JPH01156999A - ヒト癌壊死因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はヒト癌壊死因子ポリペプチド並びにそれらをコ
ードするクローン化ＤＮＡ、　それらクローン化ＤＮＡ
を組込んだベクター及びそれらのベクターで形質転換さ
れた宿主に関する。 本明細書では！［！社の簡略化のために以下の略号を使
用する。 Ａ　　　　　アデニン Ｃシトシン Ｇ　　　　　グアニン Ｔ　　　　チミン Ａｌａ　　　　　アラニン Ａｒｇ　　　　アルギニ／ Ａｓｎ　　　　　　アスパラギン Ａｓｐ　　　　　　アスパラギン酸 Ｃｙｓ　　　　　　システィン Ｇｉｎ　　　　　　グルタミン Ｇｌｕ　　　　　　グルタミン酸 Ｇｌｙ　　　　　グリシ／ Ｈｉｓ　　　　　　ヒスチジン １１ｅ　　　　　インロイシン Ｌｅｕ　　　　　　ロイシン Ｌｙｓリジ／ Ｍｅｔ　　　　　メチオニン Ｐｈｅ　　　　　　フェニルアラニ／ Ｐｒｏ　　　　　　プロリン Ｓｅｔ　　　　　セリン Ｔｈｒ　　　　　　スレオ／−７ ＴｒＰ　　　　　　）リプトファン Ｔｙｒ　　　　　　チロシン Ｖａｔ　　　　　バリン ＤＮＡ　　　　　デオキシリボ核酸 ｃ　ＤＮＡ　　　　　相補ＤＮＡ ＲＮＡ　　　　　　リボ核酸 ｍＲＮＡ　　　　　伝令ＲＮＡ ｄＡＴＰ　　　　　デオキシアすノシン三リン酸ｄＣＴ
Ｉ’　　　　　デオキシシチジン三リン酸ｄＧＴＰ　　
　　　デオキシグアノシン三リン酸ｄＴＴＰ　　　　　
デオキシチミジン三リン酸オリゴ（ｄＣ）　　　オリゴ
デオキシグアル酸オリゴ（ｄＧ）　　　オリゴデオキシ
グアニル酸オリゴ（ｄＴ）　　　オリゴデオキシチミジ
ル酸ポリ（Ａ）　　　　ポリアデニル酸 ポリ（Ｕ）　　　　　ポリウリジル酸 ポリ（ｄＡ）　　　　ポリデオキシアデニル酸ポリ（ｄ
Ｃ）　　　　ポリデオキシシチジル酸ポリ（ｄＧ）　　
　　ポリデオキシグアニル酸ポリ（ｄＴ）　　　　ポリ
デオキシチミジル酸ＥＤＴＡ　　　　　エチレンジアミ
ン四酢酸ｂｐ　　　　　　塩基対 Ｃａｒｓｗｅ　Ｉ　Ｉらは、あらかじめｂａｃ口１ｕｓ
　Ｃａｌｍｅｔｔｅ−ｃｕ６ｒ＋ｎ　（ｌ３ＣＧ　）で
感染させ、次いでエンドトキシンで処理したマウスの血
清中には、移植したＭｅｔｈ＾肉腫による癌を壊死させ
る物質が含まれていることを見いだし、この物質を壊死
死因子と名づけた［Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、＾ｃａｄ、ｓｃ
ｉ　、ｔｌＳＡ、７２．３１３００（１９７５）］。 癌壊死因子はマクロファージから放出される生理活性物
質と考えられており、その特徴として、（１）担癌動物
に投与するとある種の癌を壊死させ治癒せしめること（
ｉｉ）　ｉｎ　ｖＨｒｏである種の癌細胞（例えばマウ
スの癌細胞であるＬ細胞、ヒト癌由来のＰＣ−１０細胞
）を傷害するが、正常細胞にはほとんど存置な作用を及
ぼさないこと、及び（ｉｉ＋）その作用が種特異的でな
いことなどが知られている。このような特徴の故に壊死
死因子は、新しいタイプの制癌剤としてその臨床的応用
が強く期待されている。 しかしながら、従来の壊死死因子製造法はマウスやウサ
ギなどの動物にＢＣＧ又はＰｒｏｐ　ｔｏｎ　１ｂａｃ
ｔｅ−ｒｉｕ■ａｃｎｅｓを注射し、次いでエンドトキ
シンを投与した後その血液及び体液より壊死死因子を単
離精製するものであるため、安定して多量の壊死死因子
を安価に得ることは難しい状況であった。更に、壊死死
因子を医薬として使用するためには、抗原性等の観点か
らヒト由来の壊死死因子がより好ましいが、上記方法は
ヒト由来の壊死死囚子製造には採用できない。 従来、ヒトマクロファージ由来の癌細胞傷害因子として
、Ｍａｔｔｈｅｗｓにより報告された、正常人の末哨単
球細胞あるいは骨髄性単球性白血病細胞が産生ずる因子
（＾ｎｕ−ｔｕｍｏｒ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ）［：■■
１ｕｎｏｌｏｇｙ。 ４４、＋３５（１９８１）］及びＲｅｅｄらにより報告
された、ヒト末檜血中の培養器壁付着細胞が産生ずる因
子（＾ｄｈｅｒｅｎｔ　ｃｅｌｌ　ｔｏｘｉｎ）［Ｊ、
ｒｓｓｕｎｏｌ、、１１５，３９５（１９７５）１など
が知られている。また、Ｗ■目λ１ｓＯｎらは、ヒトＢ
細胞樹立株から産生される分子量約７万ダルトンの物質
をヒト癌壊死因子として報告している［Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ、８０，５３９７（１９
８３＞］。しかし、いずれの場合もその物質としての実
体は不明であった。 本発明者らは、ヒト由来の壊死死因子の大量生産法を確
立するために、遺伝子組換え技術に着目して鋭意研究を
行い、まずウサギ癌壊死因子をコードするクローン化Ｄ
ＮＡの単離に成功した（特願、昭５８−２２８７９０号
（特開昭００−１２０９９０号）参照）。更に研究を続
けた結果、このクローン化ＤＮＡをプローブとして、ヒ
ト癌壊死因子をコードするｃ　ＤＮＡをクローン化する
ことに成功し、更にこのクローン化ＤＮＡを組込んだプ
ラスミドで形質転換された微生物がヒト癌壊死因子を産
生ずることを確認して本発明を完成した。 本明細書において、ヒト癌壊死因子とはヒト由来細胞が
産生ずる蛋白質であって、　ｉｎｖ＋ｔｒｏで少なくと
もＬ細胞を傷害する能力、及び＋ｎ　ｖｔｖｏで少なく
とも移植したＭｅｔｈ＾肉腫による癌を壊死させる能力
を佇するものを意味し、壊死死囚子活性とは、このよう
な生物活性を意味する。 本発明は、ヒト癌壊死因子のアミノ酸配列又はその活性
中心部分を含むポリペプチド、及びそれらをコードする
クローン化ＤＮＡを提供するものである。特に、次のア
ミノ酸配列（Ｉ） Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｓ
ｅｒ　ＡｓＰ　Ｌｙｓ　Ｐｒ。 Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｈｌｓ　Ｖｉｌ　Ｖｔｌ　Ａｌｉ　Ａ
ｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　ＡｌａＧｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ
　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　
ＡｒｇＡｌａ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｌ
ａ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｖｉｌ　ＧｌｕＬｅｕ　Ａｒｇ　
Ａｓ１）　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｖａｔ　Ｖｉｌ　
Ｐｒｏ　５ｅｒＧｌｕ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｌｅ
ｕ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　ＶａｌＬｅｕ　
Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｐ
ｒｏ　Ｓｅｒ　ＴｈｒＨｌｓ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ
　Ｔｈｒ　Ｈｌｓ　Ｔｈｒ　ｒｌｅ　Ｓｅｒ　ＡｒｇＩ
Ｉｓ　Ａｌａ　Ｖａｔ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｎ　Ｔｈ
ｒ　Ｌｙｓ　Ｖａｔ　ＡｓｎＬａｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　
Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｇ
ｌｎＡｒｇ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ
　Ａｌｉ　Ｇｌｕ　Ａｌｉ　ＬｙｉＰｒｏ　Ｔｒｐ　Ｔ
ｙｒ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌ
ｙ　ＧｌｙＶａｔ　Ｐｈｅ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　
Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｒｚ　ＬｅｕＳｅｒ　Ａｌ
ａ　Ｇｌｕ　ＩＩＣＡｓｎ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　
Ｔｙｒ　ＬｅｕＡｓＰ　　Ｐｈｅ　　Ａｌａ　　Ｇｌｕ
　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｎ　　Ｖｉｌ　　Ｔｙｒ
