JPH01156999A - ヒト癌壊死因子 - Google Patents
ヒト癌壊死因子Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
本発明はヒト癌壊死因子ポリペプチド並びにそれらをコ
ードするクローン化DNA、 それらクローン化DNA
を組込んだベクター及びそれらのベクターで形質転換さ
れた宿主に関する。 本明細書では![!社の簡略化のために以下の略号を使
用する。 A アデニン Cシトシン G グアニン T チミン Ala アラニン Arg アルギニ/ Asn アスパラギン Asp アスパラギン酸 Cys システィン Gin グルタミン Glu グルタミン酸 Gly グリシ/ His ヒスチジン 11e インロイシン Leu ロイシン Lysリジ/ Met メチオニン Phe フェニルアラニ/ Pro プロリン Set セリン Thr スレオ/−7 TrP )リプトファン Tyr チロシン Vat バリン DNA デオキシリボ核酸 c DNA 相補DNA RNA リボ核酸 mRNA 伝令RNA dATP デオキシアすノシン三リン酸dCT
I’ デオキシシチジン三リン酸dGTP
デオキシグアノシン三リン酸dTTP
デオキシチミジン三リン酸オリゴ(dC) オリゴ
デオキシグアル酸オリゴ(dG) オリゴデオキシ
グアニル酸オリゴ(dT) オリゴデオキシチミジ
ル酸ポリ(A) ポリアデニル酸 ポリ(U) ポリウリジル酸 ポリ(dA) ポリデオキシアデニル酸ポリ(d
C) ポリデオキシシチジル酸ポリ(dG)
ポリデオキシグアニル酸ポリ(dT) ポリ
デオキシチミジル酸EDTA エチレンジアミ
ン四酢酸bp 塩基対 Carswe I Iらは、あらかじめbac口1us
Calmette−cu6r+n (l3CG )で
感染させ、次いでエンドトキシンで処理したマウスの血
清中には、移植したMeth^肉腫による癌を壊死させ
る物質が含まれていることを見いだし、この物質を壊死
死因子と名づけた[Proc、Nat、^cad、sc
i 、tlSA、72.31300(1975)]。 癌壊死因子はマクロファージから放出される生理活性物
質と考えられており、その特徴として、(1)担癌動物
に投与するとある種の癌を壊死させ治癒せしめること(
ii) in vHroである種の癌細胞(例えばマウ
スの癌細胞であるL細胞、ヒト癌由来のPC−10細胞
)を傷害するが、正常細胞にはほとんど存置な作用を及
ぼさないこと、及び(ii+)その作用が種特異的でな
いことなどが知られている。このような特徴の故に壊死
死因子は、新しいタイプの制癌剤としてその臨床的応用
が強く期待されている。 しかしながら、従来の壊死死因子製造法はマウスやウサ
ギなどの動物にBCG又はProp ton 1bac
te−riu■acnesを注射し、次いでエンドトキ
シンを投与した後その血液及び体液より壊死死因子を単
離精製するものであるため、安定して多量の壊死死因子
を安価に得ることは難しい状況であった。更に、壊死死
因子を医薬として使用するためには、抗原性等の観点か
らヒト由来の壊死死因子がより好ましいが、上記方法は
ヒト由来の壊死死囚子製造には採用できない。 従来、ヒトマクロファージ由来の癌細胞傷害因子として
、Matthewsにより報告された、正常人の末哨単
球細胞あるいは骨髄性単球性白血病細胞が産生ずる因子
(^nu−tumor cytotoxin)[:■■
1unology。 44、+35(1981)]及びReedらにより報告
された、ヒト末檜血中の培養器壁付着細胞が産生ずる因
子(^dherent cell toxin)[J、
rssunol、、115,395(1975)1など
が知られている。また、W■目λ1sOnらは、ヒトB
細胞樹立株から産生される分子量約7万ダルトンの物質
をヒト癌壊死因子として報告している[Proc、Na
t、^cad、sci、UsA、80,5397(19
83>]。しかし、いずれの場合もその物質としての実
体は不明であった。 本発明者らは、ヒト由来の壊死死因子の大量生産法を確
立するために、遺伝子組換え技術に着目して鋭意研究を
行い、まずウサギ癌壊死因子をコードするクローン化D
NAの単離に成功した(特願、昭58−228790号
(特開昭00−120990号)参照)。更に研究を続
けた結果、このクローン化DNAをプローブとして、ヒ
ト癌壊死因子をコードするc DNAをクローン化する
ことに成功し、更にこのクローン化DNAを組込んだプ
ラスミドで形質転換された微生物がヒト癌壊死因子を産
生ずることを確認して本発明を完成した。 本明細書において、ヒト癌壊死因子とはヒト由来細胞が
産生ずる蛋白質であって、 inv+troで少なくと
もL細胞を傷害する能力、及び+n vtvoで少なく
とも移植したMeth^肉腫による癌を壊死させる能力
を佇するものを意味し、壊死死囚子活性とは、このよう
な生物活性を意味する。 本発明は、ヒト癌壊死因子のアミノ酸配列又はその活性
中心部分を含むポリペプチド、及びそれらをコードする
クローン化DNAを提供するものである。特に、次のア
ミノ酸配列(I) Ser Ser Ser Arg Thr Pro S
er AsP Lys Pr。 Val Ala Hls Vil Vtl Ali A
sn Pro Gln AlaGlu Gly Gln
Leu Gln Trp Leu Asn Arg
ArgAla Asn Ala Leu Leu Al
a Asn Gly Vil GluLeu Arg
As1) Asn Gln Leu Vat Vil
Pro 5erGlu Gly Leu Tyr Le
u Ile Tyr Ser Gln ValLeu
Phe Lys Gly Gin Gly Cys P
ro Ser ThrHls Val Leu Leu
Thr Hls Thr rle Ser ArgI
Is Ala Vat Ser Tyr Gln Th
r Lys Vat AsnLau Leu Ser
Ala Ile Lys Ser Pro Cys G
lnArg Glu Thr Pro Glu Gly
Ali Glu Ali LyiPro Trp T
yr Glu Pro Ile Tyr Leu Gl
y GlyVat Phe Gln Leu Glu
Lys Gly Asp Arz LeuSer Al
a Glu IICAsn Arg Pro Asp
Tyr LeuAsP Phe Ala Glu
Ser Gly Gln Vil Tyr
PheGly Ile Ile Ala
Leu (I )を有するヒト癌
壊死因子[以下ポリペプチド(I)と記す]、ポリペプ
チド(I)のN末端に更に次のアミノ酸配列(II) Met Ser Thr Glu Ser Met I
le Arg AspValGlu Leu Ala
Glu Glu Ali Leu Pro Lys L
ysThr Gly Gly Pro Gln Gly
Ser Arg Arg CysLeu Phe
Lcu Ser Leu Phe Ser
Phe Leu l1eVat Ala Gly
Ala Thr Thr Leu Phe Cys
LeuLeu His Phe Gly Vat Il
e Gly Pro Gln ArgGlu Glu
Phe Pro Arg Asp Leu Ser L
eu 1ieSer Pro Leu Ali Gln
Ala Vat Arg (II )を有するポ
リペプチド[以下ポリペプチド(I+■)と記す]、及
びポリペプチド(I)のN末端にMetを有するポリペ
プチド、並びに次の塩基配列(Ill) (5’)−TCA TCT TCT CGA ACCC
CG AGT GACAAGCCT GTA GC
CCAT GTT GTA GCA AACC
CT CAAGCT GAG GGG CAG CT
CCAG TGG CTG AACCGCCGG G
CCAAT GCCCTCCTG GCCAAT
GGCGTGGAG CTG AGA GAT
AACCAG CTG GTG GTG
CCATCA GAG GGCCTG TACC
TCATCTACTCCCAGGTCCTCTTCAA
G GGCCAA GGCTGCCCCTCCAC
CCAT GTG CTCCTCACCCACAC
CATCAGCCGCATCGCCGTCTCCTAC
CAG ACCAAG GTCAACCTCCTC
TCT GCCATCAAG AGCCCCTGC
CAG AGG GAG ACCCCA GA
G GGG GCT GAG GCCAAG
CCCTGG TAT GAG CCCATC
TAT CTG GGAGGG GTCTTCC
AG CTG GAG AAG GGT G
ACCGACTCAGCGCT GAG ATCA
AT CGG CCCGACTATCTCGACT
TT GCCGAG TCT GGG CAG
GTCTΔCTTT GGG ATCΔTT
GCCCTG−(3′) (III ’)
を有する、ポリペプチド(I)をコードするクローン化
DNA [以下DNA (Ill >と記す]及びDN
A(III)の5′末端に更に次の塩Jλ配列(TV)
(5’)−ATG AGCACT GAA AGCAT
G ATCCGG GACGTG GAG CTG G
CCGAG GAG GCG CTCCCCAAGAA
G ACA GGG GGG CCCCAG GGCT
CCAGG CGGTGCTTG TTCCTCAGC
CTCTTCTCCTTCCTGATCGTG GC
A GGCGCCACCACG CTCTTCTG
CCTG CTG CACTTT GGA G
TG ATCGGCCCCCAGAGG GAA
GAG TTCCCCAGG GACCTCTC
T CTAATCAGCCCT CTG GCC
CAG GCA GTCAGA−(3’)(IV) を有する、ポリペプチド(I+■)をコードするクロー
ン化DNA [以下DNA(Ill−+lV)と記ず]
、及びDNA(III)の5′末端に開始コド7 AT
Gを佇するDNAを提供するものである。 本明細書において、ヒト癌壊死因子のアミノ酸配列を含
むポリペプチドとは、ポリペプチド(I)。 又はそのN末端又はC末端にアミノ酸又はペプチドが結
合しているポリペプチドであって、それ自身が、又は酵
素等により切断されて生じるポリペプチドが、1!リベ
プヂド(I)と同様のヒト壊死死囚子活性を示すものを
意味する。また、ヒト癌壊死因子のアミノ酸配列の活性
中心部分を含むポリペプチドとは、ポリペプチド(1)
のアミノ酸配列のうちヒト壊死死囚子活性を発現ず°6
のに必須のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、
ボリペプチド(I)と同様のヒト癌壊死因子活性を示す
ものを意味する。本発明には、ヒト癌壊死因子のアミノ
酸配列又はその活性中心部分を含むポリペプチド、それ
らをコードするDNA 、それらのDNAを組込んだベ
クター及びそれらのベクターで形質転換された宿主だけ
でなく、得られたポリペプチドが本発明のポリペプチド
(I)と高い相同性を存し、同様のヒト癌壊死因子活性
を示し、かつ免疫学的に交差するものである限り、その
ようなポリペプチド並びにそれらをコードするDNA
。 それらのDNAを組込んだベクター及びそれらのベクタ
ーで形質転換された宿主も又含まれる0例えば、ヒト癌
壊死因子DNAの対立遺伝子変異体及び遺伝子コードの
縮重又は一部の修飾を含むヒト癌壊死因子DNAの:4
導体及びこれらから得られるポリペプチドも又本発明に
含まれる。なお、一部の修飾を含むヒト癌壊死因子DN
Aの誘導体とは、ヒト癌壊死因子DNAの一部が欠失し
た誘導体及びヒト癌壊死因子DNAに他のDNA断片が
付加した誘導体を意味する。 本発明のヒト癌壊死因子をコードする塩基配列を「する
DNAは、例えば次のようにして製造することができる
。 (1)ウサギ癌壊死因子をコードするクローン化DNA
の調製 49 m rXl 5B−228’?80 号(特rj
n N 6(112099(1号>k[tl示されてい
る方法(例えば参考例2の方法)に従って、ウサギ壊死
死囚子c DNAを得る。このクローン化DNAの塩基
配列は第1表に示す通りで、ウサギ癌壊死因子のポリペ
プチドをコードする領域は第277〜738番である。 このウサギ壊死死囚子c DNAに、適当な長さのDN
A断片を与えるように制限酵素を作用させてDNA断片
を切り出し、以下に述べるヒト癌壊死因子c DNAの
クローニングのためのプローブとする。 制限酵素としては、例えば^vaI 、 HaelI
、 BstNI 。 旧ncI[、RsaIが挙げられる。DNA断片は異な
る領域に由来する2種以上のものを使用するのが好まし
い。第1表には、制限酵素として^VλI及びHae
Uを用いて、それぞれ299 bp及び88 bpcD
DNA断片を切り出す場合の切断部位を示している。 (以下余白) E−< (、l(、l QaOQ
<E−00 <h Q(、l <← (1)(、l QO0(1) <E−4Qa Qa ao Qa aQEく QOく
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oa Qaく← oo <E−oQ E< <← Oa 00 ←< LX) 00 QO aQ Oa <E−<← Qo 00 Qo 00 00 ト0く ←く Qo <h u。 Oo 00 Qa UL) ■ヒト癌壊死因子mRNAの調製 ヒトのマクロファージを肺胞、血液、腹腔、胎盤。 胛臓、その他の組織から採取する。例えば、肺胞からは
