JPS61155330A - 蛋白質標品 - Google Patents
蛋白質標品Info
- Publication number
- JPS61155330A JPS61155330A JP59274573A JP27457384A JPS61155330A JP S61155330 A JPS61155330 A JP S61155330A JP 59274573 A JP59274573 A JP 59274573A JP 27457384 A JP27457384 A JP 27457384A JP S61155330 A JPS61155330 A JP S61155330A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- tnf
- cells
- protein
- cell
- malignant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野〕
本発明は蛋白質標高に関し、詳しくはヒト腫瘍細胞を壊
死せしめる作用を有する蛋白質標高（ヒト腫瘍壊死因子
、以下ｒｈ−ＴＮＦＪと記ず。）に関する。
死せしめる作用を有する蛋白質標高（ヒト腫瘍壊死因子
、以下ｒｈ−ＴＮＦＪと記ず。）に関する。
ｈ−ＴＮＦはヒト正常細胞には壊死作用を示さず、ヒト
腫瘍細胞のみを壊死せしめる。したがって、このｈ−Ｔ
ＮＦは抗腫瘍剤として使用できる可能性がある。
腫瘍細胞のみを壊死せしめる。したがって、このｈ−Ｔ
ＮＦは抗腫瘍剤として使用できる可能性がある。
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）としては、マウス由来のＪ７７
４．１細胞を用いて各種蛋白性レクチン。
４．１細胞を用いて各種蛋白性レクチン。
リポポリサッカライド等の刺激剤と接触させて産生せし
めたマウスＴＮＦが報告されている（Ｊ。
めたマウスＴＮＦが報告されている（Ｊ。
ＩＭＮＯＬ、Ｖｏ １．ｌ ２２．Ｎ１１５．１７８５
（１９７９））が、ヒト細胞由来のｈ−ＴＮ Ｆについ
ては未だその存在すら知られていない。
（１９７９））が、ヒト細胞由来のｈ−ＴＮ Ｆについ
ては未だその存在すら知られていない。
（問題点を解決するための手段）
本発明者らは、ヒト悪性化卓球性細胞を分化誘導物質と
接触せしめた際に特異的に生産される蛋白質標高の１つ
にｈ−ＴＮＦが存在することを見出した。
接触せしめた際に特異的に生産される蛋白質標高の１つ
にｈ−ＴＮＦが存在することを見出した。
卓球性細胞としてはマクロファージが代表的なものであ
り、本発明の悪性化卓球性細胞としては、このような卓
球性細胞が自然にまたは人為的に悪性化されたもの及び
未分化の卓球性細胞が含まれる。より具体的には白血病
細胞及び骨髄細胞を人為的に悪性化したもの等がある。
り、本発明の悪性化卓球性細胞としては、このような卓
球性細胞が自然にまたは人為的に悪性化されたもの及び
未分化の卓球性細胞が含まれる。より具体的には白血病
細胞及び骨髄細胞を人為的に悪性化したもの等がある。
より具体的に例示すれば以下のものがある。ヒト前骨髄
性白血病細胞（ＨＬ−６０ＡＴＣＣＣＣＬ２４０゜Ｎａ
ｔｕｒｅ ２７０，３４７ （１９７７））、ヒト慢
性骨髄性白血病細胞（Ｋ ５６２ 、 Ｂｌｏｏｄ↓］
。
性白血病細胞（ＨＬ−６０ＡＴＣＣＣＣＬ２４０゜Ｎａ
ｔｕｒｅ ２７０，３４７ （１９７７））、ヒト慢
性骨髄性白血病細胞（Ｋ ５６２ 、 Ｂｌｏｏｄ↓］
。
３２１ （１９７５））、Ｕ−９３７ＡＴＣＣＣＲ，
Ｌ １５９３．Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ １７゜５
６５ （１９７６））、 ヒト急性骨髄性白血病細胞
（ＫＧＬ、５ｃｉｅｎｃｅ ２００．１１５３（１９
７８） ） 、 ＭＬ −１，Ｃａｎｃｅｒ Ｒａｓ、
±２．５１５２ （１９８３））、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ
ＡＴＣＣＣＣＬ １１９．Ｃａｎｃｅｒ、１８，５
５２〜５２９゜（１９６５））、ＨＰＢ−ＭＬＴ、Ｉ
ｎ ｔ、Ｊ。
Ｌ １５９３．Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ １７゜５
６５ （１９７６））、 ヒト急性骨髄性白血病細胞
（ＫＧＬ、５ｃｉｅｎｃｅ ２００．１１５３（１９
７８） ） 、 ＭＬ −１，Ｃａｎｃｅｒ Ｒａｓ、
±２．５１５２ （１９８３））、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ
ＡＴＣＣＣＣＬ １１９．Ｃａｎｃｅｒ、１８，５
５２〜５２９゜（１９６５））、ＨＰＢ−ＭＬＴ、Ｉ
ｎ ｔ、Ｊ。
Ｃａｎｃｅｒ、２１，１６６ （１９７Ｂ）、ＨＰＢ−