　　ＰｈｅＧｌｙ　　Ｉｌｅ　　Ｉｌｅ　　Ａｌａ　　
Ｌｅｕ　　　　　　　　　　　（Ｉ　）を有するヒト癌
壊死因子［以下ポリペプチド（Ｉ）と記す］、ポリペプ
チド（Ｉ）のＮ末端に更に次のアミノ酸配列（ＩＩ） Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｉ
ｌｅ　Ａｒｇ　ＡｓｐＶａｌＧｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　
Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｌｉ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌ
ｙｓＴｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ
　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　ＣｙｓＬｅｕ　　Ｐｈｅ　
　Ｌｃｕ　　Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ　　Ｐｈｅ　　Ｓｅｒ　
　Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ　　ｌ１ｅＶａｔ　Ａｌａ　Ｇｌｙ
　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　
ＬｅｕＬｅｕ　Ｈｉｓ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｖａｔ　Ｉｌ
ｅ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　ＡｒｇＧｌｕ　Ｇｌｕ　
Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌ
ｅｕ　１ｉｅＳｅｒ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ａｌｉ　Ｇｌｎ
　Ａｌａ　Ｖａｔ　Ａｒｇ　　　（ＩＩ　）を有するポ
リペプチド［以下ポリペプチド（Ｉ＋■）と記す］、及
びポリペプチド（Ｉ）のＮ末端にＭｅｔを有するポリペ
プチド、並びに次の塩基配列（Ｉｌｌ） （５’）−ＴＣＡ　ＴＣＴ　ＴＣＴ　ＣＧＡ　ＡＣＣＣ
ＣＧ　ＡＧＴ　ＧＡＣＡＡＧＣＣＴ　　ＧＴＡ　　ＧＣ
ＣＣＡＴ　　ＧＴＴ　　ＧＴＡ　　ＧＣＡ　　ＡＡＣＣ
ＣＴ　　ＣＡＡＧＣＴ　ＧＡＧ　ＧＧＧ　ＣＡＧ　ＣＴ
ＣＣＡＧ　ＴＧＧ　ＣＴＧ　ＡＡＣＣＧＣＣＧＧ　　Ｇ
ＣＣＡＡＴ　　ＧＣＣＣＴＣＣＴＧ　　ＧＣＣＡＡＴ　
　ＧＧＣＧＴＧＧＡＧ　　ＣＴＧ　　ＡＧＡ　　ＧＡＴ
　　ＡＡＣＣＡＧ　　ＣＴＧ　　ＧＴＧ　　ＧＴＧ　　
ＣＣＡＴＣＡ　　ＧＡＧ　　ＧＧＣＣＴＧ　　ＴＡＣＣ
ＴＣＡＴＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧＧＴＣＣＴＣＴＴＣＡＡ
Ｇ　　ＧＧＣＣＡＡ　　ＧＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＣＡＣ
ＣＣＡＴ　　ＧＴＧ　　ＣＴＣＣＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣ
ＣＡＴＣＡＧＣＣＧＣＡＴＣＧＣＣＧＴＣＴＣＣＴＡＣ
ＣＡＧ　　ＡＣＣＡＡＧ　　ＧＴＣＡＡＣＣＴＣＣＴＣ
ＴＣＴ　　ＧＣＣＡＴＣＡＡＧ　　ＡＧＣＣＣＣＴＧＣ
ＣＡＧ　　ＡＧＧ　　ＧＡＧ　　ＡＣＣＣＣＡ　　ＧＡ
Ｇ　　ＧＧＧ　　ＧＣＴ　　ＧＡＧ　　ＧＣＣＡＡＧ　
　ＣＣＣＴＧＧ　　ＴＡＴ　　ＧＡＧ　　ＣＣＣＡＴＣ
ＴＡＴ　　ＣＴＧ　　ＧＧＡＧＧＧ　　ＧＴＣＴＴＣＣ
ＡＧ　　ＣＴＧ　　ＧＡＧ　　ＡＡＧ　　ＧＧＴ　　Ｇ
ＡＣＣＧＡＣＴＣＡＧＣＧＣＴ　　ＧＡＧ　　ＡＴＣＡ
ＡＴ　　ＣＧＧ　　ＣＣＣＧＡＣＴＡＴＣＴＣＧＡＣＴ
ＴＴ　　ＧＣＣＧＡＧ　　ＴＣＴ　　ＧＧＧ　　ＣＡＧ
　　ＧＴＣＴΔＣＴＴＴ　　ＧＧＧ　　ＡＴＣΔＴＴ　
　ＧＣＣＣＴＧ−（３′）　　　　　　（ＩＩＩ　’）
を有する、ポリペプチド（Ｉ）をコードするクローン化
ＤＮＡ　［以下ＤＮＡ　（Ｉｌｌ　＞と記す］及びＤＮ
Ａ（ＩＩＩ）の５′末端に更に次の塩Ｊλ配列（ＴＶ）
（５’）−ＡＴＧ　ＡＧＣＡＣＴ　ＧＡＡ　ＡＧＣＡＴ
Ｇ　ＡＴＣＣＧＧ　ＧＡＣＧＴＧ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　Ｇ
ＣＣＧＡＧ　ＧＡＧ　ＧＣＧ　ＣＴＣＣＣＣＡＡＧＡＡ
Ｇ　ＡＣＡ　ＧＧＧ　ＧＧＧ　ＣＣＣＣＡＧ　ＧＧＣＴ
ＣＣＡＧＧ　ＣＧＧＴＧＣＴＴＧ　ＴＴＣＣＴＣＡＧＣ
ＣＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＣＣＴＧＡＴＣＧＴＧ　　ＧＣ
Ａ　　ＧＧＣＧＣＣＡＣＣＡＣＧ　　ＣＴＣＴＴＣＴＧ
ＣＣＴＧ　　ＣＴＧ　　ＣＡＣＴＴＴ　　ＧＧＡ　　Ｇ
ＴＧ　　ＡＴＣＧＧＣＣＣＣＣＡＧＡＧＧ　　ＧＡＡ　
　ＧＡＧ　　ＴＴＣＣＣＣＡＧＧ　　ＧＡＣＣＴＣＴＣ
Ｔ　　ＣＴＡＡＴＣＡＧＣＣＣＴ　　ＣＴＧ　　ＧＣＣ
ＣＡＧ　　ＧＣＡ　　ＧＴＣＡＧＡ−（３’）（ＩＶ） を有する、ポリペプチド（Ｉ＋■）をコードするクロー
ン化ＤＮＡ　［以下ＤＮＡ（Ｉｌｌ−＋ｌＶ）と記ず］
、及びＤＮＡ（ＩＩＩ）の５′末端に開始コド７　ＡＴ
Ｇを佇するＤＮＡを提供するものである。 本明細書において、ヒト癌壊死因子のアミノ酸配列を含
むポリペプチドとは、ポリペプチド（Ｉ）。 又はそのＮ末端又はＣ末端にアミノ酸又はペプチドが結
合しているポリペプチドであって、それ自身が、又は酵
素等により切断されて生じるポリペプチドが、１！リベ
プヂド（Ｉ）と同様のヒト壊死死囚子活性を示すものを
意味する。また、ヒト癌壊死因子のアミノ酸配列の活性
中心部分を含むポリペプチドとは、ポリペプチド（１）
のアミノ酸配列のうちヒト壊死死囚子活性を発現ず°６
のに必須のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、
ボリペプチド（Ｉ）と同様のヒト癌壊死因子活性を示す
ものを意味する。本発明には、ヒト癌壊死因子のアミノ
酸配列又はその活性中心部分を含むポリペプチド、それ
らをコードするＤＮＡ　、それらのＤＮＡを組込んだベ
クター及びそれらのベクターで形質転換された宿主だけ
でなく、得られたポリペプチドが本発明のポリペプチド
（Ｉ）と高い相同性を存し、同様のヒト癌壊死因子活性
を示し、かつ免疫学的に交差するものである限り、その
ようなポリペプチド並びにそれらをコードするＤＮＡ　
。 それらのＤＮＡを組込んだベクター及びそれらのベクタ
ーで形質転換された宿主も又含まれる０例えば、ヒト癌
壊死因子ＤＮＡの対立遺伝子変異体及び遺伝子コードの
縮重又は一部の修飾を含むヒト癌壊死因子ＤＮＡの：４
導体及びこれらから得られるポリペプチドも又本発明に
含まれる。なお、一部の修飾を含むヒト癌壊死因子ＤＮ
Ａの誘導体とは、ヒト癌壊死因子ＤＮＡの一部が欠失し
た誘導体及びヒト癌壊死因子ＤＮＡに他のＤＮＡ断片が
付加した誘導体を意味する。 本発明のヒト癌壊死因子をコードする塩基配列を「する
ＤＮＡは、例えば次のようにして製造することができる
。 （１）ウサギ癌壊死因子をコードするクローン化ＤＮＡ
の調製 ４９　ｍ　ｒＸｌ　５Ｂ−２２８’？８０　号（特ｒｊ
ｎ　Ｎ　６（１１２０９９（１号＞ｋ［ｔｌ示されてい
る方法（例えば参考例２の方法）に従って、ウサギ壊死
死囚子ｃ　ＤＮＡを得る。このクローン化ＤＮＡの塩基
配列は第１表に示す通りで、ウサギ癌壊死因子のポリペ
プチドをコードする領域は第２７７〜７３８番である。 このウサギ壊死死囚子ｃ　ＤＮＡに、適当な長さのＤＮ
Ａ断片を与えるように制限酵素を作用させてＤＮＡ断片
を切り出し、以下に述べるヒト癌壊死因子ｃ　ＤＮＡの
クローニングのためのプローブとする。 制限酵素としては、例えば＾ｖａＩ　、　ＨａｅｌＩ　
、　ＢｓｔＮＩ　。 旧ｎｃＩ［、ＲｓａＩが挙げられる。ＤＮＡ断片は異な
る領域に由来する２種以上のものを使用するのが好まし
い。第１表には、制限酵素として＾ＶλＩ及びＨａｅ　
Ｕを用いて、それぞれ２９９　ｂｐ及び８８　ｂｐｃＤ
ＤＮＡ断片を切り出す場合の切断部位を示している。 （以下余白） Ｅ−＜　　　　　（、ｌ（、ｌ　　　　　　　ＱａＯＱ
　　　＜Ｅ−００ ＜ｈ　　　Ｑ（、ｌ　　　　　＜← （１）（、ｌ　　　　　ＱＯ０（１） ＜Ｅ−４Ｑａ　　　　　Ｑａ ａｏ　　　　　Ｑａ　　　　　　　ａＱＥく　　ＱＯく
← ｏＱ　　　　（：）Ｑ　　　　　　　Ｑ（，１Ｑａ　　
　　ａＱ　　　＜←　　００ ００　　　　ト＝＜　　　　　ａｏ　　　　ａ。 トく　　　００　　　←＜　　←く Ｑ（、ｌ　　　　　＜Ｅ−１（，１（：）　　　　（１
）ＱＯａ　　　　　ａｏ　　　　　ａｕ　　　　　（、
ＩＱく←　　　Ｅ−＜　　　　ＯＱ　　　Ｅ−＜＜Ｅ−