5aneらの方法[J、lm5uno1..129.1
313(+982)]。 血液からはMatthcwsの方法[11r、J、Ca
ncer、48,405(+983)]、胎盤からはW
ilsonらの方法[J、Itwunological
Methods、50,305(+983)]により
採取する。このマクミツ1−ジを培養器面!d当たり約
2X 104〜106個播き、35〜38℃、好ましく
は約37℃、約5〜10%炭酸ガス合作空気中、湿度的
80〜100%で約30分〜2uソ間前培養する。次い
でダラム陰性菌より得られたエンドトキシン、例えば大
腸菌、緑膿菌、チフス菌由来のりボボリサブヵライドを
加え、更に培養を3〜8時間継続してヒト癌壊死因子m
RN Aの産生を:fgJQさせる。このとき蛋白合
成阻害剤(例えばシクロへキシミド)を加えることによ
り、ヒト癌壊死因子mRNAを蓄積させることができる
。なお前培養は省略してもよい。エンドトキシンの添加
量は、一般に約0.1〜1000μg11(最終濃度、
以下同じ)、好ましくは約1〜100μg/lである。 この際、ホルボール−12−ミリステート−13−アセ
テート、ホルボール−12,13−ジデカノエート、ホ
ルボール−12,13−ジベンゾエートのようなホルボ
ールエステル類を約■〜2000 ng/mNU加して
もよい。蛋白合成阻害剤の添加量は、化合物の種類等に
より異なるが、例えばシクロヘキシミドの場合、0.1
〜50μg/ifである。培地としては、高1等動物細
胞の培養に適した各種合成培地が用いられ、例えばRP
MI−IEi40.イーグルのM E M培地、ダルベ
ツコ変法によるMEM培地(以上の培地の組成について
は、例えば宗村庚修編「細胞培養マニュアル」、講談社
、 1982年に記載されている)が挙げられる。培地
には、全培養液量の約1〜20%の動物血清(例えば牛
胎児血清、子牛血清)を加えておくのが好ましい。培養
終了後、細胞より常法、例えばChirgwinらの方
法[[1,iochemistry、18+5294(
+979>]により全RNAを抽出し、次いでこれを常
法に従ってオリゴ(dT)セルロース又はポリ(U)セ
ファロース(ファルマシア社)などを用いる後管カラム
クロマトグラフィーに付すか又はバッチ法によりpol
y(八)mRNA画分を分離する。このpoly(^)
mRNA画分を酸性尿素アガロースゲル電気泳動又はシ
yM密度勾配遠心分F11に付すことにより、ヒト癌壊
死因子mRNA ’k K5 m精製することができる
。 ここに得られたmRNA画分が目的とするヒト癌壊死因
子をコードするmRNAを合作していることを確認する
ためには、mRNAを蛋白質に翻訳させてその生物活性
を調べればよい。例えばアフリカ7メガエル(Xeno
pus 1aevis)の卵母細胞、網状赤血球ライセ
ード、小麦胚芽のような連判な蛋白合成系にmRNAを
注入又は添加して蛋白質に翻訳させ、その蛋白質がマウ
スL−929細胞に対して細胞傷害活性を示すことを確
認することにより行われる。なお、アフリカッメガエル
の卵母細胞を用いる方法は、例えば次のようにして行わ
れる。卵母細胞1個当たり約50ngのmRNAをマイ
クロインジェクンヨン法で注入し、その10個を100
μlのパース培養液[Gurdon、J、B、、J、E
mbryol、Exp、Morphol 、。 20.401(19138>]中、22℃で24〜72
時間培養し、ホモジナイズした後、その遠心上清液(1
0,OOOrpm、 10分間)を検体として、L−9
29細胞傷害活性を指標として壊死死囚子活性を測定す
る[ L−029細胞傷害活性の測定法はRuffJ、
R,、et al、、J、1mmuno1.。 125、1671(1980)に記載されている]。 (3)ヒト癌壊死因子c DNAのクローニング(2)
の工程で得られたmRNAを鋳型とし、Gublerら
の方法[Gene、25.2G3(1983>1に従っ
てオリゴ(dT)をプライマーとして、dATI’、
dGTI’、 dcTr’。 dTTI’の存在下で逆転写酵素(例えばトリ骨髄性白
血病ウィルス由来逆転写酵素)によりmRNAと相補的
な単鎖c DNAを合成し、次いで大腸菌リボヌクレア
ーゼII’と大腸菌DNAポリメラーゼ■を用いて二重
鎖c DNAを合成する。ここに得られたDNAを、ポ
リ(dG)−ポリ(dC)又はポリ(dA)−ポリ(d
r>ホモポリマー伸長法(Noda、M、、et at
、。 Nature、295,202(1982); Ne1
son、T、S、、 ”Methods inEnzy
mology、” 08,41(1979)、Aca
demic Press Inc、。 Ncw York]のような常法に従って、例えばプラ
スミドpl[322の制限酵素Pst I切断部位に組
込ませる。得られた組換えプラスミドを、例えばCoh
enらの方法[I’roc、Nat、^cad、sci
、UsA、09,2110(1972)コに準じて、例
えばE、coliχ1776株のような宿主に導入して
形質転換させ、テトラサイクリン耐性株を選択してc
DNAライブラリーを作製する。 このc DNAライブラリーについて、(1)の工程で
得たウサギ癌壊死因子をコードするDNAの断片を12
1)で標識したものをプローブとして、コロニー・ハイ
ブリダイゼーンヨン試験[11anahan、D、、a
t al、。 Gana 、 10 、03(1980) ]を行い、
ウサギ壊死死囚子cDNA断片とハイブリダイズするク
ローンをスクリーニングする。 このようにして111られた多くのクロー7化DNAに
ついて、例えばMaxam−Gilbcrt法[r’r
oc、Nat、^cad 。 Sci、1ISA、74,500(1977)]に従っ
て塩バ配列を解析し、既に明らかになっているウサギ癌
壊死因子の塩基配列と相同性のある塩基配列を探し、最
終的にヒト癌壊死因子の全翻訳領域に対応する塩基配列
を含むcDNAを選び出すことにより、ヒト壊死死囚子
ポリペプチドをコードする塩基配列をイfするクローン
化DNAを得ることができる。 ことに得られたクローン化DNAの組込まれた組換えプ
ラスミドを、例えばE、co目11旧01株のような宿
主に導入して形質転換体を得た後、これを培養し、L−
9213細胞傷害活性を指標にして蛋白質を分離、精製
することにより、ヒト壊死死囚子ポリペプチドを得るこ
とができる。 更に形質発現効率を上げるためには、本発明のクローン
化DNAのヒト癌壊死因子をコードする領域を適当な制
限酵素で切り出した後、適当なプロモーターを有する形
質発現ベクターに組込んでヒト壊死死囚子ポリペプチド
生産用ベクターを作製すればよい、プロモーターとして
は、例えばlacプロモーター、 trpプロモーター
、 tacプロモーター。 PLプロモーター、 SV40初期プロモーターなど
が挙げられる。ベクターとしては、形質転換させる宿主
中で増殖するものはすべて用いることができる。例えば
プラスミド(pBR322,I)DR5/10など)、
ファージ(ラムダファージ誘導体など)。 ウィルス(SV40など)が挙げられる。これらは単独
で、又はそれらの組合わせ、例えばf) 13 R32
2−SV40ハイブリッドプラスミドなどの形で用いて
もよい。 ここに得られたクローン化DNAを組込んだベクターを
常法により適当な宿主に作用させて形質転換させること
により形質発現宿主が得られる。形質転換に用いられる
宿主としては、例えば大腸口。 枯草菌、酵母などの微生物、COS■onkey細胞な
どの動物培養細胞及び植物培養細胞が挙げられる。 本発明のヒト癌壊死因子は、ウサギ癌壊死因子と極めて
相同性の高いアミノ酸配列を育しており、DNA塩基配
列においても高い相同性が認められる。 第2表にヒト癌壊死因子及びウサギ癌壊死因子の前駆体
のアミノ酸配列の相同性を示し、第3表にヒト癌壊死因
子及びウサギ癌壊死因子の前駆体をコードするDNAの
塩基配列の相同性を示す、特願昭58−228790号
(特開昭60−120990号)で説明しているように
、ウサギ癌壊死因子は尿素非存在下では会合体の形で存
在し、第2表に示した第82番目のSetに始まり、第
236番目のLeuに終わる154個のアミノ酸から成
るポリペプチドがその基本構成単位であると考えられて
いる。即ち、前駆体ポリペプチドのN末端部分が生体内
で適当な酵素により切断され、活性化されるものと考え
られる。ヒト癌壊死因子の場合も、m 82番目のSe
tに始まり、第236番目のLeuで終わる155個の
アミノ酸から成るポリペプチドがヒト癌壊死因子の基本
構成単位であると考えられる。第2及びfi3表から明
らかなように、ヒト及びウサギ灯壊死因子のポリペプチ
ドのアミノ酸配列の相同性は81%であり、それぞれを
コードするDNA塩基配列の相同性は85%である。ま
た、ヒト壊死死囚子前駆体とウサギ灯壊死囚子前駆体と
の間にも高い相同性が認められ、ポリペプチドのアミノ
酸配列の相同性は78%であり、塩基配列の相同性は8
4%である。 ヒト及びウサギ癌壊死因子間のこのように高い相同性は
、両回子が系統発生学的には共通の分子から派生してい
ることを推測させるとともに、相同性の極めて高い領域
に壊死死因子の生物活性発現のために必須の領域があり
、壊死死因子の活性中心部分であることを示唆している
。 AGA TCA GCT TCT CGGAC
CCCG AGT GACAAGGCCCTG
AGT GACAAGGGCGTCTTCCAG
TTG °480 GAG AAG GGT GACCGG(***
)は終止コドンを示′ ネ** す。 ヒト癌壊死因子は、後記試験例で示すように、ウサギ癌
壊死因子とは免疫学的に全(交差せず、ウサギ癌壊死因
子とは免疫学的に区別し得るポリペプチドである。この
ように、ヒト及びウサギ癌壊死因子は全体としては高い
相同性を示すにもかかわらず、そのポリペプチドの性質
には明らかな相違がある。 このことは、壊死死因子の全アミノ酸配列がその生物活
性に必須ではな(、活性中心を構成する部分のアミノ酸
配列が同一であればその他の部分のアミノ酸配列が多少
変化し、それに伴ってポリペプチドの性質が変化しても
、壊死死因子の活性は保持されることを示している。 本発明により明らかにされたヒト癌壊死因子ポリペプチ
ドのアミノ酸配列やDNA塩基配列に関する知見に基づ
いて、逍伝子組換え技術の常法に従い、ヒト癌壊死因子
のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はヒト癌壊死因子
の活性中心部分を含むポリペプチドをコードするDNA
あるいは一部修飾されたヒト癌壊死因子DNAの変異体
を得ることができるし、それらを用いてヒト癌壊死因子
活性を仔するポリペプチドを容易に生産することができ
る。また、本発明で明らかにされたDNA塩基配列の一
部を化学合成し、これをプローブとして用いることによ
り、対立逍伝子変異や逍伝子コードの縮重のあるヒト癌
壊死因子DNAも容易に入手でき、それらを用いてヒト
癌壊死因子活性を有するポリペプチドを生産することが
できる。更に、ヒト癌壊死因子ポリペプチドのアミノ酸
配列に基づいて、それをコードする塩基配列のDNAを
全合成することも可能である。これらはすべて本発明の
範囲内に含まれる。 本発明のヒト癌壊死因子ポリペプチドは、優れた抗肚瘍
作用を有するので、抗腫瘍剤として悪性HIDの治療に
用いることができる。 以下に実施例及び参考例を挙げて本発明を更に具体的に
説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものでは
ない。 実施例 (蔦)ヒト癌壊死因子をコードするクローン化DNAを
検出するだめのプローブの:J4製 特願昭58−228790号(特開昭Go−12099
0号)に開示されている方法(例えば参考例2の方法)
に従って、第1表(既出)に示すウサギ癌壊死因子をコ
ードするクローン化DNAを得た。このDNAを制限酵
素11aarl及び^vaIを用いて切り出し、それぞ
れ第33〜120番の88 bpから成るDNA断片と
第285〜583番の299 bpから成るDNA断片
を得た。制限酵索へva Iで切り出した299bpの
DNA断片はウサギ癌壊死因子をコードする領域であり
、1laellで切り出した88 bpのDNA断片は
ウサギ壊死死囚子前駆体をコードする領域に相当する部
分である。 この2種のDNA断片を32pで標識して、ヒト癌壊死
因子c DNAのクローニングのためのプローブとし、
(8)項で使用した。 (2)ヒト肺胞マクロファージからのmRNA画分の車
間 ヒト肺からリン酸緩衝化生理食塩液を用いて肺胞マクロ
ファージを6.3〉・107個採取した。この肺胞マク
ロファージをIθ%牛脂児血1i17含存のRPMI−
If)40培地に懸濁させてベトリデイツシュ(直径8
=s )に1枚当たり9 X 106個となるように
播き、37°Cで5%炭酸ガス含合作気中、湿度90〜
100%で前培養した。1時間の前培養の後、工/トド
キシ/(大腸菌由来のりボボリサブカライド)。 TI’A (ホルボール−12−ミリステート−13−
アセテート)及びシクロヘキシミドをそれぞれ最終濃度
が1oμglll、 IOng/it及び1μg11と
なるように添加混和し、更に培養を継続した。4〜4.