ＡＬＬ、 Ｔ ｎ ｔ、 Ｊ、 Ｃａｎｃｅｒ、
２１． １６６（１９７７） 、 ＴＡＬＬ
（Ｎａｔｕｒｅ ２６７゜８４３、 （１９７７）
、 ＲＰＭＩ−８４０２゜Ｊ、 Ｎａｔｌ、 Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｉｎ５ｔ、 ５５． １１ （１９７５
））及びＴＨＰ−１（Ｉｎｔ、 Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、
２６． １７１−１７６ （１９８０）） 。
ＡＬＬ、 Ｔ ｎ ｔ、 Ｊ、 Ｃａｎｃｅｒ、
２１． １６６（１９７７） 、 ＴＡＬＬ
（Ｎａｔｕｒｅ ２６７゜８４３、 （１９７７）
、 ＲＰＭＩ−８４０２゜Ｊ、 Ｎａｔｌ、 Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｉｎ５ｔ、 ５５． １１ （１９７５
））及びＴＨＰ−１（Ｉｎｔ、 Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、
２６． １７１−１７６ （１９８０）） 。
人為的に悪性化された骨髄細胞を得るには未成熟又は成
熟細胞を得る方法もまた通常の方法でよい（＾ｕｓｔ、
Ｊ、 Ｅｘｐ、 Ｂｉｏｌ、 Ｍｅｄ、 Ｓｃｉ、、
４１ 、２８７（１９６６））。
熟細胞を得る方法もまた通常の方法でよい（＾ｕｓｔ、
Ｊ、 Ｅｘｐ、 Ｂｉｏｌ、 Ｍｅｄ、 Ｓｃｉ、、
４１ 、２８７（１９６６））。
人為的に骨髄細胞を悪性化させる方法には、骨髄細胞を
Ｎ−メチル−Ｎ゛−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等
の変異物質に曝す方法あるいはＸ線、紫外線、Ｔ線等を
骨髄細胞に照射する方法、更にはレトロウィルス等によ
って骨髄細胞を形質転換する方法等がある。
Ｎ−メチル−Ｎ゛−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等
の変異物質に曝す方法あるいはＸ線、紫外線、Ｔ線等を
骨髄細胞に照射する方法、更にはレトロウィルス等によ
って骨髄細胞を形質転換する方法等がある。
分化誘導物質は、□悪性化卓球性細胞と接触した時、こ
の悪性化卓球性細胞をマクロファージ、顆粒球の卓球細
胞に分化誘導せしめる作用を有する物質であり、具体的
にはヘミン、アクチノマイシンＤ、ヘキサメチレンアク
ラミノマイシンＡ、テレオシジン、マイトマイシンＣ，
プレオマイシン。
の悪性化卓球性細胞をマクロファージ、顆粒球の卓球細
胞に分化誘導せしめる作用を有する物質であり、具体的
にはヘミン、アクチノマイシンＤ、ヘキサメチレンアク
ラミノマイシンＡ、テレオシジン、マイトマイシンＣ，
プレオマイシン。
プロピオン酸、酢酸ナトリウム、カダベリン、ツニカマ
イシン、１２−０−テトラデカノイルフォルボール１３
アセテート（ＴＰＡ）、 γ−インターフェロン等の
リンフ才力イン、Ｄ−因子、アルギナーゼ、ヒストンＨ
１，リポポリサッカライド。
イシン、１２−０−テトラデカノイルフォルボール１３
アセテート（ＴＰＡ）、 γ−インターフェロン等の
リンフ才力イン、Ｄ−因子、アルギナーゼ、ヒストンＨ
１，リポポリサッカライド。
脂質Ａ、グルココルチコイド、１ｄ−２５−デバイドロ
オキシビタミンＤｚ、ポリ （■）、ポリ（ＡＤＰ−リ
ボース）、ＢＣＧ、クロロキン等があげられる。
オキシビタミンＤｚ、ポリ （■）、ポリ（ＡＤＰ−リ
ボース）、ＢＣＧ、クロロキン等があげられる。
分化８￥：、導物質により分化されたヒト悪性化卓球性
細胞とは上記のヒト悪性化卓球性細胞が上記分化誘導物
質と接触せしめられて生じた細胞であり、部分的卓球性
細胞に分化したもの及び実質的卓球性細胞に分化したも
のが含まれる。
細胞とは上記のヒト悪性化卓球性細胞が上記分化誘導物
質と接触せしめられて生じた細胞であり、部分的卓球性
細胞に分化したもの及び実質的卓球性細胞に分化したも
のが含まれる。
悪性化卓球性細胞を分化誘導物質に接触せしめる方法は
、たとえば悪性化卓球性細胞を分化誘導物質を含有する
培地に培養すればよい。悪性化卓球性細胞を培養してｈ
−ＴＮＦを生成せしめるには分化誘導物質が存在する条
件下で培養を続けてせしめた後、悪性化卓球性細胞を分
化誘導物質を含まない培地に移し変えて培養してもよい
。後者の方法の場合、悪性化卓球性細胞を移し変えた後
の培地に生体外刺激物質を添加すればより良い結果が得
られることがある。
、たとえば悪性化卓球性細胞を分化誘導物質を含有する
培地に培養すればよい。悪性化卓球性細胞を培養してｈ
−ＴＮＦを生成せしめるには分化誘導物質が存在する条
件下で培養を続けてせしめた後、悪性化卓球性細胞を分
化誘導物質を含まない培地に移し変えて培養してもよい
。後者の方法の場合、悪性化卓球性細胞を移し変えた後
の培地に生体外刺激物質を添加すればより良い結果が得