４ｔ、＞Ｃ：）　　　　Ｅ−＜　　　（、ｌ（、ＩＥ−
１＜　　　　　Ｅ−４＜　　　　　ｏａ　　　　ａｕｏ
ｏ　　　　　Ｅ−１＜　　　　　ｏａ　　　　ｏ。 ＜Ｅ−４ｏａ　　　　　＜←　　　←く＜Ｅ−ａＯ←く
　　く← ａＱ＜Ｅ−Ｉ　　　　　ＣＤＵ　　　　　＜Ｅ−（、Ｉ
Ｑ　　　　　Ｑａ　　　　　＜ｈ　　　　ａ。 ＜Ｅ−Ｅ−＜　　　　　＜←　　　←く＜Ｅ−ｏａ　　
　　　　　Ｅ−１＜ ”　　　　　ａｏ　　ｏａ　　　　←く（，１０ａＱ　
　　　　　Ｑａ 以　　　　ｏＯ＜Ｅ−ｏ。 ｏＯ（：）Ｑ　　　　　＜← シ　　　　ａｏ　　　ａｏ　　　　ｏａ（、）Ｃ：）　
　　　　＜Ｅ−１０ａ　　　　ａ。 ＵＣ：）　　　　Ｅ−１＜：　　　　＜←　　く←Ｑａ
　　　　ｏｏ　　　　＜←　　く←ｏａ　　　　ａＱ　
　　＜←　　０ａ ＯＱ　　　　ト＜　　　　　ＯＣＤ　　　ＵＣＤｏｐ　
　　　＜Ｅ−４ｏＱ　　ａ。 ＜ｘ＞　　　　　Ｑａ　　　　　＜ＩＩ：Ｅ−１ａＱＥ
−４＜　　　　ＱＯ←く　　　←く ａＯａｏ　　　　　　（：）（、Ｉ　　　　　ＣＸ：）
ａＯａＯｏａ　　　　　Ｑ（１） （、ＩＩＱ　　　　　Ｅ−（ＩＩ：　　　　　（：Ｅ−
１０ａ＜Ｅ−Ｉ　　　　Ｌ）ｔ）　　　　ＱＣ：）　　
　ＣＤＬ）ｏｏ　　　　　Ｅ−１＜　　　　　ｏｏ　　
　　ｏ。 （：Ｅ−（：Ｅ−Ｅ−４＜　　　　ＱａＯａ　　　　　
＜Ｅ−４Ｑ（：）　　　　ａＱｃｐｏ　　　　ｏｏ　　
　　←く　　←く←＜　　　　　Ｅ−１＜　　　　　Ｑ
ａ　　　　（、ｌ（、ＩＱ（：）　　　　　ａＱ　　　
　ｏａ　　　　ｏａｏＯ＜Ｅ−４Ｌ）Ｌ）　　　　（、
ＩＱ←＜　　　　Ｅ−＜　　　　＜Ｅ−＜←ｖａ　　　
　　Ｑａ　　　　　＜Ｅ−４０ａｏｏ　　　　　（、＋
（、ｌ　　　　　ｏｏ　　　　　　　ｏａ○（１）　　
　　　ｏｏ　　　　　（１）（、ｌ　　　　　　　ＱＣ
）００　　＜←　　く←　　　　くト Ｅ−１＜　　＜Ｅ−４０Ｑ　　　　００Ｑ０　００　　
←＜　　　　←く ＯＱ　　＜←　　ｏｏ　　　　　（、ＩＱａｏ　　　＜
Ｅ−１０Ｑ　　　　　ａＱｏｏ　　　ｏｏ　　　ｏｏ　
　　　　Ｅ−４＜←＜　　　ｏａ　　　ａＱ　　　　０
ａＥ−＜　　　Ｅ−＜　　　ｏＱＥ−４＜ＯＱ　　　Ｅ
−＜　　　ｕＣＤ　　　　ａＱｏｏ　　ｔ、＞ａ　　　
ｏａ　　　　　Ｑａく←　　ｏｏ　　　＜Ｅ−ｏＱ Ｅ＜　　　＜← Ｏａ　　　　００ ←＜　　　ＬＸ） ００　　　　ＱＯ ａＱ　　　　Ｏａ ＜Ｅ−＜← Ｑｏ　　　　００ Ｑｏ　　　　００ ００　　　ト０く ←く　　Ｑｏ ＜ｈ　　　　　ｕ。 Ｏｏ　　　　００ Ｑａ　　　　　ＵＬ） ■ヒト癌壊死因子ｍＲＮＡの調製 ヒトのマクロファージを肺胞、血液、腹腔、胎盤。 胛臓、その他の組織から採取する。例えば、肺胞からは
５ａｎｅらの方法［Ｊ、ｌｍ５ｕｎｏ１．．１２９．１
３１３（＋９８２）］。 血液からはＭａｔｔｈｃｗｓの方法［１１ｒ、Ｊ、Ｃａ
ｎｃｅｒ、４８，４０５（＋９８３）］、胎盤からはＷ
ｉｌｓｏｎらの方法［Ｊ、Ｉｔｗｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ
　Ｍｅｔｈｏｄｓ、５０，３０５（＋９８３）］により
採取する。このマクミツ１−ジを培養器面！ｄ当たり約
２Ｘ　１０４〜１０６個播き、３５〜３８℃、好ましく
は約３７℃、約５〜１０％炭酸ガス合作空気中、湿度的
８０〜１００％で約３０分〜２ｕソ間前培養する。次い
でダラム陰性菌より得られたエンドトキシン、例えば大
腸菌、緑膿菌、チフス菌由来のりボボリサブヵライドを
加え、更に培養を３〜８時間継続してヒト癌壊死因子ｍ
　ＲＮ　Ａの産生を：ｆｇＪＱさせる。このとき蛋白合
成阻害剤（例えばシクロへキシミド）を加えることによ
り、ヒト癌壊死因子ｍＲＮＡを蓄積させることができる
。なお前培養は省略してもよい。エンドトキシンの添加
量は、一般に約０．１〜１０００μｇ１１（最終濃度、
以下同じ）、好ましくは約１〜１００μｇ／ｌである。 この際、ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセ
テート、ホルボール−１２，１３−ジデカノエート、ホ
ルボール−１２，１３−ジベンゾエートのようなホルボ
ールエステル類を約■〜２０００　ｎｇ／ｍＮＵ加して
もよい。蛋白合成阻害剤の添加量は、化合物の種類等に
より異なるが、例えばシクロヘキシミドの場合、０．１
〜５０μｇ／ｉｆである。培地としては、高１等動物細
胞の培養に適した各種合成培地が用いられ、例えばＲＰ
ＭＩ−ＩＥｉ４０．イーグルのＭ　Ｅ　Ｍ培地、ダルベ
ツコ変法によるＭＥＭ培地（以上の培地の組成について
は、例えば宗村庚修編「細胞培養マニュアル」、講談社
、　１９８２年に記載されている）が挙げられる。培地
には、全培養液量の約１〜２０％の動物血清（例えば牛
胎児血清、子牛血清）を加えておくのが好ましい。培養
終了後、細胞より常法、例えばＣｈｉｒｇｗｉｎらの方
法［［１，ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１８＋５２９４（
＋９７９＞］により全ＲＮＡを抽出し、次いでこれを常
法に従ってオリゴ（ｄＴ）セルロース又はポリ（Ｕ）セ
ファロース（ファルマシア社）などを用いる後管カラム
クロマトグラフィーに付すか又はバッチ法によりｐｏｌ
ｙ（八）ｍＲＮＡ画分を分離する。このｐｏｌｙ（＾）
ｍＲＮＡ画分を酸性尿素アガロースゲル電気泳動又はシ
ｙＭ密度勾配遠心分Ｆ１１に付すことにより、ヒト癌壊
死因子ｍＲＮＡ　’ｋ　Ｋ５　ｍ精製することができる
。 ここに得られたｍＲＮＡ画分が目的とするヒト癌壊死因
子をコードするｍＲＮＡを合作していることを確認する
ためには、ｍＲＮＡを蛋白質に翻訳させてその生物活性
を調べればよい。例えばアフリカ７メガエル（Ｘｅｎｏ
ｐｕｓ　１ａｅｖｉｓ）の卵母細胞、網状赤血球ライセ
ード、小麦胚芽のような連判な蛋白合成系にｍＲＮＡを
注入又は添加して蛋白質に翻訳させ、その蛋白質がマウ
スＬ−９２９細胞に対して細胞傷害活性を示すことを確
認することにより行われる。なお、アフリカッメガエル
の卵母細胞を用いる方法は、例えば次のようにして行わ
れる。卵母細胞１個当たり約５０ｎｇのｍＲＮＡをマイ
クロインジェクンヨン法で注入し、その１０個を１００
μｌのパース培養液［Ｇｕｒｄｏｎ、Ｊ、Ｂ、、Ｊ、Ｅ
ｍｂｒｙｏｌ、Ｅｘｐ、Ｍｏｒｐｈｏｌ　、。 ２０．４０１（１９１３８＞］中、２２℃で２４〜７２
時間培養し、ホモジナイズした後、その遠心上清液（１
０，ＯＯＯｒｐｍ、　１０分間）を検体として、Ｌ−９
２９細胞傷害活性を指標として壊死死囚子活性を測定す
る［　Ｌ−０２９細胞傷害活性の測定法はＲｕｆｆＪ、
Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、１ｍｍｕｎｏ１．。 １２５、１６７１（１９８０）に記載されている］。 （３）ヒト癌壊死因子ｃ　ＤＮＡのクローニング（２）
の工程で得られたｍＲＮＡを鋳型とし、Ｇｕｂｌｅｒら
の方法［Ｇｅｎｅ、２５．２Ｇ３（１９８３＞１に従っ
てオリゴ（ｄＴ）をプライマーとして、ｄＡＴＩ’、　
　ｄＧＴＩ’、　　ｄｃＴｒ’。 ｄＴＴＩ’の存在下で逆転写酵素（例えばトリ骨髄性白
血病ウィルス由来逆転写酵素）によりｍＲＮＡと相補的
な単鎖ｃ　ＤＮＡを合成し、次いで大腸菌リボヌクレア
ーゼＩＩ’と大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■を用いて二重
鎖ｃ　ＤＮＡを合成する。ここに得られたＤＮＡを、ポ
リ（ｄＧ）−ポリ（ｄＣ）又はポリ（ｄＡ）−ポリ（ｄ
ｒ＞ホモポリマー伸長法（Ｎｏｄａ、Ｍ、、ｅｔ　ａｔ
、。 Ｎａｔｕｒｅ、２９５，２０２（１９８２）；　Ｎｅ１
ｓｏｎ、Ｔ、Ｓ、、　”Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ、”　　０８，４１（１９７９）、Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ　　Ｉｎｃ、。 Ｎｃｗ　Ｙｏｒｋ］のような常法に従って、例えばプラ
スミドｐｌ［３２２の制限酵素Ｐｓｔ　Ｉ切断部位に組
込ませる。得られた組換えプラスミドを、例えばＣｏｈ
ｅｎらの方法［Ｉ’ｒｏｃ、Ｎａｔ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ
、ＵｓＡ、０９，２１１０（１９７２）コに準じて、例
えばＥ、ｃｏｌｉχ１７７６株のような宿主に導入して
形質転換させ、テトラサイクリン耐性株を選択してｃ　
ＤＮＡライブラリーを作製する。 このｃ　ＤＮＡライブラリーについて、（１）の工程で
得たウサギ癌壊死因子をコードするＤＮＡの断片を１２
１）で標識したものをプローブとして、コロニー・ハイ
ブリダイゼーンヨン試験［１１ａｎａｈａｎ、Ｄ、、ａ
ｔ　ａｌ、。 Ｇａｎａ　、　１０　、０３（１９８０）　］を行い、
ウサギ壊死死囚子ｃＤＮＡ断片とハイブリダイズするク