5時間後(通算5〜5.5時間)に培養液を吸引除去し
、デイツシュ上に残ったマクロファージを0.6%ラウ
ロイルサルコシ/酸ナトリウムと6mMクエン酸ナトリ
ウムを含む5Mグアニジルチオシアネート液で溶解し、
ホモジナイズした。このホモジネートを0.1MEDT
A含fr5.1M塩化セシウム水溶液上に重居し、超遠
心分+m機(RPS27−20一クー1日立製作所)を
用い20,500 rpmで20時間遠心し、全RNA
画分をペレツトとして得た。これを0.35M NaC
1゜20mM T r i s及び20mM EDTA
を含む7M尿素液の少量に溶解し、エタノール沈殿とし
て回収した。 全RNAとして159μzh<得られた。 この全RNA画分を1 mM EDTAを含むIOmM
Tr i s −HCNU街液(pH7,4>(以下T
E液という)1肩1に溶解し、65℃で5分間加熱した
。これにNaC1溶液を0.5Mとなるように加えた後
、あらかじめ0.5MNaC1を含むTE液で平衡化し
たオリゴ(dT)セルロースカラムに付し、吸着したp
oly(A)mRNAをTE液で溶出することにより、
9 ugf) poly(A)mRNAを得た。 この
poly(A)mRNAを1.9 ng/nlの0度で
蒸留水に溶解し、これをアフリカッメガエルの卵母細胞
1個当たり50n lずつ注入し、前述の方法に従って
、卵母細胞中で翻訳された蛋白質のL−929細胞傷害
活性を測定した。その結果、10個の卵母細胞のホモシ
ネ−)0.1ml中に6.6単位/mlの活性を認め、
このPoly(A)mRNA調製品中にヒト癌+s死因
子のmRNAが含まれていることを確認した。 (3)cDNAの合成 ■項で得られたpoly(^)mRNAを鋳型としてG
ublerらの方法[Gene、25,283(198
3)]に従ってc DN、Aを合成した。 反応液量;40μ! 50mM Tris−HCI緩衝液(pH8,3) ;
10mM MgC12;10mMジチオスレイトール
; 4 mMピロホスフェート す ト リ ウ ム
; 1.25mM dGTP、 dATP、
dTTP;0.5mM dCTP:0.107μ
M a−”P−dCTP(比活性3000C+/mmo
le) ; 4μgオリゴ(dT) 12−Ill ;
6μg poly(^)mRNA ; 120単位ト
リ骨償性白血病ウィルス由来逆転写酵素。 43℃で30分間反応させた後、EDTAを加えて反応
を停止させ、フェノール−クロロホルム混液(1: 1
)で抽出し、その水層に酢酸アンモニウムを最終濃度2
.5Mになるように加え、エタノールにより反応生成物
(単鎖cDNA −RNA複合体)を沈殿させた。この
単鎖cDNA−RNA複合体を下記組成の反応緩衝液1
00μlに溶解した。 反応緩衝液組成: 20mM T r i s −HC1mm液液pH7,
5) ; 5 mM MgC12;10mM (N)1
4) 2sOa ; l00mM KC1; 0.15
mMβ−==+チンアミド アデニ/ ジヌクレオチド
;50ng/■1ウシ血清アルプミ/;40nM dG
TP、 dATP、 dTTP。 dCTP; 0.9単位大腸閏リボヌクレアーゼI−1
; 23単位大腸閑DNAポリメラーゼl0 12℃で60分間、続いて22℃でGO分間反応させた
後、EDTAを加えて反応を停止させ、上記と同様にフ
ェノール−クロロホルム混液で抽出し、エタノールによ
り沈殿させて二重鎖c DNAを得た。 (4)オリゴ(dC)テール付加c DNAの調製(3
)項で得られた二重鎖c DNAに次の組成の反応緩衝
液100μlを加え、37℃で30分間反応させ、二重
鎖cDNAにオリゴ(dC)テールを付加させた。 反応緩衝液; 2 mM COCl2.0.2mMジチオスレイトール
、0.1mM a−”I’−dcTI’(比活性3 C
i/mmole)及び10!11.位ターミナルデオキ
7ヌクレオチジルトランスフェラーゼを含有する100
mMカコジル酸ナトリウム(pH7,2)。 反応はEDTA水溶液を添加して停止させ、フ。 ノール−クロロホルム混液で抽出し、オリゴ(dC)テ
ール付加c DNAをエタノールにより沈殿させ回収し
た。これをl0mM Tris−11CH8f)液液(
pl+7.4>。 1 mM EDTA及び100mM NaC1を含む水
溶液に11当たり2μgのオリゴ(dC)テール付加c
DNAを含むように溶解した。 ■オリゴ(dG)テール付加プラスミドpIIR322
DNAの調製 20mM Tris−HCI)1衝液(pH7,4)
、 l0mM MgC12゜50mM (NHa) 2
304及び1■1当たり0.1.のウシ血1nアルフミ
/を含む水溶液100μj!にpHR322を108g
溶解し、制限酵素Pst Iエンドヌクレアーゼ15単
位を加え、37℃で1時間反応させた。反応終了後、反
応液を7エノールークロロホルム混液で抽出し、水層か
らエタノール沈殿によってDNAを回収した。得られた
DNAを前述のオリゴ(dC)テール付加に用いた水溶
液(但し”P−dCTPの代わりに’I(−dGTr’
を含む)200μ!に溶解し、ターミナルデオキシヌク
レオデジルトランスフェラーゼ80単位を用いて37℃
で20分間反応させ、約10〜15個のdG残基を取り
込ませた。反応液をフェノール−クロロホルム混液で抽
出し、水層からエタノール沈殿によってオリゴ(dC)
テール付加プラスミドpnR322 DNAを回収した
。これをオリゴ(dC)テール付加c DNAの場合と
同様の緩衝液に111当たり20μgのオリゴ(dC)
テール付加プラスミド1R3221)N Aを含むよう
に溶解した。 (6)組換え体プラスミドの作製 (4)項で得られたオリゴ(dC)テール付加cDNA
溶a120μpを、5)項で得られたオリゴ(dC)テ
ール付加flR322DNA 1B 液+20μff、
!−’KA 合L、65℃で5分間、57°Cで120
分間インキュベートしてアニーリングを行い、組換え体
プラスミド溶液を調製した。 (力形質転換体の選択 (6)項で得られた組換え体プラスミド溶液を用い、E
、coliχ1776株を形質転換させた。即ち、E、
coliχ1776株(八TCCNo、 31244)
を、ジアミノピメリン酸100μg11及びヂミジ/4
0μg1m+を補ったL−プロス201中、37℃で吸
光度(00On園)が0.5となるまで培養し、菌体を
4℃で遠心して集め、50mMCaC+2含fT l0
mM Tr i s −11CI緩衝液(pH7,3)
l0w1に分散し、4℃で再度遠心して沈殿させた。 集めた菌体を同じ緩衝液21に分散し、0℃で5分間静
置した。この分散液0.2 mlに(6)項で得られた
組換え体プラスミド溶液0.1■1を添加混合し、0℃
で15分間静置し、更に42℃で2分間保持した後、前
の培養で用いたのと同一組成のし一ブロス0.51を加
えて1時間振公培養を行った。この培養液の一部を皐り
、前述の成分の他にテトラサイタリン15μg/mlを
含むL−ブロス寒天平板に広げ、37℃で約12時間培
養し、テトラサイクリン耐性菌を選択してc DNAラ
イブラリーを作製した。 (8)クロm;7グ (7項で得られたc DNAライブラリーについて、ヒ
ト癌壊死因子をコードするc DNAを含むプラスミド
を持つ形質転換体をスクリーニングするため、(1)項
で得られたウサギ癌壊死因子をコードするDNAの制限
酵素^vaIで切り出した断片(299bp)の32p
標識物をプローブとし、コロニー・ハイブリダイゼータ
3ン試験をl1anahanらの方法[Gene、 I
on03(1980>]に従って行った。約2万個のコ
ロニーから、この標識プローブと強く結合する塩基配列
を含む組換え体プラスミドを持つ形質転換体43個を選
び出した。 更に、この43個のコロニーについて、制限酵素11a
cllで切り出したウサギ壊死死囚子コード領域の」二
流に相当するDNA断片(88bp)のff2p標識物
をプローブとし、二次スクリーニングを行い、このプロ
ーブと強くハイブリダイズする6個のコロニーを選び出
した。この2回のスクリーニングにより、ウサギ癌壊死
因子をコードするDNA塩基配列及びその上流部分と相
同性の高い塩基配列を含むDNAを得た。 (9)形質発現 (8)項で選ばれた6個のクローン(プラスミド番号1
)TITNF−1,−4,−5,−13,−22,−2
6)から、それぞれの組換え体プラスミドを取り出し、
E、col+1111101株(ATCCNo、 33
094)を宿主として形質転換体を得た。それぞれの形
質転換体について、Nagataらの方法[Natur
e、284.310(1980)]に準じて501培養
を行った。培地にはLnプロスを用いた。吸光度(Go
on曹)が約0.8になるまで培養し、約3〜5×10
1θ個の菌体を集めた。0.1%リゾチームを含む50
mM Tr i s −TICI緩衝液(pl+8.0
>と30mM NaC1より成る溶液の1■Iに菌体を
懸濁させ、氷水中で30分間静置した後、凍結融解を6
回繰返して菌体を破壊し、遠心分離して菌体抽出液を得
た。それぞれの形質転換体から得られた抽出液について
、L−929細胞傷害活性を測定した結果、プラスミド
pl−ITNF −13による形質転換体の抽出液に1
80.1単位11の活性を認めた。 (II)クロー7化DNAの塩基配列の決定(9)項で
選択された組換え体プラスミドPIITNF−13によ
る形質転換体をLI3グロスで培養して菌体を得た。こ
の菌体をWNkieらの方法[Nucleic^c+d
s Ras、、7,859(1979)]に従って処理
し、プラスミドDNAを得た。このプラスミドDNAを
制限酵素Pst Iで分解し、分離精製してクローン化
DNAを得た。このクローン化DNA断片を種々の制限
酵素で分解し、10種の制限酵素断片について、それぞ
れの塩基配列をMaxam−Gilbert法により脱
リン酸化、Pによる末端標識、塩基特異的化学分解反応
、ゲル電気泳動及びオートラジオグラフィーを行い決定
した。 図面に塩基配列決定に用いた制限酵素の切断部位と塩基
配列を決定した方向及び範囲(矢印で表示)を示す。ロ
ゴ3部分はヒト癌壊死因子前駆体ポリペプチドをコード
する領域を示す。 その塩基配列及びこの塩基配列から翻訳されたアミノ酸
配列は第4表の通りである。ヒト癌壊死因子のポリペプ
チドをコードする領域は、第1表に示したウサギ癌壊死
因子をコードする塩基配列との相同性に基づいて推定し
た。即ち、ヒト壊死死囚子ポリペプチドは、第4表の第
235〜237番のTCAのコドン(Setに対応)か
ら始まり、第697〜699番のCTG (Leuに対
応)で終わり、155残基のアミノ酸から成っている。 C末端のロイン/のコドンに続いてTGAの終止コドン
がある。塩基配列第1〜234番はヒト癌壊死因子の前
駆体をコードするために必要な配列と考えられる。 第4表 CTCCACCCTCTCTC GACCCACGG −10−I CCCTGGAAAGGACACC TCTCGAACCCCGA( Se rArgThrPros( 1′ 〕 1す01− CATGTTGTAGCAAAC Hi 5ValValA1 aAsn (”’:T(”:CTCACCCACACCCCTCA
AGCTGAGGGG ProGl nA1 aGl uGl yAACCGC
CGGGCCAAT AsnArgArgAl aAsn GGCGTGGAGCTGAGA Gl yValGl uLeuArg GTGCCATCAGAGGGC Val ProSe rGl uGl yATCAGC
CGCATCGCC LeuLeuThrHi 5Thr I I eSe rArgI l eAla’GACC
GACTCAGCGCT AspArgLeuSerA1 a GAGATCAATCGGCI GluI 1eAsnArgP GCCGAGTCTGGGC AlaGluSerGlyG ATTGCCCTGTGAG( I l eAI aLeu*零* CTTCCCAAACGCC’ (***)は終止コドンp。 CCGACTATCTCGACTTT roAspTyrLeuAspPh、eCAGGACG
AACATCCAAC rCCCCTGC 訃示す。 (以下余白) 参考例1 抗つサギ厚壊死囚子抗体の作製 特願昭58−228790号(特開昭00−12099
0号)に開示されている方法(例えば参考例3の方法)
に従って得た、精製ウサギ壊死死囚子1.9X 105
単位を含むfg液を等量のフロイントの完全アジュバン
トで乳濁化し、それをモルモットの背部皮下数カ所に注
射した。その後、■、3及び6週後に同様の方法で免疫
した。更に8迎後に、同J+tの精製ウサギ癌壊死因子
を水酸化アルミニウムゲルとともに腹腔内に注射した。 最初の免疫から9週後に心臓より全採血し、遠心分離に
より血清を分Miすることによって抗つサギ壊死死囚子
抗体を含む抗血1’i7を得た。 この抗血t?7を、正常ウサギ血清成分をカップリング
させたセファ0−ス411(ファルマシア社)カラムに
3回繰返して通過させることによりウサギの血1??成
分に対する抗体を完全に除去し、ウサギ癌壊死因子に対
する特異抗体のみを含む精製抗血lnを得た。この抗血
清は、免疫電気泳動法及びゲル内二重拡散法により精製
ウサギ癌壊死因子との間にのみ単一の沈降線を形成した
。この精製抗血清を約oo 、 ooo倍希釈したもの
は、ウサギ癌壊死因子のL−029細胞傷害活性500
単位を50%中和する能力をイrする。 参考例2 (1)ウサギ肺胞マクロファージからのmRNA分画の
単離精製 ウサギ(体重的2.5kg)にプロピオニバクテリウム
アクネ7、 (Propion+bacteriuw
acnes)死菌体を1羽当り100■の投与量で静
脈内に注入し、80後に屠殺した。直ちに開胸気管切開
し、気管内に挿入したチューブを介してリン酸暖衝化生
理食塩液を用い肺洗浄を繰返し、肺胞マクロファージを
採取した。12羽のウサギより約3 X 10’個の肺
胞マクロワ1−ジが得られた。この肺胞マクロファージ
を10%牛脂児血清含有のR1”Ml−1640培地に
懸濁させてベトリディッシュ(直径8 cs )に1枚
当り2 X 107個となるように播き、37℃で5%
炭酸ガス含有空気中、湿度90〜100%で前培養した
。1時間の前培養の後、エンドトキシン(大腸菌由来の
りボボリサッカライド)。 TI’A(ホルボール−12−ミリステート−13−ア
セテート)及びンクロへキシミドをそれぞれ最h% C
度が10 tt g/ * I 、 IOng/ w
I及びlμg/mlとなるように添加混和し、更に培養
を継続した。4〜4.5時間後(通算5〜5.5時間)
に培養液を吸引除去し、デイツシュ上に残ったマクロタ
1−ジを0.0%ラウロイルサルコシン酸ナトリウムと
6mMクエン酸ナトリウムを含有する5Mグアニジルグ
ーオシアネート液で溶解しホモジナイズした。このホモ
ジネートを0.IM EDTA含有5.7M塩化セシウ
ム水溶液上にr3.層し、超遠心分離機(RI) S
27−2日−ター1日立製作所)を用い20 、500
rp−で20時間遠心し全RNA画分をベレットとして
得た。これを0.35M NaCI、 20mM T
r i s及び20mM EDTAを含む7M尿素液の
少−1に溶解し、エタノール沈殿として回収した。12
羽のウサギより全RNAとして5.2Mgが得られた。 この全RNA画分を1 mM EDTAを含む10mM
Tris−11cIIW街液(all 7.4) (
以下TE液という)2−1に溶解し、65℃で5分間加
熱した。これにNaC1溶液を0.5Mとなるように加
えた後、あらかじめ0.5M NaC1を含むTE液で
平衡化したオリゴ(dT)セルロースカラムに付し、吸
着したpoly(^)mRNAをTE液で溶出すること
により、31Augのpoly(^)mRNAを得た。 ここで得たpoly(^)mRNAの200μgをアガ
ロースゲル電気泳動(ゲル濃度1%、8M尿素存在下、
pH4)に付し、その分子サイズに従って7つの画分に
分け、ゲルを融解(70°C110分間)させた後、水
飽和フェノールによる抽出とクロロホルムによる抽出の
のち、エタノールにより沈殿させて各両分よりpoly
(^)mRNAを回収した。各画分のpoly(^)m
RNAについてアフリカッメガエルの卵母細胞を用いる
方法でウサギ癌壊死因子mRNA flを測定し、分子
サイズとして1.6〜2.7kbに相当する両分にウサ
ギ癌壊死因子mRNAを高濃度に回収した。この精製p
oly(^)mRNAの比活性は約1 、230単位/
pg RNAであり、未精製poly(^)mRNA
UR製品の比活性約320単位/μg RNAに比べ
て約4倍にIO縮された。 ここで得られた精!i!!poly(^)mRNAを以
下の実験に用いた。 し1cDNAの合成 f+’i製poly(八)mRNA 4 ttHを用い
以下に示す条件でc DNAを合成した。 反応液量;100μ! 50mM T r i s −Ilc IG衝液液 p
H8,3) ; IOmMMHCI 2ニア0mM K
CI : 1 mMジチオスレイトール;0.5mM
dTTP、dCTP、dATr’、、dGT、r’(但
しdCTPは32■)で標識、比活性4.4X 10’
cps/ nmole) : 3μgオリゴ(dT)
12〜+g、 80単位トリ骨償性白血病ウィルス由
来逆転写酵素。 43°Cで80分間反応させた後、 EDTA水溶液で
反応を停止させた。フェノール−クロロボルム混m(1
:1)によりcDNA−mRNA複合体を抽出し、エタ
ノールにより沈殿させ回収した。更に、アルカリ加温処
理することによりmRNAを分解除去した後、合成され
た単鎖CDNAをエタノールにより沈殿させ回収した。 この単鎖c DNAの沈殿を下記組成の反応緩衝液40
μlに溶解した。 反応緩衝液; 0.5mM dATr’、 dTTI’、 dGT1’
、 dCTP; 5 mMMgCI2 ; 70mM
KCI ; 1.5mMβ−メルカプトエタノール;8
単位大腸菌DNAポリメラーゼI(ラージフラグメント
)を含有する0、1Mヘペス(ll0PQs) 緩衝G
(pHO,9)。 15℃で20時間反応させ二重鎖c DNAを合成した
。反応液にドデシル硫酸ナトリウム水溶液を加えて反応
を停止させ、二重鎖c DNAをフェノール−クロロホ
ルム混液で抽出し、エタノールにより沈殿させ回収した
。 得られた二重鎖c DNAの沈殿を、50mM酢酸ナト
リ ウ ム (PI−14,5)、 1 mM
ZnSO4,200mM NaC+。 0.5%グリセロール及びS1ヌクレアーゼ0.5単位
を含有する水溶液100μ!に溶解し、37℃で20分
間反応させてヘアピン構造を開裂させた。反応はEDT
A水溶液を添加して停止させ、フェノール−クロロホル
ム混液で抽出し、更にエーテルで再抽出した後、エタノ
ールにより沈殿させc DNAを回収した。 (3)オリゴ(dC)テール付加c DNAの調製上記
により得られた二重鎖c DNAに次の組成の反応緩衝
液100μ!を加え37℃で20分間反応させ、二重鎖
cDNAにオリゴ(dC)テールを付加させた。 反応緩衝液; 1 mM COCl2.0.1mMジチオスレイトール
。 0.2uyポリ(^)、 O,ImM ’II −dc
Tr’(比活性5400cp*#+■of)及び10!