られることがある。
生体外刺激物質とは、ヒト細胞の細胞膜またはライソゾ
ームに変化を与え生体内高分子を細胞外各種レクチン、
ビタミンＡ等がある。
ームに変化を与え生体内高分子を細胞外各種レクチン、
ビタミンＡ等がある。
このような悪性化卓球性細胞を培養する培地は動物細胞
を培養する通常の培地のいずれもが用いられる。具体的
にはローズウェル・パーク・メモリアル・インスティテ
ユート１６４０培地（Ｒｏｓｅｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍ
ｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ −１６４０、以
下、ＲＰＭＩ−１６４０と略す。）が好適であるが、他
にダルベツコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂ、ｅｃｃｏ’
ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ
）、イーグル基礎培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ旧ｎｉｍｕｍ
Ｅｓ５ｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ。
を培養する通常の培地のいずれもが用いられる。具体的
にはローズウェル・パーク・メモリアル・インスティテ
ユート１６４０培地（Ｒｏｓｅｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍ
ｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ −１６４０、以
下、ＲＰＭＩ−１６４０と略す。）が好適であるが、他
にダルベツコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂ、ｅｃｃｏ’
ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ
）、イーグル基礎培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ旧ｎｉｍｕｍ
Ｅｓ５ｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ。
以下、ＭＥＭ培地と略す。）、クリック培地（Ｃ１１ｃ
ｋ Ｍｅｄｉｕｍ ）なども用いられる。これらの培地
には胎児ウシ血清（以下ＦＢＳと略す。）や新生児ウシ
血清、ウマ血清などを添加して用いるのが望ましい。
ｋ Ｍｅｄｉｕｍ ）なども用いられる。これらの培地
には胎児ウシ血清（以下ＦＢＳと略す。）や新生児ウシ
血清、ウマ血清などを添加して用いるのが望ましい。
悪性化華球性細胞の培養は通常１〜５ｘｌＯｂ個／ｍβ
の細胞密度で３５〜３８°Ｃにて４〜６％炭酸ガス気流
中で行なう。
の細胞密度で３５〜３８°Ｃにて４〜６％炭酸ガス気流
中で行なう。
分化誘導物質は、通常培養当初より培地に含有もよいが
、同細胞の増殖がある程度進んでから培地に含有せしめ
てもよい。
、同細胞の増殖がある程度進んでから培地に含有せしめ
てもよい。
ＴＮＦは以下のように定性及び定量分析できる。
即ち、標的細胞であるＬ−９２９細胞（Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｌｌ、 Ｓ、 Ａ
、 ７２． ３６６６−３６７０）をＭＥＭ培地に５
％仔牛脂児血清を加え育成し、８ＸＩＯ’細胞が１００
μｌの同上培地に含まれる様にし、９６大の平底プレー
トに育種する。育種条件は３７℃、２時間、５％Ｃｏｔ
、１００％Ｈ，ｏで通常細胞培養に用いられる方法でよ
い。その後、アクチノマイソンＤ培地中に終濃度１μｇ
／ ｍ ／！となる様に加え、培養液の液量を１５０
μ２とする。即座にｈ−ＴＮＦを含むと考えられる検体
を適当にＭＥＭ培地で稀釈したものを５０μｌ加える。
、 ７２． ３６６６−３６７０）をＭＥＭ培地に５
％仔牛脂児血清を加え育成し、８ＸＩＯ’細胞が１００
μｌの同上培地に含まれる様にし、９６大の平底プレー
トに育種する。育種条件は３７℃、２時間、５％Ｃｏｔ
、１００％Ｈ，ｏで通常細胞培養に用いられる方法でよ
い。その後、アクチノマイソンＤ培地中に終濃度１μｇ
／ ｍ ／！となる様に加え、培養液の液量を１５０
μ２とする。即座にｈ−ＴＮＦを含むと考えられる検体
を適当にＭＥＭ培地で稀釈したものを５０μｌ加える。
この際、稀釈率を適宜調製してＥＤ５０を求めることが
できる。更に、最終液量が２００μｒとなったＬ−９２
９細胞を上記条件で１８時間培養を′ｍ続する。細胞壊
死活性は、まず全培地を除去し、ここに０．２％クリス
タルバイオレットの２％メチルアルコール溶液を加え固
定染色する。クリスタルバイオレットは全付核細胞を染