ローンをスクリーニングする。 このようにして１１１られた多くのクロー７化ＤＮＡに
ついて、例えばＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｃｒｔ法［ｒ’ｒ
ｏｃ、Ｎａｔ、＾ｃａｄ　。 Ｓｃｉ、１ＩＳＡ、７４，５００（１９７７）］に従っ
て塩バ配列を解析し、既に明らかになっているウサギ癌
壊死因子の塩基配列と相同性のある塩基配列を探し、最
終的にヒト癌壊死因子の全翻訳領域に対応する塩基配列
を含むｃＤＮＡを選び出すことにより、ヒト壊死死囚子
ポリペプチドをコードする塩基配列をイｆするクローン
化ＤＮＡを得ることができる。 ことに得られたクローン化ＤＮＡの組込まれた組換えプ
ラスミドを、例えばＥ、ｃｏ目１１旧０１株のような宿
主に導入して形質転換体を得た後、これを培養し、Ｌ−
９２１３細胞傷害活性を指標にして蛋白質を分離、精製
することにより、ヒト壊死死囚子ポリペプチドを得るこ
とができる。 更に形質発現効率を上げるためには、本発明のクローン
化ＤＮＡのヒト癌壊死因子をコードする領域を適当な制
限酵素で切り出した後、適当なプロモーターを有する形
質発現ベクターに組込んでヒト壊死死囚子ポリペプチド
生産用ベクターを作製すればよい、プロモーターとして
は、例えばｌａｃプロモーター、　ｔｒｐプロモーター
、　ｔａｃプロモーター。 ＰＬプロモーター、　　ＳＶ４０初期プロモーターなど
が挙げられる。ベクターとしては、形質転換させる宿主
中で増殖するものはすべて用いることができる。例えば
プラスミド（ｐＢＲ３２２，Ｉ）ＤＲ５／１０など）、
ファージ（ラムダファージ誘導体など）。 ウィルス（ＳＶ４０など）が挙げられる。これらは単独
で、又はそれらの組合わせ、例えばｆ）　１３　Ｒ３２
２−ＳＶ４０ハイブリッドプラスミドなどの形で用いて
もよい。 ここに得られたクローン化ＤＮＡを組込んだベクターを
常法により適当な宿主に作用させて形質転換させること
により形質発現宿主が得られる。形質転換に用いられる
宿主としては、例えば大腸口。 枯草菌、酵母などの微生物、ＣＯＳ■ｏｎｋｅｙ細胞な
どの動物培養細胞及び植物培養細胞が挙げられる。 本発明のヒト癌壊死因子は、ウサギ癌壊死因子と極めて
相同性の高いアミノ酸配列を育しており、ＤＮＡ塩基配
列においても高い相同性が認められる。 第２表にヒト癌壊死因子及びウサギ癌壊死因子の前駆体
のアミノ酸配列の相同性を示し、第３表にヒト癌壊死因
子及びウサギ癌壊死因子の前駆体をコードするＤＮＡの
塩基配列の相同性を示す、特願昭５８−２２８７９０号
（特開昭６０−１２０９９０号）で説明しているように
、ウサギ癌壊死因子は尿素非存在下では会合体の形で存
在し、第２表に示した第８２番目のＳｅｔに始まり、第
２３６番目のＬｅｕに終わる１５４個のアミノ酸から成
るポリペプチドがその基本構成単位であると考えられて
いる。即ち、前駆体ポリペプチドのＮ末端部分が生体内
で適当な酵素により切断され、活性化されるものと考え
られる。ヒト癌壊死因子の場合も、ｍ　８２番目のＳｅ
ｔに始まり、第２３６番目のＬｅｕで終わる１５５個の
アミノ酸から成るポリペプチドがヒト癌壊死因子の基本
構成単位であると考えられる。第２及びｆｉ３表から明
らかなように、ヒト及びウサギ灯壊死因子のポリペプチ
ドのアミノ酸配列の相同性は８１％であり、それぞれを
コードするＤＮＡ塩基配列の相同性は８５％である。ま
た、ヒト壊死死囚子前駆体とウサギ灯壊死囚子前駆体と
の間にも高い相同性が認められ、ポリペプチドのアミノ
酸配列の相同性は７８％であり、塩基配列の相同性は８
４％である。 ヒト及びウサギ癌壊死因子間のこのように高い相同性は
、両回子が系統発生学的には共通の分子から派生してい
ることを推測させるとともに、相同性の極めて高い領域
に壊死死因子の生物活性発現のために必須の領域があり
、壊死死因子の活性中心部分であることを示唆している
。 ＡＧＡ　　ＴＣＡ　　ＧＣＴ　　ＴＣＴ　　ＣＧＧＡＣ
ＣＣＣＧ　　ＡＧＴ　　ＧＡＣＡＡＧＧＣＣＣＴＧ　　
ＡＧＴ　　ＧＡＣＡＡＧＧＧＣＧＴＣＴＴＣＣＡＧ　　
ＴＴＧ °４８０ ＧＡＧ　　ＡＡＧ　　ＧＧＴ　　ＧＡＣＣＧＧ（＊＊＊
）は終止コドンを示′ ネ＊＊ す。 ヒト癌壊死因子は、後記試験例で示すように、ウサギ癌
壊死因子とは免疫学的に全（交差せず、ウサギ癌壊死因
子とは免疫学的に区別し得るポリペプチドである。この
ように、ヒト及びウサギ癌壊死因子は全体としては高い
相同性を示すにもかかわらず、そのポリペプチドの性質
には明らかな相違がある。 このことは、壊死死因子の全アミノ酸配列がその生物活
性に必須ではな（、活性中心を構成する部分のアミノ酸
配列が同一であればその他の部分のアミノ酸配列が多少
変化し、それに伴ってポリペプチドの性質が変化しても
、壊死死因子の活性は保持されることを示している。 本発明により明らかにされたヒト癌壊死因子ポリペプチ
ドのアミノ酸配列やＤＮＡ塩基配列に関する知見に基づ
いて、逍伝子組換え技術の常法に従い、ヒト癌壊死因子
のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はヒト癌壊死因子
の活性中心部分を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ
あるいは一部修飾されたヒト癌壊死因子ＤＮＡの変異体
を得ることができるし、それらを用いてヒト癌壊死因子
活性を仔するポリペプチドを容易に生産することができ
る。また、本発明で明らかにされたＤＮＡ塩基配列の一
部を化学合成し、これをプローブとして用いることによ
り、対立逍伝子変異や逍伝子コードの縮重のあるヒト癌
壊死因子ＤＮＡも容易に入手でき、それらを用いてヒト
癌壊死因子活性を有するポリペプチドを生産することが
できる。更に、ヒト癌壊死因子ポリペプチドのアミノ酸
配列に基づいて、それをコードする塩基配列のＤＮＡを
全合成することも可能である。これらはすべて本発明の
範囲内に含まれる。 本発明のヒト癌壊死因子ポリペプチドは、優れた抗肚瘍
作用を有するので、抗腫瘍剤として悪性ＨＩＤの治療に
用いることができる。 以下に実施例及び参考例を挙げて本発明を更に具体的に
説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものでは
ない。 実施例 （蔦）ヒト癌壊死因子をコードするクローン化ＤＮＡを
検出するだめのプローブの：Ｊ４製 特願昭５８−２２８７９０号（特開昭Ｇｏ−１２０９９
０号）に開示されている方法（例えば参考例２の方法）
に従って、第１表（既出）に示すウサギ癌壊死因子をコ
ードするクローン化ＤＮＡを得た。このＤＮＡを制限酵
素１１ａａｒｌ及び＾ｖａＩを用いて切り出し、それぞ
れ第３３〜１２０番の８８　ｂｐから成るＤＮＡ断片と
第２８５〜５８３番の２９９　ｂｐから成るＤＮＡ断片
を得た。制限酵索へｖａ　Ｉで切り出した２９９ｂｐの
ＤＮＡ断片はウサギ癌壊死因子をコードする領域であり
、１ｌａｅｌｌで切り出した８８　ｂｐのＤＮＡ断片は
ウサギ壊死死囚子前駆体をコードする領域に相当する部
分である。 この２種のＤＮＡ断片を３２ｐで標識して、ヒト癌壊死
因子ｃ　ＤＮＡのクローニングのためのプローブとし、
（８）項で使用した。 （２）ヒト肺胞マクロファージからのｍＲＮＡ画分の車
間 ヒト肺からリン酸緩衝化生理食塩液を用いて肺胞マクロ
ファージを６．３〉・１０７個採取した。この肺胞マク
ロファージをＩθ％牛脂児血１ｉ１７含存のＲＰＭＩ−
Ｉｆ）４０培地に懸濁させてベトリデイツシュ（直径８
　＝ｓ　）に１枚当たり９　Ｘ　１０６個となるように
播き、３７°Ｃで５％炭酸ガス含合作気中、湿度９０〜
１００％で前培養した。１時間の前培養の後、工／トド
キシ／（大腸菌由来のりボボリサブカライド）。 ＴＩ’Ａ　（ホルボール−１２−ミリステート−１３−
アセテート）及びシクロヘキシミドをそれぞれ最終濃度
が１ｏμｇｌｌｌ、　ＩＯｎｇ／ｉｔ及び１μｇ１１と
なるように添加混和し、更に培養を継続した。４〜４．
５時間後（通算５〜５．５時間）に培養液を吸引除去し
、デイツシュ上に残ったマクロファージを０．６％ラウ
ロイルサルコシ／酸ナトリウムと６ｍＭクエン酸ナトリ
ウムを含む５Ｍグアニジルチオシアネート液で溶解し、
ホモジナイズした。このホモジネートを０．１ＭＥＤＴ
Ａ含ｆｒ５．１Ｍ塩化セシウム水溶液上に重居し、超遠
心分＋ｍ機（ＲＰＳ２７−２０一クー１日立製作所）を
用い２０，５００　ｒｐｍで２０時間遠心し、全ＲＮＡ
画分をペレツトとして得た。これを０．３５Ｍ　ＮａＣ
１゜２０ｍＭ　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ及び２０ｍＭ　ＥＤＴＡ
を含む７Ｍ尿素液の少量に溶解し、エタノール沈殿とし
て回収した。 全ＲＮＡとして１５９μｚｈ＜得られた。 この全ＲＮＡ画分を１　ｍＭ　ＥＤＴＡを含むＩＯｍＭ
Ｔｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣＮＵ街液（ｐＨ７，４＞（以下Ｔ