l’、位ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフ
ェラーゼを含イrする130mMカコジル酸ナトリウム
−30mM Tr i s −11CI 緩衝液(pI
IO,8)。 反応はEDTA水溶液を添加して停止させ、フェノール
−クロロホルム混液で抽出し、更にエーテルで再抽出し
た後、オリゴ(dC)テール付加c DNAをエタノー
ルにより沈殿させ回収した。 これをl0mM Tr is −HC1緩衝液(PH7
,4>、 1 mMEDTA及びl00mM NaC1
を含む水溶液に1■1当り0.2μgのオリゴ(dC)
テール付加c DNAを含むように溶解した。 (4)オリゴ(da)テール付加プラスミドpI3R3
22DNAの調製 20mM T r i s −HC1mm液液 plI
7.4) 、 10mMMgC12,50mM (Nl
(4) 2304及び1ml当り0.1■のウシ血清ア
ルプミ/を含む水溶液100μlにpnR322を10
az溶解し、制限酵素1’5t(z7ドヌクレアーゼ1
5単位を加え、37℃で1時間反応させた。反応終了後
、反応液をフェノール抽出し、水射からエタノール沈殿
によってDNAを回収した。得られたDNAを前述のオ
リゴ(dC)テール付加に用いた水溶液(但し’14−
dcTI’の代りに’H−dGTPを含む)200μ
!に溶解し、ターミナルデオキシヌクレオチラルトラン
スフェラーゼ80単位を用いて37°Cで20分間反応
させ、約10〜15個のdG残基を取り込ませた。反応
液を水飽和フェノール−クロロホルム混液で抽出し、水
層からエタノール沈殿によってオリゴ(dC)テール付
加プラスミドpBR322DNAを回収した。これをオ
リゴ(dC)テール付加cDNAの場合と同様の緩衝液
に1璽1当り2μgのオリゴ(dC)テール付加プラス
ミド1R322DNAを含むように溶解した。 6)組み換え体プラスミドの作製 オリゴ(dC)テール付加c DNA溶液50μlをオ
リゴ(dc)テール付加p11 R322DNA溶液5
0μlと混合し、65°Cで10分間、57℃で120
分間、45℃で60分間、35°Cで60分間及び室昌
で60分間インキュベートしてアニーリングを行い、組
み換え体プラスミド溶液を調製した。 (6)形質転換体の選択 上記で得られた組み換え体プラスミド溶液を用い、E、
coliχl776株を形質転換させた。即ち、E、c
oliχ1776株を、ジアミノピメリン酸+00uH
/−1及びチミジン40μg/■1を補ったL−ブrJ
ス201中、37℃で吸光度(Coons>が0.5と
なるまで培養し、菌体を冷却器付遠心分子tt機で集め
、50mMcac12含イr 10mM Tris−1
1CI tilt衝液(液液7.3)IOmlに分散し
、0°Cで再度遠心して沈殿させた。集めた菌体を同じ
緩衝液21に分散し、0℃で5分間静置した。この分散
液0.2 mlに上記組み換え体プラスミド溶液0.1
1を添加混合し、0℃で15分間り置し、更に42℃で
2分間保持した後、前の培養で用いたのと同一組成のL
−ブロス0.5■1を加えて1時間振盪培養を行った。 この培養液の一部を取り、前述の成分の他にテトラサイ
クリン15μg/−1を含むし一ブロス寒天平板に広げ
37℃で約12時間培養し、テトラサイクリン耐性閏を
選択してc DNAライブラリーを作製した。 ■ハイプリダイイー2g/試験 前記のc DNAライブラリーについて、ウサギ癌壊死
因子をコードするcDNAを含むプラスミドを持つ形質
転換体をスクリーニングするため22 p標識cDNA
プローブを用い゛るコロニー・ハイブリダイゼーシコン
試験をハナハ7 (l1anahan)らの方法[Ge
ne、10.03(1980)]に従って行った。 32P M’3 識cDNAプローブは、誘導プラス及
ヒマイナス肺胞マクロファージより上記(1)項の方法
で得たmRNAを鋳型として、(2)項の方法で合成し
た。但し、” P −dCTPは高放射能比活性のもの
を用い、高濃度に標識した。この試験によりd JfJ
プラスのプ「1−ブと強く結合し、誘導マイナスのプロ
ーブとはハイブリダイズしない塩基配列を含む組み換え
体プラスミドを仔する形質転換体を選別した。約2万個
のコロニーから50個ノコロニーが選び出された。 次いで、これらの選択された菌株についてハイブリダイ
ゼーンヨン・トランスレーション試験を“モレキュラー
りローニンーグ” (Maniatis。 T、、et al、、(cd)“Mo1ecular
Cloning” 、329(1982)+Co1d
Spring 1larbor Lab、、)に記載の
方法に従って行った。それぞれの形質転換体よりプラス
ミドDNA ヲfill 出し、ニトロセルロースフィ
ルター上に加熱変性させたのち固定し、これに上記(1
)項で得たウサギ壊死死囚子mRNAを含むpoly(
^)mRNA画分を加え、50°Cで180分間反応さ
せ、/1イブリダイゼーショ/を行った。結合したmR
NAを溶出回収した後アフリカッメガエルの卵母細胞に
注入し、回収されたmRNAがウサギ壊死死囚子mRN
Aであるか否かを検定した。この試験により、上記で選
択された20個の形質転換体よりウサギ壊死死囚子mR
NAと強くハイブリダイズするcDNAを含むプラスミ
ドを持つ菌株3個を見いだした。そのうち最も長いcD
NA (約750bp)ライr t Zプラスミドより
、制限酵町de I 1? DNA断片を切り出し、二
次スクリーニング用のプローブとした。このDNA断片
を32 pで標識し、上記(6)項で得たc DNAラ
イブラリーについて再度コロニー・ハイブリダイゼーシ
qノ試験を行い、標識プローブと強く結合するc DN
Aを含むプラスミドを持つ形質転換体を選んだ。c D
NAライブラリーの約6万個のコロニーのうち98個が
陽性コロニーであった。これらからc DNAを制限酵
素Pst Iで切り出し、そのサイズをポリアクリルア
ミドゲル電気泳動で調べ、1kbp以上のサイズを「す
る17個のクロー/を選び出した。これらのうち最も大
きなc DNAを含む形質転換体(菌体番号:RTNF
802 、クローン化DNA番号: f)RTNF80
2)について、クローン化DNAを’F−ntし、後述
の方法で塩基配列を決定した。 (8)り
ードするクローン化DNA、 それらクローン化DNA
を組込んだベクター及びそれらのベクターで形質転換さ
れた宿主に関する。 本明細書では![!社の簡略化のために以下の略号を使
用する。 A アデニン Cシトシン G グアニン T チミン Ala アラニン Arg アルギニ/ Asn アスパラギン Asp アスパラギン酸 Cys システィン Gin グルタミン Glu グルタミン酸 Gly グリシ/ His ヒスチジン 11e インロイシン Leu ロイシン Lysリジ/ Met メチオニン Phe フェニルアラニ/ Pro プロリン Set セリン Thr スレオ/−7 TrP )リプトファン Tyr チロシン Vat バリン DNA デオキシリボ核酸 c DNA 相補DNA RNA リボ核酸 mRNA 伝令RNA dATP デオキシアすノシン三リン酸dCT
I’ デオキシシチジン三リン酸dGTP
デオキシグアノシン三リン酸dTTP
デオキシチミジン三リン酸オリゴ(dC) オリゴ
デオキシグアル酸オリゴ(dG) オリゴデオキシ
グアニル酸オリゴ(dT) オリゴデオキシチミジ
ル酸ポリ(A) ポリアデニル酸 ポリ(U) ポリウリジル酸 ポリ(dA) ポリデオキシアデニル酸ポリ(d
C) ポリデオキシシチジル酸ポリ(dG)
ポリデオキシグアニル酸ポリ(dT) ポリ
デオキシチミジル酸EDTA エチレンジアミ
ン四酢酸bp 塩基対 Carswe I Iらは、あらかじめbac口1us
Calmette−cu6r+n (l3CG )で
感染させ、次いでエンドトキシンで処理したマウスの血
清中には、移植したMeth^肉腫による癌を壊死させ
る物質が含まれていることを見いだし、この物質を壊死
死因子と名づけた[Proc、Nat、^cad、sc
i 、tlSA、72.31300(1975)]。 癌壊死因子はマクロファージから放出される生理活性物
質と考えられており、その特徴として、(1)担癌動物
に投与するとある種の癌を壊死させ治癒せしめること(
ii) in vHroである種の癌細胞(例えばマウ
スの癌細胞であるL細胞、ヒト癌由来のPC−10細胞
)を傷害するが、正常細胞にはほとんど存置な作用を及
ぼさないこと、及び(ii+)その作用が種特異的でな
いことなどが知られている。このような特徴の故に壊死
死因子は、新しいタイプの制癌剤としてその臨床的応用
が強く期待されている。 しかしながら、従来の壊死死因子製造法はマウスやウサ
ギなどの動物にBCG又はProp ton 1bac
te−riu■acnesを注射し、次いでエンドトキ
シンを投与した後その血液及び体液より壊死死因子を単
離精製するものであるため、安定して多量の壊死死因子
を安価に得ることは難しい状況であった。更に、壊死死
因子を医薬として使用するためには、抗原性等の観点か
らヒト由来の壊死死因子がより好ましいが、上記方法は
ヒト由来の壊死死囚子製造には採用できない。 従来、ヒトマクロファージ由来の癌細胞傷害因子として
、Matthewsにより報告された、正常人の末哨単
球細胞あるいは骨髄性単球性白血病細胞が産生ずる因子
(^nu−tumor cytotoxin)[:■■
1unology。 44、+35(1981)]及びReedらにより報告
された、ヒト末檜血中の培養器壁付着細胞が産生ずる因
子(^dherent cell toxin)[J、
rssunol、、115,395(1975)1など
が知られている。また、W■目λ1sOnらは、ヒトB
細胞樹立株から産生される分子量約7万ダルトンの物質
をヒト癌壊死因子として報告している[Proc、Na
t、^cad、sci、UsA、80,5397(19
83>]。しかし、いずれの場合もその物質としての実
体は不明であった。 本発明者らは、ヒト由来の壊死死因子の大量生産法を確
立するために、遺伝子組換え技術に着目して鋭意研究を
行い、まずウサギ癌壊死因子をコードするクローン化D
NAの単離に成功した(特願、昭58−228790号
(特開昭00−120990号)参照)。更に研究を続
けた結果、このクローン化DNAをプローブとして、ヒ
ト癌壊死因子をコードするc DNAをクローン化する
ことに成功し、更にこのクローン化DNAを組込んだプ
ラスミドで形質転換された微生物がヒト癌壊死因子を産
生ずることを確認して本発明を完成した。 本明細書において、ヒト癌壊死因子とはヒト由来細胞が
産生ずる蛋白質であって、 inv+troで少なくと
もL細胞を傷害する能力、及び+n vtvoで少なく
とも移植したMeth^肉腫による癌を壊死させる能力
を佇するものを意味し、壊死死囚子活性とは、このよう
な生物活性を意味する。 本発明は、ヒト癌壊死因子のアミノ酸配列又はその活性
中心部分を含むポリペプチド、及びそれらをコードする
クローン化DNAを提供するものである。特に、次のア
ミノ酸配列(I) Ser Ser Ser Arg Thr Pro S
er AsP Lys Pr。 Val Ala Hls Vil Vtl Ali A
sn Pro Gln AlaGlu Gly Gln
Leu Gln Trp Leu Asn Arg
ArgAla Asn Ala Leu Leu Al
a Asn Gly Vil GluLeu Arg
As1) Asn Gln Leu Vat Vil
Pro 5erGlu Gly Leu Tyr Le
u Ile Tyr Ser Gln ValLeu
Phe Lys Gly Gin Gly Cys P
ro Ser ThrHls Val Leu Leu
Thr Hls Thr rle Ser ArgI
Is Ala Vat Ser Tyr Gln Th
r Lys Vat AsnLau Leu Ser
Ala Ile Lys Ser Pro Cys G
lnArg Glu Thr Pro Glu Gly
Ali Glu Ali LyiPro Trp T
yr Glu Pro Ile Tyr Leu Gl
y GlyVat Phe Gln Leu Glu
Lys Gly Asp Arz LeuSer Al
a Glu IICAsn Arg Pro Asp
Tyr LeuAsP Phe Ala Glu
Ser Gly Gln Vil Tyr
PheGly Ile Ile Ala
Leu (I )を有するヒト癌
壊死因子[以下ポリペプチド(I)と記す]、ポリペプ
チド(I)のN末端に更に次のアミノ酸配列(II) Met Ser Thr Glu Ser Met I
le Arg AspValGlu Leu Ala
Glu Glu Ali Leu Pro Lys L
ysThr Gly Gly Pro Gln Gly
Ser Arg Arg CysLeu Phe
Lcu Ser Leu Phe Ser
Phe Leu l1eVat Ala Gly
Ala Thr Thr Leu Phe Cys
LeuLeu His Phe Gly Vat Il
e Gly Pro Gln ArgGlu Glu
Phe Pro Arg Asp Leu Ser L
eu 1ieSer Pro Leu Ali Gln
Ala Vat Arg (II )を有するポ
リペプチド[以下ポリペプチド(I+■)と記す]、及
びポリペプチド(I)のN末端にMetを有するポリペ
プチド、並びに次の塩基配列(Ill) (5’)−TCA TCT TCT CGA ACCC
CG AGT GACAAGCCT GTA GC
CCAT GTT GTA GCA AACC
CT CAAGCT GAG GGG CAG CT
CCAG TGG CTG AACCGCCGG G
CCAAT GCCCTCCTG GCCAAT
GGCGTGGAG CTG AGA GAT
AACCAG CTG GTG GTG
CCATCA GAG GGCCTG TACC
TCATCTACTCCCAGGTCCTCTTCAA
G GGCCAA GGCTGCCCCTCCAC
CCAT GTG CTCCTCACCCACAC
CATCAGCCGCATCGCCGTCTCCTAC
CAG ACCAAG GTCAACCTCCTC
TCT GCCATCAAG AGCCCCTGC
CAG AGG GAG ACCCCA GA
G GGG GCT GAG GCCAAG
CCCTGG TAT GAG CCCATC
TAT CTG GGAGGG GTCTTCC
AG CTG GAG AAG GGT G
ACCGACTCAGCGCT GAG ATCA
AT CGG CCCGACTATCTCGACT
TT GCCGAG TCT GGG CAG
GTCTΔCTTT GGG ATCΔTT
GCCCTG−(3′) (III ’)
を有する、ポリペプチド(I)をコードするクローン化
DNA [以下DNA (Ill >と記す]及びDN
A(III)の5′末端に更に次の塩Jλ配列(TV)
(5’)−ATG AGCACT GAA AGCAT
G ATCCGG GACGTG GAG CTG G
CCGAG GAG GCG CTCCCCAAGAA
G ACA GGG GGG CCCCAG GGCT
CCAGG CGGTGCTTG TTCCTCAGC
CTCTTCTCCTTCCTGATCGTG GC
A GGCGCCACCACG CTCTTCTG
CCTG CTG CACTTT GGA G
TG ATCGGCCCCCAGAGG GAA
GAG TTCCCCAGG GACCTCTC
T CTAATCAGCCCT CTG GCC
CAG GCA GTCAGA−(3’)(IV) を有する、ポリペプチド(I+■)をコードするクロー
ン化DNA [以下DNA(Ill−+lV)と記ず]
、及びDNA(III)の5′末端に開始コド7 AT
Gを佇するDNAを提供するものである。 本明細書において、ヒト癌壊死因子のアミノ酸配列を含
むポリペプチドとは、ポリペプチド(I)。 又はそのN末端又はC末端にアミノ酸又はペプチドが結
合しているポリペプチドであって、それ自身が、又は酵
素等により切断されて生じるポリペプチドが、1!リベ
プヂド(I)と同様のヒト壊死死囚子活性を示すものを
意味する。また、ヒト癌壊死因子のアミノ酸配列の活性