色し、ｈ−ＴＮＦにより壊死し、フラスコ底面より遊離
した細胞は染色しないので、ｈ−ＴＮＦ活性を直接測定
できる。゛この染色度をＯＤ５９０ｎｍの吸収で測定し
、対照群に対する染色度と比較することによりｈ−ＴＮ
Ｆ活性を測定する。活性の定義は次の様に行う。Ｌ−９
２９細胞が５０％生存できる検体原液の稀釈率のキ←〜
ヤ逆数に１０−’を乗じた値を原液の１ｍｌあたりの活
性とする。即ち、原液の１０００分の１稀釈でＥＤ５０
を与える検体の活性は１単位／ ｍ Ｉ！、である。通
常の方法によりウサギ生体内でＴＮＦを産生せしため場
合の活性は上述の定義によると、４０単位／ ｍ Ｒと
なる。また、マウス卓球性白血病細胞Ｊ７７４．１を種
々の方法によりＴＮＦ産生せしため場合、巳Ｄ５０で上
限４〜５単位／ ｍ １の活性を培養上清中に示す。
できる。更に、最終液量が２００μｒとなったＬ−９２
９細胞を上記条件で１８時間培養を′ｍ続する。細胞壊
死活性は、まず全培地を除去し、ここに０．２％クリス
タルバイオレットの２％メチルアルコール溶液を加え固
定染色する。クリスタルバイオレットは全付核細胞を染
色し、ｈ−ＴＮＦにより壊死し、フラスコ底面より遊離
した細胞は染色しないので、ｈ−ＴＮＦ活性を直接測定
できる。゛この染色度をＯＤ５９０ｎｍの吸収で測定し
、対照群に対する染色度と比較することによりｈ−ＴＮ
Ｆ活性を測定する。活性の定義は次の様に行う。Ｌ−９
２９細胞が５０％生存できる検体原液の稀釈率のキ←〜
ヤ逆数に１０−’を乗じた値を原液の１ｍｌあたりの活
性とする。即ち、原液の１０００分の１稀釈でＥＤ５０
を与える検体の活性は１単位／ ｍ Ｉ！、である。通
常の方法によりウサギ生体内でＴＮＦを産生せしため場
合の活性は上述の定義によると、４０単位／ ｍ Ｒと
なる。また、マウス卓球性白血病細胞Ｊ７７４．１を種
々の方法によりＴＮＦ産生せしため場合、巳Ｄ５０で上
限４〜５単位／ ｍ １の活性を培養上清中に示す。
このようにして得られるｈ−ＴＮＦ培養液は通常の蛋白
質の精製法に準じて精製され、本発明のｈ−ＴＮＦが精
製される。即ち、塩基性陰イオン交換体によるイオン交
換クロマトグラフィー、塩析法５透析法、ゲル濾過法、
高速分子篩クロマトグラフィー、電気泳動法等を順次又
は適宜組み合せることによって精製される。以下、更に
具体的に説明する。
質の精製法に準じて精製され、本発明のｈ−ＴＮＦが精
製される。即ち、塩基性陰イオン交換体によるイオン交
換クロマトグラフィー、塩析法５透析法、ゲル濾過法、
高速分子篩クロマトグラフィー、電気泳動法等を順次又
は適宜組み合せることによって精製される。以下、更に
具体的に説明する。
塩基性陰イオン交換体としてはＤＥＡＥ−セファデック
スＡ−２５，Ａ−５０，ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−
６８，ＤＥＡＥ−セファミル（以上、ファルマシア社製
）が好ましく、その他ジエチルアミノ基、アミノエチル
基又は四級化アミノエチル基含有陰イオン交換体等も使
用される。使用される緩衝液としてはｐＨ６，０〜９．
０のトリス−塩酸塩又はリン酸緩衝液が望ましく、これ
ら０．０５Ｍ程度の希薄な緩衝液でｈ−ＴＮＦ培養液を
稀釈し、塩濃度０．１ Ｍ以下の溶液として陰イオン交
換体と接触せしめてｈ−ＴＮＦを吸着させる。
スＡ−２５，Ａ−５０，ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−
６８，ＤＥＡＥ−セファミル（以上、ファルマシア社製
）が好ましく、その他ジエチルアミノ基、アミノエチル
基又は四級化アミノエチル基含有陰イオン交換体等も使
用される。使用される緩衝液としてはｐＨ６，０〜９．
０のトリス−塩酸塩又はリン酸緩衝液が望ましく、これ
ら０．０５Ｍ程度の希薄な緩衝液でｈ−ＴＮＦ培養液を
稀釈し、塩濃度０．１ Ｍ以下の溶液として陰イオン交
換体と接触せしめてｈ−ＴＮＦを吸着させる。
ｈ−ＴＮ Ｆの溶出はＯ１１〜０．２Ｍの食塩又は塩化
カリウム等の塩類溶液で行われ、ｈ−ＴＮ Ｆは１ン ０．２Ｍ付近の塩濃度で溶出される。該陰イオン交換体
との接触は刀ラム法が望ましが、大量の場合にはバッチ
法も採用される。
カリウム等の塩類溶液で行われ、ｈ−ＴＮ Ｆは１ン ０．２Ｍ付近の塩濃度で溶出される。該陰イオン交換体
との接触は刀ラム法が望ましが、大量の場合にはバッチ
法も採用される。
陰イオン交換クロマトグラフィーを行なう前に、前処理
として限外濾過膜で低分子物質を除去することが望まし
く、精製効果を上げることが出来る。
として限外濾過膜で低分子物質を除去することが望まし
く、精製効果を上げることが出来る。
陰イオン交換クロマトグラフィーで得られたｈ−ＴＮＦ
活性溶液は透析後、濃縮してゲル濾過に付される。ゲル
濾適用の担体としてはセファデックスＧ−７５，Ｇ−１
００（ファルマシア社製）。