Ｅ液という）１肩１に溶解し、６５℃で５分間加熱した
。これにＮａＣ１溶液を０．５Ｍとなるように加えた後
、あらかじめ０．５ＭＮａＣ１を含むＴＥ液で平衡化し
たオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに付し、吸着したｐ
ｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡをＴＥ液で溶出することにより、
９　ｕｇｆ）　ｐｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡを得た。　この
ｐｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡを１．９　ｎｇ／ｎｌの０度で
蒸留水に溶解し、これをアフリカッメガエルの卵母細胞
１個当たり５０ｎ　ｌずつ注入し、前述の方法に従って
、卵母細胞中で翻訳された蛋白質のＬ−９２９細胞傷害
活性を測定した。その結果、１０個の卵母細胞のホモシ
ネ−）０．１ｍｌ中に６．６単位／ｍｌの活性を認め、
このＰｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡ調製品中にヒト癌＋ｓ死因
子のｍＲＮＡが含まれていることを確認した。 （３）ｃＤＮＡの合成 ■項で得られたｐｏｌｙ（＾）ｍＲＮＡを鋳型としてＧ
ｕｂｌｅｒらの方法［Ｇｅｎｅ、２５，２８３（１９８
３）］に従ってｃ　ＤＮ、Ａを合成した。 反応液量；４０μ！ ５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ８，３）　；
　１０ｍＭ　ＭｇＣ１２；１０ｍＭジチオスレイトール
；　４　ｍＭピロホスフェート　　す　ト　リ　ウ　ム
　；　　１．２５ｍＭ　　ｄＧＴＰ、　　　ｄＡＴＰ、
　　　ｄＴＴＰ；０．５ｍＭ　ｄＣＴＰ：０．１０７μ
Ｍ　ａ−”Ｐ−ｄＣＴＰ（比活性３０００Ｃ＋／ｍｍｏ
ｌｅ）　；　４μｇオリゴ（ｄＴ）　１２−Ｉｌｌ　；
　６μｇ　ｐｏｌｙ（＾）ｍＲＮＡ　；　１２０単位ト
リ骨償性白血病ウィルス由来逆転写酵素。 ４３℃で３０分間反応させた後、ＥＤＴＡを加えて反応
を停止させ、フェノール−クロロホルム混液（１：　１
）で抽出し、その水層に酢酸アンモニウムを最終濃度２
．５Ｍになるように加え、エタノールにより反応生成物
（単鎖ｃＤＮＡ　−ＲＮＡ複合体）を沈殿させた。この
単鎖ｃＤＮＡ−ＲＮＡ複合体を下記組成の反応緩衝液１
００μｌに溶解した。 反応緩衝液組成： ２０ｍＭ　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣ１ｍｍ液液ｐＨ７，
５）　；　５　ｍＭ　ＭｇＣ１２；１０ｍＭ　（Ｎ）１
４）　２ｓＯａ　；　ｌ００ｍＭ　ＫＣ１；　０．１５
ｍＭβ−＝＝＋チンアミド　アデニ／　ジヌクレオチド
；５０ｎｇ／■１ウシ血清アルプミ／；４０ｎＭ　ｄＧ
ＴＰ、　ｄＡＴＰ、　ｄＴＴＰ。 ｄＣＴＰ；　０．９単位大腸閏リボヌクレアーゼＩ−１
；　２３単位大腸閑ＤＮＡポリメラーゼｌ０ １２℃で６０分間、続いて２２℃でＧＯ分間反応させた
後、ＥＤＴＡを加えて反応を停止させ、上記と同様にフ
ェノール−クロロホルム混液で抽出し、エタノールによ
り沈殿させて二重鎖ｃ　ＤＮＡを得た。 （４）オリゴ（ｄＣ）テール付加ｃ　ＤＮＡの調製（３
）項で得られた二重鎖ｃ　ＤＮＡに次の組成の反応緩衝
液１００μｌを加え、３７℃で３０分間反応させ、二重
鎖ｃＤＮＡにオリゴ（ｄＣ）テールを付加させた。 反応緩衝液； ２　ｍＭ　ＣＯＣｌ２．０．２ｍＭジチオスレイトール
、０．１ｍＭ　ａ−”Ｉ’−ｄｃＴＩ’（比活性３　Ｃ
ｉ／ｍｍｏｌｅ）及び１０！１１．位ターミナルデオキ
７ヌクレオチジルトランスフェラーゼを含有する１００
ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７，２）。 反応はＥＤＴＡ水溶液を添加して停止させ、フ。 ノール−クロロホルム混液で抽出し、オリゴ（ｄＣ）テ
ール付加ｃ　ＤＮＡをエタノールにより沈殿させ回収し
た。これをｌ０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１ＣＨ８ｆ）液液（
ｐｌ＋７．４＞。 １　ｍＭ　ＥＤＴＡ及び１００ｍＭ　ＮａＣ１を含む水
溶液に１１当たり２μｇのオリゴ（ｄＣ）テール付加ｃ
　ＤＮＡを含むように溶解した。 ■オリゴ（ｄＧ）テール付加プラスミドｐＩＩＲ３２２
ＤＮＡの調製 ２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ）１衝液（ｐＨ７，４）　
、　ｌ０ｍＭ　ＭｇＣ１２゜５０ｍＭ　（ＮＨａ）　２
３０４及び１■１当たり０．１．のウシ血１ｎアルフミ
／を含む水溶液１００μｊ！にｐＨＲ３２２を１０８ｇ
溶解し、制限酵素Ｐｓｔ　Ｉエンドヌクレアーゼ１５単
位を加え、３７℃で１時間反応させた。反応終了後、反
応液を７エノールークロロホルム混液で抽出し、水層か
らエタノール沈殿によってＤＮＡを回収した。得られた
ＤＮＡを前述のオリゴ（ｄＣ）テール付加に用いた水溶
液（但し”Ｐ−ｄＣＴＰの代わりに’Ｉ（−ｄＧＴｒ’
を含む）２００μ！に溶解し、ターミナルデオキシヌク
レオデジルトランスフェラーゼ８０単位を用いて３７℃
で２０分間反応させ、約１０〜１５個のｄＧ残基を取り
込ませた。反応液をフェノール−クロロホルム混液で抽
出し、水層からエタノール沈殿によってオリゴ（ｄＣ）
テール付加プラスミドｐｎＲ３２２　ＤＮＡを回収した
。これをオリゴ（ｄＣ）テール付加ｃ　ＤＮＡの場合と
同様の緩衝液に１１１当たり２０μｇのオリゴ（ｄＣ）
テール付加プラスミド１Ｒ３２２１）Ｎ　Ａを含むよう
に溶解した。 （６）組換え体プラスミドの作製 （４）項で得られたオリゴ（ｄＣ）テール付加ｃＤＮＡ
溶ａ１２０μｐを、５）項で得られたオリゴ（ｄＣ）テ
ール付加ｆｌＲ３２２ＤＮＡ　１Ｂ　液＋２０μｆｆ、
！−’ＫＡ　合Ｌ、６５℃で５分間、５７°Ｃで１２０
分間インキュベートしてアニーリングを行い、組換え体
プラスミド溶液を調製した。 （力形質転換体の選択 （６）項で得られた組換え体プラスミド溶液を用い、Ｅ
、ｃｏｌｉχ１７７６株を形質転換させた。即ち、Ｅ、
ｃｏｌｉχ１７７６株（八ＴＣＣＮｏ、　３１２４４）
を、ジアミノピメリン酸１００μｇ１１及びヂミジ／４
０μｇ１ｍ＋を補ったＬ−プロス２０１中、３７℃で吸
光度（００Ｏｎ園）が０．５となるまで培養し、菌体を
４℃で遠心して集め、５０ｍＭＣａＣ＋２含ｆＴ　ｌ０
ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ　−１１ＣＩ緩衝液（ｐＨ７，３）
　ｌ０ｗ１に分散し、４℃で再度遠心して沈殿させた。 集めた菌体を同じ緩衝液２１に分散し、０℃で５分間静
置した。この分散液０．２　ｍｌに（６）項で得られた
組換え体プラスミド溶液０．１■１を添加混合し、０℃
で１５分間静置し、更に４２℃で２分間保持した後、前
の培養で用いたのと同一組成のし一ブロス０．５１を加
えて１時間振公培養を行った。この培養液の一部を皐り
、前述の成分の他にテトラサイタリン１５μｇ／ｍｌを
含むＬ−ブロス寒天平板に広げ、３７℃で約１２時間培
養し、テトラサイクリン耐性菌を選択してｃ　ＤＮＡラ
イブラリーを作製した。 （８）クロｍ；７グ （７項で得られたｃ　ＤＮＡライブラリーについて、ヒ
ト癌壊死因子をコードするｃ　ＤＮＡを含むプラスミド
を持つ形質転換体をスクリーニングするため、（１）項
で得られたウサギ癌壊死因子をコードするＤＮＡの制限
酵素＾ｖａＩで切り出した断片（２９９ｂｐ）の３２ｐ
標識物をプローブとし、コロニー・ハイブリダイゼータ
３ン試験をｌ１ａｎａｈａｎらの方法［Ｇｅｎｅ、　Ｉ
ｏｎ０３（１９８０＞］に従って行った。約２万個のコ
ロニーから、この標識プローブと強く結合する塩基配列
を含む組換え体プラスミドを持つ形質転換体４３個を選
び出した。 更に、この４３個のコロニーについて、制限酵素１１ａ
ｃｌｌで切り出したウサギ壊死死囚子コード領域の」二
流に相当するＤＮＡ断片（８８ｂｐ）のｆｆ２ｐ標識物
をプローブとし、二次スクリーニングを行い、このプロ
ーブと強くハイブリダイズする６個のコロニーを選び出
した。この２回のスクリーニングにより、ウサギ癌壊死
因子をコードするＤＮＡ塩基配列及びその上流部分と相
同性の高い塩基配列を含むＤＮＡを得た。 （９）形質発現 （８）項で選ばれた６個のクローン（プラスミド番号１
）ＴＩＴＮＦ−１，−４，−５，−１３，−２２，−２
６）から、それぞれの組換え体プラスミドを取り出し、
Ｅ、ｃｏｌ＋１１１１１０１株（ＡＴＣＣＮｏ、　３３
０９４）を宿主として形質転換体を得た。それぞれの形
質転換体について、Ｎａｇａｔａらの方法［Ｎａｔｕｒ
ｅ、２８４．３１０（１９８０）］に準じて５０１培養