中心部分を含むポリペプチドとは、ポリペプチド(1)
のアミノ酸配列のうちヒト壊死死囚子活性を発現ず°6
のに必須のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、
ボリペプチド(I)と同様のヒト癌壊死因子活性を示す
ものを意味する。本発明には、ヒト癌壊死因子のアミノ
酸配列又はその活性中心部分を含むポリペプチド、それ
らをコードするDNA 、それらのDNAを組込んだベ
クター及びそれらのベクターで形質転換された宿主だけ
でなく、得られたポリペプチドが本発明のポリペプチド
(I)と高い相同性を存し、同様のヒト癌壊死因子活性
を示し、かつ免疫学的に交差するものである限り、その
ようなポリペプチド並びにそれらをコードするDNA
。 それらのDNAを組込んだベクター及びそれらのベクタ
ーで形質転換された宿主も又含まれる0例えば、ヒト癌
壊死因子DNAの対立遺伝子変異体及び遺伝子コードの
縮重又は一部の修飾を含むヒト癌壊死因子DNAの:4
導体及びこれらから得られるポリペプチドも又本発明に
含まれる。なお、一部の修飾を含むヒト癌壊死因子DN
Aの誘導体とは、ヒト癌壊死因子DNAの一部が欠失し
た誘導体及びヒト癌壊死因子DNAに他のDNA断片が
付加した誘導体を意味する。 本発明のヒト癌壊死因子をコードする塩基配列を「する
DNAは、例えば次のようにして製造することができる
。 (1)ウサギ癌壊死因子をコードするクローン化DNA
の調製 49 m rXl 5B−228’?80 号(特rj
n N 6(112099(1号>k[tl示されてい
る方法(例えば参考例2の方法)に従って、ウサギ壊死
死囚子c DNAを得る。このクローン化DNAの塩基
配列は第1表に示す通りで、ウサギ癌壊死因子のポリペ
プチドをコードする領域は第277〜738番である。 このウサギ壊死死囚子c DNAに、適当な長さのDN
A断片を与えるように制限酵素を作用させてDNA断片
を切り出し、以下に述べるヒト癌壊死因子c DNAの
クローニングのためのプローブとする。 制限酵素としては、例えば^vaI 、 HaelI
、 BstNI 。 旧ncI[、RsaIが挙げられる。DNA断片は異な
る領域に由来する2種以上のものを使用するのが好まし
い。第1表には、制限酵素として^VλI及びHae
Uを用いて、それぞれ299 bp及び88 bpcD
DNA断片を切り出す場合の切断部位を示している。 (以下余白) E−< (、l(、l QaOQ
<E−00 <h Q(、l <← (1)(、l QO0(1) <E−4Qa Qa ao Qa aQEく QOく
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oa Qaく← oo <E−oQ E< <← Oa 00 ←< LX) 00 QO aQ Oa <E−<← Qo 00 Qo 00 00 ト0く ←く Qo <h u。 Oo 00 Qa UL) ■ヒト癌壊死因子mRNAの調製 ヒトのマクロファージを肺胞、血液、腹腔、胎盤。 胛臓、その他の組織から採取する。例えば、肺胞からは
5aneらの方法[J、lm5uno1..129.1
313(+982)]。 血液からはMatthcwsの方法[11r、J、Ca
ncer、48,405(+983)]、胎盤からはW
ilsonらの方法[J、Itwunological
Methods、50,305(+983)]により
採取する。このマクミツ1−ジを培養器面!d当たり約
2X 104〜106個播き、35〜38℃、好ましく
は約37℃、約5〜10%炭酸ガス合作空気中、湿度的
80〜100%で約30分〜2uソ間前培養する。次い
でダラム陰性菌より得られたエンドトキシン、例えば大
腸菌、緑膿菌、チフス菌由来のりボボリサブヵライドを
加え、更に培養を3〜8時間継続してヒト癌壊死因子m
RN Aの産生を:fgJQさせる。このとき蛋白合
成阻害剤(例えばシクロへキシミド)を加えることによ
り、ヒト癌壊死因子mRNAを蓄積させることができる
。なお前培養は省略してもよい。エンドトキシンの添加
量は、一般に約0.1〜1000μg11(最終濃度、
以下同じ)、好ましくは約1〜100μg/lである。 この際、ホルボール−12−ミリステート−13−アセ
テート、ホルボール−12,13−ジデカノエート、ホ
ルボール−12,13−ジベンゾエートのようなホルボ
ールエステル類を約■〜2000 ng/mNU加して
もよい。蛋白合成阻害剤の添加量は、化合物の種類等に
より異なるが、例えばシクロヘキシミドの場合、0.1
〜50μg/ifである。培地としては、高1等動物細
胞の培養に適した各種合成培地が用いられ、例えばRP
MI−IEi40.イーグルのM E M培地、ダルベ
ツコ変法によるMEM培地(以上の培地の組成について
は、例えば宗村庚修編「細胞培養マニュアル」、講談社
、 1982年に記載されている)が挙げられる。培地
には、全培養液量の約1〜20%の動物血清(例えば牛
胎児血清、子牛血清)を加えておくのが好ましい。培養
終了後、細胞より常法、例えばChirgwinらの方
法[[1,iochemistry、18+5294(
+979>]により全RNAを抽出し、次いでこれを常
法に従ってオリゴ(dT)セルロース又はポリ(U)セ
ファロース(ファルマシア社)などを用いる後管カラム
クロマトグラフィーに付すか又はバッチ法によりpol
y(八)mRNA画分を分離する。このpoly(^)
mRNA画分を酸性尿素アガロースゲル電気泳動又はシ
yM密度勾配遠心分F11に付すことにより、ヒト癌壊
死因子mRNA ’k K5 m精製することができる
。 ここに得られたmRNA画分が目的とするヒト癌壊死因
子をコードするmRNAを合作していることを確認する
ためには、mRNAを蛋白質に翻訳させてその生物活性
を調べればよい。例えばアフリカ7メガエル(Xeno
pus 1aevis)の卵母細胞、網状赤血球ライセ
ード、小麦胚芽のような連判な蛋白合成系にmRNAを
注入又は添加して蛋白質に翻訳させ、その蛋白質がマウ
スL−929細胞に対して細胞傷害活性を示すことを確
認することにより行われる。なお、アフリカッメガエル
の卵母細胞を用いる方法は、例えば次のようにして行わ
れる。卵母細胞1個当たり約50ngのmRNAをマイ
クロインジェクンヨン法で注入し、その10個を100
μlのパース培養液[Gurdon、J、B、、J、E
mbryol、Exp、Morphol 、。 20.401(19138>]中、22℃で24〜72
時間培養し、ホモジナイズした後、その遠心上清液(1
0,OOOrpm、 10分間)を検体として、L−9
29細胞傷害活性を指標として壊死死囚子活性を測定す
る[ L−029細胞傷害活性の測定法はRuffJ、
R,、et al、、J、1mmuno1.。 125、1671(1980)に記載されている]。 (3)ヒト癌壊死因子c DNAのクローニング(2)
の工程で得られたmRNAを鋳型とし、Gublerら
の方法[Gene、25.2G3(1983>1に従っ
てオリゴ(dT)をプライマーとして、dATI’、
dGTI’、 dcTr’。 dTTI’の存在下で逆転写酵素(例えばトリ骨髄性白
血病ウィルス由来逆転写酵素)によりmRNAと相補的
な単鎖c DNAを合成し、次いで大腸菌リボヌクレア
ーゼII’と大腸菌DNAポリメラーゼ■を用いて二重
鎖c DNAを合成する。ここに得られたDNAを、ポ
リ(dG)−ポリ(dC)又はポリ(dA)−ポリ(d
r>ホモポリマー伸長法(Noda、M、、et at
、。 Nature、295,202(1982); Ne1
son、T、S、、 ”Methods inEnzy
mology、” 08,41(1979)、Aca
demic Press Inc、。 Ncw York]のような常法に従って、例えばプラ
スミドpl[322の制限酵素Pst I切断部位に組
込ませる。得られた組換えプラスミドを、例えばCoh
enらの方法[I’roc、Nat、^cad、sci
、UsA、09,2110(1972)コに準じて、例
えばE、coliχ1776株のような宿主に導入して
形質転換させ、テトラサイクリン耐性株を選択してc
DNAライブラリーを作製する。 このc DNAライブラリーについて、(1)の工程で
得たウサギ癌壊死因子をコードするDNAの断片を12
1)で標識したものをプローブとして、コロニー・ハイ
ブリダイゼーンヨン試験[11anahan、D、、a
t al、。 Gana 、 10 、03(1980) ]を行い、
ウサギ壊死死囚子cDNA断片とハイブリダイズするク
ローンをスクリーニングする。 このようにして111られた多くのクロー7化DNAに
ついて、例えばMaxam−Gilbcrt法[r’r
oc、Nat、^cad 。 Sci、1ISA、74,500(1977)]に従っ
て塩バ配列を解析し、既に明らかになっているウサギ癌
壊死因子の塩基配列と相同性のある塩基配列を探し、最
終的にヒト癌壊死因子の全翻訳領域に対応する塩基配列
を含むcDNAを選び出すことにより、ヒト壊死死囚子
ポリペプチドをコードする塩基配列をイfするクローン
化DNAを得ることができる。 ことに得られたクローン化DNAの組込まれた組換えプ
ラスミドを、例えばE、co目11旧01株のような宿
主に導入して形質転換体を得た後、これを培養し、L−
9213細胞傷害活性を指標にして蛋白質を分離、精製
することにより、ヒト壊死死囚子ポリペプチドを得るこ
とができる。 更に形質発現効率を上げるためには、本発明のクローン
化DNAのヒト癌壊死因子をコードする領域を適当な制
限酵素で切り出した後、適当なプロモーターを有する形
質発現ベクターに組込んでヒト壊死死囚子ポリペプチド
生産用ベクターを作製すればよい、プロモーターとして
は、例えばlacプロモーター、 trpプロモーター
、 tacプロモーター。 PLプロモーター、 SV40初期プロモーターなど
が挙げられる。ベクターとしては、形質転換させる宿主
中で増殖するものはすべて用いることができる。例えば
プラスミド(pBR322,I)DR5/10など)、
ファージ(ラムダファージ誘導体など)。 ウィルス(SV40など)が挙げられる。これらは単独
で、又はそれらの組合わせ、例えばf) 13 R32
2−SV40ハイブリッドプラスミドなどの形で用いて
もよい。 ここに得られたクローン化DNAを組込んだベクターを
常法により適当な宿主に作用させて形質転換させること
により形質発現宿主が得られる。形質転換に用いられる
宿主としては、例えば大腸口。 枯草菌、酵母などの微生物、COS■onkey細胞な
どの動物培養細胞及び植物培養細胞が挙げられる。 本発明のヒト癌壊死因子は、ウサギ癌壊死因子と極めて
相同性の高いアミノ酸配列を育しており、DNA塩基配
列においても高い相同性が認められる。 第2表にヒト癌壊死因子及びウサギ癌壊死因子の前駆体
のアミノ酸配列の相同性を示し、第3表にヒト癌壊死因
子及びウサギ癌壊死因子の前駆体をコードするDNAの
塩基配列の相同性を示す、特願昭58−228790号
(特開昭60−120990号)で説明しているように
、ウサギ癌壊死因子は尿素非存在下では会合体の形で存
在し、第2表に示した第82番目のSetに始まり、第
236番目のLeuに終わる154個のアミノ酸から成
るポリペプチドがその基本構成単位であると考えられて
いる。即ち、前駆体ポリペプチドのN末端部分が生体内
で適当な酵素により切断され、活性化されるものと考え
られる。ヒト癌壊死因子の場合も、m 82番目のSe
tに始まり、第236番目のLeuで終わる155個の
アミノ酸から成るポリペプチドがヒト癌壊死因子の基本
構成単位であると考えられる。第2及びfi3表から明
らかなように、ヒト及びウサギ灯壊死因子のポリペプチ
ドのアミノ酸配列の相同性は81%であり、それぞれを
コードするDNA塩基配列の相同性は85%である。ま
た、ヒト壊死死囚子前駆体とウサギ灯壊死囚子前駆体と
の間にも高い相同性が認められ、ポリペプチドのアミノ
酸配列の相同性は78%であり、塩基配列の相同性は8
4%である。 ヒト及びウサギ癌壊死因子間のこのように高い相同性は
、両回子が系統発生学的には共通の分子から派生してい
ることを推測させるとともに、相同性の極めて高い領域
に壊死死因子の生物活性発現のために必須の領域があり
、壊死死因子の活性中心部分であることを示唆している
。 AGA TCA GCT TCT CGGAC
CCCG AGT GACAAGGCCCTG
AGT GACAAGGGCGTCTTCCAG
TTG °480 GAG AAG GGT GACCGG(***
)は終止コドンを示′ ネ** す。 ヒト癌壊死因子は、後記試験例で示すように、ウサギ癌
壊死因子とは免疫学的に全(交差せず、ウサギ癌壊死因
子とは免疫学的に区別し得るポリペプチドである。この
ように、ヒト及びウサギ癌壊死因子は全体としては高い
相同性を示すにもかかわらず、そのポリペプチドの性質
には明らかな相違がある。 このことは、壊死死因子の全アミノ酸配列がその生物活
性に必須ではな(、活性中心を構成する部分のアミノ酸
配列が同一であればその他の部分のアミノ酸配列が多少
変化し、それに伴ってポリペプチドの性質が変化しても
、壊死死因子の活性は保持されることを示している。 本発明により明らかにされたヒト癌壊死因子ポリペプチ
ドのアミノ酸配列やDNA塩基配列に関する知見に基づ
いて、逍伝子組換え技術の常法に従い、ヒト癌壊死因子
のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はヒト癌壊死因子
の活性中心部分を含むポリペプチドをコードするDNA
あるいは一部修飾されたヒト癌壊死因子DNAの変異体
を得ることができるし、それらを用いてヒト癌壊死因子
活性を仔するポリペプチドを容易に生産することができ
る。また、本発明で明らかにされたDNA塩基配列の一
部を化学合成し、これをプローブとして用いることによ
り、対立逍伝子変異や逍伝子コードの縮重のあるヒト癌
壊死因子DNAも容易に入手でき、それらを用いてヒト
癌壊死因子活性を有するポリペプチドを生産することが
できる。更に、ヒト癌壊死因子ポリペプチドのアミノ酸
配列に基づいて、それをコードする塩基配列のDNAを
全合成することも可能である。これらはすべて本発明の
範囲内に含まれる。 本発明のヒト癌壊死因子ポリペプチドは、優れた抗肚瘍
作用を有するので、抗腫瘍剤として悪性HIDの治療に
用いることができる。 以下に実施例及び参考例を挙げて本発明を更に具体的に
説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものでは
ない。 実施例 (蔦)ヒト癌壊死因子をコードするクローン化DNAを
検出するだめのプローブの:J4製 特願昭58−228790号(特開昭Go−12099
0号)に開示されている方法(例えば参考例2の方法)
に従って、第1表(既出)に示すウサギ癌壊死因子をコ
ードするクローン化DNAを得た。このDNAを制限酵
素11aarl及び^vaIを用いて切り出し、それぞ
れ第33〜120番の88 bpから成るDNA断片と
第285〜583番の299 bpから成るDNA断片
を得た。制限酵索へva Iで切り出した299bpの
DNA断片はウサギ癌壊死因子をコードする領域であり
、1laellで切り出した88 bpのDNA断片は
ウサギ壊死死囚子前駆体をコードする領域に相当する部
分である。 この2種のDNA断片を32pで標識して、ヒト癌壊死
因子c DNAのクローニングのためのプローブとし、
(8)項で使用した。 (2)ヒト肺胞マクロファージからのmRNA画分の車
間 ヒト肺からリン酸緩衝化生理食塩液を用いて肺胞マクロ
ファージを6.3〉・107個採取した。この肺胞マク
ロファージをIθ%牛脂児血1i17含存のRPMI−
If)40培地に懸濁させてベトリデイツシュ(直径8
=s )に1枚当たり9 X 106個となるように
播き、37°Cで5%炭酸ガス含合作気中、湿度90〜
100%で前培養した。1時間の前培養の後、工/トド
キシ/(大腸菌由来のりボボリサブカライド)。 TI’A (ホルボール−12−ミリステート−13−
アセテート)及びシクロヘキシミドをそれぞれ最終濃度
が1oμglll、 IOng/it及び1μg11と
なるように添加混和し、更に培養を継続した。4〜4.