活性溶液は透析後、濃縮してゲル濾過に付される。ゲル
濾適用の担体としてはセファデックスＧ−７５，Ｇ−１
００（ファルマシア社製）。
セファクリルＳ−２００（ファルマシア社製）。
バイオゲルＰ−１００（バイオラット社製）及びトーヨ
ーバールＨＷ−５０，ＨＷ−５５（東洋曹達工業社製）
等が使用される６ ゛ −°−゛ ゲル濾過に使用する緩衝液はｐＨ６，０〜９．０のトリ
ス−塩酸又はリン酸緩衝液が使用され、吸着を防ぐ目的
で０．２〜０．５Ｍの食塩等の塩類を添加して使用する
ことが望ましい。この工程による精製度は２〜１０倍で
ある。
ーバールＨＷ−５０，ＨＷ−５５（東洋曹達工業社製）
等が使用される６ ゛ −°−゛ ゲル濾過に使用する緩衝液はｐＨ６，０〜９．０のトリ
ス−塩酸又はリン酸緩衝液が使用され、吸着を防ぐ目的
で０．２〜０．５Ｍの食塩等の塩類を添加して使用する
ことが望ましい。この工程による精製度は２〜１０倍で
ある。
ゲル濾過で精製したｈ−ＴＮＦ含有液は、次いでＭｏｎ
ｏ Ｑ ＨＲ５１５カラム（ファルマシア社製高性
能陰イオン交換体カラム）を使用するファルマシアＦ
Ｐ Ｌ Ｃ（Ｆａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ＋ Ｐｅｐｔｉ
ｄｅ。
ｏ Ｑ ＨＲ５１５カラム（ファルマシア社製高性
能陰イオン交換体カラム）を使用するファルマシアＦ
Ｐ Ｌ Ｃ（Ｆａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ＋ Ｐｅｐｔｉ
ｄｅ。
Ｐｏ１ｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、 Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈ
ｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）システムによる高性能陰イ
オン交換クロマトグラフィーによって更に精製される。
ｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）システムによる高性能陰イ
オン交換クロマトグラフィーによって更に精製される。
精製度は５〜１０倍で活性の回収率は７０〜９０％であ
る。
る。
この高性能陰イオン交換体クロマトグラフィーの条件は
最初のＤＥＡＥ−セファロース等の担体を使用する陰イ
オン交換クロマトグラフィーの場合と同じ条件下である
。
最初のＤＥＡＥ−セファロース等の担体を使用する陰イ
オン交換クロマトグラフィーの場合と同じ条件下である
。
ＦＰＬＣにより精製されたｈ−ＴＮ Ｆ溶液は高速分子
篩クロマトグラフィーで更に精製される。
篩クロマトグラフィーで更に精製される。
この際に使用する担体としてはＴＳＫ−Ｇｅ ｌＧ３０
００ＳＷ（東洋曹達工業社製）が特に望ましく、この高
速分子篩クロマトグラフィーによる精製度は５〜１０倍
であり、蛋白に対する比活性４〜８Ｘ１０３単位／＋ｎ
ｇ蛋白質を有する精製標高が得られる。
００ＳＷ（東洋曹達工業社製）が特に望ましく、この高
速分子篩クロマトグラフィーによる精製度は５〜１０倍
であり、蛋白に対する比活性４〜８Ｘ１０３単位／＋ｎ
ｇ蛋白質を有する精製標高が得られる。
このようにして精製された蛋白漂白ｈ−ＴＮＦは以下の
理化学的性質を有する。
理化学的性質を有する。
（１１分子量： ３０．０００±５，０００ （ゲル
濾過法）−′−°゛。
濾過法）−′−°゛。
（２）ｐＨ安定性：ｐＨ６，０〜９．０で安定（第１図
に示す） （３）温度安定性：ｐＨ７，０，６５°Ｃ，１時間の加
熱により６０〜７０％失活 する （４）蛋白分解酵素（プロナーゼ、トリプシン）処理に
より完全に失活する （５１ＳＤＳ・ポリアクリルアミド電気泳動（Ｌａｍｍ
ｌ ｉの方法、ゲル濃度１２．５％）：分子量２６０
００ｄと１４０００−１８０００ｄの位置に移動した。
に示す） （３）温度安定性：ｐＨ７，０，６５°Ｃ，１時間の加
熱により６０〜７０％失活 する （４）蛋白分解酵素（プロナーゼ、トリプシン）処理に
より完全に失活する （５１ＳＤＳ・ポリアクリルアミド電気泳動（Ｌａｍｍ
ｌ ｉの方法、ゲル濃度１２．５％）：分子量２６０
００ｄと１４０００−１８０００ｄの位置に移動した。
〔作用２発明の効果〕
本発明の蛋白質標高ｈ−ＴＮＦはヒトに投与したときに
副作用がなく、腫瘍細胞のみを壊死せしめるものと考え
られる。得られたｈ−ＴＮＦは、マウスに２０００単位
／マウス静注投与したとき急性および亜急性毒性を示さ
ない。したがって、たとえば腎原発肺転移を有する末期
癌患者に２５０単位静注投与すれば病巣は消失、縮退ま
たは拡大を停止し、治病するものと思われる。以下にｈ
−ＴＮＦのガン細胞系に対する細胞毒性を示す。なお、
正常細胞（ネズミＷ１３８）に対する細胞毒性は２００
