては次の■〜■が挙げられる。

■ＴＶカメラの積算回数；１〜３２０００回で、これに
より測定時間が決まる。なお、積算回数は、細胞の明る
さによって決めるもので、明るければ回数を少なく、暗
けれければ回数を多くする。

■測定時間；１／３０秒×積算回数以上■測定回数；５
９以下 ■測定波長；　３４０　ｎａ及び３Ｂ０　ｎｉ又は３８
０　ｎｍ■ＮＤフィルタの選択 ■測定波長の選択 ■画素間列；縦、横ともに最大５１２ （ロ）測定条件ファイルの修正；フロッピーより測定条
件ファイルを選択し、メモリ上に測定条件テーブルを展
開し、その修正を行い、必要ならばフロッピーへの保存
を行う。なお、測定条件は前記■〜■である。

（ハ）測定条件ファイルの削除；フロッピーより測定条
件ファイルを指定し、削除する。

（ニ）測定条件のプリンタ出力；フロッピーより測定条
件ファイルを指定し、その内容をプリンタ出力する。

（２）測定処理；測定を行い、その画像データをＴＶ左
カメラり入力し、コンピュータにとり込む。

（３）画像データ保存；画像データをフロッピー−＼セ
ーブする。

（４）画像データ出力；画像データをモニタ画面に出力
し、またモニタ画面のカラーハードコピーも行なえる。

次に、上記システムのソフトウェアについて説明する。

ここで、このソフトウェアは、下記の５ケのメニューに
別れる。

（１）自由観察；画面からの指示によって、顕微鏡のフ
ィルタを操作し、ピントチエツクを行い、予めＣａイオ
ン濃度測定用の蛍光試薬（１’ｕｒａ　−２）が投与さ
れた細胞を観察する。

（２）測定条件登録；自動測定を行うための条件を、画
面より登録する。

（３）自動測定；測定条件に従い、細胞のカルシウムイ
オン濃度を測定し、フレームメモリに書込まれた画像デ
ータを、コンピュータ１６に内蔵したＲＡＭディスクに
保存する。

（４）データＦＤ保存；自動測定により作成されたＲＡ
Ｍディスク内の画像データを、フロッピーディスクに保
存する。

（５）データ表示、ＲＡＭディスクあるいはフロッピー
ディスクにある画像データを、グラフィック画面に疑似
カラーで出力する。なお、表示中の画像データのカラー
ハードコピーが可能である。フロッピーディスクに保存
された各波長（３４０ｎａ＋と３６０　ｎｉ）の画像は
、画像処理プログラムに従って対応する画素間で比が求
められ、検量線によりカルシウムイオン濃度に変換され
る。

そして、濃度に応じた疑似カラーが与えられ、カルシウ
ムイオン濃度分布図が得られる。

しかして、上記実施例に係る蛍光顕微鏡装置よれば、Ｈ
ｇランプ２を有した落射蛍光照明装置１、干渉フィルタ
５．ＮＤフィルタ４ａから構成されるフィルタユニット
６、ダイクロイックミラー７、ビームスプリッタ１１．
及びＴＶカメラ１３．イメージプロセッサー１４．　　
コンピュータｌＢ、モニタ１７゜プリンタ１８などから
なる画像処理装置から構成されているため、画像データ
をグラフィック画面に疑似カラーで出力し、これにより
高速で画像処理しながら細胞内のカルシウムイオン濃度
を平面的な濃度分布として観察することができる。事実
、本発明装置により撮影したカルシウムイオン濃度分布
の模式図は、例えば第１１図のように表示される。なお
、同図には３つの細胞■、■、■が存在しており、例え
ば各点（Ａ−Ｅ）のＣａ濃度（／　ｎ　Ｍ）はＡ；９４
．１、Ｂ；８２．７、Ｃ；１１０／６、Ｄ；９０．３、
Ｅ；３０．９であり、色分けにより各点の濃度が同時に
判別できるようになっている（但し、第１１図は模式図
の為色分けは省略している）。

なお、本発明に係るフィルタユニットは、上記実施例の
様な構造のものに限らず、第７図に示す如く、フィルタ
枠４２内に押さえ４３を介して干渉フィルタ４４．ＮＤ
フィルタ４５を一体的に組合わせた構造のものでもよい
。

上記実施例では、５１０ｎｉ付近の波長の蛍光のみを通
過させるエミッションフィルタを用いる場合について述
べたが、これに限らず、例えば第１３図及び第１４図に
示すように上記エミッションフィルタの代わりにステッ
ピングモータ５１に直結した円板状のフィルターホルダ
ー５２を遮光用ボックス内５３内にとりつけてもよい。