を行った。培地にはＬｎプロスを用いた。吸光度（Ｇｏ
ｏｎ曹）が約０．８になるまで培養し、約３〜５×１０
１θ個の菌体を集めた。０．１％リゾチームを含む５０
ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ　−ＴＩＣＩ緩衝液（ｐｌ＋８．０
＞と３０ｍＭ　ＮａＣ１より成る溶液の１■Ｉに菌体を
懸濁させ、氷水中で３０分間静置した後、凍結融解を６
回繰返して菌体を破壊し、遠心分離して菌体抽出液を得
た。それぞれの形質転換体から得られた抽出液について
、Ｌ−９２９細胞傷害活性を測定した結果、プラスミド
ｐｌ−ＩＴＮＦ　−１３による形質転換体の抽出液に１
８０．１単位１１の活性を認めた。 （ＩＩ）クロー７化ＤＮＡの塩基配列の決定（９）項で
選択された組換え体プラスミドＰＩＩＴＮＦ−１３によ
る形質転換体をＬＩ３グロスで培養して菌体を得た。こ
の菌体をＷＮｋｉｅらの方法［Ｎｕｃｌｅｉｃ＾ｃ＋ｄ
ｓ　Ｒａｓ、、７，８５９（１９７９）］に従って処理
し、プラスミドＤＮＡを得た。このプラスミドＤＮＡを
制限酵素Ｐｓｔ　Ｉで分解し、分離精製してクローン化
ＤＮＡを得た。このクローン化ＤＮＡ断片を種々の制限
酵素で分解し、１０種の制限酵素断片について、それぞ
れの塩基配列をＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法により脱
リン酸化、Ｐによる末端標識、塩基特異的化学分解反応
、ゲル電気泳動及びオートラジオグラフィーを行い決定
した。 図面に塩基配列決定に用いた制限酵素の切断部位と塩基
配列を決定した方向及び範囲（矢印で表示）を示す。ロ
ゴ３部分はヒト癌壊死因子前駆体ポリペプチドをコード
する領域を示す。 その塩基配列及びこの塩基配列から翻訳されたアミノ酸
配列は第４表の通りである。ヒト癌壊死因子のポリペプ
チドをコードする領域は、第１表に示したウサギ癌壊死
因子をコードする塩基配列との相同性に基づいて推定し
た。即ち、ヒト壊死死囚子ポリペプチドは、第４表の第
２３５〜２３７番のＴＣＡのコドン（Ｓｅｔに対応）か
ら始まり、第６９７〜６９９番のＣＴＧ　（Ｌｅｕに対
応）で終わり、１５５残基のアミノ酸から成っている。 Ｃ末端のロイン／のコドンに続いてＴＧＡの終止コドン
がある。塩基配列第１〜２３４番はヒト癌壊死因子の前
駆体をコードするために必要な配列と考えられる。 第４表 ＣＴＣＣＡＣＣＣＴＣＴＣＴＣ ＧＡＣＣＣＡＣＧＧ −１０−Ｉ ＣＣＣＴＧＧＡＡＡＧＧＡＣＡＣＣ ＴＣＴＣＧＡＡＣＣＣＣＧＡ（ Ｓｅ　ｒＡｒｇＴｈｒＰｒｏｓ（ １′ 〕 １す０１− ＣＡＴＧＴＴＧＴＡＧＣＡＡＡＣ Ｈｉ　５ＶａｌＶａｌＡ１　ａＡｓｎ （”’：Ｔ（”：ＣＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＣＣＣＴＣＡ
ＡＧＣＴＧＡＧＧＧＧ ＰｒｏＧｌ　ｎＡ１　ａＧｌ　ｕＧｌ　ｙＡＡＣＣＧＣ
ＣＧＧＧＣＣＡＡＴ ＡｓｎＡｒｇＡｒｇＡｌ　ａＡｓｎ ＧＧＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＡ Ｇｌ　ｙＶａｌＧｌ　ｕＬｅｕＡｒｇ ＧＴＧＣＣＡＴＣＡＧＡＧＧＧＣ Ｖａｌ　ＰｒｏＳｅ　ｒＧｌ　ｕＧｌ　ｙＡＴＣＡＧＣ
ＣＧＣＡＴＣＧＣＣ ＬｅｕＬｅｕＴｈｒＨｉ　５Ｔｈｒ Ｉ　Ｉ　ｅＳｅ　ｒＡｒｇＩ　ｌ　ｅＡｌａ’ＧＡＣＣ
ＧＡＣＴＣＡＧＣＧＣＴ ＡｓｐＡｒｇＬｅｕＳｅｒＡ１　ａ ＧＡＧＡＴＣＡＡＴＣＧＧＣＩ ＧｌｕＩ　１ｅＡｓｎＡｒｇＰ ＧＣＣＧＡＧＴＣＴＧＧＧＣ ＡｌａＧｌｕＳｅｒＧｌｙＧ ＡＴＴＧＣＣＣＴＧＴＧＡＧ（ Ｉ　ｌ　ｅＡＩ　ａＬｅｕ＊零＊ ＣＴＴＣＣＣＡＡＡＣＧＣＣ’ （＊＊＊）は終止コドンｐ。 ＣＣＧＡＣＴＡＴＣＴＣＧＡＣＴＴＴ ｒｏＡｓｐＴｙｒＬｅｕＡｓｐＰｈ、ｅＣＡＧＧＡＣＧ
ＡＡＣＡＴＣＣＡＡＣ ｒＣＣＣＣＴＧＣ 訃示す。 （以下余白） 参考例１ 抗つサギ厚壊死囚子抗体の作製 特願昭５８−２２８７９０号（特開昭００−１２０９９
０号）に開示されている方法（例えば参考例３の方法）
に従って得た、精製ウサギ壊死死囚子１．９Ｘ　１０５
単位を含むｆｇ液を等量のフロイントの完全アジュバン
トで乳濁化し、それをモルモットの背部皮下数カ所に注
射した。その後、■、３及び６週後に同様の方法で免疫
した。更に８迎後に、同Ｊ＋ｔの精製ウサギ癌壊死因子
を水酸化アルミニウムゲルとともに腹腔内に注射した。 最初の免疫から９週後に心臓より全採血し、遠心分離に
より血清を分Ｍｉすることによって抗つサギ壊死死囚子
抗体を含む抗血１’ｉ７を得た。 この抗血ｔ？７を、正常ウサギ血清成分をカップリング
させたセファ０−ス４１１（ファルマシア社）カラムに
３回繰返して通過させることによりウサギの血１？？成
分に対する抗体を完全に除去し、ウサギ癌壊死因子に対
する特異抗体のみを含む精製抗血ｌｎを得た。この抗血
清は、免疫電気泳動法及びゲル内二重拡散法により精製
ウサギ癌壊死因子との間にのみ単一の沈降線を形成した
。この精製抗血清を約ｏｏ　、　ｏｏｏ倍希釈したもの
は、ウサギ癌壊死因子のＬ−０２９細胞傷害活性５００
単位を５０％中和する能力をイｒする。 参考例２ （１）ウサギ肺胞マクロファージからのｍＲＮＡ分画の
単離精製 ウサギ（体重的２．５ｋｇ）にプロピオニバクテリウム
　アクネ７、　（Ｐｒｏｐｉｏｎ＋ｂａｃｔｅｒｉｕｗ
　ａｃｎｅｓ）死菌体を１羽当り１００■の投与量で静
脈内に注入し、８０後に屠殺した。直ちに開胸気管切開
し、気管内に挿入したチューブを介してリン酸暖衝化生
理食塩液を用い肺洗浄を繰返し、肺胞マクロファージを
採取した。１２羽のウサギより約３　Ｘ　１０’個の肺
胞マクロワ１−ジが得られた。この肺胞マクロファージ
を１０％牛脂児血清含有のＲ１”Ｍｌ−１６４０培地に
懸濁させてベトリディッシュ（直径８　ｃｓ　）に１枚
当り２　Ｘ　１０７個となるように播き、３７℃で５％
炭酸ガス含有空気中、湿度９０〜１００％で前培養した
。１時間の前培養の後、エンドトキシン（大腸菌由来の
りボボリサッカライド）。 ＴＩ’Ａ（ホルボール−１２−ミリステート−１３−ア
セテート）及びンクロへキシミドをそれぞれ最ｈ％　Ｃ
度が１０　ｔｔ　ｇ／　＊　Ｉ　、　ＩＯｎｇ／　ｗ　
Ｉ及びｌμｇ／ｍｌとなるように添加混和し、更に培養
を継続した。４〜４．５時間後（通算５〜５．５時間）
に培養液を吸引除去し、デイツシュ上に残ったマクロタ
１−ジを０．０％ラウロイルサルコシン酸ナトリウムと
６ｍＭクエン酸ナトリウムを含有する５Ｍグアニジルグ
ーオシアネート液で溶解しホモジナイズした。このホモ
ジネートを０．ＩＭ　ＥＤＴＡ含有５．７Ｍ塩化セシウ
ム水溶液上にｒ３．層し、超遠心分離機（ＲＩ）　Ｓ　
２７−２日−ター１日立製作所）を用い２０　、５００
ｒｐ−で２０時間遠心し全ＲＮＡ画分をベレットとして
得た。これを０．３５Ｍ　ＮａＣＩ、　２０ｍＭ　Ｔ　
ｒ　ｉ　ｓ及び２０ｍＭ　ＥＤＴＡを含む７Ｍ尿素液の
少−１に溶解し、エタノール沈殿として回収した。１２
羽のウサギより全ＲＮＡとして５．２Ｍｇが得られた。 この全ＲＮＡ画分を１　ｍＭ　ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−１１ｃＩＩＷ街液（ａｌｌ　７．４）　　（
以下ＴＥ液という）２−１に溶解し、６５℃で５分間加
熱した。これにＮａＣ１溶液を０．５Ｍとなるように加
えた後、あらかじめ０．５Ｍ　ＮａＣ１を含むＴＥ液で
平衡化したオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに付し、吸
着したｐｏｌｙ（＾）ｍＲＮＡをＴＥ液で溶出すること
により、３１Ａｕｇのｐｏｌｙ（＾）ｍＲＮＡを得た。 ここで得たｐｏｌｙ（＾）ｍＲＮＡの２００μｇをアガ
ロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％、８Ｍ尿素存在下、
ｐＨ４）に付し、その分子サイズに従って７つの画分に
分け、ゲルを融解（７０°Ｃ１１０分間）させた後、水
飽和フェノールによる抽出とクロロホルムによる抽出の
のち、エタノールにより沈殿させて各両分よりｐｏｌｙ
（＾）ｍＲＮＡを回収した。各画分のｐｏｌｙ（＾）ｍ
ＲＮＡについてアフリカッメガエルの卵母細胞を用いる
方法でウサギ癌壊死因子ｍＲＮＡ　ｆｌを測定し、分子
サイズとして１．６〜２．７ｋｂに相当する両分にウサ
ギ癌壊死因子ｍＲＮＡを高濃度に回収した。この精製ｐ
ｏｌｙ（＾）ｍＲＮＡの比活性は約１　、２３０単位／
　ｐｇ　ＲＮＡであり、未精製ｐｏｌｙ（＾）ｍＲＮＡ
　ＵＲ製品の比活性約３２０単位／μｇ　ＲＮＡに比べ
て約４倍にＩＯ縮された。 ここで得られた精！ｉ！！ｐｏｌｙ（＾）ｍＲＮＡを以
下の実験に用いた。 し１ｃＤＮＡの合成 ｆ＋’ｉ製ｐｏｌｙ（八）ｍＲＮＡ　４　ｔｔＨを用い
以下に示す条件でｃ　ＤＮＡを合成した。 反応液量；１００μ！ ５０ｍＭ　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ　−Ｉｌｃ　ＩＧ衝液液　ｐ