０単位で５％以下である。
副作用がなく、腫瘍細胞のみを壊死せしめるものと考え
られる。得られたｈ−ＴＮＦは、マウスに２０００単位
／マウス静注投与したとき急性および亜急性毒性を示さ
ない。したがって、たとえば腎原発肺転移を有する末期
癌患者に２５０単位静注投与すれば病巣は消失、縮退ま
たは拡大を停止し、治病するものと思われる。以下にｈ
−ＴＮＦのガン細胞系に対する細胞毒性を示す。なお、
正常細胞（ネズミＷ１３８）に対する細胞毒性は２００
０単位で５％以下である。
学／
第 １ 表
５０％細胞毒 （゛パ位）
ネズミ悪性化腫瘍細胞
サルコーマ１８０ ２５０
Ｌ−１２１０５００
ヒト悪性化腫瘍細胞
ヘラ （Ｈｅ ｌａ） ５００〜１０００ＫＢ
５００〜１０００次に、本発明を
実施例により詳しく説明する。
５００〜１０００次に、本発明を
実施例により詳しく説明する。
実施例１
５％牛脂児性血清を有するＲＰＭＩ−１６４０無ＩＭｊ
ｆ３地５． Ｏｐを２０１容スピンナーフラスコに張り
込み、この培地に実施例１の方法で培養して得られたＴ
ＨＰ−１細胞を２Ｘ１０５個７ｍ１ｌになるように懸濁
した。これを３７℃で４日間培養し、得られた培養液を
遠心分離してＴＨＰ−１細胞を無菌的に採取した。この
細胞を別のスピンナーフラスコに入れた血清を含まない
上記ＲＰＭＩ−１６４０培地５．（Ｈ！に移し、これに
ＴＰＡを１００ｎ ｇ ／ ｍ Ｒ添カロし、ゆるやか
に７夜を攪（牢（１００ｒ、ｐ、ｍ、）しつつ無菌的条
件下３７０℃で５時間培養（誘導）を行った。このよう
にして得られた培養液を遠心分離して細胞を分離、除去
して０．１２５車位／’ｍｌｌのｈ−ＴＮＦ活性を有す
る培養液を得た。このようにして得た培養液２０１に２
０１の０．０５Ｍトリス−塩酸緩衝液を加えて希釈し、
これをあらかじめ同緩衝液で十分平衡化したＤＥＡＥ−
セファデックスカラム（７Ｘ７０ｃｍ）に負荷した。こ
のカラムを同緩衝液５．ＯＡで洗浄した後、０．２Ｍの
食塩を含有する同緩衝液で溶出した。
ｆ３地５． Ｏｐを２０１容スピンナーフラスコに張り
込み、この培地に実施例１の方法で培養して得られたＴ
ＨＰ−１細胞を２Ｘ１０５個７ｍ１ｌになるように懸濁
した。これを３７℃で４日間培養し、得られた培養液を
遠心分離してＴＨＰ−１細胞を無菌的に採取した。この
細胞を別のスピンナーフラスコに入れた血清を含まない
上記ＲＰＭＩ−１６４０培地５．（Ｈ！に移し、これに
ＴＰＡを１００ｎ ｇ ／ ｍ Ｒ添カロし、ゆるやか
に７夜を攪（牢（１００ｒ、ｐ、ｍ、）しつつ無菌的条
件下３７０℃で５時間培養（誘導）を行った。このよう
にして得られた培養液を遠心分離して細胞を分離、除去
して０．１２５車位／’ｍｌｌのｈ−ＴＮＦ活性を有す
る培養液を得た。このようにして得た培養液２０１に２
０１の０．０５Ｍトリス−塩酸緩衝液を加えて希釈し、
これをあらかじめ同緩衝液で十分平衡化したＤＥＡＥ−
セファデックスカラム（７Ｘ７０ｃｍ）に負荷した。こ
のカラムを同緩衝液５．ＯＡで洗浄した後、０．２Ｍの
食塩を含有する同緩衝液で溶出した。
ｈ −ＴＮ Ｆ活性区分２．Ｏｊｌ！を集め、硫安分画
（４０％〜５５％飽和画分）を行い、得られた硫安沈澱
を少量の水に溶かし、この水溶液を同緩衝液で十分透析
した（５℃、２４時間）。
（４０％〜５５％飽和画分）を行い、得られた硫安沈澱
を少量の水に溶かし、この水溶液を同緩衝液で十分透析
した（５℃、２４時間）。
透析内液を超遠心分離（６０，００Ｏｒ ｐｍ、 ６０
分）して不溶物を除去し、あらかじめ０．５Ｍの食塩を
含む０．０５Ｍトリス−塩酸緩衝液で平衡化したトーヨ
ーパールＨＷ−５ＯＳカラ轟（５，０Ｘ７０ｃｍ）を用
い流速１０ｍ＋！／ｍｉｎ、の条件でゲル濾過を行った
。次いで、ＴＮＦ活性画分を集め、０．０５Ｍ）リス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）で透析した。透析内液をあら
かしめ５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）で平
衡化したＭｏｎ。
分）して不溶物を除去し、あらかじめ０．５Ｍの食塩を
含む０．０５Ｍトリス−塩酸緩衝液で平衡化したトーヨ
ーパールＨＷ−５ＯＳカラ轟（５，０Ｘ７０ｃｍ）を用
い流速１０ｍ＋！／ｍｉｎ、の条件でゲル濾過を行った
。次いで、ＴＮＦ活性画分を集め、０．０５Ｍ）リス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）で透析した。透析内液をあら
かしめ５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）で平
衡化したＭｏｎ。
Ｑ ＨＲ５１５カラムに負荷し、同緩衝液で洗浄した
後、０．１．０．１５．０．２．０．３Ｍと順次食塩濃
度を上げる段階的溶出法によりｈ−ＴＮＦ活性物質を溶