このホルダー５２には例えば３ケのフィルター挿着用穴
５４ａ、５４ｂ、５４ｃがあり、この穴のうち一箇所に
は例えば４１０ｎａ＋（波長幅１０〜２０ｎｍ）、他の
一箇所には４６０　ｒ＋ａ＋（波長幅ｌＯ〜２０ｎｍ）
の干渉フィルタ４４を夫々ＮＤフィルタ４５に重ねて挿
着し、残りの挿着用穴は（’ｕｒａ−２測定のとき利用
するようにフィルターを挿着しない（１００％透過）。

このようにすれば、４１０１厘と４６０　ｎｍでの蛍光
像の間で比を求め、第１５図に示すカルシウムイオン濃
度と蛍光強度比との関係を示す特性図によりカルシウム
イオン濃度を求めることができる。ところで、励起光は
ｆｕｒａ−２で用いた３　４０　ｎ鳳の干渉フィルタを
利用することにより得られる。なお、第１４図において
、図中の５５はフィルタ位置決め用センサ、５Ｂは結像
用レンズ、５７はモータ支えである。

［発明の効果］ 以上詳述した如く本発明によれば、蛍光顕微鏡や画像処
理装置等゛を組合わせて用いて高速で画像処理を行い、
細胞内のカルシウムイオン濃度や水素イオン濃度等のイ
オン濃度や巨大分子濃度を、平面的な濃度分布として把
握し得る蛍光顕微鏡装置を提供できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例に係る蛍光顕微鏡装置のブロ
ック図、第２図は同装置の概略図、第３図は同装置の光
学系を示す平面図、第４図は第３第７図は本発明に係る
フィルタユニットの他の例を示す断面図、第８図は蛍光
指示薬ｆｕｒａ　−２によ゛る励起スペクトル特性図、
第９図はＴＶカメラのへカー出力特性図、第１θ図はカ
ルシウムイオン濃度と蛍光強度比との関係を示す特性図
、第１１図は本発明装置により撮影したカルシウムイオ
ン濃度分布の模式図、第１２図は蛍光強度と波長との関
係を示す特性図、第１３図及び第１４図は夫々本発明の
他の実施例に係る蛍光顕微鏡装置のフィルタ周辺部の説
明図、第１５図はカルシウムイオン濃度と蛍光強度比と
の関係を示す特性図である。 １・・・落射蛍光照明措置、２・・・Ｈｇランプ、３・
・・投光管、４　ａ、　４　ｂ、　４５・−ＮＤフィル
タ、５．４４・・・干渉フィルタ、６・・・フィルタユ
ニット、７・・・ダイクロイックフィルラダ、８・・・
対物レンズ、１０・・・サンプル、１１・・・ビームス
プリッタ−１１２・・・接眼レンズ、１３・・・ＴＶカ
メラ、１４・・・イメージプロセッサ、１５・・・コン
ピュータ、１Ｇ・・・モニタ、１７・・・プリンタ、１
８、５１・・・ステッピングモータ、２４．２８・・・
防振ゴム、２８・・・ラック、３０・・・モータ。 出願人代理人　弁理士　坪井　　淳 シ罠 東（ｎｍ） 第８図 入力 第 図 第 図 が 淡 州 第 図 第 図

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）、光源と、この光源からの光軸上に配置され透過
   波長の異なる複数の干渉フィルタからなる励起光用フィ
   ルタユニットと、この励起光用フィルタユニットを駆動
   し光軸上に干渉フィルタを配置する駆動装置と、前記励
   起用フィルタユニットを通過した励起光をサンプルへ投
   射して得られるサンプルからの透過光又は反射光の光軸
   上に配置された蛍光用干渉フィルタと、蛍光用干渉フィ
   ルタを通過した蛍光像を接眼部とテレビカメラへ分割す
   る光路切換部と、前記蛍光像を画像処理する画像処理装
   置とを具備することを特徴とする蛍光顕微鏡装置。
2. （２）、前記蛍光用干渉フィルタが透過波長の異なる複
   数の干渉フィルタからなるフィルタユニットで構成され
   、このフィルタユニットを駆動し光軸上に所望の干渉フ
   ィルタを配置することにより波長の異なる蛍光を選択す
   る特徴とする請求項１記載の蛍光顕微鏡装置。
3. （３）、光源と、この光源からの光軸上に配置された励
   起用干渉フィルタと、この励起用干渉フィルタを通過し
   た励起光をサンプルへ投射して得られるサンプルからの
   透過光又は反射光の光軸上に配置され、透過波長の異な
   る複数の干渉フィルタからなる蛍光用フィルタユニット
   と、この蛍光用フィルタユニットを駆動し光軸上に干渉
   フィルタを配置する駆動装置と、蛍光用フィルタユニッ
   トを通過したサンプルの蛍光像を接眼部とテレビカメラ
   へ分割する光路切換部と、前記蛍光像を画像処理する画
   像処理装置とを具備することを特徴とする蛍光顕微鏡装
   置。