Ｈ８，３）　；　ＩＯｍＭＭＨＣＩ　２ニア０ｍＭ　Ｋ
ＣＩ　：　１　ｍＭジチオスレイトール；０．５ｍＭ　
ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴｒ’、、ｄＧＴ、ｒ’（但
しｄＣＴＰは３２■）で標識、比活性４．４Ｘ　１０’
　ｃｐｓ／　ｎｍｏｌｅ）　：　３μｇオリゴ（ｄＴ）
　１２〜＋ｇ、　８０単位トリ骨償性白血病ウィルス由
来逆転写酵素。 ４３°Ｃで８０分間反応させた後、　ＥＤＴＡ水溶液で
反応を停止させた。フェノール−クロロボルム混ｍ（１
：１）によりｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ複合体を抽出し、エタ
ノールにより沈殿させ回収した。更に、アルカリ加温処
理することによりｍＲＮＡを分解除去した後、合成され
た単鎖ＣＤＮＡをエタノールにより沈殿させ回収した。 この単鎖ｃ　ＤＮＡの沈殿を下記組成の反応緩衝液４０
μｌに溶解した。 反応緩衝液； ０．５ｍＭ　ｄＡＴｒ’、　ｄＴＴＩ’、　ｄＧＴ１’
、　ｄＣＴＰ；　５　ｍＭＭｇＣＩ２　；　７０ｍＭ　
ＫＣＩ　；　１．５ｍＭβ−メルカプトエタノール；８
単位大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（ラージフラグメント
）を含有する０、１Ｍヘペス（ｌｌ０ＰＱｓ）　緩衝Ｇ
　（ｐＨＯ，９）。 １５℃で２０時間反応させ二重鎖ｃ　ＤＮＡを合成した
。反応液にドデシル硫酸ナトリウム水溶液を加えて反応
を停止させ、二重鎖ｃ　ＤＮＡをフェノール−クロロホ
ルム混液で抽出し、エタノールにより沈殿させ回収した
。 得られた二重鎖ｃ　ＤＮＡの沈殿を、５０ｍＭ酢酸ナト
　リ　ウ　ム　（ＰＩ−１４，５）、　　１　　ｍＭ　
　ＺｎＳＯ４，２００ｍＭ　　ＮａＣ＋。 ０．５％グリセロール及びＳ１ヌクレアーゼ０．５単位
を含有する水溶液１００μ！に溶解し、３７℃で２０分
間反応させてヘアピン構造を開裂させた。反応はＥＤＴ
Ａ水溶液を添加して停止させ、フェノール−クロロホル
ム混液で抽出し、更にエーテルで再抽出した後、エタノ
ールにより沈殿させｃ　ＤＮＡを回収した。 （３）オリゴ（ｄＣ）テール付加ｃ　ＤＮＡの調製上記
により得られた二重鎖ｃ　ＤＮＡに次の組成の反応緩衝
液１００μ！を加え３７℃で２０分間反応させ、二重鎖
ｃＤＮＡにオリゴ（ｄＣ）テールを付加させた。 反応緩衝液； １　ｍＭ　ＣＯＣｌ２．０．１ｍＭジチオスレイトール
。 ０．２ｕｙポリ（＾）、　Ｏ，ＩｍＭ　’ＩＩ　−ｄｃ
Ｔｒ’（比活性５４００ｃｐ＊＃＋■ｏｆ）及び１０！
ｌ’、位ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフ
ェラーゼを含イｒする１３０ｍＭカコジル酸ナトリウム
−３０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ　−１１ＣＩ　緩衝液（ｐＩ
ＩＯ，８）。 反応はＥＤＴＡ水溶液を添加して停止させ、フェノール
−クロロホルム混液で抽出し、更にエーテルで再抽出し
た後、オリゴ（ｄＣ）テール付加ｃ　ＤＮＡをエタノー
ルにより沈殿させ回収した。 これをｌ０ｍＭ　Ｔｒ　ｉｓ　−ＨＣ１緩衝液（ＰＨ７
，４＞、　１　ｍＭＥＤＴＡ及びｌ００ｍＭ　ＮａＣ１
を含む水溶液に１■１当り０．２μｇのオリゴ（ｄＣ）
テール付加ｃ　ＤＮＡを含むように溶解した。 （４）オリゴ（ｄａ）テール付加プラスミドｐＩ３Ｒ３
２２ＤＮＡの調製 ２０ｍＭ　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣ１ｍｍ液液　ｐｌＩ
７．４）　、　１０ｍＭＭｇＣ１２，５０ｍＭ　（Ｎｌ
（４）　２３０４及び１ｍｌ当り０．１■のウシ血清ア
ルプミ／を含む水溶液１００μｌにｐｎＲ３２２を１０
ａｚ溶解し、制限酵素１’５ｔ（ｚ７ドヌクレアーゼ１
５単位を加え、３７℃で１時間反応させた。反応終了後
、反応液をフェノール抽出し、水射からエタノール沈殿
によってＤＮＡを回収した。得られたＤＮＡを前述のオ
リゴ（ｄＣ）テール付加に用いた水溶液（但し’１４−
　ｄｃＴＩ’の代りに’Ｈ−ｄＧＴＰを含む）２００μ
！に溶解し、ターミナルデオキシヌクレオチラルトラン
スフェラーゼ８０単位を用いて３７°Ｃで２０分間反応
させ、約１０〜１５個のｄＧ残基を取り込ませた。反応
液を水飽和フェノール−クロロホルム混液で抽出し、水
層からエタノール沈殿によってオリゴ（ｄＣ）テール付
加プラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡを回収した。これをオ
リゴ（ｄＣ）テール付加ｃＤＮＡの場合と同様の緩衝液
に１璽１当り２μｇのオリゴ（ｄＣ）テール付加プラス
ミド１Ｒ３２２ＤＮＡを含むように溶解した。 ６）組み換え体プラスミドの作製 オリゴ（ｄＣ）テール付加ｃ　ＤＮＡ溶液５０μｌをオ
リゴ（ｄｃ）テール付加ｐ１１　Ｒ３２２ＤＮＡ溶液５
０μｌと混合し、６５°Ｃで１０分間、５７℃で１２０
分間、４５℃で６０分間、３５°Ｃで６０分間及び室昌
で６０分間インキュベートしてアニーリングを行い、組
み換え体プラスミド溶液を調製した。 （６）形質転換体の選択 上記で得られた組み換え体プラスミド溶液を用い、Ｅ、
ｃｏｌｉχｌ７７６株を形質転換させた。即ち、Ｅ、ｃ
ｏｌｉχ１７７６株を、ジアミノピメリン酸＋００ｕＨ
／−１及びチミジン４０μｇ／■１を補ったＬ−ブｒＪ
ス２０１中、３７℃で吸光度（Ｃｏｏｎｓ＞が０．５と
なるまで培養し、菌体を冷却器付遠心分子ｔｔ機で集め
、５０ｍＭｃａｃ１２含イｒ　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１
１ＣＩ　ｔｉｌｔ衝液（液液７．３）ＩＯｍｌに分散し
、０°Ｃで再度遠心して沈殿させた。集めた菌体を同じ
緩衝液２１に分散し、０℃で５分間静置した。この分散
液０．２　ｍｌに上記組み換え体プラスミド溶液０．１
１を添加混合し、０℃で１５分間り置し、更に４２℃で
２分間保持した後、前の培養で用いたのと同一組成のＬ
−ブロス０．５■１を加えて１時間振盪培養を行った。 この培養液の一部を取り、前述の成分の他にテトラサイ
クリン１５μｇ／−１を含むし一ブロス寒天平板に広げ
３７℃で約１２時間培養し、テトラサイクリン耐性閏を
選択してｃ　ＤＮＡライブラリーを作製した。 ■ハイプリダイイー２ｇ／試験 前記のｃ　ＤＮＡライブラリーについて、ウサギ癌壊死
因子をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドを持つ形質
転換体をスクリーニングするため２２　ｐ標識ｃＤＮＡ
プローブを用い゛るコロニー・ハイブリダイゼーシコン
試験をハナハ７　（ｌ１ａｎａｈａｎ）らの方法［Ｇｅ
ｎｅ、１０．０３（１９８０）］に従って行った。 ３２Ｐ　Ｍ’３　識ｃＤＮＡプローブは、誘導プラス及
ヒマイナス肺胞マクロファージより上記（１）項の方法
で得たｍＲＮＡを鋳型として、（２）項の方法で合成し
た。但し、”　Ｐ　−ｄＣＴＰは高放射能比活性のもの
を用い、高濃度に標識した。この試験によりｄ　ＪｆＪ
プラスのプ「１−ブと強く結合し、誘導マイナスのプロ
ーブとはハイブリダイズしない塩基配列を含む組み換え
体プラスミドを仔する形質転換体を選別した。約２万個
のコロニーから５０個ノコロニーが選び出された。 次いで、これらの選択された菌株についてハイブリダイ
ゼーンヨン・トランスレーション試験を“モレキュラー
　りローニンーグ”　（Ｍａｎｉａｔｉｓ。 Ｔ、、ｅｔ　ａｌ、、（ｃｄ）“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　
Ｃｌｏｎｉｎｇ”　、３２９（１９８２）＋Ｃｏ１ｄ　
Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、、）に記載の
方法に従って行った。それぞれの形質転換体よりプラス
ミドＤＮＡ　ヲｆｉｌｌ　出し、ニトロセルロースフィ
ルター上に加熱変性させたのち固定し、これに上記（１
）項で得たウサギ壊死死囚子ｍＲＮＡを含むｐｏｌｙ（
＾）ｍＲＮＡ画分を加え、５０°Ｃで１８０分間反応さ
せ、／１イブリダイゼーショ／を行った。結合したｍＲ
ＮＡを溶出回収した後アフリカッメガエルの卵母細胞に
注入し、回収されたｍＲＮＡがウサギ壊死死囚子ｍＲＮ
Ａであるか否かを検定した。この試験により、上記で選
択された２０個の形質転換体よりウサギ壊死死囚子ｍＲ
ＮＡと強くハイブリダイズするｃＤＮＡを含むプラスミ
ドを持つ菌株３個を見いだした。そのうち最も長いｃＤ
ＮＡ　（約７５０ｂｐ）ライｒ　ｔ　Ｚプラスミドより
、制限酵町ｄｅ　Ｉ　１？　ＤＮＡ断片を切り出し、二
次スクリーニング用のプローブとした。このＤＮＡ断片
を３２　ｐで標識し、上記（６）項で得たｃ　ＤＮＡラ