5時間後(通算5〜5.5時間)に培養液を吸引除去し
、デイツシュ上に残ったマクロファージを0.6%ラウ
ロイルサルコシ/酸ナトリウムと6mMクエン酸ナトリ
ウムを含む5Mグアニジルチオシアネート液で溶解し、
ホモジナイズした。このホモジネートを0.1MEDT
A含fr5.1M塩化セシウム水溶液上に重居し、超遠
心分+m機(RPS27−20一クー1日立製作所)を
用い20,500 rpmで20時間遠心し、全RNA
画分をペレツトとして得た。これを0.35M NaC
1゜20mM T r i s及び20mM EDTA
を含む7M尿素液の少量に溶解し、エタノール沈殿とし
て回収した。 全RNAとして159μzh<得られた。 この全RNA画分を1 mM EDTAを含むIOmM
Tr i s −HCNU街液(pH7,4>(以下T
E液という)1肩1に溶解し、65℃で5分間加熱した
。これにNaC1溶液を0.5Mとなるように加えた後
、あらかじめ0.5MNaC1を含むTE液で平衡化し
たオリゴ(dT)セルロースカラムに付し、吸着したp
oly(A)mRNAをTE液で溶出することにより、
9 ugf) poly(A)mRNAを得た。 この
poly(A)mRNAを1.9 ng/nlの0度で
蒸留水に溶解し、これをアフリカッメガエルの卵母細胞
1個当たり50n lずつ注入し、前述の方法に従って
、卵母細胞中で翻訳された蛋白質のL−929細胞傷害
活性を測定した。その結果、10個の卵母細胞のホモシ
ネ−)0.1ml中に6.6単位/mlの活性を認め、
このPoly(A)mRNA調製品中にヒト癌+s死因
子のmRNAが含まれていることを確認した。 (3)cDNAの合成 ■項で得られたpoly(^)mRNAを鋳型としてG
ublerらの方法[Gene、25,283(198
3)]に従ってc DN、Aを合成した。 反応液量;40μ! 50mM Tris−HCI緩衝液(pH8,3) ;
10mM MgC12;10mMジチオスレイトール
; 4 mMピロホスフェート す ト リ ウ ム
; 1.25mM dGTP、 dATP、
dTTP;0.5mM dCTP:0.107μ
M a−”P−dCTP(比活性3000C+/mmo
le) ; 4μgオリゴ(dT) 12−Ill ;
6μg poly(^)mRNA ; 120単位ト
リ骨償性白血病ウィルス由来逆転写酵素。 43℃で30分間反応させた後、EDTAを加えて反応
を停止させ、フェノール−クロロホルム混液(1: 1
)で抽出し、その水層に酢酸アンモニウムを最終濃度2
.5Mになるように加え、エタノールにより反応生成物
(単鎖cDNA −RNA複合体)を沈殿させた。この
単鎖cDNA−RNA複合体を下記組成の反応緩衝液1
00μlに溶解した。 反応緩衝液組成: 20mM T r i s −HC1mm液液pH7,
5) ; 5 mM MgC12;10mM (N)1
4) 2sOa ; l00mM KC1; 0.15
mMβ−==+チンアミド アデニ/ ジヌクレオチド
;50ng/■1ウシ血清アルプミ/;40nM dG
TP、 dATP、 dTTP。 dCTP; 0.9単位大腸閏リボヌクレアーゼI−1
; 23単位大腸閑DNAポリメラーゼl0 12℃で60分間、続いて22℃でGO分間反応させた
後、EDTAを加えて反応を停止させ、上記と同様にフ
ェノール−クロロホルム混液で抽出し、エタノールによ
り沈殿させて二重鎖c DNAを得た。 (4)オリゴ(dC)テール付加c DNAの調製(3
)項で得られた二重鎖c DNAに次の組成の反応緩衝
液100μlを加え、37℃で30分間反応させ、二重
鎖cDNAにオリゴ(dC)テールを付加させた。 反応緩衝液; 2 mM COCl2.0.2mMジチオスレイトール
、0.1mM a−”I’−dcTI’(比活性3 C
i/mmole)及び10!11.位ターミナルデオキ
7ヌクレオチジルトランスフェラーゼを含有する100
mMカコジル酸ナトリウム(pH7,2)。 反応はEDTA水溶液を添加して停止させ、フ。 ノール−クロロホルム混液で抽出し、オリゴ(dC)テ
ール付加c DNAをエタノールにより沈殿させ回収し
た。これをl0mM Tris−11CH8f)液液(
pl+7.4>。 1 mM EDTA及び100mM NaC1を含む水
溶液に11当たり2μgのオリゴ(dC)テール付加c
DNAを含むように溶解した。 ■オリゴ(dG)テール付加プラスミドpIIR322
DNAの調製 20mM Tris−HCI)1衝液(pH7,4)
、 l0mM MgC12゜50mM (NHa) 2
304及び1■1当たり0.1.のウシ血1nアルフミ
/を含む水溶液100μj!にpHR322を108g
溶解し、制限酵素Pst Iエンドヌクレアーゼ15単
位を加え、37℃で1時間反応させた。反応終了後、反
応液を7エノールークロロホルム混液で抽出し、水層か
らエタノール沈殿によってDNAを回収した。得られた
DNAを前述のオリゴ(dC)テール付加に用いた水溶
液(但し”P−dCTPの代わりに’I(−dGTr’
を含む)200μ!に溶解し、ターミナルデオキシヌク
レオデジルトランスフェラーゼ80単位を用いて37℃
で20分間反応させ、約10〜15個のdG残基を取り
込ませた。反応液をフェノール−クロロホルム混液で抽
出し、水層からエタノール沈殿によってオリゴ(dC)
テール付加プラスミドpnR322 DNAを回収した
。これをオリゴ(dC)テール付加c DNAの場合と
同様の緩衝液に111当たり20μgのオリゴ(dC)
テール付加プラスミド1R3221)N Aを含むよう
に溶解した。 (6)組換え体プラスミドの作製 (4)項で得られたオリゴ(dC)テール付加cDNA
溶a120μpを、5)項で得られたオリゴ(dC)テ
ール付加flR322DNA 1B 液+20μff、
!−’KA 合L、65℃で5分間、57°Cで120
分間インキュベートしてアニーリングを行い、組換え体
プラスミド溶液を調製した。 (力形質転換体の選択 (6)項で得られた組換え体プラスミド溶液を用い、E
、coliχ1776株を形質転換させた。即ち、E、
coliχ1776株(八TCCNo、 31244)
を、ジアミノピメリン酸100μg11及びヂミジ/4
0μg1m+を補ったL−プロス201中、37℃で吸
光度(00On園)が0.5となるまで培養し、菌体を
4℃で遠心して集め、50mMCaC+2含fT l0
mM Tr i s −11CI緩衝液(pH7,3)
l0w1に分散し、4℃で再度遠心して沈殿させた。 集めた菌体を同じ緩衝液21に分散し、0℃で5分間静
置した。この分散液0.2 mlに(6)項で得られた
組換え体プラスミド溶液0.1■1を添加混合し、0℃
で15分間静置し、更に42℃で2分間保持した後、前
の培養で用いたのと同一組成のし一ブロス0.51を加
えて1時間振公培養を行った。この培養液の一部を皐り
、前述の成分の他にテトラサイタリン15μg/mlを
含むL−ブロス寒天平板に広げ、37℃で約12時間培
養し、テトラサイクリン耐性菌を選択してc DNAラ
イブラリーを作製した。 (8)クロm;7グ (7項で得られたc DNAライブラリーについて、ヒ
ト癌壊死因子をコードするc DNAを含むプラスミド
を持つ形質転換体をスクリーニングするため、(1)項
で得られたウサギ癌壊死因子をコードするDNAの制限
酵素^vaIで切り出した断片(299bp)の32p
標識物をプローブとし、コロニー・ハイブリダイゼータ
3ン試験をl1anahanらの方法[Gene、 I
on03(1980>]に従って行った。約2万個のコ
ロニーから、この標識プローブと強く結合する塩基配列
を含む組換え体プラスミドを持つ形質転換体43個を選
び出した。 更に、この43個のコロニーについて、制限酵素11a
cllで切り出したウサギ壊死死囚子コード領域の」二
流に相当するDNA断片(88bp)のff2p標識物
をプローブとし、二次スクリーニングを行い、このプロ
ーブと強くハイブリダイズする6個のコロニーを選び出
した。この2回のスクリーニングにより、ウサギ癌壊死
因子をコードするDNA塩基配列及びその上流部分と相
同性の高い塩基配列を含むDNAを得た。 (9)形質発現 (8)項で選ばれた6個のクローン(プラスミド番号1
)TITNF−1,−4,−5,−13,−22,−2
6)から、それぞれの組換え体プラスミドを取り出し、
E、col+1111101株(ATCCNo、 33
094)を宿主として形質転換体を得た。それぞれの形
質転換体について、Nagataらの方法[Natur
e、284.310(1980)]に準じて501培養
を行った。培地にはLnプロスを用いた。吸光度(Go
on曹)が約0.8になるまで培養し、約3〜5×10
1θ個の菌体を集めた。0.1%リゾチームを含む50
mM Tr i s −TICI緩衝液(pl+8.0
>と30mM NaC1より成る溶液の1■Iに菌体を
懸濁させ、氷水中で30分間静置した後、凍結融解を6
回繰返して菌体を破壊し、遠心分離して菌体抽出液を得
た。それぞれの形質転換体から得られた抽出液について
、L−929細胞傷害活性を測定した結果、プラスミド
pl−ITNF −13による形質転換体の抽出液に1
80.1単位11の活性を認めた。 (II)クロー7化DNAの塩基配列の決定(9)項で
選択された組換え体プラスミドPIITNF−13によ
る形質転換体をLI3グロスで培養して菌体を得た。こ
の菌体をWNkieらの方法[Nucleic^c+d
s Ras、、7,859(1979)]に従って処理
し、プラスミドDNAを得た。このプラスミドDNAを
制限酵素Pst Iで分解し、分離精製してクローン化
DNAを得た。このクローン化DNA断片を種々の制限
酵素で分解し、10種の制限酵素断片について、それぞ
れの塩基配列をMaxam−Gilbert法により脱
リン酸化、Pによる末端標識、塩基特異的化学分解反応
、ゲル電気泳動及びオートラジオグラフィーを行い決定
した。 図面に塩基配列決定に用いた制限酵素の切断部位と塩基
配列を決定した方向及び範囲(矢印で表示)を示す。ロ
ゴ3部分はヒト癌壊死因子前駆体ポリペプチドをコード
する領域を示す。 その塩基配列及びこの塩基配列から翻訳されたアミノ酸
配列は第4表の通りである。ヒト癌壊死因子のポリペプ
チドをコードする領域は、第1表に示したウサギ癌壊死
因子をコードする塩基配列との相同性に基づいて推定し
た。即ち、ヒト壊死死囚子ポリペプチドは、第4表の第
235〜237番のTCAのコドン(Setに対応)か
ら始まり、第697〜699番のCTG (Leuに対
応)で終わり、155残基のアミノ酸から成っている。 C末端のロイン/のコドンに続いてTGAの終止コドン
がある。塩基配列第1〜234番はヒト癌壊死因子の前
駆体をコードするために必要な配列と考えられる。 第4表 CTCCACCCTCTCTC GACCCACGG −10−I CCCTGGAAAGGACACC TCTCGAACCCCGA( Se rArgThrPros( 1′ 〕 1す01− CATGTTGTAGCAAAC Hi 5ValValA1 aAsn (”’:T(”:CTCACCCACACCCCTCA
AGCTGAGGGG ProGl nA1 aGl uGl yAACCGC
CGGGCCAAT AsnArgArgAl aAsn GGCGTGGAGCTGAGA Gl yValGl uLeuArg GTGCCATCAGAGGGC Val ProSe rGl uGl yATCAGC
CGCATCGCC LeuLeuThrHi 5Thr I I eSe rArgI l eAla’GACC
GACTCAGCGCT AspArgLeuSerA1 a GAGATCAATCGGCI GluI 1eAsnArgP GCCGAGTCTGGGC AlaGluSerGlyG ATTGCCCTGTGAG( I l eAI aLeu*零* CTTCCCAAACGCC’ (***)は終止コドンp。 CCGACTATCTCGACTTT roAspTyrLeuAspPh、eCAGGACG
AACATCCAAC rCCCCTGC 訃示す。 (以下余白) 参考例1 抗つサギ厚壊死囚子抗体の作製 特願昭58−228790号(特開昭00−12099
0号)に開示されている方法(例えば参考例3の方法)
に従って得た、精製ウサギ壊死死囚子1.9X 105
単位を含むfg液を等量のフロイントの完全アジュバン
トで乳濁化し、それをモルモットの背部皮下数カ所に注
射した。その後、■、3及び6週後に同様の方法で免疫
した。更に8迎後に、同J+tの精製ウサギ癌壊死因子
を水酸化アルミニウムゲルとともに腹腔内に注射した。 最初の免疫から9週後に心臓より全採血し、遠心分離に
より血清を分Miすることによって抗つサギ壊死死囚子
抗体を含む抗血1’i7を得た。 この抗血t?7を、正常ウサギ血清成分をカップリング
させたセファ0−ス411(ファルマシア社)カラムに
3回繰返して通過させることによりウサギの血1??成
分に対する抗体を完全に除去し、ウサギ癌壊死因子に対
する特異抗体のみを含む精製抗血lnを得た。この抗血
清は、免疫電気泳動法及びゲル内二重拡散法により精製
ウサギ癌壊死因子との間にのみ単一の沈降線を形成した
。この精製抗血清を約oo 、 ooo倍希釈したもの
は、ウサギ癌壊死因子のL−029細胞傷害活性500
単位を50%中和する能力をイrする。 参考例2 (1)ウサギ肺胞マクロファージからのmRNA分画の
単離精製 ウサギ(体重的2.5kg)にプロピオニバクテリウム
アクネ7、 (Propion+bacteriuw
acnes)死菌体を1羽当り100■の投与量で静
脈内に注入し、80後に屠殺した。直ちに開胸気管切開
し、気管内に挿入したチューブを介してリン酸暖衝化生
理食塩液を用い肺洗浄を繰返し、肺胞マクロファージを
採取した。12羽のウサギより約3 X 10’個の肺
胞マクロワ1−ジが得られた。この肺胞マクロファージ
を10%牛脂児血清含有のR1”Ml−1640培地に
懸濁させてベトリディッシュ(直径8 cs )に1枚