出した。ｈ−ＴＮＦ活性は０．２ Ｍの食塩で溶出され
、比活性５Ｘ１０”Ｕ／ｍｇ蛋白質を有する精製溶液が
得られた。
後、０．１．０．１５．０．２．０．３Ｍと順次食塩濃
度を上げる段階的溶出法によりｈ−ＴＮＦ活性物質を溶
出した。ｈ−ＴＮＦ活性は０．２ Ｍの食塩で溶出され
、比活性５Ｘ１０”Ｕ／ｍｇ蛋白質を有する精製溶液が
得られた。
この高性能陰イオン交換クロマトグラフィ一工程の活性
回収率は８０％以上、精製度は約５倍であった。
回収率は８０％以上、精製度は約５倍であった。
このようにしＣ得られた活性画分を限外濾過法（アミコ
ン社製、ＹＭ−５）で濃縮し、５０ｍＭリン酸緩衝液（
ｐＨ７，０）に透析後、０．２Ｍ食塩含有の該リン酸緩
衝液で平衡化したＴＳＫ−Ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカ
ラム（０，７ｘ ６０ｃｍ）を使用して高速分子篩クロ
マトグラフィーを行なった。ｈ−ＴＮＦ活性の溶出時間
は１９．７５分であった（第２図）。同じＧ３０００Ｓ
Ｗカラムを用い同条件で標準蛋白質（オボアルブミン、
ボビンゼーラムアルブミン、α−キモトリプシノーゲン
及びリボヌクレアーゼ）の溶出時間を求め、標準蛋白の
溶出時間に基づいてｈ−ＴＮ Ｆの分子量を３０±５
Ｋ ｄと算出した。
ン社製、ＹＭ−５）で濃縮し、５０ｍＭリン酸緩衝液（
ｐＨ７，０）に透析後、０．２Ｍ食塩含有の該リン酸緩
衝液で平衡化したＴＳＫ−Ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカ
ラム（０，７ｘ ６０ｃｍ）を使用して高速分子篩クロ
マトグラフィーを行なった。ｈ−ＴＮＦ活性の溶出時間
は１９．７５分であった（第２図）。同じＧ３０００Ｓ
Ｗカラムを用い同条件で標準蛋白質（オボアルブミン、
ボビンゼーラムアルブミン、α−キモトリプシノーゲン
及びリボヌクレアーゼ）の溶出時間を求め、標準蛋白の
溶出時間に基づいてｈ−ＴＮ Ｆの分子量を３０±５
Ｋ ｄと算出した。
この高速分子篩クロマトグラフィ一工程の精製度は約ｉ
ｏ倍であり、比活性４．５ＸｌＯ’Ｕ／ｍｇ蛋白質のＩ
Ｉｉ製蛋白標高が得られた。
ｏ倍であり、比活性４．５ＸｌＯ’Ｕ／ｍｇ蛋白質のＩ
Ｉｉ製蛋白標高が得られた。
このようにして得られたｈ−ＴＮＦの理化学的性質は次
の通りである。
の通りである。
（１）分子量： ３０，０００±５，０００ （ゲル
濾過法）（２）ｐＨ安定性：ｐＨ６，０〜９．０で安定
（第１図） （３）温度安定性：ｐＨ７，０，６５℃、１時間の加熱
により６０〜７０％失活 する （４）蛋白分解酵素により完全に失活する。即ち、１０
０Ｕ／ｍｊ！のＴＮＦ活性を有する溶液にトリプシンま
たはプロナーゼを０．１ｍｇ／ｍｆｆ１を加え、ｐＨ８
，０，３７°ｃ、 ６時間の酵素反応によりいずれの
場合もＴＮＦ活性完全に失活した。
濾過法）（２）ｐＨ安定性：ｐＨ６，０〜９．０で安定
（第１図） （３）温度安定性：ｐＨ７，０，６５℃、１時間の加熱
により６０〜７０％失活 する （４）蛋白分解酵素により完全に失活する。即ち、１０
０Ｕ／ｍｊ！のＴＮＦ活性を有する溶液にトリプシンま
たはプロナーゼを０．１ｍｇ／ｍｆｆ１を加え、ｐＨ８
，０，３７°ｃ、 ６時間の酵素反応によりいずれの
場合もＴＮＦ活性完全に失活した。
＋５１３ＤＳ・ポリアクリルアミド電気泳動（Ｌａｍｍ
ｌｉの方法、ゲル濃度１２．５％）：分子量２６０００
ｄと１４０００−１８０００ｄの位置に移動した。
ｌｉの方法、ゲル濃度１２．５％）：分子量２６０００
ｄと１４０００−１８０００ｄの位置に移動した。
本発明に使用したＴＨＰ−１はＩｎｔ、Ｊ。
Ｃａｎｃｅｒ、 ２−、−６ １７１−１７６、 （１
９８０）に記載されているものであり、この礼文の箸材
より分与されたものである。Ｔ ＨＰ −１は他にもＰ
ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 八ｃａｄ、 Ｓｃ、ｉ、
ｌＪ、ｓ、八、 ８０． ５３９７−５４０
１ （１９８３）にも記載されていて、これらの研究
機関にも分与されている。また、本発明者らは権利を有
するいずれのものに対しても′「１ＩＰ−１を分与する
用意がある。
９８０）に記載されているものであり、この礼文の箸材
より分与されたものである。Ｔ ＨＰ −１は他にもＰ
ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 八ｃａｄ、 Ｓｃ、ｉ、
ｌＪ、ｓ、八、 ８０． ５３９７−５４０
１ （１９８３）にも記載されていて、これらの研究
機関にも分与されている。また、本発明者らは権利を有
するいずれのものに対しても′「１ＩＰ−１を分与する
用意がある。
第１図はｈ−ＴＮＦのｐＨ安定性を示すグラフ、第２図
はｈ−ＴＮＦの高速分子篩クロマトグラフとｈ−ＴＮＦ