イブラリーについて再度コロニー・ハイブリダイゼーシ
ｑノ試験を行い、標識プローブと強く結合するｃ　ＤＮ
Ａを含むプラスミドを持つ形質転換体を選んだ。ｃ　Ｄ
ＮＡライブラリーの約６万個のコロニーのうち９８個が
陽性コロニーであった。これらからｃ　ＤＮＡを制限酵
素Ｐｓｔ　Ｉで切り出し、そのサイズをポリアクリルア
ミドゲル電気泳動で調べ、１ｋｂｐ以上のサイズを「す
る１７個のクロー／を選び出した。これらのうち最も大
きなｃ　ＤＮＡを含む形質転換体（菌体番号：ＲＴＮＦ
８０２　、クローン化ＤＮＡ番号：　ｆ）ＲＴＮＦ８０
２）について、クローン化ＤＮＡを’Ｆ−ｎｔし、後述
の方法で塩基配列を決定した。 （８）り

【Ｊ−７化１）Ｎ　Ａの塩基配列の決定（９項
で選択された菌株（ＲＴＮＰ８０２）をジアミ７ピメリ
ン酸及びヂミジ／を添加したし一ブロスで培養して菌体
を得た。この菌体をウィルキー（Ｗｉｌｋｉａ）らの方
法［Ｎｕｃｌｅ＋ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒａｓ、、７　、８
５９（＋９７９＞１に従って処理し、プラスミドＤＮＡ
を得た。このプラスミドＤＮＡを制限酵素Ｐｓｔ　Ｉで
分解し、精製分離してクロー／化ＤＮＡを得た。このク
ローン化ＤＮＡ断片を種々の制限酵素で分解し、適当な
制限酵素断片についてそれぞれの塩Ｊλ配列をマキサム
−ギルバー）　（Ｍａに＆■−Ｇｉｌｂｅｒｔ）法によ
り脱リン酸化、Ｐによる末端標識、塩基特異的化学分解
反応、ゲル電気泳動及びオートラジオグラフィーから決
定した。 その塩１人品列は第１表の通りである。 参考例３ ウサギ癌壊死因子のＱｊ離精製 ウサギ（体重２．５〜３．０ｋｇ）にプロピオニバクテ
リウム　アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｔｕ
ｍ　ａｃｎｅｓ）死菌体５０■ｇを耳静脈より注射した
。８日後にエンドトキシン（大腸菌由来のりボボリサフ
カライド）１００μｇを耳静脈より注射し、２時間後に
心臓より全採血した。採取した血液に＋００■１当り１
００単位のヘパリンナトリウムを加えた後、５，０ＯＯ
ｒｐ■で３０分間冷却遠心操作を行い、血球及び不溶固
形物を除去した。４００羽のウサギより３，０００１１
１位ｌ−１の力価をイ［する血染２４１が得られた。 この血漿２４１にＥＤＴＡ２４ｇ及びセライト２４０ｇ
を加え１時間撹拌した後、孔径３μ、１μ及び０．２μ
のフィルターで順次濾過した。 ′／２液２４！に０．０４Ｍ　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ　−１１
ＣＩ　緩衝ン夜（ｆ）ＩＩ　７．８）＋２１’を加えた
後、Ｏ，ＩＭ　ＮａＣＩを含む０．０４Ｍ　Ｔｒ　ｉ　
５−ＴＩＣ＋緩衝液（ｆ）８７．８）で十分に平衡化し
たＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂ　（ファルマシア
社）のカラム（２７Ｘ　４５ｃ■）に徐々に付した。次
いでカラム平衡化緩衝液７５１及び０．１５Ｍ　ＮａＣ
＋を含む０．０４Ｍ　Ｔｒｉｓ−１１ＣＩ　緩衝Ｚ　（
ＰＩ（７，８＞５０１で順次洗浄後、０．１８Ｍ　Ｎａ
ＣＩを含む０．０４Ｍ　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣ１緩衝
液（ｐＨ７，２）を用いて溶出した。溶出液は８１ずつ
分画して活性画分を集めた。この活性画分に同容ｌｉｔ
の０．０４Ｍ　Ｔｒｉｓ−１１ＣＩ　緩衝液（ｐｌ−１
７，８）を加えて希釈した後、ＤＩＣＡＥ−セファ０−
スＣＬ−６Ｂのカラム（ＩＯＸ　１３ＣＩ＋＞に付した
。次いで０．ＩＭＮａＣＩを含む０．０４Ｍ　Ｔ　ｒ　
ｉ　ｓ　−１１ＣＩ　　緩衝液（ｐＴＩ７．８）１１を
用いて洗浄した後、Ｏ，１８Ｍ　ＮａＣＩを含む０．０
４Ｍ　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ　−１１ＣＩ　緩衝液（ｐＨ７，
２）５１を用いて溶出した。溶出液は２５０１ずつ分画
して活性画分を集めた。 次にこの溶出液を容器に移し７０℃の湯浴中に浸し、撹
拌しながら溶出液の温度が６０℃になるまで加熱した。 その後６０℃の別の湯浴に移し、３０分間加熱処理した
後、速やかに４°Ｃに冷却した。加熱処理した溶液は、
限外濾過により濃縮した。 ０．１Ｍ　ＮａＣ＋を含む０．００５Ｍリン酸緩衝１ｉ
ＩＥ（ｐＩＩ７．４）で十分に平衡化したセファクリル
Ｓ−２００（ファルマシア社）のカラム（５Ｘ　８０ｃ
■）に」ユ記０縮液を付し、同緩衝液で溶出した。４０
１ずつ分画して活性画分を採取し、限外濾過により濃縮
した。 ゲル濾過によって得られた活性画分の０縮液をＺｎ２“
キレートセファ０−スカラムに付した。 ポラス（Ｐｏｒａｔｈ）らの方法（Ｎａｔｕｒｅ、２５
８，５９８（１９７５＞）で得られたキレートセファ０
−ス（イミノジ酢酸固定化樹脂）を充填したカラム（１
，６Ｘ　２０ｃ■）に、１ｍｇ／ｍｌの塩化亜鉛水溶液
１２０１を流した。次いでＯ，ＩＭ　ＮａＣｌを含む０
．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）で十分に平衡化し
た後、前工程で得られた濃縮液を付し、同緩衝液で溶出
した非吸着画分を採取した。活性はこの両分にほとんど
が回収された。　前精製工程で得られた活性両分を０縮
し、０．１５Ｍ　ＮａＣ１を含む０．００５　Ｍす／酸
緩液液（ｐＨ７，４＞で十分に平衡化したトヨバールＩ
■Ｗ−５５（東洋ソーダ株式会社）のカラム（＋、５Ｘ
　９０ｃｍ）に付した。同緩衝液で溶出し活性画分を採
取した。全ｆ＋’ｔ　’Ａ工程を通しての活性の回収率
は６０％、精製度は？、５Ｘ　１０’倍であった。 このようにして得られた精製ウサギ癌壊死因子の比活性
はＯ，ＯＸ　１０’単位／　ｍｇｆｆｔ白質であった（
活性単位の定義は特開昭５８−１７４３３０号のそれと
同じである）。また、マウスに移植したＭｅｔｈ＾肉１
）Ｒを用いる生物評価において、１匹当り３，０００〜
５，０００！Ｉｊ位を静脈内に投与した場合の活性は（
＋）以上であった。 試験例 ヒト癌壊死因子の免疫学的性質 実施例の（９）項で得られた、プラスミドＰＩＩＴＮＦ
−１３による形質転換体の抽出液に、参考例１で調製し
た精製抗つサギ壊死死囚子抗１１ｎ　ｆｉｔの１００倍
希釈液を等量加えた。混液を３７℃で２時間イン↑・ユ
ベートした後、Ｌ−９２０細胞に対する細胞傷害活性を
測定した。結果を第５表に示す。第５表から明らかなよ
うに、ヒト癌壊死因子はウサギ癌壊死因子と免疫学的に
全（交差しない。 （以下余白） 第５表 宸特願昭５８−２２８７９０号（特開昭Ｇｏ−１２０９
９０号）に開示されている方法（参考例３の方法）に従
って調製したもの 【図面の簡単な説明】 図面はヒト癌壊死因子をコードするクローン化ＤＮＡの
塩基配列決定に用いた制限酵素の切断部位と塩基配列を
決定した方向及び範囲を示す。 特許出願人　　大日本！！８Ｉａ！−株式会社代　　理
　　人　　　　南　　　　　孝　　大小　　島　　−晃 坪　　井　　仔四部 図面Ｃつｌ’：’　Ｌ　＜　＋先δに変更なし）第１図 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和６３年特許願第２２０７４９号 住所　大阪市東区道修町３丁目２５番地名称　（２９１
）大日本製薬株式会社 ４、代理人 住所　東京都千代田区麹町３丁目２番地相互第一ビル （全送日：昭和６３年１２月２０日） ６、補正の対象　　　明細書の図面の簡単な説明の欄お
よび７、補正の内容

【図面の簡単な説明】

明細書、６６頁下から３行の「図面」の記載を、「第１
図」に訂正する。 １！０図面 添付した図面第１図を、先に提出の図面と差換えます。 以上

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記のアミノ酸配列からなるヒト癌壊死因子又は
   その活性中心部分を含むポリペプチド：【アミノ酸配列
   があります。】
2. （２）下記のアミノ酸配列からなるヒト癌壊死因子前駆
   体： 【アミノ酸配列があります。】
3. （３）ヒト癌壊死因子又はその前駆体をコードするＤＮ
   Ａを形質発現ベクターに挿入して形質発現ベクターを構
   築し、そのベクターを宿主細胞に導入し、ついでその形
   質転換体を培養することを特徴とするヒト癌壊死因子活
   性を有するポリペプチドの製造法。
4. （４）ヒト癌壊死因子をコードするＤＮＡが下記式で示
   されるアミノ酸配列からなるヒト癌壊死因子をコードす
   るＤＮＡである特許請求の範囲第（３）項記載のヒト癌
   壊死因子活性を有するポリペプチドの製造法： 【アミノ酸配列があります。】
5. （５）ヒト癌壊死因子活性を有するポリペプチドが下記
   アミノ酸配列からなるポリペプチドである特許請求の範
   囲第（４）項記載の製造法： 【アミノ酸配列があります。】