当り2 X 107個となるように播き、37℃で5%
炭酸ガス含有空気中、湿度90〜100%で前培養した
。1時間の前培養の後、エンドトキシン(大腸菌由来の
りボボリサッカライド)。 TI’A(ホルボール−12−ミリステート−13−ア
セテート)及びンクロへキシミドをそれぞれ最h% C
度が10 tt g/ * I 、 IOng/ w
I及びlμg/mlとなるように添加混和し、更に培養
を継続した。4〜4.5時間後(通算5〜5.5時間)
に培養液を吸引除去し、デイツシュ上に残ったマクロタ
1−ジを0.0%ラウロイルサルコシン酸ナトリウムと
6mMクエン酸ナトリウムを含有する5Mグアニジルグ
ーオシアネート液で溶解しホモジナイズした。このホモ
ジネートを0.IM EDTA含有5.7M塩化セシウ
ム水溶液上にr3.層し、超遠心分離機(RI) S
27−2日−ター1日立製作所)を用い20 、500
rp−で20時間遠心し全RNA画分をベレットとして
得た。これを0.35M NaCI、 20mM T
r i s及び20mM EDTAを含む7M尿素液の
少−1に溶解し、エタノール沈殿として回収した。12
羽のウサギより全RNAとして5.2Mgが得られた。 この全RNA画分を1 mM EDTAを含む10mM
Tris−11cIIW街液(all 7.4) (
以下TE液という)2−1に溶解し、65℃で5分間加
熱した。これにNaC1溶液を0.5Mとなるように加
えた後、あらかじめ0.5M NaC1を含むTE液で
平衡化したオリゴ(dT)セルロースカラムに付し、吸
着したpoly(^)mRNAをTE液で溶出すること
により、31Augのpoly(^)mRNAを得た。 ここで得たpoly(^)mRNAの200μgをアガ
ロースゲル電気泳動(ゲル濃度1%、8M尿素存在下、
pH4)に付し、その分子サイズに従って7つの画分に
分け、ゲルを融解(70°C110分間)させた後、水
飽和フェノールによる抽出とクロロホルムによる抽出の
のち、エタノールにより沈殿させて各両分よりpoly
(^)mRNAを回収した。各画分のpoly(^)m
RNAについてアフリカッメガエルの卵母細胞を用いる
方法でウサギ癌壊死因子mRNA flを測定し、分子
サイズとして1.6〜2.7kbに相当する両分にウサ
ギ癌壊死因子mRNAを高濃度に回収した。この精製p
oly(^)mRNAの比活性は約1 、230単位/
pg RNAであり、未精製poly(^)mRNA
UR製品の比活性約320単位/μg RNAに比べ
て約4倍にIO縮された。 ここで得られた精!i!!poly(^)mRNAを以
下の実験に用いた。 し1cDNAの合成 f+’i製poly(八)mRNA 4 ttHを用い
以下に示す条件でc DNAを合成した。 反応液量;100μ! 50mM T r i s −Ilc IG衝液液 p
H8,3) ; IOmMMHCI 2ニア0mM K
CI : 1 mMジチオスレイトール;0.5mM
dTTP、dCTP、dATr’、、dGT、r’(但
しdCTPは32■)で標識、比活性4.4X 10’
cps/ nmole) : 3μgオリゴ(dT)
12〜+g、 80単位トリ骨償性白血病ウィルス由
来逆転写酵素。 43°Cで80分間反応させた後、 EDTA水溶液で
反応を停止させた。フェノール−クロロボルム混m(1
:1)によりcDNA−mRNA複合体を抽出し、エタ
ノールにより沈殿させ回収した。更に、アルカリ加温処
理することによりmRNAを分解除去した後、合成され
た単鎖CDNAをエタノールにより沈殿させ回収した。 この単鎖c DNAの沈殿を下記組成の反応緩衝液40
μlに溶解した。 反応緩衝液; 0.5mM dATr’、 dTTI’、 dGT1’
、 dCTP; 5 mMMgCI2 ; 70mM
KCI ; 1.5mMβ−メルカプトエタノール;8
単位大腸菌DNAポリメラーゼI(ラージフラグメント
)を含有する0、1Mヘペス(ll0PQs) 緩衝G
(pHO,9)。 15℃で20時間反応させ二重鎖c DNAを合成した
。反応液にドデシル硫酸ナトリウム水溶液を加えて反応
を停止させ、二重鎖c DNAをフェノール−クロロホ
ルム混液で抽出し、エタノールにより沈殿させ回収した
。 得られた二重鎖c DNAの沈殿を、50mM酢酸ナト
リ ウ ム (PI−14,5)、 1 mM
ZnSO4,200mM NaC+。 0.5%グリセロール及びS1ヌクレアーゼ0.5単位
を含有する水溶液100μ!に溶解し、37℃で20分
間反応させてヘアピン構造を開裂させた。反応はEDT
A水溶液を添加して停止させ、フェノール−クロロホル
ム混液で抽出し、更にエーテルで再抽出した後、エタノ
ールにより沈殿させc DNAを回収した。 (3)オリゴ(dC)テール付加c DNAの調製上記
により得られた二重鎖c DNAに次の組成の反応緩衝
液100μ!を加え37℃で20分間反応させ、二重鎖
cDNAにオリゴ(dC)テールを付加させた。 反応緩衝液; 1 mM COCl2.0.1mMジチオスレイトール
。 0.2uyポリ(^)、 O,ImM ’II −dc
Tr’(比活性5400cp*#+■of)及び10!
l’、位ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフ
ェラーゼを含イrする130mMカコジル酸ナトリウム
−30mM Tr i s −11CI 緩衝液(pI
IO,8)。 反応はEDTA水溶液を添加して停止させ、フェノール
−クロロホルム混液で抽出し、更にエーテルで再抽出し
た後、オリゴ(dC)テール付加c DNAをエタノー
ルにより沈殿させ回収した。 これをl0mM Tr is −HC1緩衝液(PH7
,4>、 1 mMEDTA及びl00mM NaC1
を含む水溶液に1■1当り0.2μgのオリゴ(dC)
テール付加c DNAを含むように溶解した。 (4)オリゴ(da)テール付加プラスミドpI3R3
22DNAの調製 20mM T r i s −HC1mm液液 plI
7.4) 、 10mMMgC12,50mM (Nl
(4) 2304及び1ml当り0.1■のウシ血清ア
ルプミ/を含む水溶液100μlにpnR322を10
az溶解し、制限酵素1’5t(z7ドヌクレアーゼ1
5単位を加え、37℃で1時間反応させた。反応終了後
、反応液をフェノール抽出し、水射からエタノール沈殿
によってDNAを回収した。得られたDNAを前述のオ
リゴ(dC)テール付加に用いた水溶液(但し’14−
dcTI’の代りに’H−dGTPを含む)200μ
!に溶解し、ターミナルデオキシヌクレオチラルトラン
スフェラーゼ80単位を用いて37°Cで20分間反応
させ、約10〜15個のdG残基を取り込ませた。反応
液を水飽和フェノール−クロロホルム混液で抽出し、水
層からエタノール沈殿によってオリゴ(dC)テール付
加プラスミドpBR322DNAを回収した。これをオ
リゴ(dC)テール付加cDNAの場合と同様の緩衝液
に1璽1当り2μgのオリゴ(dC)テール付加プラス
ミド1R322DNAを含むように溶解した。 6)組み換え体プラスミドの作製 オリゴ(dC)テール付加c DNA溶液50μlをオ
リゴ(dc)テール付加p11 R322DNA溶液5
0μlと混合し、65°Cで10分間、57℃で120
分間、45℃で60分間、35°Cで60分間及び室昌
で60分間インキュベートしてアニーリングを行い、組
み換え体プラスミド溶液を調製した。 (6)形質転換体の選択 上記で得られた組み換え体プラスミド溶液を用い、E、
coliχl776株を形質転換させた。即ち、E、c
oliχ1776株を、ジアミノピメリン酸+00uH
/−1及びチミジン40μg/■1を補ったL−ブrJ
ス201中、37℃で吸光度(Coons>が0.5と
なるまで培養し、菌体を冷却器付遠心分子tt機で集め
、50mMcac12含イr 10mM Tris−1
1CI tilt衝液(液液7.3)IOmlに分散し
、0°Cで再度遠心して沈殿させた。集めた菌体を同じ
緩衝液21に分散し、0℃で5分間静置した。この分散
液0.2 mlに上記組み換え体プラスミド溶液0.1
1を添加混合し、0℃で15分間り置し、更に42℃で
2分間保持した後、前の培養で用いたのと同一組成のL
−ブロス0.5■1を加えて1時間振盪培養を行った。 この培養液の一部を取り、前述の成分の他にテトラサイ
クリン15μg/−1を含むし一ブロス寒天平板に広げ
37℃で約12時間培養し、テトラサイクリン耐性閏を
選択してc DNAライブラリーを作製した。 ■ハイプリダイイー2g/試験 前記のc DNAライブラリーについて、ウサギ癌壊死
因子をコードするcDNAを含むプラスミドを持つ形質
転換体をスクリーニングするため22 p標識cDNA
プローブを用い゛るコロニー・ハイブリダイゼーシコン
試験をハナハ7 (l1anahan)らの方法[Ge
ne、10.03(1980)]に従って行った。 32P M’3 識cDNAプローブは、誘導プラス及
ヒマイナス肺胞マクロファージより上記(1)項の方法
で得たmRNAを鋳型として、(2)項の方法で合成し
た。但し、” P −dCTPは高放射能比活性のもの
を用い、高濃度に標識した。この試験によりd JfJ
プラスのプ「1−ブと強く結合し、誘導マイナスのプロ
ーブとはハイブリダイズしない塩基配列を含む組み換え
体プラスミドを仔する形質転換体を選別した。約2万個
のコロニーから50個ノコロニーが選び出された。 次いで、これらの選択された菌株についてハイブリダイ
ゼーンヨン・トランスレーション試験を“モレキュラー
りローニンーグ” (Maniatis。 T、、et al、、(cd)“Mo1ecular
Cloning” 、329(1982)+Co1d
Spring 1larbor Lab、、)に記載の
方法に従って行った。それぞれの形質転換体よりプラス
ミドDNA ヲfill 出し、ニトロセルロースフィ
ルター上に加熱変性させたのち固定し、これに上記(1
)項で得たウサギ壊死死囚子mRNAを含むpoly(
^)mRNA画分を加え、50°Cで180分間反応さ
せ、/1イブリダイゼーショ/を行った。結合したmR
NAを溶出回収した後アフリカッメガエルの卵母細胞に
注入し、回収されたmRNAがウサギ壊死死囚子mRN
Aであるか否かを検定した。この試験により、上記で選
択された20個の形質転換体よりウサギ壊死死囚子mR
NAと強くハイブリダイズするcDNAを含むプラスミ
ドを持つ菌株3個を見いだした。そのうち最も長いcD
NA (約750bp)ライr t Zプラスミドより
、制限酵町de I 1? DNA断片を切り出し、二
次スクリーニング用のプローブとした。このDNA断片
を32 pで標識し、上記(6)項で得たc DNAラ
イブラリーについて再度コロニー・ハイブリダイゼーシ
qノ試験を行い、標識プローブと強く結合するc DN
Aを含むプラスミドを持つ形質転換体を選んだ。c D
NAライブラリーの約6万個のコロニーのうち98個が
陽性コロニーであった。これらからc DNAを制限酵
素Pst Iで切り出し、そのサイズをポリアクリルア
ミドゲル電気泳動で調べ、1kbp以上のサイズを「す
る17個のクロー/を選び出した。これらのうち最も大
きなc DNAを含む形質転換体(菌体番号:RTNF
802 、クローン化DNA番号: f)RTNF80
2)について、クローン化DNAを’F−ntし、後述
の方法で塩基配列を決定した。 (8)り
【J−7化1)N Aの塩基配列の決定(9項
で選択された菌株(RTNP802)をジアミ7ピメリ
ン酸及びヂミジ/を添加したし一ブロスで培養して菌体
を得た。この菌体をウィルキー(Wilkia)らの方
法[Nucle+c Ac1ds Ras、、7 、8
59(+979>1に従って処理し、プラスミドDNA
を得た。このプラスミドDNAを制限酵素Pst Iで
分解し、精製分離してクロー/化DNAを得た。このク
ローン化DNA断片を種々の制限酵素で分解し、適当な
制限酵素断片についてそれぞれの塩Jλ配列をマキサム
−ギルバー) (Maに&■−Gilbert)法によ
り脱リン酸化、Pによる末端標識、塩基特異的化学分解
反応、ゲル電気泳動及びオートラジオグラフィーから決
定した。 その塩1人品列は第1表の通りである。 参考例3 ウサギ癌壊死因子のQj離精製 ウサギ(体重2.5〜3.0kg)にプロピオニバクテ
リウム アクネス(Propionibactertu
m acnes)死菌体50■gを耳静脈より注射した
。8日後にエンドトキシン(大腸菌由来のりボボリサフ
カライド)100μgを耳静脈より注射し、2時間後に
心臓より全採血した。採取した血液に+00■1当り1
00単位のヘパリンナトリウムを加えた後、5,0OO
rp■で30分間冷却遠心操作を行い、血球及び不溶固
形物を除去した。400羽のウサギより3,00011
1位l−1の力価をイ[する血染241が得られた。 この血漿241にEDTA24g及びセライト240g
を加え1時間撹拌した後、孔径3μ、1μ及び0.2μ
のフィルターで順次濾過した。 ′/2液24!に0.04M T r i s −11
CI 緩衝ン夜(f)II 7.8)+21’を加えた
後、O,IM NaCIを含む0.04M Tr i
5−TIC+緩衝液(f)87.8)で十分に平衡化し
たDEAE−セファロースCL−6B (ファルマシア
社)のカラム(27X 45c■)に徐々に付した。次
いでカラム平衡化緩衝液751及び0.15M NaC
+を含む0.04M Tris−11CI 緩衝Z (
PI(7,8>501で順次洗浄後、0.18M Na
CIを含む0.04M T r i s −HC1緩衝
液(pH7,2)を用いて溶出した。溶出液は81ずつ
分画して活性画分を集めた。この活性画分に同容lit
の0.04M Tris−11CI 緩衝液(pl−1
7,8)を加えて希釈した後、DICAE−セファ0−
スCL−6Bのカラム(IOX 13CI+>に付した
。次いで0.IMNaCIを含む0.04M T r
i s −11CI 緩衝液(pTI7.8)11を