活性を示すグラフである。 特許出願人 水 野 伝 − 町 柚 源 −部 代理人 弁理士 久保１）藤 部 第１図 Ｈ 手続主甫正書（自発） 昭和６０年３月１９日
はｈ−ＴＮＦの高速分子篩クロマトグラフとｈ−ＴＮＦ
活性を示すグラフである。 特許出願人 水 野 伝 − 町 柚 源 −部 代理人 弁理士 久保１）藤 部 第１図 Ｈ 手続主甫正書（自発） 昭和６０年３月１９日
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 ヒト悪性化卓球性細胞が分化誘導物質と接触せしめられ
たときに特異的に産生され、かつ以下の性質を有する蛋
白質標高。 （１）Ｌ−９２９細胞に対する壊死活性が４×１０＾３
単位／ｍｇ・蛋白質以上である （２）分子量：３０，０００±５０，０００（ゲル濾過
法）（３）ｐＨ安定性：ｐＨ６．０〜９．０で安定（４
）温度安定性：ｐＨ７．０、６５℃、１時間の加熱によ
り６０〜７０％失活する。 （５）蛋白質分解酵素により完全に失活する。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59274573A JPS61155330A (ja) | 1984-12-28 | 1984-12-28 | 蛋白質標品 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59274573A JPS61155330A (ja) | 1984-12-28 | 1984-12-28 | 蛋白質標品 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61155330A true JPS61155330A (ja) | 1986-07-15 |
Family
ID=17543620
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59274573A Pending JPS61155330A (ja) | 1984-12-28 | 1984-12-28 | 蛋白質標品 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61155330A (ja) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58107197A (ja) * | 1981-12-21 | 1983-06-25 | Hayashibara Biochem Lab Inc | ツモアネクロシスフアクタ−の製造方法 |
| JPS58138383A (ja) * | 1982-02-13 | 1983-08-17 | Nippon Shinyaku Co Ltd | 生理活性物質の製法 |
| JPS6140221A (ja) * | 1984-07-05 | 1986-02-26 | ジエネンテク，インコ−ポレイテツド | 腫瘍壊死因子 |
| JPS6150923A (ja) * | 1984-08-17 | 1986-03-13 | Dainippon Pharmaceut Co Ltd | ヒト癌壊死因子 |
| JPS61124392A (ja) * | 1984-11-22 | 1986-06-12 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 遺伝子組換体の産生する生理活性物質の精製法 |
-
1984
- 1984-12-28 JP JP59274573A patent/JPS61155330A/ja active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58107197A (ja) * | 1981-12-21 | 1983-06-25 | Hayashibara Biochem Lab Inc | ツモアネクロシスフアクタ−の製造方法 |
| JPS58138383A (ja) * | 1982-02-13 | 1983-08-17 | Nippon Shinyaku Co Ltd | 生理活性物質の製法 |
| JPS6140221A (ja) * | 1984-07-05 | 1986-02-26 | ジエネンテク，インコ−ポレイテツド | 腫瘍壊死因子 |
| JPS6150923A (ja) * | 1984-08-17 | 1986-03-13 | Dainippon Pharmaceut Co Ltd | ヒト癌壊死因子 |
| JPS61124392A (ja) * | 1984-11-22 | 1986-06-12 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 遺伝子組換体の産生する生理活性物質の精製法 |
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