用いて洗浄した後、O,18M NaCIを含む0.0
4M T r i s −11CI 緩衝液(pH7,
2)51を用いて溶出した。溶出液は2501ずつ分画
して活性画分を集めた。 次にこの溶出液を容器に移し70℃の湯浴中に浸し、撹
拌しながら溶出液の温度が60℃になるまで加熱した。 その後60℃の別の湯浴に移し、30分間加熱処理した
後、速やかに4°Cに冷却した。加熱処理した溶液は、
限外濾過により濃縮した。 0.1M NaC+を含む0.005Mリン酸緩衝1i
IE(pII7.4)で十分に平衡化したセファクリル
S−200(ファルマシア社)のカラム(5X 80c
■)に」ユ記0縮液を付し、同緩衝液で溶出した。40
1ずつ分画して活性画分を採取し、限外濾過により濃縮
した。 ゲル濾過によって得られた活性画分の0縮液をZn2“
キレートセファ0−スカラムに付した。 ポラス(Porath)らの方法(Nature、25
8,598(1975>)で得られたキレートセファ0
−ス(イミノジ酢酸固定化樹脂)を充填したカラム(1
,6X 20c■)に、1mg/mlの塩化亜鉛水溶液
1201を流した。次いでO,IM NaClを含む0
.05Mリン酸緩衝液(pH7,4)で十分に平衡化し
た後、前工程で得られた濃縮液を付し、同緩衝液で溶出
した非吸着画分を採取した。活性はこの両分にほとんど
が回収された。 前精製工程で得られた活性両分を0縮
し、0.15M NaC1を含む0.005 Mす/酸
緩液液(pH7,4>で十分に平衡化したトヨバールI
■W−55(東洋ソーダ株式会社)のカラム(+、5X
90cm)に付した。同緩衝液で溶出し活性画分を採
取した。全f+’t ’A工程を通しての活性の回収率
は60%、精製度は?、5X 10’倍であった。 このようにして得られた精製ウサギ癌壊死因子の比活性
はO,OX 10’単位/ mgfft白質であった(
活性単位の定義は特開昭58−174330号のそれと
同じである)。また、マウスに移植したMeth^肉1
)Rを用いる生物評価において、1匹当り3,000〜
5,000!Ij位を静脈内に投与した場合の活性は(
+)以上であった。 試験例 ヒト癌壊死因子の免疫学的性質 実施例の(9)項で得られた、プラスミドPIITNF
−13による形質転換体の抽出液に、参考例1で調製し
た精製抗つサギ壊死死囚子抗11n fitの100倍
希釈液を等量加えた。混液を37℃で2時間イン↑・ユ
ベートした後、L−920細胞に対する細胞傷害活性を
測定した。結果を第5表に示す。第5表から明らかなよ
うに、ヒト癌壊死因子はウサギ癌壊死因子と免疫学的に
全(交差しない。 (以下余白) 第5表 宸特願昭58−228790号(特開昭Go−1209
90号)に開示されている方法(参考例3の方法)に従
って調製したもの 【図面の簡単な説明】 図面はヒト癌壊死因子をコードするクローン化DNAの
塩基配列決定に用いた制限酵素の切断部位と塩基配列を
決定した方向及び範囲を示す。 特許出願人 大日本!!8Ia!−株式会社代 理
人 南 孝 大小 島 −晃 坪 井 仔四部 図面Cつl’:’ L < +先δに変更なし)第1図 手続補正書(方式) %式% 1、事件の表示 昭和63年特許願第220749号 住所 大阪市東区道修町3丁目25番地名称 (291
)大日本製薬株式会社 4、代理人 住所 東京都千代田区麹町3丁目2番地相互第一ビル (全送日:昭和63年12月20日) 6、補正の対象 明細書の図面の簡単な説明の欄お
よび7、補正の内容
で選択された菌株(RTNP802)をジアミ7ピメリ
ン酸及びヂミジ/を添加したし一ブロスで培養して菌体
を得た。この菌体をウィルキー(Wilkia)らの方
法[Nucle+c Ac1ds Ras、、7 、8
59(+979>1に従って処理し、プラスミドDNA
を得た。このプラスミドDNAを制限酵素Pst Iで
分解し、精製分離してクロー/化DNAを得た。このク
ローン化DNA断片を種々の制限酵素で分解し、適当な
制限酵素断片についてそれぞれの塩Jλ配列をマキサム
−ギルバー) (Maに&■−Gilbert)法によ
り脱リン酸化、Pによる末端標識、塩基特異的化学分解
反応、ゲル電気泳動及びオートラジオグラフィーから決
定した。 その塩1人品列は第1表の通りである。 参考例3 ウサギ癌壊死因子のQj離精製 ウサギ(体重2.5〜3.0kg)にプロピオニバクテ
リウム アクネス(Propionibactertu
m acnes)死菌体50■gを耳静脈より注射した
。8日後にエンドトキシン(大腸菌由来のりボボリサフ
カライド)100μgを耳静脈より注射し、2時間後に
心臓より全採血した。採取した血液に+00■1当り1
00単位のヘパリンナトリウムを加えた後、5,0OO
rp■で30分間冷却遠心操作を行い、血球及び不溶固
形物を除去した。400羽のウサギより3,00011
1位l−1の力価をイ[する血染241が得られた。 この血漿241にEDTA24g及びセライト240g
を加え1時間撹拌した後、孔径3μ、1μ及び0.2μ
のフィルターで順次濾過した。 ′/2液24!に0.04M T r i s −11
CI 緩衝ン夜(f)II 7.8)+21’を加えた
後、O,IM NaCIを含む0.04M Tr i
5−TIC+緩衝液(f)87.8)で十分に平衡化し
たDEAE−セファロースCL−6B (ファルマシア
社)のカラム(27X 45c■)に徐々に付した。次
いでカラム平衡化緩衝液751及び0.15M NaC
+を含む0.04M Tris−11CI 緩衝Z (
PI(7,8>501で順次洗浄後、0.18M Na
CIを含む0.04M T r i s −HC1緩衝
液(pH7,2)を用いて溶出した。溶出液は81ずつ
分画して活性画分を集めた。この活性画分に同容lit
の0.04M Tris−11CI 緩衝液(pl−1
7,8)を加えて希釈した後、DICAE−セファ0−
スCL−6Bのカラム(IOX 13CI+>に付した
。次いで0.IMNaCIを含む0.04M T r
i s −11CI 緩衝液(pTI7.8)11を
用いて洗浄した後、O,18M NaCIを含む0.0
4M T r i s −11CI 緩衝液(pH7,
2)51を用いて溶出した。溶出液は2501ずつ分画
して活性画分を集めた。 次にこの溶出液を容器に移し70℃の湯浴中に浸し、撹
拌しながら溶出液の温度が60℃になるまで加熱した。 その後60℃の別の湯浴に移し、30分間加熱処理した
後、速やかに4°Cに冷却した。加熱処理した溶液は、
限外濾過により濃縮した。 0.1M NaC+を含む0.005Mリン酸緩衝1i
IE(pII7.4)で十分に平衡化したセファクリル
S−200(ファルマシア社)のカラム(5X 80c
■)に」ユ記0縮液を付し、同緩衝液で溶出した。40
1ずつ分画して活性画分を採取し、限外濾過により濃縮
した。 ゲル濾過によって得られた活性画分の0縮液をZn2“
キレートセファ0−スカラムに付した。 ポラス(Porath)らの方法(Nature、25
8,598(1975>)で得られたキレートセファ0
−ス(イミノジ酢酸固定化樹脂)を充填したカラム(1
,6X 20c■)に、1mg/mlの塩化亜鉛水溶液
1201を流した。次いでO,IM NaClを含む0
.05Mリン酸緩衝液(pH7,4)で十分に平衡化し
た後、前工程で得られた濃縮液を付し、同緩衝液で溶出
した非吸着画分を採取した。活性はこの両分にほとんど
が回収された。 前精製工程で得られた活性両分を0縮
し、0.15M NaC1を含む0.005 Mす/酸
緩液液(pH7,4>で十分に平衡化したトヨバールI
■W−55(東洋ソーダ株式会社)のカラム(+、5X
90cm)に付した。同緩衝液で溶出し活性画分を採
取した。全f+’t ’A工程を通しての活性の回収率
は60%、精製度は?、5X 10’倍であった。 このようにして得られた精製ウサギ癌壊死因子の比活性
はO,OX 10’単位/ mgfft白質であった(
活性単位の定義は特開昭58−174330号のそれと
同じである)。また、マウスに移植したMeth^肉1
)Rを用いる生物評価において、1匹当り3,000〜
5,000!Ij位を静脈内に投与した場合の活性は(
+)以上であった。 試験例 ヒト癌壊死因子の免疫学的性質 実施例の(9)項で得られた、プラスミドPIITNF
−13による形質転換体の抽出液に、参考例1で調製し
た精製抗つサギ壊死死囚子抗11n fitの100倍
希釈液を等量加えた。混液を37℃で2時間イン↑・ユ
ベートした後、L−920細胞に対する細胞傷害活性を
測定した。結果を第5表に示す。第5表から明らかなよ
うに、ヒト癌壊死因子はウサギ癌壊死因子と免疫学的に
全(交差しない。 (以下余白) 第5表 宸特願昭58−228790号(特開昭Go−1209
90号)に開示されている方法(参考例3の方法)に従
って調製したもの 【図面の簡単な説明】 図面はヒト癌壊死因子をコードするクローン化DNAの
塩基配列決定に用いた制限酵素の切断部位と塩基配列を
決定した方向及び範囲を示す。 特許出願人 大日本!!8Ia!−株式会社代 理
人 南 孝 大小 島 −晃 坪 井 仔四部 図面Cつl’:’ L < +先δに変更なし)第1図 手続補正書(方式) %式% 1、事件の表示 昭和63年特許願第220749号 住所 大阪市東区道修町3丁目25番地名称 (291
)大日本製薬株式会社 4、代理人 住所 東京都千代田区麹町3丁目2番地相互第一ビル (全送日:昭和63年12月20日) 6、補正の対象 明細書の図面の簡単な説明の欄お
よび7、補正の内容
明細書、66頁下から3行の「図面」の記載を、「第1
図」に訂正する。 1!0図面 添付した図面第1図を、先に提出の図面と差換えます。 以上
図」に訂正する。 1!0図面 添付した図面第1図を、先に提出の図面と差換えます。 以上
Claims (5)
- (1)下記のアミノ酸配列からなるヒト癌壊死因子又は
その活性中心部分を含むポリペプチド:【アミノ酸配列
があります。】 - (2)下記のアミノ酸配列からなるヒト癌壊死因子前駆
体: 【アミノ酸配列があります。】 - (3)ヒト癌壊死因子又はその前駆体をコードするDN
Aを形質発現ベクターに挿入して形質発現ベクターを構
築し、そのベクターを宿主細胞に導入し、ついでその形
質転換体を培養することを特徴とするヒト癌壊死因子活
性を有するポリペプチドの製造法。 - (4)ヒト癌壊死因子をコードするDNAが下記式で示
されるアミノ酸配列からなるヒト癌壊死因子をコードす
るDNAである特許請求の範囲第(3)項記載のヒト癌
壊死因子活性を有するポリペプチドの製造法: 【アミノ酸配列があります。】 - (5)ヒト癌壊死因子活性を有するポリペプチドが下記
アミノ酸配列からなるポリペプチドである特許請求の範
囲第(4)項記載の製造法: 【アミノ酸配列があります。】
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63220749A JPH01156999A (ja) | 1988-09-03 | 1988-09-03 | ヒト癌壊死因子 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63220749A JPH01156999A (ja) | 1988-09-03 | 1988-09-03 | ヒト癌壊死因子 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59043617A Division JPS60185799A (ja) | 1984-03-06 | 1984-03-06 | ヒト癌壊死因子 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH01156999A true JPH01156999A (ja) | 1989-06-20 |
Family
ID=16755936
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63220749A Pending JPH01156999A (ja) | 1988-09-03 | 1988-09-03 | ヒト癌壊死因子 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH01156999A (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS60228297A (ja) * | 1984-04-24 | 1985-11-13 | 株式会社 東京タツノ | 給油装置 |
JPS6150923A (ja) * | 1984-08-17 | 1986-03-13 | Dainippon Pharmaceut Co Ltd | ヒト癌壊死因子 |
JPH04506457A (ja) * | 1989-10-18 | 1992-11-12 | アメリカ合衆国 | ヒトnm23タンパク質及びそれに対する抗体の産生及び使用 |
-
1988
- 1988-09-03 JP JP63220749A patent/JPH01156999A/ja active Pending
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS60228297A (ja) * | 1984-04-24 | 1985-11-13 | 株式会社 東京タツノ | 給油装置 |
JPS6150923A (ja) * | 1984-08-17 | 1986-03-13 | Dainippon Pharmaceut Co Ltd | ヒト癌壊死因子 |
JPH04506457A (ja) * | 1989-10-18 | 1992-11-12 | アメリカ合衆国 | ヒトnm23タンパク質及びそれに対する抗体の産生及び使用 |
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